JP2012530502A - 化学物質の毒性を予測する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
ヒトの発生中、毒性傷害を最も受け易い組織には、神経系、肝臓、腎臓、肺、皮膚などがある。したがって、細胞/組織特異的マーカーと共に前駆細胞株を使用するアッセイは、特定の化学物質が毒性であるか否かばかりでなく、細胞/組織が影響を受けるか否かを確認するために役立つであろう。さらに、この特許明細書中に記載されるアプローチは、早期及び後期の細胞分化マーカー(例えば、Nkx2.5及びαMHCはそれぞれ早期及び後期心臓マーカーである)を識別する能力を有するので、追加の能力付与特徴を有している。
幹細胞に関しては多くの公表された特許及び特許出願が存在している。許容される場合、以下に列挙した文献の内容は援用によって本明細書の一部をなす。
上述した通り、冗長で費用のかかる動物試験への復帰なしにヒト発生に対する化学物質の毒性を予測するために使用でき、しかもモデル動物系に頼るよりも綿密にヒト発生を反映する新しいアッセイに対するニーズが存在している。特に、いずれの発生経路及びいずれの組織が化学物質によって影響を受けるかを予測するアッセイに対する未達成のニーズが存在している。
(i)試料中の対照未分化幹細胞集団を作用因子で処理して第1の発生経路中に第1の対照分化細胞集団を生成する段階、
(ii)前記対照未分化幹細胞集団及び/又は前記第1の対照分化細胞集団において発現される2以上のバイオマーカーのレベルを測定して対照発現レベルを決定する段階であって、前記バイオマーカーの1以上は発生経路及び/又は分化の早期ステージで発現され、前記バイオマーカーの1以上は発生経路及び/又は分化の後期ステージで発現される段階、
(iii)前記作用因子で処理する前又は後において、前記試料中の試験未分化幹細胞集団を化学物質に暴露して第1の発生経路中に第1の試験分化細胞集団を生成する段階、
(iv)前記試験未分化幹細胞集団及び/又は前記第1の試験分化細胞集団における前記2以上のバイオマーカーのレベルを測定して試験発現レベルを決定する段階、並びに
(v)前記対照発現レベルを前記試験発現レベルと比較する段階
を含んでなり、前記化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記発生経路に対する化学物質の毒性を表す方法が提供される。
本明細書中で使用される「幹細胞」は、様々な範囲の特殊化細胞タイプに分化する能力によって特徴づけられる細胞として定義される。哺乳動物幹細胞の2つの大別されたタイプには、胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞、及び成体組織中に見出される成体幹細胞がある。発生中の胚では、幹細胞はすべての特殊化胚組織に分化し得る。成体生物では、幹細胞及び前駆細胞は特殊化細胞を補給する身体の修復系として作用するばかりでなく、血液、皮膚又は腸組織のような再生器官の正常な代謝回転も維持する。
幹細胞は、i)インビトロで非限定的に分裂しかつii)各種の成熟細胞タイプに分化する能力によって特徴づけられる未分化細胞である。これらは、全部で3つの胚性胚葉(即ち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉)の細胞タイプを生成し得る多分化能性幹細胞として類別できる。これらには、(生殖隆起から導かれる)胚性始原生殖細胞及び再プログラムされた誘導多分化能性幹細胞がある。成体幹細胞は多能性であって、特定の発生経路に沿って分化する。
[1]Nanog(抗体ab21603)−早期胚並びにマウス及びヒトの胚性幹(ES)細胞及び胚性生殖(EG)細胞を含む多分化能性幹細胞に対して特異的である。
[1]DDX4(抗体ab13840)−卵巣及び睾丸で発現される始原生殖細胞マーカー。
[1]ブラキュリ(抗体ab20680)中胚葉マーカー−中胚葉形成の最も早期の指標。中胚葉分化のマーカーとして使用される。
EED(抗体ab4469)−遺伝子の転写抑制状態の維持に関係するポリコーム(Polycomb)グループファミリー。ES細胞の分化中に発現される。
[1]Ki67(抗体ab833)−Ki67抗原は、活性細胞周期のすべての段階において増殖中の細胞により発現される原型の細胞周期関連核タンパク質である。
i)分化を達成するためのプロトコル、ii)阻害剤の詳細及びiii)心筋細胞マーカー
前駆細胞から心筋細胞への分化は、McBurney, M.W.et al(1982) Nature 299, 165−167、Smith, S.C et al(1987) J.Cell Physiol. 131, 74−84及びPuceat, M. 2008, Methods, 45, 168−171に記載されたもののような、十分に特徴つけられかつ公表されたプロトコルを用いて可能である。これらのプロトコルを用いれば、胚性カルシノーマ細胞及び幹細胞のような多分化能性及び多能性前駆細胞から心筋細胞を生成することが可能である。
P19細胞は、DMSOの存在下で増殖させた場合、インビトロで収縮する心筋細胞に分化するマウス多能性胚性カルシノーマ細胞である[McBurney, M.W.(1993) Int. J. Dev. Biol. 37, 135−140]。この分化は、McBurney, M.W.et al(1982) Nature 299, 165−167及びSmith, S.C et al(1987) J. Cell Physiol. 131, 74−84に記載された方法を用いて達成できる。P19細胞は、ATCC(カタログ番号CRP−1825)から商業的に入手できる。
マウス胚性幹細胞株CGR8、R1及びBS1の分化のためのプロトコルは、Puceat,M. 2008, Methods, 45, 168−171によって以前に記載されている。CGR8及びR1は、それぞれECACC(カタログ番号07032901)及びATCC(カタログ番号SCRC−1011)から商業的に入手できる。BS1細胞株は、Zeineddine,D.et a!., 2006, Dev. Cell 11, 535−546に記載されかつ特性決定された。
マウスHSP25の発現は、P19細胞の心筋細胞分化のために重要である。p38経路によるHSP25のリン酸化は、その機能の一部にとって重要であることが知られている。特異的阻害剤SB203580(10μM)によるp38経路の阻害は、マウスP19細胞から心筋細胞への分化を妨げることが示されている[Davidson,S.M. & Norange,M. (2000) Dev. Biol, 218, 146−160]。この研究では、分化は、単一の心臓マーカー(心臓アクチン)の存在を免疫組織化学によってモニターすると共に、心臓アクチン及び心房ナトリウム排泄ペプチドの発現をRT−PCRによってモニターすることで評価された。
[1]ヒアルロナンシンターゼ1(抗体ab75329)−心臓発生に関係する。
[1]ALPK3(抗体ab57526)−心筋細胞分化で役割を果たす。
[1]Nkx2.5(Abcam社−ab35842)−心筋層及び心内膜の両方で発現される。
[1]心臓トロポニンT抗体(Abcam社−1C11、ab8295)−心筋層のみで発現され、心臓トロポニンTはトロポニン複合体のトロポミオシン結合サブユニットである。
[1]BMP10(抗体ab34962)−心室発生中において心筋細胞の増殖及び成熟を変調する際の必須成分。
[1]サルコメアαアクチニン抗体(Abcam社−EA−53、ab9465)−ACTN2は、骨格筋及び心筋の両方で発現される筋肉特異的なαアクチニンイソフォームをエンコードする。心筋及び骨格筋における筋管の張力繊維中のZ線及びZ点に位置している。
[1]HEY2(抗体ab70133)−哺乳動物の心臓発生の重要な決定子である転写因子。
MEF2A(抗体ab55547)−心筋及び骨格筋の発生に重要な役割を有する。
i)分化を達成するためのプロトコル、ii)阻害剤の詳細及びiii)神経マーカー
前駆細胞から神経系統への分化は、下記に記載されるもののような、十分に特徴つけられかつ公表されたプロトコルを用いて可能である。これらのプロトコルを用いれば、胚性カルシノーマ細胞及び幹細胞のような多分化能性及び多能性前駆細胞からニューロン細胞を生成することが可能である。
Leypoldt F.,et al.,2001(Neurochem. 76, 806−814)によって実施されたNTERA2細胞の神経分化は、簡単に述べれば以下の通りである。5%ウシ胎児血清を補充したOptiMEM(Invitrogen社)培地中において、細胞を37℃及び5%CO2で日常的に維持した。10%ウシ胎児血清を補充した高グルコースDMEM(Invitrogen社)を含む細菌学的皿内において細胞凝集法(1×106細胞/ml)を実施した。一晩後、培地に1μMトランス−レチノイン酸を添加した。培地及び培養皿は3日毎に交換した。レチノイン酸の存在を21日間維持した後、[有糸分裂阻害剤シトシン−D−アラビノフラノシド(10μg/ml)及びウリジン(1μg/ml)を補充した]凝集培地を含む、ポリ−D−リシン及びラミニン(共に10μg/ml)でコートした細胞培養処理皿に細胞凝集物を移した。これらの条件を約7日間継続し、培地は2〜3日毎に交換した。(約4週間続く)この長期プロトコルは、高率のNTERA2細胞をニューロンに効率よく分化させることを容易にする。
無血清限定培地を使用する細胞凝集技法によるEC及びヒトES細胞からの神経球の生成は、NTERA2細胞からラジアルグリア細胞を生成することが示された(Marchal−Vitorion S.,et al., 2003, Cell Neurosci., 24, 198−213)。これはマルチステージプロセスであり、神経球は培地にFGF−2を補充すれば無期限に維持できる。ヒトES細胞を用いれば、FGF−2の除去後に神経球は星状膠細胞、ニューロン及び乏突起膠細胞に分化する(Zhang,S.C.et al.,2001,Nat.Biotechnol.19,1129−1130)。
ES及びEC神経分化の効率を高めようという追加の努力では、他の細胞株(例えば、PA6間質細胞)との共培養が使用された(Scwartz et al., 2005, Stem Cell Dev., 14, 517−534)。著者らは、PA6細胞のコンフルエントな単層上においてNTERA2細胞を(2000細胞/mlで)共培養した。PA6細胞は、10μg/mlのマイトマイシンで不活性化した。共培養物は、前述した分化培地(Leypoldt F.,et al., 2001, Neurochem. 76, 806−814)と同様な分化培地中に維持した。22日後、86%のNTERA2ニューロンにおいてチロシンヒドロラーゼを検出したが、これは成熟したドーパミン作動性表現型の存在を表していた。分化過程を容易にする因子がまだ完全には特徴づけられていないので、PA6間質細胞調整培地の使用はドーパミン作動性表現型を生成するのにあまり効果的でないことが示された。
他の神経分化方法は、単層中におけるヒトES細胞の分化に基づいていた(Gerrard,L.,et al.,2005,Stem Cell,23,1234−1241)。これらの研究は、BMP阻害剤ノギンをES細胞培養物に添加すると神経前駆細胞の生成が生じることを示した。かかる方法では、FGF−2(20ng/ml)を補充したマウス胚性線維芽細胞調整培地中においてMatrigel(商標)(BD Biosciences社)上でES細胞を増殖させた。神経分化のためには、コンフルエントなES細胞を、100ng/mlのノギンを補充したN2B27神経分化培地(Invitrogen社)中で培養した。継代3で細胞を単一細胞に解離させ、FGF−2を補充したN2B27中で培養した。このプロトコルは、約97%の細胞が神経マーカームサシを発現する神経前駆細胞の生成をもたらした。N2B27処理細胞をポリ−L−リシン/ラミニンでコートした皿上に播種し、ソニックヘッジホッグ(300ng/ml)、FGF−8(100ng/ml)及びアスコルビン酸(160μM)を補充したN2B27培地中で2週間培養することで、チロシンヒドロラーゼを発現するニューロン及び神経前駆細胞が生成された。2週間後、ソニックヘッジホッグを除去し、BDNF(20ng/ml)、GDNF(20ng/ml)、アスコルビン酸(160μM)及びラミニン(500ng/ml)で置換した。
NTERA2細胞を37℃及び空気中10%CO2で増殖培地(DMEM、4.5g/lグルコース及び10%v/vウシ胎児血清)中に維持する。NTERA2細胞を分化培地(10μMレチノイン酸を補充した増殖培地)中に75cm2フラスコ当たり1×106細胞で播種する。NTERA2細胞は2〜3日以内に神経分化を受け、約10日後にニューロンが現れる。
対数増殖しているES細胞を胚様体(EB)培地(ノックアウトDMEM、20%ノックアウト血清リプレースメント、1%非必須アミノ酸、1mM β−メルカプトエタノール及び1mMグルタミン)中に再懸濁し、細胞付着を防止するための100mm Corning Ultra低結合細胞培養皿又は細菌培養皿内において37℃及び空気中5%CO2で培養する。培地は1日置きに交換する。懸濁状態で約21日後、分化したEBが現れる。これらをEB培地中のゼラチンコート表面上に25cm2当たり50の胚様体密度でプレーティングする。再プレーティングから約24時間後、付着した胚様体からの成長物として神経分化が見られる。
コンフルエントなES細胞をEB培地中に再懸濁し、25cm2細胞培養フラスコ内において37℃及び空気中5%CO2で4日間培養する。培地は毎日交換する。約4日後、DMEM/F12、N2サプリメント、FGF−2(20ng/ml)、インスリン(20μg/ml)及びヘパリン硫酸ナトリウム塩(2μg/ml)からなる神経球培地中にEBを入れ、ゼラチンでコートした25cm2フラスコ内にプレーティングする。培地は1日置きに交換する。約10日後、神経ロゼットが見られる。バチルス由来の神経メタロプロテアーゼDispase(商標)(100μg/ml、Invitrogen社)を用いて脱凝集した神経ロゼットを分離し、これらを神経球培地中に再懸濁し、DMEM/F12でコートしたフラスコ内において1%アガロース上に分配する。神経球を5日毎に新鮮な神経球培地で処理し、2〜3週間毎に継代培養する。分化試験のためには、神経球を神経球培地中においてゼラチンでコートしたフラスコ上に播種し、数回の継代後には神経球由来の細胞が培養物中において最も優勢な細胞タイプになる。これらの細胞は、通常、Musashi 1及びネスチンのような早期神経マーカーに対して陽性である。次いで、上記に略述された方法、即ちMarchal−Vitorion S., et al.,2003,(Cell Neurosci., 24, 198−213)及びZhang,S.C.et al., 2001,(Nat. Biotechnol. 19, 1129−1130)の方を用いて神経球を効率的に分化させることができる。
[1]アデノシンジアルデヒド
S−アデノシルメチオニン(AdoMet)は、DNAメチル化を含む広範囲の生物学的メチル化反応用の普遍的なメチル供与体である。遺伝子はCpG部位のメチル化によって転写的に不活性化することができ、これは時には細胞分化過程に関連する。例えば、神経分化はステージ特異的な遺伝子活性を制御する遺伝的プログラムのカスケートを要求する。これらの活性は、転写レベルばかりでなく、DNAメチル化を含む後成的修飾によっても制御される。
ガングリオシドは神経発生に関係していた。P19 EC細胞に関するインビトロニューロン分化モデルを用いて、Liour S.S.& Yu R.K.,2002,(Neurochemical Res. 27, 1507−1512)は、ガングリオシド生合成阻害剤であるD−テオ−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール(D−PDMP)が神経突起の成長を阻害し、結局はP19由来ニューロンの死を引き起こすことを証明した。
インドカルバゾスタチンA、B、C及びDは、Streptomyces種によって生成され、すべてがラットPC12細胞のNGF誘導ニューロン分化の阻害剤であることが証明されている(Matsuura N et al. 2002, J. Antibiotics 55, 355−362及びFeng, Y.et al., J. Antibiotics 57. 627−633)。簡単に述べれば、0.35%グルコース、10%ウシ胎児血清及び10%ウマ血清を補充したDMEM中でPC12細胞を増殖させた。PC12細胞を96ウェルのコラーゲンタイプ1でコートしたプレートのウェル中にプレーティングした。12時間後、インドカルバゾスタチンを添加し、12時間後にNGFを添加した。神経突起の生成を観察することでニューロン分化をモニターした。
ラットPC12細胞のNGF誘導ニューロン分化のインドカルバゾスタチン仲介阻害に関して上記に記載したものと同様な実験において、インドロカルバゾールK−252a及びbも神経分化の有効な阻害剤であることが証明された(Matsuura N et al. 2002, J. Antibiotics 55, 355−362)。これらの化合物は、明らかに、p140 trkチロシンキナーゼNGF受容体を阻害することで神経突起伸長の阻害を仲介する。
PD98059は、MAPK/ERKキナーゼ1(MAPキナーゼキナーゼ1又はMEK1)の強力な細胞透過性かつ選択的阻害剤である。それはMEK1の活性化を阻止し、したがってそれに続くMAPキナーゼのリン酸化及び活性化を阻害する。Pang, L.et al., 1995(J. Biol. Chem. 270, 13585−13588)は、PD98059が細胞生存度に影響を及ぼすことなしにPC12細胞におけるNGF誘導神経突起形成を完全に阻止することを証明した。これは、MAPキナーゼ経路がPC−12細胞におけるNGF誘導ニューロン分化のために決定的に重要であるように思われることを示している。
置換ピラゾロキナゾリノンPD90780はNGFと相互作用し、それによってp140 trkチロシンキナーゼNGF受容体及び共通ニューロトロフィン受容体p75NTRに対するそれの結合を妨げる。NGFの結合を阻害することは、PC12細胞のNGFニューロン分化を阻止する(Spiegel K et al. 1995 Biochem. Biophys Res Commun. 217, 488−494)。
AG−879は、チルホスチン(tyrphostin)ファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤の一員である。それは、EGF又はPDGF受容体のリン酸化を阻害することなく、p140 trkチロシンキナーゼNGF受容体の自己リン酸化を選択的に阻害する(IC50=10μM)。上記の化学物質と同じく、AG−879はPC12細胞におけるNGF誘導神経突起成長も阻害する(Ohmichi M et al. 1993, Biochemistry 4, 32 4650−4658)。
[1]アグリカンARCxx(抗体BC−3、ab3773)−神経前駆細胞で検出される。
[1]BRN3A(抗体ab30880)−ニューロン遺伝子の調節に関係する転写因子。
[1]ニューロゲニン1(抗体ab66498)−明確な前駆細胞集団で発現される転写因子。それはニューロン発生及び分化を調節する。
[1]星状膠細胞(抗体10E4/R5、ab3268)−星状膠細胞マーカー。
ABCA1抗体(HJ1、ab66217)及びABCA7抗体(7A1−144、ab48265)
ALDH1L1抗体(ab56777)
トロンボスポンジン抗体(A4.1、ab3131)
グリア細胞及び小グリア細胞−早期マーカー
[1]CNTF(抗体4−68、ab78269)−CNS及びPNS内のグリア細胞で発現される。CNTFは各種の神経細胞タイプの分化を刺激する。
[1]cCD11b(抗体ab8879)−神経組織で小グリア細胞マーカーとして常用されている。
[1]L1CAM(抗体2C2、ab24345)−神経外胚葉組織で発現される。軸索成長、神経移動及びニューロン分化の仲介に関与する。
[1]PTPζ(抗体ab78019)−脳で発生的に調節され、CNSで発現される。そこでは、小脳のプルキンエ細胞層、歯状回、及び側脳室の前角の上衣下層に局在している。
[1]PROX1(抗体ab57746)−CNSの早期発生において基本的な役割を果たす。それは、有糸分裂後で未分化の若いニューロンの遺伝子発現及び発生を調節する。
[1]NNPTX2(抗体ab69858)−興奮性シナプス形成で役割を果たすニューロンの即時初期遺伝子。
[1]SIRP(抗体OX−41、ab9295)−骨髄細胞及びニューロンによって発現される。
[1]SynGAP(抗体EPR2883Y、ab77235)−もっぱら海馬ニューロンのシナプスで発現される。
[1]シナプトポジン(抗体ab50485)−終脳ニューロンのスパイン装置の形成のために不可欠である。シナプス可塑性に関係している。
[1]PITX3(抗体ab30734)−この転写因子はドーパミン作動性ニューロンの分化を調節する。
[1]チロシンヒドロキシラーゼ(抗体185、ab10372)ニューロンマーカー−THはアドレナリン作動性ニューロンの生理学において役割を有し、ドーパミン作動性ニューロンに対するマーカーとして常用される。
[1]コリンアセチルトランスフェラーゼ(抗体ab54599)−末梢神経系及び中枢神経系の両方においてコリン作動性ニューロンに対する特異的マーカーとして役立つ。
[1]シンタキシン及び2(抗体4H256、それぞれab18010及びab12369)−感覚ニューロン及び小血管に達する神経の末端に局在するニューロンシンタキシン。
[1]ペリフェリン(抗体2Q135、ab17999)侵害受容(痛覚)ニューロンマーカー−末梢神経節のニューロン及びその突起に見出される。
[1]イスレット1(抗体ab20670)神経幹細胞マーカー−神経管運動ニューロン分化及び膵島細胞の胚形成において役割を果たす転写因子。
[1]Emx1(抗体ab32925)−錐体ニューロンで特異的に発現されるホメオボックス遺伝子。Emx1は、錐体ニューロン及び錐体細胞系統の信頼できるマーカーである。
[1]ヒッポカルシン(抗体ab24560)−CNSに限定され、海馬CA1領域の錐体細胞に最も豊富である。
[1]A2B5(抗体2Q162、ab68385)−発生中の乏突起膠細胞前駆細胞神経内分泌細胞で発現される細胞表面ガングリオシドエピトープ。
[1]ソルチリン(抗体ab16640)−脳、脊髄及び筋肉で発現される。ソルチリンは、ニューロテンシンに対する受容体として作用する。ソルチリンは胚形成中に発現される。
[1]ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質(抗体F3−87−8、ab24022)−MOGは、ミエリン化中の乏突起膠細胞の表面に見出される。
クロモグラニンA(抗体23A1、ab36997)−神経内分泌細胞で発現される。
[1]ニューロフィラメントは、ニューロン軸索、交感神経節細胞及び樹状突起の主構造要素をなしている。
200kDニューロフィラメント重鎖(抗体ab8135)。
160kDニューロフィラメント中鎖(抗体3H11、ab7256)。
145kDニューロフィラメント(抗体2E30、ab35953)。
68kDニューロフィラメント(抗体DA2、ab4572)。
[1]NGF受容体(抗体MLR2、ab61425)−シュワン細胞及びニューロンで発現される。発生中、NGFRはニューロン成長、移動、分化及び細胞死を調節する。
Arg3.1(抗体ab23382)−脳内に富化された即時早期遺伝子であって、発現はニューロン活性によって誘導される。海馬、扁桃、視床下部、線条及び皮質中の樹状突起で発現される。
[1]PRIMS3(抗体ab50198)−ニューロン樹状突起及びシナプス後膜肥厚に局在している。
濾胞樹状細胞マーカー(抗体ab8138)。
樹状細胞抗体(抗体ab8171)。
[1]CRMP1(抗体ab76995)、CRMP2(抗体ab54546)、CRMP5(抗体ab77158)−コラプシン応答メディエータータンパク質は、神経分化並びに神経発生中の軸索及び成長円錐誘導に関与する。
[1]アグリン(抗体AGR131、ab12362)−神経筋接合部における発生中のニコチン性アセチルコリン受容体(及びその他)のクラスタリングを促進する。
[1]ALK(抗体ALKc、ab650)−ALKは神経系中に見出され、前脳ニューロンで発現される。
シンテニン(抗体ab19903)−ニューロンにおける発生プロファイルを調節し、激しい成長及びシナプス形成の期間に最も豊富である。
[1]EAAT2(抗体ab77039)−グルタミン酸塩のシナプス後作用を終わらせるために不可欠である。
[1]MEF2A(抗体ab55547)−シナプス形成全体を通じて小脳皮質の顆粒化ニューロン中に豊富である。また、心臓及び骨格筋発生においても重要な役割を有する。
i)分化を達成するためのプロトコル、ii)阻害剤の詳細及びiii)脂肪細胞マーカー
前駆細胞から脂肪細胞への分化は、Dani C et al(1997) J. Cell Sci 110, 1279−1285に記載されたもののような、十分に特徴つけられかつ公表されたプロトコルを用いて可能である。このプロトコル及び関連するプロトコルを用いれば、多分化能性及び多能性前駆幹細胞から脂肪細胞を生成することが可能である。
Dani C et al(1997)J. Cell Sci 110, 1279−1285は、マウス胚性幹細胞株ZIN40、E14TG2a及びCGR8を用いて脂肪細胞を生成した。簡単に述べれば、この方法は、ゼラチンでコートしたプレート上において、未分化細胞株を培養培地(0.25%重炭酸ナトリウム、×1 MEM必須アミノ酸、2mMグルタミン、1mMピルビン酸塩、100μMメルカプトエタノール及び10%v/vウシ胎児血清を含むMEM/BHK21培地)中で無フィーダー条件下で培養することを含んでいた。分化を阻害するために白血病抑制因子(100単位/ml)を添加した。ES細胞を脂肪細胞に分化させるためには、細胞を胚様体中の凝集物として培養した。各懸滴は20μlの培養培地中に1000個の細胞を含んでいた。これらを、PBSを満たした細菌学的プレートの蓋上に2日間維持した。形成された胚様体を、レチノイン酸(0.1%v/v)を補充した培養培地中に再懸濁し、細菌学的プレートの蓋上に維持した。胚様体を数日間維持し、次いでゼラチンでコートしたプレート上に沈降させ、85nMインスリン、2nMトリヨードチロニン及び10%ウシ胎児血清を補充した培養培地からなる分化培地中に再懸濁した。
[1]ERKシグナリング阻害剤
細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)は、細胞増殖及び分化のような多数の細胞機能を調節するシグナリングカスケードに関与している。PPARγのERK仲介リン酸化は、明らかに脂肪生成を阻害する。PD98059はMEK1(ERK活性化を引き起こす酵素)の特異的阻害剤である。発生中のES細胞をレチノイン酸及びPD98059で共処理すれば、脂肪細胞形成及びES細胞における脂肪生成マーカーの発現が共に妨げられる(Bost F.,et al., 2002, Biochme J., 361, 621−627)。
HIVプロテアーゼ阻害剤を用いる療法は、脂肪代謝の変化に関連している。Lenhard,J.M.,et al(2000)Antiviral Res.,47,121−129は、C3H10T1/2間葉幹細胞を用いて脂肪細胞分化に対するこれらの阻害の効果を研究した。これらの細胞では、脂肪生成は200nMのインスリン並びに1μMのPPARγとRXRアゴニストBRL49653及びLGD1069をそれぞれ添加することで誘導された。
脂肪生成経路に対する幹細胞の拘束に関与するシグナリングイベントは、まだ完全には特徴づけられていない。最近、Mointeiro,M.C,et al(2009)Stem Cells Dev.,18,457−463は、マウス胚性幹細胞及びレチノイン酸の早期処理を用いて、レチノイン酸の活性化は脂肪細胞分化に対するES細胞の拘束にとって必要かつ十分であることを示した。著者らはまた、ES細胞におけるレチノイン酸受容体β誘導脂肪生成がGSK3阻害剤によって阻止し得ることも証明した。
C20orf3(抗体ab69162)−脂肪細胞分化に関与している。
レプチン(抗体ab3583)−脂肪細胞はレプチンを産生して分泌する。
検出及び定量化
細胞イメージング
セルイメージャー(例えば、IN Cell Analyzer、GE Healthcare社)を多重化モードで使用すれば、様々な特異的抗体に係留された様々な蛍光体(例えばシアニン色素、GE Healthcare社)を検出することができる。これらの蛍光体を用いることで、ESが特定の経路に沿って分化を受けるのに従い、複数の標的分子が検出及び測定される。このように機器を使用することで、定量的免疫細胞化学を用いて同一試料からの最大3種のマーカーに対する毒性化学物質の効果を測定し、かくして該化学物質の毒性プロファイルを作成することができる。さらに、この文書に記載された方法は、当業者にとって公知の技法(例えば、定量的免疫細胞化学、レポーター遺伝子アッセイ、RT−PCT及びマイクロアレイ分析)を用いて早期及び後期胚性幹細胞選択的バイオマーカーを識別するという追加の特徴を有している。
15 バイオマーカー
20 化学物質
30 刺激又は作用因子
40 分化細胞
45 バイオマーカー
47 バイオマーカー
Claims (19)
- 試料中の発生経路に対する化学物質の毒性を予測する方法であって、
(i)試料中の対照未分化幹細胞集団を作用因子で処理して第1の発生経路中に第1の対照分化細胞集団を生成する段階、
(ii)前記対照未分化幹細胞集団及び/又は前記第1の対照分化細胞集団において発現される2以上のバイオマーカーのレベルを測定して対照発現レベルを決定する段階であって、前記バイオマーカーの1以上は発生経路及び/又は分化の早期ステージで発現され、前記バイオマーカーの1以上は発生経路及び/又は分化の後期ステージで発現される段階、
(iii)前記作用因子で処理する前又は後において、前記試料中の試験未分化幹細胞集団を化学物質に暴露して第1の発生経路中に第1の試験分化細胞集団を生成する段階、
(iv)前記試験未分化幹細胞集団及び/又は前記第1の試験分化細胞集団における前記2以上のバイオマーカーのレベルを測定して試験発現レベルを決定する段階、並びに
(v)前記対照発現レベルを前記試験発現レベルと比較する段階
を含んでなり、前記化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記発生経路に対する化学物質の毒性を表す、方法。 - 段階(i)が未分化幹細胞集団を作用因子で処理してn番目の発生経路中にn番目の分化細胞集団を生成する段階を含み、次いで段階(ii)〜(v)を繰り返して前記n番目の集団における対照発現レベルと試験発現レベルとの差を決定し、化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記n番目の発生経路に対する化学物質の毒性を表す、請求項1記載の方法。
- 前記第1の発生経路及び前記n番目の発生経路がネットワーク化された発生経路である、請求項2記載の方法。
- 段階(i)が未分化幹細胞集団を作用因子で処理して複数の発生経路中に複数の分化細胞集団を生成する段階を含み、次いで段階(ii)〜(v)を繰り返して前記複数の集団における対照発現レベルと試験発現レベルとの差を決定し、化学物質への暴露後における発現レベルの差が前記複数の発生経路に対する化学物質の毒性を表す、請求項1記載の方法。
- 前記複数の発生経路がネットワーク化された発生経路である、請求項4記載の方法。
- 前記幹細胞が多分化能性幹細胞である、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 前記多分化能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項6記載の方法。
- 多分化能性幹細胞が誘導多分化能性幹細胞である、請求項7記載の方法。
- 多分化能性幹細胞が始原生殖細胞である、請求項7記載の方法。
- 前記幹細胞が成体幹細胞である、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 幹細胞がヒト幹細胞である、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
- 未分化幹細胞が2以上のバイオマーカーと機能的に連結した相異なるレポーター遺伝子を含み、2以上のバイオマーカーのレベルが相異なる遺伝子産物の測定によって定量化される、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、ニトロレダクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ及び蛍光タンパク質レポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項12記載の方法。
- 2以上のバイオマーカーのレベルが、定量的RT−PCR、定量的免疫細胞化学、表面プラズモン共鳴及びマイクロアレイ分析からなる群から選択される方法によって定量化される、請求項1乃至請求項13のいずれか1項記載の方法。
- さらに、段階(iii)後に細胞増殖を測定する段階を含む、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- 当該方法が多重方法である、請求項1乃至請求項15のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1乃至請求項のいずれか1項記載の方法を用いて、ヒト胎児発生中における細胞バイオマップ又は発生経路の変化を予測する方法。
- 請求項1乃至請求項17のいずれか1項記載の方法を実施するためのキットであって、2以上のバイオマーカーを定量化するための手段及び前記方法を実施するための取扱説明書を含んでなるキット。
- 前記手段が、抗体、酵素基質及びオリゴヌクレオチドプライマーからなる群から選択される、請求項18記載のキット。
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