JP5850840B2 - 神経発生およびその調節に関連する遺伝子、方法および組成物 - Google Patents
神経発生およびその調節に関連する遺伝子、方法および組成物 Download PDFInfo
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Description
本願は、その全体において参照により本明細書に明示して援用される2009年9月29日に出願された米国仮特許出願第61/246,967号に対する35 U.S.C. § 119による優先権を主張する。
本願は、ASCII形式で、EFS-Webを介して提出され、その全体において参照により本明細書に援用される配列表を含む。2010年9月28日に作成された前記ASCIIコピーは、21RE6840.txtと称し、2,011,398バイトのサイズである。
本発明は、神経発生、特に中枢神経系の神経発生の活動性依存性調節に関連する遺伝子、方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、神経発生に関連する遺伝子の同定および操作の方法、ならびに神経発生を調節する医薬剤のスクリーニングおよび評価の方法に関する。
神経発生は、神経系の発生および成熟の基礎となる複雑な課程である。この過程は、細胞の増殖、生存、分化および移動の適切な時間空間的な制御に依存する。新たに生成された神経細胞は、中枢神経系の機能的細胞に分化し得、脳の神経回路に組み込まれ得る。さらに、多くの動物の脳において、新しい神経細胞は、生物の生涯を通じて継続的に生成される。例えば、神経発生は、現在、成体期を通じて、哺乳動物の脳の2つの領域:側脳室の脳室下(subventricular)帯(SVZ)および海馬の歯状回において続くことが分かっている。これらの領域では、多能性神経前駆細胞(NPC)は、分裂を続け、新しい機能的ニューロンおよびグリア細胞を生じる(Jacobs, Mol. Psychiatry 2000, 5(3): 262-9)。そのため、神経発生の調節は、CNSの領域的分化(specialization)および機能的回路を形成する特異的細胞型の確立の基礎となる。
第一の局面において、本開示は、第一の動物のインタクトの脳の領域中の神経前駆細胞と医薬剤とを接触させる工程、第一の動物および第二の対照動物を、インタクトの脳の領域において活動性を誘発し得る外的刺激に曝露する工程、ならびに第一の動物における神経前駆細胞の増殖割合および第二の動物における神経前駆細胞の増殖割合を任意の順序で測定する工程を含む方法に関し、ここで神経前駆被検細胞と神経前駆対照細胞の間の増殖の差により、神経増殖を調節し得るものとしての該医薬剤が同定される。
そうではないと定義されない限り、本明細書に使用される全ての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用できるが、適切な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体において参照により援用される。また、材料、方法および実施例は、例示のためだけであり、限定を意図しない。
本開示で使用する場合、用語「約」または「およそ」は、当業者により決定される場合の特定の値について許容され得る範囲内にあることを意味し、部分的に、どのようにして値を測定または決定したか、例えば測定系または技術の限界に依存し得る。
モデル系としてのアフリカツメガエル
アフリカツメガエルは、神経発生および脳の発生のインビボ研究に有利であることが明らかにされている。これらの利点にはいくつかの要因がある:
カエルのオタマジャクシは、CNS発生の幼生期間の間にわたる、比較的長く利用可能な細胞増殖および分化の期間を有する。アフリカツメガエルの発生の前変態期(pre-metamorphic stage)の経過中に、細胞増殖により新しいニューロンが生成される。新たに形成されたニューロンは、その後発生中のオタマジャクシの脳の機能的な回路に組み込まれる。誕生から個々のニューロンの分化までの神経発生の流れは、アフリカツメガエルでは2〜4日の期間に捕えられ得るのに対して、哺乳動物系では1ヶ月を超える。
カエルにおける神経発生および回路の形成における研究により、その後ヒトを含む哺乳動物において機能的であることが示されたいくつかの脳発生の基本的な機構が明らかにされた。CNSは、アフリカツメガエルの前後軸に沿って高度に局所化(regionalize)され、種々のCNS領域は、感覚的入力処理、情報統合、記憶、意思決定、および運動調節を含む特有の機能を有する、特定の神経回路により構成される。
NPC増殖および分化は、前変態期(オタマジャクシ段階)のアフリカツメガエルにおいて直接的に観察され得る。図1Aは、脳を四角で示したオタマジャクシの透明な頭部を示す。図1Bは、視蓋を含む脳の領域のより詳細な図である。図1Cは、2時間および6日の時点の視蓋における神経細胞の相対的な位置(BrdUにより可視化)を示し、新たに生成された細胞は、ニューロンへと分化し、該ニューロンは脳室層から離れて移動する。(Wu et al., J. Neuroscience 1999, 19(11): 4472-4483)。
かかる画像化により、形態学および発生段階に基づいた異なる細胞型の同定および分析のための方法の基礎が提供される。本願は、かかる分析を容易にするための多数の細胞レポーターの使用を包含する。例えば、かかるレポーターは、神経前駆細胞、およびGABA作動性ニューロンもしくはグルタミン酸作動性ニューロンなどの分化した細胞の異なる集団の(or)タグ化および時間差モニタリングを可能にする。
いくつかの態様において、本方法は、神経発生、特にNPC増殖および分化に関与する遺伝子の同定を可能にする。候補遺伝子の同定は、例えば放射状グリア中および分化したニューロン中それぞれの核酸のマイクロアレイ分析により実施され得る。かかるマイクロアレイ技術は当業者に周知である。形態学に基づいて細胞を選択して、マイクロアレイ分析のための処理の前に異なる集団に分類し得る。例えば、細胞の特性に基づいて、細胞をNPCまたは分化したニューロンのいずれかに分類し得る。代替的に、細胞集団(または目的のかかる細胞集団を含む動物)を、分化を促進または抑制のいずれかする条件および/または刺激に曝露し得る。
神経発生の制御において局所的環境および非細胞自律的因子の確立された役割(Peunova et al., J. Neurosci 2001, 21(22): 8809-8818;Kreigstein et al., 149-84, Cheng et al., Nat Neurosci 2009, 12(4): 399-408;Javaherian et al., Cereb Cortex 2009, 19 Supp 1: i70-77;Suh et al., Ann Rev Cell Dev Biol 2009; 25: 253-75)は、インタクトの動物において増殖活性の直接的な評価を行なって、神経発生を調節する内因性の細胞的および分子的機構が同定され得る、ツメガエル属などの実験系の重要性を強調する。
医薬剤
本明細書で使用する場合、医薬剤(薬物)は、薬理学的活性を有する化合物を含み、無機化合物、イオン性物質、有機化合物、有機リガンド、例えば補因子、多糖類、組み換えおよび合成ペプチド、タンパク質、ペプトイド、核酸配列、例えば遺伝子、核酸産物が挙げられる。医薬剤は、個々にスクリーニングされ得る。代替的に、神経活動性、または神経発生に関与する遺伝子の発現を調節する能力について、1つより多くの医薬剤が同時に試験され得る。医薬剤の混合物を試験する場合、記載される方法により選択された医薬剤は、(適切な場合は)別々にされ得、適切な方法(例えばクロマトグラフィー、配列決定、PCR等により同定され得る。
別の局面において、本発明は、本発明の方法により記載され、同定される医薬剤、調節物質または化合物を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、例えば神経発生または神経細胞の機能(1つまたは複数)を調節し得るか、NPC分化および/または増殖を調節し得るか、またはニューロンに対して活性であり得るかもしくはニューロンを調節し得、かつ神経前駆細胞または神経細胞の機能および/または挙動(例えば増殖、分化等)が関与し得る神経系の障害の治療に有用であり得る、本明細書に記載される医薬剤を含み得る。
本発明の方法はさらに、単離された細胞(例えば神経前駆細胞)または適切な培養細胞株を、1つ以上の候補化合物または調節物質と接触させる工程を含む。細胞は、医薬剤の効果、濃度、細胞集団および/または評価技術に依存して種々の時間の間接触され得る。特定の態様において、細胞は、例えば約1nM〜約1mMの範囲の候補化合物(1つまたは複数)に曝露され得る。本願から逸脱することなく、他の濃度が試験され得ることが理解されるはずである。さらに、それぞれの化合物は、いくつかの濃度で並行して試験され得る。さらに、必要な場合は、リポソーム、カチオン性脂質またはポリマー、ペネトラチン(penetratin)、Tat PDT、アデノウイルス由来のペプチド(例えばペントンまたはファイバー)もしくは他のウイルス由来のペプチド等を含む、化合物の細胞への進入を補助する種々のアジュバントおよび/またはベクターおよび/または生成物が添加され得る。接触は、生きたツメガエル属のオタマジャクシの調製物のためのインキュベーションチャンバーなどの任意の適切な支持体またはデバイス中で実施され得る。
本願で公開する方法は、単離された細胞(例えば、神経前駆細胞)または適切な培養された細胞株を、1つ以上の候補化合物または調節物質と接触させる工程をさらに含む。その効果、濃度、細胞集団、および/または評価技術に依存して、細胞を、種々の時間接触させることができる。一般的に、細胞を、1nM〜1mMの範囲の候補化合物(1つまたは複数)に曝露する。他の濃度を本願から逸脱することなく試験し得ることが理解されるはずである。さらに、各化合物を、いくつかの濃度で並行して試験し得る。さらに、必要であれば、化合物が細胞に入り込むのを補助する、リポソーム、カチオン性脂質もしくはポリマー、ペネトラチン、TatPDT、アデノウイルス由来のペプチド(ペントンまたはファイバー)または他のウイルス由来のペプチド等の種々のアジュバントおよび/またはベクターおよび/または生成物を添加できる。
マイクロアレイおよび/または他のゲノム分析技術により生成されたゲノムデータの解析は、オタマジャクシCNS中のNPCの増殖および分化を調節し得る遺伝子を優先させる(prioritize)ために使用され得る。従って、アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド(MO)(Eisen et al., Development 2008, 135(10): 1735-43)は、目的の遺伝子(GOI)に対して生成され得、各GOIは、CNS中のBrdU取り込みを評価するための画像化を使用して、細胞増殖の効果に対するモルホリノ媒介ノックダウンによってスクリーニングされる。細胞増殖を増大または低減するGOIについて、いくつかのインビボアッセイが、視蓋における神経発生の制御におけるその機能を試験するために使用され得る(Nedivi et al, Science 1998, 281: 1863-1866; Ewald et al, J Neurosci 2008, 28(4): 850-61; Cantallopset al., Nat. Neurosci. 2000, 3: 498-503; Javaherian et al., Neuron, 2009 (in press); Van Aelst et al., Curr Opin Neurobiol 2004, 14(3): 297-304; Van Keuren-Jensen et al., Dev Neurobiol 2008, 68(11): 1315-24; Wu et al., Science 1998, 279: 222-226; Cline et al., J Physiol 2008, 586(6): 1509-17)。
本開示は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。以下の実施例は、例示のみのために理解され、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するとして解釈するべきではない。
概観
神経前駆細胞(NPC)の増殖および分化を、インタクトのツメガエル属オタマジャクシ中枢神経系の視覚系においてアッセイした。この実験系は、動物を視覚系刺激に曝露するか、または動物の視覚系刺激を与えない(deprive)ことによって神経活動性を操作できる。結果は、NPCの増殖割合が、12時間光/12時間暗所の条件下で飼育された動物に比べて、視覚刺激を与えられない動物において、増大することを示す。24時間視覚刺激を与えられず、その後、24時間視覚刺激を受けた動物は、視覚経験の非存在下の最初の24時間の間増殖割合が上昇し、その後、新たに生成された細胞の大部分が分化することを示した(図6)。これらのデータは、神経活動性を操作することにより、増殖割合および分化の両方が制御されることを示す:低下した神経活動性により増殖が増加し、増大した神経活動性により、前駆細胞のニューロンへの分化が誘発される。
蛍光タンパク質(FP)を発現するように、インタクトのツメガエル属オタマジャクシ中のNPCをトランスフェクトした。インタクト動物中のFP発現細胞を、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。次いで、画像化の後、動物を、光を通さないチャンバに配置し、その結果、動物は、次の24時間にわたって視覚刺激を受けなかった。FP発現細胞を、再度画像化し、動物をチャンバに配置し、そこで、動物は、24時間視覚刺激を受けた。動物から、三度目の画像を採った。各24時間間隔の間の細胞数の変化および放射状グリア(NPC)またはニューロンとしての細胞の同一性を、それらの形態に従って決定した。24時間あたりの細胞数の変化として、およびNPCまたはニューロンの形態を有する細胞の割合として、データを表した。
視覚経験の非存在下では、細胞数は、24時間の間に、+19.9±5.8%増加した(N=12の蓋が分析された)。動物を24時間の視覚刺激に曝露した後、本発明者らは、細胞数の有意な6.3±5.4%の減少を見いだした(ウィルコクソン符号付(singed)順位検定、p=0.01)。細胞を検出するために使用された蛍光マーカーが、増殖の間のみ発現されるプロモーターにより駆動されるので、この負の割合は、細胞が増殖サイクルを離れたことを示す。視覚経験に曝露されなかった動物の別のセットは、2つの24時間の期間の間で増殖割合に有意な変化がなかったことを示した(N=7の蓋が分析された、p=0.4)。
背景および方法
NPC検出
これらの実験は、分裂細胞におけるタンパク質発現を駆動する、細胞型特異的蛍光レポーター系を利用した(図3参照)。レポーターは、線維芽細胞増殖因子4(FGF4)の上流調節因子(regulatory element)の6つのリピートからなる。生体内の(endogenous)Sox2/oct3転写因子は、FGF4調節因子に結合し、Gal4の発現を駆動(drive)し、該Gal4は、次いで、UAS蛍光タンパク質を駆動する。FGF4、Sox2およびoct3は、各々、増殖細胞中で発現し、生体内のSox2/oct3転写因子に依存して、増殖細胞内でレポーター発現のGal4促進性特異性を駆動する。UAS蛍光タンパク質を別の構築物として発現させ;このレポーターは、このレポーター系に調節性および特異性を付加した。
表1−マイクロアレイ分析を介して同定された目的の遺伝子
第1日に使用した取得設定を、ピクセル値が第3日までに飽和に達することから保護するために使用した。選択した設定を、実験の間ずっと使用した。取得したz−スタックからの3D情報を使用するVolocityソフトウェア(Improvision, Perkin Elmer)を使用し、対象物の強度およびサイズの標準偏差に基づいて、標識された細胞の細胞体を同定し、かつ選択した。次いで、同定した対象物は、実験者が検証し、細胞形態に基づいて細胞型(グリア、ニューロン、または不確定)に帰属させた。各視蓋から、典型的に、15〜45細胞がトランスフェクトされた。24時間あたりの細胞数の変化として、パーセント増殖を計算した。これらの測定を、平均±s.e.m.として報告する。
表2−モルホリノノックダウン実験条件
Sox2レポーター構築物の発現は、放射状グリアが、ツメガエル属視蓋中の主要な神経前駆細胞であることを示した(図4)。分化した細胞は、もはや、Sox2/oct3を産生し、gal4−UAS−Kaede構築物を駆動しないので、ニューロンは、分化後、緑Kaedeを発現し続けなかった。NPC分裂の大部分は、最後の分裂であることが見出された。
アフィジコリン(150μM)およびヒドロキシ尿素(2%DMSO中20mM)を、細胞に加え、細胞分裂をブロックし、これらの細胞の増殖割合を、DMSOのみを受けた対照動物と比較した。この処理は、ツメガエル属の増殖を中断させる(Harris et al., Neuron 1991, 6: 499-515)。DMSOのみに曝露された対照動物において、24時間で16.4±4.2%の細胞数(N=8視蓋)の平均増加が観察された。アフィジコリンおよびヒドロキシ尿素は、細胞増殖をブロックした(細胞数の増加:0.41±6.28%(N=10、p=0.1、マン−ホイットニー;図5参照)。
視覚経験の非存在下では、細胞数は、24時間の間に19.9±5.8%増加した(N=12視蓋)。24時間の視覚刺激に動物を曝露した後、6.3±5.4%の細胞数の有意な減少が見出された(p=0.01)。この負の割合は、細胞が増殖サイクルを離れ、徐々に成長している樹状突起分枝(dendritic arbor)中での赤Kaedeレポーターの希釈により、もはや検出可能ではないことを示す。Kaedeレポーターは、増殖の間のみ発現され、従って、最終的に分化した細胞は、増殖モードの間にレポーターを産生したことのみを示す。24時間の視覚刺激を受けなかった対照動物は、2つの24時間の期間の間で増殖割合に有意な差を示さなかった(10.3±7.2%および−0.6±3.5%;N=12分析された視蓋、p=0.23;図6A)。
脱ヨード酵素ヨードサイロニンIII型は、甲状腺ホルモンの活性形態(T3)からヨウ素を除去しそれを効率的に不活性化する、甲状腺ホルモン経路中の酵素である。マイクロアレイ分析は、Dio3発現が活動中の前駆細胞中で増大したことを示唆した。アフリカツメガエル中のT3レベルは、変態期前では低いが、T3受容体の存在により、NPC中で検出され、T3レベルの相対的変化が増殖に影響し得ることを示唆した。増大した増殖は、変態期のアフリカツメガエルオタマジャクシ中の甲状腺ホルモンの上昇および受容体活性化と相関する(Denver et al., Dev Biol 2009, 326: 155-168)。従って、モルホリノ発現を用いたDio3のノックダウンにより、T3レベルが上昇し、従って、増殖が増大するはずである。
グルタチオンS−トランスフェラーゼπ1(GSTP1)は、多くの疎水性化合物および親電子性化合物と還元グルタチオンとのコンジュゲーションを触媒することにより解毒において重要な役割を果たす、タンパク質のグルタチオンS−トランスフェラーゼファミリーのメンバーである。GST−π1は、癌に対する感受性において役割を果たすと考えられている。GST−π1は、神経前駆細胞中で上方調節されていることが観察され、従って、GST−πのノックダウンは、増殖割合を低減すると予測される。
Fmr1A。脆弱X精神遅滞タンパク質1は、核から細胞質へのmRNAトラフィッキング(trafficking)およびニューロン内の局所タンパク質翻訳を制御すると考えられているmRNA結合タンパク質である。マイクロアレイデータにより、分化したニューロンに比べると、NPC中のFMR1および82kD FMRP相互作用タンパク質、増殖誘導遺伝子1(AKA核脆弱X精神遅滞タンパク質相互作用タンパク質)の発現は低いことが示唆された。ニューロンの増殖におけるFMRPおよび関連するタンパク質の潜在的な役割は、完全には明らかではない。1つの研究により、FMR1が、NPC増殖を増大させ、分化を変更することが示されたが(Castren et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 17834-17839)、別の研究(another)により、FMR1はNPCの分化のみを変更することが示された(Bhattacharyya et al., Stem Cells Dev 2008 17: 107-117)。これらの研究の間の考え得る不一致は、これらの研究の各々が、異なる供給源のインビトロ細胞を使用しているという事実のためであり得る。インビトロ研究は、NPCの増殖におけるFMR1および関連する遺伝子の役割を明確にし得る。
Claims (15)
- a)第1の動物のインタクトの脳領域中の神経前駆細胞を医薬剤と接触させる工程;
b)該第1の動物および第2の対照動物を光刺激に曝露する工程;ならびに
c)該第1の動物における該神経前駆細胞の増殖割合および該第2の動物における神経前駆細胞の増殖割合を測定する工程
を含む方法であって、該神経前駆被検細胞と該神経前駆対照細胞の間の増殖割合の相違により、神経増殖を調節し得る医薬剤として該医薬剤が同定され、該第1の動物および該第2の動物がアフリカツメガエルのオタマジャクシである、方法。 - 該インタクトの脳領域が視蓋を含む、請求項1記載の方法。
- 該インタクトの脳領域が、視覚的入力の処理に関与している、請求項1記載の方法。
- 測定する工程が、該第1の動物および該第2の動物の視蓋中の細胞の数および型を数えることを含む、請求項1記載の方法。
- 該神経前駆細胞を医薬剤と接触させる工程が、該医薬剤を該神経前駆細胞にエレクトロポレートすることを含む、請求項1記載の方法。
- 該医薬剤が、該神経前駆細胞中での1つ以上の遺伝子の発現を調節するのに有効な量である、請求項1記載の方法。
- 該動物を、無光条件下で24時間生育し、次いで、光刺激に24時間曝露する、請求項1記載の方法。
- レポーター構築物を、該神経前駆被検細胞および該神経前駆対照細胞に導入する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 該レポーター構築物が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項8記載の方法。
- 蛍光タンパク質が、該神経前駆被検細胞および該神経前駆対照細胞中で特異的に発現する、請求項9記載の方法。
- 導入する工程が、該レポーター構築物をコードするプラスミドでトランスフェクトすることを含む、請求項8記載の方法。
- 測定する工程が、少なくとも1つの所定の期間の前および後に、細胞の数および型を数えることを含む、請求項1記載の方法。
- 該神経前駆細胞を医薬剤と接触させる工程が、該医薬剤を該神経前駆細胞にエレクトロポレートすることを含む、請求項6記載の方法。
- 該医薬剤が、化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項6記載の方法。
- 該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、siRNA、shRNAおよび/またはモルホリノを含む、請求項14記載の方法。
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