WO2021145321A1 - 細胞の高密度培養方法 - Google Patents

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拓哉 樋口
俊平 風呂光
恵 西山
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味の素株式会社
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    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
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Definitions

  • the present invention relates to a high-density culture method for cells, and more particularly to a high-density culture method for cells by adding choline.
  • Patent Document 1 reports a method for culturing stem cells, which comprises treating the stem cells with a ROCK inhibitor in a medium.
  • Patent Document 2 reports a high-density culture method of animal cells by adding glucose and / or a specific amino acid to a medium in 2018 (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 The method described in Patent Document 2 is one of the very excellent methods as a high-density culture method, but this time, the present inventors reexamined the method and developed a more preferable high-density culture method. I tried.
  • the present inventors have found that cell proliferation can be promoted extremely easily by simply adding choline among various medium components during high-density culture of cells.
  • the present invention has been completed by further research based on the findings. That is, the present invention is as follows.
  • a method for culturing cells which comprises adding choline to a medium at 0.01 to 1000000 mg / L / day.
  • the method according to [3], wherein the cell density of the cultured cells in the medium is 6 ⁇ 10 5 cells / mL or more.
  • the medium composition according to [10], wherein the cell density of the cells to be suspended-cultured is 6.0 ⁇ 10 5 cells / mL or more.
  • the medium composition according to [12], wherein the pluripotent stem cells are iPS cells.
  • the medium composition according to any one of [8] to [13], wherein the cells are cells derived from iPS cells.
  • cell proliferation can be easily promoted under high-density culture.
  • suspension culture refers to a cell culture method performed in a state where cells do not adhere to a culture vessel.
  • the suspension culture may or may not be accompanied by external pressure or vibration on the liquid medium, or shaking or rotation operation in the liquid medium.
  • high density culture refers to culture at a cell density higher than that assumed in general cell culture. Dense criteria may differ depending on the kind or the like of the culture method (contact culture / suspension culture, etc.) and pluripotent stem cells, for example, the case of suspension culture iPS cells, 6 ⁇ 10 5 cells in this specification Culturing at a density of / mL or higher is defined as high density culture.
  • pluripotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into all the tissues and cells constituting the living body.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • adult stem cell also referred to as somatic stem cell
  • somatic stem cell means a cell having an ability to differentiate into a cell constituting a specific tissue (organ).
  • adult stem cells include, but are not limited to, hematopoietic stem cells, nerve stem cells, reproductive stem cells, intestinal stem cells, epidermal stem cells, and mesenchymal stem cells.
  • the "progenitor cell” means a cell in the process of differentiating from the pluripotent stem cell or adult stem cell described above into a specific somatic cell or germ cell.
  • the present invention provides a cell culture method (hereinafter, may be referred to as “the method of the present invention”), which comprises adding choline to a medium at 0.01 to 1000000 mg / L / day. ..
  • the choline used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is of a grade used for cell culture, and a commercially available product may be used. Suitable cholines include choline chloride, choline bitartrate, choline bicarbonate, choline phosphate, choline dihydrogen citrate and the like, with choline chloride being preferred.
  • the amount of choline added to the medium is usually 0.01 to 1000000 mg / L / day, preferably 0.1 to 1000 mg / L / day, more preferably.
  • Is 1 to 100 mg / L / day (for example, [1] 1 to 100 mg / L / day, 10 to 100 mg / L / day, 20 to 100 mg / L / day, 30 to 100 mg / L / day, 40 to 100 mg / L / day, 50 to 100 mg / L / day , 60-100 mg / L / day, 70-100 mg / L / day, 80-100 mg / L / day, 90-100 mg / L / day; [2] 1 to 90 mg / L / day, 10 to 90 mg / L / day, 20 to 90 mg / L / day, 30 to 90 mg / L / day, 40 to 90 mg / L / day, 50 to 90 mg / L / day; [2] 1 to 90 mg / L
  • the medium used in the method of the present invention is not particularly limited, and a medium suitable for the cell type to be cultured can be used.
  • a medium suitable for the cell type to be cultured can be used.
  • Such a medium can be prepared by a method known per se, or a commercially available product may be used.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • F12 Ham's Nutrition Mixture F12
  • DMEM / F12 medium McCoy's medium
  • McCoy's McCoy's medium
  • 5A Medium Minim's Essential Medium (MEM), Eagle's Minim's Essential Medium (EMEM), ⁇ 's Modified Eagle's Minim's Medium Essential Medium' ⁇ MEM), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, Iskov's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), MCDB131 medium, William's Medium E (Willi's Medium) ), Fisher's Medium, and the like.
  • STEMPRO registered trademark
  • hESC SFM medium Life Technologies
  • mTeSR1 medium STMCELL Technologies
  • TeSR2 medium STMCELL Technologies
  • TeSR2 medium STMCELL Technologies
  • TeSR Essential 8 medium
  • HESCGRO trademark
  • Serum-Free Medium for hES cells Millipore
  • PluristEM Human ES / iPS Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Medium
  • EMD Biological Industries Israel Beat-Haemek
  • NutriStem TM XF / FF Culture Medium Step
  • AF NutriStem® hESC XF Medium Biomedical Medium Biological Medium
  • Biologic Medium Co., Ltd.
  • StemFit registered trademark
  • components preferable for cell proliferation can be further added to these media.
  • Such components include, for example, sugars such as glucose, fructose, sucrose, maltose; amino acids such as asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid; proteins such as albumin and transformin; peptides such as glycylglycylglycine and soybean peptide; serum; Vitamin such as choline, vitamin A, vitamin B group (thiamine, riboflavin, pyridoxin, cyanocobalamine, biotin, folic acid, pantothenic acid, nicotine amide, etc.), vitamin C, vitamin E; Lipids such as cholesterol; Inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium dihydrogen phosphate; trace elements such as zinc, copper, selenium; N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2 -Aminoethanesulfonic acid (N, N-bis (2-
  • Antibiotics such as; Type I collagen, Type II collagen, fibronectin, laminin, poly-L-lysine, poly-D-lysine and other cell adhesion factors and extracellular matrix components; interleukin, fibroblast growth factor (FGF) , Transforming Growth Factor (HGF), Transforming Growth Factor (TGF) - ⁇ , Transforming Growth Factor (TGF) - ⁇ , Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Actibin A and other cytokines and growth factors; Examples thereof include hormones such as estradiol, progesterone, glucagon, and insulin, and an appropriate component can be selected and used according to the type of cells to be cultured.
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF Transforming Growth Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • TGF Transforming Growth Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • Actibin A and other cytokines and growth factors
  • examples thereof
  • D-glucose and 5 amino acids may be additionally added to the medium.
  • Glucose (or a salt thereof) is usually 0.1 g / L / day to 900 g / L / day, preferably 1 g / L / day to 200 g / L / day, more preferably 1 g / L in terms of glucose concentration. It can be added to the medium of the present invention so as to have a concentration of / day to 20 g / L / day.
  • 5 kinds of amino acids are usually 0.1 mg / L / day to the concentration of tryptophan (concentration converted to free tryptophan) with respect to the medium.
  • 11000 mg / L / day preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, more preferably 1 mg / L / day to 100 mg / L / day, with a concentration of cysteine (concentration converted to free cysteine).
  • 0.1 mg / L / day to 425,000 mg / L / day preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, more preferably 1 mg / L / day to 100 mg / L / day, cysteine or cystine concentration ( The concentration converted to cysteine in the free form) is usually 0.1 mg / L / day to 280000 mg / L / day, preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, and more preferably 1 mg / L / day to 100 mg.
  • the concentration of methionine is usually 0.1 mg / L / day to 55000 mg / L / day, preferably 1 mg / L / day to 1000 mg / L / day, and more. It is preferably 1 mg / L / day to 100 mg / L / day, and the concentration of arginine (concentration converted to free arginine) is usually 0.1 mg / L / day to 150,000 mg / L / day, preferably 1 mg / L /. It can be added to the medium of the present invention so as to have a day to 2000 mg / L / day, more preferably 1 mg / L / day to 200 mg / L / day.
  • the cell type to which the method of the present invention can be applied is not particularly limited.
  • Such cell types include, for example, germ cells such as sperm and eggs, somatic cells constituting the living body, stem cells (pluripotent stem cells, etc.), precursor cells, cancer cells isolated from the living body, and immortalizing ability separated from the living body. Includes cells (cell lines) that acquire and are stably maintained in vitro, cells that have been isolated from the living body and artificially modified with genes, cells that have been separated from the living body and artificially exchanged nuclei, etc. ..
  • somatic cells constituting the living body are not limited to the following, but are not limited to, fibroblasts, bone marrow cells, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, erythrocytes, platelets, macrophages, monospheres, and bones.
  • Cells pericutaneous cells, dendritic cells, keratinocytes, fat cells, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatic parenchymal cells, cartilage cells, oval cells, nervous system cells, glial cells, Neurons, oligodendrocytes, microglia, stellate collagen cells, heart cells, esophageal cells, muscle cells (eg, smooth muscle cells or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanin cells, hematopoietic precursor cells (eg, derived from umbilical cord blood) CD34 positive cells), mononuclear cells and the like.
  • the somatic cells include, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thoracic gland, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessels. Includes cells taken from any tissue such as tissue, blood (including cord blood), bone marrow, heart, eye, brain or nerve tissue.
  • Stem cells are cells that have the ability to replicate themselves and differentiate into other multi-lineage cells, and examples include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells). , Embryonic tumor cells, embryonic reproductive stem cells, artificial pluripotent stem cells (iPS cells), nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, reproductive stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Hair follicle stem cells and the like are included.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells
  • nerve stem cells hematopoietic stem cells
  • mesenchymal stem cells mesenchymal stem cells
  • hepatic stem cells pancreatic stem cells
  • muscle stem cells reproductive stem cells
  • intestinal stem cells intestinal stem cells
  • cancer stem cells hair follicle stem cells and the like
  • a cell line is a cell that has acquired infinite proliferative capacity by artificial manipulation in vitro, and examples thereof are, but are not limited to, CHO (Chinese hamster ovary cell line), HCT116. , Huh7, HEK293 (human fetal kidney cells), HeLa (human uterine cancer cell line), HepG2 (human liver cancer cell line), UT7 / TPO (human leukemia cell line), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT- 29, AE-1, 3D9, Ns0 / 1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five (registered trademark), Vero and the like are included.
  • CHO Choinese hamster ovary cell line
  • HCT116. Huh7, HEK293 (human fetal kidney cells)
  • HeLa human uterine cancer cell line
  • HepG2 human liver cancer cell line
  • UT7 / TPO human leukemia cell
  • the cells can be, but are not limited to, pluripotent stem cells, adult stem cells, or progenitor cells.
  • the cell can be a pluripotent stem cell.
  • the pluripotent stem cell can be an embryonic stem cell (ES cell) or an iPS cell, preferably an iPS cell.
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell preferably an iPS cell.
  • Adult stem cells can be, but are not limited to, hematopoietic stem cells, neural stem cells, reproductive stem cells, intestinal stem cells, epidermal stem cells, or mesenchymal stem cells.
  • the origin of pluripotent stem cells, adult stem cells, and progenitor cells is also not particularly limited, but those derived from mammals are preferable, and those derived from humans are more preferable.
  • the cell can be a cell derived from an iPS cell.
  • the iPS cell-derived cell means a cell in the process of differentiating an iPS cell by a method known per se, or a differentiated cell.
  • the culture conditions are not particularly limited, and a method known per se may be selected according to the cell type, cell density, culture method (adhesive culture / suspension culture, etc.) and the like.
  • the culture temperature can be usually 25 ° C. to 39 ° C., preferably 33 ° C. to 39 ° C.
  • the carbon dioxide concentration can be usually 4% by volume to 10% by volume, preferably 4% by volume to 6% by volume.
  • the oxygen concentration may be usually 1% by volume to 25% by volume, preferably 4% by volume to 20% by volume.
  • the present invention provides a cell culture medium composition (hereinafter, may be referred to as “the medium composition of the present invention”) containing 15 mg / L or more of choline.
  • the medium composition of the present invention is characterized in that a high concentration of choline is added to a general basal medium for cells.
  • the amount of choline contained in the medium for culturing cells is at most about 14 mg / L. This is because it is considered that the effect on cell proliferation is constant even if choline is added at a higher concentration.
  • the lower limit of the concentration of choline contained in the medium composition of the present invention is usually 15 mg / L, preferably 16 mg / L, more preferably 17 mg / L, still more preferably 18 mg / L, and particularly preferably 20 mg / L. It is possible, and it may be more than this.
  • the upper limit is not particularly limited, but from the viewpoint of cost and the like, it may be usually 1,000,000 mg / L, preferably 10000 mg / L, more preferably 1000 mg / L, still more preferably 100 mg / L, and particularly preferably 50 mg / L.
  • the concentration of choline in the medium composition of the present invention is usually 15 mg / L to 1,000,000 mg / L, preferably 16 mg / L to 100,000 mg / L, more preferably 17 mg / L to 10000 mg / L, still more preferably 18 mg. It can be from / L to 100 mg / L, particularly preferably 20 mg / L to 50 mg / L.
  • the medium for cells used in preparing the medium composition of the present invention may be prepared by a method known per se according to the cells to be cultured, or may be a commercially available product. ..
  • the medium that can be used for producing the medium composition of the present invention, the components that can be further added to the medium composition of the present invention, and the cell types to which the medium composition of the present invention can be applied are described in "1. Cell culture method”. It is the same as that described in.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • iPS cells a 1210B2 strain purchased from iPS Academia Japan was used.
  • a commercially available StemFit AK03N was used as a medium for iPS cells.
  • Figure 1 shows the results of verifying the effect of choline on the proliferation of iPS cells in a single series. The addition of choline gave results showing a cell proliferation promoting effect.

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Abstract

本発明は、コリンを特定の濃度で培地に添加することを含む、細胞の培養方法を提供する。

Description

細胞の高密度培養方法
　本発明は、細胞の高密度培養法に関し、詳細には、コリンの添加による、細胞の高密度培養法に関する。
　細胞を用いた再生医療技術は、これまでに治療することが困難であった様々な疾病や損傷を治療し得る手段の一つとして、近年、非常に注目されている。再生医療には大量の細胞を必要とするため、細胞を効率良く培養する方法の開発が意欲的に進められている。例えば、特許文献１には、培地中で幹細胞をＲＯＣＫ阻害剤で処理することを含む、幹細胞の培養方法が報告されている。また、本発明者らも２０１８年にグルコースおよび／または特定のアミノ酸を培地に添加することによる、動物細胞の高密度培養法等を報告している（特許文献２）。
特開２００８－０９９６６２号公報 特願２０１８－１８４３５２号
　特許文献２に記載の方法は、高密度培養法としては非常に優れた方法の一つであるが、今回、本発明者らは当該方法を再検討し、さらに好ましい高密度培養法の開発を試みた。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、細胞の高密度培養時に、様々な培地成分のなかでもコリンを追加添加するだけで極めて容易に細胞増殖を促進できる事実を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］コリンを０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで培地に添加することを含む、細胞の培養方法。
［２］細胞培養が浮遊培養である、［１］記載の方法。
［３］高密度培養用である、［１］または［２］記載の方法。
［４］培養される細胞の培地中の細胞密度が６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、［３］記載の方法。
［５］細胞が多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、［１］～［４］のいずれか記載の方法。
［６］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、［５］記載の方法。
［７］細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、［１］～［４］のいずれか記載の方法。
［８］コリンを１５ｍｇ／Ｌ以上含む、細胞培養培地組成物。
［９］浮遊培養用である、［８］記載の培地組成物。
［１０］高密度培養用である、［８］または［９］記載の培地組成物。
［１１］浮遊培養される細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、［１０］記載の培地組成物。
［１２］細胞が、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、［８］～［１１］のいずれか記載の培地組成物。
［１３］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、［１２］記載の培地組成物。
［１４］細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、［８］～［１３］のいずれか記載の培地組成物。
　本発明によれば、高密度培養下において、容易に細胞増殖を促進することができる。
図１は、ｉＰＳ細胞の増殖に対するコリン濃度の影響（ｎ＝１）を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
定義
　本明細書において、「浮遊培養」とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態で行われる細胞培養方法をいう。本発明において、浮遊培養は、液体培地に対する外部からの圧力や振動、または、当該液体培地中での振とうや回転操作を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。
　本明細書において、「高密度培養」とは、一般的な細胞培養において想定される細胞密度と比較して高い細胞密度での培養をいう。高密度の基準は、培養方法（接触培養／浮遊培養等）や多能性幹細胞の種類等によっても異なり得るが、例えば、ｉＰＳ細胞を浮遊培養する場合、本明細書においては６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の密度での培養を高密度培養と定義する。
　本明細書において、「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「成体幹細胞（体性幹細胞とも称される）」とは、特定の組織（器官）を構成する細胞に分化し得る能力を有する細胞を意味する。成体幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、表皮幹細胞、間葉系幹細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「前駆細胞」とは、前述した多能性幹細胞や成体幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞を意味する。
１．細胞の培養方法
　本発明は、コリンを０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで培地に添加することを含む、細胞の培養方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
　本発明の方法に用いられるコリンは細胞培養に用いられるグレードのものであれば特に限定されず、市販品を用いればよい。好適なコリンとしては、塩化コリン、重酒石酸コリン、重炭酸コリン、コリンリン酸塩、クエン酸二水素コリン等が挙げられるが、好ましくは塩化コリンである。
　本発明の方法において、培地に添加されるコリンの量（遊離体に換算した含有量）は、通常０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは０．１～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ（例えば、
［１］１～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、８０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、９０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［２］１～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、８０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［３］１～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［４］１～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［５］１～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［６］１～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［７］１～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［８］１～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［９］１～２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）
とすることができる。
　本発明の方法において用いられる培地は特に限定されず、培養する細胞種に適したものを使用することができる。かかる培地は自体公知の方法により調製することもできるし、市販品を用いてもよい。
　市販の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、α改変型イーグル最小必須培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（αＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ）、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。
　また、特に幹細胞培養用の培地としては、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨＥＳｃＧＲＯ（商標）　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＥＳ　ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（商標）　Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｓｒａｅｌ　Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）　ＸＦ／ＦＦ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、ＡＦ　ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｓｒａｅｌ　Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ社）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ－ＦＸ培地、ＣＤＭ培地、ＤＥＦ－ＣＳ　５００　Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ　３Ｄ　Ｓｐｈｅｒｏｉｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。
　また、これらの培地に、さらに細胞増殖に好ましい成分を添加することもできる。かかる成分としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖；アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等のアミノ酸；アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質；グリシルグリシルグリシン、大豆ペプチド等のペプチド；血清；コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ群（チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド等）、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン；オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸等の脂肪酸；コレステロール等の脂質；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩；亜鉛、銅、セレン等の微量元素；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＥＳ））、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ））、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ－［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ））等の緩衝剤；アンホテリシンＢ、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質；Ｔｙｐｅ　Ｉ　コラーゲン、Ｔｙｐｅ　ＩＩ　コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン等の細胞接着因子および細胞外マトリックス成分；インターロイキン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－α、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アクチビンＡ等のサイトカインおよび増殖因子；デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、インスリン等のホルモン等が挙げられ、培養する細胞の種類に応じて適切な成分を選択して用いることができる。
　好ましい一態様において、Ｄ－グルコースおよび５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（またはシスチン）、メチオニン、アルギニン）を追加で培地に添加してもよい。
　グルコース（またはその塩）は、グルコースの濃度に換算して通常０．１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～９００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～２００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように本発明の培地に添加することができる。
　また、５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（シスチン）、メチオニンおよびアルギニン）は、培地に対し、トリプトファンの濃度（遊離体のトリプトファンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、セリンの濃度（遊離体のセリンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～４２５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、システインもしくはシスチンの濃度（遊離体のシステインに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２８００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、メチオニンの濃度（遊離体のメチオニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～５５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、アルギニンの濃度（遊離体のアルギニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１５００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように本発明の培地に添加することができる。
　本発明の方法を適用し得る細胞種は特に限定されない。かかる細胞種としては、例えば、精子や卵子等の生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。
　細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
　一態様において、細胞は、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。
　一態様において、細胞は多能性幹細胞であり得る。この場合、ｂＦＧＦを追加で培地に添加することも好ましい。
　一態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはｉＰＳ細胞であり、好ましくはｉＰＳ細胞であり得る。また、成体幹細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、表皮幹細胞、または間葉系幹細胞であり得るが、これらに限定されない。尚、多能性幹細胞、成体幹細胞、および前駆細胞の由来も特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。
　一態様において、細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であり得る。ｉＰＳ細胞由来の細胞とは、ｉＰＳ細胞を、自体公知の方法を用いて、分化させる途中の段階にある細胞、または、分化させた細胞を意味する。
　本発明の方法において、培養条件は特に限定されず、細胞種、細胞密度、培養方法（接着培養／浮遊培養等）等に応じて自体公知の方法を選択すればよい。例えば、培養温度は、通常２５℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃であり得る。二酸化炭素濃度としては、通常４体積％～１０体積％、好ましくは４体積％～６体積％であり得る。酸素濃度としては、通常１体積％～２５体積％、好ましくは４体積％～２０体積％であり得る。
２．細胞培養培地組成物
　本発明は、コリンを１５ｍｇ／Ｌ以上含む、細胞培養用培地組成物（以下、「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。
　本発明の培地組成物は、一般的な細胞用の基礎培地に高濃度のコリンを添加することに特徴がある。
　本願出願日時点において、細胞を培養するための培地に含有されるコリン量は、多くても１４ｍｇ／Ｌ程度である。コリンをこれ以上の濃度で添加しても、細胞の増殖に対する作用が一定であると考えられているためである。しかし、本発明の培地組成物が含有するコリンの濃度の下限は、通常１５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１７ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１８ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２０ｍｇ／Ｌであり得、これ以上であってもよい。また、上限は特に限定されないが、コスト等の観点から、通常１００００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは５０ｍｇ／Ｌであり得る。一態様において、本発明の培地組成物のコリンの濃度は、通常１５ｍｇ／Ｌ～１００００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１６ｍｇ／Ｌ～１０００００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１７ｍｇ／Ｌ～１００００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１８ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２０ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌであり得る。
　本発明の培地組成物を調製するうえで用いられる細胞用の培地は、培養する細胞に即して、自体公知の方法により調製したものであってもよく、また、市販品であってもよい。
　本発明の培地組成物の製造に用い得る培地、さらに本発明の培地組成物に、さらに添加し得る成分、本発明の培地組成物を適用し得る細胞種は、「１．細胞の培養方法」において説明したものと同様である。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例
　以下の実施例では、コリンによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の増殖効果を評価した。ｉＰＳ細胞として、ｉＰＳアカデミアジャパン社より購入した１２１０Ｂ２株を用いた。また、ｉＰＳ細胞用培地として、市販のＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ（味の素社）を用いた。
［実施例１］浮遊培養系を用いたｃｈｏｌｉｎｅ強化によるｉＰＳ細胞の増殖促進効果
　ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ：　ＢＷＶ－Ｓ０３Ａ）を用いて、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ＋１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ：　０３４－２４０２４）にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ＣＯ２濃度＝５％、攪拌速度＝１２０ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。播種２日目に７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎで交換した。播種３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３ＮまたはＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ＋１０ｍｇ／Ｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（富士フイルム和光純薬社）に再懸濁し、マイクロバイオリアクターのａｍｂｒ１５（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ：００１－０８８１）に移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３ＮまたはＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ＋１０ｍｇ／Ｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅで１日１回交換し、さらに両群に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｔｒｐ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｓｅｒ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｃｙｓ塩酸塩（日本プロテイン社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｍｅｔ（味の素社）、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ａｒｇ（味の素社）、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ　Ｄ－グルコース（ナカライテスク社：１６８０６－２５）を添加した。培養８日目に生細胞数を生死細胞オートアナライザーのＶｉ－ＣＥＬＬＴＭ　ＸＲ（ベックマン・コールター社）を用いて測定した。
　ｉＰＳ細胞の増殖に対するコリンの影響を１連にて検証した結果を図１に示す。コリンの添加により、細胞増殖促進効果を示す結果が得られた。
　本発明によれば、非常に簡便且つ安価な方法により、極めて効率の良い高密度培養を行うことができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０２０－００３９５９（出願日：２０２０年１月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (14)

  1. 　コリンを０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで培地に添加することを含む、細胞の培養方法。
  2. 　細胞培養が浮遊培養である、請求項１記載の方法。
  3. 　高密度培養用である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　培養される細胞の培地中の細胞密度が６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項３記載の方法。
  5. 　細胞が多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項５記載の方法。
  7. 　細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  8. 　コリンを１５ｍｇ／Ｌ以上含む、細胞培養培地組成物。
  9. 　浮遊培養用である、請求項８記載の培地組成物。
  10. 　高密度培養用である、請求項８または９記載の培地組成物。
  11. 　浮遊培養される細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項１０記載の培地組成物。
  12. 　細胞が、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、請求項８～１１のいずれか一項記載の培地組成物。
  13. 　多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１２記載の培地組成物。
  14. 　細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項８～１３のいずれか一項記載の培地組成物。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04501660A (ja) * 1988-09-23 1992-03-26 カイロン　コーポレーション 増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地
JP2013524826A (ja) * 2010-04-26 2013-06-20 ノバルティス アーゲー 改良型細胞培養培地
JP2016026490A (ja) * 2014-06-27 2016-02-18 国立大学法人 千葉大学 多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法
JP2018184352A (ja) 2017-04-24 2018-11-22 アサマ化成株式会社 抗体を有効成分とするｔｎｆ産生抑制作用組成物
JP2020003959A (ja) 2018-06-26 2020-01-09 富士通株式会社 情報処理装置、演算処理装置及び情報処理装置の制御方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2251249B (en) * 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US20160230143A1 (en) * 2013-09-19 2016-08-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
GB201700504D0 (en) * 2017-01-11 2017-02-22 Francis Crick Inst Ltd Composition

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04501660A (ja) * 1988-09-23 1992-03-26 カイロン　コーポレーション 増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地
JP2013524826A (ja) * 2010-04-26 2013-06-20 ノバルティス アーゲー 改良型細胞培養培地
JP2016026490A (ja) * 2014-06-27 2016-02-18 国立大学法人 千葉大学 多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法
JP2018184352A (ja) 2017-04-24 2018-11-22 アサマ化成株式会社 抗体を有効成分とするｔｎｆ産生抑制作用組成物
JP2020003959A (ja) 2018-06-26 2020-01-09 富士通株式会社 情報処理装置、演算処理装置及び情報処理装置の制御方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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