KR20190069553A - 인간 간세포 이종이식을 위한 유전적으로 변형된 마우스 모델 - Google Patents

인간 간세포 이종이식을 위한 유전적으로 변형된 마우스 모델 Download PDF

Info

Publication number
KR20190069553A
KR20190069553A KR1020197014968A KR20197014968A KR20190069553A KR 20190069553 A KR20190069553 A KR 20190069553A KR 1020197014968 A KR1020197014968 A KR 1020197014968A KR 20197014968 A KR20197014968 A KR 20197014968A KR 20190069553 A KR20190069553 A KR 20190069553A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mouse
human
hepatocytes
aat
genetically modified
Prior art date
Application number
KR1020197014968A
Other languages
English (en)
Inventor
레오나드 디. 슐츠
Original Assignee
더 잭슨 래보라토리
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 잭슨 래보라토리 filed Critical 더 잭슨 래보라토리
Publication of KR20190069553A publication Critical patent/KR20190069553A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명의 하나 이상의 실시양태는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 포함하며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는다. 인간 AAT의 PiZ 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스는 유전적으로 변형된 NSG, NRG 또는 NOG 마우스일 수 있다. 상기 면역결핍 마우스는 이종 간세포, 예컨대 인간 간세포를 추가로 포함할 수 있다. 인간 간 질환의 추정적 치료는 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된 마우스에서 평가될 수 있다.

Description

인간 간세포 이종이식을 위한 유전적으로 변형된 마우스 모델
관련 출원에 대한 참조
본 출원은, 둘 다 2016년 10월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/413,736 및 62/413,743을 우선권 주장하며, 이들 가출원 둘 다의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 국립 보건 연구소에 수여된 승인 번호 1R24OD018259-01, 1R01DK098252-01, 1P01HL131471-01, 1P01HL131471-01, 및 CA034196 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 마우스 모델에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 인간 간 세포 이종이식에 대해 수용적인 트랜스제닉 마우스 모델에 관한 것이다.
동물 모델은 종종, 실험실 연구에서 인간 생물학적 활동과 질환에 대하여 연구자에게 시뮬레이션, 모방 또는 알리기 위해 사용된다. 인간 간 기능 및 질환에 대한 마우스 모델이 지속적으로 필요하다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본원에 기재된 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 것은 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에 수행될 수 있으며, 간독소를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것, 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에서 적어도 부분 간절제술을 수행하는 것, 및 간독소를 투여하는 것과 적어도 부분 간절제술을 수행하는 것 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택된 처리를 포함한다.
이와 같이 투여된 간독소는 특정한 실시양태에 따르는 모노크로탈린이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법은 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에, 약 10-100 mg/kg 모노크로탈린을 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 측면에 따라서, 내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 것은 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에, 그를 투여하는 동안 또는 그를 투여한 후에 수행되며, 항-마우스 CD95 항체를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 특정한 측면에 따라서, 내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 것은 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에, 투여하는 동안 또는 투여 후에 수행되며, 약 0.1 - 10 μg의 항-마우스 CD95 항체를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에 투여하는 것을 포함한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스가 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 임의로, 간세포는 인간 간세포이고, 추가 옵션에서, 인간 간세포는 인간 혈청 알부민을 발현한다. 인간 혈청 알부민은 본 개시내용의 측면에 따르는 마우스의 혈액에서 검출가능하며, 특정한 측면에 따라서, 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민이 상기 마우스의 혈청에 존재한다. 측면에 따라서, 본 개시내용의 면역결핍 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포이다. 본 개시내용의 측면에 따라서, 포함된 인간 간세포는 야생형 인간 AAT 및, 임의로, 상기 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 발현한다. 추가 옵션에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포는 게놈-편집된 간세포이다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하는 것인 단계; 및 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에 투여하는 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다. 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포는 1차 간세포이다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 인간 또는 동종이계 간세포를 본 개시내용의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것은 임의로, 간세포의 비장내 투여를 포함한다. 이와 같이 투여된 간세포는 임의로, 마커 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체를 발현한다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG, NRG 또는 NOG 마우스를 제공하는 단계로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 간세포에서 발현하고, 여기서 마우스는 인간 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는 것인 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 상기 마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공된다.
임의로, 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법에서 투여된 추정적 치료는 바이러스 유전자 요법 벡터의 투여를 포함한다.
임의로, 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되는 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법에서 투여된 추정적 치료는 게놈 편집된 인간 간세포의 투여를 포함한다.
도 1은 패널 a, b, c, d, e, f, 및 g로 표지된 7개의 패널로 이루어진다. 도 1의 패널 (a) (도 1a)은 2마리 공여자 마우스 균주, 즉 PiZ를 발현하는 GFP-표지된 마우스 간세포를 갖는 B6-PiZ-GFP와, GFP-표지된 야생형 마우스 간세포를 갖는 B6-GFP의 발생을 도시한다. 공여자 마우스로부터 GFP-발현 간세포를 단리하고, 그를, 마우스당 1,000,000개의 세포를 비장내 주사함으로써, 인간 PiZ 유전자를 발현하는 면역기능 저하 수컷 NSG-PiZ 마우스 내로 생착시킨다. 수용자 마우스를 생착 후 8주에 안락사시키고, 후속 분석을 위하여 간 조직을 수득하였다. 도 1의 패널 (b) (도 1b)은 RT-qPCR에 의해 결정된 바와 같은 PiZ-GFP 공여자 세포 및 야생형의 GFP 공여자 세포 (WT-GFP)에서 관찰된 Z-AAT (짙은 회색) 및 GFP (연한 회색)의 상대적 mRNA를 도시하는 그래프이다. 오류 막대는 군당 평균 3마리 마우스의 표준 오차에 상응한다. 도 1의 패널 (c) (도 1c)은 게놈 DNA 상에서 수행된 ddPCR에 의해 결정된 바와 같은 PiZ-GFP 간세포 (n=3) 또는 WT-GFP 간세포 (n=4)가 생착된 NSG-PiZ 마우스에서 이배체 게놈당 퍼센트 GFP-양성 세포를 도시하는 그래프이다. WT-GFP 공여자 간으로부터의 게놈 DNA가 양성 대조군으로서 사용되었다 (n=2). 오류 막대는 표준 오차에 상응한다. 도 1의 패널 (d) (도 1d)은 PiZ-GFP 간세포 이식편을 받은 NSG-PiZ 마우스로부터의 항-GFP 면역염색된 간 절편의 영상이다. 도 1의 패널 (e) (도 1e)은 PiZ-GFP 간세포 이식편을 받은 NSG-PiZ 마우스 간 절편의 형광 영상이다. 도 1의 패널 (f) (도 1f)은 도 1d와 비교하여 증가된 염색을 표시하는, WT-GFP 간세포 이식편을 받은 NSG-PiZ 마우스로부터의 항-GFP 면역염색된 간 절편의 영상이다. 도 1의 패널 (g) (도 1g)은 도 1e와 비교하여 증가된 형광을 표시하는, WT-GFP 간세포 이식편을 받은 NSG-PiZ 마우스 간 절편의 형광 영상이다.
도 2는 패널 a, b, c, 및 d로 표지된 4개의 패널로 이루어진다. 도 2의 패널 (a) (도 2a)은 1,000,000개의 성숙한 인간 간세포로의 비장내 생착이 진행된 NSG 마우스 (원형; ●) 또는 NSG-PiZ 마우스 (삼각형; ▲)에서 측정된 혈청 인간 알부민의 평균 농도를 도시하는 그래프이다. x-축은 시간 (주)에 상응하고, y-축은 로그 눈금에 기준한 혈청 인간 알부민 농도 (mg/mL)에 상응한다. 오류 막대는 표준 오차에 상응한다. NSG-PiZ 마우스는 모든 시점에서 NSG 마우스보다 상당히 더 많은 인간 혈청 알부민을 표시하였다. 도 2의 패널 (b) (도 2b)은 부분 간절제술 (Phx) 이후에 1,000,000개의 성숙한 인간 간세포로의 비장내 생착이 진행된 NSG 마우스 (원형; ●) 또는 NSG-PiZ 마우스 (삼각형; ▲)에서 측정된 혈청 인간 알부민의 농도를 도시하는 그래프이다. x-축은 시간 (주)에 상응하고, y-축은 로그 눈금에 기준한 혈청 인간 알부민 농도 (mg/mL)에 상응한다. 오류 막대는 표준 오차에 상응한다. NSG-PiZ 마우스는 모든 시점에서 NSG 마우스보다 상당히 더 많은 인간 혈청 알부민을 표시하였다. 도 2의 패널 (c) (도 2c) 및 (d) (도 2d)은 인간 알부민에 대항한 면역염색을 이용하여 나타낸, 부분 간절제술 및 1,000,000개의 성숙한 인간 간세포로의 비장내 생착 후 10주의 NSG-PiZ 마우스 간의 영상이다.
도 3은 패널 a, b, c, d, e, 및 f로 표지된 6개 패널로 이루어진다. 도 3의 패널 (a) (도 3a)은 ELISA에 의해 정량화된 바와 같은 NSG-PiZ 마우스의 혈청 Z-AAT 농도를 도시하는 그래프이다. x-축은 마우스의 연령 (일)에 상응하고, y-축은 마우스에서 측정된 평균 혈청 Z-AAT 농도에 상응한다. 오류 막대는 표준 오차에 상응한다. 50일 군은 10마리 마우스로 이루어졌으며, 60일 군은 n=9이고, 72일 군은 n=27이고, 85일 군은 n=12이고, 95일 군은 n=17이고, 110일 군은 n=7이고, 115일 군은 n=3이고, 185일 군은 n=5이다. 도 3의 패널 (b) (도 3b)은 6주 연령에 디아스타제 내성 과아이오딘산 쉬프 (PASD)를 사용하여 염색된 NSG-PiZ 마우스 간 절편의 대표적인 영상이다. 증가된 염색은 증가된 소구체 (예를 들어, Z-AAT 응집체를 갖는 소구체)와 상관관계가 있다. 도 3의 패널 (c) (도 3c)은 14주 연령에서 PASD를 사용하여 염색된 NSG-PiZ 마우스 간 절편의 대표적인 영상이며, 이는 6주와 비교하여 덜한 염색을 표시한다. 도 3의 패널 (d) (도 3d)은 6주 연령에서 항-인간 AAT 항체로 면역염색된 NSG-PiZ 마우스 간 절편의 대표적인 영상이다. 도 3의 패널 (e) (도 3e)은 14주 연령에서 항-인간 AAT 항체로 면역염색된 NSG-PiZ 마우스 간 절편의 대표적인 영상이며, 이는 6주와 비교하여 덜한 염색을 표시하며, Z-AAT 응집이 덜하다는 것을 암시한다. 도 3의 패널 (f) (도 3f)은 인간 간세포로의 생착 시점 및 생착 후 7주에 NSG-PiZ 마우스에서 ELISA에 의해 정량화된 바와 같이, 상기 측정된 혈청 인간 알부민 농도와 상기 측정된 혈청 인간 Z-AAT 농도 간의 상관관계를 도시하는 그래프이다. 각각의 데이터 포인트는 30마리 마우스 중 하나에 상응한다.
도 4는 패널 a, b, c, 및 d로 표지된 4개의 패널로 이루어진다. 도 4의 패널 (a) (도 4a)은 각각 인간 간세포가 투여된 NSG-PiZ 마우스 군의 평균 혈청 인간 알부민 농도를 도시하는 그래프이다. x-축은 시간 (주)에 상응하고, y-축은 로그 눈금에 기준한 혈청 인간 알부민 농도 (mg/mL)에 상응한다. 열린 원형 (○)은 인간 간세포에 부가의 선택적 단점을 제공하지 않으면서 비장내 생착 (IE)을 받은 5마리의 NSG-PiZ 마우스에서 측정된 평균 혈청 인간 알부민 농도에 상응한다. 닫힌 원형 (●)은 부분 간절제술 (PHx) 후에 비장내 생착을 받은 5마리의 NSG-PiZ 마우스에서 측정된 평균 혈청 인간 알부민 농도에 상응한다. 엑스형 (x)는 50 mg/kg 복강내 모노크로탈린의 단일 용량 (1x MCT)을 받은 후 7일에 비장내 생착을 받은 4마리의 NSG-PiZ 마우스에서 측정된 평균 혈청 인간 알부민 농도에 상응한다. 삼각형 (▼)은 생착하기 14일 및 7일 전에 50 mg/kg 복강내 모노크로탈린의 2회 용량 (2x MCT)을 받은 후에 비장내 생착을 받은 6마리의 NSG-PiZ 마우스에서 측정된 평균 혈청 인간 알부민 농도에 상응한다. 사각형 (■)은 생착 (CD95) 시점에 1 μg 항-마우스 CD95 항체와 함께 비장내 생착을 받은 4마리의 NSG-PiZ 마우스에서 측정된 평균 혈청 인간 알부민 농도에 상응한다. 오류 막대는 표준 오차에 상응한다. 50 mg/kg 복강내 모노크로탈린의 2회 용량을 받은 마우스는 가장 큰 혈청 인간 알부민 농도를 표시하였다. 도 4의 패널 (b) (도 4b)은 생착에 앞서 50 mg/kg 복강내 모노크로탈린을 받은 NSG-PiZ 마우스로부터 생착 후 10주에 수득된 마우스 간 절편의 영상이다. 이러한 절편은 항-인간 알부민 항체를 사용하여 염색하였다. 도 4의 패널 (c) (도 4c)은 인간 간세포 이종이식편을 받은 마우스 상에서 수행된 2개의 유동 세포계수법 플롯으로 이루어진다. 우측 유동 세포계수법 플롯은 인간 HLA-ABC+ 형광 시그널 강도에 상응하는 x-축 및 측면 산란 펄스 폭에 상응하는 y-축을 갖는 산포도이다. 세포의 25.7%는 도시된 바와 같이 인간 HLA-ABC+로서 게이팅되었다. 게이팅된 세포 및 게이팅되지 않은 세포의 CD324+ 형광 시그널 강도는 좌측 유동 세포계수법 플롯의 오른쪽 트레이스(trace)와 왼쪽 트레이스에 각각 도시된다. 좌측 유동 세포계수법 플롯은 CD324+ 형광 시그널 강도에 상응하는 x-축 및 세포 카운트에 상응하는 y-축을 갖는 히스토그램이다. 도 4의 패널 (d) (도 4d)은 인간 간세포로의 생착 후 10주에 다양한 마우스에서 측정된 혈청 인간 AAT 농도 (mg/mL) (y-축)를 도시하는 차트이다. x-축 표지는 상이한 마우스 군에 상응하고, 각각의 데이터 포인트는 상이한 마우스에 상응한다. 실선의 수평선은 각각의 군에 대한 평균 값을 도시하고, 오류 막대는 표준 오차에 상응한다. 점선은 572 μg/mL 하에 놓여졌다. "대조군" 마우스는 간세포 이종이식편을 받지 않은 NSG-PiZ 마우스이다. "IE" 마우스는 마우스 간세포에 부가의 선택적 단점을 제공하지 않으면서 비장내 생착 (IE)을 받은 NSG-PiZ 마우스이다. "PHx" 마우스는 부분 간절제술 후에 비장내 생착을 받은 NSG-PiZ 마우스이다. "MCT" 마우스는 50 mg/kg 복강내 모노크로탈린을 받은 후에 비장내 생착을 받은 NSG-PiZ 마우스이다.
도 5는 패널 a, b, c, d, e, 및 f로 표지된 6개 패널로 이루어진다. 도 5의 패널 (a) (도 5a)은 인간 AAT를 표적으로 하는 인공 miRNA, 및 c-Myc 태그를 수반한 miRNA-탈표적화된 인간 AAT 서열을 함유하는 프로모터 없는 이중-기능 카세트로 패키지된 재조합 AAV8 벡터의 조직을 도시하는 카툰이다. 상기 카세트는 알부민 로커스에 대해 1.1-1.3 킬로염기의 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 도 5의 패널 (b) (도 5b)은 ddPCR에 의해 측정된 바와 같은 알부민-알파-1 항트립신 융합된 전사체/뮤린 알부민 전사체 비율을 도시하는 그래프이다 (대조군 n=3, 10wk n=3, 16wk n=5). 도 5의 패널 (c) (도 5c)은 ELISA에 의해 측정되고 연령-매칭된 대조군의 평균에 대해 정규화된 바와 같은 상대적 M-AAT-c-Myc 혈청 농도를 도시하는 그래프이다 (대조군 n=6, 처리군 n=10). 도 5의 패널 (d) (도 5d)은 항-c-Myc 항체를 사용하여 면역염색된 마우스 간의 영상으로 이루어지며, 각각의 군으로부터의 2마리의 대표적인 마우스가 도시된다 (눈금 막대=2 mm). 도 5의 패널 (e) (도 5e)은 항-c-Myc 면역염색된 마우스 간에서 관찰된 c-Myc 양성 세포의 수를 도시하는 그래프이다 (대조군 n=3, 10wk n=3, 16wk n=6). 도 5의 패널 (f) (도 5f)은 ELISA에 의해 측정되고 연령-매칭된 대조군의 평균에 대해 정규화되며 침묵의 백분율로서 제시된 평균 상대적 Z-AAT 혈청 농도를 도시하는 그래프이다 (wk8 n=9, wk11-wk16 n=10). 각각의 군에서의 오류 막대는 표준 오차에 상응한다.
단수형 용어는 제한하려는 것이 아니며, 달리 명백히 언급되지 않는 한 또는 문맥상 달리 명확히 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면은 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가, 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체를 발현하지 않는 인간 간세포의 생착을 위한 유리한 환경을 제공한다는 발견에 관한 것이다. 본원에서 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스로 지칭되는 본 발명의 마우스는, 예를 들어, 인간 간 기능 및 질환의 모델로서 유용하다. 본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 유지 약물 요법 없이 번식 및 생존하고, 또한 종종 특이적 AAV 캡시드 변이체에 대한 자신의 지향성에 있어서 마우스 간세포와 상이한 인간 간세포를 형질도입하기 위해 최적의 벡터를 확인하기 위한 생체 내 모델로서 사용될 수 있다. 인간 간세포 이종이식편을 포함한, 본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 또한, 생체 내 유도 진화 연구를 위한 도구로서 유용하다.
본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체, 예컨대 인간 α-1 항트립신의 Glu342Lys 변이체를 발현한다.
면역결핍 마우스에서의 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)의 발현이, 간세포 이종이식편에 대한 놀랍게도 유용한 선택적 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 일부 측면은 Z-AAT를 발현하고 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다. 본 발명의 일부 측면은 Z-AAT를 발현하고 인간 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다.
본원에 사용된 과학적 및 기술적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 이러한 용어는 하기를 예시적으로 포함한 다양한 표준 참고문헌에서 문맥상 정의되고 사용된다 [A. Nagy, M. Gertsenstein, K. Vintersten, R. Behringer, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919; Kursad Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002;185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; Ausubel (Ed.), Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, 5th Ed., 2002; Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002; Nelson and Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; 및 Herdewijn (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004].
용어 "이종"은 "이종"으로서 언급된 물질이 특정 숙주 세포 또는 유기체의 종 이외의 또 다른 종으로부터 유래된다는 것을 표시하기 위해 그러한 숙주 세포 또는 유기체와 관련하여 본원에 사용된다. 이종 물질은, 예를 들어, 실질적으로 인간 게놈을 갖는 인간 단백질 또는 세포를 코딩하는 유전자를 포함한, 인간 물질일 수 있다.
용어 "동종이계"는 "동종이계"로서 언급된 물질이 특정 숙주 세포 또는 유기체의 종과 동일한 종으로부터 유래된다는 것을 표시하기 위해 그러한 숙주 세포 또는 유기체와 관련하여 본원에 사용된다. 숙주 마우스 내로 도입된 동종이계 물질은 마우스로부터 유래되며, 예를 들어, 실질적으로 뮤린 게놈을 갖는 뮤린 단백질 또는 세포를 코딩하는 유전자를 포함한다.
용어 "포함하는"은 개방 군을 지칭하며, 예를 들어, 구성원 A, B 및 C를 포함하는 군은 부가의 구성원을 포함할 수도 있다. 용어 "이루어지는"은 폐쇄 군을 지칭하며, 예를 들어, 구성원 A, B 및 C로 이루어진 군은 임의의 부가 구성원을 포함하지 않는다.
유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스
유전적으로 변형된 면역결핍 마우스가 본 발명의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스의 게놈은 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 코딩하고, 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체는 인간 α-1 항트립신 단백질의 아미노산 서열 내의 아미노산 위치 342에서 글루타메이트를 리신으로 치환한 것 (Glu342Lys)을 갖는다: 서열식별번호(SEQ ID NO): 1.
서열식별번호: 1
인간 Z-AAT 단백질 (시그널 펩티드를 수반하지 않음) - Glu342Lys
Figure pct00001
특정한 측면에서, Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스의 세포의 게놈 내로 통합된다. 예를 들어, Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스의 생식세포 계열 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 마우스의 자손으로 상속할 수 있게 한다.
본 발명의 다양한 측면은 그의 게놈이 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다. 인간 α-1 항트립신 단백질의 인간 PiZ 변이체 (Z-AAT)는 본원에서 서열식별번호: 1로서 확인되고, 그의 변이체가 본 발명에 유용하다.
본 발명의 특정한 측면은 그의 게놈이, 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열과의 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 측면은 그의 게놈이, 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다.
본 발명의 측면에 따라서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열과의 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 Z-AAT를 코딩하는 mRNA를 발현한다. 특정한 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 mRNA를 발현한다.
본 발명의 측면에 따라서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열과의 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 Z-AAT 단백질을 발현한다. 본 발명의 측면에 따라서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 수반한 단백질을 발현한다.
본 발명의 측면에 따르는 면역결핍 PiZ 마우스는 그의 게놈 내에, 프로모터와 작동가능하게 연결된 Z-AAT를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 Z-AAT는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열, 또는 고도로 엄격한 혼성화 조건하에 서열식별번호: 2와 혼성화되는 핵산의 보체에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 유전 코드의 축퇴 성질로 인해, 대체 핵산 서열이 Z-AAT 및 그의 변이체를 코딩한다는 것과, 이러한 대체 핵산이 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
서열식별번호: 2
인간 Z-AAT 단백질 (시그널 펩티드를 수반하지 않음) - Glu342Lys을 코딩함
Figure pct00002
2개 아미노산 서열 또는 2개 뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적을 위하여 이들 서열을 정렬시킨다 (예를 들어, 정렬 소프트웨어 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용하여 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과의 최적의 정렬을 위하여 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 내에 갭을 도입할 수 있음). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 특정 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 상기 서열들은 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 정렬 위치의 수 ÷ 정렬 위치의 총 수 · 100%). 일부 실시양태에서, 2개 서열은 동일한 길이를 갖는다.
2개 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개 서열의 비교를 위해 활용된 수학적 알고리즘의 비-제한적 예는 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, PNAS USA 87:2264-68]의 알고리즘, 예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, PNAS USA 90:5873-77]에서 변형된 바와 같은 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해, 예를 들어, 스코어=100, 워드 길이=12에 대한 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트를 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해, 예를 들어, 스코어 50, 워드 길이=3에 대한 XBLAST 프로그램 파라미터 세트를 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭이 있는 BLAST를 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-02]에 기재된 바와 같이 활용할 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST를 사용하여, 분자 간의 먼 관계를 검출하는 반복된 검색을 수행할 수 있다 (상기 문헌 참조). BLAST, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI Blast를 활용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용한다 (예를 들어, NCBI 웹사이트 참조). 서열을 비교하기 위해 활용된 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비-제한적 예는 문헌 [Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 활용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12, 및 갭 패널티 4가 사용된다. 클러스탈(Clustal) 소프트웨어 프로그램 세트는 서열을 정렬하여 퍼센트 서열 동일성을 결정하는 부가의 방법을 제공한다.
2개 서열 간의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않는 상기 기재된 것들과 유사한 기술을 사용하여 결정된다. 퍼센트 동일성을 계산하는데 있어서, 단지 정확한 매칭만을 전형적으로 카운트한다.
용어 "혼성화" 및 "혼성화한다"는 상보적 핵산의 쌍 형성 및 결합을 지칭한다. 혼성화는, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은, 핵산의 상보성 정도, 핵산의 융점 Tm, 및 혼성화 조건의 엄격도와 같은 요인에 따라서 두 핵산 간에 다양한 정도로 발생한다. 용어 "혼성화 조건의 엄격도"는 포름아미드 및 덴하르트 용액과 같은 특정한 통상의 부가제와 관련한 혼성화 배지의 조성, 온도 및 이온 강도의 조건을 지칭한다. 명시된 핵산과 관련된 특정한 혼성화 조건의 결정은 일상적이며 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; 및 F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002]에 기재된 바와 같다. 고도로 엄격한 혼성화 조건은 실질적으로 상보적인 핵산의 혼성화만을 허용하는 것이다. 전형적으로, 약 85-100% 상보성을 갖는 핵산은 고도로 상보적인 것으로 간주되며, 고도로 엄격한 조건하에 혼성화된다. 중간 수준의 엄격한 조건은 중간 수준의 상보성인 약 50-84% 상보성을 갖는 핵산 뿐만 아니라 고도의 상보성을 갖는 핵산이 혼성화되는 조건으로서 예시된다. 대조적으로, 낮은 엄격도 혼성화 조건은 낮은 정도의 상보성을 갖는 핵산이 혼성화되는 조건이다.
용어 "특이적 혼성화" 및 "특이적으로 혼성화하는"은 표적 핵산에 대한 특정한 핵산의 혼성화를 지칭하며, 샘플 중의 표적 핵산 이외의 핵산과는 실질적으로 혼성화되지 않는다.
혼성화의 엄격도 및 세척 조건은, 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같은, 프로브 및 표적의 Tm, 및 혼성화 및 세척 조건의 이온 강도를 포함한 여러 요인에 좌우된다. 혼성화, 및 원하는 혼성화 엄격도를 달성하기 위한 조건은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 및 Ausubel, F. et al., (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002]에 기재되어 있다.
돌연변이는 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발을 사용하여 도입될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 Z-AAT의 기능적 특성을 변경시키지 않으면서 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이다. Z-AAT를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 특정한 마우스에 대한 코돈 용법을 최적화하기 위해 또는 예컨대, 제한 부위를 부가 또는 결실시키거나 또는 클로닝, 증폭 및/또는 서열 결정하는데 있어서 문제가 있는 서열을 변형시키기 위해 편의상, Z-AAT를 코딩하는 유전자 및/또는 mRNA로부터 변경될 수 있다.
보존적 아미노산 치환이 Z-AAT 단백질 내에서 이루어져서 Z-AAT 변이체를 생산할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것으로 관련 기술분야에서 인식된다. 예를 들어, 각각의 아미노산은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 것으로서 기재될 수 있다: 전기 양성, 전기 음성, 지방족, 방향족, 극성, 소수성 및 친수성. 보존적 치환은 명시된 구조적 또는 기능적 특징을 갖는 하나의 아미노산을, 동일한 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트를 포함하고; 염기성 아미노산은 히스티딘, 리신, 아르기닌을 포함하며; 지방족 아미노산은 이소류신, 류신, 및 발린을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함하며; 극성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 및 티로신을 포함하고; 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 발린, 및 트립토판을 포함하며; 보존적 치환은 각각의 군 내에서의 아미노산들 간의 치환을 포함한다. 아미노산은 또한, 입체 또는 상대적 크기의 관점에서 기재될 수 있으며, 예를 들어, 알라닌, 시스테인, 아스파르테이트, 글리신, 아스파라긴, 프롤린, 트레오닌, 세린, 및 발린이 모두 전형적으로, 작은 것으로 간주된다.
용어 "핵산"은 단일-가닥, 이중-가닥, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한 임의의 형태의 2개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드 서열"은 핵산 내의 뉴클레오티드의 순서를 지칭한다.
Z-AAT를 코딩하는 핵산 및 그의 변이체는 널리 공지된 방법론을 사용하여 재조합적으로 또는 합성적으로 단리 또는 생성될 수 있다.
본 발명의 특정한 측면에서, Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적 프로모터일 수 있다. 특정한 측면에서, 프로모터는 숙주 마우스 (예를 들어, 면역결핍 마우스)에서의 유전자 발현을 구동시킬 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 CAG 프로모터일 수 있다. CAG 프로모터는 시토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소 ("C"), 치킨 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론 ("A"), 및 토끼 베타-글로불린 유전자의 스플라이스 수용체 ("G")를 포함한다. CAG 프로모터는 널리 공지되어 있고, 마우스 세포에서 강력한 발현을 표시한다 (예를 들어, 문헌 [Jun-ichi et al., 1989, Gene, 79(2):269] 참조). CAG 프로모터는, 예를 들어, 엑손을 제거하도록 변형될 수 있다. 시토메갈로바이러스 (CMV) 즉발형 프로모터 및 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터를 포함한 다른 프로모터가 마우스에서의 강력한 유전자 발현을 구동시키는 것으로 공지되어 있다 (그의 각각이 본 발명의 다양한 실시양태에 사용될 수 있음). 유전자를 설계하고 프로모터를 트랜스제닉 구축물에 위치 설정하는 방법이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Haruyama et al., 2009, Curr. Protoc. Cell Biol., 19.10] 참조).
본 발명의 특정한 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스는 그의 게놈 내에, 구성적 프로모터와 작동가능하게 연결되는 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
그의 게놈이 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 발현 카세트를 포함하는, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스가 본 발명의 측면에 따라서 제공되며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널과 작동가능하게 연결되고, 여기서 마우스는 상기와 같이 코딩된 Z-AAT를 발현한다.
용어 "발현 구축물" 및 "발현 카세트"는 원하는 코딩 서열 (예를 들어, Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)을 함유하고, 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요하거나 또는 이의 발현에 바람직한 하나 이상의 조절 요소를 함유하는 이중 가닥 재조합 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 요소"는 뉴클레오티드 서열의 발현의 일부 측면을 제어하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예시적인 조절 요소는 예시적으로, 뉴클레오티드 서열의 복제, 전사, 및 전사 후 프로세싱에 기여하는, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 인트론, 복제 기점, 폴리아데닐화 시그널 (pA), 프로모터, 전사 종결 서열, 및 상류 조절 도메인을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 발현 구축물에 이들 및 다른 조절 요소를 선택하고 사용할 수 있다. 발현 구축물은 널리 공지된 방법론을 사용하여 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 있다는 것을 지칭한다.
발현 카세트 내에 포함된 조절 요소는 프로모터일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 전사될 코딩 뉴클레오티드 서열, 예컨대 원하는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 조절 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 일반적으로, 전사될 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치하고, RNA 폴리머라제에 의한 특이적 결합을 위한 부위 및 다른 전사 인자를 제공한다. 본 발명의 특정한 측면에서, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 본 발명의 특정한 측면에서, 프로모터는 유비쿼터스, 조직-특이적 또는 세포-유형 특이적 발현을 제공한다.
발현 구축물에 포함될 수 있는 유비쿼터스 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK-1) 프로모터, 베타-액틴 프로모터, ROSA26 프로모터, 열 충격 단백질 70 (Hsp70) 프로모터, EF-1 알파 유전자 코딩 신장 인자 1 알파 (EF-1) 프로모터, 진핵 개시 인자 4A (eIF-4A1) 프로모터, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 프로모터, 및 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
발현 구축물에 포함될 수 있는 조직-특이적 프로모터는 간세포에 의해 발현된 유전자의 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
문헌 [Abboud et al., 2003, J. Histochem & Cytochem., 51(7):941-49; Schorpp et al., 1996, Nucl. Acids Res., 24(9):1787-88; McBurney et al., 1994, Devel. Dynamics, 200:278-93; 및 Majumder et al., 1996, Blood, 87(8):3203-11]에 예시된 바와 같은 이들 및 다른 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
프로모터 외에도, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) 초기 인핸서 요소 및 SV40 인핸서 요소이지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 인핸서 서열이 포함될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면에서, 부가적으로 포함된 서열은 인트론 서열, 예컨대 베타 글로빈 인트론 또는 제네릭 인트론, 전사 종결 서열, 및 mRNA 폴리아데닐화 (pA) 서열 (예컨대, SV40-pA, 베타-글로빈-pA, 및 AAT-pA이지만 이에 제한되지는 않음)을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면에서, 발현 구축물은 박테리아 세포에서의 증폭을 위해 필요한 서열, 예컨대 선별 마커 (예를 들어, 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자) 및 복제 기점을 포함한다.
발현 구축물은 착상 전의 마우스 배아인 수정 마우스 난모세포 내로 도입되거나 또는 마우스 줄기 세포 (배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포) 내로 도입되어, 널리 공지된 방법을 사용하여 유전적으로 변형된 마우스를 생성할 수 있다.
발현 구축물을 마우스 착상 전의 배아 내로 도입하는 방법의 경우, 이러한 발현 구축물은 상기 배아 내로의 주사 전에 선형화될 수 있다.
바람직하게, 발현 구축물은 수정 난모세포 내로 주사된다. 수정 난모세포는 교배 후 일 (교배 후 0.5일)에 과잉 배란된 암컷으로부터 수집하고, 그를 발현 구축물과 함께 주사한다. 이와 같이 주사된 난모세포는 밤새 배양하거나 또는 교배 후 0.5일 가임신 암컷의 난관 내로 직접 옮긴다. 과잉 배란, 난모세포의 수거, 발현 구축물 주사 및 배아 전달을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919]에 기재되어 있다. 그 자손은 DNA 분석, 예컨대 PCR, 서던 블롯 또는 뉴클레오티드 서열 결정에 의해 Z-AAT 트랜스진의 존재에 관하여 시험할 수 있다. 이러한 트랜스진을 보유하는 마우스는, 예컨대 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 단백질 발현에 관하여 시험할 수 있다.
대안적으로, 발현 구축물은 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전 또는 리포펙션에 의해 도입된다. 이어서, 상기 세포는 DNA 분석, 예컨대 PCR, 서던 블롯 또는 뉴클레오티드 서열 결정에 의해 트랜스진 통합에 관하여 스크리닝된다. 정확한 통합을 수반한 세포는, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 Z-AAT에 대한 단백질 분석에 의해 기능적 발현에 관하여 시험될 수 있다.
배아 줄기 세포는 특정한 세포주에 대하여 최적화된 배지에서 성장된다. 전형적으로, 배아 줄기 세포 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중의 15% 태아 소 혈청 (FBS) 또는 합성 또는 반합성 등가물, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.1 mM 비필수 아미노산, 50 U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 및 1000 U/ml LIF (플러스; 일부 세포주의 경우, 분화의 화학적 억제제)를 함유한다. 상세한 설명이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Tremml et al., 2008, Current Protocols in Stem Cell Biology, Chapter 1:Unit 1C.4). 배아 줄기 세포 분화의 억제제에 관한 고찰을 위해서는, 문헌 [Buehr et al., 2003, Genesis of embryonic stem cells, Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 358:1397-1402]을 참조할 수 있다.
상기 발현 구축물이 혼입된 것으로 선별된 세포는 착상 전 배아 내로 주사될 수 있다. 미세주사의 경우, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포는 트립신과 EDTA의 혼합물을 사용한 다음, 배아 줄기 세포 배지에 재현탁시켜 단일 세포가 되게 한다. 단일 세포의 군은 미세하게 인출된 유리 바늘 (20-25 마이크로미터 내경)을 사용하여 선별하고, 미세 조작기가 장착된 도립 현미경을 사용하여 배아의 투명대를 통하여 배반포 강 (포배강) 내로 도입된다. 줄기 세포는 또한, 초기 단계 배아 (예를 들어, 2-세포, 4-세포, 8-세포, 상실배 전 또는 상실배) 내로 주사될 수 있다. 주사는 투명대를 개방하기 위해 구멍을 뚫는 레이저 또는 피에조 펄스의 도움을 받을 수 있다. 배반포 또는 8-세포 단계 배아당 대략 9-10개의 선별된 줄기 세포 (배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포), 4-세포 단계 배아당 6-9개의 줄기 세포, 및 2-세포 단계 배아당 약 6개의 줄기 세포가 주사된다. 줄기 세포 도입 후, 배아는 가임신 수용자 암컷 내로 옮기기 전에, 질소 중 5% O2, 5% CO2에서 37℃ 하에 여러 시간 동안 회수될 수 있거나 또는 밤새 배양된다. 줄기 세포 주사에 대한 추가의 대안에서는, 줄기 세포가 상실배 단계 배아와 함께 응집될 수 있다. 이들 방법 모두는 널리 확립되어 있고, 그를 사용하여 줄기 세포 키메라를 생산할 수 있다. 보다 상세한 설명에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Nagy, Gertsenstein, Vintersten, and Behringer, Cold Spring Harbor Laboratory Press, December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919]을 참조할 수 있고; 또한, 문헌 [Nagy et al., 1990, Development 110:815-821; Kraus et al., 2010, Genesis 48:394-399]; 및 미국 특허 번호 7,576,259, 7,659,442, 및 7,294,754를 참조할 수 있다.
가임신 배아 수용자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조된다. 간략하게 언급하면, 6-8주령의 가임 암컷 마우스를, 정관절제술을 받았거나 또는 피임 수컷과 교배시켜, 외과적으로 도입된 배아를 지지하는데 도움이 되는 호르몬 상태를 유도시킨다. 교배 후 2.5일 (2.5 dpc)에, 배반포를 함유하는 15개 이하의 줄기 세포를 자궁-난관 접합부에 매우 가까운 자궁각 내로 도입한다. 초기 단계 배아 및 상실배에 대해서는, 이러한 배아를 시험관 내에서 배반포로 배양하거나, 또는 배아 단계에 따라서 0.5 dpc 또는 1.5 dpc 가임신 암컷의 난관 내로 착상시킨다. 착상된 배아로부터의 키메라 새끼는 착상시 배아 연령에 따라 전달 후 16-20일에 태어난다. 키메라 수컷이 번식을 위해 선택된다. 자손은, 예를 들어, 코트 색 및 유전적 분석, 예컨대 PCR, 서던 블롯 또는 뉴클레오티드 서열 결정에 의해 배아 줄기 세포 게놈의 전달에 관하여 분석될 수 있다. (예를 들어, Z-AAT의) 단백질 발현은 단백질 분석 (웨스턴 블롯, ELISA) 또는 다른 기능적 검정에 의해 분석될 수 있다. Z-AAT 트랜스진을 발현하는 자손은 이종 교배시켜, 이러한 트랜스진에 대해 동형접합성인 마우스를 창출할 수 있다. 트랜스제닉 마우스를 면역결핍 마우스와 교배시켜, Z-AAT 트랜스진을 발현하는 유사유전자형 면역결핍 계통을 창출할 수 있다.
Z-AAT 트랜스진은 또한, Hprt 또는 Rosa26 로커스와 같은 신뢰성 있는 발현을 초래하는 것으로 공지되는 줄기 세포 게놈의 특이적 로커스로 표적화될 수 있다. 표적화된 트랜스제닉을 위하여, 재조합 DNA 기술을 사용하여 표적화 구축물을 만들 수 있다. 표적화 구축물은 임의로, 내인성 유전자 표적과 상동인 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있다. 표적화 구축물은 임의로, 예를 들어, 선별성 마커, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 히그로마이신 또는 퓨로마이신, Z-AAT를 코딩하는 핵산, 및 폴리아데닐화 시그널을 추가로 포함할 수 있다. 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 정확한 전사 및 번역을 보장하기 위해, 예를 들어, 이러한 서열은 내인성 유전자 로커스와 동일 프레임 내에 있거나, 또는 스플라이스 수용체 부위 및 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열이 포함된다. 이러한 표적화 구축물은 줄기 세포 내로 형질감염될 수 있고, 줄기 세포는 PCR, 서던 블롯, 또는 뉴클레오티드 서열 결정을 이용하여 상동 재조합 현상을 검출하기 위해 스크리닝될 수 있다. 정확한 상동 재조합 현상을 수반하는 세포는 단백질 분석, 예컨대 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 트랜스진 발현에 관하여 추가로 분석될 수 있다. 원하는 경우, 선별성 마커는, 예를 들어, 줄기 세포를 Cre 레콤비나제로 처리함으로써 제거될 수 있다. Cre 레콤비나제 처리 후, 상기 세포는 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재에 관하여 분석된다. 정확한 게놈 현상을 수반한 세포를 선별하고, 그를 상기 기재된 바와 같이 착상 전 배아 내로 주사할 수 있다. 키메라 수컷이 번식을 위해 선택된다. 자손은 코트 색 및 유전적 분석, 예컨대 PCR, 서던 블롯, 또는 뉴클레오티드 서열 결정에 의해 배아 줄기 세포 게놈의 전달에 관하여 분석될 수 있고, 이들은, 예컨대 단백질 분석 (웨스턴 블롯, ELISA) 또는 다른 기능적 검정에 의해 단백질 발현에 관하여 시험될 수 있다. 상기 단백질을 발현하는 자손은 이종 교배시켜, 상기 트랜스진에 대해 동형접합성인 마우스를 창출할 수 있다. 트랜스제닉 마우스를 면역결핍 마우스와 교배시켜, 상기 트랜스진을 수반한 유사유전자형 면역결핍 계통을 창출할 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태는 실질적으로 모든 자신의 세포에 Z-AAT 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 마우스 뿐만 아니라 자신의 세포 모두는 아니지만, 일부에 Z-AAT 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 마우스를 제공한다. 본 발명의 특정한 측면에서, Z-AAT 트랜스진의 하나 또는 다수의 카피 (예컨대 콘카타머)가 상기 트랜스제닉 마우스의 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
다양한 방법 중 임의의 것을 사용하여, Z-AAT 트랜스진을 마우스 내로 도입하여 Z-AAT를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생산할 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 전핵 미세주사 및 배아 줄기 세포의 형질전환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 트랜스제닉 마우스를 생성하는 방법은 문헌 [Sundberg and Ichiki, (Eds.), Genetically Engineered Mice Handbook, CRC Press, 2006; Hofker and van Deursen, (Eds.), Transgenic Mouse Methods and Protocols, Humana Press, 2002; Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919; Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002, 185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 978047015180; Meyer et al., PNAS USA, 107 (34):15022-26]에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
상동성-기반 재조합 유전자 변형 전략, 예컨대 귀소 엔도뉴클레아제, 인테그라제, 메가뉴클레아제, 트랜스포손, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용하는 뉴클레아제 매개된 프로세스, 전사 활성화제-유사 (TAL), 클러스터된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복 서열 (CRISPR)-Cas, 또는 드로소필라 재조합-연관 단백질 (DRAP) 접근법을 사용하여, 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산, 예를 들어, hSCF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, hGM-CSF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, hIL-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 hCSF1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 면역결핍 마우스의 게놈 내로 도입하여 "녹인"시킴으로써 면역결핍 마우스를 유전적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cerbini et al., PLoS One. 2015; 10(1): e0116032; Shen et al., PLoS ONE 8(10): e77696; 및 Wang et al., Protein & Cell, February 2016, Volume 7, Issue 2, pp 152-156]을 참조할 수 있다.
면역결핍
용어 "면역결핍 마우스"는 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는 마우스를 지칭한다: 기능적 면역 세포, 예컨대 T 세포 및 B 세포의 결여; DNA 복구 결함; 림프구 상의 항원-특이적 수용체를 코딩하는 유전자의 재배열에 있어서의 결함; 및 면역 기능적 분자, 예컨대 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA의 결여. 면역결핍 마우스는 면역 기능에 관여하는 유전자, 예컨대 Rag1 및 Rag2에 있어서의 하나 이상의 결핍을 특징으로 할 수 있다 (Oettinger, M.A et al., Science, 248:1517-1523, 1990; 및 Schatz, D. G. et al., Cell, 59:1035-1048, 1989). 면역결핍 마우스는 이러한 마우스에서의 비정상적인 면역 기능을 초래하는 이들 또는 다른 결함 중 임의의 것을 가질 수 있다.
특정한 측면에 따라서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 이러한 마우스가 결함있는 내인성 인터류킨-2 수용체 γ 서브유닛 및/또는 감소된 양의 내인성 인터류킨-2 수용체 γ 서브유닛을 발현하도록 해주는 인터류킨-2 수용체 γ 서브유닛 (IL-2RG)을 코딩하는 그의 내인성 유전자에 있어서의 결함을 갖거나, 또는 상기 마우스는 내인성 인터류킨-2 수용체 γ 서브유닛을 전혀 발현할 수 없다. 상기 마우스는 임의로 IL-2RG 널일 수 있으므로, 기능적 내인성 IL- 2rg 유전자가 결여된다.
추가 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 이러한 마우스가 결함있는 내인성 DNA-의존성 단백질 키나제, 촉매 서브유닛 및/또는 감소된 양의 내인성 DNA-의존성 단백질 키나제, 촉매 서브유닛을 발현하도록 해주는 DNA-의존성 단백질 키나제, 촉매 서브유닛 (Prkdc)을 코딩하는 그의 내인성 유전자에 있어서의 결함을 갖거나, 또는 상기 마우스는 내인성 DNA-의존성 단백질 키나제, 촉매 서브유닛을 전혀 발현하지 않을 수 있다. 상기 마우스는 임의로, Prkdc 널일 수 있으므로, 기능적 내인성 Prkdc 유전자가 결여된다.
유전자 및 이들이 코딩하는 단백질과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "내인성"은 그들의 천연 유전자 로커스에서 마우스의 게놈에 존재하는 유전자를 지칭한다.
본 발명의 다양한 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 기능적인 내인성 IL- 2Rg 및 Prkdc 유전자가 결여되는, IL- 2rg 널 및/또는 Prkdc 널이다. 상기 마우스는 임의로, Prkdc 녹아웃 및/또는 IL- 2rg 녹아웃을 포함할 수 있다. 본 발명의 다양한 측면에서, 상기 마우스는 IL- 2rg, Prkdc, 또는 IL-2rg와 Prkdc 둘 다를 발현하지 않는다.
본 발명의 다양한 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 중증 복합 면역결핍증을 갖고 있다. 용어 "중증 복합 면역결핍증" 또는 "SCID"는 T 세포의 부재 및 B 세포 기능의 결여를 특징으로 하는 병태를 지칭한다.
통상적인 형태의 SCID는 IL- 2rg 유전자에 있어서의 감마 쇄 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(-)를 특징으로 하는 X-연관 SCID; 및 상염색체 열성 SCID를 포함한다. 상염색체 열성 SCID는 Jak3 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(-), ADA 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(-), IL-7R 알파-쇄 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+), CD3 델타 또는 엡실론 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+), RAG1/RAG2 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(+), 아르테미스(Artemis) 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(+), 및 CD45 유전자 돌연변이 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+)를 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 측면에 따라서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 scid 돌연변이로서 통상적으로 지칭되는, 중증 복합 면역결핍증 돌연변이 (Prkdc scid )를 갖는다. scid 돌연변이는 널리 공지되어 있고, 문헌 [Bosma et al., 1989, Immunogenetics 29:54-56]에 기재된 바와 같이 마우스 염색체 16 상에 위치한다. scid 돌연변이에 대해 동형접합성인 마우스는 기능적 T 세포 및 B 세포의 부재, 림프구 감소증, 저글로불린혈증 및 정상 조혈 미세 환경을 특징으로 한다. scid 돌연변이는, 예를 들어, 널리 공지된 방법, 예컨대 PCR 또는 유동 세포계수법을 사용하여 scid 돌연변이에 대한 마커를 검출함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 측면에 따르는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스는 IL-2 수용체 감마 쇄 결핍증을 갖는다. 용어 "IL-2 수용체 감마 쇄 결핍증"은 감소되거나 또는 기능장애를 일으킨 IL-2 수용체 감마 쇄를 지칭한다. 감소된 IL-2 수용체 감마 쇄는 유전자 결실 또는 돌연변이에 기인할 수 있다. 감소된 IL-2 수용체 감마 쇄는, 예를 들어, 널리 공지된 방법을 사용하여 IL-2 수용체 감마 쇄 유전자 결실 또는 돌연변이를 검출하고/하거나 감소된 IL-2 수용체 감마 쇄 발현을 검출함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 측면에 따르는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스는 중증 복합 면역결핍증을 갖거나, 또는 중증 복합 면역결핍증과 조합하여 IL-2 수용체 감마 쇄 결핍증을 가지며, 여기서 상기 마우스의 게놈은 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 측면에 따르는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스는 scid 돌연변이를 갖거나, 또는 scid 돌연변이와 조합하여 IL-2 수용체 감마 쇄 결핍증을 가지며, 여기서 상기 마우스의 게놈은 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면에서, 상기 면역결핍 마우스는 유전적으로 변형된 NSG 마우스, 유전적으로 변형된 NRG 마우스 또는 유전적으로 변형된 NOG 마우스이며, 여기서 유전적으로 변형된 NSG, NRG 또는 NOG 마우스의 게놈은 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "NOD scid 감마", "NOD-scid IL2rg 널 " 및 "NSG"는 문헌 [Shultz LD et al., 2005, J. Immunol, 174:6477-89]에 상세히 기재된, 널리 공지된 면역결핍 마우스 계통 NOD.Cg-Prkdc scid IL- 2rg tm1Wjl /SzJ를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. NSG 마우스는 NOD/ShiLtJ 배경으로부터의 다중 면역결핍, 중증 복합 면역결핍증 (scid) 돌연변이, 및 인터류킨-2 수용체 감마 쇄의 완전 녹아웃을 조합한다. 그 결과로서, NSG 마우스에는 성숙한 마우스 T, B, 및 NK 세포가 결여되고, 이들은 마우스 시토카인 시그널링 경로에 있어서 결핍성이다. NSG 마우스는 마우스 IL-2R-γ (감마 c) 발현의 결여, 검출가능한 마우스 혈청 이뮤노글로불린의 부재, 마우스 용혈성 보체의 부재, 성숙한 마우스 T 림프구의 부재, 및 성숙한 마우스 자연 킬러 세포의 부재를 특징으로 한다.
Z-AAT를 발현하는 NSG 마우스는 "NSG-PiZ" 마우스로서 지칭되며, 이는 유전적으로 변형된 NSG 마우스의 게놈이 NOD.Cg-Prkdc scid IL- 2rg tm1Wjl /SzJ 배경 상에 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 마우스가 Z-AAT를 발현한다는 것을 표시한다.
NRG 마우스는 문헌 [Shultz LD et al., 2008 Clin Exp Immunol 154(2):270-84]에 상세히 기재된, NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Il2rg tm1Wjl /SzJ로서 널리 공지되어 있다. Z-AAT를 발현하는 NRG 마우스는 "NRG-PiZ" 마우스로서 지칭되며, 이는 유전적으로 변형된 NRG 마우스의 게놈이 NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Il2rg tm1Wjl /SzJ 배경 상에 Z-AAT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 마우스가 Z-AAT를 발현한다는 것을 표시한다.
NOG 마우스는 문헌 [Ito, M. et al., Blood 100, 3175-3182 (2002)]에 상세히 기재된, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug /JicTac로서 널리 공지되어 있다. Z-AAT를 발현하는 NOG 마우스는 "NOG-PiZ" 마우스로서 지칭되며, 이는 유전적으로 변형된 NOG 마우스의 게놈이 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug /JicTac 배경 상에 Z-AAT 트랜스제닉 마우스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 마우스가 Z-AAT를 발현한다는 것을 표시한다.
간세포 이종이식편 및 동종이식편
본 발명의 측면에 따라서, 본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 갖는다. 이종이식편은, 예를 들어, 인간 간세포를 포함한 인간 이종이식편일 수 있다. 동종이식편은, 예를 들어, 상이한 마우스로부터의 마우스 간세포를 포함한 동종이식편일 수 있다.
간세포는 다양한 공급원 중 임의의 것, 예컨대 1차 간세포 또는 형질전환된 간세포 세포주로부터의 것일 수 있다.
본 발명의 다양한 측면에서, 이종이식편 또는 동종이식편의 세포는 마커를 코딩하는 발현 구축물을 포함하고 마커를 발현한다. 이러한 마커는, 예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 변이체일 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 이종 또는 동종이계 간세포, 예컨대 인간 간세포 또는 동종이계 간세포, 예컨대 외인성 마우스 간세포를 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다. 특정한 측면에서, 마우스의 간세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 초과가 이종 간세포, 예컨대 인간 간세포 또는 동종이계 간세포, 예컨대 외인성 마우스 간세포이다.
본 발명의 다양한 측면은 상응하는 이종 또는 동종이계 간 단백질, 예컨대 상응하는 이종 또는 동종이계 혈청 알부민 및 상응하는 이종 또는 동종이계 야생형 AAT를 발현하는 생착된 이종 또는 동종이계 간세포를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에는 인간 간세포가 생착되고, 마우스는 검출가능한 수준의 인간 혈청 알부민 및 야생형 인간 AAT를 발현하며, 이는 인간 간세포가 인간 혈청 알부민 및 야생형 인간 AAT를 발현하기 때문이다.
본 발명의 측면에 따라서, 생착된 이종 또는 동종이계 간세포를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는, 예를 들어, 적어도 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mg/mL, 또는 그 초과의 이종 또는 동종이계 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민을 가지며, 여기서 이종 간세포는 인간 간세포이다. 특정한 측면에서, 생착된 이종 또는 동종이계 간세포를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 약 0.01 내지 약 10 mg/mL, 약 0.01 내지 약 1 mg/mL, 약 0.05 내지 약 5 mg/mL, 약 0.01 내지 약 0.1 mg/mL, 약 0.05 내지 약 0.5 mg/mL, 약 0.1 내지 약 1 mg/mL, 또는 약 0.5 내지 약 5 mg/mL 이종 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민을 가지며, 여기서 이종 또는 동종이계 간세포는 인간 간세포이다. 상기 마우스는, 예를 들어, 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 mg/mL, 또는 그 초과의 이종 또는 동종이계 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민을 가질 수 있으며, 여기서 이종 간세포는 인간 간세포이다.
본 발명의 측면에 따라서, 생착된 이종 또는 동종이계 간세포를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는, 예를 들어, 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 572, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000 mg/mL, 또는 그 초과의 혈청 이종 또는 동종이계 야생형 AAT, 예컨대 인간 야생형 AAT를 가지며, 여기서 이종 간세포는 인간 간세포이다. 본 발명의 특정한 측면에서, 생착된 이종 또는 동종이계 간세포를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 약 100 내지 약 10,000 mg/mL, 약 100 내지 약 1000 mg/mL, 약 500 내지 약 5,000 mg/mL, 약 1000 내지 약 10,000 mg/mL, 약 572 내지 약 10,000 mg/mL, 약 572 내지 약 9,000 mg/mL, 약 572 내지 약 8,000 mg/mL, 약 600 내지 약 10,000 mg/mL, 약 700 내지 약 10,000 mg/mL, 약 2000 내지 약 10,000 mg/mL, 약 2500 내지 약 10,000 mg/mL, 또는 약 5000 내지 약 10,000 mg/mL 혈청 이종 또는 동종이계 야생형 AAT, 예컨대 인간 야생형 AAT를 가지며, 여기서 이종 간세포는 인간 간세포이다. 생착된 이종 또는 동종이계 간세포를 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는, 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 572, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000 mg/mL, 또는 그 초과의 혈청 이종 또는 동종이계 야생형 AAT, 예컨대 인간 야생형 AAT를 가질 수 있으며, 여기서 이종 간세포는 인간 간세포이다.
생착된 이종 또는 생착된 동종이계 간세포를 함유하는 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스를 제조하는 방법
본 발명의 다양한 측면은 생착된 이종 또는 생착된 동종이계 간세포를 함유하는 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정한 측면에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스를 제공하는 단계, 및 인간 또는 마우스 세포의 집단을 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 측면에서, 상기 방법은 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG-PiZ 마우스, NRG-PiZ 마우스 또는 NOG-PiZ 마우스를 제공하는 단계, 및 인간 간세포를 포함하는 인간 세포의 집단을 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG-PiZ 마우스, NRG-PiZ 마우스 또는 NOG-PiZ 마우스에 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 측면에서, 상기 방법은 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG-PiZ 마우스, NRG-PiZ 마우스 또는 NOG-PiZ 마우스를 제공하는 단계, 및 동종이계 마우스 간세포를 포함하는 동종이계 마우스 세포의 집단을 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 NSG-PiZ 마우스, NRG-PiZ 마우스 또는 NOG-PiZ 마우스에게 투여하는 단계를 포함한다.
투여된 세포 임의로, 마커를 발현한다.
특정한 측면에서, 본 발명의 방법은 약 103 (1000) 내지 약 106 (1,000,000), 약 103 내지 약 105, 약 104 내지 약 106, 약 105 내지 약 107, 약 1 x 103 내지 약 1 x 104, 약 5 x 103 내지 약 5 x 104, 약 1 x 104 내지 약 1 x 105, 약 5 x 104 내지 약 5 x 105, 약 1 x 105 내지 약 1 x 106, 약 5 x 105 내지 약 5 x 106, 약 1 x 106 내지 약 1 x 107, 약 2 x 105 내지 약 5 x 106, 또는 약 5 x 105 내지 약 2 x 106개의 인간 간세포 또는 동종이계 간세포 (예를 들어, 1차 인간 간세포 또는 1차 동종이계 간세포)를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다. 특정한 측면에서, 본 발명의 방법은 적어도 약 1 x 102, 약 2 x 102, 약 3 x 102, 약 4 x 102, 약 5 x 102, 약 6 x 102, 약 7 x 102, 약 8 x 102, 약 9 x 102, 약 1 x 103, 약 2 x 103, 약 3 x 103, 약 4 x 103, 약 5 x 103, 약 6 x 103, 약 7 x 103, 약 8 x 103, 약 9 x 103, 약 1 x 104, 약 2 x 104, 약 3 x 104, 약 4 x 104, 약 5 x 104, 약 6 x 104, 약 7 x 104, 약 8 x 104, 약 9 x 104, 약 1 x 105, 약 2 x 105, 약 3 x 105, 약 4 x 105, 약 5 x 105, 약 6 x 105, 약 7 x 105, 약 8 x 105, 약 9 x 105, 약 1 x 106, 약 2 x 106, 약 3 x 106, 약 4 x 106, 약 5 x 106, 약 6 x 106, 약 7 x 106, 약 8 x 106, 약 9 x 106, 약 1 x 107개, 또는 그 초과의 인간 간세포 또는 동종이계 간세포 (예를 들어, 1차 인간 간세포 또는 1차 동종이계 간세포)를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다. 특정한 측면에서, 본 발명의 방법은 적어도 약 1 x 102, 약 2 x 102, 약 3 x 102, 약 4 x 102, 약 5 x 102, 약 6 x 102, 약 7 x 102, 약 8 x 102, 약 9 x 102, 약 1 x 103, 약 2 x 103, 약 3 x 103, 약 4 x 103, 약 5 x 103, 약 6 x 103, 약 7 x 103, 약 8 x 103, 약 9 x 103, 약 1 x 104, 약 2 x 104, 약 3 x 104, 약 4 x 104, 약 5 x 104, 약 6 x 104, 약 7 x 104, 약 8 x 104, 약 9 x 104, 약 1 x 105, 약 2 x 105, 약 3 x 105, 약 4 x 105, 약 5 x 105, 약 6 x 105, 약 7 x 105, 약 8 x 105, 약 9 x 105, 약 1 x 106, 약 2 x 106, 약 3 x 106, 약 4 x 106, 약 5 x 106, 약 6 x 106, 약 7 x 106, 약 8 x 106, 약 9 x 106, 약 1 x 107개, 또는 그 초과의 인간 간세포 또는 동종이계 간세포 (예를 들어, 1차 인간 간세포 또는 1차 동종이계 간세포)를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정한 측면에서, 인간 또는 동종이계 간세포를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것은 간세포를 주사하는 것을 포함한다. 간세포를 투여하는 것은, 예를 들어, 비장내 투여, 예컨대 비장내 주사를 포함할 수 있다. 투여 경로는 투여가 외인성으로 투여된 인간 또는 동종이계 간세포가 마우스의 간에서 서식할 수 있는 한은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 특정한 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 그의 내인성 간세포의 수를 감소시키기 위해 처리된다. 용어 "내인성 간세포"은 마우스에 자연적으로 존재하는 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에 존재하는 간세포를 지칭한다. 내인성 간세포는 인간 또는 동종이계 간세포를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하기 전에, 예컨대 인간 세포를 상기 마우스에게 투여하기 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일에, 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에게 투여하는 것과 거의 동시에, 또는 인간 또는 동종이계 간세포를 상기 마우스에게 투여한 후에 감소될 수 있다.
놀랍게도, 이종 또는 동종이계 간세포를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스 내로 생착시키는 것이, 분자 항-간세포 작용제, 예컨대 간독소 또는 프로-아폽토시스 항체로의 처리에 의해 촉진될 수 있다. 분자 항-간세포 작용제로 처리하는 것이 후속 간세포 이종이식편을 정립하기 위해 간절제술보다 우수한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 특정한 측면에서, 본 발명의 방법은 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스를 분자 항-간세포 작용제, 예컨대 간독소 또는 프로-아폽토시스 항체로 처리하는 것을 포함하고, 외과적 간절제술 (예를 들어, 부분 또는 완전 간절제술)을 수행하는 것을 포함하지 않는다.
종종 숙주와 이종이식편 세포 둘 다를 표적으로 하는 간독소와는 달리, 프로-아폽토시스 항체는 종 특이적일 수 있으므로, 프로-아폽토시스 항체는 이종이식편을 투여하기 전에, 이종이식편의 투여와 함께, 및/또는 이종이식편을 투여한 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 특정한 측면에서, 인간 또는 동종이계 간세포의 투여 전에 내인성 간세포의 수를 감소시키는 것은 간독소, 예컨대 모노크로탈린을 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 약 1 내지 약 500 mg/kg 모노크로탈린, 예컨대 약 1 내지 약 10 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 100 mg/kg, 약 50 내지 약 500 mg/kg, 약 10 내지 약 200 mg/kg, 약 20 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 40 내지 약 60 mg/kg 모노크로탈린을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 임의로, 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 약 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 또는 100 mg/kg 모노크로탈린을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정한 측면에서, 간독소 (예를 들어, 모노크로탈린)는 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 1회 투여되거나 또는 2회 이상 투여된다. 간독소는, 예를 들어, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 및/또는 21일에 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 간독소, 예컨대 모노크로탈린을 (예를 들어, 그의 체내 또는 혈류 내에) 포함한다. 상기 마우스는, 예를 들어, 약 1 내지 약 500 mg/kg 모노크로탈린, 예컨대 약 1 내지 약 10 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 100 mg/kg, 약 50 내지 약 500 mg/kg, 약 10 내지 약 200 mg/kg, 약 20 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 40 내지 약 60 mg/kg 모노크로탈린을 (예를 들어, 그의 체내 또는 혈류 내에) 가질 수 있다. 상기 마우스는 임의로, 약 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 또는 100 mg/kg 모노크로탈린을 (예를 들어, 그의 체내 또는 혈류 내에) 가질 수 있다.
본 발명의 특정한 측면에서, 내인성 간세포의 수를 감소시키는 것은, 인간 또는 동종이계 간세포의 투여 전에, 그의 투여와 동시에, 및/또는 그의 투여 후에, 프로-아폽토시스 작용제, 예컨대 항-CD95 항체를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 측면에 따르는 방법은 인간 또는 동종이계 간세포의 투여 전에, 그의 투여와 동시에, 및/또는 그의 투여 후에, 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μg의 항-CD95 항체를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가 측면에 따르는 방법은 인간 또는 동종이계 간세포의 투여 전에, 그의 투여와 동시에, 및/또는 그의 투여 후에, 약 0.1 내지 약 10 μg, 약 0.1 내지 약 5 μg, 약 0.1 내지 약 2 μg, 약 0.5 내지 약 10 μg, 약 0.5 내지 약 5 μg, 약 0.5 내지 약 2 μg, 약 1 내지 약 10 μg, 또는 약 1 내지 약 5 μg의 항-CD95 항체를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또한 추가 측면에 따르는 방법은 인간 또는 동종이계 간세포의 투여 전에, 그의 투여와 동시에, 및/또는 그의 투여 후에, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μg의 항-CD95 항체를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 프로-아폽토시스 작용제 (예를 들어, 항-CD95 항체)는 1회 투여되거나 또는 2회 이상 투여된다. 프로-아폽토시스 항체는, 예를 들어, 인간 세포를 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스에게 투여하기 전 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 및/또는 21일에, 인간 세포를 투여하는 것과 거의 동시에, 및/또는 인간 세포를 상기 마우스에게 투여한 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 및/또는 21일에 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 프로-아폽토시스 작용제, 예컨대 항-CD95 항체를 (예를 들어, 그의 체내에 또는 혈류 내에) 포함한다. 프로-아폽토시스 항체는, 예를 들어, 상기 마우스의 Z-AAT-발현 간세포 내에서의 아폽토시스를 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 이로써 이종이식된 간세포에 대한 부가의 선택적 이점을 제공함). 본 발명의 일부 측면에서, 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스는 약 1 μg의 항-CD95 항체를 (예를 들어, 그의 체내에 또는 혈류 내에) 갖는다. 예를 들어, 상기 마우스는 특정 마우스일 수 있고, 이러한 마우스는 약 1 μg의 항-마우스 CD95 항체를 (예를 들어, 그의 체내에 또는 혈류 내에) 갖는다. 상기 마우스는 임의로, 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μg의 항-CD95 항체를 (예를 들어, 그의 체내에 또는 혈류 내에) 갖는다. 상기 마우스는 임의로, 약 0.1 내지 약 10 μg, 약 0.1 내지 약 5 μg, 약 0.1 내지 약 2 μg, 약 0.5 내지 약 10 μg, 약 0.5 내지 약 5 μg, 약 0.5 내지 약 2 μg, 약 1 내지 약 10 μg, 또는 약 1 내지 약 5 μg의 항-CD95 항체를 (예를 들어, 그의 체내에 또는 혈류 내에) 가질 수 있다. 상기 마우스는 임의로, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μg의 항-CD95 항체를 (예를 들어, 그의 체내에 또는 혈류 내에) 가질 수 있다.
인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법
인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법이 본 발명의 측면에 따라서 제공되며, 이는 생착된 인간 간세포를 수반하는 본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스를 제공하는 단계; 인간 간 장애의 추정적 치료를 상기 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및 마우스의 생착된 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계를 포함한다.
추정적 치료는 시험 물질의 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 인간 간 장애의 치료에 사용하기 위해 제안된 다양한 치료 중 임의의 것일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 시험 물질은, 합성 또는 자연적으로 발생하는 화합물 또는 합성 또는 자연적으로 발생하는 화합물의 조합, 작은 유기 또는 무기 분자, 단백질, 펩티드, 핵산 (예컨대 유전자 요법), 탄수화물, 올리고사카라이드, 지질 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 예시적으로 포함한, 임의의 화학적 실체일 수 있다.
인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법의 측면에 따라서, 간세포를 뉴클레오티드-지정 엔도뉴클레아제, 예컨대 CRISPR/Cas9 및 Cpf1로 생체내 또는 생체외 게놈 편집하는 것은, 게놈 편집된 간세포를 본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여함으로써 평가된다. 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법의 측면에 따라서, 벡터-유발 발암 현상, 예컨대 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 통합과 잠재적으로 연관된 것에 대한 잠재력은, rAAV를 본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여함으로써 평가된다.
본 발명의 유전적으로 변형된 면역결핍 PiZ 마우스 내에서 생착 이종 또는 동종이계 간세포에 대한 시험 화합물의 효과를 평가하는 것은 표준에 대한 반응을 비교하여 본 발명의 방법의 측면에 따르는 간세포에 대한 시험 물질의 효과를 결정하는 것을 포함한다. 표준은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 사용된 표준은 임의의 적절한 표준일 수 있다. 한 예에서, 표준은 간세포에 대한 효과를 가지는 것으로 공지된 화합물이다. 추가 예에서, 비교가능한 마우스를 처리하지 않는 것은 시험 물질의 효과의 비교를 위하여 처리하지 않은 간세포의 기준 수준 지표를 제공한다. 표준은 이전에 비교가능한 개별 마우스 또는 비교가능한 마우스의 집단에서 결정된 예상 간세포 기능의 참조 수준일 수 있으며, 리콜 및 검정 결과와의 비교를 위해 인쇄 매체 또는 전자 매체에 저장될 수 있다.
검정 결과는 파라메트릭 또는 비-파라메트릭 시험, 분산 분석, 공분산 분석, 다변량 분석을 위한 로지스틱 회귀, 피셔의 직접 확률 시험, 카이 제곱 시험, 스튜던츠 T-시험, 만 휘트니(Mann-Whitney) 시험, 윌콕슨(Wilcoxon) 부호 순위 시험, 맥네마(McNemar) 시험, 프리드만(Friedman) 시험 및 페이지(Page)의 L 추세 시험으로써 예시된, 시험 물질이 간세포에 대한 효과를 가지고 있는지를 결정하는 다양한 방법 중 임의의 것에 의한 통계적 분석을 사용하여 분석될 수 있다. 이들 및 다른 통계적 시험은 문헌 [Hicks, CM, Research Methods for Clinical Therapists: Applied Project Design and Analysis, Churchill Livingstone (publisher); 5th Ed., 2009; 및 Freund, RJ et al., Statistical Methods, Academic Press; 3rd Ed., 2010]에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
게놈 편집은 간 표현형을 개선시킨다
AAT 결핍증의 치료 방법이 본 개시내용의 측면에 따라서 제공되며, 이는 AAT 결핍증에 의해 영향을 받은 개체의 일부 또는 모든 간세포에서 Z 돌연변이체 결함 (Glu342Lys)의 교정에 의한 결핍증의 완화를 포함한다. 본 개시내용의 측면에 따라서, Z 돌연변이체 결함을 갖는 돌연변이체 AAT 단백질을 침묵시키고, 정상적인 AAT 생산을 증대시킴으로써 AAT 결핍증에 의해 영향을 받은 개체의 일부 또는 모든 간세포에서 Z 돌연변이체 결함을 교정함으로써, 상기 결핍증을 완화시키는 것을 포함하는 AAT 결핍증의 치료 방법이 제공된다.
특정한 측면에 따라서, 내인성 대립 유전자를 침묵시키기 위한 (Z 돌연변이체를 코딩함) 합성 miRNA 및 야생형 AAT를 발현하는, 프로모터 없는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터가, 병에 걸린 개체, 예컨대 인간의 간세포에서 발현된다. 임의로, 상기 벡터가 병에 걸린 개체의 간세포의 게놈 내에 혼입된다. 이러한 치료 접근법은 돌연변이체 단백질을 침묵시키고 정상적인 AAT 생산을 증대시킴으로써 편집된 간세포의 선택적인 이점을 초래하고, 간 병리상태를 개선시켜 준다.
본 발명의 조성물 및 방법의 실시양태가 하기 실시예에 예시된다. 이들 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 본 발명의 조성물 및 방법의 범위에 대한 제한으로 간주되지 않는다.
실시예
실시예와 관련한 재료 및 방법
게놈 편집을 위한 벡터 주사
성체 마우스의 처리를 위하여, 5주령 내지 9주령 수컷에게 200 μL 총 용적 중의 1E12 gc의 벡터를 정맥내 주사하였다. P1 마우스의 처리를 위하여, 수컷과 암컷 둘 다에게 2E11 gc의 벡터를 복강내로 주사하였다. 동물은 본 발명자들의 프로토콜에 따라 하악선 천자를 통해 격주로 출혈시켰고, 혈청은 분석 시점까지 -80℃ 하에 저장하였다. 종말점에서, 본 발명자들의 프로토콜에 따라 경추 탈구에 이은 CO2 질식에 의해 동물을 안락사시켰다. 간 조직을 수거하고, 조직학에 관하여 알아보기 위해 일치되는 절편을 고정시키며, 나머지 조직을 하류 분자 분석을 위해 급속 냉동시켰다.
게놈-편집 실험을 위해 사용된 B6-PiZ 마우스는 높은 트랜스진 카피 수를 갖는다 (>10).
동물 시술
모든 동물 시술은 기관내 동물 관리 및 사용 위원회의 설치류 수술을 위해 적응된 지침에 따라서 수행되었다. 모든 시술 동안 무균 기술과 멸균 기기가 사용되었다. 모든 수용자 동물은 6-10주령의 수컷이고, 이들은 폐쇄된 환기 챔버에서 이소플루란 흡입에 의해 마취시켰다.
간 관류/1차 간세포 단리
마우스를 안락사시키고 복강을 노출시키기 위해 복부 절개를 하고, 하대 정맥을 노출시키기 위해 내장을 배열하였다. 카테터 바늘을 사용하여 하대 정맥을 뚫고 하대 정맥 내로 약 1 cm 삽입시켰다. 봉합사 실크가 카테터를 고정하기 위해 적용되었다. 카테터 끝 부분에 펌프 호스를 부착시켰다. 문맥은 유출되도록 슬라이스되었다. 횡격막이 열렸고, 하대 정맥이 간 위에 고정되어 있었다. 간을 관류시키기 위해, 간 관류 배지 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 먼저, 50 mL에 대해 순환계를 통해 펌핑한 다음, 간 소화 배지 (라이프 테크놀로지스)를 50 mL에 대해 펌핑하였다. 간을 제거하고, 그를 빙냉 간세포 세척 배지 (HWM, 라이프 테크놀로지스)에 담그면 간세포가 용액으로 확산될 수 있다. 세포 현탁액을 70 μm 메쉬를 통해 끌어올려 피펫팅하고, 4℃에서 3분 동안 50 g 하에 원심분리시켰다. 세포를 회전시킨 후, 인산염 완충 식염수 (PBS; Ca2+, Mg2+ 무함유) 중의 10 mL의 HWM 및 10 mL 90% 퍼콜 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 상기 용액에 부가하여 비-생육성 세포를 제거하였다. 간세포 용액을 30 mL의 HWM으로 3회 세척하였다.
ELISA
마우스 혈청을 생착 전 및 생착 후에 격주로 수집하고, ELISA에 의해 총 AAT, Z-AAT, c-Myc, 및 인간 알부민에 관하여 시험하였다. 모든 검정에 대하여, 고 결합성 96-웰 플레이트 (이뮬론4(Immulon4); 다이나-테크 래보라토리즈(Dyna-tech Laboratories))를 4℃에서 밤새 100 μL 볼러(Voller)의 완충제 중의 관련 포획 항체로 코팅하였다. 달리 표시되지 않는 한, 모든 후속 인큐베이션을 실온에서 1 hr 동안 수행하고, 플레이트를 PBS 0.05% 트윈(Tween) 20으로 단계들 사이에 세척하였다.
인간 AAT ELISA
차단은 1% 밀크로 행해졌다. 포획 항체는 인간 특이적 염소 항-AAT (1:500, Cat#55111, 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals))이고; 검출 항체는 염소 항-hAAT (서양고추냉이 퍼옥시다제 [HRP]; 1:5,000, Cat#ab191350, 압캠(Abcam))이다. 표준은 AAT (Cat# 16-16-011609, 아테네 리서치 앤 테크놀로지(Athens Research and Technology))이다.
Z-AAT ELISA
차단은 1% 밀크로 행해졌다. 포획 항체는 주문 항체이고; 검출 항체는 상기 기재된다.
c-Myc ELISA
모든 인큐베이션은 37℃에서 수행되었다. 차단은 5% BSA로 수행되었다. 포획 항체는 (1:1,000, Cat# ab19234, 압캠)이다.
인간 알부민 ELISA
인간 알부민 수준은 제조업자에 의해 기재된 바와 같은 인간 알부민 ELISA 정량 세트 (베틸 실험실)를 사용함으로써 생착 후에 평가되었다. 모든 검정에 대하여, HRP-접합된 항체와 함께 인큐베이션한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 (KPL)을 적용하였고, 15-30분 후에 2 N H2SO4 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 부가함으로써 반응을 중지시켰다. 플레이트를 베르사맥스(VersaMax) 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 상에서 450 nm 하에 판독하였다.
면역조직화학
마우스 간을 연속적으로 4 μm 절개하였다.
인간 알부민 염색
절편을 탈파라핀화하고 시트라(Citra) (바이오제넥스(Biogenex))에 의해 98℃에서 30분 동안 처리하였다. 배경 스나이퍼 (바이오케어 메디칼(Biocare Medical))를 적용하여 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 절편을 토끼 항-인간 알부민 (1:4,000, Cat#ab2604, 압캠)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 염색은 Mach2 염소 x 토끼 HRP 중합체 (바이오케어 메디칼), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 크로마겐 (바이오케어 메디칼) 및 추루키안-앨리슨-타차(Churukian-Allison-Tacha; CAT) 헤마톡실린 대조 염색제 (바이오케어 메디칼)를 사용하여 가시화하였다.
인간 AAT 염색
슬라이드를 크실렌으로 탈파라핀화하고, 내인성 퍼옥시다제 활성 (메탄올 중 3% 과산화수소)을 켄칭하기 위한 중간 단계를 포함하여 에탄올의 물에 대한 농도를 감소시킴으로써 재수화시켰다. 슬라이드를 1x 트리스 완충 식염수 (TBS)로 옮겼다. 효소 유도 항원 검색을 위하여, 절편을 다이제스트 올 트립신(Digest-all Trypsin) (인비트로겐(Invitrogen))에 침지시키면서 37℃ 하에 5분 동안 가열하였다. 슬라이드를 연속적으로 1x TBS에서 세정하고, 범용 단백질 차단제 스나이퍼 (바이오케어 메디칼)와 함께 실온 (RT)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 1x TBS에서 세정하고, 인간 AAT (1:600, Cat#KDI-A1ATRYPabr, 피츠제럴드(Fitzgerald))를 인식하는 (마우스 ATT는 인식하지 않음) 1차 토끼 항체와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 1x TBS에서 세정한 다음, 접합된 2차 항체 (Mach 2 염소 항-토끼 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합됨; 바이오케어 메디칼)를 RT에서 30분 동안 적용하였다. AAT의 검출은 3'3' 디아미노벤지딘 (바이오케어 메디칼) 중의 슬라이드를 RT에서 1.5분 동안 인큐베이션함으로써 달성되었다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색하고, 시토실(Cytoseal) XYL (리차드-알렌 사이언티픽(Richard-Allen Scientific))을 장착시켰다.
PAS-D 염색
쉬프 시약을 RT에서 적어도 30분 동안 미리 가온시켰다. 절편을 탈파라핀화하고 재수화시켰다. 아밀라제를 RT에서 20분 동안 슬라이드 위에 적용하고, 물로 세정하였다. 절편을 0.5% 과아이오딘산에서 10분 동안 인큐베이션하고 세정하였다. 쉬프 시약을 슬라이드에 15분 동안 적용하였다. 이어서, 절편을 미지근한 수돗물에서 5분 동안 세척하였다. 헤마톡실린 대조 염색제를 15초 동안 적용하였고, 블루 핵을 1분 동안 적용하였다. 아밀라제 처리하지 않은 하나의 슬라이드가 대조군으로서 작용하였다.
PSR 염색
PSR 염색은 피크로시리우스(Picrosirius) 레드 염색 키트 (Cat#24901-250; 폴리사이언시스 인크.(Polysciences Inc.))를 사용하여 수행되었다.
한계치 분석
분석은 플로리다 대학교 병리학 코어의 숙련된 기술자에 의해 맹목적으로 수행되었다.
모델 최적화
동물을, 생착하기 전 7일에 또는 14일 및 7일에 50 mg/kg MCT (오크우드 케미칼(Oakwood Chemical))로 복강내로 미리 처리하거나, 또는 생착 시점에 1 μg 정제된 NA/LE 햄스터 항-마우스 CD95 항체 (제1 아폽토시스 시그널 [FAS]; 비디 파밍겐(BD PharMingen))로 정맥내로 처리하였다.
유동 세포계수법 검정
해리 후, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 항-마우스/인간 CD324 [바이오레전드(Biolegend)] 및 항-HLA-ABC [비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)] 항체로 염색하여 인간 간세포 백분율을 결정하였다. 이어서, 세포를 1x PBS로 2회 세척하고, 0.5% FBS 및 2 mM EDTA로 보충시킨 1x PBS에 재현탁시켰다. FACS-LSRII 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 세포를 획득하였고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (버전 10.1; 트리 스타 인크.(Tree Star Inc.))로 분석하였다.
ddPCR 검정
게놈 DNA를 급속 냉동시킨 간으로부터 단리하였고 (젠트라 퓨레진(Gentra Puregene) 키트; 퀴아젠(QIAGEN)), 50 ng의 DNA를 입력으로서 사용하고 GFP 및 RPP30을 검출하는 TaqMan 검정을 사용하여 제조업자의 권장 사항에 따라서 ddPCR (바이오-라드(Bio-Rad))을 수행하였다.
통계
회귀 분석에 이어 양측 피어슨(Pearson) R 검정을 수행하였다. 양방향 ANOVA는 시간과 처리의 효과를 결정하기 위해 수행되었다. 연령-매칭된 대조군과 치료군 간의 차이의 통계적 유의성을 대응표본 t 검정으로 결정하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05로서 규정되었다.
실시예 1. 야생형 마우스 간세포는 NSG-PiZ 마우스의 간에서 서식할 수 있다.
정상 간세포가 PiZ 간을 재생시킬 수 있었는지를 결정하기 위해, 인간 Z-AAT를 발현하는 PiZ 마우스로부터 2마리의 새로운 마우스 계통을 창출하였다. 이러한 PiZ 마우스를 먼저, NOD-scid IL2rg 널 (NSG) 배경 상으로 역교배시켰다. 심하게 면역기능 저하된 NSG-PiZ 계통은 이들 마우스가 거부 반응 없이 인간 간세포 뿐만 아니라 동종이계 마우스 간세포를 접종할 수 있게 한다. 간세포 공여자 마우스는 또한, 트랜스제닉 C57BL/TG( CAG - EGFP ) 마우스 계통을 야생형 C57BL/6 또는 C57BL/6-PiZ 트랜스제닉 마우스와 교배함으로써 창출되었다. 이들 교배는 PiZ 돌연변이체 인간 α-1 항트립신 유전자를 수반한 GFP (PiZ-GFP) 또는 이러한 유전자를 수반하지 않은 GFP (야생형, WT-GFP)에 대해 반접합성인 C57BL/TG( CAG - EGFP )-PiZ F1 한배 새끼를 생성하였다 (도 1a 참조). 도 1b에 도시된 바와 같이, PiZ-GFP 마우스로부터 단리된 간세포는 인간 Z-AAT와 GFP 유전자 둘 다를 발현한 반면, WT-GFP 마우스는 GFP만을 발현하였다. 이어서, 이들 마우스로부터의 간세포를 사용하여, 1,000,000개의 PiZ-GFP 또는 WT-GFP 공여자 간세포를 비장내 주사함으로써 수컷 NSG-PiZ 마우스에 생착시켰다. 주사 후 8주에, 수용자 NSG-PiZ 마우스로부터의 간을 디지털 비말 PCR (ddPCR)에 의해서 뿐만 아니라 면역조직학에 의해 공여자 생착에 관하여 검사하였다. 정량적 ddPCR 데이터는 NSG-PiZ 마우스에서의 공여자 간세포 생착 수준이, 공여자 간세포가 Z-AAT를 발현하는 지의 여부에 의존적이라는 것을 확증한다. 도 1c에서의 결과는 마우스에게 야생형 GFP-발현 정상 간세포가 생착된 경우에 NSG-PiZ 간의 간세포의 평균 40%가 GFP-양성이었다는 것을 나타내며, 이는 공여자 간세포가 GFP 및 Z-AAT를 발현할 때 (PiZ-GFP) 단지 5%였다는 것과 비교된다. 이들 결과는 숙주 간의 면역조직화학 (IHC) 및 면역형광 염색에 의해 확증되었으며, 여기서 WT-GFP 간세포는 PiZ-GFP 간세포와 비교 시 상당히 더 높은 비율로 생착되었다 (도 1d- g). GFP 면역조직화학 염색 및 영상의 양성 픽셀 카운트 한계치 분석 결과, 생착이 간엽에 의해 32% 내지 48%로서 다양하게 나타났지만 (표 1), 전반적으로, 조직학 절편에 대한 양성 픽셀 카운트 분석은 ddPCR 결과를 뒷받침해준다. 이러한 데이터는 야생형 간세포가 Z-AAT-함유 간세포와 비교해서 증가된 재생 능력을 갖고 있다는 것을 확증하고, Z-AAT-부담된 숙주 간이, 야생형 공여자 간세포에 상당한 수준으로 재증식할 수 있는 능력을 제공하기에 충분한 대사전환을 진행하고 있다는 것을 암시한다.
표 1. 야생형 간세포는 Z-AAT를 발현하는 간세포 (PiZ)보다 더 신속하게 확장된다.
Figure pct00003
B6: C57BL/6, GFP: 녹색 형광 단백질, WT: 야생형, S: 비장 주사만, S+PHx: 비장 주사 및 부분 간절제술, ddPCR: 비말 디지털 폴리머라제 연쇄 반응, IHC: 면역조직화학, NA: 이용가능하지 않음.
실시예 2. 인간 간세포가 NSG-PiZ 마우스의 간에서 서식할 수 있다.
NSG-PiZ 및 NSG 대조군 마우스에게 1,000,000개의 성숙한 인간 간세포를 비장내로 주사하였다. 인간 간 생착을 위한 대용물로서 마우스 혈청 샘플에서 인간 알부민 수준을 전향적으로 모니터링하였다. 도 2a에서의 혈청 인간 알부민 수준은 이들 마우스에서의 인간 간세포의 생착에 따른 결과로서 간 키메라 현상이 발생한다는 것과, Z-AAT를 발현하는 NSG 마우스 간에서 달성된 인간 간세포 생착 수준이 현저하게 증가되었다는 것을 확증한다. 이는 야생형 간세포를 우선적으로 확장시킬 수 있게 하는 니치를 창출하는데 있어서의 Z-AAT 부담의 역할을 추가로 확증한다.
인간 간세포가 또한, NSG-PiZ 마우스에서 증가된 유사 분열 지수로부터 혜택을 받았다는 점을 고려해 볼 때, 간세포 대사전환을 증가시키면 생착이 증가될 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 실험은 비장내 주사 시점에 부가된 부분 간절제술로 반복되었다. 원래의 간 질량은 일반적으로 70% 부분 간절제술 후 약 7일 이내에 재생되기 때문에, 이러한 증식기는 증가된 생착을 나타내는 것으로 가정되었다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 부분 간절제술은 순환성 혈청 인간 알부민 수준에 있어서의 5-10배 증가를 초래하였다. 흥미롭게도, NSG 마우스에서는 간절제술이 생착에 있어서의 저하를 유발시켰다. 이러한 관찰은 마우스 간과 관련하여 인간 간세포에 비해 야생형 증식 마우스 간세포의 이점에 기인할 수 있다. NSG-PiZ 마우스 간에서 인간 알부민에 대한 면역조직화학적 염색 (도 2c-d)은 인간 간세포가 상당 부분의 NSG-PiZ 간에 생착할 수 있다는 것을 확증하였다.
실시예 3. NSG-PiZ 마우스 내에서의 Z-AAT 부담은 연령에 따라 감소되고, 간세포 생착은 Z-AAT 수준과 상관관계가 있다.
PiZ 트랜스제닉 마우스는 아폽토시스의 발생률이 더 높은 Z-AAT 소구체 함유 간세포를 가지며, 이들 세포는 Z-AAT 소구체 부하가 더 낮은 간세포에 의해 우세한 경향이 있다. 이러한 현상은 NSG-PiZ 마우스에서의 인간 간세포 또는 야생형 마우스의 경쟁적으로 유리하게 된 생착을 위한 근본적인 기초가 될 수 있다 (본원에서 확인된 추정적 또는 확증된 메카니즘은 특허 청구범위 또는 개시내용의 범위를 제한하지 않음). 공여자 간세포의 부재하에 이러한 정상적인 간세포 대사전환의 결과를 보다 명확하게 정의하기 위해, 대사전환은 NSG-PiZ 마우스에서 조사되었으며, 이는 또한 시간 경과에 따른 Z-AAT 소구체 부하의 감소와 상관이 있는 것으로 추정된다. 이들 마우스에서의 혈청 Z-AAT 수준에 대한 전향적인 분석은 마우스의 연령과 Z-AAT 혈청 수준 간에 명확하고 강한 역 상관관계 (r2=0.80, p≤0.003, 양측)를 보여준다 (도 3a). NSG-PiZ 마우스가 나이 들어감에 따라, 혈청 Z-AAT 농도는 감소하며, 이는 또한 6주령 내지 14주령 간세포의 소구체 함유 상태에 있어서의 감소로써 조직학적으로 반영된다. 소구체 조직학은, 예를 들어, 디아스타제 내성 과아이오딘산 쉬프 (PASD, 도 3b-c) 및 상이한 연령대의 간에서의 인간 AAT 염색 (도 3d-e)에 의해 가시화될 수 있다. 이러한 데이터는 생착된 야생형 간세포의 부재하에서는, NSG-PiZ 마우스 내의 간이 여전히, 더 적은 양의 Z-AAT를 생산하고 축적하는 간세포의 생존과 확장을 도와주기에 충분한 선택 압력을 행사한다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, 마우스가 나이 들어감에 따라, 일부 간세포는 Z-AAT 소구체를 계속 축적하며, 비록 그것이 아주 드물긴 하지만 그의 소구체가 더 커지는 경향이 있는 것으로 나타났다 (도 3b). 마우스가 나이 들어감에 따라 Z-AAT 부담이 감소하기 때문에, 정상적인 인간 생착된 간세포의 증식 이점 또한 감소될 수 있다. 인간 간세포 영속성을 조사하기 위해, 후향적 분석은 소정의 마우스의 평균 혈청 인간 알부민 농도를 생착 시점의 혈청 Z-AAT 농도와 비교하였다. 이러한 분석 결과, 평균 인간 알부민 혈청 농도에 의해 결정된 바와 같은 인간 간 키메라 현상 수준과 Z-AAT 혈청 농도 간에는 중간 정도이긴 하지만 고도로 유의적인 양의 상관관계 (r2=0.46, p≤0.0003)가 있는 것으로 밝혀졌다 (도 3f).
실시예 4. 작은 분자 및 생물 제제로 내인성 마우스 간세포를 감소시킨다.
증가된 인간 간세포 생착을 위한 부가의 방법을 조사하기 위해, 간 이종이식편 분야에서 사용된 2가지 접근법, 즉 모노크로탈린 (MCT)과 마우스-특이적 항-Fas 항원 (CD95) 항체를 시험하였다. MCT는 폐, 간 및 신장에 공지된 내피 독성을 갖는 피롤리지딘 식물 알칼로이드이다. MCT 치료는 간에서의 세포 생착을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 항-CD95 항체는 마우스 Fas를 인식하고, 마우스 간세포 및 다른 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 마우스 Fas를 발현하는 세포의 세포 용해 활성을 초래한다. 이러한 2가지 간 손상 모델을 이용하는 다양한 프로토콜을 시험하였고, 그 결과 부분 간절제술을 필요로 하지 않으면서도 용이하고 재현 가능하게 수행될 수 있는 "2 히트" 프로토콜을 만들었다.
생착은 이들 개입 둘 다에서 상당히 증가되었으며, 부분 간절제술과 거의 동등하거나 그보다 더 높은 수준을 달성하였다 (도 4a). 생착하기 전에 1회 또는 2회 용량의 MCT (50 mg/kg)를 투여하였고, 마우스에게 2회 용량의 MCT를 투여하였을 때 가장 큰 생착이 달성되었다 (도 4a). 간세포 전달 시점에 항-CD95 항체를 단일 복강내 주사한 후의 생착 동역학은 혈청 인간 알부민 농도에 의해 결정된 바와 같이 부분 간절제술만큼 효과적이었다 (도 4a). 인간 알부민에 대한 MCT-처리된 및 CD95-처리된 마우스 간의 염색은 인간 간세포의 생착을 확증하였다 (도 4b). 더욱이, 항-HLA 항체를 사용하는 정량적 유동 세포계수법 분석은 MCT-처리된 마우스 내의 모든 간세포의 적어도 25%가 인간 기원의 것임을 암시한다 (도 4c).
인간 AAT의 단백질 증대에 대한 FDA 승인 치료용 혈청 한계치는 현재 11 μM으로 설정되어 있으며, 이는 572 μg/ml와 등가이다. 이종이식편 실험으로부터의 결과는 이러한 한계치가 간단한 간세포의 세포 요법 접근법으로 달성될 수 있다는 것을 처음으로 나타낸다. NSG-PiZ 마우스에서 인간 간세포 이식 후 총 인간 AAT 수준을 정량화한 결과, 이러한 치료 한계치를 달성하는 것이 가능하고, 부분 간절제술과 조합된 경우에는 이러한 전략이 임상적으로 관련될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 4d).
실시예 5. 게놈-편집된 간세포의 선택적 확장.
수컷 B6-PiZ 마우스에게 식염수 또는 AAV-진라이드(GeneRide)-이중기능AAT (GR-dfAAT)를 정맥내로 주사하였다. GR-dfAAT는 2A-펩티드 서열 다음에 탈표적화된, c-Myc-태그부착된 인간 AAT 서열, 및 Z-AAT를 표적화하는 인공 miRNA를 함유하는 프로모터 없는 카세트이다 (Mueller et al., 2012, Mol. Ther. 20:590-600). 이러한 카세트는 C57BL/6 Alb 로커스에 대해 상보적이고 상동 재조합을 허용하는 2개의 상동성 아암 (1.1-1.3 kb)에 의해 플랭킹된다. 상동 재조합 후, Alb와 AAT는 단일 Alb-AAT mRNA ("융합된 전사체")로서 공동 전사되며, 리보솜 스키핑을 통해 2개의 단백질을 생산한다 (도 5a).
게놈-편집된 대립 유전자에 의해 부여된 발현을 측정하기 위해, 상기 융합된 mRNA 전사체의 상대적 존재량을, 주사 후 제10주 및 제16주에 마우스의 서브세트에서 정상 알부민 전사체와 비교해서 ddPCR에 의해 정량화하였다 (도 5b). 제10주에, 그 비율은 0.2%였고, 이는 제16주에 3%로 증가하였으며, 1마리 마우스는 12.8% 정도로 높았다 (도 5b). 이러한 결과는 시간의 함수로서의 게놈-편집된 간세포의 확장을 암시한다. 혈청 c-Myc-태그부착된 AAT (M-AAT-c-Myc) 농도 측정은 이러한 결과를 뒷받침한다. 마우스를 주사 이전에 출혈시켰고, 그 후에는 격주로 출혈시켰으며, 이는 ELISA에 의한 M-AAT-c-Myc 혈청 농도의 모니터링을 허용하였다. M-AAT-c-Myc의 농도는 제1주에 약간 증가하였고, 제1주 내지 제16주에 시간 경과에 따라 평균 10배 증가하였다 (도 5c). 이러한 증가는 시간이 지남에 따라 (p<0.0001) 및 대조군과 처리된 마우스 간에 둘 다에 대해 통계적으로 유의적이다 (p≤0.0002).
결과는 주사 후 10주 및 16주에 c-Myc에 대하여 염색된 간의 서브세트에서 면역조직화학에 의해 입증되었다 (도 5d). 염색은 전체 간 전반에 걸친 간세포의 클러스터를 보여주었고 (도 5d), 클러스터의 크기는 두 시점 사이에서 증가하였다. 이러한 정성적인 관찰은 정량적 한계치 분석에 의해 뒷받침되며 (도 5e), 이는 c-Myc 양성 픽셀 카운트의 백분율을 제10주에서는 1.6%로, 제16주에서는 2.6%로 계산한 것이다. 최종적으로, 혈청 Z-AAT의 수준을 ELISA에 의해 평가하였고, Z-AAT 침묵의 백분율은 시간 경과에 따라 증가되었으며 (도 5f), 이는 제16주에 통계적으로 유의적이었다 (p≤0.0184). 흥미롭게도, Z-AAT 침묵의 크기는 그것이 게놈-편집된 간세포의 양을 훨씬 초과한다는 점을 고려해 볼 때 예상치 못한 것이었다. 이러한 발견은 중요한 의미를 가지고 있으며 모든 간세포가 동일한 양의 Z-AAT를 생산하지는 않는다는 것을 암시한다. 상기 데이터는 진라이드에 대한 가장 높은 정도의 증식 이점 (및 이에 따른 Z-AAT 침묵)이, 많은 양의 Z-AAT를 지속적으로 생산하고 유지하는 간세포에 있을 수 있다는 것을 암시할 수 있다. 대안적으로, 상기 데이터는 편집되지 않은 간세포에서 항-AAT miRNA의 역위 말단 반복 서열 (ITR)-구동된 발현을 암시할 수 있다. 취합해 보면, 상기 데이터는 간 전반에 걸친 세포에서 상동 재조합이 발생하였으며, 이어서 게놈-편집된 간세포가 확창되었고, 그의 확장이 시간이 지남에 따라 Z-AAT의 감소를 동반하면서 혈청 M-AAT의 증가를 초래한다는 가설을 뒷받침해준다.
추가로, 상기 데이터는 게놈 편집된 간세포를 이용한 유전자 요법을 위한 전임상 모델로서의 NSG-PiZ 마우스의 사용을 뒷받침해준다.
실시예 6. NSG-PiZ 마우스의 발생.
NSG-PiZ 마우스는 잭슨 래보라토리(Jackson Laboratory)의 레오나르드 디. 슐츠(Leonard D. Shultz)의 연구용 집락에 의해 제조되었고, 그로부터 수득되었다. 세르핀 펩티다제 억제제의 PiZ 대립 유전자, 클레이드 A (알파-1 안티프로테이나제, 항트립신), 구성원 1 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) 트랜스진을 보유하는 FVB.Cg-Tg(SERPINA1E342K*)#Slcw 마우스는 데이비드 펄뮤터(David Perlmutter) (피츠버그 대학교 의과 대학)로부터 수득하였다. 이러한 트랜스제닉 모델은 인간 Z-AAT 발현을 허용하는 인간 알파-1 항트립신 (SERPINA1*) 트랜스진의 Z 변이체 (PiZ) 대립 유전자를 보유하고 있다. 이러한 PiZ 대립 유전자는 NSG 계통 배경에 대한 마커 지원형 속도 유사유전자형 접근법에 의해 5세대에 걸쳐 역교배되었다. NSG-Tg(SERPINA1*E342K)#Slcw/Sz가 NSG-PiZ 마우스로서 약칭된다. PiZ 트랜스제닉 반접합성 마우스를 이종 교배시켜 PiZ 대립 유전자를 동형접합성으로 고정시켰다. NSG-PiZ 동형 접합체는 잭슨 래보라토리의 SPF 차단 마우스 룸에서 길러졌고, 동형접합성 브리더를 이종 교배함으로써 유지되었다. 생착 실험을 위해 사용된 마우스는 문헌 [Shultz et al., 2005, J Immunol 174:6477-89]에 기재된 바와 같이, 격주로 음료수 중의 술파메톡사졸/트리메토프림에서 유지시켰다. 마우스를 베드-오코브(Bed-o'cob) 1/4" 베딩 (앤더슨스(Andersons)) 상에서 12 hr 조명/암실 주기로 수용하였고, 표준 실험실 음식을 공급하였다. 마우스는 시술 중 임의의 것 전에 금식하지 않았다. 모든 시술은 조명 주기 동안 수행되었다.
실시예 7. 외과적 시술: 비장내 주사 및 부분 간절제술.
모든 수용자 마우스는 6-10주령의 수컷이었고, 이들은 폐쇄된 환기 챔버에서 이소플루란 흡입에 의해 마취시켰다. 비장내 주사를 위해, 비장을 노출시키기 위해 마우스의 왼쪽 요추 부위 옆의 구멍에 절개를 하였다. 1/3 mL 주사기에 연결된 25 게이지 바늘을 사용하여, 행크스 평형 식염수 용액 50 μl에 현탁된 1백만 개의 1차 인간 간세포 (바이오리클레메이션 IVT)를 비장의 하극 내로 주사하였다. 노출된 비장을 복강으로 되돌려 보내고 절개 부위를 흡수성 봉합사 (4-0 비크릴(Vicryl))로 봉합하였다. 피부 절개를 봉합하기 위해 베트 본드를 국소 도포하였다. 부분 간절제술을 위하여, 중앙선 절개를 하여 간을 노출시켰다. 간의 중엽과 좌측엽은 4-0 실크 블레이크 꼰 봉합사로 단단히 묶고 잘라내었다. 전체 간 중 3분의 2가 부분 간절제술에 의해 제거되었다. 나머지 간은 부드럽게 복강으로 되돌려 보냈다. 최종적으로, 복부 벽의 마주보는 부분을 복부 정중선에 맞추고, 흡수성 봉합사 (4-0 비크릴)를 적용하여 절개 부위를 밀봉하였다. 베트 본드를 국소 도포하여 피부 절개 부위를 봉합하였다.
Z-AAT를 발현하는 마우스에게 인간 간세포를 투여하면, 간세포의 약 35-50%가 인간 간세포인 간을 수반한 마우스가 초래되었다. 이들 마우스는 >0.1 mg/mL 혈청 인간 알부민 및 >572 μg/mL 혈청 인간 AAT를 발현하였다. 572 μg/mL (즉, 11 μM)는 특히, 인간 AAT의 단백질 증대에 대한 FDA 승인 치료용 혈청 한계치이다.
실시예 8
게놈 편집은 간 표현형을 개선시킨다
내인성 대립 유전자를 침묵시키기 위한 합성 miRNA 및 야생형 AAT를 발현하는, 프로모터 없는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 알부민 로커스 내로 통합시켰다. 이러한 유전자 편집 접근법은 돌연변이체 단백질을 침묵시키고 정상적인 AAT 생산을 증대시킴으로써, 편집된 간세포의 선택적인 이점을 초래하고, 간 병리상태를 개선시켜 준다.
Z-AAT 간 병리상태는 Z-AAT 단백질의 중합 및 소구체에서의 상기 중합체의 축적에 의해 유발된다. 임상적으로 환자는 간경화증 및 간세포 암종을 유발할 수 있는 간 섬유증을 앓고 있다. 혈청 Z-AAT의 수준은 ELISA에 의해 평가되었고, Z-AAT 침묵의 백분율은 시간이 지남에 따라 증가하고, 이는 성체 처리된 마우스에서 6개월부터 시작하여 통계적으로 유의적이며 (양측 비-대응표본 t 검정, p < 0.0002), P1-처리된 마우스에서는 4개월부터 시작하여 통계적으로 유의적이다 (양측 비-대응표본 t 검정, p < 0.0001). M-AAT-c-Myc 데이터와 일치하여, 성체 처리된 동물에서 보다는 P1-처리된 동물에서 침묵이 더 높다 (양방향 ANOVA, p < 0.0012). 흥미롭게도, Z-AAT 침묵의 크기는 그것이 게놈-편집된 간세포의 양을 훨씬 초과한다는 점을 고려해 볼 때 예상치 못한 것이었다. 이러한 발견은 중요한 의미를 가지고 있으며 모든 간세포가 동일한 양의 Z-AAT를 생산하지는 않는다는 것을 암시하고, 본 발명자들의 데이터에 의해 암시된 바와 같이, 진라이드에 대한 가장 높은 정도의 증식 이점 (및 이에 따른 Z-AAT 침묵)이, 많은 양의 Z-AAT를 지속적으로 생산하고 유지하는 간세포에 있을 수 있는 것으로 추정된다. 대안적으로, 이는 편집되지 않은 간세포에서 항-AAT miRNA의 역위 말단 반복 서열 (ITR)-구동된 발현을 시사할 수 있었다.
간 표현형은 처리 후 6개월 및 8개월에 P1-처리된 마우스에서 추가로 특징 규명되었다. 마젠타 구체로 보이는 Z-AAT 소구체의 양을 평가하기 위해, 과아이오딘산-쉬프-디아스타제 (PAS-D) 염색을 상기 마우스로부터의 간 절편 상에서 수행하였다. 정량화됨에 따라, PAS-D+ 세포의 백분율은 처리 후 6개월과 8개월 둘 다에서 100배 초과 만큼 상당히 감소된다 (양방향 ANOVA, p < 0.0001).
피크로시리우스 레드 (PSR) 면역조직화학 염색을 수컷 동물로부터의 간 절편 상에서 수행하여, 간 섬유증의 척도로서 레드가 나타날 콜라겐 섬유의 양을 평가하였다. PSR+ 세포의 정량화 결과, 처리 후 8개월에 40% 이상의 감소가 나타났다 (양측 비-대응표본 t 검정; 유의적이지 않음). PAS-D 염색 및 PSR 염색에 대한 대표적인 영상을 수득하였다.
모두 취합해 보면, 상기 데이터는 간 전반에 걸친 세포에서 HR이 발생하였으며, 이어서 게놈-편집된 간세포가 선택적으로 확장되었고, 이러한 확장이 시간이 지남에 따라 Z-AAT의 감소를 동반하면서 혈청 M-AAT의 증가를 초래한다는 가설을 뒷받침해준다. 이로써 간 병리상태가 현저하게 개선된다.
명확한 설명을 위해 별도의 실시양태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정의 특색이 또한, 단일 실시양태에서 조합하여 제공될 수 있는 것으로 인지된다. 반대로, 간략한 설명을 위해 단일 실시양태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특색이 또한, 개별적으로 또는 임의의 적절한 서브 조합으로 제공될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 현재, 바람직한 실시양태를 대표하며, 예시적이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 변형 및 다른 용도가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 이러한 변형 및 용도는 청구범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고서도 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The Jackson Laboratory <120> GENETICALLY MODIFIED MOUSE MODEL FOR HUMAN HEPATOCYTE XENOTRANSPLANTATION <130> 47JLA11952WO <150> 62/413,736 <151> 2016-10-27 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His 1 5 10 15 Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu 20 25 30 Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr 35 40 45 Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe 85 90 95 Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu 100 105 110 Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp 115 120 125 Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr 130 135 140 Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe 195 200 205 His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu 210 215 220 Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu 225 230 235 240 Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp 245 250 255 Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile 260 265 270 Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu 275 280 285 Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly 305 310 315 320 Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala 325 330 335 Val Leu Thr Ile Asp Lys Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe 340 345 350 Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys 355 360 365 Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe 370 375 380 Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys 385 390 <210> 2 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaggatcccc agggagatgc tgcccagaag acagatacat cccaccatga tcaggatcac 60 ccaaccttca acaagatcac ccccaacctg gctgagttcg ccttcagcct ataccgccag 120 ctggcacacc agtccaacag caccaatatc ttcttctccc cagtgagcat cgctacagcc 180 tttgcaatgc tctccctggg gaccaaggct gacactcacg atgaaatcct ggagggcctg 240 aatttcaacc tcacggagat tccggaggct cagatccatg aaggcttcca ggaactcctc 300 cgtaccctaa accagccaga cagccagctc cagctgacca ccggcaatgg cctgttcctc 360 agcgagggcc tgaagctagt ggataagttt ttggaggatg ttaaaaagtt gtaccactca 420 gaagccttca ctgtcaactt cggggatcac gaagaggcca agaaacagat caacgattac 480 gtggagaagg gtactcaagg gaaaattgtg gatttggtca aggagcttga cagagacaca 540 gtttttgctc tggtgaatta catcttcttt aaaggcaaat gggagagacc ttttgaagtc 600 aaggacaccg aggacgagga cttccacgtg gaccaggtga ccaccgtgaa ggtccctatg 660 atgaagcgtt taggcatgtt taacatccag cactgtaaga agctgtccag ctgggtactg 720 ctaatgaaat acctgggcaa tgccaccgcc atcttcttcc tacctgatga ggggaaacta 780 cagcacctgg aaaatgaact cacccacgat atcatcacca agttcctgga aaatgaagac 840 agaaggtctg ccagcttaca tttacccaaa ctgtccatta ctggaaccta tgatctgaag 900 agcgtcctgg gtcaactggg catcactaag gtcttcagca atggggctga cctctccggg 960 gtcacagagg aggcacccct gaagctctcc aaggccgtgc ataaggctgt gctgaccatc 1020 gacaagaagg ggactgaagc tgctggggcc atgtttttag aggccatacc aatgtctatc 1080 cccccagagg tcaagttcaa caaacccttt gtcttcttaa tgattgaaca aaataccaag 1140 tctcccctct tcatgggaaa agtggtgaat cccacccaaa aa 1182

Claims (32)

  1. 인간 α-1 항트립신 (AAT)의 PiZ 변이체 (Glu342Lys)를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스로서, 여기서 마우스는 인간 α-1 항트립신의 PiZ 변이체 (Z-AAT)를 발현하고, 여기서 마우스는 Z-AAT를 발현하지 않는 동일한 유형의 면역결핍 마우스와 비교 시 감소된 수의 마우스 간세포를 갖는 것인 면역결핍 마우스.
  2. 제1항에 있어서, 면역결핍 마우스가 유전적으로 변형된 NSG, NRG 또는 NOG 마우스인 면역결핍 마우스.
  3. 제1항에 있어서, 면역결핍 마우스의 간세포가 Z-AAT를 발현하는 것인 면역결핍 마우스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포를 포함하는 이종이식편 또는 동종이식편을 추가로 포함하는 면역결핍 마우스.
  5. 제4항에 있어서, 이종이식편이 인간 간세포를 포함하는 것인 면역결핍 마우스.
  6. 제5항에 있어서, 인간 간세포가 인간 혈청 알부민을 발현하는 것인 면역결핍 마우스.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이식편의 상기 간세포가 마커 단백질을 포함하는 것인 면역결핍 마우스.
  8. 제7항에 있어서, 마커 단백질이 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체인 면역결핍 마우스.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스의 간세포의 적어도 약 25%가, 생착된 인간 간세포인 면역결핍 마우스.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민이 마우스의 혈액에서 검출가능한 것인 면역결핍 마우스.
  11. 제10항에 있어서, 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 0.01 mg/mL 인간 혈청 알부민을 포함하는 면역결핍 마우스.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 간세포가 야생형 인간 AAT를 발현하는 것인 면역결핍 마우스.
  13. 제13항에 있어서, 마우스의 혈청에 존재하는 적어도 약 100 μg/mL 야생형 인간 AAT를 포함하는 면역결핍 마우스.
  14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이식편 또는 동종이식편의 간세포가 게놈-편집된 간세포인 면역결핍 마우스.
  15. 하기 단계를 포함하는, 생착된 외인성 간세포를 포함하는 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법:
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계; 및
    인간 또는 동종이계 간세포를 마우스에게 투여하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 인간 또는 동종이계 간세포가 1차 간세포인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 인간 또는 동종이계 간세포를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것이 상기 간세포를 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 동종이계 간세포를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것이 상기 간세포의 비장내 투여를 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포가 마커 단백질을 발현하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 마커 단백질이 녹색 형광 단백질 또는 그의 형광 유사체인 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 것이, 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에 수행되며, 간독소를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것, 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에서 적어도 부분 간절제술을 수행하는 것, 및 간독소를 투여하는 것과 적어도 부분 간절제술을 수행하는 것 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택된 처리를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 간독소가 모노크로탈린인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에 약 10-100 mg/kg 모노크로탈린을 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 마우스 간세포를 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 처리하는 것이, 인간 또는 동종이계 간세포를 투여하기 전에, 그를 투여하는 동안, 또는 그를 투여한 후에 수행되며, 항-마우스 CD95 항체를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 약 0.1 - 10 μg의 항-마우스 CD95 항체를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  27. 하기 단계를 포함하는, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법:
    제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제공하는 단계;
    인간 간 장애의 추정적 치료를 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스에게 투여하는 단계; 및
    마우스의 인간 간세포에 대한 추정적 치료의 효과를 평가하는 단계.
  28. 제27항에 있어서, 추정적 치료가 바이러스 유전자 요법 벡터의 투여를 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 추정적 치료가 게놈 편집된 인간 간세포의 투여를 포함하는 것인 방법.
  30. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은, 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스.
  31. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은, 유전적으로 변형된 면역결핍 마우스를 제조하는 방법.
  32. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은, 인간 간 장애의 추정적 치료의 안전성 및/또는 효능을 평가하는 방법.
KR1020197014968A 2016-10-27 2017-10-27 인간 간세포 이종이식을 위한 유전적으로 변형된 마우스 모델 KR20190069553A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662413743P 2016-10-27 2016-10-27
US201662413736P 2016-10-27 2016-10-27
US62/413,743 2016-10-27
US62/413,736 2016-10-27
PCT/US2017/058758 WO2018081561A1 (en) 2016-10-27 2017-10-27 Genetically modified mouse model for human hepatocyte xenotransplantation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190069553A true KR20190069553A (ko) 2019-06-19

Family

ID=60451173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197014968A KR20190069553A (ko) 2016-10-27 2017-10-27 인간 간세포 이종이식을 위한 유전적으로 변형된 마우스 모델

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20190274290A1 (ko)
EP (1) EP3532493B1 (ko)
JP (1) JP2020500014A (ko)
KR (1) KR20190069553A (ko)
CN (1) CN109923124A (ko)
AU (1) AU2017348348A1 (ko)
CA (1) CA3041851A1 (ko)
IL (1) IL266117A (ko)
RU (1) RU2019115976A (ko)
SG (1) SG11201903676SA (ko)
WO (1) WO2018081561A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110850070B (zh) * 2019-11-22 2021-06-01 北京大学 一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法
WO2023114461A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 The Jackson Laboratory Humanized mouse model of fibrosis

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2767161T3 (en) 2004-10-19 2018-05-07 Regeneron Pharma Method of generating an animal homozygous for genetic modification
US8569573B2 (en) * 2007-06-05 2013-10-29 Oregon Health & Science University Method of expanding human hepatocytes in vivo
JP2012525154A (ja) * 2009-05-01 2012-10-22 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ 生体内でヒト肝細胞を増大させる方法
EP3318635A1 (en) * 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
WO2013192094A1 (en) * 2012-06-18 2013-12-27 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Reconstituted human liver tumor model

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201903676SA (en) 2019-05-30
CA3041851A1 (en) 2018-05-03
AU2017348348A1 (en) 2019-05-02
RU2019115976A (ru) 2020-11-27
WO2018081561A1 (en) 2018-05-03
CN109923124A (zh) 2019-06-21
EP3532493A1 (en) 2019-09-04
EP3532493B1 (en) 2023-04-26
IL266117A (en) 2019-06-30
US20190274290A1 (en) 2019-09-12
JP2020500014A (ja) 2020-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9839208B2 (en) Human SIRPα transgenic mice and their methods of use
US20200008406A1 (en) Fumarylacetoacetate hydrolase (fah)-deficient and immunodeficient rats and uses thereof
CN110740641A (zh) 具有改善的人先天免疫细胞发育的人源化小鼠模型
KR102377189B1 (ko) C9orf72 유전자좌에서 파괴를 갖는 비-인간 동물
JP6282591B2 (ja) 遺伝子ノックイン非ヒト動物
WO2016154299A1 (en) Genetic modification of pigs for xenotransplantation
US20080070256A1 (en) Non-Human Animal Models for B-cell Non-Hodgkin&#39;s Lymphoma and Uses Thereof
US8431767B2 (en) Transgenic non-human animal and methods for stem cell engraftment
JP7404237B2 (ja) ヒトインターロイキン１５を発現する免疫不全マウス
KR20190069553A (ko) 인간 간세포 이종이식을 위한 유전적으로 변형된 마우스 모델
Moriguchi et al. Gata3 hypomorphic mutant mice rescued with a yeast artificial chromosome transgene suffer a glomerular mesangial cell defect
JP5075641B2 (ja) 遺伝子改変動物およびその用途
KR20200081377A (ko) Slc30a8 돌연변이를 포함하는 비인간 동물 및 사용 방법
FR2822161A1 (fr) Cellule et animal transgenique modelisant les reponses humaines allergiques mediees par les ige, et leurs utilisations
US20090214482A1 (en) Transgenic Mammals Expressing Human Preproinsulin
Burnet et al. Generation and characterization of a Ddx4‐iCre transgenic line for deletion in the germline beginning at genital ridge colonization
US20240130341A1 (en) Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2022012636A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric il17a and/or il17f
JP2023544333A (ja) ヒトｃｒ１を発現する齧歯類動物
Gupta Insulin receptor positive T cell transgenic mice and implications for type-1 diabetes
Willetts The role of VAMP7-mediated events in eosinophil degranulation: implications from animal models of allergic airway inflammation
조범래 Selection of target genes and production of transgenic pigs for xenotransplantation
Bähr founder animals and establishment of breeding herds
Proungvitaya Regulation of inflammation in Th1 CD4 T cell mediated autoimmune responses
Furusawa et al. Catalytic RAG1 mutants obstruct v