KR102481035B1

KR102481035B1 - 선하수체 또는 이의 전구 조직의 제조 방법

Info

Publication number: KR102481035B1
Application number: KR1020177005265A
Authority: KR
Inventors: 요시키 사사이; 지카후미 오조네; 히데타카 스가
Original assignee: 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소; 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2022-12-26
Also published as: SG11201700599TA; CN107075481A; JPWO2016013669A1; AU2015293077B2; MY191960A; JP7029144B2; SG10202101001QA; CA2956130C; US20180195041A1; CN107075481B; AU2015293077A1; IL250258B; AU2022200554A1; KR20170042612A; WO2016013669A1; US12116593B2; US10760047B2; US20200370010A1; EP3954763A1; CN114774350A

Abstract

본 발명은 인간 다능성 줄기 세포에서의 선하수체 또는 이의 전구 조직의 시험관 내 유도 방법을 제공한다. 본 발명은 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양하여 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하고, 수득된 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유하는 인간 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 추가로 부유 배양하여 표면 외배엽에서 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 형성을 유도함으로써, 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 것을 포함한다.

Description

선하수체 또는 이의 전구 조직의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING ADENOHYPOPHYSIS OR PRECURSOR TISSUE THEREOF}

본 발명은 시험관 내에서 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell) 의 선하수체 또는 이의 전구 조직으로의 분화를 유도하는 기술에 관한 것이다.

뇌하수체는 간뇌의 하부에 인접한 작은 내분비 기관이며, 다양한 호르몬의 제어 중추로서 주요한 역할을 한다. 예를 들어, 생명 유지에 필수적인 코르티코스테로이드의 생성을 촉진하는 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 어린이의 성장을 촉진하는 성장 호르몬 등을 비롯한 다양한 뇌하수체 호르몬을 생성한다. 따라서, 뇌하수체 기능 장애는 중증 전신 질환을 야기한다. 하지만, 뇌하수체는 배아에서 매우 복잡한 발달 과정을 통해 형성되기 때문에, 배아 줄기 (Embryonic Stem) (ES) 세포 등과 같은 줄기 세포로부터 뇌하수체 조직을 형성하는 것은 어려운 일이었다.

본 발명자들은 ES 세포 등과 같은 다능성 줄기 세포로부터 신경 세포 및 망막 세포를 효율적으로 분화시키는 방법으로서 확립된 신속한 재응집을 통한 배아체-형 응집체의 무(無)혈청 부유 배양 (SFEBq 법) 을 적용하여, 시험관 내에서 마우스 ES 세포로부터 뇌하수체의 자가 조직화 (self-organization) 를 성공시켰다 (비특허문헌 1). 이러한 방법에서, 마우스 ES 세포의 응집체를 SAG 함유 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 헤지호그 (hedgehog) 신호를 활성화시키고, 응집체에서 시상하부 및 구강 외배엽을 동시에 형성시키고, 이의 상호작용으로 뇌하수체 플라코드 (placode) 형성 및 라트케낭 (Rathke's pouch) 의 자가 조직화를 유도한다. 저해 실험을 기반으로 하는 이러한 방법에서는, 내인성 BMP4 신호가 뇌하수체 플라코드 형성에 요구되는 것으로 보고되어 있다.

비특허문헌 1: Nature. 2011 Nov 9; 480(7375): 57-62

본 발명자들은, 인간 다능성 줄기 세포에서의 뇌하수체의 자가 조직화를 목표로, 상기 언급된 방법을 인간 다능성 줄기 세포에 적용하였다. 하지만, 마우스에서 만큼 효율적인 뇌하수체 형성을 달성할 수 없었다.

따라서, 본 발명은 인간 다능성 줄기 세포로부터 선하수체 또는 이의 전구 조직을 시험관 내에서 효율적으로 유도하는 기술을 제공하는 것을 목표로 한다.

우선, 본 발명자들은 마우스 계에 외인성으로 BMP4 를 첨가하고, 이의 효과를 검증하였다. 하지만, 마우스 계에서, 외인성 BMP4 신호의 첨가는 표면 외배엽의 형성을 촉진하지만, 세포 응집체 내부의 신경상피 조직 (시상하부) 의 형성에는 오히려 저해 작용을 하여, 표면 외배엽 및 시상하부 신경상피 조직 둘 모두를 포함하는 세포 응집체를 형성하는 것이 어려웠다. 하지만, 예상외로, 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 계에서는, 마우스와는 달리, 외인성 BMP4 가 표면에의 표면 외배엽의 형성 및 내부에의 시상하부 신경상피 조직의 형성 둘 모두를 촉진시킨다는 것을 발견하였다. 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 BMP4 및 SAG 함유 배지에서 부유 배양하면, 세포 응집체에서 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽 둘 모두가 동시에 형성되며, 이의 상호작용으로 인해 표면 외배엽에서 뇌하수체 플라코드가 형성되었다. 뇌하수체 플라코드는 내부에 함입되어, 라트케낭-형 주머니 구조를 형성하였다. 연속 배양으로 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭에서 ACTH 생성 세포, GH 생성 세포 및 PRL 생성 세포의 출현을 유도하였다. 뇌하수체 플라코드 또는 라트케낭 함유 세포 응집체는 CRH 자극에 대하여 ACTH 를 분비하고, ACTH 분비는 글루코코르티코이드에 의해 피드백 방식으로 억제되었다. 따라서, 세포 응집체는, 생체 내 뇌하수체에서와 같은 방식으로, 시상하부의 자극 및 다운스트림 표적 조직으로부터의 피드백 조절에 대하여 뇌하수체 호르몬의 분비를 제어하는 능력을 갖는 것으로 나타났다.

본 발명자들은 상기 언급한 발견들을 기반으로 추가 연구를 실시하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 다음과 같다:

[1] 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양하는 것을 포함하는, 선하수체 또는 이의 전구 조직을 포함하는 인간 세포 응집체의 제조 방법.

[2] [1] 에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양하여 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 포함하는 인간 세포 응집체를 수득하고, 수득된 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 포함하는 인간 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 추가로 부유 배양하여 표면 외배엽에서 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 형성을 유도함으로써, 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 포함하는 인간 세포 응집체를 수득하는 것을 포함하는, 제조 방법.

[3] [2] 에 있어서, 추가 부유 배양에 사용되는 배지가 FGF2 를 추가로 포함하는 제조 방법.

[4] [2] 또는 [3] 에 있어서, 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 포함하는 인간 세포 응집체를 Shh 신호 경로 작용 물질을 포함하는 배지에서 추가로 부유 배양하여 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화를 유도함으로써, 선하수체를 포함하는 인간 세포 응집체를 수득하는 것을 포함하는 제조 방법.

[5] [4] 에 있어서, 추가 부유 배양에 사용되는 배지가 FGF2 를 추가로 포함하는 제조 방법.

[6] [4] 또는 [5] 에 있어서, 추가 부유 배양에 사용되는 배지가 노치 (Notch) 신호 저해제를 추가로 포함하는 제조 방법.

[7] [6] 에 있어서, 노치 신호 저해제가 DAPT 인 제조 방법.

[8] [4] - [7] 중 어느 하나에 있어서, 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 제조 방법.

[9] [1] - [8] 중 어느 하나에 있어서, 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 인 제조 방법.

[10] [1] - [9] 중 어느 하나에 있어서, Shh 신호 경로 작용 물질이 SAG 인 제조 방법.

[11] [1] - [10] 중 어느 하나에 있어서, 시상하부 신경상피 조직이 배쪽 (ventral) 시상하부 신경상피 조직인 제조 방법.

[12] [1] - [11] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포인 제조 방법.

[13] [1] - [12] 중 어느 하나에 있어서, 부유 배양을 피더 (feeder) 세포 부재 하에서 실시하는 제조 방법.

[14] [1] - [13] 중 어느 하나에 따른 제조 방법에 의해 수득가능한 세포 응집체.

본 발명에 따르면, 선하수체 또는 이의 전구 조직을 시험관 내에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 효율적으로 유도할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 응집체에서 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽 둘 모두가 동시에 형성되며, 이의 상호작용으로 인해 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭이 자가 조직화된다. 본 발명에 따르면, 생체 내 뇌하수체에서와 같은 방식으로, 시상하부의 자극 및 다운스트림 표적 조직으로부터의 피드백 조절에 대하여 뇌하수체 호르몬의 분비를 조절하는 능력을 갖는 인간 선하수체를 시험관 내에서 구축할 수 있다.

도 1 은 인간 다능성 줄기 세포에서의 배쪽 시상하부 및 상피 플라코드의 3차원 형성을 나타낸다. A: d17 응집체. Rx::Venus: 녹색, E-카드헤린 (E-cadherin): 적색, DAPI: 청색. B: d24 응집체. Rx::Venus: 녹색, Nkx2.1: 적색, DAPI: 청색. C: d24 응집체. Rx::Venus: 녹색, 판-시토케라틴 (pan-cytokeratin): 백색, DAPI: 청색.
도 2 는 뇌하수체 플라코드의 분화 및 라트케낭의 자가 조직화를 나타낸다. A: d30 응집체. 죄측 도면, Lim3: 녹색, Isl1/2: 적색, DAPI: 청색. 우측 도면, Pitx1: 백색, DAPI: 청색. B: d27 응집체. Rx::Venus: 녹색, Lim3: 적색, 판-시토케라틴: 백색. C: d27 응집체. Rx::Venus: 녹색, Lim3: 적색, 판-시토케라틴: 백색.
도 3 은 BMP4 비(非)첨가 조건 하에서의 분화 유도를 나타낸다. d24 또는 25 응집체의 사진. a 및 c: SAG 미함유. b 및 d: d6 - 25, SAG (200nM). a 및 b: Rx::Venus: 녹색, FoxG1: 적색, DAPI: 청색. c 및 d: Rx::Venus: 녹색, Nkx2.1: 적색, Pax6: 백색.
도 4 는 뇌하수체 플라코드 분화 유도에서의 헤지호그 신호의 역할을 나타낸다. d24 응집체의 사진. a 및 c: SAG 미함유. b, d 및 e: d6 - 25, SAG (2 μM). a 및 b: Rx::Venus: 녹색, 판-시토케라틴: 백색. c 및 d: chx10: 적색. e: Rx::Venus: 녹색, Nkx2.1: 적색, DAPI: 청색.
도 5 는 뇌하수체 플라코드에서의 ACTH 생성 내분비 세포의 분화 유도를 나타낸다. a: d67 응집체. Pitx1: 백색, DAPI: 청색. b: d67 응집체. ACTH: 녹색, DAPI: 청색. c: d70 응집체. Rx::Venus: 녹색, ACTH: 적색, DAPI: 청색. d: d100 응집체. Rx::Venus: 녹색, ACTH: 적색, DAPI: 청색.
도 6 은 CRH 에 의한, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 뇌하수체 내분비 세포에서의 ACTH 의 방출 유도를 나타낸다. a: CRH 자극 시 배양 상청액 중 ATCH 의 농도 (pg/ml). b: 배양 상청액 중 ATCH 의 농도 (pg/ml) 에 대한 히드로코르티손의 효과.
도 7 은 CRH 에 의한, 인간 ES 세포 유래의 ACTH 생성 세포에서의 ACTH 및 코르티코스테로이드의 생체 내 분비를 나타낸다. a: 이식 후 14 일차 ACTH 생성 세포. hNuclei: 적색, DAPI: 청색. b: 이식 후 14 일차 ACTH 생성 세포. ACTH: 녹색, DAPI: 청색. c: CHR 부하 후 혈장 중 ACTH 농도. 오차 막대 (error bar) 는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. **P<0.01, 대응표본 t-검정 (paired t-test). d: CHR 부하 후 혈장 중 코르티코스테론 농도.
도 8 은 인간 ES 세포 유래의 ACTH 생성 세포 이식에 의한 뇌하수체 적출된 마우스의 활동성, 생존 및 체중 감소의 개선을 나타낸다. a: 는 러닝 휠 (running wheel) 활동성 시험의 결과를 나타낸다. b: 는 홈-케이지 (home-cage) 활동성 시험의 결과를 나타낸다. c: 는 ACTH 생성 세포 이식에 의한 생존의 개선을 나타낸다. d: 는 ACTH 생성 세포 이식에 의한 체중 감소의 개선을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± s.e.m. 을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 스튜던트 t-검정 (Student's t-test) (a, b), 로그 순위 검정 (c), 만-휘트니 (Mann-Whitney) 검정 (d).
도 9 는 DAPT 처리에 의한 응집체에서의 Tbx19 발현 유도를 나타낸다.
도 10 은 뇌하수체 플라코드에서의 GH- 및 PRL 생성 내분비 세포의 분화 유도를 나타낸다. a: d67 응집체. PRL: 녹색, ACTH: 적색, Pitx1: 백색, DAPI: 청색. b: d70 응집체. Rx::Venus: 녹색, Pitx1: 적색, GH: 백색, DAPI: 청색.
도 11 은 인간 다능성 줄기 세포에서의 등쪽 (dorsal) 시상하부의 입체 형성을 나타낸다. a: d21 응집체. Rx::Venus: 녹색, Nkx2.1: 적색, Pax6: 백색, DAPI: 청색. a: d81 응집체. Otp: 적색, DAPI: 청색.
도 12 는 GRF 에 의한, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 뇌하수체 내분비 세포에서의 GH 방출 유도를 나타낸다. 세로축은 배양 상청액 중 GH 농도 (pg/ml) 를 나타낸다.
도 13 은 덱사메타손에 의한 GH 생성 세포의 유도를 나타낸다. (a) 는 GRF 에 의한, 덱사메타손에 의해 유도된 GH 생성 세포에서의 GH 방출 유도를 나타낸다. n=3, 일원 분산분석 (one-way ANOVA), *p<0.05, ***p<0.001. (b) 는 GH 방출에 대한 소마토스타틴 처리의 효과를 나타낸다. n=3, 스튜던트 t-검정, ***p<0.001.
도 14 는 뇌하수체 플라코드에서의 내분비 세포의 유도를 나타낸다. a: GH 생성 세포, b: PRL 생성 세포, c: TSH 생성 세포.
도 15 는 뇌하수체 플라코드에서의 내분비 세포의 유도를 나타낸다. a: LH 생성 세포, b: FSH 생성 세포.

(1) 다능성 줄기 세포

"다능성 줄기 세포" 는, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력 (분화 다능성), 및 세포 분열을 통해 동일한 분화능을 갖는 딸 세포를 생성하는 능력 (자가 복제 능력) 둘 모두를 갖는 세포를 나타낸다.

분화 다능성은 평가 대상의 세포를 누드 마우스 내에 이식하고, 3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 의 각각의 세포를 함유하는 테라토마의 형성 유무를 시험함으로써 평가될 수 있다.

다능성 줄기 세포의 예에는, 배아 줄기 세포 (ES 세포), 배아 생식 세포 (EG 세포), 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등이 포함되며, 다능성 줄기 세포는 분화 다능성 및 자가 복제 능력 둘 모두를 가지고 있는 한, 제한되지 않는다. 본 발명에서, 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포가 바람직하게 사용된다.

배아 줄기 세포 (ES 세포) 는, 예를 들어, 착상 전 초기 배아, 초기 배아를 구성하는 내부 세포 물질, 단일 할구 등을 배양함으로써 확립될 수 있다 (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)). 초기 배아로서, 체세포의 핵을 핵이식하여 제조된 초기 배아가 사용될 수 있다 (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira IRITANI et al. (Tanpakushitsu Kakusan Koso, 44, 892 (1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000), Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) 인쇄 중)). 초기 배아로서, 단위생식 배아가 또한 사용될 수 있다 (Kim et al. (Science, 315, 482-486 (2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985 (2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)).

ES 세포 및 체세포의 세포 융합에 의해 수득된 융합 ES 세포 또한 본 발명의 방법에 사용되는 배아 줄기 세포에 포함된다.

배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수가능하며, 시판품을 구입할 수 도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 [Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University] 에서 입수가능하다.

배아 생식 세포 (EG 세포) 는 LIF, bFGF, SCF 등의 존재 하에서 원시 생식 세포를 배양함으로써 확립될 수 있다 (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).

유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 는, 체세포 (예를 들어, 섬유아세포, 피부 세포, 림프구 등) 를 핵 재프로그래밍 인자와 접촉시킴으로써, 분화 다능성 및 자가 복제 능력이 인공적으로 획득된 세포를 나타낸다. iPS 세포는 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 로 구성된 핵 재프로그래밍 인자를 체세포 (예를 들어, 섬유아세포, 피부 세포 등) 내에 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 처음 발견되었다 (Cell, 126: p. 663-676, 2006). 그 후, 많은 연구자들에 의해 재프로그래밍 인자의 조합 및 인자의 도입 방법에 대한 다양한 개선이 이루어졌고, 유도된 다능성 줄기 세포의 다양한 제조 방법이 보고되었다.

핵 재프로그래밍 인자는, 섬유아세포 등과 같은 체세포로부터 분화 다능성 및 자가 복제 능력을 갖는 세포를 유도할 수 있는 물질 (물질들) 이면, 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산 (벡터에 내재된 형태 포함), 또는 저분자 화합물과 같은 임의의 물질로 구성될 수 있다. 핵 재프로그래밍 인자가 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산인 경우, 바람직한 핵 재프로그래밍 인자는 하기 조합으로 예시될 수 있다 (이하, 단백질성 인자의 명칭 만을 제시함).

(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (여기서 Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체가능함. Klf4 는 Klf1, Klf2 또는 Klf5 로 대체가능함. 나아가, c-Myc 는 T58A (활성형 돌연변이), N-Myc 또는 L-Myc 로 대체가능함.)

(2) Oct3/4, Klf4, Sox2

(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc

(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28

(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28

(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF

(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF

(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF

(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF

이러한 조합 중에서, 수득된 iPS 세포를 치료 용도로 사용하는 것이 고려되는 경우, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 의 3 가지 인자의 조합이 바람직하다. 한편, 수득된 iPS 세포를 치료 용도로 사용하는 것이 고려되지 않는 경우 (예를 들어, 신약 개발 스크리닝을 위한 연구 도구로서 사용되는 경우 등), Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc 로 이루어진 4 가지 인자, 또는 이에 Lin28 또는 Nanog 를 추가한 5 가지 인자가 바람직하다.

iPS 세포는 바람직하게는 자가 이식에 사용된다.

염색체 내 유전자를 공지된 유전 공학 방법에 의해 변경하여 수득된 다능성 줄기 세포 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 다능성 줄기 세포는, 표지 유전자 (예를 들어, GFP 등과 같은 형광 단백질) 가 공지된 방법에 의해 인-프레임 (in-frame) 방식으로 분화 마커를 인코딩하는 유전자에 녹인 (knock in) 된 세포로서, 상기 세포는 지표로서 표지 유전자의 발현을 사용하여 대응하는 분화 단계에 도달했다는 것을 식별가능하게 하는 세포일 수 있다.

다능성 줄기 세포로서, 온혈 동물 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 포유동물의 다능성 줄기 세포가 사용될 수 있다. 포유동물에는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니피그와 같은 설치류 및 토끼를 포함하는 실험 동물; 돼지, 소, 염소, 말 및 양과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 애완 동물; 인간, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지와 같은 영장류가 포함된다. 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 다능성 줄기 세포, 및 가장 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포이다.

다능성 줄기 세포는 자체 공지된 방법에 의해 유지 배양될 수 있다. 예를 들어, 임상 적용의 관점에서는, 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 Knockout^TM 혈청 대체물 (KSR) 등과 같은 혈청 대체물을 사용한 무(無)혈청 배양, 또는 무(無)피더 세포 배양에 의해 유지된다.

본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 단리된 것이다. "단리된" 이란, 표적 세포 또는 성분 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져, 상기 세포 또는 성분이 더 이상 자연 상태로 존재하지 않는 것을 의미한다. "단리된 인간 다능성 줄기 세포" 의 순도 (총 세포수에 대한 인간 다능성 줄기 세포수의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다.

(2) 다능성 줄기 세포 응집체의 형성

다능성 줄기 세포 응집체는, 분산된 다능성 줄기 세포를 배양기에 대하여 비(非)접착성인 조건 하에서 배양 (즉, 부유 배양) 하고, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성시킴으로써 수득될 수 있다.

응집체 형성에 사용되는 배양기는 특별히 제한되지 않으며, 이의 예에는, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 (Petri) 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 (bag) 및 롤러 보틀이 포함된다. 비접착성 조건 하에서 배양을 가능하게 하기 위하여, 배양기는 세포-비접착성인 것이 바람직하다. 유용한 세포-비접착성 배양기에는, 배양기의 표면이 세포-비접착성이 되도록 인공적으로 처리된 배양기, 세포 접착성이 향상되도록 인공적으로 처리 (예를 들면, 세포외 기질 등으로의 코팅 처리) 되어 있지 않은 배양기 등이 포함된다.

응집체 형성에 사용되는 배지는, 기초 배지로서 포유동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지는, 포유동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지, 이들의 혼합 배지 등일 수 있다. 하나의 구현예에서, IMDM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지가 사용된다. 혼합비는, 예를 들어, 부피비로 IMDM:Ham's F-12 = 0.8 - 1.2:1.2 - 0.8 이다.

배양에 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 무혈청 배지는, 비(非)조정된 또는 비(非)정제된 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 정제된 혈액 유래 성분 및 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 을 함유하는 배지가 무혈청 배지에 해당한다. 화학 합성이 아닌 (chemically-undefined) 성분의 혼입을 방지하기 위하여, 본 발명에서는 무혈청 배지가 바람직하게 사용된다.

응집체 형성에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물 등을 적절하게 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 방법을 보다 용이하게 시행하기 위하여, 시판용 혈청 대체물이 사용될 수 있다. 이러한 시판용 혈청 대체물의 예에는, 녹아웃 혈청 대체물 (Knockout Serum Replacement) (KSR, Invitrogen 사제), 화학 합성 (Chemically-defined) 지질 농축물 (Gibco Company 사제) 및 Glutamax (Gibco Company 사제) 가 포함된다.

응집체 형성에 사용되는 배지는, 다능성 줄기 세포의 뇌하수체 또는 이의 부분 조직, 또는 이의 전구 조직으로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예에는, 비제한적으로, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어, 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어, 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어, 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민 등), 아미노산 (예를 들어, L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어, 2-메르캅토에탄올 등), 비타민 (예를 들어, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생제 (예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어, HEPES 등) 등이 포함된다.

응집체 형성에 사용되는 배지는 하기 언급되는 제 1 배양 공정에 사용되는 배지일 수 있다.

다능성 줄기 세포 응집체의 형성에 있어서, 다능성 줄기 세포를 계대 배양으로부터 회수하고, 단일 세포 상태 또는 단일 세포 상태에 가까운 상태까지 분산시킨다. 다능성 줄기 세포를 적절한 세포 해리액으로 분산시킨다. 세포 해리액의 예에는, EDTA; 트립신, 콜라게나아제 IV 및 메탈로프로테이나아제 등과 같은 프로테아제 등이 포함되며, 이들은 단독으로 또는 적절한 조합으로 사용될 수 있다. 이들 중에서, 세포 독성이 낮은 것이 바람직하며, 이러한 세포 해리액의 예에는, DISPASE (EIDIA), TrypLE (Invitrogen), Accutase (MILLIPORE) 등과 같은 시판품이 포함된다. 분산된 다능성 줄기 세포를 상기 언급된 배지에 현탁시킨다.

분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위하여, Rho-관련 이중 나선 (coiled-coil) 키나아제 (ROCK) 의 저해제를 배양 개시부터 첨가하는 것이 바람직하다 (JP-A-2008-99662). ROCK 저해제는, 배양 개시로부터, 예를 들어 15 일 이내, 바람직하게는 10 일 이내, 더욱 바람직하게는 6 일 이내에 첨가된다. ROCK 저해제의 예에는, Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드) 등이 포함된다. 부유 배양에 사용되는 ROCK 저해제의 농도는, 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들어, Y-27632 에 있어서, 이러한 농도는 통상적으로 약 0.1 내지 200 μM, 바람직하게는 약 2 내지 50 μM 이다. ROCK 저해제의 농도는 이의 첨가 기간 중에 변경 가능하며, 예를 들어, 기간의 후반에 농도가 반감될 수 있다.

분산된 다능성 줄기 세포의 현탁액을 상기 언급된 배양기 내에 씨딩하고, 분산된 다능성 줄기 세포를 세포 배앙기에 대하여 비접착성인 조건 하에서 배양함으로써, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 이러한 경우, 분산된 다능성 줄기 세포를 10-cm 디쉬와 같은 비교적 큰 배양기 내에 씨딩하여 1 개의 배양 구획 중에 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 동시에 형성시킬 수 있다. 하지만, 응집체의 크기 및 그 안에 함유된 다능성 줄기 세포수는 넓은 범위에서 가변적일 수 있으며, 이러한 가변성은 응집체 간 다능성 줄기 세포의 뇌하수체 또는 이의 부분 조직, 또는 이의 전구 조직으로의 분화 수준에서의 차이를 초래하여, 결과적으로 분화 유도의 효율을 저하시킬 수 있다. 따라서, 분산된 다능성 줄기 세포를 신속하게 응집시켜, 1 개의 배양 구획 중에 1 개의 응집체를 형성하는 것이 바람직하다. 분산된 다능성 줄기 세포를 신속하게 응집시키는 방법의 예에는, 하기 방법들이 포함된다:

(1) 비교적 작은 체적 (예를 들어, 1 ml 이하, 500 ㎕ 이하, 200 ㎕ 이하, 100 ㎕ 이하) 의 배양 구획 중에 분산된 다능성 줄기 세포를 동봉 (enclosing) 하여, 상기 구획 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 방법. 바람직하게는, 분산된 다능성 줄기 세포를 동봉한 후, 배양 구획을 정치시킨다. 배양 구획의 예에는, 비제한적으로, 멀티-웰 플레이트 (384-웰, 192-웰, 96-웰, 48-웰, 24-웰 등), 마이크로포어, 챔버 슬라이드 등에 있어서의 웰, 튜브, 현적법 (hanging drop method) 에 있어서의 배지의 액적 등이 포함된다. 상기 구획 중에 동봉된 분산된 다능성 줄기 세포는 중력으로 인해 1 개의 지점에 침전되거나, 또는 세포가 서로 접착되어 1 개의 배양 구획 중에 1 개의 응집체가 형성된다. 멀티-웰 플레이트, 마이크로포어, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥의 형상은, 분산된 다능성 줄기 세포가 1 개의 지점에 침전되는 것이 용이하도록 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥이다.

(2) 원심분리 튜브 중에 분산된 다능성 줄기 세포를 위치시키고, 이를 원심분리하여 1 개의 지점에 다능성 줄기 세포를 침전시킴으로써, 상기 튜브 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 방법.

1 개의 배양 구획 중에 씨딩되는 다능성 줄기 세포수는, 1 개의 배양 구획 당 1 개의 응집체가 형성되고, 본 발명의 방법에 의해 상기 응집체에서 다능성 줄기 세포의 뇌하수체 또는 이의 부분 조직, 또는 이의 전구 조직으로의 분화 유도가 가능한 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 1 개의 배양 구획 중에, 약 1 x 10³ - 약 5 x 10⁴ 개, 바람직하게는 약 1 x 10³ - 약 2 x 10⁴ 개, 더욱 바람직하게는 약 2 x 10³ - 약 1.2 x 10⁴ 개의 다능성 줄기 세포가 씨딩된다. 이어서, 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시킴으로써, 1 개의 배양 구획 당, 일반적으로 약 1 x 10³ - 약 5 x 10⁴ 개, 바람직하게는 약 1 x 10³ - 약 2 x 10⁴ 개, 보다 바람직하게는 약 2 x 10³ - 약 1.2 x 10⁴ 개의 다능성 줄기 세포로 구성된 1 개의 세포 응집체가 형성된다.

응집체 형성까지의 시간은, 1 개의 구획 당 1 개의 응집체가 형성되고, 본 발명의 방법에 의해 상기 응집체에서 다능성 줄기 세포의 뇌하수체 또는 이의 부분 조직, 또는 이의 전구 조직으로의 분화가 유도될 수 있는 한, 적절하게 결정될 수 있다. 이러한 시간을 단축시킴으로써, 대상 뇌하수체 또는 이의 부분 조직 또는 이의 전구 조직으로의 효율적 분화 유도가 예상되기 때문에, 상기 시간은 보다 짧은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 다능성 줄기 세포 응집체는 24 시간 이내, 더욱 바람직하게는 12 시간 이내, 보다 더 바람직하게는 6 시간 이내, 가장 바람직하게는 2 - 3 시간 내에 형성된다. 응집체 형성까지의 시간은, 세포 응집을 위한 도구, 원심분리 조건 등을 선택함으로써 당업자에 의해 적절하게 조정될 수 있다.

응집체 형성 시의 배양 온도 및 CO₂ 농도와 같은 다른 배양 조건은 적절하게 설정될 수 있다. 배양 온도는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO₂ 농도는, 예를 들어, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.

나아가, 동일 배양 조건 하에서 복수의 배양 구획을 제조하고, 각각의 배양 구획 중에 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시킴으로써, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 수득할 수 있다. 다능성 줄기 세포 응집체가 질적으로 균일한지 여부는, 응집체 덩어리의 크기 및 그 안의 세포수, 거시적 형태, 미시적 형태 및 조직학적 염색에 의해 분석된 바와 같은 그 균질성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균질성, 분화 마커의 발현 조절 및 그 동시성, 응집체 간 분화 효율의 재현성 등을 기반으로 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 다능성 줄기 세포 응집체 집단은, 응집체 내에 균일한 수의 다능성 줄기 세포를 함유한다. 특정 매개변수에 있어서 다능성 줄기 세포 응집체 집단이 "균일" 하다는 것은, 총 응집체 집단 중 90% 이상의 상기 응집체 집단이 상기 매개변수의 평균치 ±10%, 바람직하게는 ±5% 의 범위 내에 있다는 것을 의미한다.

(3) 선하수체 또는 이의 전구 조직의 유도

본 발명은, 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog) (Shh) 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양하는 것을 포함하는, 선하수체 또는 이의 전구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서, 선하수체는 전엽 또는 중엽의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 중 적어도 1 종을 함유하는 조직을 나타낸다. 뇌하수체 호르몬 생성 세포의 예에는, 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포, 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 생성 세포, 난포-자극 호르몬 (FSH) 생성 세포, 황체형성 호르몬 (LH) 생성 세포 등과 같은 전엽을 구성하는 세포; 및 멜라닌세포-자극 호르몬 (MSH) 생성 세포 등과 같은 중엽을 구성하는 세포가 포함된다. 하나의 구현예에서, 선하수체는 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종, 더욱 바람직하게는 3 종의 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 함유한다. 추가의 구현예에서, 선하수체는 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포, 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 생성 세포, 난포-자극 호르몬 (FSH) 생성 세포, 및 황체형성 호르몬 (LH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종 이상 (2, 3, 4, 5 또는 6 종) 의 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 함유한다.

본 발명에서, 조직은 상이한 형태 및 특성을 갖는 복수의 종의 세포가 특정 패턴으로 입체적으로 배치된 구조를 갖는 세포 집단 구조를 나타낸다.

선하수체의 전구 조직으로서, 뇌하수체 플라코드, 라트케낭 등이 언급될 수 있다. 뇌하수체 플라코드는 배아발달 과정에서 표면 외배엽 영역에 형성된 비후된 구조이며, 이는 뇌하수체 전구 세포 마커를 발현한다. 뇌하수체 전구 세포 마커로서, Lim3, Pitx1, Isl1/2 등이 언급될 수 있다. 뇌하수체 플라코드는 Lim3, Pitx1 및 Isl1/2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 모든 뇌하수체 전구 세포 마커를 발현한다. 라트케낭은 뇌하수체 플라코드의 함입에 의해 형성된 주머니 구조를 나타낸다.

본 발명의 제조 방법은 특히, 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양하여 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 포함하는 세포 응집체를 수득하고 (제 1 배양 공정), 수득된 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 포함하는 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 추가로 부유 배양하여 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 포함하는 세포 응집체를 수득하는 것 (제 2 배양 공정) 을 포함한다. 제 1 배양 공정으로 다능성 줄기 세포로부터 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽의 분화를 유도하고, 수득된 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유하는 세포 응집체를 제 2 배양 공정에 적용함으로써, 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 추가의 분화를 유도한다.

(3.1) 제 1 배양 공정

제 1 배양 공정에서, 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양한다.

다능성 줄기 세포 응집체를 "부유 배양한다" 는 것은, 다능성 줄기 세포 응집체를 배지 중에서 배앙기에 대하여 비접착성인 조건 하에서 배양하는 것을 나타낸다. 이는 통상적으로 어려웠던 선하수체 또는 이의 전구 조직의 효율적인 유도를 가능하게 한다.

부유 배양에 사용되는 배지는 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유한다. 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 작용에 의해, 다능성 줄기 세포에서의 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽의 분화가 유도된다.

본 발명에서, 골 형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질은 골 형성 인자와 수용체의 결합 시 신호가 전달되는 경로를 활성화하는 임의의 물질이다. 골 형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 예에는, BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등이 포함된다. 바람직하게는, 골 형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP4 이다. 하기에, 주로 BMP4 가 기재되지만, 본 발명에 사용되는 골 형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 에 제한되는 것은 아니다. BMP4 는 공지된 사이토카인이며, 이의 아미노산 서열 또한 공지되어 있다. 본 발명에 사용되는 BMP4 는 포유동물의 BMP4 이다. 포유동물의 예에는, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등과 같은 설치류, 토끼 등과 같은 실험 동물; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등과 같은 가축; 개, 고양이 등과 같은 애완동물; 및 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등과 같은 영장류가 포함된다. BMP4 는 바람직하게는 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 BMP4 이고, 가장 바람직하게는 인간 BMP4 이다. 인간 BMP4 는, BMP4 가 인간 생체 내에서 자연적으로 발현되는 BMP4 의 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 인간 BMP4 의 대표적인 아미노산 서열의 예에는, NCBI 등록 번호 NP_001193.2 (2013 년 6 월 15 일 갱신), NP_570911.2 (2013 년 6 월 15 일 갱신), NP_570912.2 (2013 년 6 월 15 일 갱신), 이러한 아미노산 서열 각각으로부터 N-말단 신호 서열 (1-24) 을 제거하여 수득된 아미노산 서열 (성숙형 인간 BMP4 아미노산 서열) 등이 포함된다.

본 발명에서, Shh 신호 경로 작용 물질은 Shh 에 의해 매개되는 신호 전달을 증강시킬 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. Shh 신호 경로 작용 물질의 예에는, 비제한적으로, 헤지호그 계열에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 작용제, 푸르모르파민, 평활화된 작용제 (Purmorphamine, Smoothened Agonist) (SAG)(3-클로로-N-[트랜스-4-(메틸아미노)시클로헥실]-N-[[3-(4-피리디닐)페닐]메틸]-벤조[b]티오펜-2-카르복사미드) 등이 포함된다. 이들 중에서, SAG 가 바람직하다.

골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 바람직한 조합은, BMP4 및 SAG 의 조합이다.

배지 중 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 세포 응집체에서 다능성 줄기 세포의 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화를 유도할 수 있는 범위 내에서 적절하게 설정될 수 있다. BMP4 가 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질로서 사용되는 경우, 이의 농도는 일반적으로 0.01 nM 이상, 바람직하게는 0.1 nM 이상, 더욱 바람직하게는 1 nM 이상이다. 이의 상한은, 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 nM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 BMP4 의 농도는 일반적으로 0.01 - 1000 nM, 바람직하게는 0.1 - 100 nM, 더욱 바람직하게는 1 - 10 nM (예를 들어, 5 nM) 이다. 외인성 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질은 특히 1) 표면 외배엽의 적극적 형성, 및 2) 세포 응집체에서 대뇌가 아니라 시상하부의 신경상피 조직의 분화 유도에 기여하기 때문에, 이는 이러한 효과를 달성할 수 있는 농도로 배지 중에 함유된다.

골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질이 제 1 배양 공정의 모든 기간에 걸쳐 배지 중에 함유되어 있을 필요는 없다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 개시로부터 2 - 4 일 (예를 들어, 3 일) 동안은 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질이 배지에 첨가되지 않고, 그 후에 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질이 배지에 첨가될 수 있다.

배지 중 Shh 신호 경로 작용 물질의 농도는, 세포 응집체에서 다능성 줄기 세포의 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화를 유도할 수 있는 범위 내에서 적절하게 설정될 수 있다. SAG 가 Shh 신호 경로 작용 물질로서 사용되는 경우, 이의 농도는 일반적으로 1 nM 이상, 바람직하게는 10 nM 이상, 더욱 바람직하게는 100 nM 이상이다. 이의 상한은, 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 μM 이하, 바람직하게는 100 μM 이하, 더욱 바람직하게는 10 μM 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 SAG 의 농도는 일반적으로 1 nM - 1000 μM, 바람직하게는 10 nM - 100 μM, 더욱 바람직하게는 100 nM - 10 μM (예를 들어, 2 μM) 이다. 외인성 Shh 신호 경로 작용 물질이 특히 신경 망막이 아니라 시상하부 (바람직하게는 배쪽 시상하부) 의 신경상피 조직의 분화를 유도하는 역할을 담당하기 때문에, 이는 이러한 효과를 달성할 수 있는 농도로 배지 중에 함유된다.

Shh 신호 경로 작용 물질이 제 1 배양 공정의 모든 기간에 걸쳐 배지 중에 함유되어 있을 필요는 없다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 개시로부터 5 - 7 일 (예를 들어, 6 일) 동안은 Shh 신호 경로 작용 물질이 배지에 첨가되지 않고, 그 후에 Shh 신호 경로 작용 물질이 배지에 첨가될 수 있다.

하나의 구현예에서, 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지에서 2 - 4 일 동안 부유 배양한 후, 수득된 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하고 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지에서 2 - 4 일 동안 부유 배양하고, 추가로, 수득된 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽이 유도될 때까지 배양한다.

본 발명에 사용되는 BMP4 등과 같은 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 단리된 것이다. "단리된" 이란, 표적 성분 또는 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져, 상기 성분 또는 세포가 더 이상 자연 상태로 존재하지 않는 것을 의미한다. 따라서, "단리된 단백질 X" 에는, 배양되는 세포 또는 조직에서 생성된 내인성 단백질 X 가 포함되지 않는다. "단리된 단백질 X" 의 순도 (총 단백질 중량에 대한 단백질 X 의 중량 백분율) 은 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다. 부유 배양에 사용되는 배지 중에 함유된 단리된 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질은, 배지에 외인성으로 첨가된 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 단리된 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질을 제 1 배양 공정에 사용되는 배지에 외인성으로 첨가하는 공정을 포함한다.

분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위하여, Rho-관련 이중 나선 키나아제 (ROCK) 의 저해제를 배양 개시부터 제 1 배양 공정에 사용되는 배지에 첨가하는 것이 바람직하다 (JP-A-2008-99662). ROCK 저해제는, 배양 개시로부터, 예를 들어 15 일 이내, 바람직하게는 10 일 이내, 더욱 바람직하게는 6 일 이내에 첨가된다. ROCK 저해제의 예에는, Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드) 등이 포함된다. 부유 배양에 사용되는 ROCK 저해제의 농도는, 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들어, Y-27632 에 있어서, 이러한 농도는 통상적으로 약 0.1 내지 200 μM, 바람직하게는 약 2 내지 50 μM 이다. ROCK 저해제의 농도는 이의 첨가 기간 중에 변경 가능하며, 예를 들어, 기간의 후반에 농도가 반감될 수 있다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 기초 배지로서 포유동물의 세포 배양에 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지는, 포유동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지, 이들의 혼합 배지 등일 수 있다. 하나의 구현예에서, IMDM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지가 사용된다. 혼합비는, 예를 들어, 부피비로 IMDM:Ham's F-12 = 0.8 - 1.2:1.2 - 0.8 이다.

배양에 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학 합성이 아닌 성분의 혼입을 방지하기 위하여, 세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 무혈청 배지이다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물 등을 적절하게 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 방법을 보다 용이하게 시행하기 위하여, 시판용 혈청 대체물이 사용될 수 있다. 이러한 시판용 혈청 대체물의 예에는, 녹아웃 혈청 대체물 (Knockout Serum Replacement) (KSR, Invitrogen 사제), 화학 합성 지질 농축물 (Gibco Company 사제) 및 Glutamax (Gibco Company 사제) 가 포함된다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 다능성 줄기 세포의 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예에는, 비제한적으로, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어, 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어, 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어, 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민 등), 아미노산 (예를 들어, L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어, 2-메르캅토에탄올 등), 비타민 (예를 들어, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생제 (예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어, HEPES 등) 등이 포함된다.

하나의 구현예에서, 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화 유도에 대한 악영향을 방지하지 위하여, 세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 배지 중에 함유되는 것으로 특히 본 명세서에 기재된 것 이외에 성장 인자를 함유하지 않는, 혈청 대체물 (KSR 등) 이 보충된, 화학 합성 배지 (성장-인자-미함유 화학 합성 배지; gfCDM) 이다. 여기서 "성장 인자" 에는, Fgf; BMP; Wnt, Nodal, Notch, Shh 등과 같은 패턴 형성 인자; 인슐린 및 지질-풍부 알부민이 포함된다. 성장 인자 미함유 화학 합성 배지의 예에는 [Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008] 에 개시된 gfCDM 이 포함된다.

배양 온도, CO₂ 농도, O₂ 농도 등과 같은 세포 응집체의 부유 배양의 다른 배양 조건은 적절하게 설정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30 - 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO₂ 농도는, 예를 들어, 약 1 - 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. O₂ 농도는, 예를 들어, 약 20% 이다.

바람직한 구현예에서, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양한다. 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 사용함으로써, 응집체 간 선하수체 또는 이의 전구 조직으로의 분화 수준의 차이가 최소한으로 억제될 수 있으며, 목적하는 분화 유도 효율이 개선될 수 있다. 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단의 부유 배양에는, 하기 구현예가 포함된다.

(1) 복수의 배양 구획을 제조하고, 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체가 1 개의 배양 구획에 함유되도록, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 씨딩한다 (예를 들어, 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 위치시킴). 각각의 배양 구획에서, 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양한다.

(2) 복수의 다능성 줄기 세포 응집체가 1 개의 배양 구획에 함유되도록, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 씨딩한다 (예를 들어, 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 10 cm 디쉬에 위치시킴). 상기 배양 구획에서, 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양한다.

본 발명의 방법으로 구현예 (1) 및 (2) 중 임의의 것을 채용할 수 있고, 배양 중 구현예를 변경할 수도 있다 (구현예 (1) 에서 구현예 (2) 로, 또는 구현예 (2) 에서 구현예 (1) 로). 하나의 구현예에서, (1) 의 구현예를 제 1 배양 공정에서 채용하고, (2) 의 구현예를 제 2 배양 공정에서 채용한다.

제 1 배양 공정은, 다능성 줄기 세포에서의 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽의 분화를 유도하기에 충분한 기간 동안 실시된다. 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽으로의 분화는, 예를 들어, RT-PCR, 또는 시상하부 신경상피 조직 또는 표면 외배엽의 마커에 대하여 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 제 1 배양 공정은, 배양 중 세포 응집체의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상이 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유할 때까지 실시된다. 배양 기간은, 다능성 줄기 세포의 동물 종, 및 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 종류에 따라 가변적일 수 있기 때문에 절대적으로 명시될 수는 없지만, 제 1 배양 공정은, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포가 사용되는 경우, 일반적으로 15 - 20 일 (예를 들어, 18 일) 이다.

제 1 배양 공정을 실시함으로써, 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유하는 세포 응집체가 수득될 수 있다.

시상하부 신경상피 조직은 시상하부 마커를 발현하는 신경상피 조직이다. 시상하부에는 배쪽 시상하부 및 등쪽 시상하부가 포함된다. 시상하부 마커로서, NKx2.1 (배쪽 시상하부 마커), Pax6 (등쪽 시상하부 마커) 등이 언급될 수 있다. 하나의 구현예에서, 배쪽 시상하부 신경상피 조직은 Rx-양성, Chx10-음성, 및 Nkx2.1-양성 신경상피 조직이다. 하나의 구현예에서, 등쪽 시상하부 신경상피 조직은 Rx-양성, Chx10-음성, 및 Pax6-양성 신경상피 조직이다. 제 1 배양 공정에서 수득된 세포 응집체 중에 함유된 시상하부 신경상피 조직은 바람직하게는 배쪽 시상하부 신경상피 조직이다.

표면 외배엽은 배아 발달에서 배아의 표면 층에 형성되는 외배엽 세포 층이다. 표면 외배엽 마커로서, 판-시토케라틴이 언급될 수 있다. 표면 외배엽은 일반적으로 뇌하수체 전엽, 피부, 구강 상피, 치아 에나멜, 피부샘 등으로 분화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 표면 외배엽은 E-카드헤린-양성 및 판-시토케라틴-양성 세포 층이다.

바람직하게는, 시상하부 신경상피 조직은 제 1 배양 공정에서 수득된 세포 응집체의 내부를 차지하고, 단층 표면 외배엽의 세포는 세포 응집체의 표면을 구성한다. 표면 외배엽은 그 일부에 비후된 상피 플라코드를 함유할 수 있다.

(3.2) 제 2 배양 공정

제 2 배양 공정에서, 제 1 배양 공정에서 수득된, 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유하는 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 추가로 부유 배양하여, 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 함유하는 세포 응집체를 수득한다. 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 작용에 의해, 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 추가의 분화가 유도된다.

골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 정의는 제 1 배양 공정의 설명에 기재된 바와 같다.

바람직하게는, 제 2 배양 공정에 사용되는 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질은, 제 1 배양 공정에서와 같은 BMP4 이다. 바람직하게는, 제 2 배양 공정에 사용되는 Shh 신호 경로 작용 물질은, 제 1 배양 공정에서와 같은 SAG 이다.

배지 중 골 형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 세포 응집체에서 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화가 유도될 수 있는 범위 내에서 적절하게 결정될 수 있다. BMP4 가 골 형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질로서 사용되는 경우, 이의 농도는 일반적으로 0.01 nM 이상, 바람직하게는 0.1 nM 이상, 더욱 바람직하게는 1 nM 이상이다. 이의 상한은, 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 nM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 BMP4 의 농도는 일반적으로 0.01 - 1000 nM, 바람직하게는 0.1 - 100 nM, 더욱 바람직하게는 1 - 10 nM (예를 들어, 5 nM) 이다. 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 첨가 기간 중에 가변적일 수 있다. 예를 들어, 농도는 제 2 배양 공정의 개시 시에는 상기 언급된 농도로 설정될 수 있고, 매 2 - 4 일 마다 반감될 수 있다.

배지 중 Shh 신호 경로 작용 물질의 농도는, 세포 응집체에서 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 또는 라트케낭으로의 분화를 유도할 수 있는 범위 내에서 적절하게 설정될 수 있다. SAG 가 Shh 신호 경로 작용 물질로서 사용되는 경우, 이의 농도는 일반적으로 1 nM 이상, 바람직하게는 10 nM 이상, 더욱 바람직하게는 100 nM 이상이다. 이의 상한은, 뇌하수체 플라코드 또는 라트케낭으로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 μM 이하, 바람직하게는 100 μM 이하, 더욱 바람직하게는 10 μM 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 SAG 의 농도는 일반적으로 1 nM - 1000 μM, 바람직하게는 10 nM - 100 μM, 더욱 바람직하게는 100 nM - 10 μM (예를 들어, 2 μM) 이다.

바람직한 구현예에서, 제 2 배양 공정에 사용되는 배지는 FGF2 를 함유한다. FGF2 는 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드로의 분화를 촉진시킨다.

FGF2 는 또한 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 로 불리는 공지된 사이토카인이며, 이의 아미노산 서열 또한 공지되어 있다. 본 발명에 사용되는 FGF2 는 일반적으로 포유동물의 FGF2 이다. 포유동물의 예에는, 상기 언급된 것들이 포함된다. FGF2 는 다수의 포유동물의 종 사이에서 교차-반응성이 있기 때문에, 본 발명의 목적이 달성될 수 있는 한, 임의의 포유동물의 FGF2 가 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 배양되는 세포와 동일한 종의 포유동물의 FGF2 가 사용된다. 예를 들어, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 FGF2 가 사용된다. 여기서, 마우스 FGF2 는, FGF2 가 마우스의 생체 내에서 자연적으로 발현되는 FGF2 의 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 다른 단백질 등에 대해서도 마찬가지로 동일한 해석이 적용된다. 마우스 FGF2 의 대표적인 아미노산 서열의 예에는, NCBI 등록 번호 NP_032032.1 (2014 년 2 월 18 일 갱신), 이러한 아미노산 서열로부터 N-말단 신호 서열 (1-9) 을 제거하여 수득된 아미노산 서열 (성숙형 마우스 FGF2 아미노산 서열) 등이 포함된다. 인간 FGF2 의 대표적인 아미노산 서열의 예에는, NCBI 등록 번호 NP_001997.5 (2014 년 2 월 18 일 갱신) 등이 포함된다.

배지 중 FGF2 의 농도는, 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드로의 분화를 촉진시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 일반적으로 1 ng/ml 이상, 바람직하게는 10 ng/ml 이상이다. FGF2 농도의 상한은, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 500 ng/ml 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 FGF2 의 농도는 일반적으로 1 - 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 - 100 ng/ml 이다.

본 발명에 사용되는 BMP4 등과 같은 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 FGF2 는 바람직하게는 단리된 것이다. 제 2 배양 공정에 사용되는 배지 중에 함유된 단리된 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 단리된 FGF2 는, 배지에 외인성으로 첨가된 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 단리된 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 (및 임의로, 단리된 FGF2) 을 제 2 배양 공정에 사용되는 배지에 외인성으로 첨가하는 공정을 포함한다.

제 2 배양 공정에 사용되는 배지는, 제 1 배양 공정에 사용되는 배지와 같이, 기초 배지로서 포유동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지는, 포유동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지, 이들의 혼합 배지 등일 수 있다. 하나의 구현예에서, IMDM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지가 사용된다. 혼합비는, 예를 들어, 부피비로 IMDM:Ham's F-12 = 0.8 - 1.2:1.2 - 0.8 이다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물 등을 적절하게 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 방법을 보다 용이하게 시행하기 위하여, 시판용 혈청 대체물이 사용될 수 있다. 이러한 시판용 혈청 대체물의 예에는, 녹아웃 혈청 대체물 (KSR, Invitrogen 사제), 화학 합성 지질 농축물 (Gibco Company 사제) 및 Glutamax (Gibco Company 사제) 가 포함된다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예에는, 비제한적으로, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어, 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어, 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어, 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민 등), 아미노산 (예를 들어, L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어, 2-메르캅토에탄올 등), 비타민 (예를 들어, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생제 (예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어, HEPES 등) 등이 포함된다.

하나의 구현예에서, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화 유도에 대한 악영향을 방지하지 위하여, 세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 배지 중에 함유되는 것으로 특히 본 명세서에 기재된 것 이외에 성장 인자를 함유하지 않는, 혈청 대체물 (KSR 등) 이 보충된, 화학 합성 배지 (성장-인자-미함유 화학 합성 배지; gfCDM) 이다. 여기서 "성장 인자" 에는, Fgf; BMP; Wnt, Nodal, Notch, Shh 등과 같은 패턴 형성 인자; 인슐린 및 지질-풍부 알부민이 포함된다. 성장 인자 미함유 화학 합성 배지의 예에는 [Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008] 에 개시된 gfCDM 이 포함된다.

제 2 배양 공정에서의 부유 배양은 바람직하게는 고 산소 분압 조건 하에서 실시된다. 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 함유하는 세포 응집체가 고 산소 분압 조건 하에서 추가로 부유 배양되는 경우, 세포 응집체 내부로의 산소의 전달 및 세포 응집체의 장기간 동안의 유지 배양이 달성되며, 이는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 효율적인 분화 유도를 가능하게 한다.

고 산소 분압 조건은, 공기 중 산소 분압 (20%) 을 초과하는 산소 분압 조건을 의미한다. 제 2 배양 공정에서의 산소 분압은, 예를 들어, 30 - 60%, 바람직하게는 35 - 60%, 더욱 바람직하게는 38 - 60% 이다.

제 2 배양 공정에서의 배양 온도 및 CO₂ 농도와 같은 다른 배양 조건은 적절하게 설정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO₂ 농도는, 예를 들어, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.

제 2 배양 공정은 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화를 유도하기에 충분한 기간 동안 실시된다. 제 2 배양 공정을 실시함으로써, 뇌하수체 플라코드가 표면 외배엽에 형성된다. 뇌하수체 플라코드의 일부 또는 전부가 세포 응집체 (즉, 인접한 시상하부 신경상피) 내부에 함입되어 라트케낭을 형성할 수 있다. 표면 외배엽의 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화에는 본질적으로 표면 외배엽과 시상하부 신경상피 조직 (바람직하게, 배쪽 시상하부 신경상피 조직) 간의 상호작용이 요구된다. 본 발명에서, 제 1 배양 공정에 의해, 세포 응집체에 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽이 동시에 형성되고; 바람직한 구현예에서, 시상하부 신경상피 조직은 세포 응집체의 내부를 차지하고, 단층 표면 외배엽의 세포는 세포 응집체의 표면을 구성한다. 그 결과, 세포 응집체 내에서 인접한 표면 외배엽과 시상하부 신경상피 조직 간의 양호한 상호작용이 가능할 수 있으며, 표면 외배엽에서의 뇌하수체 플라코드 형성, 뇌하수체 플라코드의 함입, 라트케낭의 형성 등과 같은 배아 발달에서의 뇌하수체의 자가 조직화 과정이 시험관 내에서 재현될 수 있다. 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로의 분화는, 예를 들어, 뇌하수체 전구 세포 마커 (예를 들어, Lim3, Pitx1, Isl1/2 등) 에 대한 특이적 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 뇌하수체 전구 세포 마커-양성 플라코드 또는 주머니 구조의 형성을 검출함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 제 2 배양 공정은, 배양 중 세포 응집체의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상이 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 함유할 때까지 실시된다. 배양 기간은, 다능성 줄기 세포의 동물 종, 및 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 종류에 따라 가변적일 수 있기 때문에 절대적으로 명시될 수는 없지만, 제 2 배양 공정은, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포가 사용되는 경우, 일반적으로 6 일 이상, 예를 들어, 6 - 12 일이다.

제 2 배양 공정을 실시함으로써, 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 포함하는 세포 응집체가 수득될 수 있다.

(3.3) 제 3 배양 공정

제 2 배양 공정에서 수득된, 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 포함하는 세포 응집체를 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 추가로 부유 배양하여, 선하수체를 함유하는 세포 응집체를 수득할 수 있다 (제 3 배양 공정). 제 3 배양 공정에 의해, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화가 유도되고, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 생성됨으로써, 선하수체가 형성될 수 있다.

Shh 신호 경로 작용 물질의 정의는 제 1 배양 공정의 설명에 기재된 바와 같다.

바람직하게는, 제 3 배양 공정에 사용되는 Shh 신호 경로 작용 물질은, 제 1 및 제 2 배양 공정에서와 같은 SAG 이다.

배지 중 Shh 신호 경로 작용 물질의 농도는, 세포 응집체에서 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화를 유도할 수 있는 범위 내에서 적절하게 설정될 수 있다. SAG 가 Shh 신호 경로 작용 물질로서 사용되는 경우, 이의 농도는 일반적으로 1 nM 이상, 바람직하게는 10 nM 이상, 더욱 바람직하게는 100 nM 이상이다. 이의 상한은, 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 μM 이하, 바람직하게는 100 μM 이하, 더욱 바람직하게는 10 μM 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 SAG 의 농도는 일반적으로 1 nM - 1000 μM, 바람직하게는 10 nM - 100 μM, 더욱 바람직하게는 100 nM - 10 μM (예를 들어, 2 μM) 이다.

바람직한 구현예에서, 제 3 배양 공정에 사용되는 배지는 FGF2 를 함유한다. FGF2 는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화를 촉진시킨다.

FGF2 의 정의는 제 2 배양 공정에서의 설명에 기재된 바와 같다.

배지 중 FGF2 의 농도는, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 일반적으로 1 ng/ml 이상, 바람직하게는 10 ng/ml 이상이다. FGF2 농도의 상한은, 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 500 ng/ml 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 FGF2 의 농도는 일반적으로 1 - 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 - 100 ng/ml 이다.

바람직한 구현예에서, 제 3 배양 공정에 사용되는 배지는 노치 (Notch) 신호 저해제를 함유한다. 노치 신호 저해제는 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (특히, ACTH 생성 세포) 로의 분화를 촉진시킨다. 노치 신호 저해제는 ACTH 생성의 업스트림을 조절하는 전사 인자 Tbx19 의 발현을 증가시킨다.

노치 신호 저해제는, 노치에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 노치 신호 저해제의 예에는, DAPT (N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-l-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르), DBZ, MDL28170 등과 같은 감마 세크레타아제 저해제가 포함된다. 이들 중에서, DAPT 가 바람직하다.

배지 중 노치 신호 저해제의 농도는, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (특히, ACTH 생성 세포) 로의 분화를 촉진할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, DAPT 의 경우, 예를 들어, 일반적으로 0.1 μM 이상, 바람직하게는 1 μM 이상이다. DAPT 농도의 상한은, 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 μM 이하, 바람직하게는 100 μM 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 DAPT 농도는 일반적으로 0.1 - 1000 μM, 바람직하게는 1 - 100 μM (예를 들어, 10 μM) 이다.

제 3 배양 공정에서, 배지에의 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가는 필요하지 않다. 하나의 구현예에서, 제 3 배양 공정에 사용되는 배지는 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하지 않는다.

본 발명에 사용되는 FGF2 는 바람직하게는 단리된 것이다. 제 3 배양 공정에 사용되는 배지 중에 함유된 단리된 FGF2 는, 배지에 외인성으로 첨가된 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 단리된 FGF2 를 제 3 배양 공정에 사용되는 배지에 외인성으로 첨가하는 공정을 포함한다.

제 3 배양 공정에서, 배지에 코르티코스테로이드를 첨가하여, 세포 응집체를 코르티코스테로이드로 처리할 수 있다. 코르티코스테로이드 처리에 의해, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 ACTH 생성 세포 이외의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (즉, GH 생성 세포, PRL 생성 세포, TSH 생성 세포, LH 생성 세포, FSH 생성 세포 등) 로의 분화가 촉진된다. 코르티코스테로이드의 예에는, 비제한적으로, 히드로코르티손, 코르티손 아세테이트, 플루드로코르티손 아세테이트 등과 같은 천연 글루코코르티코이드; 및 덱사메타손, 베타메타손, 프레도니솔론, 메틸프레드니솔론, 및 트리암시놀론 등과 같은 인공 합성 글루코코르티코이드가 포함된다.

배지 중 코르티코스테로이드의 농도는, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (ACTH 생성 세포 제외) 로의 분화를 촉진시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 코르티코스테로이드의 종류에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 히드로코르티손의 경우, 예를 들어, 일반적으로 100 ng/ml 이상, 바람직하게는 1 ㎍/ml 이상이다. 히드로코르티손 농도의 상한은, 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (ACTH 생성 세포 제외) 로의 분화에 대한 악영향이 발견되지 않는 한 특별히 설정되지 않으나, 배양 비용의 관점에서, 일반적으로 1000 ㎍/ml 이하, 바람직하게는 100 ㎍/ml 이하이다. 하나의 구현예에서, 배지 중 히드로코르티손의 농도는 일반적으로 100 ng/ml - 1000 ㎍/ml, 바람직하게는 1 - 100 ㎍/ml 이다. 덱사메타손이 코르티코스테로이드로서 사용되는 경우, 배지 중 이의 농도는 히드로코르티손의 약 1/25 로 설정될 수 있다.

제 3 배양 공정에서, 코르티코스테로이드의 배지에의 첨가 시기는, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (ACTH 생성 세포 제외) 로의 분화를 촉진시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 제 3 배양 공정의 개시부터 코르티코스테로이드가 배지에 첨가되거나, 또는 제 3 배양 공정의 개시 후 일정 기간 동안 코르티코스테로이드 미함유 배지에서 배양한 후 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 제 3 배양 공정의 개시 후, 세포 응집체에서 ACTH 생성 세포의 출현이 확인되는 단계에서 코르티코스테로이드가 배지에 첨가된다. 즉, 세포 응집체는 세포 응집체에서 ACTH 생성 세포의 출현이 확인될 때까지 코르티코스테로이드 미함유 배지에서 배양되고, ACTH 생성 세포 출현이 확인된 후, 코르티코스테로이드 함유 배지에서 제 3 배양 공정이 계속된다. ACTH 생성 세포의 출현은 ACTH 에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학적 염색에 의해 확인될 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포가 사용되는 경우, ACTH 생성 세포의 출현은 일반적으로 제 3 배양 공정의 개시로부터 37 일차 또는 그 후로 예상될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 코르티코스테로이드는 제 3 배양 공정의 개시로부터 37 일차 또는 그 후에 배지에 첨가된다.

코르티코스테로이드로의 세포 응집체의 처리 기간은, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (ACTH 생성 세포 제외) 로의 분화가 촉진될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 일반적으로, 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (ACTH 생성 세포 제외) 로의 분화의 촉진이 코르티코스테로이드 비(非)처리군과 비교하여 코르티코스테로이드 처리군에서 확인될 때까지, 세포 응집체가 코르티코스테로이드로 처리된다. 처리 기간은 일반적으로 7 일 이상, 바람직하게는 12 일 이상이다. 처리 기간의 상한은 특별히 설정되지 않으나, 뇌하수체 호르몬 생성 세포 (ACTH 생성 세포 제외) 로의 분화 촉진이 코르티코스테로이드 비처리군과 비교하여 코르티코스테로이드 처리군에서 확인되는 단계에서, 코르티코스테로이드가 배지로부터 제거될 수 있다.

배지에의 코르티코스테로이드의 첨가는, 피드백 저해로 인한 ACTH 생성 세포 분화 유도에 대하여 억제적으로 작용한다.

제 3 배양 공정에 사용되는 배지는, 제 1 및 제 2 배양 공정에 사용된 배지와 같이, 기초 배지로서 포유동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지는, 포유동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, Ham's F-12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, Neurobasal 배지, 이들의 혼합 배지 등일 수 있다. 하나의 구현예에서, IMDM 배지 및 Ham's F-12 배지의 혼합 배지가 사용된다. 혼합비는, 예를 들어, 부피비로 IMDM:Ham's F-12 = 0.8 - 1.2:1.2 - 0.8 이다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 다능성 줄기 세포의 뇌하수체 플라코드로의 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예에는, 비제한적으로, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어, 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어, 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어, 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어, 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민 등), 아미노산 (예를 들어, L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어, 2-메르캅토에탄올 등), 비타민 (예를 들어, 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생제 (예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어, HEPES 등) 등이 포함된다.

하나의 구현예에서, 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화 유도에 대한 악영향을 방지하지 위하여, 세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는, 배지 중에 함유되는 것으로 특히 본 명세서에 기재된 것 이외에 성장 인자를 함유하지 않는, 혈청 대체물 (KSR 등) 이 보충된, 화학 합성된 배지 (성장-인자-미함유 화학 합성 배지; gfCDM) 이다. 여기서 "성장 인자" 에는, Fgf; BMP; Wnt, Nodal, Notch, Shh 등과 같은 패턴 형성 인자; 인슐린 및 지질-풍부 알부민이 포함된다. 성장 인자 미함유 화학 합성 배지의 예에는 [Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008] 에 개시된 gfCDM 이 포함된다.

제 3 배양 공정에서의 부유 배양은 바람직하게는 고 산소 분압 조건 하에서 실시된다. 1) 시상하부 신경상피 조직, 및 2) 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭을 함유하는 세포 응집체가 고 산소 분압 조건 하에서 추가로 부유 배양되는 경우, 세포 응집체 내부로의 산소의 전달, 및 세포 응집체의 장기간 동안의 유지 배양이 달성되며, 이는 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 효율적인 분화 유도를 가능하게 한다.

고 산소 분압 조건은, 공기 중 산소 분압 (20%) 을 초과하는 산소 분압 조건을 의미한다. 제 3 배양 공정에서의 산소 분압은, 예를 들어, 30 - 60%, 바람직하게는 35 - 60%, 더욱 바람직하게는 38 - 60% 이다.

제 3 배양 공정에서의 배양 온도 및 CO₂ 농도와 같은 다른 배양 조건은 적절하게 설정될 수 있다. 배양 온도는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO₂ 농도는, 예를 들어, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.

제 3 배양 공정은 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 기간 동안 실시된다. 제 3 배양 공정을 실시함으로써, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화가 유도되고, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭에서 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 생성됨으로써, 선하수체가 형성될 수 있다. 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로부터 유도된 뇌하수체 호르몬 생성 세포의 예에는, 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포는 CRH 자극에 대하여 ACTH 를 분비하고, ACTH 분비는 글루코코르티코이드에 의해 피드백 방식으로 억제된다. 하나의 구현예에서, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭의, 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종, 더욱 바람직하게는 3 종의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화가 유도되고, 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종, 더욱 바람직하게는 3 종의 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 함유하는 선하수체가 형성된다. 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포 이외에, 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 생성 세포, 난포-자극 호르몬 (FSH) 생성 세포, 황체형성 호르몬 (LH) 생성 세포, 멜라닌세포-자극 호르몬 (MSH) 생성 세포 등과 같은 다른 뇌하수체 호르몬 생성 세포가, 뇌하수체 플라코드 및/또는 라트케낭으로부터 유도될 수 있다. 즉, 제 3 배양 공정에 의해 형성된 선하수체는, 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종, 바람직하게는 2 종, 더욱 바람직하게는 3 종 이외에, 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 생성 세포, 난포-자극 호르몬 (FSH) 생성 세포, 황체형성 호르몬 (LH) 생성 세포, 멜라닌세포-자극 호르몬 (MSH) 생성 세포 등과 같은 다른 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 포함할 수 있다. 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화는, 예를 들어, 뇌하수체 호르몬에 대한 특이적 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 뇌하수체 호르몬 양성 세포를 검출함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 제 3 배양 공정은, 배양 중 세포 응집체의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상이 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 함유할 때까지 실시된다. 배양 기간은, 다능성 줄기 세포의 동물 종, 및 Shh 신호 경로 작용 물질의 종류에 따라 가변적일 수 있기 때문에 절대적으로 명시될 수는 없지만, 제 3 배양 공정은, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포가 사용되는 경우, 일반적으로 37 일 이상 (예를 들어, 37 - 70 일) 이다.

제 3 배양 공정을 실시함으로써, 선하수체를 포함하는 세포 응집체가 수득될 수 있다.

세포 응집체의 부유 배양은, 본 발명의 제조 방법에 의해 다능성 줄기 세포로부터 선하수체 또는 이의 전구 조직으로의 분화 유도가 가능한 한, 피더 세포의 존재 또는 부재 하에서 실시될 수 있다. 한정되지 않은 인자와의 혼입을 방지하기 위하여, 응집체의 부유 배양은 바람직하게는 피더 세포의 부재 하에서 실시된다.

본 발명의 제조 방법에서, 세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배양기는 특별히 제한되지 않는다. 이러한 배앙기에는, 예를 들어, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀이 포함된다. 비접착성 조건 하에서 배양을 가능하게 하기 위하여, 배양기는 세포-비접착성인 것이 바람직하다. 유용한 세포-비접착성 배양기에는, 배양기의 표면이 세포-비접착성이 되도록 인공적으로 처리된 배양기, 세포 접착성이 향상되도록 인공적으로 처리 (예를 들면, 세포외 기질 등으로의 코팅 처리) 되어 있지 않은 배양기 등이 포함된다.

세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배양기로서, 산소-투과성인 것이 사용될 수 있다. 산소-투과성 배앙기를 사용함으로써, 세포 응집체에의 산소 공급을 개선하여, 세포 응집체의 장기간 동안의 유지 배양에 기여할 수 있다.

응집체의 부유 배양에서, 배앙기에 대하여 응집체가 비접착성인 상태로 유지될 수 있는 한, 응집체를 정치 배양에 적용하거나, 또는 회전 배양 또는 진탕 배양에 의해 의도적으로 이동시킬 수 있다. 하지만, 본 발명에서 회전 배양 또는 진탕 배양에 의해 응집체를 의도적으로 이동시킬 필요는 없다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 제조 방법에서의 부유 배양은 정치 배양으로 실시된다. 정치 배양은, 응집체의 의도적인 이동이 없는 상태로 응집체를 배양하는 배양 방법을 나타낸다. 예를 들어, 배지 온도의 국소적 변화에 따른 배지의 대류로 인해, 응집체의 이동이 일어날 수 있다. 하지만, 응집체가 의도적으로 이동되는 것이 아니기 때문에, 이와 같은 경우 또한 본 발명에서 정치 배양에 포함된다. 정치 배양은 부유 배양의 전체 기간 동안, 또는 단지 일부의 기간 동안 실시될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 정치 배양은 부유 배양의 전체 기간 동안 실시될 수 있다. 정치 배양은 장치가 필요하지 않고, 세포 응집체에 대한 손상을 보다 적게 야기하는 것으로 예상되며, 배양 배지의 양을 소량으로 할 수 있기 때문에 유리하다.

(4) 세포 응집체, 단리된 선하수체 또는 이의 전구 조직, 및 뇌하수체 호르몬 생성 세포의 용도

추가의 양태에서, 선하수체 또는 이의 전구 조직 (뇌하수체 플라코드, 라트케낭 등) 은 상기 언급된 바와 같이 수득된 세포 응집체로부터 단리될 수 있다. 또한, 트립신 등 및/또는 EDTA 등과 같은 프로테아제로의 선하수체의 처리에 의해, 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 단리될 수 있다. 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 및 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 수득된 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 및 뇌하수체 호르몬 생성 세포는, 이식 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 선하수체 (전엽 또는 중엽, 바람직하게는 전엽) 의 장애로 인한 질환 또는 선하수체 (전엽 또는 중엽, 바람직하게는 전엽) 의 손상 상태에서 해당하는 손상 부위를 보충하기 위한 치료제로서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 또는 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 수득된 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 또는 뇌하수체 호르몬 생성 세포를, 선하수체의 장애로 인한 질환 또는 선하수체의 손상 상태를 갖는 환자에게 이식함으로써, 선하수체의 장애로 인한 질환 또는 선하수체의 손상 상태를 치료할 수 있다. 이식 부위는, 이식된 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 및 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 장애가 있는 선하수체의 대체물로서 기능할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 신장 피막 하 등이 언급될 수 있다. 선하수체의 장애로 인한 질환의 예에는, 범하수체기능부전 (panhypopituitarism), 뇌하수체 왜소증, 부신피질부전, 부분적 뇌하수체기능부전, 전엽 뇌하수체 호르몬의 단독 결손증 등이 포함된다. 나아가, 선하수체의 손상 상태의 예에는, 선하수체절제수술한 환자, 뇌하수체 종양에 대한 방사선 조사 후 환자, 외상이 포함된다.

이식 요법에서, 조직 적합성 항원의 차이로 인한 거부 반응이 종종 문제로 제기된다. 하지만, 이러한 문제는 이식 수혜자의 체세포에서 확립된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포) 를 사용함으로써 해결될 수 있다. 즉, 바람직한 구현예에서, 수혜자의 체세포에서 확립된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포) 를 본 발명의 방법에서 다능성 줄기 세포로서 사용하여, 수혜자에 대하여 면역학적으로 그 자신인, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 또는 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 제조하고, 수혜자에게 이식한다.

나아가, 본 발명에 의해 수득된 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직, 또는 뇌하수체 호르몬 생성 세포는, 약물의 스크리닝 및 평가에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 수득가능한 선하수체 또는 이의 전구 조직은, 생체 내 선하수체 또는 이의 전구 조직과 유사한 고차 구조를 가지고 있기 때문에, 선하수체의 장애로 인한 질환, 및 손상된 선하수체를 위한 치료제의 스크리닝, 의약품의 부작용 및 독성 시험, 및 선하수체 질환의 신규한 치료 방법의 개발 등에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 선하수체의 장애로 인한 질환, 특히 유전성인 선하수체의 장애로 인한 질환을 앓는 인간 환자로부터 iPS 세포를 제조하고, 상기 iPS 세포를 사용하여, 본 발명의 방법에 의해 선하수체 또는 이의 전구 조직을 함유하는 세포 응집체를 제조한다. 수득된 세포 응집체 중에 함유된 선하수체 또는 이의 전구 조직으로 시험관 내에서 환자의 질환을 야기하는 선하수체의 장애를 재현할 수 있다. 장애가 있는 선하수체 또는 이의 전구 조직을 함유하는 세포 응집체, 또는 이로부터 단리된 장애가 있는 선하수체 또는 이의 전구 조직을, 시험 물질의 존재 또는 부재 (음성 대조군) 하에서 배양한다. 이어서, 시험 물질로 처리된 세포 응집체, 선하수체 또는 이의 전구 조직의 장애 수준을 음성 대조군과 비교한다. 그 결과, 장애 정도를 감소시킨 시험 물질을 장애로 인한 질환의 치료제 후보 물질로서 선택할 수 있다. 또한, 시험 물질로서, 약제로서 안정성이 확인된 물질을 사용하여 선택된 물질의 치료적 유효량을, 스크리닝에 사용되는 세포 응집체, 또는 선하수체 또는 이의 전구 조직의 기원이 되는 환자에게 투여함으로써, 상기 환자에서 선하수체의 장애로 인한 질환을 치료할 수 있다. 나아가, 장애가 있는 선하수체 또는 이의 전구 조직을 함유하는 세포 응집체, 또는 이로부터 단리된 장애가 있는 선하수체 또는 이의 전구 조직을 사용하여, 상기 장애로 인한 질환을 위한 의약품의 부작용, 독성 시험, 및 신규한 치료 방법의 개발을 실시할 수 있다.

본 발명을 하기 실시예를 참조로 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1] 인간 다능성 줄기 세포에서의 배쪽 시상하부 및 상피 플라코드의 입체 형성

(방법)

인간 ES 세포 (KhES-1) 를 통상의 방법에 의해 MEF 상에서 유지 배양한 것을 사용하였다. 시상하부 조직으로의 분화 유도를 모니터링하기 위하여, Venus cDNA 가 시상하부 신경상피 마커인 Rx 유전자 내에 녹인 (knock in) 된 KhES-1 를 사용하였다. 인간 ES 세포를 응집체의 무혈청 부유 배양 (SFEBq 법) 으로 분화시키기 위하여, 인간 ES 세포를 Nakano 등의 방법 (Cell Stem Cell, 2012) 에 의해 효소를 이용하여 단일 세포로 분산시키고, 세포 접착성이 낮은 V-바닥 96 웰 플레이트 (SUMITOMO BAKELITE) 에서 재응집시켰다. 웰 당 5,000 개의 세포를 씨딩하고, 하기 분화 배지 중에서, 5% CO₂, 37℃ 에서 배양하였다. gfCDM 배지 (성장-인자-미함유 화학 합성 배지; Wataya et al., PNAS, 2008) + 5% KSR (Invitrogen).

씨딩한 날을 분화 배양 0 일차로 하여, 20 μM Y-27632 (ROCK 저해제; 분산 중 세포사 저해제: Watanabe et al., Nature Biotechnology, 2007) 를 0 일차부터 3 일차까지 첨가하고, 배양 3 일차 및 6 일차에 배지의 절반을 Y-27632 미함유 분화 배지로 교환하였다. 배양 3 일차부터 18 일차까지, BMP4 (최종 농도 5 nM) 를 배지에 첨가하였다. 18 일차 이후에는, 배지의 절반을 매 3 일 마다 BMP4 미함유 배지로 교환하였다. 배양 6 일차 이후에는, SAG (최종 농도 2 μM) 를 배지에 첨가하였다. 18 일차 이후에는, 배양 중 산소 분압을 40% 로 설정하였다. 조직의 분화를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

상기 언급된 방법에 의해 배양된 인간 ES 세포의 응집체 내부는, 분화 배양 17 일차에, Rx::Venus-양성, Chx10 (망막 마커)-음성 시상하부 신경상피 조직으로 대부분 점유되어 있었으며, 반면 표면에는 E-카드헤린-양성 표면 외배엽이 단일 세포 층을 형성하고 있었다 (도 1A). 배양 24 일차에, Rx::Venus-양성 시상하부의 대부분은 배쪽 시상하부 마커인 Nkx2.1 로 발현되었다 (도 1B). 표면 외배엽은 표면 외배엽 (구강 외배엽 포함) 마커인 판-시토케라틴으로 발현되었지만, 이의 일부는 비후되어 상피 플라코드 (뇌하수체 플라코드 포함) 의 형태를 나타내었다 (도 1C).

[실시예 2] 뇌하수체 플라코드의 분화 및 라트케낭의 자가 조직화

(방법)

배쪽 시상하부 조직 및 상피 플라코드를 동시에 함유하는 인간 ES 세포 유래의 세포 응집체를 실시예 1 의 방법에 의해 형성하고, 유사한 조건 하에서 배양 27 일차 또는 30 일차까지 배양을 계속하고, 응집체를 형광 항체법으로 분석하였다. 일부 배양에서는, FGF2 (최종 농도 20 ng/ml) 를 배양 15 일차부터 배지에 첨가하였다.

(결과)

배양 27 일차 및 30 일차에, 판-시토케라틴-양성 상피 플라코드는 현저하게 비후되어 있었고, 형광 항체법에 의한 분석에서는, Lim3, Pitx1 및 Isl1/2 등과 같은 뇌하수체 전구 세포 마커가 강하게 발현되어 있었다 (도 2A). 이러한 마커를 발현하는 비후된 플라코드의 일부는 태아 라트케낭의 초기 형성에서와 같이 내부 쪽으로 합침되어 있었고 (도 2B), 다른 부분은 낭포를 형성하고 있었다 (도 2C). FGF2 의 첨가는 뇌하수체 플라코드의 형성을 30% 증가시켰다.

[실시예 3] 뇌하수체 플라코드의 분화 유도에서의 BMP4 의 역할

(방법)

실시예 1 의 방법에 의해, 세포 응집체 분화에 대한 BMP4 첨가 유무의 효과를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

BMP4 를 첨가하지 않는 경우, 배양 24 일차 응집체 표면에는 표면 외배엽이 형성되어 있지 않았고, 신경상피가 전체 표면을 차지하고 있었다. 신경상피의 대부분이 Rx::Venus 를 발현하지 않고, FoxG1-양성이며, 대뇌 조직을 형성하고 있다는 것을 확인하였다 (도 3a, b). SAG 를 첨가하지 않는 경우, FoxG1-양성 및 Pax6-양성 대뇌 피질이 분화되었고, SAG 를 첨가한 경우, FoxG1-양성 및 Nkx2.1-양성 대뇌 기저핵이 분화되었다 (도 3a-d). 따라서, 외인성 BMP4 가 1) 표면 외배엽의 적극적 형성 및 2) 대뇌가 아니라 시상하부 (뇌하수체 플라코드 유도에 필수적임) 신경 조직의 분화 유도의 2 가지 역할을 동시에 수행한다는 것이, 인간 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양으로 밝혀졌다.

[실시예 4] 뇌하수체 플라코드의 분화 유도에서의 헤지호그 신호의 역할

(방법)

실시예 1 의 방법에 의해, 세포 응집체 분화에 대한 헤지호그 신호 작용제 SAG 첨가 유무의 효과를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

SAG 를 첨가하거나 첨가하지 않은 경우, 배양 24 일차 및 27 일차 응집체 표면에는 표면 외배엽이 형성되어 있었고, Rx::Venus-양성 조직이 이의 전체 내부를 차지하고 있었다 (도 4a, b). SAG 를 배양 6 일차부터 첨가한 경우, 실시예 1, 2 에서와 같이, 배쪽 시상하부 조직 (Rx::Venus-양성, Chx10-음성, Nkx2.1-양성) 이 응집체 내부에 형성되어 있었고, 뇌하수체 플라코드가 표면에 형성되어 있었다 (도 4b, d, e). 한편, SAG 를 첨가하지 않은 경우, 신경 망막 조직 (Rx::Venus-양성, Chx10-양성, Nkx2.1-음성) 이 내부에 형성되어 있었고, 표면에서 뇌하수체 플라코드의 형성은 관찰되지 않았다 (도 4a, c). 따라서, 강한 헤지호그 신호를 알맞은 시기에 작용시킴으로써, 신경 망막이 아니라 배쪽 시상하부가 효율적으로 형성될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

[실시예 5] 뇌하수체 플라코드에서의 ACTH 생성 내분비 세포의 분화 유도

(방법)

실시예 1, 2 에서와 동일한 방식으로, 인간 ES 세포 응집체의 부유 배양에 의해 뇌하수체 플라코드를 자가 조직화하였다. 배양 30 일차부터, 응집체를 EZ Sphere 플레이트로 옮기고, 40% O₂, 5% CO₂, 37℃ 에서 부유 배양을 계속하였다. 배양 30 일차부터 45 일차까지, gfCDM + 10% KSR 에 SAG (2 μM), FGF2 (20 ng/ml) 를 보충한 것을 배지로서 사용하였다. 배양 45 일차 이후에는, KSR 농도가 20% 증가된 유사한 배지를 배양에 사용하였다. 내분비 세포의 분화를 형광법으로 분석하였다.

(결과)

배양 67 일차 샘플에서, 다수의 ACTH 생성 세포를 Pitx1-양성 뇌하수체 조직에서 형광 항체법으로 확인하였다 (도 5a, b). 유사한 ACTH-양성 세포를 또한 배양 70 일차 및 100 일차 샘플에서 확인하였다 (도 5c, d).

[실시예 6] CRH 에 의한, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 뇌하수체 내분비 세포에서의 ACTH 방출 유도

(방법)

실시예 5 의 방법으로 제조한 ACTH 생성 세포 함유 응집체를 사용하여 시험관 내 호르몬 분비능을 분석하였다. 배양 80 일차에, 16 개의 응집체를 함유하는 250 ㎕ 의 HBSS(-) 함유 1.5 ml Eppendorf 튜브를 사용하여, 응집체를 CRH (1 ㎍/ml) 존재 또는 부재 하에서 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 배양 상청액 중 ACTH 의 농도를 ELISA 법으로 정량화하였다.

나아가, 다운스트림 호르몬 (글루코코르티코이드) 에 의한 피드백 억제 능력을 시험하기 위하여, 배양 80 일차 16 개의 응집체를 히드로코르티손 (20 ㎍/ml) 존재 또는 부재 하에서 37℃ 에서 3 시간 동안 예비인큐베이션하고, CRH 처리 후 ACTH 방출 효과를 분석하였다.

(결과)

CRH (1 ㎍/ml) 존재 하에서의 인큐베이션 후 배양 상청액에서는, CRF 부재 하에서의 인큐베이션 후 배양 상청액과 비교하여 ACTH 가 5-배 이상의 농도로 분비되었다 (도 6a).

히드로코르티손 (20 ㎍/ml) 존재 하에서 예비인큐베이션한 군에서는, 이의 부재 하에서 예비인큐베이션한 군과 비교하여 ACTH 농도가 1/7 미만으로 감소하였다 (도 6b).

[실시예 7] CRH 에 의한, ES 세포 유래의 ACTH 생성 세포에서의 생체 내 ACTH 및 코르티코스테로이드 분비

(방법)

실시예 5 의 방법 (단, Fgf2 를 첨가하지 않음) 으로 인간 ES 세포에서 분화된 ACTH 생성 세포 응집체를, 뇌하수체 적출 마우스의 신장 피막 하에 이식하였다. 이식 전, 뇌하수체 적출 후 CRH 부하 시험을 실시하여 이러한 마우스가 ACTH 분비능을 손실하였다는 것을 확인하였다.

구체적으로, 응집체를 72 내지 82 일 동안 배양하고, ACTH 생성 세포를 함유하는 뇌하수체 플라코드를 응집체로부터 잘라내고, 뇌하수체 적출 마우스의 신장 피막 하에 마이크로주사기를 이용하여 이식하였다. 이식 14 일 후, CRH 부하 시험을 실시하고, 부하 전 혈장 ACTH 값과 부하 후 혈장 ACTH 및 코르티코스테로이드 (코르티코스테론) 값을 ELISA 법으로 측정하였다.

(결과)

신장 피막 하에 이식된 ES 세포 유래의 ACTH 생성 세포가 이식 후 14 일차에도 붙어있다는 것을 형광 항체법으로 확인하였다 (도 7a, b). 대조군에서 (모의 조작 (Sham operation)), CRH 부하 후, 혈장 ACTH 값은 3 pg/ml 미만이었고, 코르티코스테론 값은 0.2 ng/ml 미만이었다. 한편, 이식 군에서, CRH 부하 후, ACTH 값은 50-60 pg/ml 이었고, 코르티코스테론 값은 19 ng/ml 였다 (도 7c, d). 또한, 이식 군에서, CRH 부하 후 ACTH 값은 부하 전 ACTH 값의 4 배 이상이었다 (도 7c).

[실시예 8] ES 세포 유래의 ACTH 생성 세포 이식에 의한 뇌하수체 적출 마우스에서의 활동성, 생존 및 체중 감소 개선

(방법)

인간 ES 세포 유래의 ACTH 생성 세포를 실시예 7 과 같이 뇌하수체 적출 마우스 (9-주령) 의 신장 피막 하에 이식하였다. 이식된 마우스의 생존 및 체중 변화를 시간의 흐름에 따라 관찰하고, 마우스의 운동을 또한 대조군 (모의 조작) 과 비교하여 평가하였다. 마우스의 운동에 대해서는, 마우스가 하루에 러닝 휠 (running wheel) 을 몇 번 회전하였는지를 ENV-044 (MedAssociates, Georgia) 를 사용하여 측정하였다 (러닝 휠 활동성 시험 (Running wheel activity test)). 또한, IR 센서 (MDC-W02 (Brain Science Idea, Osaka)) 를 사용하여, 케이지 내에서의 마우스의 자발적 이동 거리도 측정하였다 (홈-케이지 활동성 시험 (Home-cage activity test)).

(결과)

이식 군의 마우스는 대조군과 비교하여 높은 수준의 운동을 나타내었다 (도 8a, b).

대조군에서는 모의 조작 후 64 일차까지 모든 마우스가 죽었지만, 이식 군에서는 마우스의 83% 가 생존해 있었다 (도 8c). 나아가, 이식 군은 대조군과 비교하여 조작 후 3 및 4 주 내에 체중 감소를 거의 나타내지 않았다 (도 8d).

[실시예 9] 노치 신호 저해제에 의한 ACTH 생성 내분비 세포 분화 유도의 촉진

(방법)

실시예 5 의 방법에 따라, 인간 ES 세포 유래의 뇌하수체 플라코드를 형성하고, 장기 배양하였다. 노치 신호 저해제 DAPT (10 μM) 를 배양 65 일차부터 74 일차까지 작용시키고, 이의 효과를 qPCR 법으로 분석하였다.

(결과)

qPCR 법으로 DAPT 처리 군과 비처리 군을 비교하면, 배양 74 일차 응집체에서 ACTH 생성의 업스트림을 제어하는 ACTH 생성 세포 마커인 전사 인자 Tbx19 의 발현이, 처리 군에서 8 배 이상 증가되어 있었다 (도 9).

[실시예 10] 뇌하수체 플라코드에서의 GH- 및 PRL 생성 내분비 세포의 분화 유도

(방법)

실시예 5 의 방법에 따라, 인간 ES 세포 유래의 뇌하수체 플라코드를 형성하고, 장기 배양하였다. 배양 67 또는 70 일차에, 내분비 세포의 분화를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

배양 67 일차 Pitx1-양성 뇌하수체 플라코드를 분석한 결과, ACTH 생성 세포 뿐 아니라 PRL 생성 세포가 확인되었다 (도 10a). 배양 70 일차 Pitx1-양성 뇌하수체 플라코드를 분석한 결과, 다수의 GH 생성 세포도 검출되었다 (도 10b).

[실시예 11] 인간 다능성 줄기 세포에서의 등쪽 시상하부의 입체 형성

(방법)

분화 유도 후 6 일차까지는 세포를 실시예 1 의 배양 조건 하에서 배양하고, 6 일차 이후에는, 배지의 절반을 매 3 일 마다 BMP4 미함유 배지로 교환하였다. SAG (최종 농도 1 μM) 를 6 일차부터 12 일차까지 배지에 첨가하였다. 18 일차 이후에는, 배양 중 산소 분압을 40% 로 설정하였다. 조직의 분화를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

상기 언급된 방법으로 배양된 인간 ES 세포 응집체 내부에서, 분화 배양 24 일차에, 등쪽 시상하부의 신경상피 (Rx:: venus-양성, Pax6-양성, Chx10-음성) 가 배쪽 시상하부 조직 (Rx:: venus-양성, Nkx2.1-양성, Chx10-음성) 과 함께 관찰되었다 (도 11a). 분화 배양 81 일차에는, 등쪽 시상하부의 후기 마커인 Otp 의 발현도 확인되었다 (도 11b). 따라서, 실시예 1 의 분화 조건보다 BMP4 의 작용 기간을 단축시키고, 추가로 SAG 의 농도를 감소시킴으로써, 등쪽 시상하부가 효율적으로 형성될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

[실시예 12] GRF 에 의한, 인간 다능성 줄기 세포 유래의 뇌하수체 내분비 세포에서의 GH 방출 유도

(방법)

실시예 10 의 방법에 더하여, 배양 72 일차부터 84 일차까지 히드로코르티손 (1 ㎍/ml) 함유 배지에서 분화시킨 GH 생성 세포를 함유하는 응집체를 사용하여, 시험관 내 호르몬 분비능을 분석하였다. 배양 84 일차의 33 개의 응집체를 함유하는 500 ㎕ 의 HBSS 함유 1.5 ml Eppendorf 튜브를 사용하여, 응집체를 GRF (100 ng/ml) 의 존재 또는 부재 하에서 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 배양 상청액 중 GH 의 농도를 ELISA 법으로 정량화하였다.

(결과)

GRF 존재 하에서의 인큐베이션 후 배양 상청액에는, GRF 부재 하에서의 인큐베이션 후 배양 상청액과 비교하여 GH 가 6 배 이상의 농도로 분비되어 있었다 (도 12).

[실시예 13] GRF 에 의한, 덱사메타손에 의해 유도된 GH 생성 세포에서의 GH 방출 유도

(방법)

실시예 10 의 방법에 더하여, 배양 70 일차부터 84 일차까지 덱사메타손 (40 ng/ml) 함유 배지에서 분화시킨 GH 생성 세포를 함유하는 응집체를 사용하여, 시험관 내 호르몬 분비능을 분석하였다. 배양 84 일차의 30 개의 응집체를 함유하는 750 ㎕ 의 배지 함유 1.5 ml Eppendorf 튜브를 사용하여, 응집체를 GRF (0.1, 1, 10 ㎍/ml) 의 존재 하에서 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 배양 상청액 중 GH 의 농도를 ELISA 법으로 정량화하였다.

또한, 소마토스타틴에 의한 GH 분비 억제능을 시험하기 위하여, 배양 98 일차의 18 개의 응집체를 소마토스타틴 (100 ng/ml) 의 존재 또는 부재 하에서 37℃ 에서 90 분 동안 인큐베이션하고, GRF 처리 후 GH 방출에 대한 효과를 분석하였다.

(결과)

덱사메타손을 분화 배지에 첨가하지 않은 경우에는, GRF 와 함께 인큐베이션한 경우에 비해, 배양 상청액 중 GH 의 농도가 매우 낮았다. 대조적으로, 덱사메타손을 첨가한 경우에는, 배양 상청액 중 GRF 에 대한 GH 분비가 확인되었다 (도 13a).

소마토스타틴 (100 ng/ml) 존재 하에서 예비인큐베이션한 군에서는, 소마토스타틴 부재 하에서 예비인큐베이션한 군에 비해, GH 농도가 약 1/4 감소되어 있었다 (도 13b)

[실시예 14] 뇌하수체 플라코드에서의 TSH 생성 내분비 세포의 분화 유도

(방법)

실시예 13 의 방법에 따라 84 일 동안 배양한 내분비 세포의 분화를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

배양 84 일차의 뇌하수체 플라코드를 분석한 결과, GH-, PRL 생성 세포 이외에 TSH 생성 세포가 확인되었다 (도 14a-c).

[실시예 15] 뇌하수체 플라코드에서의 LH/FSH 생성 내분비 세포의 분화 유도

(방법)

실시예 8 의 방법에 더하여, 배양 72 일차부터 82 일차까지 노치 신호 저해제 DAPT (10 μM) 와 반응시킨 뇌하수체 플라코드의 분화를 형광 항체법으로 분석하였다.

(결과)

뇌하수체 플라코드에서 LH 생성 세포 및 FSH 생성 세포가 확인되었다 (도 15a, b).

본 발명에 따라, 인간 다능성 줄기 세포로부터 선하수체 또는 이의 전구 조직을 시험관 내에서 효율적으로 유도할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 응집체에서 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽 둘 모두가 동시에 형성되고, 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭은 이의 상호작용에 의해 자가 조직화된다. 본 발명에 따라, 생체 내 뇌하수체에서와 동일한 방식으로, 시상하부 자극 및 다운스트림 표적 조직으로부터의 피드백 조절에 대하여 뇌하수체 호르몬의 분비를 조절하는 능력을 갖는 인간 선하수체를 시험관 내에서 구축할 수 있다.

특허 및 특허 출원을 비롯한 본원에 인용된 임의의 출판물에 개시된 내용은, 이들이 본원에 개시된 정도까지, 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제 2014-152384 호 (출원일: 2014 년, 7 월 25 일) 를 기반으로 하며, 상기 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에 포함된다.

Claims

선하수체를 포함하는 인간 세포 응집체의 제조 방법으로서,
(a) 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 부유 배양하여, 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 포함하는 인간 세포 응집체를 수득하는 공정,
(b) 수득된 시상하부 신경상피 조직 및 표면 외배엽을 포함하는 인간 세포 응집체를 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질 및 Shh 신호 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 추가로 부유 배양하여, 표면 외배엽에서 뇌하수체 플라코드 (placode), 라트케낭 (Rathke's pouch), 또는 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭의 형성을 유도함으로써, (i) 시상하부 신경상피 조직, 및 (ii) 뇌하수체 플라코드, 라트케낭, 또는 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭을 포함하는 인간 세포 응집체를 수득하는 공정, 및
(c) (i) 시상하부 신경상피 조직, 및 (ii) 뇌하수체 플라코드, 라트케낭, 또는 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭을 포함하는 인간 세포 응집체를 Shh 신호 경로 작용 물질을 포함하는 배지에서 부유 배양하여, 뇌하수체 플라코드, 라트케낭, 또는 뇌하수체 플라코드 및 라트케낭의 뇌하수체 호르몬 생성 세포로의 분화를 유도함으로써, 시상하부 신경상피 조직 및 선하수체를 포함하는 인간 세포 응집체를 수득하는 공정을 포함하고,
골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF5로 이루어진 군으로부터 선택되고, Shh 신호 경로 작용 물질이 헤지호그 계열에 속하는 단백질, Shh, Shh 수용체, Shh 수용체 작용제, 푸르모르파민 및 평활화된 작용제 (Smoothened Agonist) (SAG)(3-클로로-N-[트랜스-4-(메틸아미노)시클로헥실]-N-[[3-(4-피리디닐)페닐]메틸]-벤조[b]티오펜-2-카르복사미드) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 세포 응집체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 공정 (b) 에서 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 배지 교환에 의해 감소되는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 공정 (b) 에서 사용되는 배지가 FGF2 를 추가로 포함하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 공정 (c) 에서 사용되는 배지가 FGF2 를 추가로 포함하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 공정 (c) 에서 사용되는 배지가 노치 (Notch) 신호 저해제를 추가로 포함하는 제조 방법.
제 5 항에 있어서, 노치 신호 저해제가 DAPT 인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 뇌하수체 호르몬 생성 세포가 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 골 형성 단백질 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, Shh 신호 경로 작용 물질이 SAG 인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 시상하부 신경상피 조직이 배쪽 시상하부 신경상피 조직인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 부유 배양을 피더 (feeder) 세포 부재 하에서 실시하는 제조 방법.
선하수체의 제조 방법으로서,
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 시상하부 신경상피 조직 및 선하수체를 포함하는 인간 세포 응집체를 제조하는 공정, 및
상기 세포 응집체로부터 선하수체를 단리하거나 또는 물리적으로 잘라내는 공정을 포함하는 선하수체의 제조 방법.
뇌하수체 호르몬 생성 세포의 제조 방법으로서,
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 시상하부 신경상피 조직 및 선하수체를 포함하는 인간 세포 응집체를 제조하는 공정,
상기 세포 응집체로부터 선하수체를 단리하거나 또는 물리적으로 잘라내는 공정, 및
상기 선하수체로부터 뇌하수체 호르몬 생성 세포를 단리하는 공정을 포함하는 뇌하수체 호르몬 생성 세포의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 시상하부 신경상피 조직 및 선하수체를 포함하는 인간 세포 응집체로서, 선하수체가 성장 호르몬 (GH) 생성 세포, 프로락틴 (PRL) 생성 세포, 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 생성 세포를 함유하는 인간 세포 응집체.
제 15 항에 있어서, 선하수체가 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 생성 세포, 난포-자극 호르몬 (FSH) 생성 세포, 황체형성 호르몬 (LH) 생성 세포, 또는 멜라닌세포-자극 호르몬 (MSH) 생성 세포를 추가로 함유하는 인간 세포 응집체.