WO2021145319A1 - 細胞培養用培地組成物 - Google Patents

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WO2021145319A1
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晋平 小川
拓哉 樋口
俊平 風呂光
伊藤　健一郎
恵 西山
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味の素株式会社
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for cells, and more particularly to a medium composition for high-density suspension culture of cells.
  • Patent Document 1 reports a method for culturing stem cells, which comprises treating the stem cells with a ROCK inhibitor in a medium.
  • Patent Document 2 reports a high-density culture method of animal cells by adding glucose and / or a specific amino acid to a medium in 2018 (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 is one of the very excellent methods as a high-density culture method for animal cells including pluripotent stem cells, but this time, the present inventors have reexamined the method. An attempt was made to develop a more preferable high-density culture method for cells.
  • the present inventors have determined the amount of basic fibroblast growth factor (bFGF) previously recommended in the art in high-density culture by suspension culture of cells.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the addition of a large amount of bFGF can maintain the undifferentiated state of the pluripotent stem cells cultured at high density very well, and the addition of a large amount of bFGF was added.
  • pluripotent stem cells prepared by high-density culture in a medium have extremely good differentiation potential, and further research was carried out based on such findings to complete the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a medium composition for cell culture which comprises 150 ng / mL or more of basic fibroblast growth factor (bFGF) or a stabilized bFGF having a concentration equivalent to that of bFGF.
  • the medium composition according to [1] which is used for suspension culture.
  • the cell density of cells suspension culture is 6.0 ⁇ 10 5 cells / mL or more, [3] the medium composition.
  • [6] A method for culturing cells, which comprises suspending and culturing cells in the medium composition according to [1]. [7] The method according to [6], wherein a stabilized bFGF having a bFGF of 10 to 1000 ng / mL / day or a concentration equivalent to that of bFGF is added to the medium. [8] a cell density of pluripotent stem cells suspension culture is 6.0 ⁇ 10 5 cells / mL or more, [6] or [7] The method according. [9] The method according to any one of [6] to [8], wherein the cell is a pluripotent stem cell, an adult stem cell, or a progenitor cell.
  • cells can be prepared extremely efficiently. Further, according to the present invention, high-quality pluripotent stem cells having a good undifferentiated state and good differentiation ability can be prepared very efficiently.
  • FIG. 3 is a diagram showing that the desired effect of the present invention can be obtained even by using stabilized bFGF.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes over time in the number of cells (VCD: Viable Cell Density) when iPS cells are cultured in a medium containing a high concentration of bFGF.
  • FIG. 5 is a diagram showing the expression level of CD30 in iPS cells cultured in a medium containing a high concentration of bFGF.
  • iPS cells cultured in a medium containing a high concentration of bFGF is a high density state of more than 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL, high efficiency paraxial mesoderm (PM: Paraxial Mesoderm) It is a figure which shows that it was able to differentiate into.
  • FIG. 7 is a diagram showing that cells induced to differentiate from iPS cells cultured in a medium containing a high concentration of bFGF highly express PLL1 (PM marker).
  • suspension culture refers to a cell culture method performed in a state where cells do not adhere to a culture vessel.
  • the suspension culture may or may not be accompanied by external pressure or vibration on the liquid medium, or shaking or rotation operation in the liquid medium.
  • high density culture refers to culture at a cell density higher than that assumed in general cell culture. Dense criteria may differ depending on the kind or the like of the culture method (contact culture / suspension culture, etc.) or cells, for example, the case of suspension culture iPS cells, 6 ⁇ 10 5 cells / mL or more in the specification Culturing at a density of (preferably 2 ⁇ 10 6 cells / mL or higher) is defined as high density culture.
  • pluripotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into all the tissues and cells constituting the living body.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • adult stem cell also referred to as somatic stem cell
  • somatic stem cell means a cell having an ability to differentiate into a cell constituting a specific tissue (organ).
  • adult stem cells include, but are not limited to, hematopoietic stem cells, nerve stem cells, reproductive stem cells, intestinal stem cells, epidermal stem cells, and mesenchymal stem cells.
  • the "progenitor cell” means a cell in the process of differentiating from the pluripotent stem cell or adult stem cell described above into a specific somatic cell or germ cell.
  • the present invention is a medium composition for cell culture containing a basic fibroblast growth factor (bFGF) of 150 ng / mL or more, or a stabilized bFGF having a concentration equivalent to that of bFGF. (Hereinafter, it may be referred to as "medium composition of the present invention").
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the medium composition of the present invention can be prepared by adding a very high concentration of bFGF to a general basal medium for cells.
  • the medium for cells used in preparing the medium composition of the present invention may be prepared by a method known per se according to the cells to be cultured, or may be a commercially available product. ..
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • F12 Ham's Nutrition Mixture F12
  • DMEM / F12 medium McCoy's medium
  • McCoy's McCoy's medium
  • 5A Medium Minim's Essential Medium (MEM), Eagle's Minim's Essential Medium (EMEM), ⁇ 's Modified Eagle's Minim's Medium Essential Medium' ⁇ MEM), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, Iskov's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), MCDB131 medium, William's Medium E (Willi's Medium) ), Fisher's Medium, and the like.
  • the medium for culturing stem cells for example, STEMPRO (registered trademark) hESC SFM medium (Life Technologies), mTeSR1 medium (STEMCELL Technologies), TeSR2 medium (STEMCELL Technologies-TechLegies), TeSR2 Medium (STEMCELL Technologies) , Essential 8 medium (Life Technologies), HESCGRO (trademark) Serum-Free Medium for hES cells (Millipore), Pluristem (trademark) Human ES / iPS Medium (EMD) Medium (Biological Industries Islael Beat-Haemek), NutriStem (trademark) XF / FF Culture Medium (Stemment), AF NutriStem (registered trademark) hESC XF Medium Medium (Biological) Medium Biomedical Co., Ltd.), StemFit (registered trademark) AK03N medium (Ajinomoto Co., Ltd.), hESF9 medium, hESF-FX medium, CDM medium, DEF-CS 500 Xeno-
  • the amount of bFGF contained in the medium for culturing cells is at most about 100 ng / mL. This is because it is believed that the addition of bFGF at higher concentrations has a constant effect on cell proliferation and / or undifferentiation.
  • the lower limit of the concentration of bFGF contained in the medium composition of the present invention is usually 150 ng / mL, preferably 200 ng / mL, more preferably 250 ng / mL, still more preferably 275 ng / mL, and particularly preferably 300 ng / mL. It is possible, and it may be more than this.
  • the upper limit is not particularly limited, but from the viewpoint of cost and the like, it may be usually 1500 ng / mL, preferably 1000 ng / mL, more preferably 800 ng / mL, still more preferably 600 ng / mL, and particularly preferably 500 ng / mL.
  • the concentration of bFGF in the medium composition of the present invention is usually 150-1500 ng / mL, preferably 200-1000 ng / mL, more preferably 250-800 ng / mL, even more preferably 275-600 ng / mL, in particular. It can preferably be 300-500 ng / mL.
  • the bFGF added to the medium composition of the present invention may be stabilized.
  • the stabilized bFGF that can be added to the medium composition of the present invention may be produced by a method known per se, or may be a commercially available product. Suitable commercially available products include, but are not limited to, Heat Stable Recombinant Human bFGF (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Moreover, as another example of stabilized bFGF, "FGF2-G3" can be mentioned.
  • FGF2-G3 is a mutant bFGF protein having nine amino acid mutations (R31L, V52T, E54D, H59F, S94I, L92Y, C96N, S109E, T121P) as compared to wild-type bFGF. Although not bound by theory, FGF2-G3 has been reported to exhibit comparable activity at about 40% usage compared to unstabilized wild-type bFGF (Hui). -Hsuan Kuo et al., Negligible-Cost and Weekend-Free Chemically Defined Human iPSC Culture).
  • a suitable concentration range of stabilized bFGF may be a concentration that exhibits a cell proliferation promoting effect and / or an undifferentiated maintaining effect equivalent to that of unstabilized bFGF.
  • a suitable concentration range when using stabilized bFGF refer to the above concentration range and confirm the difference in effect between unstabilized bFGF and stabilized bFGF by a method known per se, etc. Therefore, those skilled in the art can set it as appropriate.
  • the concentration of stabilized bFGF in the medium composition can vary depending on the means and degree of stabilization of bFGF, but is usually achieved when the above-mentioned unstabilized bFGF concentration range is adopted.
  • the concentration range in which the desired effect of the present invention (cell proliferation promoting effect and / or undifferentiated maintenance effect) can be obtained may be appropriately set.
  • the determination of the stabilized bFGF concentration range may be determined as follows: (1) Quantify the effect (that is, cell proliferation promoting effect and / or undifferentiated maintaining effect) when a medium composition containing unstabilized bFGF is used (the effect is quantified in Examples of the present application described later. The method used in (can be adopted), (2) Using stabilized bFGF instead of unstabilized bFGF, the same test as in (1) is performed, and stabilized to achieve the same level of effect as the effect quantified in (1). The concentration of bFGF is determined.
  • the lower limit of the concentration of stabilized bFGF contained in the medium composition of the present invention is usually 75 ng / mL, preferably 100 ng / mL, more preferably 125 ng / mL, still more preferably 138 ng / mL, in particular. It can preferably be 150 ng / mL and may be higher.
  • the upper limit is not particularly limited, but from the viewpoint of cost and the like, it may be usually 750 ng / mL, preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, still more preferably 300 ng / mL, and particularly preferably 250 ng / mL.
  • the concentration of bFGF in the medium composition of the present invention is usually 75-750 ng / mL, preferably 100-500 ng / mL, more preferably 125-400 ng / mL, still more preferably 138-300 ng / mL, in particular. It can preferably be 150-250 ng / mL.
  • the lower limit of the concentration of stabilized bFGF contained in the medium composition of the present invention is usually 50 ng / mL, preferably 67 ng / mL, more preferably 84 ng / mL, even more preferably 92 ng / mL, in particular. It can preferably be 100 ng / mL and may be higher.
  • the upper limit is not particularly limited, but from the viewpoint of cost and the like, it may be usually 500 ng / mL, preferably 334 ng / mL, more preferably 267 ng / mL, still more preferably 200 ng / mL, and particularly preferably 167 ng / mL.
  • the concentration of bFGF in the medium composition of the present invention is usually 50-500 ng / mL, preferably 67-334 ng / mL, more preferably 84-267 ng / mL, still more preferably 92-200 ng / mL, in particular. It can be preferably 100 to 167 ng / mL.
  • the lower limit of the concentration of stabilized bFGF contained in the medium composition of the present invention is usually 38 ng / mL, preferably 50 ng / mL, more preferably 63 ng / mL, even more preferably 69 ng / mL, in particular. It can preferably be 75 ng / mL and may be higher.
  • the upper limit is not particularly limited, but from the viewpoint of cost and the like, it may be usually 375 ng / mL, preferably 250 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, still more preferably 150 ng / mL, and particularly preferably 125 ng / mL.
  • the concentration of bFGF in the medium composition of the present invention is usually 38-375 ng / mL, preferably 50-250 ng / mL, more preferably 63-200 ng / mL, still more preferably 69-150 ng / mL, in particular. It can preferably be 75-125 ng / mL.
  • bFGF can be stabilized by separately adding a compound that contributes to the stabilization of bFGF to the medium.
  • a sulfated compound eg, a sulfated polysaccharide such as sodium dextran sulfate, a sulfated polymer such as a sulfo group-containing polyvinyl alcohol, a sulfated product of a sugar lactone such as gluconolactone-SO 3 NA, etc.
  • a sulfated compound eg, a sulfated polysaccharide such as sodium dextran sulfate, a sulfated polymer such as a sulfo group-containing polyvinyl alcohol, a sulfated product of a sugar lactone such as gluconolactone-SO 3 NA, etc.
  • components preferable for cell proliferation can be further added.
  • Such components include, for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose; amino acids such as asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid; proteins such as albumin and transformin; peptides such as glycylglycylglycine and soybean peptide; serum; Vitamin such as choline, vitamin A, vitamin B group (thiamine, riboflavin, pyridoxin, cyanocobalamine, biotin, folic acid, pantothenic acid, nicotine amide, etc.), vitamin C, vitamin E; Lipids such as cholesterol; Inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium dihydrogen phosphate; trace elements such as zinc, copper, selenium; N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2 -Aminoethanesul
  • Antibiotics such as; Type I collagen, Type II collagen, fibronectin, laminin, poly-L-lysine, poly-D-lysine and other cell adhesion factors and extracellular matrix components; interleukin, fibroblast growth factor (FGF) , Transforming Growth Factor (HGF), Transforming Growth Factor (TGF) - ⁇ , Transforming Growth Factor (TGF) - ⁇ , Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Actibin A and other cytokines and growth factors; Examples thereof include hormones such as estradiol, progesterone, glucagon, and insulin, and an appropriate component can be selected and used according to the type of cells to be cultured.
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF Transforming Growth Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • Actibin A and other cytokines and growth factors
  • examples thereof
  • the medium composition of the present invention may contain choline (or a salt thereof) at the following concentration (in the case of a choline salt, an amount converted to a free form): [1] 1 to 100 mg / L, 10 to 100 mg / L, 20 to 100 mg / L, 30 to 100 mg / L, 40 to 100 mg / L, 50 to 100 mg / L, 60 to 100 mg / L, 70 to 100 mg / L , 80-100 mg / L, 90-100 mg / L; [2] 1 to 90 mg / L, 10 to 90 mg / L, 20 to 90 mg / L, 30 to 90 mg / L, 40 to 90 mg / L, 50 to 90 mg / L, 60 to 90 mg / L, 70 to 90 mg / L , 80-90 mg / L; [3] 1 to 80 mg / L, 10 to 80 mg / L, 20 to 80 mg / L, 30 to 80 mg / L, 40 to 80 mg / L, 50 to 80
  • D-glucose and five amino acids may be additionally added to the medium composition of the present invention.
  • the amount of these components added is appropriately set according to the purpose of culture and various culture conditions (eg, cell density, frequency of medium exchange), etc., with reference to the corresponding description in "2. Cell culture method” below. do it.
  • the cells can be, but are not limited to, pluripotent stem cells, adult stem cells, or progenitor cells.
  • the pluripotent stem cell can be an embryonic stem cell (ES cell) or an iPS cell, preferably an iPS cell.
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell preferably an iPS cell.
  • Adult stem cells can be, but are not limited to, hematopoietic stem cells, neural stem cells, reproductive stem cells, intestinal stem cells, epidermal stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • the origin of pluripotent stem cells, adult stem cells, and progenitor cells is also not particularly limited, but those derived from mammals are preferable, and those derived from humans are more preferable.
  • the medium composition of the present invention can be provided as a medium for suspension culture of pluripotent stem cells.
  • the medium composition of the present invention can be provided as a medium for suspension culture of pluripotent stem cells and for high-density culture.
  • the medium composition of the present invention has a function of maintaining a high-density suspension culture of pluripotent stem cells in a preferable state, and can realize very good cell proliferation of pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells proliferated using the medium composition of the present invention maintain a good undifferentiated state. That is, the pluripotent stem cells proliferated using the medium composition of the present invention are of high quality and therefore can be suitably used for, for example, regenerative medicine.
  • the medium composition of the present invention is a medium composition for maintaining undifferentiated maintenance of pluripotent stem cells, or a medium for maintaining undifferentiated maintenance of pluripotent stem cells and promoting proliferation. It can be said to be a composition.
  • the undifferentiated state of pluripotent stem cells may be confirmed by a method known per se. For example, those skilled in the art can easily confirm by confirming the expression of known markers (eg, CD30, Oct3/4, Nanog, etc.) indicating an undifferentiated state.
  • the medium of the present invention may be provided in a liquid state, or may be prepared in a state of being more concentrated than the concentration at the time of use or in a solid state such as lyophilized powder, and a solvent such as water may be used at the time of use. It can also be diluted with water, or dissolved or dispersed in a solvent such as water. Moreover, since bFGF is easily thermally decomposed, it can be added immediately before the use of the medium.
  • the present invention also provides a cell culture method (hereinafter, may be referred to as “the method of the present invention”), which comprises suspending and culturing cells using the medium composition of the present invention. ..
  • bFGF is additionally added to the medium being cultured.
  • the amount of bFGF additionally added is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, but is usually 10 to 1000 ng / mL / day, preferably 30 to 800 ng / mL / day, more preferably 50 to 600 ng. It can be / mL / day, more preferably 70-500 ng / mL / day, particularly preferably 105-420 ng / mL / day.
  • stabilized FGF can be additionally added.
  • the amount of additional stabilized bFGF added may vary depending on the means and degree of stabilization of bFGF, but is usually achieved when the above-mentioned amount of unstabilized bFGF added is adopted.
  • the amount of addition that can obtain the same effect as the desired effect of the present invention may be appropriately set.
  • stabilized bFGF is additionally added to the medium being cultured.
  • the amount of stabilized bFGF additionally added is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, but is usually 5 to 500 ng / mL / day, preferably 15 to 400 ng / mL / day, more preferably.
  • the amount of stabilized bFGF additionally added is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is obtained, but is usually 4 to 334 ng / mL / day, preferably 4 to 334 ng / mL / day.
  • the amount of stabilized bFGF additionally added is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is obtained, but is usually 3 to 250 ng / mL / day, preferably 3 to 250 ng / mL / day.
  • the above-mentioned additional addition of bFGF or stabilized bFGF can be performed using the medium of the present invention at the timing of medium replacement.
  • the frequency of medium exchange may be appropriately determined according to the cell density, cell type, etc., and is not particularly limited, but the concentration of active bFGF in the medium is the maintenance of proliferation and / or undifferentiated state of pluripotent stem cells. It is performed at least once a day (preferably at least twice or more) and 50 to 100% (preferably) of the medium in use at the time of the medium exchange, in order to avoid a decrease to the extent that the medium is adversely affected.
  • the frequency of medium exchange is at least once a day (eg, once, twice, or three times), and at the time of the medium exchange, 70 to 100% of the medium in use is the medium of the present invention.
  • D-glucose and five amino acids may be additionally added to the medium of the present invention.
  • Glucose (or a salt thereof) is usually 0.1 g / L / day to 900 g / L / day, preferably 1 g / L / day to 200 g / L / day, more preferably 1 g / L in terms of glucose concentration. It can be added to the medium of the present invention so as to have a concentration of / day to 20 g / L / day.
  • 5 kinds of amino acids are usually 0.1 mg / L / day to the concentration of tryptophan (concentration converted to free tryptophan) with respect to the medium.
  • 11000 mg / L / day preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, more preferably 1 mg / L / day to 100 mg / L / day, with a concentration of cysteine (concentration converted to free cysteine).
  • 0.1 mg / L / day to 425,000 mg / L / day preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, more preferably 1 mg / L / day to 100 mg / L / day, cysteine or cystine concentration ( The concentration converted to cysteine in the free form) is usually 0.1 mg / L / day to 280000 mg / L / day, preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, and more preferably 1 mg / L / day to 100 mg.
  • the concentration of methionine is usually 0.1 mg / L / day to 55000 mg / L / day, preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, and more. It is preferably 1 mg / L / day to 100 mg / L / day, and the concentration of arginine (concentration converted to free arginine) is usually 0.1 mg / L / day to 150,000 mg / L / day, preferably 1 mg / L /. It can be added to the medium of the present invention so as to have a day to 2000 mg / L / day, more preferably 1 mg / L / day to 200 mg / L / day.
  • choline eg, choline chloride, etc.
  • the amount of choline added to the medium is usually 0.01 to 1000000 mg / L / day, preferably 0.1 to 1000 mg / L / day, more preferably.
  • Is 1 to 100 mg / L / day (for example, [1] 1 to 100 mg / L / day, 10 to 100 mg / L / day, 20 to 100 mg / L / day, 30 to 100 mg / L / day, 40 to 100 mg / L / day, 50 to 100 mg / L / day , 60-100 mg / L / day, 70-100 mg / L / day, 80-100 mg / L / day, 90-100 mg / L / day; [2] 1 to 90 mg / L / day, 10 to 90 mg / L / day, 20 to 90 mg / L / day, 30 to 90 mg / L / day, 40 to 90 mg / L / day, 50 to 90 mg / L / day , 60-90 mg / L / day, 70-90 mg / L / day, 80-90 mg / L / day; [3] 1 to 80 mg / L / day, 10 to 80 mg / L
  • the pluripotent stem cell can be an embryonic stem cell (ES cell) or an iPS cell, preferably an iPS cell.
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell preferably an iPS cell.
  • pluripotent stem cells suspension-cultured using the medium composition of the present invention not only proliferate efficiently, but also have a good state even in a state of maintaining undifferentiation. Therefore, the method of the present invention can be rephrased as a method for promoting proliferation of pluripotent stem cells and / or maintaining undifferentiated cells.
  • the culture conditions are not particularly limited, and a method known per se may be selected according to the cell type, cell density, culture method (adhesive culture / suspension culture, etc.) and the like.
  • the culture temperature can be usually 25 ° C. to 39 ° C., preferably 33 ° C. to 39 ° C.
  • the carbon dioxide concentration can be usually 4% by volume to 10% by volume, preferably 4% by volume to 6% by volume.
  • the oxygen concentration may be usually 1% by volume to 25% by volume, preferably 4% by volume to 20% by volume.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • bFGF induced pluripotent stem cells
  • the number of viable cells was measured using a vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), a vi-dead cell autoanalyzer.
  • a vi-CELL TM XR Beckman Coulter
  • StemFit Basic03 does not contain bFGF.
  • FIG. 1 shows the results of verifying the effect of bFGF concentration on the proliferation of iPS cells in a single series. Increasing the bFGF concentration in the medium from 100 ng / mL to 300 ng / mL promoted the proliferation of iPS cells.
  • the expression rate of CD30 stained as described above was measured using Attune NxT Flow Cytometer (Thermo Fisher Scientific). The result of verifying the influence of the addition amount of bFGF on the expression of CD30 in a series is shown in FIG.
  • the expression of CD30 in iPS cells was maintained as high as about 80% at the 10th day of culture.
  • StemFit Basic03 + 100 ng / mL bFGF medium replace once or twice daily
  • StemFit Basic03 + 100 ng / mL stabilized bFGF medium replace 70% of the medium once daily
  • 40 mg / L / day Trp for both groups. 40 mg / L / day Ser, 40 mg / L / day Cys, 40 mg / L / day Met, 160 mg / L / day Arg, 4 g / L / day D-glucose were added.
  • Cells were collected on the 10th day of culture, and CD30, which is an iPS cell marker, was stained as follows.
  • FIG. 3 shows the results of verifying the effect of stabilized bFGF on the expression of CD30 in duplicate. It was shown that the expression of CD30 was maintained even by changing the medium once a day by using stabilized bFGF. In other words, it has been shown that it is also effective to use stabilized bFGF instead of adding a large amount of bFGF.
  • Example 4 Evaluation of differentiation potential of iPS cells cultured using a medium enriched with bFGF.
  • the number of living cells was quantified using Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), a living and dead cell autoanalyzer, and the expression ratio of CD30, which is an iPS cell marker, was measured.
  • FIGS. 4 and 5 Results on iPS cell proliferation and undifferentiated markers are shown in FIGS. 4 and 5. As shown in FIGS. 1 and 2, by culturing iPS cells in a medium containing a high concentration of bFGF, 8.8 to 9.7 ⁇ 10 ⁇ 6 cells / mL while maintaining the undifferentiated state of iPS cells. High-density culture was realized.
  • FIGS. 6 and 7 The results regarding cell proliferation and differentiation markers associated with differentiation into PM are shown in FIGS. 6 and 7.
  • the iPS cells cultured in a medium containing a high concentration of bFGF were able to differentiate from iPS cells to PM with high efficiency at a high density of more than 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 cells / mL.
  • cells can be prepared extremely efficiently. Further, according to the present invention, high-quality pluripotent stem cells in which the undifferentiated state is well maintained can be prepared very efficiently.

Abstract

本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１５０ｎｇ／ｍＬ以上含む、細胞培養用培地組成物を提供する。

Description

細胞培養用培地組成物
　本発明は、細胞用培地組成物に関し、詳細には、細胞の高密度浮遊培養用培地組成物に関する。
　細胞を用いた再生医療技術は、これまでに治療することが困難であった様々な疾病や損傷を治療し得る手段の一つとして、近年、非常に注目されている。再生医療には大量の細胞を必要とするため、細胞を効率良く培養する方法の開発が意欲的に進められている。例えば、特許文献１には、培地中で幹細胞をＲＯＣＫ阻害剤で処理することを含む、幹細胞の培養方法が報告されている。また、本発明者らも２０１８年にグルコースおよび／または特定のアミノ酸を培地に添加することによる、動物細胞の高密度培養法等を報告している（特許文献２）。
特開２００８－０９９６６２号公報 特願２０１８－１８４３５２号
　特許文献２に記載の方法は、多能性幹細胞を含む動物細胞の高密度培養法としては非常に優れた方法の一つであるが、今回、本発明者らは当該方法を再検討し、さらに好ましい細胞の高密度培養法の開発を試みた。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、細胞の浮遊培養による高密度培養において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をこれまでに当該技術分野において推奨されていた量を遥かに超えて培地に添加すると、細胞増殖がより顕著に促進される事実を見出した。加えて、細胞が多能性幹細胞である場合、多量のｂＦＧＦの添加が、高密度培養される多能性幹細胞の未分化状態を極めて良好に維持し得ることや、多量のｂＦＧＦが添加された培地での高密度培養により調製された多能性幹細胞が、極めて良好な分化能を有することをも見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１５０ｎｇ／ｍＬ以上、または該濃度のｂＦＧＦと同等の効果を奏する濃度の安定化されたｂＦＧＦを含む、細胞培養用培地組成物。
［２］浮遊培養用である、［１］記載の培地組成物。
［３］高密度培養用である、［１］または［２］記載の培地組成物。
［４］浮遊培養される細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、［３］記載の培地組成物。
［５］細胞が、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、［１］～［４］のいずれか記載の培地組成物。
［６］［１］記載の培地組成物において、細胞を浮遊培養することを含む、細胞の培養方法。
［７］ｂＦＧＦが１０～１０００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙで、または、該濃度のｂＦＧＦと同等の効果を奏する濃度の安定化されたｂＦＧＦが培地に添加される、［６］記載の方法。
［８］浮遊培養される多能性幹細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、［６］または［７］記載の方法。
［９］細胞が多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、［６］～［８］のいずれか記載の方法。
　本発明によれば、細胞を極めて効率よく調製することができる。また、本発明によれば、未分化状態が良好に維持され、且つ良好な分化能を有する高品質な多能性幹細胞を非常に効率良く調製することができる。
図１は、ｉＰＳ細胞の増殖に対するｂＦＧＦ濃度の影響（ｎ＝１）を示す図である。 図２は、ｂＦＧＦの添加量がｉＰＳ細胞におけるＣＤ３０の発現に与える影響（ｎ＝１）を示す図である。 図３は、安定化されたｂＦＧＦを用いても本発明の所望の効果が得られることを示す図である。 図４は、高濃度のｂＦＧＦを含有する培地でｉＰＳ細胞を培養したときの、細胞数（ＶＣＤ：Ｖｉａｂｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｎｓｉｔｙ）の経時的な変化を示す図である。 図５は、高濃度のｂＦＧＦを含有する培地で培養されたｉＰＳ細胞におけるＣＤ３０の発現量を示す図である。 図６は、高濃度のｂＦＧＦを含有する培地で培養されたｉＰＳ細胞が、１．０×１０７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える高密度の状態で、高効率に沿軸中胚葉（ＰＭ：Ｐａｒａｘｉａｌ　Ｍｅｓｏｄｅｒｍ）へ分化させることができたことを示す図である。 図７は、高濃度のｂＦＧＦを含有する培地で培養されたｉＰＳ細胞から分化誘導させた細胞が、ＤＬＬ１（ＰＭマーカー）を高発現していることを示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
定義
　本明細書において、「浮遊培養」とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態で行われる細胞培養方法をいう。本発明において、浮遊培養は、液体培地に対する外部からの圧力や振動、または、当該液体培地中での振とうや回転操作を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。
　本明細書において、「高密度培養」とは、一般的な細胞培養において想定される細胞密度と比較して高い細胞密度での培養をいう。高密度の基準は、培養方法（接触培養／浮遊培養等）や細胞の種類等によっても異なり得るが、例えば、ｉＰＳ細胞を浮遊培養する場合、本明細書においては６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上（好ましくは、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）の密度での培養を高密度培養と定義する。
　本明細書において、「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「成体幹細胞（体性幹細胞とも称される）」とは、特定の組織（器官）を構成する細胞に分化し得る能力を有する細胞を意味する。成体幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、表皮幹細胞、間葉系幹細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「前駆細胞」とは、前述した多能性幹細胞や成体幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞を意味する。
１．培地組成物
　本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１５０ｎｇ／ｍＬ以上、または該濃度のｂＦＧＦと同等の効果を奏する濃度の安定化されたｂＦＧＦを含む、細胞培養用培地組成物（以下、「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。
　本発明の培地組成物は、一般的な細胞用の基礎培地に非常に高濃度のｂＦＧＦを添加することにより調製することができる。
　本発明の培地組成物を調製するうえで用いられる細胞用の培地は、培養する細胞に即して、自体公知の方法により調製したものであってもよく、また、市販品であってもよい。
　市販の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、α改変型イーグル最小必須培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（αＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ）、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。
　また、特に幹細胞培養用の培地としては、例えば、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨＥＳｃＧＲＯ（商標）　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＥＳ　ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（商標）　Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｓｒａｅｌ　Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）　ＸＦ／ＦＦ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、ＡＦ　ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｓｒａｅｌ　Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ社）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ－ＦＸ培地、ＣＤＭ培地、ＤＥＦ－ＣＳ　５００　Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ　３Ｄ　Ｓｐｈｅｒｏｉｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。
　本願出願日時点において、細胞を培養するための培地に含有されるｂＦＧＦ量は、多くても１００ｎｇ／ｍＬ程度である。ｂＦＧＦをこれ以上の濃度で添加しても、細胞の増殖および／または未分化性に対する作用が一定であると考えられているためである。しかし、本発明の培地組成物が含有するｂＦＧＦの濃度の下限は、通常１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２７５ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは３００ｎｇ／ｍＬであり得、これ以上であってもよい。また、上限は特に限定されないが、コスト等の観点から、通常１５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは６００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは５００ｎｇ／ｍＬであり得る。一態様において、本発明の培地組成物のｂＦＧＦの濃度は、通常１５０～１５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２００～１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５０～８００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２７５～６００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは３００～５００ｎｇ／ｍＬであり得る。
　一態様において、本発明の培地組成物に添加するｂＦＧＦは安定化されたものであってもよい。本発明の培地組成物に添加し得る安定化されたｂＦＧＦは自体公知の方法で製造したものであってよく、また、市販品であってもよい。好適な市販品としては、例えば、Heat Stable Recombinant Human bFGF (Thermo Fisher Scientific社製)などが挙げられるが、これに限定されない。また、安定化されたｂＦＧＦの他の一例としては、「ＦＧＦ２－Ｇ３」が挙げられる。ＦＧＦ２－Ｇ３は、野生型ｂＦＧＦと比較して９つのアミノ酸変異（Ｒ３１Ｌ、Ｖ５２Ｔ、Ｅ５４Ｄ、Ｈ５９Ｆ、Ｓ９４Ｉ、Ｌ９２Ｙ、Ｃ９６Ｎ、Ｓ１０９Ｅ、Ｔ１２１Ｐ）を有する変異体ｂＦＧＦタンパク質である。理論に拘束されることを望むものではないが、ＦＧＦ２－Ｇ３は、安定化されていない野生型ｂＦＧＦと比較して約４０％の使用量で同等の活性を示すことが報告されている（Ｈｕｉ－Ｈｓｕａｎ　Ｋｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ－Ｃｏｓｔ　ａｎｄ　Ｗｅｅｋｅｎｄ－Ｆｒｅｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳＣ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）。
　本態様において、安定化されたｂＦＧＦの好適な濃度範囲は、安定化されていないｂＦＧＦと同等の細胞増殖促進効果および/または未分化維持効果を奏する濃度であり得る。安定化されたｂＦＧＦを使用する場合の好適な濃度範囲は、上記した濃度範囲を参考に、安定化されていないｂＦＧＦと安定化されたｂＦＧＦの効果の差を自体公知の方法により確認すること等により当業者であれば適宜設定可能である。安定化されたｂＦＧＦの培地組成物中の濃度は、ｂＦＧＦの安定化の手段や程度によっても変化し得るが、通常は、上述した安定化されていないｂＦＧＦの濃度範囲を採用した場合に達成される本発明の所望の効果（細胞増殖促進効果および／または未分化維持効果）と同等の効果が得られる濃度範囲を適宜設定すればよい。具体的には、安定化されたｂＦＧＦの濃度範囲の決定は、次のように決定してよい：
（１）安定化されていないｂＦＧＦを含有する培地組成物を用いた場合の効果（即ち、細胞増殖促進効果および／または未分化維持効果）を定量する（効果の定量は、後述する本願実施例で用いられた方法を採用することができる）、
（２）安定化されていないｂＦＧＦの代わりに、安定化されたｂＦＧＦを用いて（１）と同様の試験を行い、（１）で定量された効果と同等程度の効果を達成する安定化されたｂＦＧＦの濃度を決定する。
　一態様において、本発明の培地組成物が含有する安定化されたｂＦＧＦの濃度の下限は、通常７５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１２５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１３８ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬであり得、これ以上であってもよい。また、上限は特に限定されないが、コスト等の観点から、通常７５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬであり得る。一態様において、本発明の培地組成物のｂＦＧＦの濃度は、通常７５～７５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１２５～４００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１３８～３００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１５０～２５０ｎｇ／ｍＬであり得る。
　一態様において、本発明の培地組成物が含有する安定化されたｂＦＧＦの濃度の下限は、通常５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは６７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８４ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは９２ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍＬであり得、これ以上であってもよい。また、上限は特に限定されないが、コスト等の観点から、通常５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３３４ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２６７ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１６７ｎｇ／ｍＬであり得る。一態様において、本発明の培地組成物のｂＦＧＦの濃度は、通常５０～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは６７～３３４ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８４～２６７ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは９２～２００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１００～１６７ｎｇ／ｍＬであり得る。
　一態様において、本発明の培地組成物が含有する安定化されたｂＦＧＦの濃度の下限は、通常３８ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６３ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは６９ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは７５ｎｇ／ｍＬであり得、これ以上であってもよい。また、上限は特に限定されないが、コスト等の観点から、通常３７５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１２５ｎｇ／ｍＬであり得る。一態様において、本発明の培地組成物のｂＦＧＦの濃度は、通常３８～３７５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～２５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６３～２００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは６９～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは７５～１２５ｎｇ／ｍＬであり得る。
　或いは、培地中にｂＦＧＦの安定化に寄与する化合物を別途添加することによって、ｂＦＧＦを安定化することもできる。かかる態様の一例としては、硫酸化化合物（例、デキストラン硫酸ナトリウム等の硫酸化多糖類、スルホ基含有ポリビニルアルコール等の硫酸化ポリマー、グルコノラクトン－ＳＯ３ＮＡ等の糖ラクトンの硫酸化物等）を添加することが挙げられる（詳細は、ＷＯ２０１３／１４７２６４を参照）。このような方法においてｂＦＧＦを安定化する場合も、上述した安定化されていないｂＦＧＦの濃度範囲、ｂＦＧＦの安定化の度合い、達成される効果を考慮して、当業者であれば適宜ｂＦＧＦの濃度範囲を決定することができる。
　また、本発明の培地組成物は、上記に加えて、さらに細胞増殖に好ましい成分を添加することもできる。かかる成分としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖；アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等のアミノ酸；アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質；グリシルグリシルグリシン、大豆ペプチド等のペプチド；血清；コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ群（チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド等）、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン；オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸等の脂肪酸；コレステロール等の脂質；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩；亜鉛、銅、セレン等の微量元素；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＥＳ））、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ））、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ－［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ））等の緩衝剤；アンホテリシンＢ、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質；Ｔｙｐｅ　Ｉ　コラーゲン、Ｔｙｐｅ　ＩＩ　コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン等の細胞接着因子および細胞外マトリックス成分；インターロイキン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－α、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アクチビンＡ等のサイトカインおよび増殖因子；デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、インスリン等のホルモン等が挙げられ、培養する細胞の種類に応じて適切な成分を選択して用いることができる。
　一態様において、本発明の培地組成物は、コリン（またはその塩）を次の濃度で含有し得る（コリン塩である場合は、遊離体に換算した量）：
［１］１～１００ｍｇ／Ｌ、１０～１００ｍｇ／Ｌ、２０～１００ｍｇ／Ｌ、３０～１００ｍｇ／Ｌ、４０～１００ｍｇ／Ｌ、５０～１００ｍｇ／Ｌ、６０～１００ｍｇ／Ｌ、７０～１００ｍｇ／Ｌ、８０～１００ｍｇ／Ｌ、９０～１００ｍｇ／Ｌ；
［２］１～９０ｍｇ／Ｌ、１０～９０ｍｇ／Ｌ、２０～９０ｍｇ／Ｌ、３０～９０ｍｇ／Ｌ、４０～９０ｍｇ／Ｌ、５０～９０ｍｇ／Ｌ、６０～９０ｍｇ／Ｌ、７０～９０ｍｇ／Ｌ、８０～９０ｍｇ／Ｌ；
［３］１～８０ｍｇ／Ｌ、１０～８０ｍｇ／Ｌ、２０～８０ｍｇ／Ｌ、３０～８０ｍｇ／Ｌ、４０～８０ｍｇ／Ｌ、５０～８０ｍｇ／Ｌ、６０～８０ｍｇ／Ｌ、７０～８０ｍｇ／Ｌ；
［４］１～７０ｍｇ／Ｌ、１０～７０ｍｇ／Ｌ、２０～７０ｍｇ／Ｌ、３０～７０ｍｇ／Ｌ、４０～７０ｍｇ／Ｌ、５０～７０ｍｇ／Ｌ、６０～７０ｍｇ／Ｌ；
［５］１～６０ｍｇ／Ｌ、１０～６０ｍｇ／Ｌ、２０～６０ｍｇ／Ｌ、３０～６０ｍｇ／Ｌ、４０～６０ｍｇ／Ｌ、５０～６０ｍｇ／Ｌ；
［６］１～５０ｍｇ／Ｌ、１０～５０ｍｇ／Ｌ、２０～５０ｍｇ／Ｌ、３０～５０ｍｇ／Ｌ、４０～５０ｍｇ／Ｌ；
［７］１～４０ｍｇ／Ｌ／、１０～４０ｍｇ／Ｌ、２０～４０ｍｇ／Ｌ、３０～４０ｍｇ／Ｌ；
［８］１～３０ｍｇ／Ｌ／、１０～３０ｍｇ／Ｌ／、２０～３０ｍｇ／Ｌ；
［９］１～２０ｍｇ／Ｌ、１０～２０ｍｇ／Ｌ）。
　好ましい一態様において、Ｄ－グルコースおよび５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（またはシスチン）、メチオニン、アルギニン）を追加で本発明の培地組成物に添加してもよい。これらの成分の添加量は、以下の「２．細胞の培養方法」における対応記載を参考に、培養の目的や各種培養条件（例、細胞密度、培地交換の頻度）等に即して適宜設定すればよい。
　一態様において、細胞は、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。
　一態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはｉＰＳ細胞であり、好ましくはｉＰＳ細胞であり得る。また、成体幹細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、表皮幹細胞、または間葉系幹細胞であり得るが、これらに限定されない。尚、多能性幹細胞、成体幹細胞、および前駆細胞の由来も特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。
　一態様において、本発明の培地組成物は多能性幹細胞の浮遊培養用培地として提供され得る。また、別の一態様において、本発明の培地組成物は多能性幹細胞の浮遊培養用、且つ、高密度培養用培地としても提供され得る。本発明の培地組成物は多能性幹細胞の高密度での浮遊培養を好ましい状態に維持する機能を備え、多能性幹細胞の非常に良好な細胞増殖を実現し得る。同時に、本発明の培地組成物を用いて増殖させた多能性幹細胞は未分化状態を良好に維持している。即ち、本発明の培地組成物を用いて増殖させた多能性幹細胞は高品質であり、従って例えば再生医療等にも好適に使用し得る。この点を考慮すれば、本発明の培地組成物は、多能性幹細胞の未分化維持培養用の培地組成物であると言え、あるいは、多能性幹細胞の未分化維持および増殖促進用の培地組成物とも言える。尚、多能性幹細胞の未分化状態の確認は自体公知の方法を持ちいて行えばよい。例えば、未分化状態を示す公知のマーカー（例、ＣＤ３０、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ等）の発現を確認することにより当業者であれば容易に確認することができる。
　本発明の培地は、液体の状態で提供されてもよいし、また、使用時の濃度よりも濃縮した状態や、凍結乾燥された粉末等の固体の状態で調製し、使用時に水等の溶媒で希釈し、または水等の溶媒に溶解または分散して用いる態様とすることもできる。また、ｂＦＧＦは熱分解しやすいため、培地の使用直前に添加することもできる。
２．細胞の培養方法
　本発明はまた、本発明の培地組成物を用いて、細胞を浮遊培養することを含む、細胞の培養方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
　本発明の方法の一態様において、培養中の培地にｂＦＧＦが追加で添加される。追加で添加されるｂＦＧＦ量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、好ましくは３０～８００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、より好ましくは５０～６００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、さらに好ましくは７０～５００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、特に好ましくは１０５～４２０ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙであり得る。
　また、本発明の一態様において、安定化されたＦＧＦを追加で添加することもできる。追加で添加される安定化されたｂＦＧＦ量は、ｂＦＧＦの安定化の手段や程度によっても変化し得るが、通常は、上述した安定化されていないｂＦＧＦの添加量を採用した場合に達成される本発明の所望の効果（細胞増殖促進効果および／または未分化維持効果）と同等の効果が得られる添加量を適宜設定すればよい。
　本発明の方法の別の一態様において、培養中の培地に安定化されたｂＦＧＦが追加で添加される。追加で添加される安定化されたｂＦＧＦ量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常、５～５００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、好ましくは１５～４００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、より好ましくは２５～３００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、さらに好ましくは３５～２５０ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、特に好ましくは５３～２１０ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙであり得る。
　本発明の方法の別の一態様において、追加で添加される安定化されたｂＦＧＦ量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常、４～３３４ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、好ましくは１０～２６７ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、より好ましくは１７～２００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、さらに好ましくは２４～１６７ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、特に好ましくは３５～１４０ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙであり得る。
　本発明の方法の別の一態様において、追加で添加される安定化されたｂＦＧＦ量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常、３～２５０ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、好ましくは８～２００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、より好ましくは１３～１５０ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、さらに好ましくは１８～１２５ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙ、特に好ましくは２７～１０５ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙであり得る。
　また、本発明の方法の一態様において、上述したｂＦＧＦまたは安定化されたｂＦＧＦの追添加は培地交換のタイミングに合わせて、本発明の培地を用いて行うこともできる。培地交換の頻度は細胞密度や細胞種等に即して適宜決定すればよく、特に限定されないが、活性を有するｂＦＧＦの培地中の濃度が多能性幹細胞の増殖および／または未分化状態の維持に悪影響を与える程度まで低下することを避けるため、１日に少なくとも１回以上（好ましくは少なくとも２回以上）行われ、且つ、当該培地交換時に、使用中の培地の５０～１００％（好ましくは６０～１００％、７０～１００％、８０～１００％、９０～１００％、または１００％）が本発明の培地組成物によって交換され得る。一態様において、培地交換の頻度は１日に１回以上（例えば、1回、２回、または３回）であり、当該培地交換時に、使用中の培地の７０～１００％が本発明の培地組成物により交換され得る。
　一態様において、Ｄ－グルコースおよび５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（またはシスチン）、メチオニン、アルギニン）を追加で本発明の培地に添加してもよい。
　グルコース（またはその塩）は、グルコースの濃度に換算して通常０．１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～９００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～２００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように本発明の培地に添加することができる。
　また、５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（シスチン）、メチオニンおよびアルギニン）は、培地に対し、トリプトファンの濃度（遊離体のトリプトファンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、セリンの濃度（遊離体のセリンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～４２５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、システインもしくはシスチンの濃度（遊離体のシステインに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２８００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、メチオニンの濃度（遊離体のメチオニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～５５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、アルギニンの濃度（遊離体のアルギニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１５００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように本発明の培地に添加することができる。
　また、一態様において、コリン（例、塩化コリン等）を追加で本発明の培地に添加してもよい。本発明の方法において、培地に添加されるコリンの量（遊離体に換算した含有量）は、通常０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは０．１～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ（例えば、
［１］１～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、８０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、９０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［２］１～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、８０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［３］１～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［４］１～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［５］１～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［６］１～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［７］１～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［８］１～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［９］１～２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）
とすることができる。
　一態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはｉＰＳ細胞であり、好ましくはｉＰＳ細胞であり得る。
　上述した通り、本発明の培地組成物を用いて浮遊培養された多能性幹細胞は効率よく増殖するのみならず、未分化維持の状態においても良好な状態を有している。従って、本発明の方法は、多能性幹細胞の増殖促進および／または未分化維持方法とも言い換え得る。
　本発明の方法において、培養条件は特に限定されず、細胞種、細胞密度、培養方法（接着培養／浮遊培養等）等に応じて自体公知の方法を選択すればよい。例えば、培養温度は、通常２５℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃であり得る。二酸化炭素濃度としては、通常４体積％～１０体積％、好ましくは４体積％～６体積％であり得る。酸素濃度としては、通常１体積％～２５体積％、好ましくは４体積％～２０体積％であり得る。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例
　以下の実施例では、ｂＦＧＦによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の増殖効果および未分化維持能を評価した。ｉＰＳ細胞として、ｉＰＳアカデミアジャパン社より購入した１２１０Ｂ２株を用いた。また、ｉＰＳ細胞用培地として、市販のＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ（味の素社）またはＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３（味の素社）を用いた。
［実施例１］浮遊培養系を用いたｂＦＧＦ強化によるｉＰＳ細胞の増殖促進効果
　ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ：ＢＷＶ－Ｓ０３Ａ）を用いて、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ＋１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ：０３４－２４０２４）にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ＣＯ２濃度＝５％、攪拌速度＝１２０ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。播種２日目に７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎで交換した。播種３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋３００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦに再懸濁し、バイオリアクターのａｍｂｒ１５（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ：００１－０８８１）に移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。７割の各培地を１日２回交換し、さらに両群に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ（日本プロテイン社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ（味の素社）、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ（味の素社）、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコース（ナカライテスク社：１６８０６－２５）を添加した。培養５日目以降に生細胞数を生死細胞オートアナライザーのＶｉ－ＣＥＬＬＴＭ　ＸＲ（ベックマン・コールター社）を用いて測定した。尚、ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３はｂＦＧＦを含有しない。
　ｉＰＳ細胞の増殖に対するｂＦＧＦ濃度の影響を１連にて検証した結果を図１に示す。培地のｂＦＧＦ濃度を１００ｎｇ／ｍＬから３００ｎｇ／ｍＬに増加させることにより、ｉＰＳ細胞の増殖が促進された。
［実施例２］浮遊培養系を用いたｂＦＧＦ強化によるｉＰＳ細胞の未分化維持効果
　ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを用いて、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ＋１０μＭ　Ｙ－２７６３２にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ＣＯ２濃度＝５％、攪拌速度＝１２０ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。播種２日目に７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎで交換した。播種３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１５０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦに再懸濁し、バイオリアクターのａｍｂｒ１５に移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。１日１回、各培地で７割の培地を交換し、さらに両群に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコースを添加した。培養１０日目に細胞を回収し、ｉＰＳ細胞マーカーであるＣＤ３０を以下のように染色した。
　ＣＤ３０を染色するため、２×１０５ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬエッペンチューブに分取した。遠心後（４００×ｇ、４℃、５分間）、上清を除去して０．２％ＢＳＡ（ナカライテスク：０１２８１－８４）を含むＰＢＳ（－）（ナカライテスク：１４２４９－２４）（以下、０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ）にＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ－ＣＤ３０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：５５００４１）を２０％添加したものを２０μＬ添加し、５～１０回のピペッティングにより均一にして４℃遮光下で２０分間静置した。０．５ｍＬ　０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳを添加して遠心後（４００×ｇ、４℃、５分間）、上清を除去し、０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳを３００μｌ添加して５～１０回のピペッティングにより均一にし、３５μｍセルストレーナー付き５ｍＬラウンドチューブに移した。
　上記のように染色したＣＤ３０の発現割合を、Ａｔｔｕｎｅ　ＮｘＴ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。ｂＦＧＦの添加量がＣＤ３０の発現に対する影響を１連にて検証した結果を図２に示す。培地中のｂＦＧＦ濃度を１００ｎｇ／ｍＬから１５０ｎｇ／ｍＬに増加させることにより、培養１０日目の時点で、ｉＰＳ細胞におけるＣＤ３０の発現が約８０％と高く維持されていた。
［実施例３］安定化ｂＦＧＦを用いたｉＰＳ細胞の未分化維持効果
　ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを用いて、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ＋１０ｕＭ　Ｙ－２７６３２にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ＣＯ２濃度＝５％、攪拌速度＝１２０ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。播種２日目に７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎで交換した。播種３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１００ｎｇ／ｍＬ　Ｈｅａｔ　Ｓｔａｂｌｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ｂＦＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（以下、安定化ｂＦＧＦ）に再懸濁し、マイクロバイオリアクターのａｍｂｒ１５に移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦの培地については１日１または２回、ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｂａｓｉｃ０３＋１００ｎｇ／ｍＬ安定化ｂＦＧＦの培地については１日１回７割の培地を交換し、さらに両群に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコースを添加した。培養１０日目に細胞を回収し、ｉＰＳ細胞マーカーであるＣＤ３０を以下のように染色した。すなわち、２×１０５ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬエッペンチューブに分取して遠心後（４００×ｇ、４℃、５分間）、上清を除去して０．２％ＢＳＡ（ナカライテスク：０１２８１－８４）を含むＰＢＳ（－）（ナカライテスク：１４２４９－２４）（以下、０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ）にＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ－ＣＤ３０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：５５００４１）を２０％添加したものを２０ｕＬ添加し、５～１０回のピペッティングにより均一にして４℃遮光下で２０分間静置した。０．５ｍＬ　０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳを添加して遠心後（４００×ｇ、４℃、５分間）、上清を除去し、０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳを３００ｕｌ添加して５～１０回のピペッティングにより均一にし、３５ｕｍセルストレーナー付き５ｍＬラウンドチューブに移した。上記のように染色したＣＤ３０の発現割合を、Ａｔｔｕｎｅ　ＮｘＴ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。安定化ｂＦＧＦがＣＤ３０の発現に与える影響を２連にて検証した結果を図３に示す。安定化ｂＦＧＦを用いることで１日１回の培地交換でもＣＤ３０の発現が維持されていることが示された。換言すれば、多量のｂＦＧＦを添加する代わりに、安定化されたｂＦＧＦを使用することも有効であることが示された。
［実施例４］ｂＦＧＦが強化された培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞の分化能の評価
１．ｉＰＳ細胞の高密度および未分化維持培養
　ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ：ＢＷＶ－Ｓ０３Ａ）を用いて、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ＋１０ｕＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ：０３４－２４０２４）にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ＣＯ２濃度＝５％、攪拌速度＝１２０ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。播種２日目に７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎで交換した。播種３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ＋１０ｍｇ／Ｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（富士フイルム和光純薬）＋２００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に再懸濁し、マイクロバイオリアクターのａｍｂｒ１５（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ：００１－０８８１）に２連で移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝４％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ＋１０ｍｇ／Ｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ＋２００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦで１日２回交換し、さらに両群に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ（日本プロテイン）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ（味の素社）、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ（味の素社）、１８．６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｈｉｓ（味の素社）、４３．７ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｉｌｅ（味の素社）、４７．３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｌｅｕ（味の素社）、７３．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｌｙｓ　ＨＣｌ（味の素社）、２８．４ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｐｈｅ（味の素社）、４２．３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｖａｌ（味の素社）、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコース（ナカライテスク）を添加した。培養７日目に生死細胞オートアナライザーのＶｉ－ＣＥＬＬＴＭ　ＸＲ（ベックマン・コールター）を用いて生細胞数を定量し、またｉＰＳ細胞マーカーであるＣＤ３０の発現割合を測定した。
　ｉＰＳ細胞の増殖および未分化マーカーに関する結果を図４および５に示す。図１および２に示される通り、ｂＦＧＦを高濃度で含有する培地でｉＰＳ細胞を培養することで、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持しながら、８．８～９．７×１０＾６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの高密度培養を実現できた。
２．ｉＰＳ細胞の沿軸中胚葉（Ｐａｒａｘｉａｌ　Ｍｅｓｏｄｅｒｍ：ＰＭ）への分化誘導
　上記１．において培養した２連の細胞懸濁液を１連にまとめ、ＰＭへ分化誘導した。具体的には、新鮮な分化１培地（ＡＫ０２Ｎ・Ａ液（味の素社）＋２０％　ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（味の素社）＋１０ｕＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（富士フイルム和光純薬）＋３０ｎｇ／ｍＬ　アクチビンＡ（味の素社）＋１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ＋３００ｎＭ　ＬＤＮ－１９３１８９（富士フイルム和光純薬））に再懸濁し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。１２時間後に７割の培地を分化１培地で交換し、さらにその６時間後に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ、１８．６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｈｉｓ、４３．７ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｉｌｅ、４７．３　ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｌｅｕ、７３．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｌｙｓ　ＨＣｌ、２８．４ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｐｈｅ、４２．３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｖａｌ、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコースを添加した。６時間後に、細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮な分化２培地（ＡＫ０２Ｎ・Ａ液＋２０％　ＳｔｅｍＦｉｔ　Ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ＋５ｕＭ　ＣＨＩＲ９９０２１＋１０ｕＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）＋１００ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ＋３００ｎＭ　ＬＤＮ－１９３１８９）に再懸濁し、培養を続けた。１２時間後に７割の培地を分化２培地で交換し、さらにその６時間後に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ、１８．６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｈｉｓ、４３．７ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｉｌｅ、４７．３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｌｅｕ、７３．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｌｙｓ　ＨＣｌ、２８．４ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｐｈｅ、４２．３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｖａｌ、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコースを添加した。６時間後に生細胞数とＰＭマーカーであるＤＬＬ１の発現割合を測定した。
　ＰＭへの分化に伴う細胞増殖および分化マーカーに関する結果を図６および７に示す。ｂＦＧＦを高濃度で含有する培地で培養されたｉＰＳ細胞は、１．０×１０＾７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える高密度の状態で、ｉＰＳ細胞からＰＭへ高効率で分化させることできた。
　本発明によれば、細胞を極めて効率よく調製することができる。また、本発明によれば、未分化状態が良好に維持された高品質な多能性幹細胞を非常に効率良く調製することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０２０－００３９５８（出願日：２０２０年１月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (9)

  1. 　塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１５０ｎｇ／ｍＬ以上、または該濃度のｂＦＧＦと同等の効果を奏する濃度の安定化されたｂＦＧＦを含む、細胞培養用培地組成物。
  2. 　浮遊培養用である、請求項１記載の培地組成物。
  3. 　高密度培養用である、請求項１または２記載の培地組成物。
  4. 　浮遊培養される細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項３記載の培地組成物。
  5. 　細胞が、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の培地組成物。
  6. 　請求項１記載の培地組成物において、細胞を浮遊培養することを含む、細胞の培養方法。
  7. 　ｂＦＧＦが１０～１０００ｎｇ／ｍＬ／ｄａｙで、または、該濃度のｂＦＧＦと同等の効果を奏する濃度の安定化されたｂＦＧＦが培地に添加される、請求項６記載の方法。
  8. 　浮遊培養される多能性幹細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項６または７記載の方法。
  9. 　細胞が多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、請求項６～８のいずれか一項記載の方法。
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