KR20050083636A - 세포성 응답의 실시간 측정 - Google Patents

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KR20050083636A
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Abstract

살아있는 세포를 세포질과 핵으로부터 서로 다른 색을 방출하도록 안정적으로 변형시킴으로써, 육안으로 또는 기구를 사용한 관찰에 의해 상기 세포의 상태와 상기 세포에 대한 약제의 효과를 분석하는 것이 가능하다. 또한, 단일 형광 단백질을 발현하도록 변형된 세포를 사용하여 시간의 함수로서 형광 강도를 관찰함으로써, 증식속도와 약물 민감성을 실시간으로 측정할 수 있다.

Description

세포성 응답의 실시간 측정{REAL TIME MEASUREMENT OF CELLULAR RESPONSES}
관련 출원 참조란
본 출원은 2002년 11월 18일자 미국특허출원 60/427,604호 및 2002년 8월 16일자 미국특허출원 60/404,005호의 35 U.S.C.119(e)에 따른 우선권 주장 출원으로서, 상기 두 출원의 내용은 모두 본 발명에 통합되어 있다.
기술 분야
본 발명은 세포 증식, 약물 감작성, 세포 주기 위치, 및 기타 세포성 응답의 생체외 실시간 관찰에 관한 것이다. 본 발명은 마커로서 형광 단백질을 사용하여 세포, 특히 살아있는 세포를 직접 관찰하는 것에 관한 것이다. 어떤 세포 주기 중의 세포 상태를 핵과 세포질을 개별적으로 표지시킴으로써 모니터할 수 있다.
1962년에 에쿠로레아 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 녹색 형광 단백질 (GFP)이 발견되었다. GFP의 구조, 메카니즘 및 응용에 관한 지식은 1992년 GFP 유전자가 클로닝된 이래 비약적으로 축적되었다. 다른 생명체에서 GFP 유전자의 이종 발현이 입증된 후, GFP는 가장 널리 사용되는 리포터 유전자 중 하나가 되었다. 1999년, 디스코소마 레드 (DsRed)를 비롯하여, 또 다른 부류의 형광 단백질이 산호로부터 클로닝되었고, 그 후 2000년엔 아네모니아 레드 (AsRed)가, 2001년엔 HcRed가 클로닝되었다. 이들 단백질의 생물학적 역할은 GFP에서와 같은 순수한 시그널 기능부터 산호로부터 분리된 신규 단백질에 의한 광합성 공생체의 광보호에 이르기까지 다양하다. 이들 착색된 수용성 단백질 중 두가지인, 분자량 25-27 kD의 GFP 및 DsRed의 경우, X-선 구조 분석 결과 동종 β-배럴 구조라는 것이 입증되었다. 이들 단백질의 일차 구조의 고통적 특징은 GFP의 위치 66 및 67을 점유하는, 아미노산인 티로신과 글라이신이 보존되어, 후번역 자기촉매적 변형시 발색단을 형성하는데 참여한다는 것이다.
이 단백질들 (야생형 및 돌연변이체)은 다색 리포터로서 이용될 수 있다. 이들의 형광 스펙트럼 대역은 460nm의 "청색" 피크로부터 640nm의 적색 대역까지 거의 180nm에 달한다. GFP는 세포 생물학(Gerdes, H. -H., 및 Kaether, C., FEBS Letters (1996)389:44-47), 면역학(Kawakami, N., 외, Immunology Lett (1999) 70: 165-171), 및 감염성 질환, 예컨대 동물 모델에 있어서 숙주-병원체 상호작용(Zhao, M., 외, Proc. Natl. Acad. Sci. (2001)98:9814-9818)의 분야에서 가장 널리 사용되는 유전자 마커이다. GFP는 종양 성장, 전이 및 혈관신생 (Yang, M., 외, Proc. Natl. Acad. Sci. (2002) 99: 3824-3829 ; Yang, M., 외, Proc. Natl. Acad. Sci.(2000) 97: 1206-1211; 및 Yang, M, 외, Proc. Natl. Acad. Sci.(2001) 98: 2616-2621), 유전자 발현(Yang, M., 외, Proc. Natl. Acad. Sci.(2000) 97: 12278-12282), 및 세균 감염(Zhao, M., 외, 상기문헌)의 전신 조영에 사용되어 왔다.
이들 모든 응용예에서, 적색 방출은 배경 방출의 최소화와 생체내 산란의 최소화 및 FRET (형광 공명 에너지 전이) 분석과 관련하여 특히 중요하다. 형광 단백질의 높은 흡광계수, 양자 수율 및 모노머 상태는 생체내 응용을 비롯하여 이들의 리포터로서의 용도에 매우 중요한 변수들이다. 다이머화하는 경향이 적은 GFP와 대조적으로, 관련 단백질들은 올리고머를 형성하는 경향이 큰데, 예컨대 DsRed의 경우 테트라머, 심지어 더 큰 응집체가 관찰되어다. 흡광계수와 양자 수율은 적색 단백질과 새로 개발된 모노머 DsRed의 경우 비교적 낮다.
인간의 히스톤 H2B 유전자를 에쿠오레아 빅토리아의 GFP를 코딩하는 유전자와 융합시켜 인간 세포내로 트랜스펙션시킴으로써 H2B-GFP를 기본구성적으로 발현하는 안정한 세포주를 얻었다. H2B-GFP 융합 단백질은 세포 주기 진전에 영향을 미침이 없이 뉴클레오좀 내로 통합시켰다. H2B-GFP는 유사분열 단백질과 간기 염색질을 모두 포함하는 핵의 고해상 조영을 가능케 하였으며, 여기서 후자는 생세포 중 여러가지 다양한 염색질 농축 상태를 나타내었다 (Kanda, T. 외, Curr. Biol. (1998)8:377-385).
인용 문헌의 개시내용은 본 발명에 모두 참고 통합된다.
이들 다양한 단백질들은 종양 전이를 모니터링하는데, 그리고 발현을 코니터링하기 위한 리포터 유전자로서 사용되어 왔다. 예컨대, Kanda, T., 외, Curr. Biol. (1998)8:377-385; Yang, M, 외, Clin. Exp. Metastasis (1999) 17: 417-422; Yang, M, 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:2616-2621; 및 Yang, M, 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3824-3829. 그러나, 본 출원인들이 아는 한, 세포 증식, 세포 주기 상태 또는 세포의 약물 감작성을 생체외에서 모니터링하는데 이들 단백질이 사용된 적은 없으며, 이중 표지된 (dual labeled) 세포들이 생체외에서나 생체내에서 이용된 예도 없었다.
세포 증식을 모니터링하는 대부분의 생체외 기술은 세포를 죽이는 결과를 초래한느 관찰 기술을 포함한다. 예컨대, 플라스틱 표면에 부착되어 증식하는 세포들을 트립신과 같은 효소에 의해 플라스틱으로부터 떼어낸 다음 입자계수기를 이용하여 계수한다. 테트라졸륨 염료와 같은 염색약도 널리 사용되는데, 이것은 미토콘드리아 효소 활성으로부터 유래된 전자에 의해 환원되어 세포의 생존능력에 부정적인 영향을 미친다. 또한, LacZ 유전자를 세포내로 도입하여 마커로서 사용할 수 있으나, 활성을 관찰하기 위해서는 세포를 염색하여야만 한다.
따라서, 증식의 전통적인 모니터링법은 정상적인 세포 대사를 파괴하거나 심지어는 세포를 죽음에 이르게 할 수도 있다.
본 발명은 세포의 증식과 기타 세포 활성을 생체외 또는 생체내에서 실시간으로 관찰하는 기회를 제공한다. 이러한 관찰은 다양한 단계에서 핵/세포질 비율의 변화에 따라 유리하게 세포 주기를 관찰하는 것으로까지 확장될 수도 있다.
본 출원인들이 아는 한, GFP에 융합된 H2B 유전자가 핵을 표지하는데 사용된 적은 있지만, 살아있는 세포의 핵과 세포질을 서로 다른 두가지 색상의 단백질로 각각 표지시키는 것에 관한 제안은 없었다. 본 발명은 이러한 생세포를 관찰하는 능력을 제공해준다.
도 1은 안정한 높은 GFP 및 RFP를 발현하는 인간 섬유육종 세포 (HT-1080-듀얼-1)를 생체외 도시한 것이다. 인간의 섬유육종 세포(HT-1080)를 레트로바이러스 벡터 중 네오마이신 내성 유전자, 히스톤 H2B-GFP 및 하이그로마이신 내성 유전자와 RFP를 이용하여 트랜스덕션시켰다. G418과 하이그로마이신에 대해 두배의 형질전환체를 선별하고 안정한 클론들을 수립하였다. 막대 길이 50㎛.
도 2는 친(parental) 및 형광 단백질 발현 클론의 세포 증식 속도를 비교한 도면이다. 각 시점마다 각각의 클론 (친HT-1080, HT-1080-RFP, HT-1080-듀얼-1 및 HT-1080-듀얼-6)에 대해 세개의 디쉬를 사용하여 1주일간 세포수를 계수하였다. 세포들을 트립신화시키고, 트리판 블루로 염색한 다음 혈구계로 계수하였다. 색칠된 써클은 각 그룹에 있어서의 평균적인 세포수를 가리킨다.
도 3A-3B는 형광 표지된 세포를 이용하여 생체외에서의 세포 증식 과정을 경시적으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. HT-1080-듀얼-1 세포를 10% FBS가 보강된 RPMI 1640에서 배양하고 경시적 이미지를 여러 시점에서 형광 현미경 하에서 동일한 생세포로부터 포착하였다. 도 3A는 5분 간격으로 찍은 사진이다. a:0분, b: 5분, c:10분, d:15분, e:20분, f:25분, g:30분. 막대 길이; 20㎛. 도 3B는 30분 간격으로 찍은 사진이다. a:0분, b:30분, c:60분, d:90분, e:120분. 막대 길이: 75 ㎛. 녹색 및 백색 써클은 증식중인 세포들이 관찰된 대표적인 위치를 가리킨다. 유사분열 세포들이 그들의 상대적인 위치를 바꾼다 해도, 이들은 쉽게 볼 수 있었다.
도 4A-4B는 스타우로스포린에 의해 유발된 HT-1080-듀얼-6-세포자멸사(apoptosis)의 이미지를 도시한 것이다. 세포자멸사 유발을 위해, HT-1080-듀얼-6 세포들을 2㎛ 스타우로스포린과 함께 인큐베이션시켰다. 세포들을 청색광 하에서 가시화시켜 CCD 카메라와 형광 현미경을 이용하여 이미지를 포착하였다. 도 4A는 2 ㎛ 스타우로스포린으로 처리한지 12시간 후의 이미지를 도시한 것이다. 세포자멸사가 HT-1080-듀얼 세포에 고속으로 잘 유도되었다. 막대 길이, 50 ㎛. 도 4B는 다음과 같이 2 ㎛ 스타우로스포린에 의해 유발된 HT-1080-듀얼-6-세포의 세포자멸사 과정의 실시간 고배율 이미지를 도시한 것이다: a: 무처리. b: 스타우로스포린 처리 2시간 후. c: 4시간: d: 6시간. e: 8시간. f: 10시간. g: 12시간. 세포질과 핵의 농축 및 핵 단편화가 잘 가시화되었다. 막대 길이, 10 ㎛.
도 5A-5B는 총경동맥 내로 HT-1080-듀얼-1 세포를 주사한 직후의 뇌의 실험적 전이를 도시한 것이다. 세동맥 중의 2색 세포의 색전이 피부판 윈도우로 두개골을 통해 단일 세포 레벨로 관찰되었다. 세포의 형태 및 각각의 세포 핵의 형태가 가시화된다. 도 5A는 저배율 사진이다. 막대 길이, 400 ㎛, 백색으로 표시한 사각형 부분을 고배율로 확대하여 도 5B에 도시하였다. 도 5B는 고배율 사진이다. 막대 길이, 100 ㎛.
도 6A-6B는 살아있는 마우스의 종양 세포 증식의 실시간 이미지를 도시한 것이다. 살아있는 마우스에서의 유사분열 종양 세포의 실시간 이미지를 세포 주사 후 12시간 후에 포착하였다. 도 6A는 고배율 이미지를 도시한 것이다. 막대 길이, 50 ㎛. 도 6B는 도6A의 모형이다.
도 7A-7D는 G1상, S상, G2상 및 M상을 비롯한, 이중 표지된 PC-3 인간 전립선암 세포의 세포 주기의 이미지를 도시한 것이다. 도 7E는 세포자멸 중인 PC-3 이중 표지된 세포를 도시한 것이다.
도 8은 PC-3 이중 표지된 세포들에 대한 TaxolTM의 효과를 경시적으로 도시한 것이다.
도 9는 젤 전기영동에서 관찰된 결과를 포함, TaxolTM의 효과의 또 다른 이미지를 도시한 것이다.
도 10은 이중 표지된 PC-3 세포에 대한 빈블라스틴의 처리효과를 도시한 것이다.
도 11은 세포자멸 PC-3 이중 표지된 세포들의 생체내 이미지를 도시한 것이다.
본 발명은 생체외 및 생체내에서 여러가지 화합물에 대한 세포의 감작성 및 증식을 관찰하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵은 어떤 한 색상으로 표지되고, 세포질은 다른 색상으로 표지되어 있는 이중 표지된(dual labeled) 세포에 관한 것이다.
따라서, 한가지 관점에서, 본 발명은 형광 단백질로 표지된 배양체 중의 세포들의 형광 강도의 변화를 시간의 함수로서 관찰하는 단계를 포함하여 이루어지는, 세포 증식의 생체외 측정 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 세포 배양체에 의해 방출된 형광을 시간의 함수로서, 측정함으로써, 생체외에서 약물과 같은 화합물에 대한 세포 응답을 모니터링하는 것에 관한 것으로, 여기서 상기 배양체 중의 세포는 형광 단백질을 발현하도록 변형된 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 세포질 내에 잔류하는 제1색상의 제1형광 단백질에 대한 발현계와, 핵 표적화 단백질에 커플링된 제2형광 단백질에 대한 발현계를 생세포에 제공함으로써, 상기 제1단백질과 상기 제2융합 단백질의 발현시, 상기 세포의 핵은 어떤 한 색상으로 그리고 세포질은 다른 색상으로 표지되는, 생세포의 표지 방법에 관한 것이기도 하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 세포질은 제1형광 단백질로 안정하게 표지되고 핵은 상기 제1단백질과는 다른 색상을 갖는 제2형광 단백질로 표지된, 상기와 같이 제조된 세포에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 얻어진 이중 표지된 생세포를 배양 또는 살아있는 식물이나 동물에 사용하는 방법에 관한 것이다. 세포 주기에 미치는 여러가지 제제의 효과를 이들 세포들을 이용하여 검사할 수도 있다.
발명을 수행하기 위한 형태
세포 표지에 의해 수득가능한 정보는 핵과 세포질을 따로따로 표지시킴으로써 개선시킬 수 있다. 이러한 이중 표지는 세포 증식의 모니터링을 가능하게 할 뿐만 아니라, 세포 라이프 중에 일어나는 사건들을 모니터링하는 것도 가능하게 해준다. 핵은 형광으로서 방출되는 어떤 한 색상으로 표지되고 세포질은 다른 색상으로 표지되는, 본 발명의 표지가 특히 편리하다.
형광을 모니터링함으로써 세포의 증식을 간편하게 실시간으로 생체외 또는 생체내 모니터링하는 방법도 본 발명의 또 다른 특징이다. 이중 표지된 세포들이 이 방법에 이용되지만, 엄격하게 말해서 이중 표지가 필요한 것은 아니다. 오직 하나의 형광 표지(그 강도를 세포가 살아있는 상태에서 측정할 수 있음)만으로 표지된 세포를 이용할 수도 있다. 여러가지 처리 또는 약물에 대한 응답 역시 세포 증식에 미치는 약물 또는 제제의 효과를 확인함으로써 이러한 방식으로 모니터링할 수 있다.
본 발명에 이용가능한 적절한 세포들은 인간 세포를 비롯하여, 효모, 곰팡이, 식물, 척추동물 및 무척추동물의 세포와 같은 진핵 생물의 세포이다. 효모 및 예컨대 곰팡이(molds) 또는 진균(fungi)와 같은 단세포 생물의 관찰시에는, 배양 중 직접 관찰하는 것이 바람직하다. 세포 배양 중 관찰은 보다 고등생물인 식물이나 동물 세포의 세포에 대해서도 이용가능하다. 적절한 동물로는 전형적으로는 래트, 마우스 및 기타 설치류와 같은 실험실 동물, 가축, 어류 및 인간의 세포를 들 수 있다.
세포질과 핵의 이중 표지를 필요로 하지 않는 본 발명의 방법의 경우, 상기한 진색 생물에 더해 원핵 생물의 세포도 이용가능하다.
본 발명의 방법에 따라 세포들을 형광 단백질로 표지시킨다. 본 명세서에서 "형광 단백질(fluorescent protein)"이라 함은 적절하게 자극될 경우 빛을 방출하는 단백질을 가리킨다. 전형적으로, 형광 단백질은 여기 파장으로 조사될 경우, 가시대역의 빛, 즉, 약 400nm - 800nm 대역의 빛을 방출한다. 기기조작에 의할 경우 보다 넓은 대역도 이용가능하다. 형광을 발생시키는 다른 메카니즘도 이용가능하다; 한가지 편리한 예로 루시페라제를 들 수 있는데, 여기서는 대사 에너지를 이용하여 시그널을 발생시킨다. 따라서, "형광 단백질"이라 함은 여기 조사, 화학발광 또는 발광에 필요한 에너지를 공급하는 기타 다른 메카니즘에 의해 적절한 에너지가 공급될 경우, 발광하는 단백질을 가리키는 것이다.
본 발명의 많은 구체예에서, 상기한 배경기술란에 설명된 것과 같은 형광 단백질이 사용된다. 명백히, 이들 형광 단백질은 다양한 색상을 가지며; 어떤 표기법에서는, 예컨대 녹색 형광 단백질은 GFP(green fluorescent protein), 적색 형광 단백질은 RFP(red fluorescent protein)처럼, 그 단백질의 두문자 자체에 색상이 표시된 경우도 잇다. 그러나, 본래 분리된 형광 단백질이 녹색임로, 어떤 경우 두문자 GFP는 방출된 파장과 관계없이 이들 형광 단백질을 설명하는데 사용되기도 한다. 따라서, 어떤 의미에서, GFP는 예컨대 황색, 적색 또는 청색 파장 대역의 빛을 방출 할 수 있다. GFP가 총괄적 의미로 사용되는지 아니면 방출광의 색상이 녹색인 경우를 가리키는데 사용되는지는 그 문맥에 따라 명료히 이해할수 있을 것이다. 예컨대, 설명을 위한 구체예에서, 적색 형광 단백질을 이용하여 세포질을 표지하고, 톡색 형광 단백질을 이용하여 핵을 표지한다. 여기서 GFP는 실제로 녹색 파장 방출을, RFP는 적색 파장 방출을 의미한다.
본 발명은 방출된 형광 광도를 시간의 함수로서 관찰함으로써 생체외 또는 생체내에서 세포의 증식을 관찰하여, 세포의 증식 속도를 측정하는 방법을 제공한다. 클론 이질성 역시 이 기술에 의해 측정할 수 있다.
형광 단백질을 생산하는 형질전환된 세포를 얻는 방법은 이제 이 기술 분야에 널리 알려져 있다. 다양한 색상의 형광이 얻어질 수 있고 안정한 세포주들이 예컨대 미국특허 제6232,523호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다(이 내용은 본 발명에 참조 통합됨). 본 발명의 한가지 구체예에서, 이들 세포들은 생체내에서 관찰되기 보다는 생체외 분석에서 실시간으로 사용된다.
한가지 구체예에서, GFP와 같은 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 암세포주를 96-웰 디쉬에 플레이팅시킨다. 주기적으로, 플레이트를 Molecular Devices Gemini와 같은 형광 플레이트 리더 중에서 각 웰에 대해 형광을 측정한다. 각각의 특정 웰에 있어서, 세포가 증식 할수록, 형광 강도는 증가한다. 따라서, 형광 강도 대 시간의 데이타를 플로팅하거나 달리 조작함으로써 증식 속도를 직접 판독할 수 있다.
세포의 증식에 미치는 다양한 제제의 효과를 테스트하는 용도에서, 플레이트의 웰을 한 세트의 웰은 대조군으로, 그리고 다른 세트는 목적하는 약물과 함께 인큐베이션시키는 방식으로 마크한다. 적절한 시간 간격으로, 전형적으로는 매일 또는 이틀마다 각 웰의 형광 강도를 읽음으로써 대조군 및 약물-처리된 웰에 대한 성장 곡선을 얻는다. 배양체는 아무런 처리도 필요로 하지 않거나 또는 이들 측정에 대한 부가를 필요로 한다. GFP는 죽어가는 세포자멸 또는 세포괴사 세포에서 가수분해된 후에는 형광화하지 않기 때문에, GFP는 세포 생활력(viability)의 즉각적인 마커이다. 각 웰 중의 총 형광은 존재하는 생세포의 수에 상응하며 이에 따라 정량화가 가능해진다. 따라서, 시험 화합물의 증식 억제 또는 증식 촉진 능력을 쉽게 측정할 수 있다.
전술한 방법의 한가지 응용예에서,각각의 웰에, 종양으로부터 유래한 세포들을 최소 갯수로 또는 심지어는 하나의 세포만 공급할 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 방법을 사용함으로써 종양 이질성을 설명할 수 있다. 이질성은 각기, 종양으로부터 수득된 하나의 세포 또는 소량의 세포의 증식을 각각 나타내는 웰들로부터 얻어진 차이에 의해 관찰된다.
본 발명은 또한 세포질과 핵에 대한 마커를 발현하는, 안정적으로 형질전환된 세포들도 제공한다. 핵 표적화 시그널이 결핍된 형광 단백질의 발현계 및, 융합 단백질(색상을 달리하는 제2형광 단백질이 핵 표적화 서열에 커플링됨)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 생세포에 제공함으로써, 현미경 관찰시 핵과 세포질 두가지 모두가 개별적으로 가시화되게 된다. 세포의 이러한 이중 표지에 의해, 세포 주기 중의 사건들을 편리하게 모니터링할 수 있으며 세포 주기에 미치는 여러가지 제제들의 영향 역시 평가 가능하다. 세포들은 배양중에 현미경으로 직접 관찰될 수 있으며, 또는 온전한 동물인 채로, 심지어는 살아있는 동물인 채로 관찰될 수 있다.
발광된 빛의 "색상"이란 그 빛이 방출된 파장을 의미한다. 핵과 세포질은 각기 측정가능한 서로 다른 파장의 빛을 방출하기 때문에, "서로 다른 색상"이라고 표시된다. 색상의 차이는 반드시 육안으로 식별 가능해야만 하는 것은 아니다; 비록 이러한 정도의 파장차가 존재하는 것이 바람직하기는 하지만, 적절한 소프트웨어를 이용한다면, 파장 감작성을 달리하는 필터 및/또는 검출기를 이용함으로써, 더 미소한 파장차도 관찰할 수 있다. 따라서, 예컨대, 본문에 그 내용이 통합된 미국특허 제6,444,992호에 설명된 것과 같은, 확대조사 영역의 현미경을 이용함으로써 밀접하게 상호 관련된 서로 다른 파장을 이용하는 것이 가능하다.
그러나, 그의 색상차가 육안으로 식별가능한 형광 단백질을 사용함으로써 관찰을 간편화하는 것이 바람직하다. 파장차가 육안 식멸을 가능하게 하기에 충분한 경우에는, 기기조작 역시 간편해진다.
세포들은 안정적으로 형질전환되어 두가지 형광 단백질을 생산하므로, 세포들이 살아있고, 다양한 세포 주기 단계를 수행하는 동안 세포들을 관찰하는 것이 가능하다. 세포들은 배양중에 관찰될 수도 있고, 또는 살아있는 생명체 중에 존재하는 동안 관찰될 수도 있다. 예컨대, 녹색 형광 단백질로 안정하게 형질전환된 세포들을 이용하여 살아있는 동물들을 실시간으로 전신 관찰하는 것이 미국특허 6,251,384호, 6,235,968호 및 6,235,967호에 설명되어 있으며 이들 문헌의 내용은 본 발명에 참조 통합되었다. 생물 전신의 용도를 위해서는 고도의 형광 단백질이 바람직하며; 따라서, 루시페라제와 같은 중등에 불과한 형광 단백질은 전신 관찰에 사용할 경우 실용적이지 못하다.
물론, 실험실 동물에 외래 세포가 이식될 경우, 이들 동물들은 그 세포가 거부되지 않도록 충분히 면역기능이 저하되어야 한다. 여러가지 동물의 면역약화 기술은 이 기술분야에 잘 알려져 있으며; 이미 면역약화된 편리한 대상으로는 누드 마우스 또는 SCID 마우스 및 비슷하게 변형된 기타 설치류, 예컨대 래트를 들 수 있다.
형광 단백질은 상기한 배경기술란에 설명된 바와 같은, 당해 기술분야에서 일반적으로 입수가능한 것이면 어느 것이든 무방하다. 본래 분리된 A. viactoria 녹색 형광 단백질의 다양한 변형성은 여러가지 색상의 단백질 및, 여러가지 다양한 세포 종류에서 쉽게 발현될 수 있는 단백질들을 파생시켰다. 다양한 발광 파장의 형광 단백질들의 옵션은 다양하며 잘 알려져 있다.
연구대상 세포가 발현계를 함유하도록 변형시키는 방법은 어느 것이든 무방하다. 형질전환 방법은 세포의 특성에 좌우되며, 비제한적인 예로서, 예컨대 리포펙션, 전기영동 및 바이러스 감염등이 포함된다. 식물 세포의 경우, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개성 형질전환이 이용될 수 있으며, 원형질 변형도 이용가능하다. 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현계의 컨트롤 서열의 선택 역시 가변적이며 적절한 컨트롤 및 벡터의 선택은 세포 특성과 세포 변형 방식에 좌우될 것이다.
어떤 적절한 핵 표적화 시그널이든 이용가능하며; 이하에는 히스톤 H2B에 대해 예시하였다; 그러나, 핵을 표적화하는 다른 서열들도 알려져 있고, 따라서 그러한 다른 서열들로 대체가능함은 물론이다.
따라서, 변형시키고자 하는 세포들을 각각의 형광 단백질들(오직 하나의 형광 단백질을, 그 단백질을 핵에 표적화시킬 부가적인 아미노산 서열에 커플링시킴)에 대한 발현계를 함유하는 적절한 벡터로 트랜스펙션시킨다. 형질전환에 이용된 벡터들은 세포질에 겨냥된 형광 단백질과 핵에 겨냥된 상이한 색상의 형광 단백질에 대한 별개의 벡터들일 수 있으며 또는, 두가지 발현계가 모두 하나의 동일한 발현 벡터 내에 함유될 수도 있다. 핵 표적화 서열을 먼저 사용한 다음, 이어서, 세포질을 표지할 형광 단백질에 대한 발현계를 그 세포가 함유하도록 트랜스펙션시키며, 여기서, 트랜스펙션 이벤트 사이의 세포주의 안정성을 확고히 하는 것이 바람직하다. 트랜스펙션의 순서는 세포질 단백질 투여를 위한 발현계를 먼저 이용하는 방식으로 역전시킬 수도 있다. 또는, 바람직하게는 상이한 선별 마커를 이용하여 공동 트랜스펙션되도록 두가지 발현 벡터들을 세포와 동시에 접촉시킬 수 있다. 두가지 단백질에 대해 비시스트로닉(bicistronic) 발현계를 사용할 수도 있을 것이다.
상응하는 발현계를 게놈 내로 통합시키는 경우를 비롯하여 안정한 변형을 위해서, 세포들을 선택 가압시킨다. 적절한 선별 마커들은 세포들의 특성에 좌우된다; G418 또는 하이그로마이신 내성은 여러가지 광범위한 세포에 편리한 마커이다; 또 다른 선별 방법에는 DHFR 기제 시스템과 관련하여 메토트렉세이트와 같은 독소를 이용하는 것이 포함된다. 당업자라면 사용되는 선별 유형을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 한가지 접근방식에서, 적절한 세포주를, 청색광을 방출하는 형광 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 핵 표적화 시그널을 코딩하는 아미노산 서열에 융합된 발현계를 포함하는 레트로바이러스 벡터로 감염시킨다. 바이러스 벡터는 선별 마커로서 하이그로마이신 내성을 추가로 포함한다. 이렇게 처리도니 세포들을 하이그로마이신 존재 하에 선택 가압시키고 몇 라운드의 선별과정을 거친 후, 적절한 형질전환체가 얻어지게 된다.안정하게 형질전환된 세포들을 이어서 전기영동을 이용하여 DNA 처리하며, 여기서 벡터는 DHFR에 커플링된 녹색 발광 형광 단백질을 포함한다. 이어서 세포들을 하이그로마이신과 메토트렉세이트 두가지 모두에 대해 선별하여 핵은 청색으로, 세포질은 녹색으로 염색된 세포주를 얻는다.
본 발명에 의해 수득가능한 차별 염색은 세포 주기의 여러 단계가 핵과 세포질로부터 방출된 조사광의 상이한 분포 및/또는 강도를 유발한다는 점에서 유용하다. 따라서, 예컨대, 강도의 비율은 세포 주기 위치의 측정을 가능케 해 줄 것이다. 또한, 핵의 형태는 세포자멸사가 일어날 때 변경되며 이것은 쉽게 검색된다. 여러가지 소형 분자 약물, 단백질, 안티센스 또는 트리플렉스 형성 핵산 또는 억제제 RNA를 비롯한 여러가지 제제의 효과를, 세포 주기 또는 세포 형태에 미치는 이들 제제의 효과를 관찰함으로써 테스트할 수 있다. 세포질 또는 핵에 대한 여러가지 제제의 상이한 표적화 역시 본 발명의 방법을 이용함으로써 관찰가능하다. 평가될 수 있는 세포의 특징으로는 휴지, 세포자멸사, 세포 주기 단계, 표적화 제제의 위치 (location), 및 당업자에게 잘 알려진 기타 다양한 특성을 들 수 있다. 필요한 경우, 세포를 처리하는데 사용된 제제들 자체를 표지시킬 수도 있다.
따라서, 세포들을 배양중 현미경을 통해 관찰할 경우, 제제들을 직접 배양체에 첨가할 수 있다. 살아있는 동물이나 식물 중에서 세포가 관찰될 경우, 이러한 제제는 일반적으로 그 동물이나 식물에 직접 투여된다.
한가지 구체예에서, 암세포를 핵에만 발현된 히스톤 H2B-GFP 및, 세포질에만 단독으로 발현된 레트로바이러스 벡터가 도입된 DsRed-2로 이중 표지시킨다. 이렇게 하면 핵-세포질 비율을 녹색 대 적색 형광의 비율로 측정할 수 있다. 이러한 측정법은 세포 주기의 증식 상태에 있어서의 세포의 상대적 숫자를 측량하는 것을 가능케 해준다. 비증식 세포보다 세포 배가 과정 중의 핵에서의 DNA 합성으로 인해 녹색 대 적색 비율이 더 높거나 핵 대 세포질 비율이 더 높으면 S상과 G2상으로 결정된다. 2색 세포들을 96웰 디쉬에 플레이팅시키고 적색 형광과 녹색 형광의 강도 및 비율을 여러 시점에서 측정한다. 이러한 비율에 의해, 세포 주기 중의 상태를 결정하는 것이 가능하다.
증식 자체의 관찰과 함께, 여러가지 화합물로 이들 세포를 처리한 결과를 테스트하도록 이러한 분석법을 맞출 수 있다. 이러한 응용의 경우, 대조군 세포는 한 세트의 웰에, 그리고 테스트 시약은 다른 세트의 웰에 플레이팅시킨다. 이어서 이 플레이트를 이중 파장 측정이 가능한 형광 판독기에 넣어서 녹색 및 적색 형광의 상대적 증가 및 이들 비율을 측정한다. 이것에 의해 상대적인 증식 속도를 측정하는 것 뿐만 아니라 이들 과정에 미치는 약물의 영향과 세포 주기 위치도 측정할 수 있다.
세포가 유래된 여하한 조직의 이질성 역시 웰마다 세포를 최소의 수만큼 이용함으로써 본 발명의 방법에 의해 설명할 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다. 모든 경우, 이미지는 Hamamatxu C5810 3CCD 카메라 (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ)로 직접 포착하였다. 마크로-조영의 경우, 형광 박스 (Lightools Research, Encinitas, CA)를 이용하였다. 마이크로-조영의 경우, Leica 형광 스테레오 현미경 모델 LZ12를 CCD 카메라와 연결시켰다. 이 현미경에 GFP 필터와 50W 전력의 수은등을 달았다. 이미지를 콘트라스트와 밝기 조절한 다음 Image Proplus 3.1 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 1024 x 724 픽셀의 고해상도 이미지가 IBM PC 40상에 직접 포착되었다.
제조예 A
RFP 레트로바이러스의 제작
RFP 레트로바이러스 22)를 제작하기 위하여, pDsRed2 (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)로부터 얻은 전장 적색 형광 단백질 cDNA를 포함하는 Hind III/Not I 단편을 네오마이신 내성 유전자를 갖는 pLNCX2 (Clontech)의 Hind III/Not I 자리에 삽입하여, pLNCX2-DsRed2 플라스미드를 제작하였다. 10 Al 바이러스 외피를 발현하는 NIH3T3 유래 패키징 세포주인 PT67를 CLONTECH Laboratories, Inc. 로부터 구입하였다. PT67 세포를 10% 열불활성화 소태아혈청 (FBS) (Gemini Bio-products, Calabasas, CA)이 보충된 DME 배지 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)에서 배양하였다. 벡터 제작을 위하여, 70% 융합에서, PT67 세포를 포화량의 pLNCX2-DsRed2 플라스미드와 LipofectAMINETM 시약 (Life Technologies, Grand Island, NY)의 침전 혼합물과 함께 18 시간동안 배양하였다. 그리고 나서, 신선한 배지를 공급하였다. 형질도입 후 48 시간째에 형광 현미경을 통하여 세포를 관찰하였다. RFP 레트로바이러스 벡터 (PT67-DsRed2)를 다량으로 생산하는 클론을 선별하기 위하여, 세포를 G418 (Life Technologies) 200 내지 1,000 ㎍/ml 존재하에서 7일간 배양하였다. 몇몇 경우, 약물 선별 15 후에, 형광 현미경 하에서 생존 콜로니를 조사하고, GFP 또는 RFP 양성 콜로니를 분리하였다. 3T3 세포주를 사용하는 바이러스 역가 시험 후 몇 개의 클론을 선별하여 세포주 내로 확장시켰다.
제조예 B
히스톤 H2B-GFP 벡터의 제작
히스톤 H2B-GFP 레트로바이러스 제작을 위하여, 히스톤 H2B 유전자를 Geoff Wahl (Salk Institute) 교수로부터 입수하였다. 상기 유전자는 종결 코돈을 갖지 않기 때문에, H2B 유전자를 에큐오리아 빅토리아 (Aequoria victoria) EGFP 유전자 (Clontech)의 5' 코딩 부위에 연결시키는 것이 가능하다 24). 그리고 나서, 상기 히스톤 H2B-GFP 융합 유전자를 하이그로마이신 내성 유전자를 갖는 pLHCX (Clontech)의 Hind III/Cal I 자리에 삽입하였다. 히스톤 H2B-GFP 레트로바이러스 벡터를 다량으로 생산하는 클론을 제작하기 위하여, pLHCX 히스톤 H2B-GFP 플라스미드를 PT67-DsRed2의 경우와 동일한 방법으로 PT67 세포에 형질감염(transfection)시켰다. 상기 형질감염된 세포를 하이그로마이신 (Life Technologies) 200 내지 400 ㎍pg/ml 존재하에서 15일간 배양하여, 최종적으로 PT67-히스톤 H2B-GFP 세포를 제작하였다. 몇몇 경우, 약물 선별 15일후, 형광 현미경 하에서 생존 콜로니를 조사하고, GFP 또는 RFP 양성 콜로니를 분리하였다. 3T3 세포주를 사용하는 바이러스 역가 시험 후 몇 개의 클론을 선별하여 세포주 내로 확장시켰다.
실시예 1
인간 전립선암 세포 - 세포핵에서 히스톤 H2B-GFP 발현하고 세포질에서 pLNC DsRed를 발현
GFP와 히스톤 H2B (21)와의 융합에 의하여 세포핵에서 독점적으로 GFP를 발현하고 세포질에서 독점적으로 RFP를 발현하는 2색(dual color) PC-3 세포를 분리하였다. 이들 세포는 살아있는 전립선 암 세포의 2색 영상화 가능성을 보여주는 것이다.
단계 I: DsRed 발현 세포의 제작
PT 패키징 세포로부터 제작된 pLNC DsRed-2로 PC-3 세포를 형질전환시켰다. 형광 현미경 하에서 PC-3 세포에서의 DsRed-s 발현을 모니터링하였다. G418의 증가량에 따라서 선별하였다.
단계 II: 이중 표지된 H2B GFP 및 DsRed-2 세포의 제작
LipofectAMINE PlusTM을 사용하여 pLHC H2B-GFP DNA로 DsRed-2 PC-3 세포를 형질감염시켰다. 24 시간 배양 후, H2B GFP 및 DsRed-2 발현 세포를 하이그로마이신 및 G148의 증가량에 따라 선별하였다.
생세포에서의 세포 주기의 위치를 적색 세포질에 대한 녹색 세포핵의 면적비에 의하여 분석하였다. 생세포에서의 핵 형태에 의하여 세포자멸(apoptosis)을 평가하였다.
실시예 2
섬유육종 세포의 RFP 및 히스톤 H2B-GFP 유전자 형질도입
RFP 및 히스톤 H2B-GFP 유전자 형질도입을 위하여, 인간 섬유육종에서 유래하는 70% 융합 HT-1080 세포를 미국 균주 콜렉션 (American Type Culture Collection, Rockville, ML)으로부터 구입하였다. 2색 세포를 제작하기 위하여, 우선, 세포질에서 RFP를 발현하는 HT-1080의 클론 (HT-1080-RFP)을 제작하였다. 약술하면, HT-1080 세포를 PT67-RFP 세포의 레트로바이러스 상청액과 10% 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Herndon, VA)와의 1:1 침전 혼합물과 함께 72 시간동안 배양하였다. 그리고 나서, 신선한 배지를 공급하였다. 형질도입 후 72시간째에 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 수확하고, 1:15의 비율로 G418 200 ㎍/ml을 함유하는 선별 배지내로 계대배양하였다. G418의 농도를 800 ㎍/ml까지 순차적으로 증가시켰다. 트립신/EDTA를 사용하여 클로닝 실린더 (Bel-Art Products, Pequannock, NJ)로 HT-1080-RFP를 분리하고, 통상적인 배양법에 의하여 증폭시켰다.
클론된 두 서브라인 (HT-1080-dual-1 및 HT-1080-dual-6)은 세포핵에서 GFP를, 세포질에서 RFP를 안정적으로 발현하였다. 대조군으로서 RFP 또는 GFP만을 함유하는 클론을 추가적으로 얻었다 (HT-1080-RFP, HT-1080-GFP).
실시예 3
HT-1080-RFP 및 HT-1080-Dual 모클론(parent clone)의 세포 증식률
각각의 형광 표지된 HT-1080 클론 (HT-1080-RFP, HT-1080-dual-1 또는 HT-1080-dual-6)과 모클론 (HT-1080)을 10% FBS 배지를 함유하는 RPMI가 들어있는 100 mm 디쉬에 1x103 세포/디쉬의 밀도로 접종하였다 (제1일). 상기 디쉬를 5% C02 및 37 ℃의 인큐베이터에 놓아 두었다. 그 이후 매일 (제2 내지 7일), 각 클론 당 3 개 디쉬의 세포수를 측정하였다. 약술하면, 트립신 처리 후 수집된 재현탁 세포를 트립판 블루 (Sigma)로 염색하였다. 이어서, 혈구계 (Reichert Scientific Instruments, Buffalo, NY)를 사용하여 생세포만을 카운팅하였다.
도 1은 선별된 HT-1080-2색 세포가 생체외에서 밝은 GFP 및 RFP 형광을 나타냄을 보여준다. 녹색 형광은 세포핵 내에 잘 위치화되어 있다. 개체군 내의 모든 세포는 GFP 및 RFP를 발현하였으며, 이는 상기 전이 유전자 (transgene)의 안정성을 보여주는 것이다. 도 2는 단층 세포 배양에서 측정된 HT-1080, HT-1080-RFP, HT- 1080-dual-1 또는 HT-1080-dual-6 모클론의 증식률에 차이가 없음을 보여준다.
HT-1080-dual-1 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지가 들어있는 150 mm 디쉬에서 배양하였다. 5 내지 30 분마다, 상기 디쉬를 형광 입체 현미경 하에 두고 동일 생세포에서의 시간에 따른(time-course) 영상을 기록하였다.
도 3A는 유사분열 동안의 HT-1080 dual-1의 시간에 따른 일련의 영상을 5분 간격으로 보여주는 것이다. 도 3B는 30분 간격의 분열기 세포를 보여주는 것으로,상기 분열기 세포는 대규모 개체군에서의 위치가 변경되는 경우에도 쉽게 추적될 수 있었다.
실시예 4
생체외 ( In vitro )에서의 세포자멸 과정의 실시간 관찰
세포자멸 과정의 실시간 영상 기록을 위하여, HT-1080-dual-6 클론을 사용하였다. -80 도에서 저장되고 DMSO에 용해된 스타우로스포린 (Staurosporine, Alexis, San Diego, CA)을 사용하여 세포자멸을 유도하였다. 3x105 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640이 들어있는 25 cm2의 플라스크에 접종하였다. 다음날, 스타우로스포린을 2 μM 농도로 첨가하였다. 매 2 시간마다, 상기 플라스크를 형광 입체 현미경 하어 두고 각 시점에서의 실시간 영상을 기록하였다.
스타우로스포린 2 μM에 의하여 HT-1080-dual-6 세포에서 세포자멸이 유도되었다 (도 4A 및 4B). 매 2 시간마다 세포핵의 진행성 파편화 (Progressive fragmentation)가 관찰되었다.
실시예 5
생체내 ( In vivo )에서의 이중 표지된 세포의 실시간 관찰
모든 동물 실험을 "The National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (보증번호 A3873-1)에 개시된 이론과 절차에 따라서 수행하였다. 동물들을 HEPA 여과하의 울타리 쳐진 시설에 두었다. 마우스를 고압 실험용 설치류 사료(Tecldand LM-485, Western Research Products, Orange, CA)로 사육하였다.
온경동맥의 세포 주입을 위하여, 누드 마우스를 케타민 혼합물 (케타민 HCl 10 ㎕, 자일라진 7.6 ㎕, 아세프로마진 말리에이트 2.4 ㎕, H20 10 ㎕)를 피하 주사하여 마취시켰다. 우선, 목 부분에서 피부 세로 절개를 수행하였다. 턱밑샘을 찾은 후, 중간 부분에서 절개하고 각 면을 집어넣었다. 우측 흉골설골근(sternohyoid muscle)과 우측 흉골유돌근(sternomastoideus muscle)과 결합 조직을 무딘 기구로 분리하였다. 우측 온경동맥을 찾은 후, 상기 동맥을 주변 결합조직으로부터 살며시 적출하였다. 끝이 무딘 후크 (Fine ScienceTools, Inc. , Foster City, CA)로 동맥의 몸쪽 부위에 가벼운 장력을 가하였다. 33G 바늘 (Fine Science Tools)을 사용하여 2x105 HT-1080-dual-1 세포를 함유하는 총 200 ㎕의 배지를 동맥에 주입하였다. 주입 직후에, 상기 주입 부위를 면봉으로 눌러서 잠시동안 출현 또는 주입된 종양 세포의 유출을 방지하였다. 출혈 정지를 확인한 후, 6-0 봉합사로 피부를 봉하였다. 전술한 모든 처치 과정은 7X 해부 현미경 (MZ6, Leica, Deerfield, IL)을 사용하여 수행하였다.
HT-1080-dual-1의 온경동맥 주입 후, 두피편을 거쳐 두개골을 통과하여 뇌 미세동맥 내의 색전 세포를 가시화시켰다 (도 5A 및 5B). 마우스의 두개골은 상대적으로 투명하다. 종양 세포는 신장되어 백혈구와 유사한 미세 혈관에 적응되는 것으로 관찰되었다. 종양 세포핵은 혈관내 가시화된 종양 세포에 있어서 매우 연장되어 있었다.
실시예 6
생체내 종양 세포의 핵-세포질 동력학의 가시화
생체내 종양 세포 핵 세포질 동력학을 가시화시키기 위하여, 마우스를 케타민 혼합물로 마취시켰다. 청색광 하에서 형광 입체 현미경으로 귀 표면을 직접적으로 관찰하였다.
폐 전이에서의 핵 세포질 동력학을 관찰하기 위하여, 6 마리의 마우스 꼬리 정맥에 300 ㎕ 부피의 1x106 HT-1080-dual-1 세포를 주입하였다. 다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고, 폐를 적출하였다. 폐 상의 전이 콜로니를 청색광 하에서 직접적으로 가시화시켰다. 조직학적 분석을 위하여, 상기 적출된 폐를 조직 동결 배지 (Triangle Biomedical Sciences, Durham NC)에 함입시키고 -80 도에서 저장하였다. 냉동 미세 절단기 (cryostat) LEICA 모델 CM-1850를 사용하여 4 ㎛ 두께의 동결된 절편을 제조하였다. GFP 필터 세트가 장착된 형광 입체 현미경 하에서 상기 제조된 절편을 직접 관찰하였다.
서로 매우 근접하여 있는 각각의 핵으로 적출된 폐에서의 미세전이를 가시화하였다 (데이터를 나타내지 않음). 상기 세포들은 뒤틀려서 세포핵 간 접촉을 가능하게 하는 것으로 보인다.
이 실험은 생체내 뿐 아니라 생체외에서의 세포 수준에서의 세포자멸 과정을 포함하는 종양 세포 핵-세포질 동력학의 실시간 관찰 가능성을 제시하는 것이다. 분열기 세포는 살아있는 마우스의 귀에 주입한 후 용이하게 가시화시킬 수 있다. 꼬리 정맥 주입 후, 적출된 폐에서 2색 미세전이가 관찰되었다.
실시예 7
전신 형광 광학 영상화
HT-1080-dual-1의 주입 후 12 시간된 살아있는 마우스에서 분열기 세포의 실시간 영상을 포착할 수 있었다 (도 6A 및 6B). 보여진 세포들은 혈관외 유출되고, 배양시의 분열하는 세포와 유사하게, 둥근 모양인 것으로 나타났다. 어떠한 고정 또는 염색도 하지 않고 살아있는 동물에서 각 세포핵의 상태와 세포 경계를 가시화시켰다.
실시예 8
2색 인간 전립선암 세포주의 제작
PC-3 세포를 10% FCS가 보충된 RPMI1640 배지에서 증식시켰다. 기하급수적으로 증식하는 세포 (10 cm 디쉬에서)를 폴리브렌 (Polybrene) 8 ㎍/ml의 존재하에서 PT67/pLHCX H2B-EGFP로부터 얻은 바이러스 상청액과 함께 배양하였다. 하루밤 배양 후, 배지를 교체하고, 감염된 세포들을 순차적 하이그로마이신 선별을 위하여 확장시켰다. 약물 선별 15일 후, 형광 현미경 하에서 살아있는 콜로니를 가시화시키고, GFP 양성 콜로니를 분리하였다. H2B-EGFP이 균일하고 높은 수준으로 발현하는 클론을 선별하였다.
그리고 나서, 기하급수적으로 증식하는 H2B-EGFP 발현 세포를 폴리브렌 (Polybrene) 8 ㎍/ml의 존재하에서 PT67/pLNCX DsRed-2로부터 얻은 바이러스 함유 상청액과 함께 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 배지를 교체하고 감염 48시간 후 감염된 세포를 순차적 G418 선별을 위하여 확장시켰다. 약물 선별 15일 후, 형광 현미경 하에서 살아있는 콜로니를 가시화시키고 RFP 양성 콜로니를 분리하였다. H2B- EGFP와 RFP (PC3-dual)를 모두 균일하고 높은 수준으로 발현하는 클론을 선별하였다.
증식률 측정을 위하여, 1x105 세포를 60 mm 페트리 디쉬에서 배양하고 1 주일동안 매일 수를 측정하였다. 트립판 블루 염색에 의하여 사멸 세포를 제외하고, 지정된 시간에 3 번씩 웰 당 생세포수를 측정하였다.
상기 세포주에서의 H2B-EGFP 및 세포질 RFP의 고발현은 하이그로마이신 B 및 G418 선별 배양의 부재시에 3 개월 이상 안정적이었다. 2색 세포의 증식률은 이의 모세포인 PC-3의 생체외 증식률과 동일하다. 이러한 결과는 2색 PC-3 세포가 생체내 및 생체외 실험을 위한 유용한 모델이 될 수 있음을 나타낸다.
실시예 9
세포주기 및 세포자멸의 관찰
2색 세포를 생세포에서 관찰되는 바와 같은 "핵-세포질" 비율에 의하여 세포 주기 위치에 용이하게 위치시킬 수 있었다. 이들 세포의 형광 현미경 관찰을 위하여, 머큐리 50 W 전원 공급 장치가 장착된 Leica 형광 입체 현미경 모델 LZ12를 사용하였다. GFP와 RFP 형광을 동시에 모두 가시화시키기 위하여, D425/60 대역 통과 필터, 470 DCXR 색선별 거울 (dichroic mirror)을 통하여 여기시키고, 방출되는 형광을 장거리 통과 필터 GG475 (Chroma Technology, Brattleboro, VT)를 통하여 수집하였다.
도 7A 내지 7D는 세포 주기를 보여주는 것이고; 도 7E는 세포자멸을 나타낸 것이다.
세포질과 비교하여 세포핵 크기가 큰 경우는 매우 작은 핵-세포질 비율을 갖는 G1기 세포와 비교하여 용이하게 G2기 세포로 동정하였다. S기 세포는 G1기 세포보다 크지만 G2기 세포보다 적은 핵-세포질 비율을 갖는다. 유사 분열에 진입하려고 하는 간기 세포는 염색체 응축정도에 의하여 동정하였다. 한 줄로 늘어선 중기 판을 갖는 세포가 용이하게 관찰되고 후기에 진입시 가시화될 수 있다. 세포자멸 세포는 파편화를 포함하여 세포핵 이상 형태에 의하여 동정하였다.
따라서, 각각의 세포의 연속하는 세포 주기 진행을 빈번한 간격으로 얻어지는 현미경 사진에 의하여 실시간으로 추적할 수 있었다.
실시예 10
약물에 의해 유발된 세포자멸사의 실시간 가시화
PC-3 듀얼 세포들을 TaxolTM(0.8㎍/ml); 티미딘 (2mM), 및 빈블라스틴 (60nM)으로 처리하였다. 실시간 조영을 제0시, 12시, 24시, 36시 및 48시에 행하였다. DNA 추출 및 아가로스 젤 전기영동 (1.8%) 분석을 위해 세포들을 수집하였다. 패클리탁셀 (TaxolTM) (0.8㎍/ml)은 핵에 대해 매우 특이적인 효과를 나타내어, 발색단이 핵막에 부착된데 기인한 것이 분명한 고리 모양의 구조를 형성하도록 하였다. 도 8은 RFP-표지된 세포질을 배경으로 해서, GFP-표지된 핵이 매우 잘 가시화되었음을 보여준다. 핵의 고리 구조는 24시간까지 볼 수 있었다. 48시간 경에는 세포들이 매우 비정상적인 핵구조와 단편화를 수반하는 세포자멸사로 접어듦을 볼 수 있었다.
도 9는 처리를 개시한지 24시간 후에 관찰된 TaxolTM에 의해 유발된 고리 구조가 DNA 단편화 발생 전이라는 것을 보여주며 젤 전기영동에 의해 관찰가능했다. 세포가 세포자멸사에 접어든 48시간 까지는, DNA 단편화가 관찰되었다.
또 다른 튜불린 시약인 빈블라스틴 (60nM)은, 도 10에 도시된 바와 같이 핵은 농축되고 세포는 확장된 것으로 나타난, TaxolTM 처리의 경우와는 다른 영향을 미쳤다.
실시예 11
생체내 관찰
모든 동물 연구는, NIH (National Institute of Health) 보증번호 A3873-1에 의거한 동물의 관리 및 이용에 관한 NIH 가이드에 개략된 방법과 원칙에 따라 실시하였다. 5 내지 6주령의 수컷 누드 마우스 (NCr-nu)를 HEPA-필터 랙 상의 배리어 설비 내에서 키웠다. 2색(dual color)의 PC-3 인간 전립선 암세포 (2x106)를 누드 마우스의 발바닥에 주사하였다. 마우스들을 20일 후에 안락사시켰다. 종양과 임파절 및 폐를 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 11은 유사분열 2색 PC-3 세포를 형광 현미경으로 임파절에서 관찰한 것을 도시한 것이다.

Claims (27)

  1. 핵에 국소화된 제1형광 단백질과 세포질에 국소화된 제2형광 단백질을 포함하는 살아있는 세포의 제조방법으로서, 여기서 상기 제1 및 제2형광 단백질들은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는 것이고, 상기 방법은, 살아있는 세포로 하여금
    (a) 상기 제1형광 단백질의 발현을 위한 제1발현계 (여기서 상기 제1형광 단백질은 상기 융합 단백질을 핵에 표적화시키는 아미노산 서열에 융합된 것임)와 핵 표적화 서열이 결핍된 제2형광 단백질의 발현을 위한 제2발현계를 함유하도록 변형시키거나; 또는
    (b) 상기 제1형광 단백질과 상기 제2형광 단백질의 두가지 모두를 발현하는 발현계를 함유하도록 변형시킨 다음;
    상기 변형된 세포들을 안정하게 변형된 세포들에 대해 선별하는 단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 단계에서, 상기 세포들을 상기 제1발현계로 먼저 변형시키고 이어서 상기 제2발현계로 변형시키거나 또는 역순으로 변형시키는 방법.
  3. 1항에 있어서, (a) 단계에서, 세포들을 두가지 발현계 모두에 의해 동시에 변형시키는 방법.
  4. 1항에 있어서, 항생제나 독소의 존재 하에 세포를 배양시킴으로써 상기 선별단계를 수행하는 방법.
  5. 핵에 표적화된 아미노산 서열에 융합된 제1형광 단백질 및 핵을 표적화하는 아미노산 서열이 결핍된 제2형광 단백질을 생산하도록 안정적으로 변형된 살아있는 세포로서;
    여기서 상기 제1형광 단백질 및 제2형광 단백질은 서로 다른 파장의 가시광선을 방출하는 것인 살아있는 세포.
  6. 핵에 국소화된 제1형광 단백질과 세포질에 국소화된 제2형광 단백질을 함유하도록 변형된 살아있는 세포로서, 여기서 상기 제1형광 단백질과 제2형광 단백질은 서로 색상을 달리하는 것인 살아있는 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1형광 단백질은 녹색이고, 상기 제2형광 단백질은 적색인 세포.
  8. 제5항에 있어서, 상기 핵에 표적화된 아미노산 서열이 히스톤 H2B인 세포.
  9. 제6항에 따른 세포의 핵 면적 대 세포질 면적의 비율을 평가하는 것을 특징으로 하는, 살아있는 세포의 세포 주기 위치를 결정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 평가를 시간의 함수로서 수행하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 세포를 살아있는 동물에서 관찰하는 방법.
  12. 세포에 대한 제제의 효과를 측정하는 방법으로서,
    제6항에 따른 세포의 제1시료를 상기 제제로 처리한 다음 상기 세포로부터 방출된 조사광선의 분포 및/또는 강도에 미치는 상기 처리 효과를 관찰하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제제로 처리되지 않은 상기 세포들로부터 방출된 조사광선의 분포 및/또는 강도를 관찰하고,
    제1시료에 대한 관찰결과를 제2시료에 대한 관찰결과와 비교하는 단계를 초가로 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 분포 및/또는 강도가 휴지기의 특징인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 분포 및/또는 강도가 세포자멸사의 특징인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 분포 및/또는 강도가 세포 주기 중의 단계들의 특징인 방법.
  17. 제6항에 따른 세포를 상기 제제로 처리하고 상기 세포로부터 방출된 조사광선의 분포 및/또는 강도를 관찰하는 단계를 포함하는, 시약의 표적화 위치를 결정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제제 자체를 표지시키고, 상기 방법이 표지의 위치를 직접 관찰하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 형광 단백질을 함유하도록 변형된 세포들을 배양하고; 상기 세포에 의해 방출된 형광을 시간의 함수로서 측정함으로써, 상기 세포의 증식 속도를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는, 세포 배양체의 증식 속도를 측정하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 형광 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP)이거나 또는 적색 형광 단백질(RFP)인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 배양체가 단일 세포로부터 생육된 것인 방법.
  22. 세포 증식에 미치는 시험 화합물의 효과를 측정하는 방법으로서,
    형광 단백질을 함유하도록 변형시켜 놓은 상기 세포를, 상기 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 배양시키고;
    상기 화합물의 존재 및 부재 하에 형광의 강도를 시간의 함수로서 측정하여 상기 화합물의 존재 및 부재 하에서의 증식 속도를 측정하고;
    상기 화합물의 존재 및 부재 하에서의 증식 속도를 비교하는 단계를 포함하여 이루어지며,
    여기서, 상기 화합물의 부재시와 반대되는 경우로서의 상기 화합물의 존재시의 증식 속도의 변화가 상기 화합물을 세포 증식의 조정자로서 특징지우는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 형광 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 배양은 단일 세포로부터 시작하는 방법.
  25. 종양의 이질성을 검사하는 방법으로서,
    상기 중양에 함유된 개별 세포 또는 세포들의 개별 집단으로부터의 콜로니를 복수개 배양하고,
    상기 세포 배양체들의 증식 속도를 측정함으로써, 상이한 증식 속도를 나타내는 배양체를 상기 종양과 이질적이라고 판단하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포들은 형광 단백질을 함유하도록 변형된 것이고, 증식 속도는 방출된 형광의 강도를 시간의 함수로서 측정하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 세포들은 핵에 국소화된 제1형광 단백질과 세포질에 국소화된 제2형광 단백질을 함유하도록 변형된 것이고 여기서, 상기 제1형광 단백질과 제2형광 단백질을 서로 다른 색상을 갖는 것인 방법.
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