JP5721111B2 - 幹細胞の培地及び培養方法 - Google Patents
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Description
ci. 24, 3480-3488 (2004))があるものの、ROCKの阻害がアポトーシスを促進するという報告(Rattanら, J. NeurosciRes. 83, 243-255 (2006) 及びSvobodaら, Dev Dyn.229, 579-590 (2004))もあり、アポトーシス制御におけるRho/ROCKの役割は未だ確立されていない(Rientoら, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446-456 (2003))。
〔1〕培地中で幹細胞をROCK阻害剤で処理する工程を含む、幹細胞の培養方法;
〔2〕幹細胞が胚性幹細胞である、上記〔1〕の方法;
〔3〕幹細胞が霊長類幹細胞である、上記〔1〕又は〔2〕の方法。
〔4〕幹細胞がヒト幹細胞である、上記〔3〕の方法;
〔5〕幹細胞が分散している、上記〔1〕〜〔4〕のいずれかの方法;
〔6〕分散した幹細胞が、単一細胞であるか、又は凝集した幹細胞(即ち、細胞塊を形成している細胞)である、上記〔5〕の方法;
〔7〕幹細胞を分散させる工程、並びに幹細胞をROCK阻害剤で処理する工程を含む、上記〔1〕〜〔6〕のいずれかの方法;
〔8〕幹細胞の分散前に、幹細胞をROCK阻害剤で処理する、上記〔7〕記載の方法;
〔9〕幹細胞の分散後に、幹細胞をROCK阻害剤で処理する、上記〔7〕又は〔8〕記載の方法;
〔10〕ROCK阻害剤が、Y−27632、Fasudil又はH−1152である、上記〔1〕〜〔9〕のいずれかの方法;
〔11〕細胞を接着培養又は浮遊培養で培養する、上記〔1〕〜〔10〕のいずれかの方法;
〔12〕培養方法が継代培養又は分化誘導培養である、上記〔1〕〜〔11〕のいずれかの方法;
〔13〕(a)幹細胞の純化又はクローン化、(b)幹細胞の遺伝子改変株の製造、あるいは(c)浮遊培養による神経細胞の製造のために用いられる、上記〔1〕〜〔12〕のいずれかの方法;
〔14〕神経細胞が前脳神経細胞である、上記〔13〕の方法;
〔15〕ROCK阻害剤の存在下において幹細胞を培養することを含む、生存率及び/又は増殖能が改善された幹細胞あるいは分化効率が向上した幹細胞からの分化細胞の製造方法;
〔16〕幹細胞をROCK阻害剤で処理する方法;
〔17〕幹細胞及びROCK阻害剤を含む、細胞調製物;
〔18〕幹細胞が分散している、上記〔17〕の細胞調製物;
〔19〕ROCK阻害剤を含む、幹細胞の培地;
〔20〕ROCK阻害剤を含む無血清培地;並びに
〔21〕幹細胞及びROCK阻害剤を培地中に含む、培養系。
−培養物中で、必要に応じてフィーダー上で、多分化能性状態でES細胞を維持すること;
−少なくとも1度、ES細胞を継代すること;
−培地がフィーダー、血清及び血清抽出物を含まないように、培地から血清又は血清抽出物(存在する場合)を除去すること並びにフィーダー(存在する場合)を除去すること;並びに
−その後、ROCK阻害剤の存在下で、多分化能性状態でES細胞を維持すること。
−選択マーカーをコードするコンストラクトで、ES細胞をトランスフェクトする工程;
−ES細胞を蒔く工程;
−ROCK阻害剤の存在下でES細胞を培養する工程;及び
−選択マーカーを発現する細胞を選択する工程。
本明細書に記載した実験に用いたヒト胚性幹細胞は、京都大学再生医科学研究所中辻憲夫研究室で樹立したヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞(KhES−1、KhES−2及びKhES−3)を、ヒト胚性幹細胞に関する政府指針に従い分与を受け、使用した(主にKhES-1)。中辻研究室の方法(Suemoriら, Biochem Biophys Res Commun. 345, 926-32 (2006))に従い、細胞のフィーダー層としてマウス胎児線維芽細胞(マイトマイシン処理で不活化、MEF)を蒔いたプラスチック培養皿の上で未分化ヒト胚性幹細胞を培養した。より具体的には、培養液は、D−MEMF12(Sigma D6421)に最終濃度20%のKSR(Invitrogen/Gibco-BRL)、1×NEAA(非必須アミノ酸;Invitrogen/GibcoBRL)、2mM L−グルタミン酸及び0.1mM 2−メルカプトエタノールを添加したものを用いて、37℃、5% CO2下で培養した。植え継ぎは3−4日毎に行い、解離液(リン酸バッファー緩衝生理学的食塩水に0.25%トリプシン、1mg/mlコラゲナーゼIV液、1mM CaCl2を添加したもの;全てInvtrogen/Gibco-BRL)を用いて、ES細胞をフィーダー層から解離し、ピペッティングで小細胞塊(約50−100個)に分散した後、前日にMEFを播種し形成させたフィーダー層の上に蒔いた。
6日間培養後、ROCK阻害剤を使用しなかった場合、クローン化効率(最初に播種したヒト胚性幹細胞数に対する形成コロニー数の割合)は1%であったのに対し、ROCK阻害剤処理をしたものは27%であった。ROCK阻害剤処理によって形成されたコロニー中の細胞は、未分化胚性幹細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼやOct3/4を発現していた。クローン化効率に対するROCK阻害剤の優れた効果は、ヒト胚性幹細胞としてKhES-1を用いた場合のみならず、KhES−2及びKhES−3を用いた場合においても確認された。
ヒト胚性幹細胞は実施例1のように細胞小塊の植え継ぎで維持培養した。
ヒト胚性幹細胞を分散/インキュベーション後、15〜30分の間に顕著なRhoの活性化が認められた。
維持培養におけるヒト胚性幹細胞のクローン化効率に対する他のROCK阻害剤の効果を、実施例1に記載の方法を用いて検証した。ROCK阻害剤、Fasudil/HA1077(10μM)及びH−1152(200nM)を用いた。また、比較のため、他のキナーゼに対する阻害剤を用いた。他のキナーゼに対する阻害剤としては、プロテインキナーゼA阻害剤であるcAMP−Rp(1−100μM)及びKT5720(5−500nM);プロテインキナーゼC阻害剤であるビスインドリルマレイミド(0.01−5μM)及びスタウロスポリン(1〜50nM);MAPK阻害剤であるPD98059(0.5〜50μM);PI3K阻害剤であるLY294002(1〜50μM)、並びにMLCK阻害剤であるML−7(0.3〜30μM)を用いた。
ROCK阻害剤(Fasudil/HA1077及びH−1152)を用いた場合は、阻害剤を用いなかった場合と比較して、クローン化効率における有意な増強が観察されたが、他のキナーゼに対する阻害剤を用いた場合には、そのような増強は観察されなかった。
実施例1と同様に、維持培養に供されたヒトES細胞をフィーダー細胞から小細胞塊として分離し、さらに残存フィーダー細胞を除去後に、トリプシン消化によって単一細胞に分散した。遠心分離後に2×105細胞を分化誘導後用の無血清培養液(Watanabeら,Nature Neuroscience 8,288-296,2005;G−MEM、KSR及び2−メルカプトエタノールを添加したもの。KSRは20%の濃度で添加。)に分散した。単一分散したヒトES細胞(1.0×105細胞/ml)を、非細胞接着性の35mm培養プレートにおいて浮遊培養させることで、凝集塊を形成させ、同培養液で2〜6日間培養した(SFEB法;上記のWatanabeらを参照)。2日間培養後に、TUNEL法(MEBSTAIN Apoptosis kit Direct,MBL)によりアポトーシス細胞の割合を測定した。ROCK阻害剤Y−27632は、実施例1と同様に、細胞を分離する1時間前から処理を開始し、分散後も維持培養液に添加した。比較として、アポトーシス抑制効果の報告のあるカスパーゼ阻害剤(ZVAD;10μM)とBDNF/NT−3/NT−4(各50ng/mlの混合)を用いて実験を行った。さらに、それぞれの場合の6日後の生存細胞数を計測した。
2日間培養後、無添加対照の場合、TUNEL法で80%の細胞においてアポトーシスが認められた。ROCK阻害剤処理した細胞では、9%の細胞においてのみTUNEL陽性であった。一方、カスパーゼ阻害剤(ZVAD;10μM)あるいはBDNF/NT−3/NT−4(各50ng/ml)の添加でTUNEL陽性細胞がそれぞれ72%、69%であった。これらの結果は、ROCK阻害剤が強い細胞死抑制活性を有することを示す。それに呼応して、6日後の生存細胞数については、無添加群では分散培養開始時の8%であったが、ROCK阻害剤処理した群では70%が生存し、多くの細胞が生存していた。カスパーゼ阻害剤処理、あるいはBDNF/NT−3/NT−4処理では、生存細胞はいずれも、播種した細胞数の10%未満であった。
実施例4と同様に、維持培養を行ったヒトES細胞をフィーダー細胞から小細胞塊として分離し、さらに残存フィーダー細胞を除去後に、トリプシン消化によって単一細胞に分散した。遠心分離後に分化誘導培養液に2×105細胞/mlで細胞を分散し、非細胞接着性の培養プレートを用いて浮遊培養させることで、浮遊凝集塊の無血清培養(SFEB法)を行った。さらに分化誘導培養開始後の最初の10日間はNodal阻害剤のLefty A(1μg/ml、R&D)、Wnt阻害剤のDkk1(500ng/ml、R&D)及びBMP阻害剤の可溶性BMPR1A−Fc(1.5μg/ml、R&D)を添加した。16〜35日間の無血清浮遊培養後、細胞塊を固定し、蛍光抗体法で免疫染色を行った。ROCK阻害剤Y−27632は実施例1と同様に、細胞を分離する1時間前から処理を開始し、分散後もまた維持培養液に最初の6日間添加した。
分化培養開始20日後に、ROCK阻害剤処理したほぼ全ての細胞塊で神経前駆細胞マーカーのネスチン及びPax6陽性細胞が出現した。分化培養24日後には、これらの陽性細胞数は増加し、約80%の細胞がPax6陽性細胞となった。一方、未分化状態ES細胞マーカーであるOct3/4陽性細胞は10%未満であった。分化培養35日後では、約60%の細胞塊で大脳前駆細胞マーカーであるBf1陽性が多数存在していた。このことは、ヒトES細胞から大脳神経組織が産生されたことを示す。ROCK阻害剤処理しなかった場合、分化培養7日後では生存細胞は殆ど存在しなかった。
マウス胎児線維芽細胞(MEF)などのフィーダー細胞を用いない無フィーダー細胞培養でも、ROCK阻害剤処理によりヒトES細胞の単一分散培養が可能かを実証するために、既知の文献(Xu C-H et al., Nature Biotechnol.19, 971-974 (2001))の方法に従って、MEFにより調製した細胞外マトリクス上でヒトES細胞を培養した。具体的には、上記文献に従い、コンフルエントに培養したMEF細胞を培養ディッシュ上でデオキシコール酸法により溶解し、細胞外マトリクスのみ残した。その上に、単一分散したヒトES細胞(96ウェルプレートの1ウェルあたり500個)を通常のMEF細胞上での培養と同様の手法(前記の実施例)でY−27632処理下(10μM又は0μM)に播種した。培養液には、ヒトES細胞維持培地をMEFと予め一日間培養した馴化培地(conditioned medium)を用いた。5日後に形成したヒトES細胞コロニー数を計測した。
Y−27632処理群では播種したヒトES細胞あたり10.2%と高いクローン化効率を認めた。一方、Y−27632未処理群では、0.2%未満のクローン化効率であった。また、Y−27632処理群で形成されたコロニーは未分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ強陽性であった。これらの所見は、ROCK阻害剤がフィーダー細胞ではなく、直接ヒトES細胞に作用しコロニー形成を促進したことを示す。さらに、フィーダー細胞との共培養を用いなくとも、適切に調製した細胞外マトリクス上で、液性因子(例、馴化培地に含まれるもの)の存在下にヒトES細胞を培養する場合、ROCK阻害剤によりヒトES細胞の単一分散培養が可能であることが実証された。
単一分散ヒトES細胞の維持培養に関し、Y−27632が分散培養早期の細胞生存を促進するかを検討するために、Y−27632の処理時間を下記の3つの群に分けて、維持培養における細胞生存の促進効果を比較した。
第1群:ヒトES細胞の分散培養過程でY−27632処理(10μM、以下同様)を前処理1時間及び分散後の培養の最初12時間のみ行ったもの。
第2群:ヒトES細胞の分散培養過程でY−27632処理を前処理1時間及び分散後の全培養期間行ったもの。
第3群:Y−27632処理を全く行わなかったもの。
Y−27632未処理の第3群は、3日後には、播種した全細胞数のうち1%以下の細胞しか生存しなかった。一方、Y−27632を分散後12時間処理した第1群では、播種細胞数の270%の細胞数を計測し;Y−27632を持続処理した第2群では、播種細胞数の290%の細胞数を計測した。これらの結果は、接着培養によるヒトES細胞の維持培養では、Y−27632処理は分散培養開始後最初の半日で十分高い促進効果を有することを示す。
上記の実施例7と同様の実験で、第1群、第2群について、培養期間を6日間に延長し、分散培養開始後6日間の細胞増殖に対するY−27632の効果を調べた。
6日後における細胞数は、第1群で当初の播種細胞数の670%に、第2群では860%にそれぞれ増加していた。分散培養開始後2日から6日間の間の細胞数をもとにした集団倍加時間は第1群で49.0時間、第2群で41.5時間であり;第2群では倍加時間が半分に短縮していた。なお、第1群、第2群の双方において、3日及び5日の段階でのアポトーシスの比率(活性型カスパーゼ3陽性細胞率)は全細胞の1%未満であった。これらの結果は、Y−27632が、分散培養開始直後に細胞生存支持活性を有することに加え、その後生存した細胞に対する細胞増殖促進活性をも有することを示す。
Claims (57)
- ヒト多分化能性幹細胞をROCK(Rhoキナーゼ)阻害剤で処理することを含む、生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながら、ヒト多分化能性幹細胞を培養する方法。
- ヒト多分化能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項1記載の方法。
- ヒト多分化能性幹細胞が分散している、請求項1又は2記載の方法。
- 分散したヒト多分化能性幹細胞が、単一ヒト多分化能性幹細胞であるか、又は凝集したヒト多分化能性幹細胞である、請求項3記載の方法。
- ヒト多分化能性幹細胞を分散させること、並びにヒト多分化能性幹細胞をROCK(Rhoキナーゼ)阻害剤で処理することを含む、請求項1〜4のいずれか記載の方法。
- ヒト多分化能性幹細胞の分散前に、ヒト多分化能性幹細胞をROCK阻害剤で処理する、請求項5記載の方法。
- ヒト多分化能性幹細胞の分散後に、ヒト多分化能性幹細胞をROCK阻害剤で処理する、請求項5又は6記載の方法。
- ROCK阻害剤が、Y−27632、Fasudil又はH−1152である、請求項1〜7のいずれか記載の方法。
- ヒト多分化能性幹細胞を接着培養又は浮遊培養で培養する、請求項1〜8のいずれか記載の方法。
- (a)ヒト多分化能性幹細胞の純化又はクローン化、(b)ヒト多分化能性幹細胞の遺伝子改変株の製造、あるいは(c)浮遊培養による神経細胞の製造のために用いられる、請求項1〜9のいずれか記載の方法。
- 神経細胞が前脳神経細胞である、請求項10記載の方法。
- ヒト多分化能性幹細胞からの分化細胞の製造方法であって、該方法は、ROCK阻害剤の存在下において、未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養し、ヒト多分化能性幹細胞の生存率及び/又は増殖能を改善すること、及び生存率及び/又は増殖能が改善されたヒト多分化能性幹細胞から分化細胞を誘導することを含む、方法。
- ヒト多分化能性幹細胞からの分化細胞の製造方法であって、該方法は、ROCK阻害剤の存在下において、生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養し、ヒト多分化能性幹細胞の分化効率を向上させること、及び分化効率が向上したヒト多分化能性幹細胞から分化細胞を誘導することを含む、方法。
- ROCK阻害剤の存在下において、生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養することにより得られる、ヒト多分化能性幹細胞及びROCK阻害剤を含む、細胞調製物。
- ヒト多分化能性幹細胞が分散している、請求項14記載の細胞調製物。
- ROCK阻害剤を含む、生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養するための培地。
- 基礎培地及びROCK阻害剤を含む、請求項16記載の培地。
- 無血清である、請求項16又は17記載の培地。
- ROCK阻害剤を含む培地において生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養することを含む、クローン化効率又は継代効率を促進するためのヒト多分化能性幹細胞の培養方法。
- ROCK阻害剤の存在下で生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養することを含む、ヒト多分化能性幹細胞培養におけるコロニー形成の促進方法。
- ROCK阻害剤の存在下で生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養することを含む、ヒト多分化能性幹細胞培養におけるクローン化効率又は継代効率の改善方法。
- 請求項19〜21のいずれか記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、フィーダー細胞、フィーダー細胞抽出物、及び/又は血清の非存在下で培養される、方法。
- 請求項19〜22のいずれか記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、サブクローニング又は継代の前に、ROCK阻害剤の存在下で培養される、方法。
- 請求項23記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、サブクローニング又は継代の前に少なくとも1時間、ROCK阻害剤の存在下で培養される、方法。
- 請求項19〜24のいずれか記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、サブクローニング又は継代の後、ROCK阻害剤の存在下で生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながら培養される、方法。
- 請求項25記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、少なくとも12時間、ROCK阻害剤の存在下で生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながら培養される、方法。
- 請求項26記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、少なくとも2日間、ROCK阻害剤の存在下で生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながら培養される、方法。
- 請求項25記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、少なくとも1継代の間、ROCK阻害剤の存在下で生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながら培養される、方法。
- 請求項19〜28のいずれか記載の方法であって、ROCK阻害剤がその後培地から除去される、方法。
- 請求項29記載の方法であって、ROCK阻害剤が12時間後に除去される、方法。
- 請求項29記載の方法であって、ROCK阻害剤が2、4又は6日間後に除去される、方法。
- 請求項29記載の方法であって、ROCK阻害剤が少なくとも1継代の後除去される、方法。
- ヒト多分化能性幹細胞をROCK阻害剤に接触させることを含む、培養物におけるヒト多分化能性幹細胞の生存の改善方法。
- ヒト多分化能性幹細胞を分散させることを更に含む、請求項33記載の方法。
- 分散の前及び/又は後に、ヒト多分化能性幹細胞をROCK阻害剤に接触させる、請求項34記載の方法。
- 請求項33〜35のいずれか記載の方法であって、培養物が浮遊状態で分散したヒト多分化能性幹細胞又はヒト多分化能性幹細胞の塊を含む、方法。
- 請求項33〜36のいずれか記載の方法であって、培養物が低密度のヒト多分化能性幹細胞を含む、方法。
- 請求項33〜37のいずれか記載の方法であって、培養物がクローン密度のヒト多分化能性幹細胞を含む、方法。
- 請求項33〜38のいずれか記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が少なくとも12時間、ROCK阻害剤の存在下で維持される、方法。
- 請求項39記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、少なくとも2日間、ROCK阻害剤の存在下で維持される、方法。
- 請求項39記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞が、少なくとも1継代の間、ROCK阻害剤の存在下で維持される、方法。
- 請求項33〜41のいずれか記載の方法であって、ROCK阻害剤がその後培地から除去される、方法。
- 請求項42記載の方法であって、ROCK阻害剤が12時間後に除去される、方法。
- 請求項42記載の方法であって、ROCK阻害剤が2、4又は6日間後に除去される、方法。
- 請求項42記載の方法であって、ROCK阻害剤が少なくとも1継代の後除去される、方法。
- 請求項19〜45のいずれか記載の方法であって、ヒト多分化能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、方法。
- 請求項19〜46のいずれか記載の方法であって、ROCK阻害剤がY−27632、Fasudil又はH−1152である、方法。
- ROCK阻害剤を含む、ヒト多分化能性幹細胞の生存を改善するための剤。
- 分散処理によるヒト多分化能性幹細胞の低生存率を改善するための剤である、請求項48記載の剤。
- ヒト多分化能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項48又は49記載の剤。
- ROCK阻害剤がY−27632、Fasudil又はH−1152である、請求項48〜50のいずれか記載の剤。
- ヒトES細胞の培養方法であって、該方法が以下工程:
(I)培養物中で、多分化能性状態でヒトES細胞を維持する工程;
(II)少なくとも1度、ヒトES細胞を継代する工程;
−培地がフィーダー、血清及び血清抽出物を含まないように、培地から血清、血清抽出物を除去する工程並びにフィーダーを除去する工程;並びに
(III)その後、ROCK阻害剤の存在下で、多分化能性状態でヒトES細胞を維持する工程;を含む、方法。 - 工程(I)におけるヒトES細胞の維持がフィーダー上で行われる、請求項52記載の方法。
- 請求項52又は53記載の方法であって、ヒトES細胞が、血清、血清抽出物及び/又はフィーダーの除去の前に、ROCK阻害剤の存在下で培養される、方法。
- ヒトES細胞のトランスフェクト集団を得る方法であって、該方法が以下工程:
−選択マーカーをコードするコンストラクトで、ヒトES細胞をトランスフェクトする工程;
−ヒトES細胞を蒔く工程;
−ROCK阻害剤の存在下で、生存を改善し及び/又は未分化状態でヒトES細胞を培養する工程;及び
−選択マーカーを発現する細胞を選択する工程;
を含む、方法。 - 請求項55記載の方法であって、ROCK阻害剤の存在下で、選択マーカーを発現するヒトES細胞をサブクローニングする工程をさらに含む、方法。
- 血清及び血清抽出物を含まない、生存を改善しながら及び/又は未分化状態を維持しながらヒト多分化能性幹細胞を培養するための培地であって、以下:
−基礎培地;
−ROCK阻害剤;及び
−鉄輸送体、を含む、培地。
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