KR20090097504A

KR20090097504A - 동물의 형질전환 엠브리오에서 형광 단백질 발현 양상을통해 독성물질의 발생 독성을 평가하는 방법

Info

Publication number: KR20090097504A
Application number: KR1020080022667A
Authority: KR
Inventors: 박재학; 석승혁
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2009-09-16

Abstract

본 발명에 의하면 다른 모델 종들 간에 각각의 독성 정도를 비교하거나 다른 물질들과의 독성 정도를 비교할 수 있으며, 독성물질이 인체에 미치는 유해성을 정량적으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 리포터 유전자의 시·공간 표현 양상을 형광 단백질 발현양상을 통해 관찰하는 것만으로도 초기 발생 단계의 분석이 가능해져 간편하고 경제적이다.

제브라피쉬, 비소, 형광 단백질, 프로모터, 형질 전환

Description

동물의 형질전환 엠브리오에서 형광 단백질 발현 양상을 통해 독성물질의 발생 독성을 평가하는 방법{fluoescent protein as an indicator of developmental toxicity in transgenic embryo}

본 발명은 독성물질이 동물 형질전환 엠브리오의 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법과 평가시 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오 (Embryo)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 독성물질 반응 유전자 프로모터가 삽입된 형광 단백질 발현 벡터를 엠브리오(Embryo)에 주입하여 제조한 동물의 형질전환 엠브리오에 독성 물질을 노출시켜, 상기 독성물질이 엠브리오의 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법과 영향 평가시 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오 (Embryo)에 관한 것이다.

독성물질은 동물은 물론 인간의 건강에 해로운 물질이다. 기관이 형성되기 전 동물의 발생 단계에서 독성 물질에 노출될 경우 심각한 세포 손상이나 염색체 이상을 일으키고 이는 주로 치명적인 기형으로 연결된다. 일부 독성 물질은 반감기가 길기 때문에 기간 형성기간 동안에 순환 과정을 통해 잔류할 수 있고, 모체에 해로워서 자궁 내 환경 자체를 기형 발생적인 환경으로 만들기도 한다. 수정에서부 터 초기 착상 후 기간을 포함한 초기 배아 발생 단계에서 배아가 독성에 노출될 경우배아 단계에서 사멸되는 결과를 낳는다. 1988년에 Generoso, Palpfer and Streffer 등도 배 발생단계 동안에 독성 물질에의 노출은 기형 배아를 증가시킨다고 주장했다.

특히, 독성 물질 중 금속과 비금속의 성질을 동시에 갖고 있는 준금속(Metalloid) 중의 하나인 비소는 가장 독성이 강한 무기원소로 알려져 있다. 서뱅갈, 인도, 방글라데시 등지에서는 식수로 사용하는 지하수에 존재하는 수백 ppb(μg/L) 농도의 비소에 노출된 사람들 대부분이 매우 심각한 질병에 걸려 있는 것으로 보고되고 있다. 비소는 흡수율이 높고 혈액 중에 공존할 뿐만 아니라 혈액에 흡수되는 즉시 폐에 침착되고 여러 기관으로 분포되어 잔존한다. 모체가 비소에 노출된 경우 비소는 태반을 쉽게 통과해서 모유에서도 검출된다고 알려져 있다. 이로 인해 수년 전부터 비소(arsenic)에 의한 유해성이 전 세계적으로 매우 심각한 환경 재해로 받아들여지고 있다.

따라서, 인체 및 동물의 발생과정에 미치는 독성물질 특히, 비소의 유해성을 빠르고 간편하게 측정하는 방법이 절실한 상황이다. 이에 다수의 방법이 개발되고 있는데, 종래에 독성물질을 측정하는 방법으로는 크게 물리화학적 방법과 생물학적 방법이 있다.

유기오염물질성분의 분석에는 클로로메탄, 클로로에탄, 1,1-디클로로메탄, 메틸렌, 트리클로로에탄 등의 발암성 물질 등이 주로 분석되며 대상유기오염물질의 농도는 가스크로마토그래피(GC)를 사용하여 측정한다. 중금속물질 성분에는 크롬, 비소 카드뮴, 납 등이 있으며 주로 유도결합플라즈마(Inductively Coupled Plasma)를 이용하여 측정한다. 유기인계 농약성분인 다이아지논, 파라티온, 말라티온의 시료내 농도는 가스크로마토그래피를 사용하여 측정한다.

그러나 이 방법은 GC-MS(gas chromatography-Mass spectrometry), ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)등 고가의 분석 기자재 및 고도로 숙련된 분석요원을 필요로 하며, 각각의 독성물질에 따라 별도의 분석을 수행하여야 하므로 분석시간이 길고 유입 독성 물질의 성분을 알 수 없을 경우에는 분석하기가 어렵다. 또한 채취한 시료를 먼 거리로 이동시 시료 내 반응 등으로 성분 및 농도의 변화가 생길 수 있는 문제점이 있다.

뿐만 아니라 이러한 이화학적인 측정방법이 생물체에 대한 위해성, 특히 생물체의 발생 과정에 미치는 유해성을 대변하기는 어렵다. 즉, 생물체의 위해가 발생하기 위해서는 환경물질이 생물체 내로 흡수되어야 하고 초기 변병을 유발해야 하는데. 이러한 단순한 환경 매체 내의 오염물질의 존재로서보다는 그것을 대변할 수 있는 생체내의 구체적인 변화로 측정 평가되어야 할 필요가 있기 때문이다.

이러한 단점으로 인하여 생물학적인 방법의 필요성이 대두되었고, 생물을 이용한 방법으로는 박테리아 등의 미생물의 대사 또는 효소를 이용하는 방법, 또는 어패류, 무척추동물, 미세조류(microalgae) 또는 원생동물 등 진핵생물을 이용하는 방법이 있다. 생물학적 지표는 환경물질에 대한 개체의 노출, 전임상적 효과와 예민성을 평가할 수 있는 중요한 지표로서 날로 심각해지는 환경문제에 대한 지표로 서 주목받고 있다.

종래의 생물학적 방법 중 대표적인 것은 Azur Environmental사의 Microtox 분석방법이다. 이는 분리한 미생물의 생물 발광 현상을 이용하여 독성을 측정하는 장치이다. 그러나 이러한 마이크로톡스사의 방법은 독성에 의한 발광 미생물의 폐사 및 발광량 저하에 기초하므로 시료의 독성이 미생물 세포에 어떠한 영향을 끼치는지에 대한 정보를 제공해주지는 못한다. 또한 채취한 시료를 먼 거리로 이동시 시료 내의 반응으로 인해 성분 및 농도의 변화가 생길 수 있으며, 냉동 건조된 발광 미생물을 사용하기 때문에, 냉동 건조된 발광 미생물을 별도 구입해야 하고 냉동 건조된 발광 미생물을 다시 활성화시키기 위해서 마이크로톡스 삼투압 조절액, 마이크로톡스 재생액 등 별도의 시약을 첨가시켜야 할 뿐만 아니라, 별도의 온도 조절 장치가 필요하다.

한국특허 10-0316153 (고정화된 발광 미생물을 이용한 독성 물질 측정방법 및 이를 위한 바이오 센서 키트)는 독성 물질로 인한 발광 미생물의 광량의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 독성 물질 측정 방법에 관한 것이다. 또한 한국특허 등록번호 10-2003-0021091 (고정화된 유전자 재조합 발광 미생물을 이용하여 시료 내 존재하는 독성 물질의 농도, 종류 및 독성 정도를 분석하는 독성 분석 키트)는 독성 물질의 농도에 비례하여 발광량을 증가시키는 유전자 재조합 발광 미생물을 고정화 물질로 마이크로플레이트에 고정한 독성 분석 키트 및 독성 분석 키트의 마이크로플레이트의 웰에 시료를 주입하고, 발광량을 측정하여 시료 내 존재하는 독성 물질의 농도, 종류 및 독성 정도를 분석하는 방법에 관한 것이다.

그러나 이러한 재조합 미생물을 이용하여 독성물질을 분석하는 방법은 유전자 재조합 미생물을 필요로 하기 때문에 미생물 배양이 필수적일 뿐만 아니라 독성물질에 따라 민감도의 차이가 크며 특히, 독성 물질 중 비소에 대해서는 분석된 바가 없다. 더구나 미토콘드리아는 강장동물에 불과해 척추동물인 인체와는 생물 분류를 달리하므로 독성물질이 인체에 미치는 영향에 대한 지표가 될 수는 없다는 한계가 있다.

한국 특허 10-0459107 (녹색 형광 단백질 유전자를 이용한 삭시톡신 검출용 바이오 센서)는 녹색 형광 단백질 유전자로 형질 전환된 대장균에 독성 물질을 처리하여 독성 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이는 독성 물질을 검출하는 방법일뿐 동물의 시·공간적 발현 양상에 관해서는 알 수 없을 뿐만 아니라 독성 물질 중 삭시톡신에 한하는바 제한적이다.

이에 본 발명자들은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하고자 연구하던 중 모든 척추동물들은 기본적인 발생 과정이 매우 유사하며 발생조절 유전자들이 높은 상동성을 가지고 있어 척추동물의 발생 독성 연구를 통하여 얻어진 결과들은 인간의 발생 기작과 질병 연구에 직접 활용될 수 있고, 특히 제브라피쉬는 인간과 같은 척추동물로써 유전체 구성과 발생과정이 인간과 유사하여 인간의 게놈 구조와 큰 차이가 없어 인체의 세포생물학적 연구가 가능할 뿐만 아니라 발생 배가 투명하여 여러 조직과 장기 및 세포의 모양과 움직임과 같은 시 ·공간 양상 관찰이 가능하여 경제적일 뿐만 아니라 간편하다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 동물의 형질전환 엠브리오에 독성 물질을 노출시켜, 독성물질이 엠브리오의 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법과 평가시 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오 (Embryo)에 관한 것으로,

본 발명의 주된 목적은 독성 물질 탐색용 형질 전환 엠브리오에 독성 물질을 노출시켜 형광 단백질의 발현 양, 발현 시기 또는 발현 부위 등 형광단백질의 발현 양상을 확인함으로써 독성물질이 엠브리오 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법과 평가시 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오를 제공함으로써 독성물질의 발생 독성과 작용기전을 확인할 수 있는 도구로써 활용하기 위함이다.

또 다른 목적은 발생 독성 결과를 인간의 발생 기작과 질병 연구에 활용하여 여성에게 임상연구를 하기전과 의약품을 허가하기 전 검증 또는 임신시 부작용에 대한 광범위한 모니터링등의 의학적 문제에 중요한 자료를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 리포터 유전자의 시 공간 표현 양상을 확인하기 위해 며칠에 걸려 염색을 하는 대신에 형광 현미경만으로도 쉽게 형질 전환 동물의 형광 단백질 발현양상을 통해 초기 발생 단계의 분석이 가능하도록 하여 간편하고 경제적이며, 신속한 결과 획득이 가능케 하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 독성물질 반응 유전자 프로모터가 삽입된 형광 단백질 발현 벡터를 엠브리오(Embryo)에 주입하여 제조한 동물의 형질전환 엠브리오에 독성 물질을 노출시켜, 독성물질이 엠브리오의 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 독성물질 반응 유전자 프로모터가 삽입된 형광 단백질 발현 벡터를 도입하여, 독성물질이 엠브리오 발생 과정에 미치는 영향을 평가하는데 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오 (Embryo)에 관한 것이다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 독성물질 반응 유전자 프로모터가 삽입된 형광 단백질 발현 벡터를 엠브리오 (Embryo)에 주입하여 동물의 형질전환 엠브리오를 제조하는 제1단계;

상기 형질 전환 엠브리오를 발달시키는 과정에서 독성물질에 노출시켜 형광 단백질의 발현양상을 평가하는 제2단계를 포함하는 독성물질이 엠브리오의 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법과

독성물질이 동물의 형질전환 엠브리오 발생 과정에 미치는 영향을 평가하는데 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오 (Embryo)이다.

바람직하게는 Hsp70 유전자 프로모터인 HSRE (heat-shock responsive element) 또는 CYP1A1 유전자 프로모터인 AhRE (aryl-hydrocarbon responsive element)를 벡터에 삽입하는 것을 특징으로 하고,

상기 사람의 HSRE 또는 AhRE 프로모터는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라 이머를 사용하여 HSRE를 클로닝하는 단계 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 AhRE를 클로닝한 프로모터임을 특징으로 한다.

본 발명의 독성물질 반응 유전자 프로모터를 형광 단백질을 발현하는 벡터에 삽입하여 형질 전환하는 엠브리오는 다음과 같이 제조할 수 있다.

먼저, 독성 물질 반응유전자 프로모터 (promoter)를 클로닝한다.

예를 들어, HSRE를 얻기 위해 Hum-Hsp70-pro-A1 (서열번호 1 : CTG TTC CCT CCA GTG AAT) 및 Hum-Hsp70-pro-B1 (서열번호 2 : GGT AGT GGA CTG TCG CAG) 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 기법으로 Hsp70 유전자의 5'-프로모터 부분을 pCR3.1 벡터에 클로닝하고, 이 벡터의 염기서열을 결정하여 Hsp70 프로모터와 염기서열이 일치함을 확인한다.

또한, AhRE-EGFP는 Hun-1A1-5-E1 (서열번호 3 : CTG GGA TCA CAA GGA TCA GG) 및 Hum-1A1-5-F1 (서열번호 4 : AGC CAC ACG CAG ACC TAG AC) 프라이머를 사용하여 PCR 기법으로 CYP1A1 유전자의 5'-프로모터 부분을 pCR3.1 벡터에 클로닝하고, 이 벡터의 염기서열을 결정하여 CYP1A1 프로모터와 염기서열이 일치함을 확인한다.

이와 같이 제조된 프로모터를 형광 단백질을 발현하는 벡터에 삽입한다.

예를 들어, 위에서 설시한 Hsp70 프로모터를 pEGFP-C1 벡터로 서브클로닝(subcloning)하여 pHSRE-EGFP를 제조할 수 있고, 제조된 CYP1A1 프로모터 또한 pDGFP-C1 벡터로 서브클로닝하여 AhRE-EGFP를 제조할 수 있다.

이렇게 제조된 벡터를 발생 배에 주입한 후 배양하면 동물의 형질전환 엠브리오를 수득할 수 있다.

본 발명에서 "형질 전환 (Transfection)"이라 함은 DNA를 배양 (culture) 중인 세포 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것이다. DNA를 세포 내로 유입시키는 방법은 크게 화학적 방법, 물리적 방법 , 바이러스 중재 방법 등 3가지로 분류할 수 있다. 화학적 방법에는 칼슘-인산염 (calcium-phosphate), DEAE-덱스트란(dextran), 리포펙틴 (Lipofectin) 등의 양이온 리포솜 (cationic liposome) 등이 DNA를 패키징 (packaging) 하는 작용제(agent)로 사용될 수 있다. 물리적 방법으로는 전기 천공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 등이 사용될 수 있으며, 그밖에 바이러스-중재 방법 (virus-mediated method)으로서 아데노바이러스 (adenovirus)나 레트로바이러스 (retrovirus)의 바이러스 게놈 (virus genome)에 원하는 DNA를 클로닝 (cloning) 삽입하여 세포에 감염시키는 방법도 많이 사용되고 있다.

특히, 배아 형질 전환 방법으로는 electroporation, DNA particle bombardment, sperm-mediated gene transfer, viral infection, direct muscle injection insulator, transposon등이 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 microinjection에 의한다.

본 발명에서 "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모 터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서 "HSP (Heat shock protein) 또는 스트레스 단백질 (stress protein)"은 모든 생명체의 모든 세포에 존재하는 단백질 그룹 중의 하나로 열,추위, 또는 산소 부족과 같은 다양한 환경적 스트레스에 처했을 때 발현되는 단백질을 말한다. HSP (Heat-shock protein)는 분자량에 따라 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60와 작은 HSP 군 (small HSP family)으로 분류되며, 다수의 HSP에서 비생물적 환경스트레스에 의한 세포 단백질의 불활성화 방지 기능-분자적 샤페론(molecular chaperone) 기능이 있다.

본 발명에서 "AHR (Ah receptor) 리간드(ligands)"는 AHRE를 활성화시키고 면역억제, 기형발생 (teratogenesis), 종양발생, 내분비장애, 심장혈관계 질환 등 다양한 부작용을 일으키는 것을 말한다. AhR는 사람 세포에서 다이옥신(dioxin) 등의 화합물과 결합하여 세포질에서 활성화되어 핵으로 이동하여, 여러 대사 관련 유전자의 5' 부분(region)에 있는 AhRE에 결합하고 해당 유전자를 발현한다.

본 발명의 프로모터를 코딩하는 서열은 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 염기서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에서 "상동성"이란 천연형(wild type)의 핵산 서열과의 동일한 정도를 나타내는 것으로 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 본 발명의 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 프로모터 영역을 코딩하는 핵산 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에서 "벡터"란 목적 유전자를 코딩하는 DNA, RNA 등의 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하기 위한 수단을 의미한다.

본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 프로모터가 독성 물질 탐색용 프로모터인 벡터로서, 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 벡터는 숙주세포의 게놈 내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 중금속 유도성 발현조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당

해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 "동물"은 척추동물과 무척추동물로 나뉘고 척추동물에는 양서류, 파충류, 포유류, 조류를 포함하며 바람직하게는 어류를 포함하는 것을 특징으로 한다. 어류는 연근해 어류, 패류 어류, 내수면 어류,원양어류, 해조류어류 등 개서대, 용서대, 흑대기, 노랑각시, 서대, 객주리, 날개쥐치, 말쥐치,쥐치, 거북복, 가시복, 개복치, 은밀복, 흑밀복, 복 섬, 졸 복, 흰점복, 검 복, 검자주복, 자주복, 까치복 등을 포함하고, 바람직하게는 제브라피쉬인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 제브라피쉬는 D. 아크로스토무스(acrostomus), D. 애퀴핀나투스(aequipinnatus), D. 말라바리쿠스(malabaricus),D. 알볼리네아투스(albolineatus), D. 안난달레이(annandalei), D. 아포곤(apogon), D. 아포파이리스(apopyris), D. 아싸멘시스(assamensis), D. 초프래(choprae), D.크라이소타에니아투스(chrysotaeniatus), D. 당길라(dangila), D. 데바리오(devario), D. 팡팡개(fangfangae), D.프란케이( frankei), D. 프라세리(fraseri), D. 지버(gibber), D. 인터럽투스(interruptus), D. 카크히에넨시스(kakhienensis), D. 카이아티트(kyathit), D. 라오엔시스(laoensis), D. 렙토스(leptos), D. 마에타엔겐시스(maetaengensis), D. 말라바리쿠스(malabaricus), D. 나가넨시스(naganensis), D. 네일그헤르리엔시스(neilgherriensis), D. 니그로파스시아투스(nigrofasciatus), D. 파티라나(pathirana), D. 레지나(regina), D. 레리오(rerio), D. 로세우스(roseus), D. 살모나타(salmonata), D. 샤넨시스(shanensis), D. 스피노수스(spinosus), 브라차이다니오 프란케이, 및 브란차이다니오 sp.로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "형광 단백질"은 특정 파장의 빛을 받을 경우 이를 흡수하여 활성화된 뒤 다시 정상상태로 되돌아 가는 과정에서 특정 파장의 빛을 외부로 발산함으로써 독특한 색깔의 빛을 내는 단백질을 일컫는다. 특정 파장의 빛을 받을 경우 이를 흡수하여 활성화된 뒤 다시 정상상태로 되돌아 가는 과정에서 특정 파장의 빛을 외부로 발산함으로써 독특한 색깔의 빛을 내는 것이다.

형광 단백질을 특성을 알고자 하는 단백질 앞쪽 혹은 뒤쪽에 결합시킴으로써 실험에 사용되는 단백질의 발현 과정이나 세포 내 위치 등을 쉽게 알 수가 있다. 또한 부가적인 cofactors나 substrates를 필요로 하지 않고서도 직접 형광을 검출할 수 있고 대부분의 생물종에서 단백질을 발현할 수 있으며 안정된 단백질인바 고정화 처리하는 것으로 단백질을 장기 보관, 유지할 수 있다는 장점이 있다. 형광 단백질로는 녹색 형광을 나타내는 GFP(Green Fluorescence Proein)를 비롯해, 변형된 녹색 형광성 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광성 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광성 단백질(RFP), 증강된 적색 형광성 단백질(ERFP), 청색 형광성 단백질(BFP), 증강된 청색 형광성 단백질(EBFP), 황색 형광성 단백질(YFP), 증강된 황색 형광성 단백질(EYFP), 남색 형광성 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광성 단백질(ECFP)등 많은 종류의 형광 단백질들이 있으며 실제로 우리가 눈으로 볼 수 있는 거의 모든 영역의 파장을 모두 사용하고 있다. 다른 파장의 형광 단백질로, multi-color labeling이나 FRET(Fluorescent resonance energy transfer) application에 이상적이다. 본 발명에서는 바람직하게는 YFP(yellow fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), EGFP(enhanced GFP), BFP(blue fluorescent protein), EBFP(enhanced BFP), CFP(cyan fluorescent protein) 또는 ECFP(enhanced CFP)임을 특징으로 한다.

본 발명에서 "독성 물질"에는 카드뮴 (cadmium), L-아제티딘(azetidine)-2-카르복시산 (carboxylic acid), 2,3,7,8-테트라클로로디벤조 (tetrachlorodibenzo)-p-다이옥신 (dioxin), 3-메틸콜란트렌 (methyl cholanthrene), 3,4,5,3',4',5'-헥사크로모바이페닐 (hexabromobiphenyl), 아로클로 (Aroclor) 1254 또는 벤조에이피렌 (benzo[a]pyrene)가 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 상기 독성물질은 비소 (arsenic)임을 특징으로 한다. 본 발명에서 비소의 발생 독성 분석을 위한 기준 데이터가 되는 비소 농도는 바람직하게는 10.0 μM (비소 EC50 보다 더 낮음) 내지 300.0 μM (비소 LC50 보다 높음)로 한다.

본 발명에서 제조된 형질 전환 엠브리오를 발달시키는 과정에서 독성물질에 노출시켜 형광 단백질의 발현양상을 평가하고, 평가방법에는 형광 단백질의 발현 양, 발현 시기 또는 발현 부위를 확인하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

"엠브리오 발생"은 난할, 낭배, 기관 형성을 거쳐 애벌레단계를 지나 성숙하는 단계에 이른다. 다양한 동물들의 기본적 발생 조절 기작은 서로 매우 유사하여 서로 유사한 형태 형성 과정을 공유한다.

예를 들어 인간의 엠브리오 발생 단계를 근거로 설명하면,

난할기란 수정란의 초기 세포분열 과정을 말하고 난할이 진행되면 할구(난할 결과 생긴 세포)의 수는 증가하나 크기는 감소하는 시기이다. 1분열(2세포기)은 경할(세로로 분열), 2분열(4세포기)도 경할(1분열과 직각방향으로 세로), 3분열(8세포기)은 위할(가로로 분열)이 일어난다.

상실기란 수정란이 난할을 거듭하여 할구의 수가 무수히 많아져서 마치 뽕나무열매(오디, 桑實)와 같은 모양이 되는 단계를 말한다.

포배기는 할구의 수가 증가함에 따라 중앙 쪽에 있던 할구들이 외부에서 산소를 얻기 위해 표면으로 솟아 올라와 안쪽에 텅 빈 공간(난할강, 할강)이 생기는 시기를 말한다.

낭배기는 동물극(위쪽)의 분열 속도가 식물극(아래쪽)보다 더 빠르기 때문에 식물극 쪽으로 세포들이 밀려 들어가서(함입) 주머니 모양이 되는 시기를 말한다. 이때 생긴 구멍을 원구라 하고, 원구 내부의 공간을 원장이라 함원구가 그대로 입이 되면 선구동물(원중배엽세포계 동물)이라 하고,원구가 항문이 되고 입이 나중에 생기면 후구동물(원장체강계 동물)이라 한다. 이때 외부에 남아 있는 세포층을 외배엽, 함입되어 밀려 들어간 세포층을 내배엽,나중에 외배엽과 내배엽 사이에 새롭게 생기는 세포층을 중배엽이라한다.

신경배는 낭배기가 끝날 무렵이 되면 신경관이란 부위가 분화되어 뇌와 척수가 생기는 단계이다.

기관형성기는 각 배엽에서 기관이 형성되는 시기로 외배엽은 표피, 신경계, 감각기관 등이, 내배엽에서는 소화계, 호흡계등이, 중배엽은 중앙부에 척색이 형성되어 사람은 척추로 분화하고, 체절. 측판이이란 부위에서 골격계, 근육계, 생식계, 배설계, 순환계 등이 분화된다.

제브라피쉬는 사람 염색체와 90% 유사하고 허파를 제외하고는 간, 췌장, 그리고 지라, 흉선 등 면역계를 포함한 대부분의 기관을 가지며, 특히 돌연변이 연구에서 밝혀지는 여러 결과들이 인간의 유전질환과 매우 유사하다.

"발생 시기"와 관련하여 제브라피쉬는 발생이 매우 빨라 초기 세포분열은 대장균(20분)보다도 빠르게 15분 간격으로 진행되며, 발생 6시간째 낭배형성이 시작되어 4시간 만에 마치며, 신경발생은 낭배가 형성되면서 시작된다. 발생 12시간이 지나면 눈의 형태형성이 이미 시작된다. 수정 후 24시간이 지나면 심장의 박동과 혈액순환을 관찰할 수 있다.

이하 , 제브라피쉬의 엠브리오 발생 과정은 다음과 같다.

"형광 단백질의 발현 양"은 예를 들어, 형광 강도를 측정하거나 형광 단백질의 양을 측정하는 것으로 확인할 수 있다.

상기 형광 단백질의 양 측정을 위한 "단백질의 정제"는 예를 들어, tag을 단백질 앞, 뒤에 붙이는 방법으로 β-galactosidase, glutathione Stransferase(GST) 등의 효소 tags, IgG와의 친화성을 이용한 protein A 등의 단백질 tags, 금속친화성을 이용한 polyhistidine tag, 소수성 결합을 이용한 polyphenylalanine tag, 이온 교환수지를 이용할 수 있는 polyalanine tag 등의 방법에 의할 수 있다. 본 발명과 관련해서는 니켈과의 친화도를 이용한 크로마토그래피로 정제된 His-tagged GFP가 이용될 수 있다.

본 발명에서 상기 "형광성" 관찰을 위한 장치로는 형광실체현미경 (Fluorescence Stereomicroscope)과 형광 현미경 (Fluorescence Microscope)등이 포함된다.

형광실체현미경이란 일반 실체현미경과 유사한데, 광원으로 백색광이 아닌 형광 램프에서 방출되는 특별한 파장의 빛(UV)을 사용하며 관찰시에도 필터를 사용해 여러 가지 색깔의 각종 형광을 관찰할 수 있는 기능이 있다. 일반 형광현미경으로는 관찰할 수 없는 각종 형광발현 형질전환 동물들을 포함한 큰 사이즈의 종들에서 형광발현을 관찰할 수도 있다.

형광 현미경(fluorescent microscope,螢光顯微鏡)의 경우 파장이 짧은 자외선을 시료에 비추면 형광을 발하는 원리를 이용해, 시료에 형광물질(형광색소)을 처리한 후 관찰하는 방법으로 조직 절편 및 세포 중에서 실체 이미지 및 형광 이미지 관찰이 가능하다.

"형광강도 측정"은 Laser scanning-confocal, andmulti-photon microscopy, Evanescent wave microscopy, Wide-field microscopy등을 포함하고 바람직하게는 The PerkinElmer Victor3 1420 multilabel counter로 할 수 있다.

"발광량 변화의 차이"는 비속도법, 생체발광량도법, 감마법 등을 통해 계산되고 여기에서 계산된 값은 직선에 가까운 값을 가진다. 이때 계산하는 방법은 다음과 같은 방법을 포함한다.

a)비속도(specific rate)를 이용한 방법

일정기간 동안 발생하는 생체발광량을 측정하는 방법으로,

μ(비속도)= (lnL2- lnL1 (t2 -t1 )

t1 : 처음측정시간 t2 : 두 번째 측정시간

L1 : 처음 측정되는 생체발광량도 L2 : 두 번째 측정되는 생체발광량도

b) 생체발광도법 ( bioluminescence intensity )

Io /I = I+Ks[Q]

Io :독성물질이 없을때의 생체발광도 I: 독성물질이 없을때의 생체발광도

Ks: 상수(constant) [Q]: 독성물질의 농도

c)감마값(γ value )

잔류하는 발광량에 대한 감소한 빛의 양의 비

γ(t,T): T℃에서의 t시간동안의 감마효과

R(t): t시간동안 독성물질이 유입되지 않은 시료(블랭크)의 생체발광량도의 비,

t시간 후의 독성물질이 유입되지 않은시료의 생체발광량을 처음 측정할 때의 값으 나누어서 구한다.

L(0): 처음 측정할 때의 샘플의 생체발광도 L(t): t시간후의 생체발광도

각 농도에서의 γ값을 구하여 독성물질의 농도와 γ값을 로그-로그 그래프에 나타내며 직선화하여 표현할 수 있다. 이때의 γ=1이 되는 독성물질의 농도가 EC50 값이 된다. 이 때의 값은 각각의 독성물질의 종류에 따라 다르게 나타내어진다. 이와 같은 특성을 이용하여 그 값을 구하고 그 값이 EC50 을 넘어서게 되면 경보를 발령 하거나 디스플레이 한다.

본원 발명에서는 형질 전환 엠브리오가 독성 물질의 농도에 따라 발현하는 정제된 형광단백질의 양과 형광강도를 측정하여 수득한 데이터를 이용해 표준 곡선 방정식을 구성하는 데 있어 회귀 분석이 이용된다.

본 발명에서 "회귀분석"이라 함은 어떤 변수가 다른 변수에 의하여 설명된다고 보고 그 함수 관계를 조사하는 통계적인 해석 수법을 말한다. 이때 통계적 분석을 위한 수치는 평균 ±S.D.로 표현되고 평균치 사이의 차이에 대한 가중치는 Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 컴퓨터 패키지를 사용한 복합적인 비교를 위해 분산의 일 방향 분석(ANOVA)을 거친 뒤 The Duncan test를 할 수 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 독성물질의 발생 독성과 작용기전을 확인할 수 있는 도구로써 발생 독성 결과를 통하여 인간의 발생 기작과 질병 연구에 활용하여 의약품 등의 의학적 문제와 관련한 중요한 정보를 제공한다.

또한 다른 기질(substrates)이나 보조인자(cofactors) 첨가 없이도 동물이나 인체에 미치는 유해성을 정량적으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 리포터 유전자의 시 공간 표현 양상을 확인하기 위해 며칠에 걸려 염색을 하는 대신에 형질 변환 엠브리오의 형광 단백질 발현을 통해 빠른 시간 내에 변환 유전자 단백질이 발현되게 할 수 있고 이로써 형광 현미경만으로도 쉽게 초기 발생 단계의 분석이 가능해져 간편하고 경제적이며, 신속한 결과 획득이 가능하다.

이하에서는 본 발명을 하기의 실시를 위한 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실기 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1>

화학 물질

비소(arsenite (NaAsO2))는 Sigma (St. Louis, MO)에서 습득하였고, N-acetyl-cysteine (NAC), 1-pheny 2-thiourea을 습득했고, 녹색 형광 물질(GFP; recombinant protein expressed in E. coli)은 Upstate (Lake Placid, NY)을 통해 습득했다.

제브라피쉬

제브라피쉬는 froma에서 습득했고 14:10 h light/dark cycle at 28.5 °C의 탱크에서 제브라피쉬를 사육했다. 성장한 제브라피쉬에게는 깨끗한 물의 Flakefood 와 살아있는 바다 새우와 shrimp를 하루에 두 번 주었다. The Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee (Approval no. SNU-050418-2)의 지침에 따라 물고기를 사육했다.

플라스미드 벡터의 구성 ( Construction of plasmid vector )

인간의 hsp70 조절 리포터 플라스미드인, pHhsp70-EGFP는 HSE 서열 일부와 전환된 CAAT-box, a TATA-box로 구성된다.

즉, 먼저 사람의 공해물질 반응유전자 프로모터 (promoter)를 클로닝하는데, HSRE를 얻기 위하여 Hum-Hsp70-pro-A1 (서열번호 1 : CTG TTC CCT CCA GTG AAT) 및 Hum-Hsp70-pro-B1 (서열번호 2 : GGT AGT GGA CTG TCG CAG) 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 기법으로 Hsp70 유전자의 5'-프로모터 부분을 pCR3.1 벡터에 클로닝하고, 이 벡터의 염기서열을 결정하여 Hsp70 프로모터와 염기서열이 일치함을 확인하고, AhRE-EGFP는 Hun-1A1-5-E1 (서열번호 3 : CTG GGA TCA CAA GGA TCA GG) 및 Hum-1A1-5-F1 (서열번호 4 : AGC CAC ACG CAG ACC TAG AC) 프라이머를 사용하여 PCR 기법으로 CYP1A1 유전자의 5'-프로모터 부분을 pCR3.1 벡터에 클로닝하고, 이 벡터의 염기서열을 결정하여 CYP1A1 프로모터와 염기서열이 일치함을 확인했다. 그 다음에는 제조된 Hsp70 프로모터를 pEGFP-C1 벡터로 서브클로닝(subcloning)하여 pHSRE-EGFP를 제조하거나, 제조된 CYP1A1 프로모터 또한 pDGFP-C1 벡터로 서브클로닝하여 AhRE-EGFP를 제조했다.

< 실험예 2>

비소 독성 농도 범위 결정

형질 전환 제브라피쉬로 실험을 하기 전에, 초기 유충단계의 제브라피쉬에서 비소 독성을 결정하고 hsp70 발현에 대한 농도 범위를 결정하기 위해서 0-200μM 범위의 비소 농도로 72hpf에서 야생 제브라피쉬 유충을 대상으로 96-h 독성 테스트를 실시했다. The median lethal concentration (LC50), The median combined adverse effect concentration(EC50)을 결정하고 유전자 발현에 관한 비소노출 농도를 선택하기 위해서 Blechinger's method를 이용해 비소 독성에 따른 민감도 테스트를 거쳤다. 막 부화한 유충을 링거액 혹은 비소 (0.300 μM)에 96시간, 수정 후 72시간 (72 hour post fertilization (72hpf)) 동안 계속해서 노출시켰다. 비소에 유도된 산화 스트레스를 막기 위해서 비소 처리 전 24시간 동안 항산화제 조절제 (antioxidative modulator (30 μMNAC))로 처리하였다. 각 농도에서 3배로 처리하였다. 하루에 두 번 형태 관찰을 하고 용액을 갈아주었고, 사멸한 유충의 수를 센 후에 용액에서 제거하였다. 각 농도에서 마지막 유충의 평균 비율을 계산했다. The LC50 와 EC50는 각각 94.12 μM(90.66-98.57 μM의 95%신뢰 범위)과 39.01 μM(35.34-42.96 μM의 95%신뢰 범위)로 계산되었다. 제브라피쉬의 배아에서 비소 독성과 세포 독성 간의 관계를 검토해 본 결과, 인간 hsp70 발현 실험으로 10.0 μM (비소 EC50 보다 더 낮음), 50.0 μM (비소 EC50 와 LC50 사이임), 300.0 μM (비 소 LC50 보다 높음)의 비소 농도로 범위가 결정되었다.

< 실험예 3>

제브라피쉬의 발생에 비소 독성이 미치는 영향

hsp70 형질전환 제브라피쉬를 비소에 처리한 다음 초반에 관찰된 결과는 사멸(mortality), 부종(edema), 부풀지않는 부레(uninflated swim bladder), 각화증(keratosis), 몸통기형(trunk abnormalitie(척추전만, 척추측만증, 척추후만))이였다. 부종은 200μM의 비소 처리 이후에 pericarninal Q1 부위 6h에서 관찰되었고 몇몇 부위에서는 피하 부종이 발견되었다. 또한 비소 유발 독성과 산화 스트레스간에 관계가 있는지를 검토하기 위해 24시간 동안 30μM NAC로 사전처리했다. 항산화제인 NAC를 사전에 처리한 결과 비소에 의한 제브라피쉬의 형질 이상 현상이 사라졌다. 비소 독성이 산화 스트레스를 발생시킨다는 것을 보여주었다(도2).

< 실험예 4>

비소독성과 자기사멸과의 연관성

자기사멸이란 '세포(細胞)가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태' 로 세포가 축소되면서 시작되고 그 이후 인접하는 세포 사이에 틈새가 생기고, 세포 내에서는 DNA가 규칙적으로 절단되어 단편화되어 마지막에 세포 전체도 단편화 하여 아포토시스 소체라고 불리는 것으로 된 후 가까이 있는 세포에게 먹혀버림으로써 죽음에 이르게 되는 것을 말한다.

자기 사멸 분석을 위하여 배아가 투명하게 되도록 75 μMPTU에 노출시켰다. PTU 처리는 28 원체절 단계에서 시작해서 실험 끝까지 지속했다. 36시간 (72 hpf) 동안 비소처리 한 후에 배아는 실내 온도에서 10분 동안 4% paraformaldehyde로 고정시키고 an ethanol/PBS series (1:3, 1:1, 3:1)로 탈수시켰고 10분 동안 -20°C 아세톤에서 부화시키고 PBS로 10분 동안 두 번 헹궜다. 배아는 E0.1% Triton X-100 함유액과 0.1% sodium citrate를 함유한 PBS에서 실내온도 15분 동안 부화시켜 더 투과성이 좋게 만들고 PBS로 10분 동안 헹궈낸 후에 The In Situ Cell Death Detection Kit, POD로 TUNEL 분석했다.

TUNEL 양성 반응 세포로 배아가 발생하는 과정을 살펴봄으로써 자기사멸활동이 제브라피쉬의 비소 처리와 연관되어 있는지 여부를 분석할 수 있다. 초반의 72hpf 36시간 동안 300μM 비소 처리한 배아의 외심막 상피 조직, 몸통, grill에서 자기사멸현상이 관찰되었다. 그러나 비소 처리 이전에 항산화제인 NAC 300μM 로 사전 처리한 배아에서는 자기사멸활동이 증가하지 않았다. 이러한 양상은 고농도의 비소가 세포사멸로 이어지는 산화 스트레스를 발생시킴을 보여주었다. 비소 처리한 배아에서 자기 사멸이 일어나는 세포 부위는 외심막 상피 조직, 몸통, grill에 집중되어 나타났는바, 이는 제브라피쉬의 형태 파괴 부위와도 일치했다. 이는 비소에 의해 유도된 자기사멸 부위가 EGFP발현 부위와 관련되어 있음을 보여주었다. 도 3은 이러한 결과를 나타내었다.

< 실험예 5>

비소 농도에 따른 형질 전환 제브라피쉬 배아의 EGFP 발현 양상

인간 hsp70 프로모터와 EGFP 리포터 유전자를 가진 형질전환 제브라피쉬에서 최대의 EGFP 축적을 위해 72 hpf에서 링거액이나 비소 (저농도: 50 μM, 고농도: 300 μM)에 3시간 동안 노출시켰다. 링거액이란 생리적 식염수에 칼륨, 칼슘 이온을 첨가한 것으로 이러한 링거액에 노출된 제브라피쉬에서는 EGFP가 나타나지 않은 반면, 50 과 300 μM 의 비소에 노출된 배아 중 각각 91.7% 과 94.3%는 EGFP가 발현되었다. 제브라피쉬의 조직에서 유전자를 발현시키는 비소 처리 농도당 유충 비율은 살아있는 유충의 전신에 위치하는 형광 지점에 따라 달라졌다. 비소 50 과 300 μM는 발생 중인 피부(Skin), Gill, 후각상피조직(olfactory epithelium), 신경세포(Neuronal cell), 망막(Retina), 근관(Myotube)에서 EGFP를 발생시켰다. grill은 가장 빠른 속도로 강한 EGFP 발현 양상을 보였는데 이는 이것이 가장 민감한 조직이여서 상대적으로 낮은 금속의 농도에서조차 쉽게 영향을 받을 수 있음을 암시했다. 비소 독성은 많은 조직에서 질병을 일으켰다. EGFP를 발현시키는 조직의 유형과 수 면에서 EGFP의 형광성은 농도 의존적인 양상을 보였다. 이하 표에서 이러한 결과를 나타내었다.

Percent embryos expressing EGFP in tissue

Treatment (μM arsenite)	Percent embryos expressing EGFP in tissue
Treatment (μM arsenite)	Skin	Gill	Olfactory epithelium	Neuronal cell	Retina	Myotube
0(n= 88)	0	0	0	0	0	0
10 (n= 90)	88.9	90.0	46.7	66.7	54.4	61.1
50 (n= 96)	80.3	91.7	52.1	72.2	50.5	51.2
300 (n= 87)	81.1	94.3	65.2	71.0	69.7	65.2

< 실험예 6>

Hsp -70에 의해 조절되는 EGFP 발현 형질 전환 제브라피쉬에서 나타나는 시간에 따른 빛과 형광도의 발현 양상

형질전환 물고기를 비소에 노출시킨 이후 EGFP 발현을 관찰한 결과 비소 노출 직후인 3시간 내에서는 즉각적으로 형광물질이 발현되지 않았다. 이는 hsp70 유전자 트랜스크립션이 시작되어 신호를 발생시킬 정도의 충분한 EGFP의 축적이 있기까지 요구되는 시간 때문으로 추측된다. 피부(Skin), Gill, 후각상피조직 (olfactory epithelium)는 독성물질인 비소가 포함되지 않은 깨끗한 물로 옮긴 뒤 6시간 이후에 제일 먼저 형광성을 드러내었다. 물 갈아 준 뒤 24시간 이후에는 신경세포 (Neuronal cell), 망막 (Retina), 근관 (Myotube)에서도 EGFP가 나타났다.

< 실험예 7>

비소 농도에 따라 Hsp -70에 의해 조절되는 EGFP 발현 형질 전환 제브라피쉬에서의 빛과 형광도의 발현 양상의 공간적 관찰

EGFP의 공간적 발현 양상은 72hsp에서 비소에 3시간 동안 노출시킨 뒤에는 96hsp를 나타내었다. 피부(Skin), Gill ,후각상피조직(olfactory epithelium), 신경세포(Neuronal cell), 망막(Retina), 근관(Myotube)에서 EGFP가 발현되었고 모든 농도에서 눈의 렌즈부위와 난황 부위에서 가장 낮은 자체 형광도를 보였다. NAC를 24시간 동안 사전 처리한 경우에는 hsp70 유전자 활동을 막아 EGFP 발현 양이 줄어들었다. 도 5에서 이러한 결과를 나타내었다.

< 실험예 8>

8-1 GFP standard curves ( GFP 표준 곡선 방정식)

니켈과의 친화도를 이용한 크로마토그래피로 정제된 His-tagged GFP는 형광강도와 단백질의 양에 대한 표준 곡선을 만드는데 이용된다.

표준곡선에서 GFP양의 범위는 10.0ng 에서 15.0μg로 했다. The PerkinElmer Victor3 1420 multilabel가 535 nm에서 초당 각 샘플을 스캔하기 위해 사용되었다.

회귀분석은 형광강도와 GFP의 양 간의 연관성을 검토하기 위해 사용되었다.

8-2 EGFP quantification ( EGFP 정량화)

각 샘플의 상대적 형광성은 a PerkinElmer Victor3 1420 multilabel counter로 정량화되었다. EGFP의 증강 값을 정량화하기 위해 무작위 추출된 12개의 배아에서 단백질을 추출했다. 제브라피쉬의 유충을 포함해 모아진 조직은 라이시스 버퍼의 5층 두께에서 세라믹 모터로 균질화되었다. 수용성 단백질은 Bradford 방법을 이용해 추출하여 정량화되었다. 깨끗한 바닥의 black 96-well 플레이트에서 추출 샘플의 형광강도를 분석했다. 각 웰에서의 단백질 농도를 1.5 라이시스 버퍼로 희석했다. EGFP값은 이미 알고 있는 GFP의 양을 표준 곡선 방정식에 대입하여 정량화하여 산출했다. 수치는 아무것도 주입하지 않은 대조군의 535nm 수치 값을 빼서 표준화했다

8-3 통계적 분석( Statistical analysis )

수치는 평균 ±S.D.로 표현되고 평균치 사이의 차이에 대한 가중치는 Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 컴퓨터 패키지를 사용한 복합적인 비교를 위해 분산의 일 방향 분석(ANOVA)을 거친 뒤 Duncan test를 했다. The LC50 와 EC50 수치는 Pb0.05단계에서 SPSS probit에 의해 측정했다. 대조군과 실험군 사이의 차이는 Fischer's exact test을 이용하여 가중치 테스트를 거쳤다. 조직 특이적 인간 hsp70-EGFP 발현 양으로 모든 수치는 대조군의 hsp70-EGFP와는 상당히 차이가 있었다.

8-4 이미 수득한 GFP 양 데이터를 통해 표준곡선 방적식을 이용하여 EGFP 의 양을 정량화하는 방법

비소 처리된 형질 전환 제브라피쉬를 EGFP양으로 평가하기 위해 배아 조직 200㎎을 모아 균질화하여 단백질을 추출하였다. 이로부터 나온 결과로 보건대, 연관성은 상당했으며 고농도 비소에 노출된 제브라피쉬의 경우에는 정상 제브라피쉬의 69.67±22.0 와 비교했을때 309.67±9.64를 발현시켰다. (ng EGFP/g 배아조직) 상기 A 데이터로 구성된 표준 곡선 방정식은 수득한 형광강도를 EGFP발현 양으로 수치화하기 위해 이용되었다. EGFP의 발현 양은 형광 강도와 직접 비례했다. 특히, PBS 현탁액 속의 정제된 GFP는 10.0 ng 에서 15.0 μg 범위에서 비소 농도의 변화에 따라 완전한 비례관계를 나타냈다. B의 결과는 독성농도와 EGFP의 수치에 강한 연관성이 있음을 보여주었다. 이는 도 5에서 본 것과 일치했다. 정량화 데이터는 샘플당 12개의 유충을 사용하여 적어도 세 개의 독립적인 실험을 통해 얻어진 대표적 수치였다. 이는 거대 실험 그룹으로부터 무작위 추출된 값으로부터 도출된 결과이다. 도 6에서 보여주는 정량화 데이터는 통계적으로 더 낮은 비소농도에서 EGFP 발현 양이 더 낮아지는 이유가 독성에 노출된 제브라피쉬의 조직 내 작은 단세포의 제한된 분포 때문만이 아님을 보여주기 때문에 또 다른 의미가 있다.

본 발명은 당업자가 본 발명을 실시 및 이용할 수 있도록 충분히 자세히 설명 및 예시되었으나, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화, 변형, 및 개량이 이루어질 수 있음이 명백하다.

당업자라면, 본원 고유의 목적, 최종산물 및 이익뿐 아니라, 개시한 목적으로 실시하여, 최종산물 및 이익을 얻을 수 있음을 이해할 것이다. 세포주, 배아, 동물, 및 그들의 제조 과정 및 방법은 바람직한 일면들의 대표적인 예로서, 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 바는 없다. 당업자는 본원의 변형 및 기타 용도를 구현할 수 있을 것이다. 이들 변형은 본 발명의 사상 범주 내에 포함되며, 특허청구범위에 의하여 한정된다.

당업자라면, 본원에 개시된 본 발명에 대하여 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고, 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.

본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 당업자의 수준의 척도이다. 모든 특허 및 공보는, 개개의 공보 각각이 참고로 인용되었음을 구체적이고 개별적으로 지적한 경우와 동일한 견지에서 본원에 참고로 인용된다.

본원에 예시적으로 설명된 본 발명은, 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적절히 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현들은 기술 용어로서 비제한적인 의미로 사용되며, 용어의 사용 시 제시되거나 설명된 특징들의 임의의 등가체 또는 그의 일부를 배제하고자 하는 의도가 전혀 없으며, 청구된 본 발명의 범위내에서 다양한 변형이 가능함이 인지될 것이다. 따라서, 당업자라면, 본 발명이 바람직한 일면 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 설명되었을지라도, 개시된 본원의 개념의 변형 및 변경이 가능하며, 그러한 변형 및 변경이 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주됨을 이해해야 한다.

도 1은 비소 독성과 제브라피쉬 배아의 사멸률간의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 2는 비소에 노출시킨 hsp70 형질전환 제브라피쉬 배아와 비소에 노출시키기 전에 미리 24시간 동안 30μM NAC로 사전처리한 hsp70 형질 전환 제브라피쉬의 발생을 GFP로 관찰한 사진이다.

도 3은 비소 300μM 에 노출시킨 hsp70 형질전환 제브라피쉬 배아(C,D)와 비소 300μM 에 노출시키기 전에 미리 24시간 동안 30μM NAC로 사전처리한 hsp70 형질 전환 제브라피쉬 배아(E,F)의 발생을 36시간 동안 GFP로 관찰한 사진이다.

도 4는 비소 300μM 에 3시간 동안 노출시킨 hsp70 형질전환 제브라피쉬 배아에서 발현하는 EGFP 발현 양상을 시간경과에 따라 빛(A,C)과 형광도로(B,D)로 관찰한 사진이다.

도 5는 hsp70 형질전환 제브라피쉬가 비소 농도에 따라 차이를 보이는 GFP의 양과 형광강도를 관찰한 것으로서, A,B는 대조군으로 비소에 노출시키지 않은 것이고 C,D는 비소 50μM로 처리한 것이며 E,F는 비소 300μM로 처리한 것이고 G,H는 비소 300μM 에 노출시키기 전에 NAC로 사전 처리한 것이다.

도 6은 A는 수득한 GFP 양 데이터를 이용해 구성한 표준 곡선 방정식을 이용해 EGFP의 양을 정량화하는 그래프이고, B는 비소 농도에 따른 형질전환 제브라피쉬에서 발현한 정제된 EGFP 추출물의 형광강도를 분석하고, 비소에 노출시키지 않은 대조군에서의 535 nm에서의 수치를 빼서 평균화한 값을 나타낸 그래프이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> fluoescent protein as an indicator of developmental toxicity in transgenic embryo <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hum-Hsp70-pro-A1 <400> 1 ctgttccctc cagtgaat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hum-Hsp70-pro-B1 <400> 2 ggtagtggac tgtcgcag 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hun-1A1-5-E1 <400> 3 ctgggatcac aaggatcagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hum-1A1-5-F1 <400> 4 agccacacgc agacctagac 20

Claims

독성물질 반응 유전자 프로모터가 삽입된 형광 단백질 발현 벡터를 엠브리오 (Embryo)에 주입하여 동물의 형질전환 엠브리오를 제조하는 제1단계;

상기 형질 전환 엠브리오를 발달시키는 과정에서 독성물질에 노출시켜 형광 단백질의 발현양상을 평가하는 제2단계를 포함하는

독성물질이 엠브리오의 발생에 미치는 영향을 평가하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 동물은 어류인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 어류는 제브라피쉬인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

형질 전환 엠브리오는 Hsp70 유전자 프로모터인 HSRE (heat-shock responsive element) 또는 CYP1A1 유전자 프로모터인 AhRE (aryl-hydrocarbon responsive element)를 벡터에 삽입하는 것을 특징으로 하는 독성물질의 발생 독성을 확인하는 방법.
제 3 항에 있어서,

사람의 HSRE 또는 AhRE 프로모터는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 HSRE를 클로닝하는 단계 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 AhRE를 클로닝한 프로모터임을 특징으로 하는 독성물질의 발생 독성을 확인하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2단계의 발현향상을 평가하는 방법은 형광 단백질의 발현 양, 발현 시기 또는 발현 부위를 확인하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
독성물질 반응 유전자 프로모터가 삽입된 형광 단백질 발현 벡터를 도입하여, 독성물질이 엠브리오 발생 과정에 미치는 영향을 평가하는데 사용되는 동물의 형질전환 엠브리오 (Embryo).
제7항에 있어서, 상기 동물은 어류인 것을 특징으로 하는 형질전환 엠브리오 (Embryo).
제8항에 있어서, 상기 어류는 제브라피쉬인 것을 특징으로 하는 형질 전환 엠브리오 (Embryo).
제 9 항에 있어서,

Hsp70 유전자 프로모터인 HSRE (heat-shock responsive element) 또는 CYP1A1 유전자 프로모터인 AhRE (aryl-hydrocarbon responsive element)를 벡터에 삽입하여 형질전환한 것임을 특징으로 하는 형질 전환 제브라피쉬 엠브리오.
제 10 항에 있어서,

사람의 HSRE 또는 AhRE 프로모터는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 HSRE를 클로닝하는 단계 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 AhRE를 클로닝한 프로모터임을 특징으로 하는 형질 전환 제브라피쉬 엠브리오.
제 7 항에 있어서,

독성 물질은 비소임을 특징으로 하는 동물의 형질 전환 엠브리오.
제 7 항에 있어서,

형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), EGFP(enhanced GFP), BFP(blue fluorescent protein), EBFP(enhanced BFP), CFP(cyan fluorescent protein) 또는 ECFP(enhanced CFP)임을 특징으로 하는 동물의 형질 전환 엠브리오.