CN102859356A - 与神经发生及其调节相关的基因、方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本申请提供了研究神经发生，神经细胞增殖和分化的方法。具体来说，本发明涉及到用于筛选能够调节神经发生和神经细胞的增殖的药剂的方法，筛选调节神经发生和神经祖细胞增殖的基因的方法，以及鉴定作为神经发生和神经细胞增殖的候选调节剂的药剂的方法。本发明还涉及到鉴定表征和调节神经的药剂的方法，通过该方法鉴定的药剂，用这种药剂治疗患者的方法，含有这种药剂的组合物。因此，本方法能够澄清在健康动物中以及神经系统疾病中控制神经发生、大脑发育和功能的机制。此外，本方法有利于开发组合物，其用于预防、改善或稳定在包括认知障碍在内的各种中枢神经系统疾病中受损的神经发生。

Description

与神经发生及其调节相关的基因、方法和组合物

相关申请

本申请根据35USC§119要求于2009年9月29日提交的美国临时申请61/246,967的优先权，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式通过EFS的网站提交，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本，创建于2010年9月28日，被命名为21RE6840.txt，大小为2011398字节。

技术领域

本发明涉及参与神经发生(特别是中枢神经系统的神经发生的活动依赖性调节)的基因、方法和组合物。更特别的是，本发明涉及鉴定和操纵参与神经发生的基因的方法，以及用于筛选和评估调节神经发生的药剂的方法。

背景技术

神经发生是一个复杂的过程，是神经系统的发展和成熟的基础。这个过程依赖于细胞增殖、存活、分化和迁移的正确时空调控。新产生的神经细胞能够分化为中枢神经系统的功能细胞，并整合进大脑中的神经回路。此外，在许多动物的大脑中，在生物体的整个生命周期不断产生新的神经细胞。例如，目前已知哺乳动物整个成年期持续在大脑的两个区域进行神经发生：侧脑室的脑室下区（SVZ区）和海马齿状回。在这些区域，多能神经祖细胞（NPC）继续分裂和产生新的功能性神经元和神经胶质细胞(Jacobs,Mol.Psychiatry 2000,5(3):262-9)。因此，控制神经发生决定了中枢神经系统的区域特异化和建立弥补功能回路的特定类型的细胞。

神经发生在中枢神经系统生理学中起着根本作用。神经祖细胞（NPC）池可由产生额外的NPC的对称分裂而扩展，或通过后代终末分化成神经元或神经胶质细胞而耗尽(Buet al.,Neuron 2005,48:591-604;Gotz et al.,NatRev Mol Cell Biol 2005,6:777-788;Huttner et al.,Curr Opin Cell Biol 2005,17:648-657;Noctor et al.,Arch Neurol 2007,64:639-642;Kriegstein et αΙ.,Αηη Rev Neurosci 2009,32:149-184)。因此，使NPC保持在活跃的增殖状态可以扩大祖细胞池，并且可以扩大小鼠的大脑皮层(Chenn et al.,Science2002,297:365-369;Lehmann et al.,Eur J Neurosci 2005,21:3205-3216)。相反，NPC过早从增殖状态过渡到分化状态可以消耗祖细胞池，在短期内，这样可以提高分化的神经元和神经胶质细胞的生成，但在长期，祖细胞池枯竭限制了神经后代的继续生成。皮质的大小也可以通过增加或减少NPC的存活而改变。(Depaepe et al.,Nature 2005,435:1244-1250;Putz et al,Nat.Neurosci.2005,8:322-331)。

神经发生的中断可以在中枢神经系统疾病和障碍中发挥基础性作用。神经元细胞的数量在很大程度上取决于NPC的增殖和他们的后代的存活和分化。虽然这些步骤可独立地调节，他们也必须得到妥善协调，以在神经系统中建立正常运作的回路。事实上，神经元生成和它们组装成回路中的错误可以导致许多神经系统疾病，包括异位(heterotopias)，智力低下，自闭症，癫痫，局灶性皮质发育不良。神经元细胞类型产生的改变可以导致大脑中的兴奋和抑制回路的不相称的比例，可引起自闭症、抑郁症和精神分裂症的不平衡。

这些报告强调了调节NPC增殖和它们后代的命运的机制的至关重要的作用。调节细胞增殖的机制可以划分为细胞自主机制和非细胞自主机制。细胞自主机制方面，最近在鉴定将细胞推入“多能(pluripotent)/多能(multipotent)”状态并保持这种状态所需的因素方面已取得巨大进步。(Welstead et al,Curr.Opin.Genet.Dev.2008,18:123-129)。

然而，对依赖于体内的神经活动的非细胞自主机制的了解较少。因此阐明控制在完整动物的神经发生的机制是正确理解健康动物的大脑发育和功能以及神经系统疾病的关键所在。这对开发预防、改善和/或稳定（例如，调节）神经系统的神经发生特别是受损的神经发生（特别是包括认知功能障碍在内的神经系统疾病）的方法和组合物也是至关重要的。

本发明通过提供涉及到以活动依赖方式调节神经发生的靶、方法和组合物来满足本领域的这些和其它需求。

发明概述

在第一方面，公开了一种方法，包括：使第一动物的完整的脑区内的神经祖细胞与药剂接触；使所述第一动物和第二对照动物暴露于视觉刺激；和测定所述第一动物的神经祖细胞的增殖率和所述第二动物的神经祖细胞的增殖率；其中所述对象神经祖细胞和所述对照神经祖细胞之间的增殖率差异表示所述药剂是能够调节神经细胞增殖的药剂。

在某些实施方式中，第一和第二动物可以是脊椎动物，包括两栖类动物和哺乳动物。更特别的是，第一和第二动物可以是非洲爪蟾(Xenopuslaevis)，更具体的可以是非洲爪蟾蝌蚪。

在某些实施方式，完整的脑区可以参与处理嗅觉输入、视觉输入、或机械感觉输入，或可参与介导行为输出。在具体实施方式中，第一和第二动物可以是非洲爪蟾，完整的脑区可以是视顶盖。完整的脑区也包括端脑，中脑，后脑/脊髓，视网膜，或嗅窝的回路。

在某些实施方式，测定实验动物和对照动物的神经祖细胞的增殖率包括对所述第一动物和所述第二动物的视顶盖内的细胞的数量和类型进行计数。

在一些实施方式中，使神经祖细胞与药剂接触可以包括通过电穿孔使药剂进入神经祖细胞。

在另一个方面，公开了一种方法，包括：使对象神经祖细胞与药剂接触，所述药剂的量能够有效地调节所述对象神经祖细胞的一个或多个基因的表达；测定所述对象神经祖细胞的增殖率和未与所述药剂接触的对照神经祖细胞的增殖率；和比较所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞的增殖率；其中所述对象神经祖细胞和所述对照神经祖细胞之间的增殖率差异表示所述一个或多个基因是神经细胞增殖的调节剂。

在某些实施方式，对象神经祖细胞可以在第一动物中，对照神经祖细胞可以在第二动物中。在一些实施方式中，所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞可以分别在所述第一动物和第二动物的完整的脑区中。在一个实施方式中，第一和第二动物可以是非洲爪蟾。

在一些实施方式中，该方法可以进一步包括在所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞中引入报告子构建体。在某些实施方式，报告子构建体可以包括荧光蛋白编码基因。荧光蛋白的表达可以在空间上受到限制，特别是限制到特定的细胞类型，如神经祖细胞。在另一实施方式中，荧光蛋白的表达也可以在时间上受到限制，例如限制在特定的时间点后在脑区产生的后代细胞。在某些实施方式，所述引入包括用编码所述报告子构建体的质粒进行转染。

在一些实施方式中，所述测定包括对至少一个预定的时间段之前和之后的细胞的数量和类型进行计数。

在另一个实施方式中，该方法可以进一步包括将第一和第二动物暴露于视觉刺激。

在一些实施方式，药剂可以包括化合物或反义寡核苷酸。在某些实施方式，反义寡核苷酸可以包括siRNA，shRNA和/或吗啉寡核苷酸(morpholino)。

在本方法的另一实施方式，所述一个或多个基因可以选自SEQ ID NO.1-651，或者它们的功能性截短物、修饰物和/或替代物。

在另一个方面，公开了一种方法，包括：使对象神经祖细胞与药剂接触；测定所述对象神经祖细胞的增殖率和未与所述药剂接触的对照神经祖细胞的增殖率；和比较所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞的增殖率；其中所述对象神经祖细胞和所述对照神经祖细胞之间的增殖率差异表示所述药剂能够调节增殖。

在一些实施方式中，该方法可包括在所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞中引入报告子构建体。。在某些实施方式，报告子构建体可以包括荧光蛋白编码基因。在一些实施方式中，荧光蛋白可以特异性在神经祖细胞中表达。

在一些实施方式中，所述引入包括用编码所述报告子构建体的质粒进行转染。

在一些实施方式中，使对象神经祖细胞与药剂接触包括通过电穿孔使药剂进入所述对象神经祖细胞。

在某些实施方式中，该方法可以进一步包括将第一和第二动物暴露于视觉刺激。

在第四个方面，公开了一种方法，包括：将药剂施用于表达靶基因的对象细胞，所述靶基因选自SEQ ID NO.1-651，或者它们的功能性截短物、修饰物和/或替代物；对施用了所述药剂的对象细胞中的靶基因的表达和未与所述药剂接触的对象细胞中的靶基因的表达进行比较；其中施用了所述药剂的施用对象细胞中的目标基因的表达和未施用所述药剂的对象细胞相比的差异表明所述药剂是神经细胞增殖或分化的候选调节剂。

在另一个方面，公开了由本文描述的方法鉴定的药剂。

另一个方面，公开了药物组合物，该药物组合物含有由本文描述的方法鉴定的药剂。

另一个方面，公开了治疗患者的方法，包括施用由本文描述的方法鉴定的药剂。

本发明包括对神经细胞增殖和分化的现象进行研究的方法，通过这种方法鉴定的药剂，含有该药剂的组合物，以及包含施用所述药剂或组合物的治疗方法。因此，本发明提供鉴定参与神经发生调节的基因的方法；鉴定表征和调节神经发生的药剂的方法；用于神经系统特别是各种神经系统紊乱和/或受伤的调节剂和治疗，包括预防、改善和/或稳定神经系统中(特别是包括认知功能障碍在内的神经系统紊乱中)的神经发生特别是受损的神经发生（即调节）的方法和组合物。本发明还包括通过本发明的方法所选择的药剂，以及含有所选药剂的药物组合物，以及将所述药剂和组合物施用于患者的方法，其中所述患者包括人类患者，施用的目的是调节神经发生，特别是预防、改善和/或稳定神经系统中，特别是患者（尤其是人类）的包括认知功能障碍在内的神经系统紊乱中的神经发生，特别是受损的神经发生。

附图说明

图1描绘了非洲爪蟾蝌蚪的透明的大脑（A）；大脑的视顶盖区域（B）；和顶盖叶的细胞增殖和分化（C）。

图2是显示神经祖细胞（NPC）不同的谱系的示意图。

图3是有利于在完整的大脑中成像的标记细胞的时空分辨的增殖报告子的示意图。

图4显示NPC在24小时的时期在非洲爪蟾的视顶盖的增殖。

图5显示暴露于细胞分裂阻断剂后的顶盖细胞的增殖率下降。

图6显示第1天在没有视觉刺激下和第2天在视觉刺激下，在细胞分裂阻断剂存在或不存在的情况下，顶盖的增殖率（A）；在细胞分裂阻断剂存在或不存在的情况下，第3天顶盖神经元的百分比（B）。

图7表示与对照动物相比，在视觉刺激存在或不存在的情况下，在表达针对脱碘酶碘化甲腺氨酸Ⅲ型的吗啉寡核苷酸（DIO3-MO）的动物中顶盖的增殖率。

图8表示与对照动物相比，在表达针对谷胱甘肽-S-转移酶Pi 1的吗啉寡核苷酸（GSTpi-MO）的动物中，三天内顶盖神经元和神经胶质细胞的百分比。

图9表示与对照动物相比，在表达针对感兴趣的11个基因（GOIs）之一的吗啉寡核苷酸的动物中，三天内顶盖的增殖率（A）和顶盖神经元和神经胶质细胞的百分比（B）。GOIs：热休克蛋白70（HSPA5）；B-1型Ephrin受体；脱碘酶碘化甲腺氨酸Ⅲ型（DIO3）；含ETS结构域的蛋白质ELK-4（ELK4）；Wingless型MMTV（鼠乳腺肿瘤病毒）整合位点家族，成员7B（Wnt7b）；脆性X智力低下，常染色体同源物（FXR1）；脆性X智力低下蛋白1（FMR1A）；基质金属蛋白酶9（MMP9），cAMP依赖蛋白激酶催化亚基α（PRKACA），神经突起蛋白(neuritin)1-A（cpgl5）；谷胱甘肽-S-转移酶Pi 1（GSTPi）。

具体实施方式

除非另有界定，此处使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。虽然与此处所述的方法和材料类似或等同的方法可以用于本发明的实践或测试，但是此处描述了合适的方法和材料。在此所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它文献的全部内容通过引用并入本文。此外，材料、方法和例子仅是说明性的，而不是为了限制。

为开展本发明涉及的基本技术手段参考包含定义和方法的标准实验室手册。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001);CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel et al.(eds.),John Wiley & Sons,Inc.,Hoboken,NJ(2010),Current Protocols in Cell Biology，Bonifacino et al.(eds.),John Wiley & Sons,Inc.,Hoboken,NJ(2010);Current Protocols inImmunology，Coligan et al.(eds,),John Wiley & Sons,Inc.,Hoboken,NJ(2010);Current Protocols in Neuroscience,Gerfen et al.(eds.),John Wiley &Sons,Inc.,Hoboken,NJ(2010);Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，Egli et al.(eds.),John Wiley and Sons,Inc.,Hoboken,NJ(2010);CurrentProtocols in Pharmacology，Enna et al.(eds.),John Wiley and Sons,Inc.,Hoboken,NJ(2010);以及在此引用的各种文献。

定义

在本申请中所用的术语“约”或“大约”是指在本领域技术人员确定的特定的值可接受的范围内，并可以部分取决于该值如何测量或确定，例如，测量系统或技术的限制。

术语“a(一)”、“an(一)”和“the(所述)”被理解为单数和复数的意思，除非另有明确规定。因此，“a(一)”、“an(一)”和“the(所述)”（及其在适当的情况下的语法变化）一般是指一个或多个。

这里所用的“神经发生”包括神经细胞在体内、体外或离体的增殖、存活，分化和迁移。细胞可以位于、获得于或来源于动物或人类的中枢神经系统或其他地方（例如周围神经系统）。神经发生意欲包括正常发育中的神经发生，以及疾病、伤害或治疗干预后发生的神经再生。本发明的实施方式包括检测或测量神经发生的非限制性指示物的增殖或分化。

“外部刺激”的定义非常广泛，包括任何类型可诱导神经活动的简单或复杂的细胞外刺激。因此，外部刺激包括动物视觉系统的输入。它还包括到大脑其他区域的输入，如参与处理嗅觉、机械感觉或视觉输入和参与介导行为输出的区域。

此处所用的术语“调节”，包括改变基因的表达或RNA分子或等同(equivalent)RNA分子的水平，包括非编码RNA和编码一个或多个蛋白质或蛋白质亚基的RNA。“调节”还包括改变一个或多个基因产物（包括非编码RNA）、蛋白质或蛋白质亚基的活性，因此，与不存在调节剂相比，存在调节剂时的表达、水平或活性不同。例如，术语“调节”可以指“上调”或“下调”，虽然“调节”这个词的使用并不仅限于这些定义。调节可以增加或减少表达或活性，基因产物的结合特性的变化，或任何其他生物活性分子的生物功能或免疫属性的变化。

“神经发生的调节”或“调节神经发生”包括细胞增殖、存活、分化或迁移的变化。这种变化可以发生在一个细胞或细胞群，包括在完整的脑区内的细胞群。非限制的例子包括神经发生的诱导剂（或抑制剂）的水平的增加（或减少），例如直接参与NPC增殖的基因产物的水平变化。这种变化也可以包括在细胞分化或细胞迁移的神经回路中的差异。在某些实施方式中，调节神经发生是指对细胞增殖和细胞命运的影响（例如，神经元还是神经胶质）。

术语“调节剂”、“化合物”和“药剂”在此可以互换使用，包括单独或混合形式的药物学活性物质。例如，药剂，化合物或调节剂可以是分离的和结构明确的产品，未知结构的分离的产品，几个已知和已表征的产品的混合物，或包括一或多种产品的未明确的组合物。未明确的组合物的例子包括：组织样本，生物学流体，细胞上清液，植物制剂等。药剂，化合物或调节剂可以是任何有机或无机的产品，包括多肽（或蛋白质或肽）、核酸、脂质、多糖、化学实体或混合物或其衍生物。药剂，化合物或调节剂可以是天然或人工来源，并可以包括化合物库。

相对于不存在“调节剂”、“化合物”或“药剂”时的神经发生的量、程度或性质，“调节剂”、“化合物”或“药剂”可以增加（或减少）在体内、在体外或体外的神经发生反应的量、程度或性质。在某些实施方式，在用于检测或确定神经发生方法的条件下，与不存在试剂的情况下的神经发生反应的量、程度或性质相比，用这样的“神经发生”试剂治疗可以使神经应答的量、程度或性质增加（或减少）至少约1％，2％，3％，4％，5％，10％，20％，40％，50％，75％，100％，200％（2倍），300％（3倍），400％（4倍），500％（5倍），或更多或更少。

“抑制”、“下调”或“减少”包括，将基因的表达，或编码一个或多个蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平，或一个或多个基因产物、蛋白质或蛋白质亚基的活性减少至低于不存在本发明的方法定义的一个或多个调节剂的情况下（例如，siRNA，短发夹RNA，反义吗啉寡核苷酸等）所观察的表达、水平或活性。“增强”或“上调”包括，将基因的表达，或编码一个或多个蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平，或一个或多个基因产物、蛋白质或蛋白质亚基的活性增加至低于不存在本发明的方法定义的一个或多个调节剂的情况下（例如，siRNA，短发夹RNA，反义吗啉寡核苷酸等）所观察的表达、水平或活性。

“靶基因”或“感兴趣的基因”不仅包括蛋白质编码基因，还包括非编码基因。这种非编码基因包括那些编码核糖体RNA（rRNA），转移核糖核酸（tRNA基因），小核核糖核酸（snRNAs），以及小分子RNA，snoRNA，siRNAs，piRNAs，ncRNA的基因。也可以包括调节复制、转录、翻译或其他对基因产物的表达重要的过程的多核苷酸区域，或包含编码基因产物的区域和可操作地连接并调控表达的区域的核苷酸。靶基因可以是染色体的（基因组的）或染色体外的。这可以是细胞的内源性基因，或可以是外源基因（转基因）。外源基因可整合到宿主基因组，也可以是染色体外的遗传构建体，如质粒或粘粒。靶基因也可以来自能够感染生物体或细胞等的病原体，如病毒、细菌、真菌或原生动物。靶基因可以是病毒和原病毒的基因。在具体实施方式，靶基因可以参与或涉及对神经发生而言重要的细胞活动的进展。

术语“靶核酸”包括任何其表达或活性待调节的核酸序列。靶核酸可以是DNA或RNA。此外，靶基因或基因可以包括较大靶核酸序列的一般具有生物活性的片段。

现在将参考结合附图和实施例描述一些实施方式。虽然此处描述了某些实施方式，但是需要理解的是，所描述的实施方式不旨在限制权利要求所界定的发明范围。相反，本申请拟涵盖可包括在权利要求所界定的精神和发明的范围内的替代品，修改和等同物。此外，在目前披露的某些细节可以有助于透彻了解权利要求定义的发明。然而，对于本领域技术人员而言是明显的，某些实施方式可没有在这些细节的情况下实行。在某些情况下，没有描述众所周知的方法、程序或其他具体细节以避免不必要地遮蔽权利要求定义的发明。

鉴定和表征参与神经发生的基因的方法

非洲爪蟾作为模型系统

非洲爪蟾已被证明有利于在体内研究神经发生和大脑发育。几个因素决定了以下优点：

紧凑的神经发生期

青蛙蝌蚪有一个相对长期和易获得的细胞增殖和分化期，其贯穿CNS发育的幼虫期。在非洲爪蟾发育的前变态阶段的过程中，通过细胞的增殖生成新的神经元。新形成的神经元然后整合入发育中的蝌蚪脑的功能性回路。可以在2-4天的时间内捕获非洲爪蟾从出生到单独的神经元分化的神经发生序列，而哺乳动物系统要超过一个月。

这种紧凑的时间框架有利于包括神经发生的不同步骤的详细调查。这种优势，连同神经发生的机制是进化上保守的证据，强调非洲爪蟾不仅在揭示哺乳动物系统相关的神经发育基本机制中，而且在提供用于研究人类神经疾病的实验模型系统中的价值。

易获得的大脑回路

青蛙的神经元发育和回路形成的研究显示大脑发育的几个基本机制，其随后被显示在包括人类在内的哺乳动物中起作用。CNS沿非洲爪蟾的前后轴高度区域化，不同的CNS区域是由具有独特功能的特定神经回路形成的，包括感觉输入处理、信息整合、存储、决策和运动控制。

CNS室层的神经祖细胞的前后模式化是随后脑功能区域特异化的基础，并且被认为是通过转录因子家族的进化上保守的神经祖细胞中的表达模式而建立的，所述转录因子家族如OTX、Pax和Hox，接着激活转录级联限定祖细胞的区域亚组和他们的神经元后代(O'Leary et al.,Curr.Opin.Neurobiol.2008,18:90-100;Lichtneckert et al.,Adv.Exp.Med.Biol.2008,628:32-41).

事实上，Hox家族转录因子，不仅调节沿着前后轴从端脑到脊髓的祖细胞和细胞命运，而且可以在神经元分化时通过控制下游转录因子级联的功能而指定发育中的回路中的神经元之间的联系。(Dasen et al.,Curr.Top.Dev.Biol.2009,88:169-200;Dalla Torre di Sanguinetto et al.,Curr.Opin.Neurobiol.2008,18:36-43.)

本发明的实施方式包括分析在不同的大脑回路和细胞类型中的转录组的方法。这些包括端脑、中脑和后脑/脊髓，以及视网膜和嗅窝。每个区域由不同组的NPC后代表征。例如，端脑接收和处理嗅觉输入，并包含参与记忆和运动控制的同源的海马和基底节区域(Maier et al.,J Chem Neuroanat,40(1):21-35;Brox et al.,J Comp Neurol 2004,474(4):562-77).The midbrainprocesses mechanosensory and visual inputs(Hiramoto et al.,Dev Neurobiol2009,69(14):959-71;Deeg et al.,J Neurophysiol 2009,102(6):3392-404)andthe hindbrain and spinal cord mediate behavioral outputs(Soffe et al.,J Physiol2009,587(Pt 20):4829-44;Orger et al,Nat Neurosci 2008,11(3):327-33)。

本发明的方法不仅包括不同的脑区的分析，而且包括这类回路内的专门的细胞类型的分析。独特的回路在每个脑区被认为是由具有细胞特异性转录物的兴奋性和抑制性神经元的独特组合组成，其赋予区域特异性回路以特定属性。因此，本发明的方法包括对鉴定的神经元(如在这里描述的脑区GABA能和谷氨酸能神经元)的转录物进行分析。

在一些实施方式，所述方法可针对非洲爪蟾视顶盖区域。视顶盖是非哺乳动物脊椎动物的主要视觉中心，它是一个配对的结构，形成中脑（或中脑）的重要组成部分，并以构造上有序的方式接收来自视网膜纤维的输入。见，例如，Dingwell et al,J.Neurobiol.2000,44:246-259。

直接成像

NPC增殖和分化可在非洲爪蟾的前变态（蝌蚪阶段）直接观察到。图1A显示蝌蚪透明的头，用框表示大脑。图1B是一个更详细的视图，显示包括视顶盖的大脑区域。图1C显示神经细胞在2个小时和6天在视顶盖中的相对位置（用BrdU可视化）；新生成的细胞分化成神经元，其迁移离开室层。(Wu et al.,J.Neuroscience 1999,19(11):4472-4483)。

因此，爪蟾蝌蚪适于在体内进行时间推移成像，从而在完整的动物中使神经祖细胞（NPC）和他们的后代得到鉴别和成像。在这方面，NPC是未分化的神经胶质细胞，可以划分不同的模式，如图2所示。在第一种模式，单个NPC可以分裂形成两个子代NPC（例如，“增殖模式”）。在第二种模式中，单个NPC可以分裂，形成一个子代NPC和一个子代神经元（例如，“混合模式”）。在第三模式，单个NPC可以分裂形成两个子代神经元细胞（“分化模式”或“终端模式”。见Kriegstein et αl,Αnn Rev Neurosci 2009,32:149-184）。

神经发生报告子

这种成像提供了根据形态以及发育阶段鉴别和分析不同的细胞类型的方法。本申请涵盖使用多种细胞报告子以促进这种分析。举例说，比如报告子允许标记和随时间推移监测神经祖细胞，以及分化的细胞的不同群体，如GABA能或谷氨酸能神经元。

因此，在一些实施方式，本发明的方法可以使用对分裂中的NPC具有特异性的报告子。举例来说，报告子可以包括二元GAL4-UAS（上游激活序列）报告子系统(Hartley et al.,Proc Nat Acad Sci 2002,99(3):1377-1382)。图3显示了一个示例性的GAL4-UAS报告子系统，该系统由两部分组成：GAL4驱动器和UAS报告子。控制Gal4表达的序列因此决定UAS报告子的表达。

在图3所示的例子中，Gal4的控制区域包括成纤维细胞生长因子4（FGF4）基因启动子的多个增强子元素。这个控制区域的激活需要结合内源性sox2/oct3转录因子，其在增殖中的NPC表达，但不以显著的水平存在于已分化的非增殖神经元。因此，这个系统可以在增殖中的NPC中特异性检测UAS报告子。

报告子可以包括任何感兴趣的标记物。在一些实施方式中，如图3，它可以编码荧光蛋白（例如，Kaede荧光蛋白质或绿色荧光蛋白（GFP）），或任何其他合适的可检测或可视化的报告子。因此，正在积极分裂的细胞表达所述报告子蛋白（如Kaede或GFP）。在NPC的情况下，仍处于增殖状态的子细胞（例如，在增殖模式或混合模式（其中一个子细胞是NPC）中进行分裂）继续表达例如Kaede荧光蛋白。相反，NPC在终端模式的分裂会产生两个停止分裂的分化的神经元，从而表达很少或不表达Kaede荧光蛋白，将只包含胞质分裂过程中遗传的残留Kaede蛋白。因此，上述GAL4-UAS报告子系统可以提供NPC增殖的测定。

上述GAL4-UAS的报告子系统是一个示例性的报告子系统。然而，任何合适的报告子系统都可以采用（例如，单组分系统或其他双组分系统）。在其他实施方式中，它可以包括可以调节靶细胞中的功能的基因产物。事实上，该系统允许与GAL4驱动子联合使用多个UAS报告子。

此外，所述报告子可以有额外的属性，如允许在体内时间上分辨神经细胞。这样的一种报告子是如图3所示的光转化性荧光蛋白Kaeda。Kaede蛋白具有绿色荧光发射光谱，但它可以被光转化以在暴露于紫外光、405nm激光或任何其他合适的光源时展现出红色荧光发射光谱。因此，Kaede的光转化性使得获得在观察和表征NPC行为时的时间控制元件。

例如，NPC可以用具有Kaede荧光效应子元件的上述GAL4-UAS报告子转染。表达报告子的增殖中的细胞会产生具有绿色Kaede蛋白的子代。经过一段优选地预定的时间（例如，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，16小时，20小时，24小时，30小时，36小时，48小时，72小时，96小时，168小时，或其他任何值或它们的值范围内），含有Kaede蛋白的NPC可以暴露于光源（例如，405nm激光，紫外线），以将Kaede蛋白从绿色转化为红色。新产生的后代会在胞质分裂过程中遗传红色Kaede蛋白，但是保持未分化的NPC将产生绿色Kaede蛋白(Caron et ah,Development2008,17:107-117)。因此，新产生的子细胞可以与母细胞区分开，并可以通过测量绿色与红色Kaede蛋白的相对水平来确定父代和子代细胞的相对数目。这种测量方法也可以提供每种类型的细胞分裂(例如，增殖，混合，终端)的相对比例的估计。

适用于本方法的报告子系统可以由本领域公知的技术（例如，转染等）引入任何感兴趣的细胞或组织。在某些实施方式，报告子系统可以在质粒上构建，并且通过电穿孔引入细胞(Haas et ah,Differentiation 2002,70:148-154)。

通过微阵列分析进行差异筛选

在一些实施方式，本方法可以鉴定与神经发生有关的基因，特别是与NPC增殖和分化有关的基因。可以通过分别在放射状胶质细胞和分化的神经元中进行核酸微阵列分析来鉴定候选基因。这种微阵列技术是本领域众所周知的。在进行微阵列分析之前，细胞可以基于形态学进行选择，并分成不同的群。例如，细胞可以基于表征为NPC或分化的神经元而被分离。另外，可以将细胞群（或含有感兴趣的细胞群的动物）暴露于促进或抑制分化的条件和/或刺激。

非洲爪蟾蝌蚪已良好表征的神经系统发育为鉴定参与神经发生的候选基因提供了基础。例如，感兴趣的基因（例如，如SEQ ID NO.1-651）或其功能截短物、修改物和/或替代物，可以通过比较非洲爪蟾的未分化的NPC与在分化的神经元中表达的基因的比较微阵列分析来鉴定（见，例如，下面的实施例2）。在一个实施方式，在神经发育过程中，在不同天数从非洲爪蟾视顶盖收获细胞，例如在第1天和第5天。与第5天收获的细胞(其具有较大比例的分化的神经元)相比，第1天收获的细胞中未分化的NPC所占比例较大。与第5天收获的细胞相比，在第1天收获的细胞中显示出差异表达特别是显著的（例如，P<0.05，0.04，0.03，0.02，0.01或以下，或其中任何其他值）差异表达的基因代表在NPC增殖和分化的调控或调节中的感兴趣的基因。

在另一个实验方案，从动物的脑区收获细胞，所述脑区已收到或没有收到外部刺激输入，所述输入如光，嗅觉线索，或机械感觉刺激。在一个实施方式中，从视顶盖保持在黑暗中的动物和暴露在光线的动物收获细胞。通常情况下，暴露于黑暗和光的动物的细胞在同一时间收获（例如，12小时后，24小时后，48小时后，72小时后等），然后进行所含基因的微阵列分析。如本文所讨论的（见下面的实施例1和2），从维持在黑暗中的动物提取的细胞一般有较高比例的未分化的NPC。在相同时间内暴露在光线的细胞一般具有相对较高的分化的神经元比例。因此，这两个群体的微阵列分析可以揭示，相对于从暴露在光的动物中提取的细胞，在维持在黑暗中的动物的细胞（例如，有更大的NPC的相对比例）中差异表达（P<0.01）的基因，从而确定那些与NPC增殖和分化相关的基因。

例如，此处所述，非洲爪蟾暴露于光已表明可以在视顶盖促进NPC分化成神经元。因此，相对于维持在黑暗中的对照动物，暴露在光下的动物可以显示较高比例的分化的神经元。因此，单独的爪蟾动物可以在黑暗或光照条件下暴露一段时间（如，12小时，24小时，1天，2天，3天，4天，7天，等等。），然后从动物收获例如来自视顶盖的细胞并进行微阵列分析。另外，维持时间较长的动物将具有日益发育的视顶盖。因此，相对于从2天、3天、5天、7天或以上的动物收获的细胞相比，从24小时后的动物收获并通过微阵列分析的细胞可以有更大的NPC比例。在任何情况下（光vs暗或早vs晚），从第一动物群视顶盖收获的细胞群通常有更多的NPC，从第二动物收获的细胞群通常有更多的分化的神经元。因此，比较微阵列分析可以揭示那些优先在NPC中表达的基因。通过这种方法确定的基因包括此处所列的SEQ ID NO.1-651。这些基因可优先在NPC中表达，并且与神经发生相关（例如，NPC增殖，分化和/或生存）。

操纵候选基因在体内的表达

已经建立的当地环境和非细胞自主的因素在调节神经发生中的作用(Peunova et al.,J.Neurosci 2001,21(22):8809-8818;Kreigstein et al,149-84,Cheng et al,Nat Neurosci 2009,12(4):399-408;Javaherian et al,Cereb Cortex2009,19Supp 1:

Suh et al,Ann Rev Cell Dev Biol 2009;25:253-75)突出如爪蟾的实验系统的重要性，其中可以在完整的动物中直接评估增殖活性，以鉴定调节神经发生的内源性细胞和分子机制。

使用药剂在非洲爪蟾的CNS（例如，视顶盖）的NPC中调节基因表达证明感兴趣的基因与NPC增殖相关。例如，可以根据已知的基因序列设计吗啉寡核苷酸，并有效地沉默感兴趣的基因的下游产物（例如，RNA，蛋白质）。因此，鉴别调节NPC增殖的基因提供用于筛选可以调节神经发生和NPC增殖的药剂的靶。

神经发生调节剂的筛选和评价方法

药剂

此处所用的药剂（药物）包括具有药物学活性的化合物，包括无机化合物，离子材料，有机化合物，有机配体，包括辅助因子，糖类，重组合成肽，蛋白质，类肽(peptoids)，核酸序列，包括基因，核酸产物。药剂可以单独筛选。另外，可以同时测试多种药剂调节神经活性或与神经发生有关的基因表达的能力。混合药剂进行测试时，通过上述方法选择的药剂可以通过合适的方法（如色谱法，测序，PCR等）分开（如适用）和鉴定。

可以测试通过组合化学合成或其他方法所产生的药剂（如，有机化合物，重组或合成肽，类肽，核酸）的大型组合文库(see e.g.,Zuckerman,R.N.et al,J.Med.Chem.,37:2678-2685(1994)and references cited therein;seealso,Ohlmeyer,M.H.J.et al,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,90:10922-10926(1993)and DeWitt,S.H.et al,Proc.Natl；Acad.Sci.USA,90:6909-6913(1993),relating to tagged compounds;Rutter,W.J.et al,U.S.Pat.No.5,010,175;Huebner，V.D.et al,U.S.Pat.No.5,182,366;and Geysen,H.M.,U.S.Pat.No.4,833,092)，其中的相关部分通过引用并入本文。从组合文库中选择的药剂具有独特的标签时，可以通过色谱法鉴定单独的药剂。也可以根据在此描述的方法测试（筛选）化学品文库，微生物肉汤和噬菌体展示文库以确定是否存在一或多种调节神经活性或与神经发生有关的基因表达的药剂。

在此公开的方法可以筛选或鉴定展现出选定的属性（例如，调节神经祖细胞的增殖，调节靶基因的表达，等等）的化合物。本文所披露的方法也可用于评估或鉴定神经活性药剂的结构和功能。例如，通过分析或者筛选候选化合物衍生物和比较衍生物对未修饰亲代调节剂的活性，这种方法允许评估活性（如，特异性，疗效等方面）和/或调节活性。例如，本领域技术人员可以理解，化学实体可用其他原子、官能团和/或取代基进行同源性结构修饰，或通过原子或基团取代来进行结构修饰。

因此，本发明提供筛选、鉴定、表征和修饰神经活性化合物的方法和组合物，所述神经活性化合物例如具有神经细胞功能活性或调节神经细胞功能的调节剂或化合物，以鉴定和/或表征和/或改善具有神经元活性或可以调节神经元的化合物。这种调节剂或化合物可以用于治疗可能与神经祖细胞或神经细胞的功能和/或行为（例如，增殖和分化）相关的神经系统疾病。因此，在某些实施方式，本发明的方法可鉴定和/或表征和/或改善能够调节神经祖细胞(NPC)分化成神经元的化合物。

在此所述的神经活性药剂、化合物或调节剂还可以包括能够改变（例如，恢复或纠正）细胞的一个或多个功能（特别是神经元或神经祖细胞）的任何化合物。例如，调节剂的化合物能够改变细胞（神经元）的至少一个代谢途径或生物学或功能特性，并鉴定和/或表征和/或改善对神经元具有活性特别是能够调节神经祖细胞分化成神经元的化合物。作为一个例子，本发明的具有生物学活性的化合物是能够恢复受伤神经元的正常表型的化合物，或至少部分抑制对神经元的伤害的有害影响的化合物。在具体的实施方式，可以选择活性化合物的抑制或激活细胞机制的能力，刺激或抑制代谢途径、恢复生物学特性、防止细胞死亡等的能力。

适于体内分析的药剂可以包括例如用于敲低(knock down)GOI的吗啉寡核苷酸，其使得能够分析该基因在神经发生中的功能。其他药剂可以包括shRNA构建体。与MO相比，shRNA介导的敲低提供独立的敲低方法并且允许细胞特异性地操纵蛋白表达。已经开发出提高shRNA介导的在爪蟾神经元中的敲低的方法，质粒盒可用来简化许多的shRNA构建体的生成。因此，针对GOI的shRNA构建体可以用于测试对GOI表达的特异性敲低(Chen et ah,Front Neurosci 2009,3:63)，并且随后测试对NPC增殖的影响。当然，本文所述的方法或方案可用于筛选（或鉴别、表征或改善）化合物，该化合物对神经发生具有活性，例如细胞存活，NPC分化成神经元或胶质细胞，以及在脑区或神经回路的细胞迁移和组装。

本文所述的方法和方案可以被用于筛选（或识别，表征或改善）化合物，该化合物对神经细胞的存活或发育具有活性，并可以特异性调节NPC分化成神经细胞。

药物组合物

在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包括由本发明的方法鉴定的药剂、调节剂或化合物。这种药物组合物可以包括本文所述的：例如可以调节神经发生或神经元细胞的功能的药剂，调节NPC分化和/或增殖的药剂，或可以是对神经元有活性的或调节神经元的药剂，以及可以有助于治疗与神经祖细胞或神经细胞的功能和/或行为（例如，细胞增殖，分化）有关的神经系统疾病的药剂。

本文所述的药剂可以配制成药物组合物并且以各种适于选定的施用途径（例如口服或注射，静脉注射，肌肉注射，局部或皮下路线）的形式施用于如人类的哺乳动物，并可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

基于细胞的检测

本发明的方法还包括使分离的细胞（如神经祖细胞）或合适的培养细胞系与一种或多种候选化合物或调节剂接触。根据它们的作用、浓度、细胞的群体和/或评估技术，细胞可以接触不同时间。在具体的实施方式中，细胞可以暴露于例如1nM到1mM的候选化合物。应被理解，可以在不脱离本申请的情况下用其它浓度进行测试。此外，每种化合物以不同浓度进行并行测试。此外，如果必要，可以添加帮助化合物渗透到细胞的各种佐剂和/或载体和/或产品，包括脂质体、阳离子脂质体或聚合物、穿透肽(penetratin)、Tat PDT、来自腺病毒或其他病毒的肽（例如，五联体或纤毛(fiber)）。可以在任何适当的支持物或设备中进行接触，如用于活爪蟾蝌蚪的孵育室。

可以根据几种方法确定候选化合物的描述(profile)。特别是，可以测定不同的终点以评估化合物的神经活性，如：细胞数，存活，抗原的表达，特定基因的转录和形态的变化例如大小、轴突生长等。

在一个具体实施方式中，候选化合物的神经活性可以与不存在任何化合物和/或用参考化合物处理的对照组神经元细胞群进行比较而确定。可以通过评估不同的物理度量例如光学特性、在不同波长的荧光来确定神经元的状态。可使用不同的装置，包括装有灯具或激光的自动显微镜等。其他技术包括通过冷冻CCD相机的光检测。所测量的信号可以根据已知的技术处理，例如包括像素直方图，聚类分析和形态分析的软件。

本发明还涉及到使用由本发明的方法鉴定、选择、描述或表征的任何化合物（或其衍生物）作为：例如（i）用于实验研究的靶；和/或（ii）制造作为调节剂和专门用于治疗神经系统疾病的药物组合物。

在一些实施方式中，可通过将细胞与调节剂接触而调节细胞分化模式。在其他实施方式中，可以通过将调节剂引入感兴趣的细胞而调节细胞分化模式，例如，通过电穿孔，或任何其他合适的技术将调节剂引入到细胞中。

在具体的实施方式中，相对于其他分裂方式，所述药剂可以增加在增殖模式中分裂的细胞的数量或比例。在其他实施方式中，所述药剂可以降低在增殖模式分裂的细胞的数量或比例。在其他实施方式中，所述药剂可以增加在混合模式分裂的细胞数量或比例。另外，所述药剂可以降低在混合模式分裂的细胞数量或比例。在额外的实施方式，所述药剂可以增加在分化模式分裂的细胞的数量或比例。另外，所述药剂可以降低在分化模式分裂的细胞的数量或比例。也可以使用药剂的组合来实现对NPC增殖和分化的预期的效果。

可以选择本发明的药剂，使得它调节与NPC增殖和分化的调控有关的已知基因靶。因此，可以构建或选择药剂（例如，吗啉寡核苷酸，siRNA等）以例如抑制或上调已知在NPC增殖和分化中起调节作用的靶基因的翻译。与靶细胞接触或将这样的药剂引入靶细胞可以对NPC行为进行调节。

体内实验

本发明公开的方法，进一步包括使分离的细胞（如神经祖细胞）或合适的培养细胞系与一种或多种候选化合物或调节剂接触。根据它们的作用，浓度、细胞的群体和/或评估技术，细胞可以接触不同时间。在具体的实施方式中，细胞可以暴露于例如1nM到1mM的候选化合物。应被理解，可以在不脱离本申请的情况下用其它浓度进行测试。此外，每种化合物以不同浓度进行并行测试。此外，如果必要，可以添加帮助化合物渗透到细胞的各种佐剂和/或载体和/或产品，包括脂质体，阳离子脂质体或聚合物，穿透肽，Tat PDT，来自腺病毒或其他病毒的肽（例如，五联体或纤毛）。

可以根据几种方法确定候选化合物的描述。特别是，可以测定不同的终点以评估化合物的神经活性，如：细胞数，存活，抗原的表达，特定基因的转录和形态的变化例如大小、轴突生长等。

优选地，候选化合物的神经活性可以与不存在任何化合物和/或用参考化合物处理的对照组神经元细胞群进行比较而确定。可以通过评估不同的物理度量例如光学特性、在不同波长的荧光来确定神经元的状态。可使用不同的装置，包括装有灯具或激光的自动显微镜等。其他技术包括通过冷冻CCD相机的光检测。所测量的信号可以根据已知的技术处理，例如包括像素直方图、聚类分析和形态分析的软件。

本发明还涉及到使用由本发明的方法确定、选择、描述或表征的任何化合物（或其衍生物）作为：例如（i）用于实验研究的靶；和/或（ii）制造用于治疗神经系统疾病的药物组合物。

在一些实施方式中，可通过将细胞与调节剂接触而调节细胞分化模式。在其他实施方式中，可以通过将调节剂导入感兴趣的细胞而调节细胞分化模式，例如，通过电穿孔或任何其他合适的技术将调节剂引入到细胞中。

在具体的实施方式中，相对于其他分裂方式，所述药剂可以增加在增殖模式中分裂的细胞的数量或比例。在其他实施方式中，所述药剂可以降低在增殖模式分裂的细胞的数量或比例。在其他实施方式中，所述药剂可以增加在混合模式分裂的细胞数量或比例。另外，所述药剂可以降低在混合模式分裂的细胞数量或比例。在额外的实施方式，所述药剂可以增加在分化模式分裂的细胞的数量或比例。另外，所述药剂可以降低在分化模式分裂的细胞的数量或比例。也可以使用所述药剂的组合来实现对NPC增殖和分化的预期的效果。

可以选择本发明的药剂，使得它调节与NPC增殖和分化的调控有关的已知靶基因。因此，可以构建或选择药剂（例如，吗啉寡核苷酸，siRNA等）以抑制或上调已知在NPC增殖和分化中起调节作用的靶基因的翻译。与靶细胞接触或将这样的药剂引入靶细胞可以对NPC行为进行调节。

体内实验

微阵列和/或其他基因组分析技术所产生的基因组数据的分析可用于优先化能够调节蝌蚪CNS的NPC增殖和分化的基因。由此可以针对感兴趣的基因（GOI）产生反义吗啉寡核苷酸（MOS）(Eisen et al,Development2008,135(10):1735-43)，每个GOI通过吗啉寡核苷酸介导的敲低细胞增殖效果而筛选，使用成像来评价CNS中的BrdU掺入。对于增加或减少细胞增殖的GOI，可以采用几个体内实验来测试其在控制视顶盖的神经发生中的功能(Nedivi et al,Science 1998,281:1863-1866;Ewald et al,J Neurosci2008,28(4):850-61;Cantallopsei al,Nat.Neurosci.2000,3:498-503;Javaherian et al,Neuron,2009(in press);Van Aelst et al,Curr Opin Neurobiol2004,14(3):297-304;Van Keuren-Jensen et al.,Dev Neurobiol 2008,68(11):1315-24;Wu et al.,Science 1998,279:222-226;Cline et al,J Physiol 2008,586(6):1509-17)。

第一示范性的实验结合BrdU掺入和免疫标记作为神经元的标记物。BrdU标记的优点是非侵入性并且可以作为对GOI敲低或过表达对细胞增殖的效果的相对高通量筛选。BrdU和神经元标记相结合，使得可以对神经发生的GOI进行定量评价。蝌蚪可以暴露于包含BrdU的饲养溶液。这种方法有效地标记增殖细胞，并允许更大的控制BrdU暴露时间。已证明，BrdU的进入在整个研究的发育时期不会发生变化，不会响应于DNA损伤而发生BrdU掺入。通常所有动物在一天的同一时间进行BrdU暴露，以控制昼夜节律对增殖潜在的影响。暴露于BrdU后，立即将动物固定，或在固定和进行BrdU免疫标记之前将动物饲养2-3天。

然后将动物麻醉、微波固定(Paupard et al.,J.Histochem.Cytochem.2001,49(8):949-956)，用一抗对脑进行处理，以在整体(whole mount)或振动切片部分标记抗体(mouse anti-BrdU,BD Bioscience;rabbit anti NeuroD;Abeamand Alexafluor secondary antibodies(Molecular Probes))。

第二实例实验使用由合适的报告子或标记物标记的细胞(如Sox2.mFGF4标记的NPC)在体内的时间推移成像。时间推移体内成像实验的优点是纵向研究允许直接观察细胞增殖、细胞的命运、这些基本事件下的结构动力学。对GOI过表达/敲低如何改变体内神经发生进行定量，可以确定细胞分裂率和后代的命运。

室部分、整体固定脑制备物和体内FP-标记的样品的增殖细胞可以使用安装在配备有激光线和分色镜以及用于将紫外解析为远红荧光的过滤器的显微镜上的旋转盘共聚焦附件进行成像。信号被捕获在敏感的、高信噪比EMCCD相机上。使用适当的图像采集软件采集图像。在双标记实验中，依次采集图像以消除渗滤(bleed-through)。进行具有单荧光标记的对照以确保没有渗滤。

在体内图像时间推移成像中，麻醉的蝌蚪被放置在一个自定义的成像室。使用用于荧光的适当激光/过滤器设置来获取完整的聚焦栈1μm Z步骤。对于整体固定的组织和部分，获取完整的Z-栈（0.5μmZ-间隔）的视顶盖叶。

为了分析时间推移数据，根据基于细胞的三维结构的形态标准来区分放射状胶质细胞和神经元。确定对称分裂增殖、不对称神经发生分裂、终端对称神经发生分裂的数量和顺序，以及沿着时间进程的谱系中每个细胞的分化状态。单独的NPC的时间推移成像可在成像实验过程中鉴定细胞的命运，包括分裂和分化细胞的形态学变化的评估。

因此，在某些实施方式，本发明的方法可用于筛选（或鉴定，表征或改善）药剂，该药剂在体内尤其是完整的大脑中改变祖细胞分化成神经细胞。本方法的优点是，可以采用体内神经细胞群，如爪蟾蝌蚪的完整的视觉系统。因此，使用体内的神经细胞群允许对化合物或调节剂的生物活性进行预测和可靠的评估。使用的NPC和神经元可以是各种来源，包括哺乳动物的起源（例如，啮齿动物，人类，灵长类动物，等），以及如非洲爪蟾的两栖动物。

可确定药剂的体内活性，例如，此处涉及筛选神经发生相关基因。例如，由于爪蟾蝌蚪适于体内时间推移成像，神经祖细胞和它们的后代可以在完整的动物成像。因此，使体内NPC细胞与候选药剂接触后，可测量（例如，可视化）试验动物群相对对照动物群的NPC的体内增殖率。因此，将改变NPC增殖率（例如，提高或降低）的药剂鉴定为神经发生和神经细胞增殖的调节剂。

此处就体内筛选作为神经发生调节剂的药剂的方法和体内基因筛选方法而描述的条件（例如，药剂的浓度，读数等）也可用在体外培养的方法。例如，可转染（例如，通过电穿孔）完整的动物CNS区域（例如，视顶盖）的NPC群，由此其表达荧光蛋白（FP）。完整的动物表达FP的细胞可在时间t=0成像，然后在预定的时间段后（例如，24小时，48小时，96小时，等）再次成像，可在预定的时间段内的间隔成像（例如，在12小时，24小时，36小时，等）。可通过根据它们的形态确定细胞分类而在每24小时间隔的预定时间内确定细胞的相对类型和数量（例如，NPC和分化的神经元）的变化。在形态上的变化可以被表征为相对于对照群，NPC和神经胶质细胞在测试群中的相对比例。在试验动物群和对照动物群的细胞之间的差异可以表明所述候选药剂是NPC增殖的调节剂。

在一个具体实施方式，可以使用用于评估在非洲爪蟾蝌蚪（其大脑用针对GOI的吗啉寡核苷酸电穿孔）中的BrdU掺入的成像检测筛选GOI对CNS细胞增殖的影响。一到两天后，增殖细胞在处死前可以暴露于BrdU2小时而标记。然后可以处理大脑以检测整体的BrdU，通过收集贯穿大脑的完整的z系列共聚焦图像而成像。这种整体大脑成像提供了一个极好的方法来定量细胞增殖水平。

实施例

将利用以下非限制的实施例进一步说明本发明。下面的例子只被理解为范例，不应该被解释为对权利要求限定的发明范围的限制。

1、视觉刺激和NPC增殖

综述

在完整的爪蟾蝌蚪的中枢神经系统中测定视觉系统的神经祖细胞（NPC）的增殖和分化。这个实验系统允许将动物暴露于视觉系统的刺激或剥夺动物的视觉系统刺激来操纵神经活动。结果表明，与在12H光/12小时黑暗条件下饲养的动物相比，被剥夺视觉刺激的动物的NPC增殖率增加。动物被剥夺视觉刺激24小时后进行24小时视觉刺激，在没有视觉感受的第一个24小时增殖率增加，随后是大部分新产生的细胞分化（图6）。这些数据表明，操纵神经活动控制增殖率和分化：减少神经活动增加增殖，而增加神经活动触发祖细胞分化成神经元。

方法

在完整的爪蟾蝌蚪中转染NPC，使得其表达荧光蛋白（FP）。利用共聚焦显微镜成像在完整的动物中表达FP的细胞。成像后，将动物放置在避光室，从而它们在未来24小时没有收到任何的视觉刺激。表达FP的细胞再次成像，将动物放置在室中使其收到24小时视觉刺激。对动物进行第三次成像。根据其的形态测定每24小时间隔细胞数量的变化并确定所述细胞的身份为放射状胶质细胞（NPC）或神经元细胞。数据被表示为在每24小时的细胞数量的变化，以及具有NPC或神经元形态的细胞的比例。

结果

在不存在视觉经验的情况下，细胞数24小时内增加19.9+5.8％（N=12分析的顶盖）。动物暴露于视觉刺激24小时后，我们发现细胞数显著下降6.3+5.4％（Wilcoxon signed rank test p=0.01）。这种负增殖率表明，细胞已经离开了增殖周期，因为用于检测细胞的荧光标记由仅在增殖过程中表达的启动子驱动。没有暴露于视觉经验的独立组动物显示，在两个24小时之间的增殖率无显著性差异(N=7分析的顶盖,p=0.4)。

在没有暴露于视觉刺激的动物大脑中，神经发生有一个稳定的速率。在没有视觉刺激的情况下，在第一个24小时间隔内，新神经元的比率增长32.9+11.3％，与第二个24小时间隔的30.1+9.4%相比没有显著性差异(N=7顶盖,威氏符号等级检验p=.73)。相比之下，在过去的24小时间隔被暴露于视觉刺激的动物的神经元发生率显著下降，从第一个24小时间隔的79.4+22.9％下降到第二个24小时间隔的18.0+9.4％(N=12顶盖,p=.05)。

在不存在24小时视觉经验的情况下，细胞失去胶质外观率在第一个24小时内下跌17.1+9.7%，在最后一个24小时内降低44.9+10.6%(N=7顶盖,p=0.18)。从剥夺视觉24小时和随后24小时暴露于视觉刺激的动物得到的细胞失去其胶质外观的比例在暴露于视觉刺激后显著提高(之前17.1+9.7%失去，和之后56.0+10.0%失去,p=.04).。

这些结果与视觉经验中断细胞增殖和增加神经胶质前体分化成神经元的速率是一致的。

2、有和没有视觉经验的调节剂和NPC增殖

背景和方法

NPC检测

这些实验中利用了细胞类型特异性的驱动蛋白表达在分裂中的细胞表达的荧光报告系统（见图3）。报告子由成纤维细胞生长因子4（FGF4）的上游调控元件的6个重复组成。内源性sox2/oct3转录因子结合FGF4调控元件，驱动Gal4的表达，这反过来又驱动UAS-荧光蛋白。FGF4，sox2和oct3各自在增殖中的细胞表达，并依靠内源性sox2/oct3转录因子，驱动Gal4所促进的报告子在增殖中的细胞内的表达特异性。UAS-荧光蛋白表达为单独的构建体；报告子给改报告子系统增加了模块化和特异性。

表达上述荧光报告子的视顶盖细胞从具有不同的视觉经验及从已表达所述构建体不同时间的蝌蚪收获。然后将从这些细胞获得的RNA进行处理和微阵列比较。选择来作进一步的分析的鉴定的感兴趣的基因在下面的表1总结：

表1-通过微阵列鉴定的感兴趣的基因

对不同年龄的蝌蚪（更大的增殖细胞群体对更大的终末分化细胞群体）与具有不同视觉经验的蝌蚪之间进行了比较，这也可以偏向于对于终末分化的增殖的相对水平。在多个微阵列比较中表现出表达显著变化的基因被优先考虑。

上述报告子用于驱动蝌蚪视顶盖的增殖中的细胞内的荧光蛋白Kaede。Kaede的荧光发射光谱可以在暴露于紫外线或405纳米的激光源后从绿色光转化到红色，增加了对实验的时间控制。蝌蚪转染报告子24-36小时后，所有表达Kaede的细胞被光转化为蛋白的红色形式。根据用类似的方法公布的数据(Caron et al.,Development 2008,135:3259-3269)，新产生的后代在胞质分裂过程中继承红色Kaede，但继续合成新的绿Kaede蛋白。例如，Caron et al.（同上）通过绿色到红色的相对水平而鉴定新生成的细胞。

视顶盖细胞通过电穿孔用增殖报告子转染，这是一种有效的方法，能可靠地获得在组织中的多个标记的细胞(Haas et al.,Differentiation 2002,70:148-154。GAL4驱动子和UAS-Kaede质粒（0.5微克/微升）注入视顶盖室，然后跨越组织施用电压脉冲来推动质粒进入顶盖细胞。这些质粒的构建体与吗啉反义寡核苷酸一起电穿孔，所述吗啉反义寡核苷酸设计用于抑制候选基因的翻译(Eisen et al.,Development 2008,135:1735-1743)。吗啉寡核苷酸以0.lmM被电穿孔并用丽丝胺荧光标签观察。为了防止Kaede被来自环境光的紫外线波长的转化，动物被保持在黑暗处。24-36小时后，使蝌蚪麻醉，连续3天每天贯穿每个动物的视顶盖收集一个完整的Z-栈。第一次成像顶盖后，所有的动物都返回到黑暗处24小时，直到第二次成像。这时，一些动物被暴露于增强的视觉环境，其由包括一组阵列LED灯（发光在567纳米，超越转换Kaede蛋白的波长）的室组成，所述LED灯以0.2赫兹闪1秒。这种视觉刺激已被证明增强顶盖神经元的突触驱动，并且导致突触可塑性的显著变化(Sin et al,Nature 2002,419:475-480)。

数据采集和分析

选择第一天所用的采集设置，以防止第三天像素值达到饱和。整个实验过程中使用选定的设置。利用使用来自采集的Z-栈的三维信息的Volocity软件（Improvision，Perkin Elmer公司）来基于目标的密度和大小的标准偏差而鉴别和选择标记的细胞的细胞体。然后对所确定的目标进行人工验证并且基于细胞形态分配细胞类型（神经胶质细胞，神经元，或未确定）。每个顶盖叶通常15至45个细胞被转染。计算增殖百分比作为每24小时细胞数量的变化。这些测量报告为平均值+标准偏差。

报告了对照动物、与细胞增殖阻断剂接触的动物以及接受了24小时的增强视觉刺激的动物的增殖分析。还报告了由微阵列（DIO3和GST Pi）确定的2种候选物被反义吗啉寡核苷酸敲低的实验结果。此外，报告了确定视觉经验影响存在DIO3吗啉寡核苷酸敲低下的增殖的实验结果。所采用的实验条件总结在下表2中：

表2-吗啉寡核苷酸敲低实验条件

结果与讨论

Sox2报告子构建体的表达表明，放射状胶质细胞是爪蟾视顶盖中的主要的神经祖细胞（图4）。神经元分化后没有继续表达绿色Kaede，因为分化的细胞不再产生驱动GAL4-UAS-Kaede构建体的sox2/oct3。大多数的NPC被发现是终末分裂。

细胞分裂阻断剂

阿非科林（150uM）和羟基脲（2％二甲基亚砜20mM）施用于细胞以阻止细胞分裂，将这些细胞的增殖率与只接收二甲基亚砜的动物进行比较。这种处理破坏非洲爪蟾的增殖(Harris et al.,Neuron 1991,6:499-515)。在仅暴露于二甲基亚砜的对照动物中，观察到24小时的细胞数平均增幅为16.4+4.2％(N=8顶盖叶)。阿非科林和羟基脲阻断细胞增殖（细胞数量的增加：0.41±6.28％（N=10，P=0.1，采用Mann-Whitney，见图5）。

NPC命运的视觉经验依赖控制

在缺少视觉经验的情况下，24小时之内细胞数量增加了19.9±5.8％(N=12顶盖叶)。动物暴露于视觉刺激24小时后，发现显著的细胞数减少6.3±5.4％（P=0.01）。这下降率显示，这些细胞可能已经离开增殖周期，由于红色Kaede报告子在不断增长的树突丛中稀释而不再能够检测。Kaede报告子仅在增殖过程中表达，因此，终末分化的细胞将只展示出增殖模式中所产生的报告子。没有收到24小时视觉刺激的对照动物在2个24小时期间没有表明出增殖率的显著性差异(10.3+7.2%and-0.6+3.5%;N=12分析的顶盖叶,p=0.23;图6A).。

为了测试是否暴露于视觉经验影响顶盖细胞的命运，对接受24小时视觉刺激和没有视觉刺激的标记群体的神经元比例进行了比较。与对照动物相比，暴露于视觉刺激的动物的具有神经元形态的细胞比例更大(75.7+4.1%对60.1+4.8%,p=0.02,Mann-Whitney；图6B),，表明视觉经验促进NPC后代分化。

DIO3吗啉寡核苷酸表达和神经发生

脱碘酶碘化甲腺氨酸III型是消除碘甲状腺激素的活性形式（T3）中的碘的甲状腺激素途径中的酶。微阵列分析表明，DIO3表达在活性祖细胞中增强。变态阶段之前，T3水平在非洲爪蟾较低，但在NPC中已检测到T3受体的存在，表明T3水平的相对变化可以会影响增殖。在非洲爪蟾蝌蚪的变态阶段，增加增殖与增加甲状腺激素受体激活相关(Denver et ah,Dev Biol2009,326:155-168)。因此，吗啉寡核苷酸表达敲低DIO3应该增加T3水平，并相应增加增殖。

转染抗DIO3（DIO3-MO）的吗啉寡核苷酸的动物表现出细胞数量增加：第一个24小时11.4+17.3％，第二个24小时33.9+22.2％（N=4，图7）。相比之下，对照动物在第一个24小时表现最大的增殖增幅，然后在随后的24小时内没有增殖。在转染DIO3-MO的动物的顶盖内发现似乎是克隆的异常细胞簇，这与没有正常时间的迁移的不寻常增殖模式一致。

表达DIO3-MO的一些动物在第二个24小时也被暴露于视觉刺激（图7）。发现视觉经验降低用DIO3-MO（n=5）转染的动物的增殖率，但这种差异不被视为显著，由于增殖率的大变化。

敲低GSTpi促进神经元分化

谷胱甘肽-S-转移酶Pi 1（GSTPI）是蛋白质谷胱甘肽-S-转移家庭的成员，它起着通过催化许多疏水性和亲电化合物与还原的谷胱甘肽缀合而解毒的重要作用。GST-Pi 1被认为在癌症易感性发挥作用。观察到GST-Pi 1在神经前体细胞上调，因此预测敲低GST-Pi 1将降低增殖率。

在表达针对GSTpi的吗啉寡核苷酸的蝌蚪顶盖中发现一个出乎意料的结果。甚至第一天的神经元数量显著高于对照动物中观察到的（图8）。与对照动物相比（42.0+4.7％），在试验动物中，表达GSTpi-MO的顶盖细胞的明显更大的群体（72.7+4.7％，n=7顶盖叶）在第1天分化成神经元（P=0.002，Mann-Whitney）。第2天，在试验动物中，86.4+3.7％的细胞分化成神经元，对照群体为49.2+5.7％（P=0.001）。该神经元的比例可以代表最大值，这是由于在第三个时期在实验动物中没有观察到神经元数量增加（86.8+1.0％），并且显著高于对照动物的神经元的比例（60.1+16.6％，P=0.004）。

神经元总比例的增加显示神经前体群体随GSTpi-MO表达而降低。在表达GSTpi-MO的动物和对照动物中，放射状胶质细胞的比例在3天期间减少（图8）。来自表达GSTpi-MO的大脑细胞与对照动物的比例比较表明，第1天神经胶质细胞显著减少（13.3±4.6％和41.5+4.8％;P=0.005），而这些差异在未来两天继续（8.4+2.0％和17.4±3.5％，P=0.02;4.8±1.6％和13.3±4.6％，P=0.02）。一小部分细胞不能分为放射状胶质细胞或神经元细胞。

脆性X相关基因

FmrlA，脆性X智力低下蛋白是mRNA结合蛋白，被认为调节从细胞核向细胞质转运mRNA并调节神经元内的局部蛋白翻译。微阵列的数据表明，FMRl和一个82kD的FMRP的相互作用蛋白类似的蛋白质即增殖诱导基因1（又名核脆性X智力低下蛋白相互作用蛋白）在NPC中的表达低于分化的神经元。FMRP和相关蛋白在神经元增殖的潜在作用尚不完全清楚。一项研究表明，FMRl增加NPC增殖和改变分化(Castren et al,Proc NatlAcad Sci USA 2005,102:17834-17839)，而另一个显示，FMRl只改变NPC分化(Bhattacharyya et ah,Stem Cells Dev 200817:107-117)。这些研究之间出现的偏差可以是由于一个事实，即每项研究使用不同来源的体外细胞。体内实验可以澄清FMRl和相关基因在NPCs的增殖中的作用。

FXRl，脆性X智力低下常染色体同源基因与功能相似的蛋白质FMRl和FXR2相互作用。基于微阵列数据，敲低FXRl可以通过抑制分化而增加增殖。

针对FMRIA和FXRl的吗啉寡核苷酸似乎减少顶盖中的NPC增殖。这些都是定性的观察。

Claims (52)

1.一种方法，包括：

a）使第一动物的完整的脑区内的神经祖细胞与药剂接触；

b）使所述第一动物和第二对照动物暴露于视觉刺激；和

c）测定所述第一动物的神经祖细胞的增殖率和所述第二动物的神经祖细胞的增殖率；

其中所述对象神经祖细胞和所述对照神经祖细胞之间的增殖率差异表示所述药剂是能够调节神经增殖的药剂。

2.权利要求1的方法，其中所述完整的脑区包括视顶盖。

3.权利要求1的方法，其中所述完整的脑区参与处理选自嗅觉输入、视觉输入和机械感觉输入的一种或多种，或者参与介导行为输出。

4.权利要求1的方法，其中所述完整的脑区包括端脑、中脑、后脑/脊髓、视网膜或嗅窝的回路。

5.权利要求1的方法，其中所述第一动物和所述第二动物是非洲爪蟾(Xenopus laevis)。

6.权利要求1的方法，其中，所述测定包括对所述第一动物和所述第二动物的视顶盖内的细胞的数量和类型进行计数。

7.权利要求1的方法，其中使神经祖细胞与药剂接触包括通过电穿孔使所述药剂进入所述神经祖细胞。

8.一种方法，包括：

a）使对象神经祖细胞与药剂接触，所述药剂的量能够有效地调节所述对象神经祖细胞中的一个或多个基因的表达；

b）测定所述对象神经祖细胞的增殖率和未与所述药剂接触的对照神经祖细胞的增殖率；和

c）比较所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞的增殖率；

其中所述对象神经祖细胞和所述对照神经祖细胞之间的增殖率差异表示所述一个或多个基因是神经细胞增殖的调节剂。

9.权利要求8的方法，其中所述对象神经祖细胞在第一动物中，所述对照神经祖细胞在第二动物中。

10.权利要求9的方法，其中，所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞分别在所述第一动物和第二动物的完整的脑区中。

11.权利要求10的方法，其中，所述完整的脑区参与处理选自嗅觉输入、视觉输入和机械感觉输入的一种或多种，或者参与介导行为输出。

12.权利要求10的方法，其中，所述完整的脑区包括端脑、中脑、后脑/脊髓、视网膜或嗅窝的回路。

13.权利要求10的方法，其中，所述第一动物和所述第二动物是非洲爪蟾。

14.权利要求8的方法，还包括在所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞中引入报告子构建体。

15.权利要求14的方法，其中所述报告子构建体包括编码荧光蛋白的基因。

16.权利要求15的方法，其中所述荧光蛋白在神经祖细胞中特异性表达。

17.权利要求14的方法，其中所述引入包括用编码所述报告子构建体的质粒进行转染。

18.权利要求8的方法，其中，所述测定包括对至少一个预定的时间段之前和之后的细胞的数量和类型进行计数。

19.权利要求8的方法，其中使对象神经祖细胞与药剂接触包括通过电穿孔使所述药剂进入所述对象神经祖细胞。

20.权利要求9的方法，还包括使第一和第二动物暴露于视觉刺激。

21.权利要求8的方法，其中所述药剂包含化合物或反义寡核苷酸。

22.权利要求21的方法，其中所述反义寡核苷酸包括siRNA和shRNA和/或吗啉寡核苷酸。

23.权利要求8的方法，其中所述一个或多个基因选自SEQ ID NO.1-651，或者它们的功能性截短物、修饰物和/或替代物。

24.一种方法，包括：

a）使对象神经祖细胞与药剂接触；

b）测定所述对象神经祖细胞的增殖率和未与所述药剂接触的对照神经祖细胞的增殖率；和

c）比较所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞的增殖率；

其中所述对象神经祖细胞和所述对照神经祖细胞之间的增殖率差异表示所述药剂是能够调节增殖的药剂。

25.权利要求24的方法，其中所述对象神经祖细胞在第一动物中，所述对照神经祖细胞在第二动物中。

26.权利要求25的方法，其中，所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞分别在所述第一动物和第二动物的完整的脑区中。

27.权利要求26的方法，其中，所述完整的脑区参与处理选自嗅觉输入、视觉输入和机械感觉输入的一种或多种，或者参与介导行为输出。

28.权利要求26的方法，其中，所述完整的脑区包括端脑、中脑、后脑/脊髓、视网膜或嗅窝的回路。

29.权利要求25的方法，其中所述第一动物和所述第二动物是非洲爪蟾。

30.权利要求24的方法，还包括在所述对象神经祖细胞和对照神经祖细胞中引入报告子构建体。

31.权利要求30的方法，其中所述报告子构建体包括编码荧光蛋白的基因。

32.权利要求31的方法，其中所述荧光蛋白在神经祖细胞中特异性表达。

33.权利要求30的方法，其中所述引入包括用编码所述报告子构建体的质粒进行转染。

34.权利要求24的方法，其中所述测定包括对至少一个预定的时间段之前和之后的细胞的数量和类型进行计数。

35.权利要求24的方法，其中使对象神经祖细胞与药剂接触包括通过电穿孔使所述药剂进入所述对象神经祖细胞。

36.权利要求24的方法，还包括使第一和第二动物暴露于视觉刺激。

37.一种方法，包括：

a）将药剂施用于表达靶基因的对象细胞，所述靶基因选自SEQ ID NO.1-651或者它们的功能性截短物、修饰物和/或替代物；

b）对施用了所述药剂的对象细胞中的靶基因的表达和未与所述药剂接触的对象细胞中的靶基因的表达进行比较；

其中施用了所述药剂的对象细胞中的目标基因的表达和未施用所述药剂的对象细胞相比的差异表明所述药剂是神经增殖或分化的候选调节剂。

38.权利要求37的方法，其中所述对象细胞和对照细胞是神经祖细胞。

39.权利要求37的方法，还包括评价完整的脑区中神经发生的所述候选调节剂。

40.权利要求39的方法，其中所述完整的脑区是非洲爪蟾的视顶盖。

41.通过权利要求1的方法鉴定的药剂。

42.通过权利要求8的方法鉴定的药剂。

43.通过权利要求24的方法鉴定的药剂。

44.通过权利要求37的方法鉴定的药剂。

45.一种方法，包括给患者施用权利要求38的药剂。

46.一种方法，包括给患者施用权利要求39的药剂。

47.一种方法，包括给患者施用权利要求40的药剂。

48.一种方法，包括给患者施用权利要求41的药剂。

49.一种药物组合物，其包含权利要求38的药剂。

50.一种药物组合物，其包含权利要求39的药剂。

51.一种药物组合物，其包含权利要求40的药剂。

52.一种药物组合物，其包含权利要求41的药剂。

Images