MX2012003773A - Genes. metodos y composiciones relacionadas con la neurogenesis y su modulacion. - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona métodos para investigar la neurogénesis, la proliferación y diferenciación de células neuronales. Específicamente, la presente descripción se refiere a métodos para identificar agentes farmacéuticos capaces de modular la neurogénesis y la proliferación celular neuronal, métodos de cribado para genes que modulan la neurogénesis y la proliferación de células progenitoras neuronales, y métodos de identificación de agentes farmacéuticos como moduladores candidato de la neurogénesis y la proliferación o diferenciación neuronal. La presente descripción también se refiere a métodos para la identificación de agentes farmacéuticos para caracterizar y modular la neurogénesis, agentes farmacéuticos identificados por tales métodos, métodos para el tratamiento de pacientes con tales agentes farmacéuticos, y composiciones que contienen tales agentes farmacéuticos. Consecuentemente, los métodos actuales permiten la obtención de mecanismos que controlan la neurogénesis, el desarrollo y función cerebral en animales saludables y en trastornos del sistema nervioso. Además, los métodos actuales facilitan el desarrollo de composiciones para evitar, mejorar o estabilizar la neurogénesis debilitada en diversos trastornos del sistema nervioso, incluyendo trastornos cognitivos.

Description

GENES, MÉTODOS Y COMPOSICIONES RELACIONADOS CON LA NEUROGÉNESIS Y SU MODULACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a los genes, métodos, y composiciones involucradas en la neurogénesis , particularmente modulación de neurogénesis dependiente de la actividad en el sistema nervioso central. Más particularmente, la presente invención se relaciona a métodos para identificar y manipular los genes involucrados en la neurogénesis y para cribadon y evaluación de agentes farmacéuticos que modulen la neurogénesis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La neurogénesis es un proceso complejo que recalca el desarrollo y maduración del sistema nervioso. Este proceso depende de la propia regulación espacio-temporal de la proliferación, supervivencia, diferencia y migración de células. Las células nerviosas producidas recientemente son capaces de diferenciar las células funcionales del sistema nervioso central e integrarse en los circuitos nerviosos en el cerebro. Además, en los cerebros de muchos animales, las células nerviosas nuevas se generan continuamente a través del periodo de vida del organismo. Por ejemplo, la neurogénesis ahora es conocida por persistir a través de la adultez en dos regiones del cerebro mamífero: la zona subventricular (SVZ, por sus siglas en inglés) de los ventrículos laterales y el giro dentado del hipocampo. En estas regiones, las células progenitoras neuronales multipotentes (NPCs, por sus siglas en inglés) continúan dividiéndose y dando lugar a nuevas neuronas funcionales y células gliales ((Jacobs, Mol. Psychiatry 2000, 5(3): 262-9) . Por lo tanto, el control de la neurogénesis subyace a la especialización regional . del SNC y al establecimiento de tipos de célula específicos gue constituyen circuitos funcionales .

La neurogénesis desempeña una función fundamental en la fisiología del SNC. La agrupación de células progenitoras neuronales (NPCs) puede expandirse por medio de divisiones simétricas que dan lugar a NPCs adicionales o reducirse por medio de diferenciación terminal de la progenie en neuronas o la glía. (Butt et al., Neuron 2005, 48: 591-604; Gotz et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2005, 6: 777-788; Huttner et al., Curr Opin Cell Biol 2005, 17: 648-657; Noctor et al., Arch Neurol 2007, 64: 639-642; Kriegstein et al., ??? Rev Neurosci 2009, 32: 149-184) . Al mantener las NPCs en un estado proliferativo activo de este modo puede agrandar la agrupación de células y puede agrandar la corteza cerebral de los ratones (Chenn et al., Science 2002, 297: 365-369; Lehmann et al., Eur J Neurosci 2005, 21: 3205-3216) . Por otra parte, la transición prematura de NPCs de un estado proliferativo a uno diferenciado puede reducir la agrupación progenitora; en un corto tiempo, esto puede incrementar la generación de neuronas diferenciadas y glia, pero a largo plazo, la reducción de la agrupación progenitora limita la generación futura de progenie neuronal. (El tamaño cortical también puede alterarse por medio de la incrementación o disminución de la supervivencia de NPCs. (Depaepe et al., Nature 2005, 435: 1244-1250; Putz et al, Nat . Neurosci. 2005, 8: 322-331) .

Las interrupciones en la neurogénesis pueden desempeñar una función fundamental en enfermedades y trastornos del SNC . El número de células neuronales se determina mayoritariamente por proliferación de NPCs y la supervivencia y diferenciación de su progenie. Aunque estos pasos pueden regularse independientemente, también deben de coordinarse apropiadamente para establecer circuitos que funcionen adecuadamente dentro del sistema nervioso. De hecho, los errores en la generación de neuronas y su ensamble en circuitos pueden llevar a numerosos trastornos neurológicos :i n luyendo heterotopias , retraso mental, trastornos de espectro autista, epilepsia, dislapsia cortical focal. Las alteraciones en la producción de tipos de células neuronales pueden llevar a una relación desproporcionada de circuitos inhibitorios y excitatorios en el cerebro, una ambivalencia que puede subyacer a los trastornos de espectro autista, depresión y esquizofrenia.

Estas observaciones destacan la función crucial de los mecanismos moduladores de proliferación NPC y el destino de su progenie. Los mecanismos que regulan la proliferación pueden clasificarse como autónomo celulares y no autónomos celulares. Con respecto a los mecanismos autónomos celulares, se han realizado recientemente grandes progresos en la identificación de factores requeridos para empujar las células en un estado "pluripotente/multipotente" y para mantener este estado. ( elstead et al, Curr. Opin. Genet. Dev. 2008, 18 : 123-129) .

Sin embargo, los mecanismos no autónomo celulares son menos entendidos, los cuales dependen de la actividad neurona1 in vivo. La producción de los mecanismos que controlan la neurogénesis en animales intactos es por consiguiente crucial para un entendimiento propio del desarrollo y función del cerebro en animales saludables y en trastornos del sistema nervioso. También es crucial para el desarrollo de métodos y composición para prevenir, mejorar y/o estabilizar la neurogénesis (por ejemplo, modular) , y específicamente neurogénesis deteriorada, en el sistema nervioso y específicamente en los trastornos del sistema nervioso, incluyendo trastornos cognitivos.

La presente invención cumple con esta y otras necesidades en la técnica proporcionando objetivos, métodos, y composiciones que se relacionan a la modulación de la neurogénesis en una forma activamente dependiente.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente descripción se relaciona con un método que comprende poner en contacto las células progenitoras neuronales en una región intacta del cerebro de un primer animal con un agente farmacéutico, exponiendo al primer animal y un segundo animal de control a un estímulo externo capaz de producir actividad en la región intacta del cerebro, y medir las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en el primer animal y de las células progenitoras neuronales en el segundo animal, en cualquier orden, en donde una diferencia en la tasa de proliferación entre las células en cuestión progenitoras neuronales y las células de ' control progenitoras neuronales identifican el agente farmacéutico como uno capaz de modular la proliferación neuronal.

En ciertas modalidades, el primero y el segundo animales pueden ser vertebrados, incluyendo anfibios y mamíferos. Más particularmente, el primero y segundo animales pueden ser Xenopus laevis, y más específicamente pueden ser renacuajos de Xenopus laevis.

En ciertas modalidades, la región intacta del cerebro puede estar involucrada en el procesamiento de entradas olfativas, entradas visuales, o entradas mecanosensoriales, o pueden estar involucradas en la mediación de entradas de comportamiento. En modalidades específicas, el primero y segundo animales pueden ser Xenopus laevis y la región intacta del cerebro puede ser el tectum óptico. La región intacta del cerebro también puede comprender circuitos de telencéfalo, mesencéfalo, romboencéfalo/médula espinal, retina, u hoyo olfativo.

En ciertas modalidades, medir las tasas de proliferación de las células progenitores neuronales en los animales de control y de experimento comprende contar el número y tipo de células en el tectum óptico del primer y segundo animales.

En algunas modalidades, poner en contacto las células progenitoras neuronales con el agente farmacéutico puede comprender la electroporación de dicho agente farmacéutico en células progenitoras neuronales.

En otro aspecto, la presente descripción está relacionada con un método que comprende poner en contacto células progenitoras neuronales en cuestión con un agente farmacéutico en una cantidad efectiva para modular la expresión de uno o más genes en dichas células progenitoras neuronales en cuestión, midiendo las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales que no se han puesto en contacto con el agente farmacéutico, y comparando las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales, en cualquier orden, en donde una diferencia en la tasa de proliferación entre las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales identifica uno o más genes como moduladores de proliferación de células progenitoras neuronales.

En ciertas modalidades, las células progenitoras neuronales en cuestión pueden estar en un primer animal y las células de control progenitoras neuronales pueden estar en un segundo animal. En algunas modalidades, las células en cuestión y de control de progenitor neuronal pueden estar en el tectum óptico del primer y del segundo animales respectivamente. En una modalidad, el primer y segundo animales pueden ser Xenopus laevis.

En algunas modalidades, además el método puede comprender la introducción de un constructo reportero en las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales. En ciertas modalidades, el constructo reportero puede comprender un gen que codifica una proteina fluorescente. En una modalidad, la expresión de la proteina fluorescente puede estar restringida espacialmente, en particular a un tipo de célula especifica, como las células progenitoras neuronaleses . En otra modalidad, la expresión de proteina fluorescente' también puede restringirse temporalmente, por ejemplo, restringirse a células de progenie producidas en una región del cerebro después de un punto particular en tiempo. En otras modalidades, introducir el constructo reportero en las células progenitoras neuronales en cuestión puede comprender la transfección de células con un plásmido que codifica al constructo reportero.

En algunas modalidades, medir las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales puede comprender contar el número y tipo de células antes y después de al menos un periodo de tiempo predeterminado.

En otra modalidad, además el método puede comprender la exposición del primer y segundo animales a estímulos visuales.

En algunas modalidades, el agente farmacéutico puede comprender un componente químico o un oligonucleótido antisentido. En ciertas modalidades, el oligonucleótido antisentido puede . comprender un siARN, un shARN y/o morfolino.

En otra modalidad del presente método, uno o más genes en las células progenitoras neuronales en cuestión pueden ser seleccionados de SEQ. ID. NOs . 1-651, u obstáculos funcionales, modificaciones y/o substituciones de ese.

En otro aspecto, la presente descripción relacionada a un método comprende poner en contacto las células progenitoras neuronales en cuestión con un agente farmacéutico, medir las tasas de proliferación de células progenitoras neuronales en cuestión y de células de control progenitor neuronal que no han sido conectadas con el agente farmacéutico, comparando las tasas de proliferación de células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales, en cualquier orden, donde una diferencia en la tasa de proliferación entre las células progenitoras neuronales eh cuestión y las células de control progenitoras neuronales identifican el agente farmacéutico como uno capaz de modular la proliferación.

En algunas modalidades, el método puede comprender la introducción de un constructo reportero en las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales. En ciertas modalidades, el constructo reportero puede comprender un gen que codifica una proteí a fluorescente. En algunas modalidades, la proteina fluorescente puede ser expresada de manera específica en células progenitoras neuronales.

En algunas modalidades, ' introducir el constructo reportero en las células progenitoras neuronales puede comprender la transfección de células con un plásmido que codifica al constructo reportero.

En algunas modalidades, poner en contacto las células progenitoras neuronales con el agente farmacéutico comprende la electroporación del agente en las células progenitoras neuronales en cuestión.

En ciertas modalidades, además el método puede comprender la exposición del primer y segundo animales a estímulos visuales.

En un cuarto aspecto, la presente descripción está relacionada con un método que comprende la administración de un agente farmacéutico a células en cuestión expresando un gen objetivo seleccionado de un grupo formado de SEQ ID NOs. 1-651, u obstáculos funcionales, modificaciones y/o substituciones de ese, comparando la expresión del gen objetivo en las células en cuestión donde se administró el agente farmacéutico, comparado con la expresión del gen objetivo en las células en cuestión administradas al agente farmacéutico comparado con la expresión del gen objetivo en células en cuestión no administradas con el agente farmacéutico, en cualquier orden, en donde una diferencia en la expresión del gen objetivo en células en cuestión administradas con el agente farmacéutico comparado con las células en cuestión no administradas con el agente farmacéutico identifica al agente farmacéutico como un modulador candidato de proliferación o diferenciación neuronal .

En otro aspecto, la presente descripción se relaciona a los agentes farmacéuticos identificados por métodos descritos en el presente documento.

Aún en otro aspecto, la presente descripción se relaciona a las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente farmacéutico identificado por métodos descritos en el presente documento.

Aún en otro aspecto, la presente descripción se relaciona a los métodos para el tratamiento del paciente que comprende la administración de componentes identificados por métodos descritos en el presente documento.

La presente invención comprende métodos para la investigación de fenómenos de proliferación y diferenciación celular neuronal, los agentes farmacéuticos identificados por dichos métodos, composiciones que contienen los mismos y métodos de tratamiento que comprenden la administración de tales agentes farmacéuticos o composiciones. En este sentido, la presente descripción proporciona métodos para identificar los genes involucrados en la regulación de neurogénesis, métodos para la identificación de agentes farmacéuticos para caracterizar y modelar la neurogénesis en el sistema nervioso, y específicamente¦ varios trastornos del sistema nervioso y/o lesiones incluyendo métodos y composiciones para prevenir, mejorar y/o estabilizar la neurogénesis (por ejemplo, modular), y específicamente neurogénesis deteriorada, en el sistema nervioso y específicamente en los trastornos del sistema nervioso, incluyendo trastornos cognitivos. La presente' invención también comprende los agentes farmacéuticos seleccionados por métodos de la presente invención, así como también las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos agentes farmacéuticos seleccionados, así como también métodos de dichos agentes farmacéuticos y composiciones para pacientes, en donde los pacientes incluyen pacientes humanos y en donde dicha administración es con el propósito de modular la neurogénesis y específicamente para prevenir, mejorar y/o estabilizar la neurogénesis y específicamente la neurogénesis deteriorada, en el sistema nervioso y específicamente los trastornos del sistema nervioso, incluyendo trastornos cognitivos, en pacientes y específicamente en humanos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las FIGS.1A-1C representan el cerebro transparente de un renacuajo Xenopus ¦ laevis (Fig. 1A) , la región tectum óptica del cerebro (Fig. IB); y la proliferación y diferenciación de células dentro del lóbulo tectal (Fig. 1C) .

FIG.2 es un diagrama que muestra los diferentes linajes de células progenitoras neuronales (NPCs) .

FIG.3 es un diagrama de indicador de proliferación que facilita la solución espacial y temporal de células etiquetadas reflejadas en el cerebro intacto.

FIG.4 es una imagen que muestra la proliferación de NPCs en un periodo de 24 horas en el tectum óptico de Xenopus laevis.

FIG.5 es una gráfica que muestra la disminución en la tasa de proliferación de células tectales seguida de una exposición a los inhibidores de división de células.

Las FIGS.6A-6B son gráficas que muestran las tasas de proliferación tectal en presencia o ausencia de inhibidores de división de células en el día 1 sin estimulación visual y el día 2 con estimulación visual (Fig. 6A) ; y el porcentaje de neuronas tectales en presencia o ausencia de inhibidores de división de células en el día 3 (Fig. 6B) .

FIG.7 es una gráfica que muestra las tasas de proliferación tectal en animales expresando un morfolino contra una Yodotironina Deiodinasa · tipo III (dio3-M0) con y sin estimulación visual, comparada al control de animales.

FIG.8 Es una gráfica que muestra el porcentaje de neuronas tectales y células glial en animales expresando un morfolino contra Glutation S-transferasa Pi 1 (GSTpi- O) en tres días, comparada al control de animales.

Las FIGS . 9A-9B es una gráfica que muestra las tasas de proliferación tectal (Fig. 9A) y el porcentaje de neuronas tectales y células glial (Fig. 9B) en animales expresando un morfolino contra uno de 11 genes de interés (GOIs, por sus siglas en inglés) en tres días, comparado al control de animales. GOIs: proteína de choque de calor 70 (HSPA5) ; receptor Ephrin tipo B-l (ePHrbl); Yodotironina Deiodinasa tipo III (dio3); Proteina contenedora de dominio ETS Elk-4(ELK4) MMTV del tipo sin extremos (Wingless) (virus de tumor mamario murino) familia de sitio de integración, miembro 7b (Wnt7b) ; retraso mental Frágil X, homólogo autosomal (FXR1); proteina 1 de retraso mental Frágil X ( FMR1A) ; metalopeptidasa 9 de matriz (MMP9) , subunidad alfa catalítica de proteína cinasa dependiente de cAMP (PRKACA) , N-euritin 1-A (cpgl5) ; Glutation S-transferasa Pi 1 (GSTpi) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otra forma, todos los términos científicos y técnicos usados en .el presente documento tienen el mismo significado como comúnmente lo entiende un experto ordinario en la técnica. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales idóneos describen en el presente documento. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende sean limitantes.

La referencia se hace para estandarizar los manuales de laboratorios que contienen definiciones y métodos y medios para llevar a cabo las técnicas básicas abarcadas por la presente invención. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds.), John iley & Sons, Inc., Hoboken, NJ (2010), Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino et al. · (eds.), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ (2010); Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds,),- John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ (2010); Current Protocols in Neuroscience, Gerfen et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ (2010); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Egli et al. (eds.), John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, ÑJ (2010); Current. Protocols in Pharmacology, Enna et al. (eds.), John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, NJ (2010); y varias referencias citadas allí.

Definiciones Como se utilizó en la presente descripción, el término "acerca" o "aproximadamente" entra en un intervalo aceptable para un valor particular como lo determinó un experto en la técnica, y puede depender en parte de cómo el valor se mide o se ¦ determina, por ejemplo, las limitantes del sistema o técnica de medición.

Los términos "un", "uno (a)" y "la, el" debe entenderse que significan en plural' y en singular, a menos que se indique de otra forma. Además "un", "uno (a)" y "la, el" (y variaciones gramáticas de los mismos donde sea apropiado) generalmente se refieren a uno o más.

Como se usA én el- presente documento, la "neurogénesis" incluye la proliferación, supervivencia, diferenciación, y migración de una célula neuronal in vivo, in vitro o ex vivo. Las células pueden estar localizadas en u obtenerse u originarse del sistema nervioso central o cualquier otra parte de ahí de un animal o ser humano (por ejemplo, el sistema nervioso periférico) . Se pretende que la neurogénesis incluya la neurogénesis cuando ocurre durante un desarrollo normal, así como también una regeneración neurona! que ocurra después de una enfermedad, daño o intervención terapéutica. Las modalidades de esta modalidad descrita incluyen la detección o medida de ya sea la proliferación o diferenciación como indicadores no limitantes de neurogénesis .

Un "estímulo externo" se define ampliamente para abarcar cualquier tipo de estímulo extracelular complejo o simple que puede inducir la actividad neuronal. De este modo un estímulo externo incluye entradas al sistema visual de un animal. También incluye una entrada a otras regiones del cerebro, como aquellas involucradas en el proceso olfativo, mecanosensorial , o entradas visuales, y en la mediación de entradas de comportamiento.

El término "modular" como se usó en el presente documento incluye la alteración de la expresión de gen, o nivel de moléculas de ARN o moléculas equivalentes de ARN, incluyendo ARNs no codificantes y aquellos que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas. "Modular" también incluye alterar la actividad de uno o más productos de gen (incluyendo ARNs no codificantes), proteínas, o subunidades de proteínas, tal expresión, nivel, o actividad en presencia de un modulador difiere de lo observado en la ausencia del modulador. Por ejemplo, el término "modular" no está limitado para estas definiciones. La modulación puede ser un incremento o disminución en expresión o actividad, un cambio en características de enlace de un producto de gen, o cualquier otro cambio en' las propiedades biológicas, funcionales, o inmunológicas de moléculas biológicamente activas .

La "Modulación ¦ de neurogénesis" o "Modular la neurogénesis" incluye cambios en proliferación de células, supervivencia, diferenciación, o migración. Tal cambio puede ocurrir en una célula o población de células, incluyendo aquellas dentro de una región intacta del cerebro. Los ejemplos no limitantes incluyen niveles incrementados (o disminuidos) de un inductor (o inhibidor) de neurogénesis, como cambios en el nivel de un producto de gen directamente involucrado en la proliferación de NPC. Dichos cambios también incluyen una diferencia en la diferenciación de células o migración de células dentro de un circuito neuronal. En ciertas modalidades, la modulación de la neurogénesis se refiere a los efectos en la proliferación de células y en el destino de la célula.

Los términos "modulador", "componente" y "agente farmacéutico" pueden usarse intercambiablemente en el presente documento, e incluye sustancias farmacológicamente activas en forma aislada, o mezclas del mismo. Por ejemplo, un agente farmacéutico, componente o modulador puede ser un producto aislado y es.tructuralmente definido, un producto aislado de estructura desconocida, una mezcla de productos conocidos y caracterizados, o una composición no definida que comprende uno o más productos. Los ejemplos de tales composiciones no definidas incluyen por ejemplo, muestras de tejido, fluidos biológicos, ' células supernaturales, preparaciones vegetales, · etc. El agente farmacéutico, compuesto o modulador puede ser un producto orgánico o inorgánico, incluyendo un polipéptido (o una proteina o un péptido) , un ácido nucleico, un lipido, un polisacárido, una entidad química, o una. mezcla o derivados de los .mismos. El agente farmacéutico, compuesto o modulador puede ser de origen natural o sintético, y el/los compuesto (s) pueden incluir bibliotecas de compuestos.

Un "modulador", "compuesto" o "agente farmacéutico" puede incrementar (o disminuir) la cantidad, grado, o naturaleza de una respuesta neurogénica in vivo, in vitro o ex vivo, relativa a la cantidad, grado, o naturaleza de la neurogénesis en la ausencia del agente o reactivo. En ciertas modalidades, el tratamiento con un agente "neurogénico" puede incrementar (o disminuir) la cantidad, grado, o naturaleza de una respuesta neurogénica por al menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% (2 veces), 300% (3 veces), 400% (4 veces), 500% (5 veces), o aún más o menos, comparado a la cantidad, grado, o naturaleza o respuesta neurogénica en la ausencia del agente, bajo las condiciones del método usado para detectar o determinar neurogénesis .

Los términos "inhibir", "süb-regular" , o "reducir" incluyen la disminución de una expresión de un gen, o nivel de moléculas de ARN o moléculas equivalentes de ARN, incluyendo ARNs no codificantes y aquellos que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o activamente uno o más productos de gen, proteínas o subunidades de proteína que se observan a continuación en la ausencia de uno o más moduladores (por ejemplo, siARN, shARN, morfolino antisentido, etc.) como se definió en los métodos reivindicados. Los términos "maximizar" o "sobre-regular" incluyen el incremento de expresión de un gen, o nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifiquen una o más proteínas o subunidades de proteína, o actividad de uno o más productos de gen, proteínas o subunidades de proteína que se observan a continuación en la ausencia de uno o más moduladores como se definió en los métodos reivindicados.

El término "gen objetivo" o "gen de interés" incluye no sólo a los genes codificadores de proteína sino también a los genes no codificadores. Dichos genes no codificadores incluyen aquellos que codifican ARNs (rARNs) ribosomales , ARNs (tARNs) de transferencia, y ARNs (snRNAs) pequeños nucleares, asi como también microARNs, snoARNs, siARNs, piARNs y ncARNs . También pueden incluir una región de polinucleótidos que regula la replicación, transcripción, traducción, u otros procesos importantes para la expresión de producto de gen, o un polinucleótido que comprende ambas una región que codifica un producto de gen y una región operablemente conectada a ella que regula la expresión. El gen objetivo puede ser cromosomático (genómico) o extracromosomático . Debe ser endógeno a la célula, o debe ser un gen exterior (un transgen) . El gen exterior puede ser integrado en el genoma huésped, o puede ser presentado en una construcción genética extracromosomática como un plásmido o cósmido. El gen objetivo' también puede ser derivado de un patógeno, como un virus, bacteria, hongo, o protozoario, el cual es capaz de infectar un organismo o célula. Los genes meta pueden ser genes virales y provirales. En una modalidad especifica, un gen objetivo es aquel involucrado o asociado con la progresión de actividades celulares importantes para la neurogénesis .

El término "ácido nucleico meta" incluye cualquier secuencia de ácido nucleico de la cual la expresión o actividad va modularse. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. Además el gen objetivo o gen puede comprender fragmentos de secuencias de ácido nucleico que por lo general son biológicamente activas.

Ahora se hará referencia a muchas modalidades de la presente descripción, ejemplos que están ilustrados y descritos en conjunto con sus respectivos dibujos y ejemplos. Mientras que ciertas , modalidades están descritas en el presente documento, debe de entenderse que las modalidades descritas no pretenden limitar el enfoque de invención como está definido por las reivindicaciones adjuntas. Por el contrario, la presente descripción pretende cubrir alternativas, modificaciones y equivalentes que pueden estar incluidas dentro de la esencia y enfoque de la invención como sé definió en las reivindicaciones adjuntas. Además, en la presente descripción ciertos detalles son proporcionados para expresar un entendimiento de la invención definido por las reivindicaciones adjuntas. Sin embargo, será aparente para aquellos expertos en la técnica que ciertas modalidades pueden ser practicadas sin estos detalles. En ciertas instancias, los métodos bien conocidos, procedimientos u otros detalles específicos no han sido descritos para evitar aspectos ocultos no necesarios dé la invención definida por las reivindicaciones adjuntas.

Métodos de identificación y caracterización de genes involucrados en la neurogénesis Xenopus laevis como un Sistema de modelo El Xenopus laevis ha probado ser ventajoso para estudios in vitro de neurogénesis y desarrollo cerebral. Muchos factores recalcan estas ventajas: Periodo compacto de neurogénesis Los renacuajos de rana tienen un periodo de proliferación y diferenciación de células prolongado y accesible que se extiende a través del periodo larval de desarrollo de SNC. En el transcurso del curso de las etapas pre-metamórficas del desarrollo de X. laevis, nuevas neuronas se han generado vía proliferación de células. Las neuronas formadas recientemente entonces se integran a los sistemas de circuito funcionales del cerebro de renacuajo en desarrollo. La secuencia neurogénica desde el nacimiento a diferenciación de neuronas individuales puede capturarse en un periodo de 2 a 4 días en X. laevis, lo contrario a los sistemas mamíferos que son de más de un mes..

Este marco de tiempo compacto facilita investigaciones detalladas en los diferentes pasos que comprenden la neurogénesis. Esta ventaja, junto con la evidencia de mecanismos de neurogénesis se conserva evolutivamente, subraya el valor de Xenopus no sólo en revelar los mecanismos fundamentales de neurodesarrollo de relevancia para los sistemas mamíferos sino también proporcionando un sistema de modelo experimental para estudiar las enfermedades del neurodesarrollo humano.

Sistema de circuitos de cerebro accesibles Los estudios en el desarrollo neuronal y formación de circuito en ranas han revelado muchos mecanismos fundamentales de desarrollo cerebral los cuales se han mostrado de manera subsecuente para funcionar en mamíferos, incluyendo los humanos. El SNC es altamente regionalizado junto al eje posterior-anterior de X.laevis y diferentes regiones del SNC se componen de circuitos neuronales específicos, con funciones únicas, incluyendo el proceso de salida sensorial, integración de la información, memoria, toma de decisiones, y control motor. (O'Leary et al., 'Curr. Opin. Neurobiol. 2008, 18: 90-100; Lichtneckert et al., Adv. Exp. Med. Biol. 2008, 6.28: 32-41).

En efecto, los factores de transcripción de la familia Hox no sólo regulan el destino de progenitores y células a lo largo del eje anterior-posterior del telecefalon a médula espinal, sino que también hacen contacto específico entre neuronas en circuitos desarrollados en virtud de que controlan las caídas del factor de transcripción cadena abajo como diferenciación de neuronas. (Dasen et al., Curr. Top. Dev. Biol. 2009, 88: 169-200; Dalla Torre di Sanguinetto et al., Curr. Opin. Neurobiol. 2008, 18: 36-43.) Las modalidades de la presente invención abarcan métodos para analizar el transcriptoma en diferentes circuitos cerebrales y tipos de células. Estos incluyen el telencéfalo, el mesencéfalo y el rombencéfalo/médula espinal, asi como la retina y fosa olfatoria. Cada' una de estas regiones se caracteriza por distintos conjuntos de progenie NPC. Por ejemplo, el telencéfalo recibe y procesa las entradas olfatorias e incluye regiones homologas al hipocampo y ganglio basal, que están involucrados en la memoria y control de movimiento (Maier et al., J Chem Neuroanat, 40(1) : 21-35; Brox et al., J Comp Neurol 2004, 474(4): 562-77). El mesencéfalo procesa entradas mecanosensoriales y visuales (Hiramoto et al., Dev Neurobiol 2009, 69(14): 959-71; Deeg et al., J Neurophysiol 2009, 102(6): 3392-404) y el rombencéfalo y la médula espinal median las salidas de comportamiento (Soffe et al., J Physiol 2009, 587 (Pt 20): 4829-44; Orger et al., Nat Neurosci 2008,' 11(3): 327-33).

Los métodos de la invención actual no sólo abarcan análisis de distintas regiones del cerebro sino también tipos de células especializadas dentro de tales circuitos. Los circuitos distintos en cada área del cerebro se pueden que están compuestas de combinaciones únicas de neuronas de excitación e inhibición con composición de transcripción de célula especifica, que dotan a los circuitos específicos de región con propiedades particulares. En consecuencia, los métodos de la presente invención incluyen el análisis del transcriptoma de neuronas identificadas, tal como neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas en las regiones cerebrales descritas aquí.

En algunas modalidades, los métodos pueden dirigirse a la región tectum óptica de X. laevis. El tectum óptico es el centro visual primario en vertebrados no mamíferos; es una estructura emparejada que forma un compuesto principal del mesencéfalo (o cerebro medio) y recibe entradas desde las fibras retínales en una manera ordenada topográficamente. Ver, por ejemplo, Dingwell et al., J. Neurobiol. 2000, 44: 246-259.

Formación de imágenes directa La proliferación y diferenciación de NPC puede observarse directamente en Xenopus laevis pre-metamórfico (etapas de renacuajo) . La FIG. 1A muestra la cabeza transparente de un renacuajo, con el cerebro indicado por un cuadro. La FIG. IB es una vista en más detalle de la región del cerebro que incluye el tectum óptico. La FIG. 1C muestra la ubicación relativa de células neuronales (visualizada con BrdU) en el tectum óptico en 2 horas y en 6 días; las células generadas recientemente que se diferencian en neuronas que migran desde la capa ventricular. (Wu et al., J. Neuroscience 1999, 19(11): 4472-4483).

Los renacuajos de Xénopus son por lo tanto susceptibles a formación de imagen secuencial in vivo, de manera que las células progenitoras neuronales (NPCs) y su progenie pueden identificarse y formarse en imagen en el animal intacto. A este respecto, las NPCs son glías radiales diferenciadas que pueden dividirse en modos distintos, como se describe en la FIG. 2. En un primer modo, una NPC sencilla puede dividirse y formar dos NPCs hijas (por ejemplo, un "modo proliferativo" ) . En un segundo modo, una NPC sencilla puede dividirse para formar una NPC hija y una neurona hija (por ejemplo, un "modo mezclado"). En un tercer modo, una NPC sencilla puede dividirse para formar dos neuronas hijas (un "modo de diferenciación" o "modo terminal." Ver Kriegstein et al., Ann Rev Neurosci 2009, 32: 149-184).

Reporteros neurogénicos Tal formación de imagen proporciona una base para métodos de identificación y análisis de tipos de células distintos basados en la morfología así como la etapa de desarrollo. La solicitud actual abarca el uso de reporteros celulares múltiples para facilitar tal análisis. Por ejemplo, tales reporteros permiten la vigilancia etiquetada y secuencial de las células progenitoras neuronales, asi como poblaciones diferentes de células diferenciadas, tal como neuronas GABAérgicas o glutamatérgicas .

En consecuencia, en algunas modalidades, los métodos actuales pueden emplear un reportero que es especifico para dividir células NPC. ' Por ejemplo, el reportero puede comprender un sistema reportero Gal4-UAS (secuencia de activación cadena arriba) binario (Hartley et al., Proc Nat Acad Sci 2002, 99(3): 1377-1382). La FIG. 3 muestra un sistema reportero Gal4-UAS ejemplar, que comprende dos compuestos: un conductor Gal4 y un reportero UAS. Las secuencias que controlan la expresión de Gal4 por lo tanto dictarán la expresión del reportero UAS.

En el ejemplo mostrado en- la FIG. 3, la región de control de Gal4 comprende elementos aumentadores múltiples del promotor del gen del factor 4 de crecimiento de fibroblasto (FGF4). La activación de esta región controlada requiere la unión a los factores de transcripción sox2/oct3 endógenos, que se . expresan en NPCs proliferantes pero no se presentan en niveles importantes en neuronas diferenciadas, no proliferantes. Por lo tanto, este sistema permite la detección especifica de un reportero UAS en NPCs proliferantes.

El reportero puede incluir cualquier marcador de interés. En algunas modalidades, tal como la que se muestra en la FIG. 3, se puede codificar una proteina fluorescente, (por ejemplo, proteina fluorescente Kaede o proteina fluorescente verde ' (GFP) ) , o cualquier otro reportero apropiado que pueda detectarse o visualizarse. En consecuencia, las células que se dividen activamente expresan la proteina reportera (por ejemplo, Kaede o GFP) . En el caso de NPCs, las células hijas se mantienen en el estado proliferativo, (por ejemplo, se dividen en modo proliferativo o' en modo mezclado (en donde una célula hija es una NPC) continuo a expresarse, 'por ejemplo, la proteina fluorescente Kaede. En contraste, la división de una NPC en modo terminal producirá dos neuronas diferenciadas que cesan de dividirse y de esta manera expresarán poco o nada de la proteínas fluorescentse Kaede y sólo contendrán proteína Kaede residual heredada durante la citocinesis. En consecuencia, el sistema reportero Gal4-UAS antes descrito puede proporcionar una medida de proliferación de NPCs.

El sistema reportero Gal4-UAS antes descrito es un sistema reportero ejemplar. Sin embarqo, puede ' emplearse cualquier sistema reportero apropiado (por ejemplo, un sistema de un compuesto u otro sistema de dos compuestos) . En otras modalidades, este puede incluir un producto de gen .que puede modular la función en la célula objetivo. En efecto, el sistema permite el uso de múltiples reporteros UAS en concierto con un conductor Gal4.

Por otro lado, el reportero puede tener propiedades adicionales, tales como aquellas que permiten la resolución temporal de células neuronales in vivo. Uno de tales reporteros es la proteina Kaede fluorescente fotoconvertible mostrada en la FIG. 3. La proteina Kaede exhibe un espectro de emisión fluorescente verde, pero puede fotoconvertirse para exhibir un espectro de emisión fluorescente rojo durante la exposición a ya sea luz UV, un láser de 405 nm, o cualquier otra fuente de luz apropiada. En consecuencia, la propiedad fotoconvertible de Kaede permite un elemento de control temporal para observar y caracterizar el comportamiento NPC.

Por ejemplo, las NPCs pueden transíectarse con el reportero Gal4-UAS antes descrito que tiene un elemento efector fluorescente Kaede. Las células proliferativas que expresan el reportero producirán hijas con la proteina Kaede verde. Después de un periodo de tiempo preferiblemente predeterminado (por ejemplo, 1 h, 2h, 4h, 8h, 12, h, 16 h, 20 h, 24 h, 30 h, 36 h, 48 h, 72 h, 96 h, 168 h, o cualquier otro valor o intervalos de valores entre estos) , las células NPC que contienen la proteina Kaede pueden exponerse a una fuente de luz (por ejemplo-, un láser de 405 nm, luz UV, etc.) para fotoconvertir la ' proteína Kaede de verde a rojo. La progenie recientemente producida heredaría la proteína Kaede roja durante la citocinesis, pero aquellas NPCs que se mantienen sin diferenciación producirán la proteína Kaede verde (Carón et al., Development 2008, 17: 107-117). En consecuencia, las células hijas recientemente generadas pueden distinguirse de las células precursoras, y los números relativos de células precursoras e hijas puede determinarse al medir los niveles relativos ' de proteína Kaede verde a roja. Esta medición también proporciona un estimado de las proporciones relativas de cada tipo de división celular (por ejemplo, proliferación, mezclado, terminal) .

Un sistema reportero apropiado para uso en los métodos actuales puede introducirse en las células o tejido de interés por cualquier técnica apropiada conocida en el arte {por ejemplo, transíección, etc.). En ciertas modalidades, el sistema reportero puede construirse en un plásmido, y puede introducirse en la célula por medio, por ejemplo, de electroporación (Haas et al., Differentiation 2002, 70: 148-154) .

Cribado Diferencial por Análisis de Microconfiguración En algunas modalidades, los métodos actuales permite la identificación de genes involucrados en neurogénesis , y en particular, proliferación y diferenciación de NPC. La identificación de genes candidatos puede realizarse, por ejemplo, por análisis . de microconfiguración de ácidos nucleicos en neuronas glia radiales y diferenciadas, respectivamente. Tales técnicas de microconfiguración son bien conocidas en el arte. Las células pueden seleccionarse con base en la morfología y ¦ separarse en poblaciones diferentes antes de procesarlas para análisis de microconfiguración . Por ejemplo, las células pueden separarse con base en su caracterización como NPCs o neuronas diferenciadas. Alternativamente, las poblaciones celulares (o animales que contienen tales poblaciones celulares de interés) pueden exponerse, a condiciones y/o estímulos que ya sea promueven o suprimen la diferenciación.

El desarrollo bien caracterizado de los sistemas nerviosos del renacuajo X. laevis proporciona una base para identificar los genes candidatos involucrados en la neurogénesis. Por ejemplo, los genes de interés (por ejemplo, SEQ ID NOs. 1-651), o truncamientos, modificaciones y/o substituciones funcionales de los mismos, pueden identificarse por medio del análisis de microconfiguración comparativo de genes expresados en neuronas diferenciadas comparado con NPCs no diferenciadas en X. laevis (ver, por ejemplo, Ejemplo 2 enseguida)-. En una modalidad, las células del tectum óptico de X. laevis se cosechan en días diferentes durante el neurodesarrollo, por ejemplo en el día 1 y día 5. Las células cosechadas en el dia 1 tendrán una proporción más grande de NPCs no diferenciadas comparado con las células cosechadas el dia 5, que tendrán una proporción más grande de neuronas diferenciadas. Los genes que muestran expresión diferencial y específicamente una expresión diferencial importante (por ejemplo, p < 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01 o menos, o cualquier otro valor entre estos) en células cosechadas el dia 1 con relación a aquellas cosechadas el dia 5 representan genes de interés en la regulación o modulación de proliferación y diferenciación de NPC.

En otro protocolo experimental, las células pueden cosecharse de la región del cerebro de animales que han recibido o no reciben estímulos externos de entradas a tal región, tal como luz, una entrada olfatoria, o estímulo mecanosensorial . En una modalidad, las células se cosechan desde el tectum óptico de animales mantenidos en la oscuridad y de animales expuestos a la luz. Típicamente, las células de animales expuestos a la oscuridad . y la luz se cosechan al mismo tiempo (por ejemplo, después de 12 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr, etc.) y .luego se realiza el análisis de microconfiguración de genes contenidos en estas. Como se discute en la presente (ver Ejemplos 1 y 2 enseguida), las células cosechadas de animales mantenidos en la oscuridad generalmente tienen una proporción más alta de NPCs no diferenciadas. Las células expuestas a la luz durante el mismo periodo generalmente- tienen una proporción relativa más alta de neuronas diferenciadas. En consecuencia, el análisis de microconfiguración de estas dos poblaciones puede revelar genes expresados diferencialmente (p < 0.01) en células de animales mantenidos en . la oscuridad (por ejemplo, que tienen una proporción relativa mayor de NPCs) con relación a las células cosechadas de animales expuestos a la luz, identificando de esta manera aquellos genes como que están implicados en la proliferación y diferenciación de NPC.

Por ejemplo, como se describe en la presente, la exposición de Xenopus a la- luz se ha mostrado que promueve la diferenciación de NPC en neuronas en el tectum óptico. En consecuencia, los animales expuestos a la luz pueden exhibir una proporción más alta de neuronas diferenciadas con relación a un animal de control mantenido en la ' oscuridad. De esta manera, animales Xenopus individuales pueden exponerse a condiciones ya sea de oscuridad o luz durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 12h, 24h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, etc.), y entonces las células de, por ejemplo, el tectum óptico, pueden colectarse de los animales y someterse al análisis de microconfiguración . Alternativamente, los animales mantenidos por periodos de tiempo más largos desarrollarán crecientemente techos (tecta) ópticos. En consecuencia, las células cosechadas de animales después de 24 horas y analizadas por medio de microconfiguración pueden tener una proporción mayor de NPCs con relación a aquellas cosechadas del animal después de, por ejemplo, 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, o más. En cualquier caso (luz vs . oscuridad o previas vs . tardías), las poblaciones celulares cosechadas de los techos de una primera población de animal típicamente tienen más NPCs y la población restante de un segundo animal típicamente tienen más neuronas diferenciadas. En consecuencia, el análisis de microconfiguración comparativo puede revelar aquellos genes expresados preferencialmente en NPCs. Los genes identificados por tales métodos incluyen SEQ ID NO.s 1-651, enlistadas en la presente. Estos genes pueden expresarse preferencialmente en NPCs, y como tales, están implicados en la neurogénesis (por ejemplo, proliferación, diferenciación y/o supervivencia de NPC) .

Manipulación de Expresión de Genes Candidato In vivo El papel establecido del ambiente local y factores autónomos no celulares en la regulación de la neurogénesis (Peunova et al., J. · Neurosci 2001, 21(22): 8809-8818 ; Kreigstein et al., 149-84, Cheng et al., Nat Neurosci 2009, 12(4): 399-408; Javaherian et al., Cereb Cortex 2009, 19 Supp 1: Í70-77; Suh et al., Ann Rev Cell Dev Biol 2009; 25: 253-75) acentúa la importancia de sistemas experimentales, tales como Xenopus, en los cuales la evaluación directa de actividad proliferativa puede hacerse en el animal intacto para identificar mecanismos celulares y moleculares endógenos que regulan la neurogénesis.

El uso de agentes farmacéuticos para modular la expresión de genes en NPCs en el SNC (por ejemplo, tectum óptico) de X. laevis pone en evidencia que un gen de interés está implicado en la proliferación de NPCs. Por ejemplo, pueden diseñarse morfolinos con base en su secuencia de genes conocida y expresar cadena debajo de forma silenciosa efectivamente productos del gen de interés (por ejemplo, ARN, proteína) . En consecuencia, la identificación de genes que regulan la proliferación proporciona objetivos conocidos para uso en seleccionar agentes farmacéuticos que puedan modular la neurogénesis y proliferación de NPC.

Métodos de Cribado y Evaluación de Moduladores de Neurogénesis Agentes Farmacéuticos Los agentes farmacéuticos (fármacos), como se usan en la presente, incluyen compuestos con actividad farmacológica e incluyen compuestos inorgánicos, materiales iónicos, compuestos orgánicos, ligandos orgánicos, incluyendo cofactores, sacáridos, péptidos recombinantes y sintéticos, proteínas, peptoides, secuencias de ácido nucleico, incluyendo genes, productos de ácido nucleico. Los agentes farmacéuticos pueden seleccionarse individualmente.

Alternativamente, puede · probarse más de un agente farmacéutico simultáneamente para la capacidad de modular la neuroactividad o expresión de un gen involucrado en la neurogénesis. Donde se prueba una mezcla de los agentes farmacéuticos, los agentes farmacéuticos seleccionados por los métodos descritos pueden separarse (como sea apropiado) e identificarse por métodos apropiados (por ejemplo, cromatografía, formación de secuencias, PCR, etc.).

Pueden probarse colecciones de combinación grandes de los agentes farmacéuticos (por ejemplo, compuestos orgánicos, péptidos sintéticos o recombinantes, peptoides, ácidos nucleicos) producidos por síntesis química de combinación u otros métodos (ver por ejemplo, Zuckerman, R. N. et al., J.

Med. Chem. , 37: 2678-2685 (1994) y referencias citadas en la presente; ver también, Ohlmeyer, M. H. J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90:10922-10926 (1993) y DeWitt, S. H. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913 (1993), con relación a compuestos etiquetados; Rutter, . J. et al., Pat. E.U.A. No. 5,010,175; Huebner, ¦ V. D. et al., Pat. E.U.A. No. 5,182,366; y Geysen, H. M . , Pat. E.U.A. No. 4,833,092), las porciones relevantes dé cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Donde los agentes farmacéuticos seleccionados de una colección de combinación portan etiquetas únicas, es posible la identificación de agentes farmacéuticos individuales por métodos cromatográficos . Las colecciones químicas, caldos microbianos y colecciones que exhiben fagos, también pueden probarse (seleccionarse) para la presencia de uno o más agentes farmacéuticos que sean capaces de modular la neuroactividad o expresión de uno o más genes involucrados en la neurogénesis de acuerdo con los métodos descritos én la presente.

Los métodos descritos en la presente pueden permitir la selección o identificación de compuestos que exhiben una propiedad seleccionada (por ejemplo, modular la proliferación de célula progenitora neuronal, modular la expresión de gen objetivo, etc.). Los métodos descritos en la presente también pueden usarse para evaluar o caracterizar la estructura y función de, un agente farmacéutico neuroactivo. Por ejemplo, tales métodos permiten la evaluación de la actividad (por ejemplo, en términos de especificidad, eficacia, etc. y/o para modular la actividad, al evaluar o seleccionar derivados de dichos compuestos candidatos y comparar la actividad de tales derivados con un modulador no modificado precursor. Por ejemplo, puede modificarse estructuralmente una entidad química por homologado con átomos adicionales, grupos funcionales y/o sustituye tes, o por medio de la sustitución de átomos o grupos, como se apreciará por aquellos expertos en la técnica.

En consecuencia, la presente descripción proporciona métodos y composiciones ¦ para cribar, identificar, caracterizar, . y modificar compuestos neuroactivos, por ejemplo, moduladores o compuestos que sean activos para o modulen las funciones de células neuronales y para identificar y/o caracterizar y/o mejorar compuestos que puedan ser activos en o modular neuronas. Tales moduladores o compuestos pueden ser útiles para tratar trastornos del sistema nervioso, en donde la célula progenitora neuronal o función y/o comportamiento de célula neuronal (por ejemplo, proliferación y diferenciación) puede impactarse. De esta manera, en ciertas modalidades, los métodos actuales pueden emplearse para identificar y/o. caracterizar y/o mejorar compuestos que sean capaces de modular la diferenciación de células progenitoras neuronales (NPCs) en neuronas.

Los agentes farmacéuticos, compuestos o moduladores neuroactivos como . se describe en la presente también pueden incluir cualquier compuesto que tienen la capacidad de alterar (por ejemplo, restaurar o corregir) una o varias funciones de una célula (específicamente una neurona o progenitor neuronal) . Por ejemplo, el compuesto del modulador puede ser capaz de alterar al menos una trayectoria metabólica o propiedad biológica o funcional de una célula (neurona) y para identificar y/o caracterizar y/o mejorar compuestos que son activos en neuronas y capaces específicamente de modular la diferenciación de células progenitoras neuronales (NPCs) en neuronas. Como un ejemplo, un compuesto biológicamente activo de esta invención es un compuesto, que es capaz de restaurar un fenotipo normal a una neurona lesionada o de inhibir al menos parcialmente el efecto perjudicial de una lesión en una neurona. En modalidades específicas, el compuesto activo puede seleccionarse por su capacidad para reprimir o activar un- mecanismo celular, por' su capacidad para estimular o inhibir una trayectoria metabólica, para restaurar una propiedad biológica, para prevenir la muerte celular, etc.

Los agentes farmacéuticos apropiados para análisis in vivo pueden incluir, . por ejemplo, morfolinos para inactivación de GOIs, que permiten el análisis de la función del gen en la neurogénesis . Otros agentes farmacéuticos pueden incluir constructos de shARN. La inactivación mediada por shARN ofrece un método independiente para inactivación comparado con Os y permite la manipulación especifica de tipo de célula de la expresión de proteina. Los métodos que se han desarrollado para aumentar la inactivación mediada por shARN en neuronas de Xenopus, y casetes de plásmido, están disponibles para hacer más eficiente la generación de muchos constructos shARN. En consecuencia, los constructos shARN contra GOIs pueden probarse para inactivación especifica de expresión GOI (Chen et al., Front Neurosci 2009, 3: 63) y probarse posteriormente, para efectos en la proliferación de NPC, por ejemplo. Por supuesto, los métodos o protocolos como se describe en la presente pueden emplearse para seleccionar (o identificar, caracterizar o mejorar) compuestos que son activos en cualquier otro atributo de neurogénesis, tal como supervivencia celular, diferenciación de NPC en neuronas o glia, y la migración y ensamble de células dentro de una región del cerebro o circuito neuronal.

Los métodos y protocolos como se describen en la presente pueden emplearse para seleccionar (o identificar, caracterizar o mejorar) compuestos que son activos en la supervivencia o desarrollo neuronal, y que pueden modular específicamente la diferenciación de NPCs en neuronas.

Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un agente, modulador o compuesto farmacéutico, como se describe identificado por los métodos de la. presente invención. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender los agentes farmacéuticos como se describen en la presente que pueden, por ejemplo, modular la neurogénesis o funciones de la célula neuronal, modular la diferenciación y/o proliferación de NPC, o pueden ser activos en o modular las neuronas, y pueden ser útiles para tratar trastornos del sistema nervioso en donde las células progenitoras neuronales o la función y/o comportamiento de . la célula neuronal (por ejemplo, proliferación, diferenciación etc.) puede estar implicado.

Los agentes farmacéuticos ' como se describen en la presente, pueden formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a, por ejemplo, un hospedero mamífero tal como un paciente humano en una variedad de formas adaptadas para la vía de administración elegida, por ejemplo, oralmente o parenteralmente , por rutas intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea, y puede comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Ensayos Basados en Células Los métodos de la presente invención comprenden además poner en contacto células aisladas (por ejemplo, células progenitores neuronales) o lineas de células cultivadas apropiadas con uno o más compuestos o moduladores candidato. Las células pueden ponerse en contacto por varios periodos de tiempo, dependiendo de su efecto, concentración, la población celular, y/o la técnica de evaluación. En una modalidad especifica, las células pueden . exponerse a compuestos candidatos, por ejemplo, en el intervalo desde alrededor de 1 nM hasta alrededor de 1 mM. Debe entenderse que pueden probarse otras concentraciones sin desviarse de la solicitud actual. Adicionalmente, cada compuesto puede probarse, en paralelo, a varias concentraciones. Adicionalmente, si es necesario, pueden agregarse diferentes adyuvantes y/o vectores y/o productos que ayudan a los compuestos a penetrar las células, incluyendo liposomas, lipidos o polímeros catiónicos, penetratina, Tat PDT, péptidos de adenovirus (por ejemplo, penton o fibra) u otros virus, etc. La puesta en contacto puede realizarse en cualquier soporte o dispositivo apropiado, tal como cámaras de incubación para preparaciones de renacuajo Xenopus- vivo.

La determinación del perfil de los compuestos candidatos puede realizarse de acuerdo con varios métodos. En particular, pueden medirse diferentes puntos finales, con objeto de evaluar la neuroactividad de los compuestos, tal como: número celular, supervivencia, expresión de antigenos, transcripción de genes específicos, y cambios morfológicos, por ejemplo, tamaño, crecimiento de neuritas, etc.

En una modalidad específica, la neuroactividad de' los compuestos candidatos puede determinarse al comparar con las poblaciones de célula neuronal de control, en ausencia de cualquier compuesto y/o tratadas con compuestos de referencia. La determinación del estado de las neuronas puede realizarse al evaluar diferentes mediciones físicas, por ejemplo, propiedades ópticas, fluorescencia en varias longitudes de onda, luminiscencia etc. Pueden usarse diferentes instrumentos, incluyendo microscopios automatizados equipados con lámparas o láser, etc. Otras técnicas incluyen detección de luz a través de una cámara CCD refrigerada. Las señales medidas pueden tratarse de acuerdo con técnicas conocidas, usando por ejemplo software que incluye histograma de pixeles, análisis en agrupado y análisis de morfología.

La presente invención también se refiere al uso de cualquier compuesto (o derivados del mismo) identificado, seleccionado, perfilado o caracterizado por los métodos de la presente invención como, por ejemplo (i) objetivos para investigación experimental ' y/o (ii) fabricación de composiciones farmacéuticas como moduladores y específicamente para tratar trastornos neurológicos.

En algunas modalidades, los modos de diferenciación celular pueden modularse al poner en contacto las células con un agente de modulación. En otras modalidades', los modos de diferenciación celular pueden modularse al introducir un agente de modulación en las células de interés, por ejemplo, por electroporación, o cualquier otra técnica apropiada para introducir el agente de modulación en las células.

En modalidades específicas, el agente farmacéutico puede incrementar el número o proporción de células que dividen en el modo proliferante con relación a otros modos de división. En otras modalidades, el agente farmacéutico puede reducir el número o proporción de células que . se dividen en un 'modo proliferante. En otras modalidades, el agente farmacéutico puede incrementar . el número o proporción de células que se dividen en un modo mezclado. Alternativamente, el agente farmacéutico puede reducir el número o proporción de células que se dividen en un modo mezclado. En modalidades adicionales, el agente farmacéutico puede incrementar el número o proporción de células que se dividen en un modo de diferenciación. Alternativamente, el agente farmacéutico puede reducir el. número o proporción de células que se dividen en un modo de diferenciación. También pueden emplearse combinaciones . de los agentes farmacéuticos para alcanzar un efecto deseado en la proliferación y diferenciación de NPC.

Los agentes farmacéuticos de la presente invención pueden seleccionarse de tal manera que modulan un objetivo de gen conocido implicado en la regulación de proliferación y diferenciación de NPC-. En consecuencia, un agente farmacéutico (por ejemplo, un morfolino, siARN, etc.) puede construirse o seleccionarse para, por ejemplo, inhibir o sobrerregular la traducción de un gen objetivo conocido por tener un papel regulador en la proliferación y diferenciación de NPC. La puesta en contacto de las células en cuestión con o la introducción de tal agente farmacéutico en las células en cuestión puede de esta manera efectuar la modulación del comportamiento de NPC.

Ensayos in vivo Los métodos actualmente descritos comprenden además poner en contacto células aisladas (por ejemplo, células progenitoras neuronales) o lineas celulares cultivadas adecuadas con uno o más moduladores o compuestos candidato. Las células pueden ponerse en contacto durante varios periodos de tiempo, dependiendo de su efecto, concentración, la población celular, y/o la técnica de evaluación. Generalmente, las células se exponen a compuestos candidato en el intervalo desde 1 nM hasta 1 mM. Debe entenderse que otras concentraciones se pueden probar sin desviarse de la aplicación actual. Adicionalmente, cada compuesto se puede probar, en paralelo, en varias concentraciones. Adicionalmente, si es necesario, pueden agregarse diferentes adyuvantes y/o vectores y/o productos ayudan a los compuestos para penetrar las células, incluyendo liposomas, lipidos catiónicos o polímeros, penetratina, Tat · PDT, péptidos de adenovirus (por ejemplo, pentona o fibra) u otros virus, etc.

La determinación del perfil de los compuestos candidato se puede realizar de acuerdo a varios métodos. En particular, se pueden medir puntos de extremo diferentes, con objeto de evaluar la neuro-actividad de los compuestos, tal como: número celular, sobrevivencia, expresión de antígenos, transcripción de genes específicos, y cambios morfológicos, por ejemplo, tamaño, crecimiento de neuritas, etc.

Preferiblemente, la neuroactividad de los compuestos candidatos se determina por comparación con poblaciones de células neuronales de control, en ausencia de cualquier compuesto y/o tratada con compuestos de referencia. Determinar el estado de las neuronas se puede realizar al evaluar diferentes mediciones físicas, propiedades ópticas, fluorescencia en varias longitudes de onda, luminiscencia etc. Se -pueden usar diferentes instrumentos, incluyendo microscopios automáticos fijados con lámparas o láseres, etc. Otras técnicas incluyen detección de luz a través de una cámara CCD refrigerada. Las señales medidas se pueden probar de acuerdo a técnicas conocidas, usando por ejemplo software incluyendo histograma de pixel, análisis de conglomerados y análisis de morfología.

La invención también abarca el uso de cualquier compuesto (o derivados del mismo) identificados, seleccionados, perfilados o caracterizados por los métodos descritos arriba, (i) como objetivos para búsqueda experimental o (ii) para la fabricación de composiciones farmacéuticas para tratar . trastornos neurológicos .

En algunas modalidades, los modos de diferenciación celular se pueden modular al poner en contacto las células con un agente modulador. En otras modalidades, los modos de diferenciación celular se pueden modular al introducir un agente modulador en las células de interés por, por ejemplo, electroporación, o cualquier otra técnica adecuada para introducir el agente modulador en las células.

En ciertas modalidades, el agente farmacéutico puede incrementar el número o proporción de células que se divide en un modo proliferativo con relación a otros modos de división. En otras modalidades, el agente farmacéutico puede disminuir el número o proporción de células que se divide en un modo proliferativo . Todavía en otras modalidades, el agente farmacéutico puede incrementar el número o proporción de células que se divide en un modo mezclado. Alternativamente, el agente farmacéutico puede disminuir el número o proporción de células que se divide en un modo mezclado. En modalidades adicionales, el agente farmacéutico puede incrementar el número o proporción de células que se divide en un modo diferenciado. Alternativamente, el agente farmacéutico puede disminuir el número o proporción de células que se divide en un modo diferenciado. Las combinaciones de agentes farmacéuticos también se pueden emplear para alcanzar un efecto deseado en diferenciación y proliferación NPC.

El agente farmacéutico se puede seleccionar de manera que module un objetivo de gen conocido implicado en la regulación de diferenciación y · proliferación NPC. En consecuencia, un agente farmacéutico (por ejemplo, un morfolino, siARN, etc.) se puede construir o seleccionar para, por ejemplo, inhibir o sobre regular la traducción de un gen objetivo conocido para tener un papel regulatorio en diferenciación y proliferación NPC. Poner en contacto las células en cuestión con o que introducen tal agente farmacéutico dentro de las células en cuestión puede de esta manera efectuar la modulación del comportamiento NPC.

Ensayos in vivo El análisis de datos genómicos generados por técnicas de microconfiguración y/u otros análisis genómicos se puede usar para priorizar genes que pueden regular la proliferación y diferenciación de NPCs en el SNC de renacuajo. Los oligonucleótidos de morfolino' (MOs, por sus siglas en inglés) antisentido (Eisen et al, Development 2008, 135(10): 1735-43) pueden de esta manera generarse contra genes de interés (GOI) y cada GOI seleccionado por desactivación mediada por morfolino para un efecto de proliferación celular usando formación de imágenes para evaluar la incorporación BrdU en el SNC. Para GOI que incrementa o disminuye la proliferación celular, varios ensayos in vivo se pueden emplear para probar su función al controlar la neurogénesis en el tectum óptico (Nedivi et al, Science 1998, 281: 1863-1866; Ewald et al, J Neurosci 2008, 28(4): 850-61;' Cantallopsei al, Nat . Neurosci . 2000, 3: 498-503; Javaherian et a.l, Neuron, 2009 (en prensa); Van Aelst et al, Curr Opin Neurobiol 2004, 14(3): 297-304; Van Keuren-Jensen et al., Dev Neurobiol 2008, 68(11): 1315-24; Wu et al., Science 1998, 279: 222-226; Cline et al, J Physiol 2008, 586(6): 1509-17).

Un primer ensayo ejemplar combina incorporación BrdU con inmunoetiquetado para marcadores neuronales. Las ventajas de etiquetado BrdU son que el método no es invasivo y se puede usar como una selección de desempeño relativamente alto de los efectos de desactivación GOI o sobreexpresión en proliferación celular. BrdU combinado y etiquetado neuronal permiten la evaluación cuantitativa de GOI en neurogénesis . Los renacuajos se pueden exponer a una solución de cria que contiene BrdU. Este 'método eficientemente etiqueta las células proliferativas y permite mayor control sobre el tiempo de exposición a BrdU. Se ha mostrado que el acceso de BrdU no cambia durante los periodos de desarrollo estudiados y que la incorporación BrdU no ocurre en respuesta al daño del ADN . Las exposiciones BrdU típicamente se realizan al mismo momentos del día para todos los animales para controlar los efectos circadianos potenciales en la proliferación: Después de la exposición BrdU, los animales se . fijan ya sea inmediatamente, o crían durante 2-3 días antes de fijar y procesar los animales para inmunoetiquetado BrdU.

Los animales luego se anestesian terminalmente, se fijan en microondas (Paupard et al., J. Histochem. Cytochem. 2001, 49(8): 949-956) y los cerebros se procesan para etiquetado de anticuerpo en montaje completo o secciones vibrátomo (Peunova et al., 8809-8818) con anticuerpos primarios (anti-BrdU de ratón, BD Bioscience; anti NeuroD de conejo; anticuerpos secundarios Abeam y Alexafluor (Molecular Probes) ) .

Un segundo ensayo ejemplar usa formación de imágenes en un lapso de tiempo in vivo de células etiquetadas con marcadores o reporteros adecuados, tales como NPCs etiquetados Sox2. mFGF : : FP . Las ventajas de los experimentos de formación de imágenes in vivo en un lapso de tiempo son que los estudios longitudinales permiten observación directa de proliferación celular, destino celular y la dinámica estructural que subyacen a estos eventos. Se cuantifica cómo altera la desactivación/sobreexpresión GOI la neurogénesis in vivo, y se pueden terminar las velocidad de división celular y destino de progenie.

Las células proliferativas en secciones ventriculares , preparaciones de cerebro fijas de montaje completo y muestras etiquetadas FP in vivo se pueden formar en imagen usando un enlace confocal de disco hilado- montado en un microscopio equipado con lineas láser . y espejos dicroicos y filtros para resolver fluoróforos rojos UV hasta más. Las señales se capturan en una señal alta, sensible al ruido de la cámara EMCCD. Las imágenes se adquieren usando software de adquisición de imágenes apropiado. En experimentos de etiqueta doble, las imágenes se adquieren secuencialmente para eliminar a través de la sangre. Los controles con etiquetados de fluoroforo sencillos se hacen para asegurar la ausencia a través de sangre.

Para formación de imágenes en un lapso de tiempo de la imagen in vivo, los renacuajos anestesiados se reemplazan en una cámara de formación de imágenes a la medida. Las pilas confocales completas en 1 µ?? en la etapa z se adquieren usando ajustes de láser/filtro apropiadas para los fluorórforos . Para secciones y montajes completos de tejido fijo, las pilas z completas (OÍ 5 µp? de intervalo z) se adquieren de los lóbulos tectales.

Para análisis de datos en un lapso de tiempo, las neuronas y glia radial se distinguen de acuerdo al criterio morfológico basado en la estructura tridimensional de las células. Se determinan los números y secuencia de divisiones proliferativas , simétricas;. divisiones neurogénicas , asimétricas; divisiones neurogénicas simétricas terminales, y el estado de diferenciación de cada célula en el linaje durante el curso de tiempo del experimento. La formación de imagen en el lapso de tiempo de los NPCs individuales permite la identificación del destino de las células durante el curso del experimento de formación de imágenes, incluyendo la evaluación de cambios . morfológicos en células divididas y diferenciadas.

De esta manera, en ciertas modalidades los métodos actuales son útiles para separación por exclusión (o identificación, caracterización . o mejora) de agentes farmacéuticos que alteran la diferenciación de células progenitoras neuronales (NPCs) en neuronas in vivo, más particularmente en un cerebro intacto. Una ventaja de los métodos actuales es que tales métodos pueden emplear poblaciones celulares neuronales in vivo, tales como aquellos en el sistema visual intacto de un renacuajo Xenopus. En consecuencia, el uso de poblaciones de célula neuronal in vivo permite una evaluación confiable y predictiva de la actividad biológica de un compuesto o modulador. Las NPCs y neuronas empleadas pueden ser de varios orígenes, incluyendo origen mamífero (por ejemplo, roedores, humanos, primates, etc..) así como anfibios tales como Xenopus laevis.

La actividad de un agente farmacéutico in vivo puede determinarse, por ejemplo, como se describe en la presente con respecto a la separación por exclusión de genes relacionados con neurogénesis . Por ejemplo, ya que los renacuajos Xenopus son susceptibles a formación de imágenes en un lapso de tiempo in vivo, las células progenitoras neuronales y su progenie se pueden formar en imagen en el animal intacto. En consecuencia, después de poner en contacto células NPC in vivo con un agente farmacéutico candidato, puede medirse la velocidad de proliferación en una población de animal de prueba con relación a una población de animal de control (por ejemplo, visualizarse), y la actividad de un candidato modulado determinado por las tasas relativas de proliferación NPC en animales tratados o puestos en contacto con un agente farmacéutico candidato con relación a una población de control. Un agente farmacéutico que modifica las tasas de proliferación NPC (por ejemplo, aumenta o disminuye) de esta manera se identifica como un modulador de neurogénesis y proliferación celular neuronal.

También pueden emplearse aquí condiciones descritas en la presente con respecto a los métodos in vitro para separación por exclusión de agentes farmacéuticos como moduladores de neurogénesis y métodos de separación por exclusión del gen in vivo (por ejemplo, concentración del agente farmacéutico, lectura, etc.). Por ejemplo, se puede transferir una población de célula NPC en una región SNC de animal intacto (por ejemplo, tectum óptico) (por ejemplo, por electroporación) por lo. que se expresa una proteina fluorescente (FP). Las células que expresan FP en el animal intacto se pueden formar en imagen en el momento t=0, luego se hace de nuevo la formación de imagen después de un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 24h, 48h, 96hr, etc.), y se puede formar en imagen en intervalos durante el periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, en 12 hr, 24 hr, 36 hr, etc.)- El cambio en número y tipo relativo de células (por ejemplo, NPCs y neuronas diferenciadas) durante el periodo de tiempo predeterminado cada intervalo de 24h se puede determinar al clasificar las células de acuerdo a sus morfologías. Los cambios en morfología se pueden caracterizas como fracciones de NPCs y células glíales en una población de prueba con relación a una población de control. Las diferencias entre las células en la población animal de prueba y la población animal . de control puede indicar que el agente candidato es un modulador de proliferación NPC.

En una modalidad específica, una selección de efectos GOI en proliferación celular SNC se puede realizar usando un ensayo de formación de imágenes para evaluar la incorporación Brdü en renacuajos X. laevis cuyos cerebros se electroporaron con morfolinos para GOIs. Uno a dos días después, las células proliferativas se pueden etiquetar por exposición a BrdU durante 2hr después del sacrificio. Los cerebros luego se pueden procesar para detectar BrdU en montaje completo y formación de imagen al recolectar una serie. z completa de imágenes confocales a través del cerebro. Tal formación de imágenes de cerebros de montaje completo proporciona un método excelente para cuantificar niveles de proliferación celular.

EJEMPLOS La descripción actual se ilustrará además por los siguientes Ejemplos no limitantes. Los siguientes Ejemplos se entienden para ser únicamente ejemplares, y no deben construirse como que limitan el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. 1. Estímulo visual y Proliferación NPC Introducción Se colocaron en ensayo la diferenciación y proliferación de células progenitoras' neuronales (NPC) en el sistema visual del sistema nervioso central intacto de renacuajo Xenopus. Este sistema experimental permite la manipulación de actividad neuronal al exponer a los animales a estimulación del sistema visual o privar a los animales de estimulación del sistema visual. Los resultados muestran que la tasa de proliferación de NPCs se incrementa en animales privados de estimulación visual comparados con animales criados bajo condiciones de 12h de luz/12h de oscuridad. Los animales que se privan de estimulación visual durante 24h seguido por un periodo de 24h de estimulación visual muestran una velocidad incrementada de proliferación durante las primeras 24h en ausencia de experiencia visual, seguido por diferenciación de la mayoría de nuevas células generadas (FIG. 6) . Estos datos muestran que al manipular el control de actividad neuronal de tanto la tasa de proliferación como diferenciación: disminuye la actividad neuronal que incrementa la proliferación e incrementa la actividad ' neuronal que dispara la diferenciación de progenitores en las neuronas.

Métodos Las NPCs se transíectaron en renacuajos Xenopus intactos por lo que expresan proteina fluorescente (FP). Las células que expresan FP en animales intactos se formaron en imagen usando microscopía confocal. Después de la formación de imágenes los animales luego se colocaron en cámara hermética a luz de manera que no reciben estimulación visual durante las siguientes 24h. Las células que expresan FP se formaron en imágenes de nuevo y los animales se colocaron en una cámara donde reciben estimulación de visual durante 24h. Los animales se formaron en imágenes durante un tercer momento. El cambio en números celulares durante cada intervalo de 24h y la identidad de las células ¦ como glía radial (NPCs) o neuronas se determinó de acuerdo a sus morfologías. Los datos se expresan como el cambio en número celular por 24h y como la fracción de células con NPC o morfologías neuronales.

Resultados En ausencia de experiencia visual, los números celulares incrementan +19.9 ± 5.8% durante un periodo de 24 horas (N= 12 techos {tecta) analizados) . Después de exponer los animales al estimulo visual durante 24 horas, se encontró una caída importante de 6.3 + 5.4% en números celulares (prueba de rango con signo de Wilcoxon, p = 0.01) . Esta tasa negativa indica que las células han dejado el ciclo proliferativo debido a que el marcador de fluorescencia usado para detectar las células se conduce por un promotor que se expresa únicamente durante la proliferación. Un conjunto separado de animales que no se expusieron a la experiencia visual no muestran diferencias importantes en la tasa de proliferación entre los dos periodos de.24 horas (N= 7 techos analizados, p = 0.4) .

Hubo una neurogénésis de tasa constante en los cerebros de animales que no se expusieron al estimulo visual. En ausencia de estimulación visual, la tasa de neuronas nuevas incrementa 32.9 ± 11.3% durante el primer intervalo de 24 horas que no fue importante del incremento al 30.1 ± 9.4% medido durante el segundo intervalo de 24 horas ( = 7 techos, prueba de rango con signo de Wilcoxon p = .73) . En contraste, la tasa de neurogénésis de animales que se expusieron al estímulo visual durante el último intervalo de 24 horas cayó significativamente de 79.4 ± 22.9% en el primer intervalo de 24 horas hasta 18.0 ± 9.4% durante el segundo intervalo de 24 horas (N= 12 techos, p = .05) .

En ausencia de la experiencia visual de 24 horas, la tasa de esas células que pierde su apariencia glial muestra una caía al 17.1 + 9.7% durante el primer periodo de 24 horas y una disminución al 44.9 ± 10.6% durante el último intervalo de 24 horas (N= 7 techos, p = 0.18). La tasa de esas células de los animales con 24 horas de privación visual seguido por exposición de 24 horas a estimulación visual que pierde su apariencia glial significativamente incrementa después de la exposición al estimulo visual (17.1 ± 9.7% pérdida antes y 56.0 ± 10.0% pérdida después, p = .04).

Juntos estos resultados son consistentes ' con la proliferación celular que interrumpe la experiencia visual e incrementa la tasa con la cual los precursores gliales difieren en las. neuronas. 2. Agentes Moduladores Con y Sin Experiencia Visual y Proliferación NPC Antecedentes y Métodos Detección NPC Estos experimentos aprovecharon un sistema reportero fluorescente, especifico de tipo celular que conduce la expresión de proteina en células divididas (ver FIG. 3) . El reportero consiste de 6 repeticiones de elementos reguladores corriente arriba del factor de crecimiento de fibroblasto 4 (FGF4). Los factores de transcripción sox2/oct3 endógenos enlazan a los elementos- reguladores FGF4 y conducen la expresión de Gal4 que a su vez conduce la proteína UAS-fluorescente . FGF4, sox2 y oct3, son cada uno expresado en células proliferadas , y dependen de los factores de transcripción sox2/oct3. endógenos para conducir especificidad promovida por Gal4 de la expresión reportera dentro de las células proliferadas . La proteína UAS-fluorescente se expresó como un constructo separado; este reportero agrega modularidad y especificidad a este sistema reportero.

Las células tectales que · expresan el reportero fluorescente descrito arriba se cosecharon de renacuajos con experiencia visual variada así como de renacuajos que han expresado el constructo para cantidades diferentes de tiempo. El ARN de estas células luego se procesó y se hicieron comparaciones de microconfiguración . Los genes identificados de interés seleccionados para análisis adicional se resumen en la Tabla 1 enseguida: No . de acceso Nombre actual Descripción NM MGC82106 Una isoforma supuesta 001092639 .1 ELK4, proteina de de Elk4. domino ETS (proteina 1 de accesorio SRF) (elk4-b) BC170068. 1 Ribonucleasa 1 polisomal BC170070. 1 Ribonucleasa •1 polisomal BC169356. 1 Subunidad alfa catalítica de cinasa de proteína dependiente de cAMP Proteína 1 enlazada Proteina enlazada a al elemento de ARN que estimula la poliadenilación poliadenilación y citoplásmica traducción en células germinales y neuronas Gen de plasticidad Involucrado en la candidato 15 sobrevivencia celular y se regula por actividad BC106400. 1 Desiodinasa , Remueve el yodo de la yodotironina, tipo forma activa de la III hormona de tiroides (T3) para activarse.

NM Xenopus laevis 001087027 .1 efrina-A3 (efna3) (ligando) NM ELK4, proteína de Un miembro y factor de 001085854.1 dominio ETS (proteina transcripción de los 1 de accesorio SRF) factores de complejo (elk4-a) (sapl) ternarios. Regulado por cinasas reguladas extracelulares como parte de la trayectoria MAPK de la señalización del factor de crecimiento.

NM Efrina-Bl Una proteina de 001090601. 1 Receptor EPH Bl membrana tipo I y un ligando de tirosina cinasas del receptor relacionado Eph.

NM Proteina 1 de retraso Proteina enlazada al 001085687. 1 mental X frágil ARN cuya pérdida resulta en retraso mental X frágil NM Retraso mental X Conodico para 001088317. 1 frágil, gen homólogo interactuar con fmrlA autosomal M Glutationa s- Parte de la familia de 001088783. 1 transferasas pi 1 proteínas que catalizan la conjugación de compuestos hidrofóbicos y electrofílieos con glutationa reducida.

NM Histona' desacetilasa Responsable para la 001087017. 1 6 desacetilación de Tabla 1 - Genes de Interés Identificados por medio Análisis de Microconfiguracion Se hicieron las comparaciones entre renacuajos de diferentes edades (población mayor de células proliferadas contra población mayor de células terminalmente diferenciadas) y renacuajos con experiencia visual diferente, que también pueden estar predispuestos a los niveles relativos de proliferaciones contra diferenciación terminal. Se priorizaron genes que muestran cambios importantes en su expresión en comparaciones de microconfiguración múltiples.

Se empleó el reportero descrito arriba para conducir la proteina fluorescente Kaede en las células proliferadas del tectum óptico de renacuajos. El espectro de emisión fluorescente de Kaede puede fotoconvertirse de verde a rojo después de la exposición a una luz UV o fuente láser 405 nm, que agrega control temporal a los experimentos. 24-36 horas después de que los renacuajos se transíectaron con el reportero, todas las células que expresan Kaede se fotoconvirtieron a la forma roja de la proteina. Basado en los datos publicados usando métodos similares (Carón et al., Development 2008, 135:3259-3269), la progenie nuevamente producida hereda el Kaede rojo durante la citocinesis, pero continua para sintetizar nueva proteina Kaede verde. Por ejemplo, Carón et al. (ibid.) identifica células nuevamente generadas por los niveles relativos de verde a rojo.

Las células del tectum óptico se transfectaron con el reportero de proliferación por electroporación, un método bien establecido que confiablemente resulta en células etiquetadas múltiples en el tejido (Haas et al., Differentiation 2002, 70: 148-154). El conductor Gal4 y plásmidos UAS-kaede (0.5 µ?/µ?) se inyectaron en el ventrículo del tectum óptico y luego los pulsos de voltaje se aplicaron .a través del tejido para conducir los plásmidos en las células del tectum. Estos constructos de plásmido se co-electroporaron con oligonucleótidos de morfolino antisentido diseñados para inhibir la traducción de los genes candidato (Eisen et al., Development 2008, 135: 1735-1743). Los morfolinos se electroporaron en 0..1 mM y visualizaron por una etiqueta fluorescente de lisamina. Para prevenir la conversión de Kaede de- longitud de onda UV de luz ambiente, los animales se mantuvieron en la oscuridad. 24-36 horas después, los renacuajos se anestesiaron y una pila z completa a través del tectum óptico de cada animal se recolectó en cada día durante 3 días consecutivos. Después de formar la primera imagen del tectum, todos los animales se regresaron a la oscuridad durante el periodo de 24 horas hasta que se forma la segunda imagen. Al momento, algunos animales se expusieron a un ambiente visual aumentado que consiste de una cámara con' una configuración de luz LED (que emite unos 567 nm, más allá de la longitud de onda para convertir la proteína Kaede) que destella durante 1 seg. a 0.2 Hz. Este estimulo visual se ha mostrado para aumentar la conducción sináptica en las neuronas tectales y resulta en cambios importantes en plasticidad sináptica (Sin et al, Nature 2002, 419: 475-480) .

Análisis y adquisición de datos Los ajustes de adquisición usados en el primer día se eligieron para protegerse contra la saturación alcanzada de valores de pixel en el tercer día. Los ajustes seleccionados se usaron a lo largo del experimento. El software Volocity ( Improvision, Perkin Elmer) que usa la información en 3D de las pilas z adquiridas se usó para identificar y seleccionar cuerpos celulares de las células etiquetadas basadas en la desviación estándar de la intensidad y tamaño de los objetos. Los objetos identificados luego se verificaron por el experimentador y el tipo celular (glia, neurona, o no definido) se asignó basado en la morfología celular. De cada lóbulo tectal típicamente entre 15 y 45 células se transíectaron . Se calculó el porcentaje de proliferación como el cambio en números celulares por un periodo de 24 horas. Estas mediciones se reportan como media ± s.e.m.

En el análisis de proliferación en animales de control, se reportan animales cón bloqueadores de proliferación celular-, y animales que reciben la estimulación visual aumentada en 24 horas. Los resultados de experimentos en los cuales 2 candidatos identificados de las microconfiguraciones (Dio3 y GstPi) se desactivan con morfolinos antisentido también se reportan. Además, se reportan los resultados de experimentos para determinar la experiencia visual que afecta la proliferación en presencia de desactivación de morfolino Dio3. Las condiciones experimentales empleadas se resumen en la Tabla 2 enseguida: Condiciones del Experimento de Desactivación Resultados y Discusión La expresión del constructo reportero Sox2 demuestra que las glias radiales son las células progenitoras nueronales en el tectum óptico Xenopus (FIG. 4). Las neuronas no continúan para expresan Kaede verde después de la diferenciación ya que las células diferenciadas ya no producen sox2/oct3 para conducir el constructo- gal4-UAS-Kaede . La mayoría de divisiones NPC se encontraron para ser divisiones terminales.

Bloqueadores de división celular Se aplicaron afidicolina (150uM) e hidroxiurea (20mM en DMSO al 2%) a células para bloquear divisiones celulares, y las tasas de proliferación de aquellas células comparadas con animales de control que reciben únicamente DMSO. Este tratamiento interrumpe la proliferación en Xenopus (Harris et al., Neuron 1991, 6: 499-515). En animales de control expuestos a únicamente ' DMSO, se observó un incremento promedio de 16.4 ± 4.2% en número celular durante 24 horas (N = 8 lóbulos tectales) . Afidicolina e hidroxiurea bloquean la proliferación celular (incremento en números celulares: 0.41 + 6.28% (N= 10, p=0.1, Mann-Whitney; ver FIG. 5).

Control dependiente de experiencia visual de destino NPC En ausencia de experiencia visual, los números celulares incrementan 19.9 ± 5.8% durante un periodo de 24 horas (N= 12 lóbulos tectales) . Después de exponer los animales al estimulo visual durante 24 horas se encontró una disminución importante al 6.3 ± 5.4% en números celulares (p = 0.01). Esta tasa negativa muestra que las células pueden dejar el ciclo proliferativo y ya no son detectable debido a dilución del reportero Kaede rojo en el eje dendritico que incrementa el crecimiento. El. reportero Kaede se expresa únicamente durante la proliferación y en consecuencia, las células terminalmente diferenciadas exhibirán únicamente que el reportero se produce en el modo proliferativo . Los animales de control que no reciben el periodo de 24 horas de estimulación visual no muestran diferencias importantes en la tasa de proliferación entre los dos periodos de 24 horas (10.3 ± 7.2% y -0.6 ± 3.5%; N= 12 lóbulos tectales analizados, p = 0.23; FIG. 6A) .

Para probar si la exposición a experiencia visual afecta el destino de las . células en el tectum, se comparó la fracción de neuronas en la población etiquetada después de 24 h con o sin estimulación visual. La proporciona de células con morfología neuronal fue mayor en animales que se expusieron a estimulo visual como se compara con animales de control (75.7 ± 4.1% contra- 60.1 ± 4.8%, p .= 0.02, Mann-Whitney; FIG. 6B) , que muestra, que la experiencia visual promueva la diferenciación de la progenie NPC.

Neurogénesis y expresión de Dio3-morfolino La desiodinasa yodotironina tipo III es la enzima en la trayectoria de la hormona de tiroides que remueve todo de la forma activa de la hormona de tiroides (T3) , al inactivarla efectivamente. Un análisis de microconfiguración sugiere que la expresión Dio3 se incrementó en células progenitores activas. Los niveles T3 en X'. laevis son bajos antes de las etapas metamórficas , pero la pres.encia de receptores T3 se ha detectado en NPCs, sugiriendo que los cambios relativos en niveles T3 puede afectar la proliferación. La proliferación incrementada se correlaciona con la hormona de tiroides incrementada y activación del receptor en renacuajos X. laevis en etapas metamórficas (Denver et al., Dev Biol 2009, 326: 155-168). Por lo tanto, una desactivación de Dio3 con expresión de morfolino debe incrementar los niveles T3 y en consecuencia incrementa la proliferación.

Los animales transíectados con morfolinos contra Dio3 (Dio3-M0) muestran números células incrementados: 11.4 ± 17.3% en el primer periodo de 24 horas y 33.9 ± 22.2% durante el segundo periodo de 24h (N=4, FIG. 7) . En contraste, los animales de control muestran el incremento más grande en proliferación del primer periodo de 24 horas, luego poca proliferación durante el periodo de 24 horas posterior. Los grupos inusuales de células que aparecen para ser clones se encontraron dentro de los techos (tecta) de animales transíectados con Dio3-MO, consistente con patrones inusuales de proliferación sin el tiempo normal para migración.

Algunos animales que expresan Dio3-MO también se expusieron a estimulo visual durante el segundo periodo de 24h (FIG. 7) . La experiencia visual se encontró para disminuir las tasas de proliferación en animales transíectados con Dio3-MO (N=5) , sin embargo esta diferencia no se consideró importante debido a la gran variación en tasas de proliferación.

Desactivación de GSTpi que promueve diferenciación neuronal La Glutationa S-transferasa Pi 1 (GSTPI) es un miembro de la familia de Glutationa S-transferasa de proteínas, que juega un papel importante en la destoxificación al catalizar la conjugación de muchos compuestos hidrofóbicos y electrofílieos con glutationa reducida. GST-Pi 1 se cree que juega un papel en la susceptibilidad para cánceres. GST-Pi 1 se observó para sobrerregularse en células precursoras neuronales y por lo tanto una desactivación GST-Pi se predice para disminuir las tasas de proliferación.

Se observó un resultado notable en los techos de renacuajos que expresan morfolinos contra GSTpi. El número de neuronas aún por el primer día fue significativamente mayor que aquel observado en animales de control (FIG. 8) . Una población significativamente más grande de células tectales (72.7 ± 4.7%, N = 7 lóbulos tectales) que expresan GSTpi-MO se diferenciaron en neuronas por el dia 1 en animales de prueba con relación a animales de control (42.0 + 4.7%), (p = 0.002, Mann-Whitney) . En el dia 2, 86.4 ± 3.7% de las células se han diferenciado eri neuronas en los animales de prueba comparados para 49.2 + 5.7% dentro de la población de control (p = 0.001). Esta proporción de neuronas puede representar un máximo ya que el número de neuronas no se observó para incrementar en los animales de prueba durante el tercer periodo (86.8 ± 1.0%), y es significativamente más grande que la proporción de neuronas dentro de los animales de control (60.1 ± 16.6%; p = 0.004) .

Un incremento en la proporción total de neuronas muestra que la población del precursor neuronal disminuye con la expresión GSTpi-MO. La proporción de glia radial disminuye durante el periodo de 3 días en animales que expresan GSTpi-MO, asi como animales de control (FIG. 8) . Comparar la proporción de células de cerebros que expresan GSTpi-MO para los animales de control muestra que en el dia 1 hubieron significativamente menos glía (13.3 ± 4.6% y 41.5 ± 4.8%; p = 0.005) y estas diferencias continúan durante los siguientes dos días (8.4 ± 2.0% y 17.4 ± 3.5%, p = 0.02; 4.8 ± 1.6% y 13.3 + 4.6%, p = 0.02) . Una proporción pequeña de células no puede categorizarse en glias radiales o neuronas.

Genes relacionados a X frágil FmrlA. Proteína 1 de retraso mental X frágil es una proteína enlazada a mARN que se cree que regula el tráfico de mARN del núcleo para el citoplasma y la traducción de proteína local dentro de las neuronas. Los datos de microconfiguración sugieren que la expresión de FMR1 y una proteína similar- a la Proteína que Interactúa a FMRP 82-kD, gen 1 que induce la proliferación (proteína de interacción de proteína de retraso mental ¦ X frágil nuclear AKA) fueron inferiores en NPCs comparados con neuronas diferenciadas. El papel potencial de FMRP y proteínas relacionadas en proliferación neuronal .no es completamente claro. Un estudio muestra que FMR1 incrementa la proliferación NPC y altera la diferenciación (Castren et al, Proc Nati Acad Sci USA 2005, 102: 17834-17839), aunque otro muestra que FMR1 únicamente altera la diferenciación NPC (Bhattacharyya et ah, Stem Células Dev 2008 17: 107-117). La discrepancia posible entre estos estudios puede ser debido al hecho de que cada uno de los estudios usa una fuente diferente de células in vitro. Un estudio in vivo puede clarificar el papel de FMR1 y genes relacionados en proliferación de NPCs.

FXR1. El gen homólogo autosomal, de retraso mental X frágil interactúa con las proteínas funcionalmente similares FMR1 y FXR2. Basados en los datos de microconfiguración, las desactivación FXR1 puede incrementar la proliferación al inhibir la diferenciación.

Los morfolinos contra FMRIA y FXRl aparecen para disminuir la proliferación NPC en el tectum. Estas fueron observaciones cualitativas.

Claims (52)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto, células progenitoras neuronales en una región intacta del cerebro de un primer animal con un agente farmacéutico; b) exponer el primer animal y un segundo animal de control a un estimulo visual; y c) medir las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en el primer animal y de células progenitoras neuronales en el segundo animal; en donde una diferencia en la tasa de proliferación entre las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales identifica el agente farmacéutico como uno capaz de modular proliferación neuronal.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región intacta del cerebro comprende el tectum óptico.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región intacta del cerebro se involucra en el procesamiento de uno o más del grupo seleccionado de entradas olfatorias, entradas visuales, y entradas mecanosensoriales, o se involucra al mediar salidas de comportamiento.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región intacta del cerebro comprende circuitos del telencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo/médula espinal, retina, o fosa olfativa.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer y segundo animales son Xenopus laevis .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende contar el número y tipo de células en el tectum óptico del primer y segundo animales .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque . poner en contacto las células progenitoras neuronales con -agente farmacéutico comprende electroporar el agente farmacéutico en las células progenitoras neuronales.

8. Un método, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto células progenitoras neuronales en cuestión con un agente farmacéutico en una cantidad efectiva para modular la expresión de uno o más genes en las células progenitoras neuronales en cuestión; b) medir las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en cuestión y de células de control progenitoras neuronales que no se han puesto en contacto con el agente farmacéutico; y c) comparar las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales; en donde una diferencia en tasa de proliferación entre las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales identifica uno o más genes como moduladores de proliferación de células progenitoras neuronales.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las células progenitoras neuronales en cuestión están en un primer animal y las células de control progenitoras neuronales están en un. segundo animal.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las células de control y objetivo progenitoras neuronales están en una región intacta del cerebro de cada uno del primer y segundo animales respectivamente. .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la región intacta del cerebro se involucra en el procesamiento de entradas olfatorias, entradas visuales, o entradas mecanosensoriales, o se involucra al mediar salidas de comportamiento.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la región intacta del cerebro comprende circuitos del telencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo/médula espinal, retina, o fosa olfativa.

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el primer y segundos animales son Xenopus laevis.

14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además comprende introducir un constructo reportero en las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el constructo reportero comprende un gen que codifica una proteina fluorescente.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteina fluorescente se expresa específicamente en células progenitoras neuronales.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la introducción comprende transfectarse con un plásmido que codifica el constructo reportero.

18. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la medición comprende contar el número y tipo de células antes · y después al menos en un periodo de tiempo predeterminado.

19. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque poner en contacto las células progenitoras neuronales en cuestión con un agente farmacéutico comprende electroporar el agente farmacéutico en las células progenitoras neuronales en cuestión.

20. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende exponer el primer y segundos animales a un estimulo visual.

21. El método de ' conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente farmacéutico comprende un compuesto químico o un oligonucleótido antisentido.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el oliogonucleotido antisentido comprende un siARN, y shARN y/o un morfolino.

23. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porqué uno o más genes se seleccionan de SEQ. ID. NOs . 1-651, o truncamientos - funcionales, modificaciones y/o sustituciones del os mismos.

24. Un método, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto células progenitoras neuronales en cuestión con un agente farmacéutico; b) medir las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en cuestión y de células de control progenitoras neuronales que no se han puesto en contacto con el agente farmacéutico; y c) comparar las tasas de proliferación de las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales1; en donde una. diferencia en tasa de proliferación entre las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales identifica el agente farmacéutico como uno capaz de modular la proliferación.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque las células progenitoras neuronales en cuestión están en un primer animal y las células de control progenitoras neuronales están en un segundo animal.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las células de control progenitoras neuronales y objeto progenitoras neuronales están' en una región intacta del cerebro de cada uno del primer y segundo animales.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la región intacta del cerebro se involucra en el procesamiento de entradas olfatorias, entradas visuales, o entradas mecanosensoriales, o se involucra al mediar salidas de comportamiento.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la región intacta del cerebro comprende circuitos del telencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo/médula espinal, retina, o fosa, olfativa.

29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer y segundos animales son Xenopus laevis.

30. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende introducir un constructo reportero en las células progenitoras neuronales en cuestión y las células de control progenitoras neuronales.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el constructo reportero comprende un gen que codifica una proteína fluorescente.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la proteína fluorescente se expresa específicamente en células progenitoras neuronales.

33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la introducción comprende la transfección con un plásmido que codifica el constructo reportero.

34. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la medición comprende contar el número y tipo de células antes y después de al menos un periodo de tiempo predeterminado.

35. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque poner en contacto las células progenitoras neuronales en cuestión con un agente farmacéutico comprende electroporar el agente farmacéutico en las células progenitoras neuronales en cuestión.

36. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende exponer el primer y segundos animales a un .estimulo visual.

37. Un método, caracterizado porque comprende; a) administrar un agente farmacéutico a células en cuestión que expresan un gen objetivo seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs . 1-651, o truncamientos funcionales, modificaciones y/o sustituciones de los mismos; y b) comparar la expresión del gen objetivo en las células en cuestión que administran el agente farmacéutico comparadas con la expresión del gen objetivo en células en cuestión sin ponerse en contacto con el agente farmacéutico; en donde una diferencia en expresión del gen objetivo en las células en cuestión que administran el agente farmacéutico comparado con células en cuestión que no administran el agente farmacéutico, identifica el agente farmacéutico como un modulador candidato de diferenciación o proliferación neuronal.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque las células de control y objeto son células progenitoras neuronales.

39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque además comprende evaluar el modulador candidato de neurogénesis en una región intacta del cerebro.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la región intacta del cerebro es el tectum óptico de Xenopus laevis.

41. Un agente farmacéutico identificado por el método de conformidad con la reivindicación 1.

42. Un agente farmacéutico identificado por el método de conformidad con la reivindicación 8.

43. Un agente farmacéutico identificado por el método de conformidad con la reivindicación 24.

44. Un agente farmacéutico identificado por el método de conformidad con la reivindicación 37.

45. El método, caracterizado porque comprende administrar el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 38 a un paciente.

46. El método, caracterizado porque comprende administrar el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 39 a un paciente.

47. El método, caracterizado porque comprende administrar el agente, farmacéutico de conformidad con la reivindicación 40 a un paciente.

48. El método, caracterizado porque comprende administrar el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 41 a un paciente.

49. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 38.

50. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 39.

51. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 40.

52. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el agente farmacéutico de conformidad con la reivindicación 41.