ES2677319T3 - Medio y método de cultivo de células madre - Google Patents

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Kiichi Watanabe
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Abstract

Un método para cultivar células madre pluripotentes humanas, que comprende tratar las células madre con un inhibidor de ROCK (Rho-quinasa).

Description

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DESCRIPCION
Medio y metodo de cultivo de celulas madre
La presente invencion proporciona un metodo para cultivar celulas madre tales como celulas madre embrionarias (celulas ES), un medio para el cultivo de tales celulas madre, y usos de los mismos.
Las celulas ES proporcionan un fuerte candidato como fuente de celulas en trasplantes de celulas para enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Parkinson y la diabetes. En el estudio de las celulas ES, en el momento actual se usan normalmente las celulas ES de raton, pero a la vista de las aplicaciones clmicas es necesario llevar a cabo investigacion y desarrollo sin usar celulas ES humanas. Sin embargo, las celulas ES humanas experimentan mas facilmente la muerte celular que las celulas ES de raton en cultivo celular.
Por ejemplo, en el subcultivo de celulas ES humanas en cultivo de mantenimiento, los agregados celulares se suspenden una vez que se han separado de celulas alimentadoras o sustratos mediante tratamiento enzimatico o desprendimiento mecanico, separados por pipeteo a pequenos agregados celulares, y luego se han sembrado en una nueva placa de cultivo. Sin embargo, las celulas ES humanas experimentan un desprendimiento y una disociacion deficientes en comparacion con las cepas celulares comunes y las celulas ES de raton, y muchas de las celulas no sobreviven. Dado que las celulas ES humanas se dividen muy lentamente y se diferencian facilmente, se requiere mucho tiempo y mucha mano de obra para cultivar celulas ES humanas manteniendo al mismo tiempo sus propiedades indiferenciadas, y se requiere una capacitacion tecnica para obtener resultados reproducibles. Ademas, un impedimento para la investigacion y el desarrollo que usa celulas ES humanas es que la tasa de recoleccion disminuye debido a la muerte celular en el subcultivo. Ademas, aunque se desea clonar celulas ES humanas en procesos de ingeniena genetica, cuando las celulas ES humanas se disocian homogeneamente en celulas unicas la muerte celular y el cese del crecimiento ocurren muy facilmente y se cree que la eficacia de clonacion en celulas ES humanas es del 1% o menos.
Ademas, para diferenciar las celulas ES humanas, se separan de las celulas alimentadoras, se disocian como pequenos agregados celulares o celulas individuales, luego se siembran en un sustrato o celulas alimentadoras espedficas y se cultivan en un medio inductor de la diferenciacion. Este proceso tiene una eficiencia muy baja. Ademas, en un metodo de cultivo embrioide, un metodo SFEB (cultivo flotante libre de suero de agregados similares a cuerpos embrioides) desarrollado por el presente inventor (documento WO2005/123902 y Watanabe et al., Nature Neuroscience 8, 288 - 296 (2005)), se requiere que las celulas se disocien en celulas individuales una vez que se forman agregados de celulas, pero cuando dicha metodologfa se aplica a las celulas madre humanas, muchas celulas mueren. Ademas, existe un problema en el caso de las celulas ES humanas que, incluso si no estan completamente disociadas individualmente (en el caso del cultivo a partir de pequenos agregados celulares), es muy frecuente que las celulas mueran - Frisch et al., Curr. Opin. Cell Biol. 13, 555 - 562 (2001)). De acuerdo con esto, se desea el desarrollo de una metodologfa mejorada para el cultivo de celulas ES humanas.
La quinasa en doble espiral Rho-asociada (ROCK: n° de registro Gen-Bank: NM_005406) es una de las principales moleculas efectoras de la Rho GTPasa y se sabe que controla fenomenos fisiologicos tales como la constriccion vascular y la extension del axon del nervio (Riento et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446 - 456 (2003)). Se conocen varios compuestos como inhibidores de ROCK (por ejemplo, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol., 57, 976 - 983 (2000) y Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273 - 284 (2000)).
Aunque hay varias publicaciones segun las cuales la muerte celular es controlada por la inhibicion de ROCK (Minambres et al., J. Cell Sci. 119, 271 - 282 (2006) y Kobayashi et al., J. Neurosci. 24, 3480 - 3488 (2004)), tambien hay informes de que la inhibicion de ROCK acelera la apoptosis (Rattan et al., J. Neurosci Res. 83, 243 - 255 (2006) y Svoboda et al., Dev Dyn. 229, 579 - 590 (2004)) y el papel de Rho/ROCK en el control de la apoptosis aun no ha sido establecido (Riento et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446 - 456 (2003)).
Se conoce por Pacary E. et al., J. Cell Science 119, n° 13, julio 2006 pp 2667 - 2678 que el CoCl2 induce la diferenciacion de celulas madre mesenquimales en las neuronas y que la inhibicion de ROCK potencia este efecto. Sin embargo, no hay ninguna publicacion con respecto al cultivo de celulas madre tales como celulas ES en un medio que contiene un inhibidor de ROCK.
Fukushima et al., Hepatology, vol. 38, pagina 562, 2003, publica que el hidroxifasudil, un inhibidor de ROCK, suprime el crecimiento celular y la produccion de colageno en celulas hepaticas de rata. Laplante et al., Journal of Neurobiology, vol. 60, no. 3, 289 - 307, 2004 publica que RhoA/ROCK y Cdc42 regulan el contacto de celula con celula y el nivel de protema N- cadherina durante la neurodeterminacion de celulas madre embrionarias P19.
El documento WO2006/053014 A2 describe un metodo para prevenir o retrasar la apoptosis de una celula suministrando a la celula un agente que inhibe selectivamente ROCK1 y que comprende un acido nucleico, un polipeptido, un peptido o una mezcla de los mismos. Se propone en particular el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante la administracion de tal agente.
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar una nueva metodologfa y un nuevo medio eficaz para el cultivo de celulas madre tales como las celulas ES.
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Los presentes inventores han estudiado ampliamente el tema y como resultado han encontrado que la tasa de supervivencia, la potencia de proliferacion y/o la eficacia de diferenciacion de una celula madre tal como una celula madre pluripotente, especialmente una celula ES, se puede mejorar cultivando la celula madre en un medio de cultivo que contiene un inhibidor de ROCK.
Por tanto, la presente invencion proporciona:
[1] Un metodo de cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, que comprende tratar las celulas madre con un inhibidor de ROCK (Rho-quinasa).
[2] El metodo del epfgrafe [1] mencionado anteriormente, en el que las celulas madre estan disociadas.
[3] El metodo del epfgrafe [2] mencionado anteriormente, en el que las celulas madre son celulas unicas o celulas madre agregadas (es decir, celulas que han formado un racimo de celulas).
[4] El metodo de cualquiera de los epfgrafes [1] - [3] anteriormente mencionados, en el que las celulas madre se cultivan en cultivo adherente o en cultivo en suspension.
[5] Un metodo para producir una celula diferenciada a partir de una celula madre que tiene una tasa de supervivencia y/o una potencia de proliferacion mejorada, o una celula madre que tiene una eficacia de diferenciacion mejorada, comprendiendo dicho metodo cultivar una celula madre pluripotente humana en presencia de un inhibidor de ROCK.
[6] Un metodo segun cualquiera de los epfgrafes [1] - [5] mencionados anteriormente, en donde el inhibidor de ROCK es Y-27632, Fasudil o H-1152.
[7] Un preparado de celulas que comprende una celula madre pluripotente humana y un inhibidor de ROCK.
[8] El preparado celular del epfgrafe [7] antes mencionado, en el que la celula madre esta disociada.
[9] Un preparado celular de acuerdo con cualquiera de los epfgrafes [7] - [8] anteriormente mencionados, en el que el inhibidor de ROCK es Y027632, Fasudil o H-1152.
[10] Uso de un inhibidor de ROCK (i) para promover y/o mejorar la eficiencia de clonacion o la eficiencia de pasajes en un cultivo de celulas madre pluripotentes, (ii) para promover y/o mejorar la formacion de colonias en un cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, y/o (iii) para promover y/o mejorar la supervivencia de las celulas madre pluripotentes humanas en un cultivo.
[11] Un uso de acuerdo con el epfgrafe [10] mencionado anteriormente, en el que el inhibidor de ROCK es Y- 27632, Fasudil o H-1152.
Las realizaciones de lo anterior incluyen asf un metodo de cultivo de una celula madre pluripotente humana que comprende el mantenimiento de la celula madre en un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ROCK, y un medio de cultivo de celulas madre pluripotentes humanas que comprende un inhibidor de ROCK.
En otros aspectos, la invencion proporciona un metodo de cultivo de celulas madre pluripotentes humanas para promover la eficiencia de clonacion o la eficiencia de los pasajes, que comprende cultivar las celulas madre en un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ROCK; un metodo para promover la formacion de colonias en un cultivo de celulas madre, que comprende cultivar celulas madre pluripotentes humanas en presencia de un inhibidor de ROCK; y un metodo para mejorar la eficacia de clonacion o la eficacia de pasaje en un cultivo de celulas madre, que comprende cultivar celulas madre pluripotentes humanas en presencia de un inhibidor de ROCK.
En realizaciones preferidas de la invencion, las celulas madre se cultivan en ausencia de celulas alimentadoras, extractos de celulas alimentadoras y/o suero. Las celulas madre se pueden cultivar en presencia de un inhibidor de ROCK antes de la subclonacion o el pasaje, v. g. durante al menos una hora antes de subclonar o pasar. Alternativa o adicionalmente, las celulas madre se mantienen en presencia de un inhibidor de ROCK despues de la subclonacion o el pasaje. En realizaciones preferidas, las celulas madre se mantienen en presencia de un inhibidor de ROCK durante al menos aproximadamente 12 horas, mas preferiblemente al menos aproximadamente 2, aproximadamente 4 o aproximadamente 6 dfas. En otras realizaciones, las celulas madre se mantienen en presencia de un inhibidor de ROCK durante al menos uno a cinco pasajes.
En algunas realizaciones de la invencion, el inhibidor de ROCK se retira posteriormente del medio de cultivo, por ejemplo despues de aproximadamente 12 horas o despues de aproximadamente 2, aproximadamente 4 o aproximadamente 6 dfas. En otras realizaciones, el inhibidor de ROCK se retira despues de al menos uno a cinco pasajes.
Otro aspecto de la invencion proporciona un metodo para mejorar la supervivencia de celulas madre pluripotentes humanas en un cultivo, que comprende poner en contacto las celulas madre con un inhibidor de ROCK o exponer de otra forma las celulas madre al mismo. Los metodos de este aspecto de la invencion son particularmente adecuados
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para mejorar la supervivencia celular cuando el cultivo comprende celulas madre disociadas o agregados de celulas madre en suspension. Tales metodos son especialmente utiles cuando el cultivo comprende celulas a baja densidad, que incluyen las densidades celulares ejemplares descritas aqm, o cuando el cultivo comprende celulas madre a densidad clonal. Preferiblemente, las celulas madre se mantienen en presencia de un inhibidor de ROCK durante al menos aproximadamente 12 horas, mas preferiblemente durante al menos aproximadamente 2, aproximadamente 4, o aproximadamente 6 dfas, o durante al menos uno a cinco pasajes. Opcionalmente, el inhibidor de ROCK se retira posteriormente del medio de cultivo, v. g. despues de aproximadamente 12 horas, despues de aproximadamente 2, aproximadamente 4, o aproximadamente 6 dfas, o despues de al menos uno a cinco pases. Un metodo adicional de la invencion es un metodo de transporte de celulas madre que comprende el transporte de las celulas madre en un medio que comprende un inhibidor de ROCK.
Se apreciara que los metodos de la invencion se pueden llevar a cabo usando cualquier inhibidor de ROCK adecuado como se describe en el presente texto. Los inhibidores de ROCK preferidos son Y-27632, Fasudil y H-1152.
Los metodos se pueden usar ventajosamente en cualquier situacion en la que las celulas madre pluripotentes humanas se afslen o se cultiven a bajas densidades. En el uso de la invencion, las celulas madre se mantienen en un estado indiferenciado con muerte celular reducida. Por tanto, los metodos se pueden usar para mejorar la derivacion de las celulas madre de los tejidos.
Los metodos tambien son utiles en el contexto de la modificacion genetica de celulas madre pluripotentes humanas, particularmente en el aislamiento de poblaciones clonales de celulas madre geneticamente modificadas. Una poblacion transfectada de celulas ES humanas se puede obtener mediante un metodo, que comprende:
- transfectar celulas ES con una construccion que codifica un marcador seleccionable;
- cultivar en placa las celulas ES;
- cultivar las celulas ES en presencia de un inhibidor de ROCK; y
- seleccionar las celulas que expresan el marcador seleccionable.
El inhibidor de ROCK puede estar presente en el medio de cultivo antes y/o despues de la aplicacion de la seleccion para las celulas que expresan el marcador seleccionable. Se prefiere que el inhibidor de ROCK este presente durante la seleccion, particularmente si el marcador seleccionable confiere resistencia a agentes de seleccion particulares presentes en el medio (por ejemplo, resistencia a antibioticos) para contrarrestar los efectos de las bajas densidades de celulas madre. Opcionalmente, el metodo incluye ademas la etapa de subclonar las celulas ES que expresan el marcador seleccionable en presencia de un inhibidor de ROCK, promoviendo asf el crecimiento de celulas madre y/o la formacion de colonias, y/o mejorando la supervivencia de las celulas madre.
Se puede usar un inhibidor de ROCK en la fabricacion de un medio de cultivo para celulas madre pluripotentes humanas. El medio de cultivo puede ser cualquier medio descrito en el presente texto, o puede comprender una combinacion o uno o mas componentes de medios descritos en este documento. El medio puede formularse para que sea adecuado para el cultivo de cualquier tipo de celula madre descrito en la presente memoria, que incluye celulas madre humanas y de raton, v. g. celulas ES.
Tambien se describe un medio de cultivo de celulas que esta libre de suero y extracto de suero y comprende: medio basal; un inhibidor de ROCK; y opcionalmente uno o mas de insulina, factor de crecimiento de insulina y un transportador de hierro. Los medios basales adecuados y los transportadores de hierro (por ejemplo, transferrina) estan facilmente disponibles para un profesional experto, incluyendo los medios ejemplares y transportadores de hierro descritos en este documento.
Los aspectos de adicion de la presente invencion se refieren al uso de un inhibidor de ROCK para lograr los efectos sobre celulas madre pluripotentes humanas descritas en este documento. En particular, los aspectos de la invencion proporcionan el uso de un inhibidor de ROCK para promover y/o mejorar la eficacia de la clonacion o la eficacia de los pasajes en un cultivo de celulas madre; uso de un inhibidor de ROCK para promover y/o mejorar la formacion de colonias en un cultivo de celulas madre; y el uso de un inhibidor de ROCK para promover y/o mejorar la supervivencia de las celulas madre en un cultivo.
Se apreciara que la discusion de las ventajas de los metodos de la invencion proporcionados en la presente memoria se aplica igualmente al uso de inhibidores de ROCK segun la invencion y a medios y otras composiciones de acuerdo con la invencion.
Los metodos de cultivo de la presente invencion pueden mejorar la tasa de supervivencia, la potencia de proliferacion o la eficacia de diferenciacion de celulas madre pluripotentes humanas. En particular, el metodo de cultivo de la presente invencion puede mostrar sus ventajas, por ejemplo, en cualquier metodo de cultivo que incluya la disociacion de celulas madre, cultivos adherentes o en suspension de las celulas madre disociadas, o similares. El metodo de cultivo de la presente invencion tiene tales ventajas, por lo que puede usarse preferiblemente para el cultivo de paso de la celula madre, induccion de diferenciacion de la celula madre (por ejemplo, celulas neurales o nerviosas),
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purificacion o clonacion de la celula madre, modificacion genetica de la celula madre, etc.
La preparacion de celulas, el agente de cultivo, la combinacion (por ejemplo, composicion y kit), medio libre de suero, sistema de cultivo y similares descritos en la presente memoria se pueden usar preferiblemente, por ejemplo, para el metodo de cultivo de la presente invencion.
Las celulas madre pluripotentes humanas a tratar con un inhibidor de ROCK de acuerdo con la presente invencion pueden ser celulas disociadas o celulas no disociadas. Las celulas disociadas se refieren a celulas tratadas para promover la disociacion celular (por ejemplo, la disociacion que se describe mas adelante). Las celulas disociadas incluyen una sola celula y las celulas que han formado un pequeno racimo de celulas (agregado) de varias celulas (tfpicamente de aproximadamente 2 a 50, de 2 a 20 o de 2 a 10). Las celulas disociadas pueden ser celulas suspendidas (flotantes) o celulas adheridas. Por ejemplo, se ha sabido que las celulas ES, tales como las celulas ES humanas, son susceptibles a condiciones espedficas tales como la disociacion (y/o el cultivo en suspension despues de la disociacion). Los metodos de la presente invencion tienen un uso particular cuando la celula madre esta sujeta a condiciones en las que se habna producido la muerte celular hasta ahora.
Para practicar la presente invencion, los inhibidores de ROCK generalmente son adecuados sin limitacion, siempre y cuando un inhibidor pueda inhibir la funcion de la Rho-quinasa (ROCK), y los inhibidores adecuados incluyen Y-27632 (por ejemplo, veanse Ishizaki et al., Mol. Pharmacol., 57, 976 - 983 (2000); Narumiya y col., Methods Enzymol. 325, 273 - 284 (2000)), Fasudil (tambien denominado HA1077) (por ejemplo, vease Uenata et al., Nature 389: 990 - 994 (1997)), H-1152 (por ejemplo, vease Sasakiet et al., Pharmacol. Ther. 93: 225 - 232 (2002)), Wf-536 (por ejemplo, vease Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4): 319 - 324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de EE. UU. 5478838) y sus derivados, y acido nucleico antisentido para ROCK, acido nucleico que induce la interferencia de ARN (por ejemplo, ARNsi), peptidos competitivos, peptidos antagonistas, anticuerpos inhibidores, fragmentos de anticuerpo-ScFv, variantes negativas dominantes y vectores de expresion de los mismos. Ademas, dado que otros compuestos moleculares bajos son conocidos como inhibidores de ROCK, tales compuestos o sus derivados tambien se pueden usar en la presente invencion (por ejemplo, veanse las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 y 20030087919, y Publicaciones de patente internacional Nos. 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 y 2004/039796). En la presente invencion, tambien se puede usar una combinacion de uno o dos o mas de los inhibidores de ROCK.
De acuerdo con la presente invencion, la celula madre se puede tratar con el inhibidor de ROCK en un medio. De ese modo el medio usado en los metodos de la presente invencion puede contener ya el inhibidor de ROCK o, alternativamente, los metodos de la presente invencion pueden implicar una etapa de adicion del inhibidor de ROCK al medio. La concentracion del inhibidor de ROCK en el medio no esta limitada particularmente en la medida en que pueden lograr los efectos deseados, tales como la tasa de supervivencia mejorada de las celulas madre. Por ejemplo, cuando se usa Y-27632 como inhibidor de ROCK, se puede usar preferiblemente a la concentracion de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 pM, mas preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 pM, aun mas preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 30 pM, y lo mas preferiblemente alrededor de 2,0 a 20 mM. Cuando se usa Fasudil/HA1077 como inhibidor de ROCK, se puede usar a aproximadamente el doble de la concentracion de Y-27632 antes mencionada. Cuando se usa H-1152 como inhibidor de ROCK, puede usarse aproximadamente a 1/50 de la concentracion de Y-27632 antes mencionada.
El tiempo para tratar con el inhibidor de ROCK no esta particularmente limitado siempre y cuando tenga una duracion suficiente para que se puedan conseguir los efectos deseados, tales como la tasa de supervivencia mejorada de las celulas madre. Para una celula madre embrionaria humana (no de la invencion), el tiempo para el tratamiento es preferiblemente de aproximadamente 30 minutos a varias horas (por ejemplo, aproximadamente una hora) antes de la disociacion. Despues de la disociacion, la celula madre embrionaria humana puede tratarse con el inhibidor de ROCK durante, por ejemplo, aproximadamente 12 horas o mas para lograr los efectos deseados.
La densidad de la celula o celulas madre a tratar con el inhibidor ROCK es particularmente no limitada por cuanto es una densidad a la que se pueden conseguir los efectos deseados, tales como la tasa de supervivencia mejorada de las celulas madre. Es preferiblemente de aproximadamente 1,0 x 101 a 1,0 x 107 celulas/ml, mas preferiblemente de aproximadamente 1,0 x 102 a 1,0 x 107 celulas/ml, ademas preferiblemente de aproximadamente 1,0 x 103 a 1,0 x 107 celulas/ml, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 3,0 x 104 a 1,0 x 106 celulas/ml.
Los metodos de la presente invencion pueden implicar adicionalmente una etapa de disociacion de celulas madre. La disociacion de celulas madre se puede realizar usando cualquier procedimiento conocido. Estos procedimientos incluyen tratamientos con un agente quelante (como EDTA), una enzima (como la tripsina, la colagenasa) o similares, y operaciones tales como la disociacion mecanica (como el pipeteo). La o las celulas madre pueden tratarse con el inhibidor de ROCK antes y/o despues de la disociacion. Por ejemplo, las celulas madre pueden tratarse solo despues de la disociacion. El tratamiento de las celulas madre con el inhibidor de ROCK puede ser como se describio anteriormente.
Las condiciones de cultivo de acuerdo con la presente invencion se definiran apropiadamente dependiendo del medio y de las celulas madre utilizadas. La presente invencion tambien proporciona un medio para ser usado en los metodos de la presente invencion.
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El medio de acuerdo con la presente invencion se puede preparar usando un medio que se emplea para cultivar celulas animales como su medio basal. Como medio basal, puede ser utilizado cualquiera de los medios BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, MEM Zinc Option mejorado, IMDM, Medio 199, Eagle Mem, aMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 y Fischer, asf como cualquier combinacion de los mismos, pero el medio no esta particularmente limitado a el en la medida en que puede usarse para cultivar celulas animales.
El medio de acuerdo con la presente invencion puede ser un medio que contiene o que no contiene suero. El medio libre de suero se refiere a medios sin suero no procesado o no purificado y, en consecuencia, puede incluir medios con componentes hemoderivados purificados o componentes derivados de tejido animal (tales como factores de crecimiento). Desde el punto de vista de la prevencion de la contaminacion con componentes heterogeneos derivados de animales, el suero puede derivarse del mismo animal que el de las celulas madre.
El medio de acuerdo con la presente invencion puede contener o no contener ninguna alternativa al suero. Las alternativas al suero pueden incluir materiales que contienen apropiadamente albumina (tal como albumina rica en lfpidos, sustitutos de albumina como albumina recombinante, almidon vegetal, dextranos e hidrolizados de protemas), transferrina (u otros transportadores de hierro), acidos grasos, insulina, precursores de colageno, elementos traza, 2- mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol, o equivalentes de los mismos. Las alternativas al suero se pueden preparar por el metodo descrito en la Publicacion Internacional N° 98/30679, por ejemplo. Alternativamente, se puede usar cualquier material disponible comercialmente para mayor comodidad. Los materiales comercialmente disponibles incluyen knockout Serum Replacement (KSR), lfpido qmmicamente definido concentrado (Gibco) y Glutamax (Gibco).
El medio de la presente invencion tambien puede contener acidos grasos o lfpidos, aminoacidos (tales como aminoacidos no esenciales), vitaminas, factores de crecimiento, citoquinas, sustancias antioxidantes, 2- mercaptoetanol, acido piruvico, agentes de tamponamiento y sales inorganicas. La concentracion de 2-mercaptoetanol puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 1,0 mM, y preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 0,5 mM, pero la concentracion no se limita de un modo particular a ellas, siempre y cuando sea apropiada para cultivar las celulas madre.
Un recipiente de cultivo utilizado para cultivar las celulas madre puede incluir, pero sin limitarse a ellos: matraz, matraz para cultivo de tejidos, plato, placa de Petri, plato para cultivo de tejidos, plato multiple, microplaca, placa de micropocillos, multiplaca, placa multipocillos, micro slide, portaobjetos de camara, schale, tubo, bandeja, bolsa de cultivo, y frasco rotatorio, siempre y cuando sea capaz de cultivar las celulas madre en ellos.
El recipiente de cultivo puede ser adhesivo o no adhesivo celular, y puede seleccionarse segun el proposito. El recipiente de cultivo adhesivo celular se puede recubrir con cualquiera de los sustratos para la adhesion celular, tal como la matriz extracelular (ECM) para mejorar la adhesividad de la superficie del recipiente a las celulas. El sustrato para la adhesion celular puede ser cualquier material destinado a unir celulas madre o celulas alimentadoras (si se usan). El sustrato para la adhesion celular incluye colageno, gelatina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, laminina y fibronectina y mezclas de los mismos, por ejemplo Matrigel, y preparados de membranas celulares lisadas (Klimanskaya I et al. 2005. Lancet 365: p 1636 - 1641).
Pueden definirse apropiadamente otras condiciones de cultivo. Por ejemplo, la temperatura de cultivo puede ser de aproximadamente 30 a 40°C y preferiblemente aproximadamente 37°C, pero no se limita a ellas de un modo particular. La concentracion de CO2 puede ser de aproximadamente 1 a 10% y preferiblemente de aproximadamente 2 a 5%. La tension de oxfgeno puede ser del 1 al 10%.
Los metodos de la presente invencion se pueden usar para el cultivo de adhesion de celulas madre, por ejemplo. En este caso, las celulas se pueden cultivar en presencia de celulas alimentadoras. En el caso en el que se usan las celulas alimentadoras en los metodos de la presente invencion, se pueden usar como celulas alimentadoras celulas estromales tales como fibroblastos fetales (por ejemplo, veanse Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634 (1981); Evans et al., Nature, 292, 154 (1981); Jainchill et al., J. Virol., 4, 549 (1969); Nakano et al., Science, 272, 722(1996); Kodama et al., J. Cell. Physiol., 112, 89 (1982); y las publicaciones internacionales Nos. 01/088100 y 2005/080554).
Los metodos de la presente invencion tambien se pueden usar para un cultivo en suspension de celulas madre, incluyendo el cultivo en suspension en portadores (Fernandes AM) et al. J. Biotechnology 2007) o encapsulacion en gel/biopolfmero (Patente de los Estados Unidos 20070116680). La expresion “cultivo en suspension de celulas madre” significa que las celulas madre se cultivan bajo condiciones no adherentes con respecto al recipiente de cultivo o celulas alimentadoras (si se usan) en un medio. El cultivo en suspension de celulas madre incluye un cultivo de disociacion de celulas madre y un cultivo en suspension de agregados de celulas madre. La expresion “cultivo de disociacion de celulas madre” significa que se cultivan celulas madre suspendidas, y el cultivo de disociacion de celulas madre incluye las de las celulas madre individuales o las de pequenos agregados de celulas compuestos por una pluralidad de celulas madre (por ejemplo, de 2 a 20 celulas). Cuando se continua el cultivo de disociacion mencionado anteriormente, las celulas disociadas cultivadas forman un agregado de celulas madre mas grande, y despues de eso puede realizarse un cultivo de suspension de agregados. El cultivo de suspension de agregados incluye un metodo de cultivo embrioide (vease Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862 - 869 (1995)), y un metodo SFEB (Watanabe et
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al., Nature Neuroscience 8, 288 - 296 (2005); publicacion internacional n° 2005/123902). Los metodos de la presente invencion pueden mejorar significativamente la tasa de supervivencia y/o la eficacia de diferenciacion de celulas madre en un cultivo en suspension.
Los metodos de la presente invencion se pueden usar como metodos de subcultivo de celulas madre. Por tanto, los metodos de la presente invencion pueden implicar una etapa de recoleccion/cultivo en placa de celulas madre. De acuerdo con los metodos de la presente invencion, se puede conseguir una tasa de supervivencia mas alta y una potencia de proliferacion mejorada.
En consecuencia, los metodos de la presente invencion permiten que las celulas individuales (o una pequena agregacion de celulas) se disocien unas de otras en cultivo de manera eficiente; ademas, los metodos de la invencion pueden promover la eficacia del descubrimiento de farmacos y ensayos de seguridad (por ejemplo, cribado de alto rendimiento) usando celulas madre. Ademas, los metodos de la presente invencion proporcionan un facil cribado/subclonacion de celulas madre modificadas geneticamente (celulas recombinadas y/o recombinadas homologicamente) y un cribado mas seguro y mas homogeneo de una lmea de celulas madre para aplicaciones medicas. Los metodos de la presente invencion tambien tienen ventajas por cuanto dan como resultado que las celulas madre retengan propiedades indiferenciadas de celulas madre sin afectar su potencia de diferenciacion.
Los metodos de la presente invencion se pueden usar mientras se induce la diferenciacion de las celulas madre. Por tanto, los metodos de la presente invencion pueden implicar una etapa de induccion de diferenciacion de las celulas madre. Se puede emplear cualquier metodo conocido para inducir la diferenciacion de celulas madre. Los ejemplos de las celulas que han de producirse a traves de la diferenciacion de celulas madre incluyen celulas endodermicas (celulas positivas a marcadores Sox17 o AFP, etc.), celulas mesodermicas (celulas positivas a marcadores Brachyury, Flk1, Mox, etc.) y celulas ectodermicas. Los ejemplos de celulas ectodermicas incluyen celulas neurales (NCAM, TuJ1, tirosina hidroxilasa (TH), serotonina, nestina, mAP2, MAP2ab, NeuN, GABA, glutamato, ChAT o celulas positivas al marcador Sox1, etc.), celulas epidermicas (celulas positivas al marcador de citoqueratina, etc.), celulas sensoriales (celulas positivas para el marcador RPE o rodopsina, etc.), celulas pigmentarias (celulas positivas para el marcador TRP-1, etc.) y celulas mesenquimatosas derivadas de la cresta neural (celulas positivas para el marcador SMA, etc.). El metodo SFeB (vease Nature Neuroscience 8, 288 - 296, 2005; publicacion internacional N° 2005/123902) puede usarse para inducir preferiblemente celulas del sistema nervioso, tales como celulas neurales (por ejemplo, celulas neurales cerebrales) y sus precursores, a partir de las celulas ES. En este caso, se pueden usar los factores de la forma siguiente; inhibidores nodales (Lefty-A, Lefty-B, Lefty-1, Lefty-2, receptores nodales solubles, anticuerpos nodales, inhibidores del receptor nodal, etc.); inhibidores Wnt (Dkk1, protemas Cerberus, inhibidores del receptor Wnt, receptores Wnt solubles, anticuerpos Wnt, inhibidores de casema quinasa, protemas Wnt negativas dominantes, etc.); e inhibidores de BMP (anticuerpos anti-BMP, receptores BMP solubles, inhibidores del receptor de BMP, etc.). De acuerdo con los metodos de la presente invencion, las celulas madre se pueden diferenciar eficientemente en celulas espedficas. Los metodos de la presente invencion tienen otras ventajas porque se pueden usar preferiblemente en otros metodos (por ejemplo, un metodo SDIA, un metodo AMED, un metodo que usa celulas PA6), que permiten que las celulas madre se diferencien en celulas neurales (celulas neurales del prosencefalo o cerebro anterior y/o celulas dorsales cerebrales (region cortical) y celulas ventrales cerebrales (region ganglionar basal).
La presente invencion proporciona un preparado celular obtenido por los metodos de la presente invencion y/o los tratamientos de disociacion mencionados anteriormente. El preparado celular de la presente invencion incluye una celula madre pluripotente humana y un inhibidor de ROCK. Un preparado celular de la presente invencion puede ser un preparado que comprende celulas disociadas tales como agregados pequenos de celulas compuestos por una pluralidad de celulas individuales. Tal preparado celular puede mejorar la tasa de supervivencia o la eficacia de diferenciacion de las celulas madre, preferiblemente celulas madre neurales humanas. El preparado celular de la presente invencion, por ejemplo, puede usarse para el almacenamiento (por ejemplo, crioconservacion) y/o el transporte de celulas madre o el subcultivo de celulas madre. Cuando el preparado celular se usa para la crioconservacion de celulas madre, el preparado celular de la presente invencion puede incluir adicionalmente el suero descrito anteriormente o un sustituto del mismo, o un disolvente organico (por ejemplo, DMSO). En este caso, la concentracion de suero o de su sustituto puede ser, pero no esta limitada a ella, aproximadamente 1 - 50% (v/v), preferiblemente aproximadamente 5 - 20% (v/v). La concentracion de disolvente organico puede ser, pero sin limitarse a ella, aproximadamente 0 - 50% (v/v), preferiblemente aproximadamente 5 - 20% (v/v). Las composiciones de estas realizaciones de la invencion pueden incluir suero o pueden estar exentas de suero y por separado pueden incluir celulas alimentadoras.
Un agente de cultivo de celulas madre comprende un inhibidor de ROCK. En general, el agente de cultivo sera un medio de cultivo para celulas madre. El agente de cultivo puede usarse preferiblemente en los metodos de cultivo de la presente invencion.
Puede usarse, por ejemplo, una combinacion que comprende un inhibidor de ROCK y otros componentes para cultivar celulas madre (por ejemplo, cultivo de pasaje, cultivo de induccion de la diferenciacion).
Por ejemplo, la combinacion puede ser una composicion. La composicion puede proporcionarse en forma de una mezcla de un inhibidor de ROCK y otros componentes. Los otros componentes que pueden incluirse en la composicion incluyen, por ejemplo: agentes de ajuste de la diferenciacion de celulas madre tales como inhibidores de diferenciacion
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de las celulas madre (por ejemplo, suero, FGF, LIF, BMP, Wnt, una matriz extracelular, TGF-p, una celula alimentadora), e inductores de diferenciacion de celulas madre (por ejemplo, un inhibidor de BMP, un inhibidor de Wnt, un inhibidor nodal, acido retinoico, suero, una matriz extracelular, las celulas alimentadoras tales como celulas mesenquimales); as^ como el aditivo de cultivo (por ejemplo, KSR, 2-mercaptoetanol, aminoacidos, acidos grasos y los otros factores descritos anteriormente).
La combinacion puede ser tambien un kit. Un kit puede comprender un inhibidor de ROCK y otros componentes por separado (es decir, de una manera no mixta). Por ejemplo, el kit se puede proporcionar en forma de cada componente que se empaqueta individualmente en un envase. Los otros componentes que pueden estar contenidos en el kit incluyen, por ejemplo: los otros componentes mencionados anteriormente, que se pueden incluir en la composicion; un material para la identificacion o medida (deteccion o cuantificacion) de las celulas madre o celulas diferenciadas (por ejemplo, un anticuerpo contra el marcador celular); un medio de cultivo celular; un recipiente para cultivo que se trata con una matriz extracelular; un plasmido para recombinacion genetica y un agente selectivo de la misma.
Un sistema de cultivo contiene celulas madre y un inhibidor de ROCK en un medio. El sistema de cultivo puede contener celulas madre en el medio de la presente invencion. El sistema de cultivo puede contener ademas factores de cultivo de celulas en un medio, distintos de los componentes descritos en detalle con relacion a los metodos de la presente invencion, tales como una celula alimentadora, matriz soporte de celulas, o un inhibidor de ROCK.
A continuacion se proporcionan ejemplos detallados. Los ejemplos se ilustran mediante los siguientes dibujos:
Figura 1 - El inhibidor de ROCK Y-27632 aumenta notablemente la eficacia de clonacion de celulas hES (KhES-1) sin afectar a su pluripotencia. (a - c) Cultivo de baja densidad de celulas hES disociadas en ausencia (a) y presencia (b) de Y-27632 1o |jM en MEF durante siete dfas. Casi todas las colonias fueron positivas para ALP. Barras, 500 pm. (c) Relaciones de colonias ALP+ con el numero de celulas hES sembradas inicialmente (**, P < 0,01 frente a control, n = 3). (d - f) Inmunotincion de colonias de celulas hES tratadas con Y-27632, con anticuerpos anti-E-cadherina (d), - Oct3/4 (e) y -SSEA-4 (f). Los paneles inferiores son tinciones DAPI nucleares. Barras, 100 pm. El tratamiento con Y- 27632 no produjo cambio drastico en la formacion de haces de actina de celulas hES (no mostrado). (g) Analisis por RT-PCR de los marcadores mesodermicos tempranos Brachyury y Meoxl en la diferenciacion de celulas hES. RT(-), G3PDH PCR sin transcripcion inversa. (h) Analisis de RT-PCR del marcador endodermico temprano Sox17 en celulas ES diferenciadoras. (i - k) Inmunotincion para los marcadores mesodermicos y endodermicos en diferenciacion de celulas hES en una placa de 8 pocillos recubierta con colageno I y IV. (i) Expresion del marcador mesodermico de Brachyury (rojo) en varias celulas diferenciadoras. Se uso DAPI para tincion nuclear (azul; c). Barra, 10 jm. (j) Inmunotincion de actina de musculo liso (SMA; rojo) en celulas derivadas de celulas hES (tratadas con Y-27632) cultivadas en celulas OP9 durante 12 dfas. Los nucleos se tineron con DAPI (azul). Barra, 5 jm. (k) Inmunotincion de Hnf3p y E-cadherina en una lamina epitelial derivada de celulas hES en el dfa 6. Barra, 5 jm. (I - n) Formacion de teratoma (100%, n = 20) a partir de celulas hES mantenidas a baja densidad en presencia de Y-27632 (30 pasajes). Barras, 1 cm. Las celulas se inyectaron bilateralmente en los testfculos de raton SCID (I). Despues de 9 semanas, los teratomas conteman una mezcla de tejidos bien diferenciados que inclrnan cartflagos macroscopicos (flechas blancas; m, n) y epitelio pigmentario (flecha negra; n).
Figura 2 - Y-27632 potencia directamente la eficacia de clonacion de las celulas hES (KhES-1). (a, b) Cultivo libre de celulas alimentadoras, de celulas hES en placas recubiertas de matrigel en medio acondicionado MEF. Barras, 500 jm. La formacion de colonias de celulas hES disociadas se vio claramente mejorada por Y-27632 (b; recuadro, una vista con muchos aumentos de una colonia tfpica, barra, 100 jm) mientras que pocas colonias se formaron en su ausencia (a; < 0,2% y 10,2 ± 1,2% sin y con Y-27632, respectivamente, P < 0,001, n = 3). (c, d) Cultivo de una celula individual hES en MEF en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en presencia de Y-27632 10 jM durante siete dfas. (c) Porcentajes de la presencia de una colonia ALP+ (d) en cada pocillo (**, P < 0,01 frente a control, n = 3 estudios). Control, celulas no tratadas. Barra, 100 jm. (e, f) Formacion de colonias resistentes a la higromicina a partir de celulas hES tratadas con Y-27632 en cultivo de disociacion de baja densidad en MEF 12 dfas despues de la transfeccion. Barras, 100 jm. (e) Vista de contraste de fase. (f) Expresion de Venus-GFP. (g) Curva de crecimiento de celulas hES cultivadas en MEF con diferentes cursos de tiempo de tratamiento con Y-27632. Grupo 1 (azul), tratamiento con Y- 27632 solamente durante las primeras 12 horas (con pretratamiento de una hora); Grupo 2 (rojo), tratamiento continuo con Y-27632 durante todo el penodo de cultivo; No Y-27632, ningun tratamiento en absoluto con Y-27632 (purpura). Para cada condicion, se sembraron en placas 5 x 104 celulas disociadas/pocillo (placa de 6 pocillos) en MEF. **, P < 0,01, Grupo 2 frente a Grupo 1 (n = 3 estudios). (h) Porcentajes de celulas Ki67+ (mitoticas) en celulas hES Nanog+ en los grupos 1 (azul) y 2 (rojo) en los dfas 3 y 5. (i - n) Analisis de citometna de flujo de las poblaciones espedficas de la fase del ciclo celular. (i, j, I, m) Patrones de citometna de flujo. Eje X, contenido de ADN mostrado por union de 7-AAD; Eje Y, captacion de BrdU despues de una exposicion de una hora. (k, n) Porcentajes relativos de poblaciones espedficas de fase entre las celulas hES en los Grupos 1 (azul) y 2 (rojo). (i - k) dfa 3. (I - n) dfa 5. *, P < 0,05; **, P < 0,01, Grupo 2 frente a Grupo 1 (n = 3 estudios). El grado de aumento en el crecimiento celular no es muy grande y no puede explicar el fuerte aumento de la eficiencia de clonacion (1% frente a 27%).
Figura 3 - El inhibidor de ROCK previene la apoptosis y promueve la supervivencia de celulas hES disociadas (KhES- 1) en cultivo en suspension. (a - c) ensayo TUNEL. Las celulas hES disociadas se cultivaron en suspension durante dos dfas en ausencia (a) o en presencia (b) de Y-27632 10 jM. Las celulas TUNEL+ fueron analizadas por FACS. (c) Efectos de Y-27632, inhibidor de caspasa I (Z-VAD-fmk) y un coctel de neurotrofina (BDNF+ NT-3 y -4) en porcentajes
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de celulas apoptoticas (**, P < 0,01; ***, P < 0,001, entre cada par, n = 3 estudios). (d - f) Efectos de soporte de Y- 27432 sobre la supervivencia/crecimiento de celulas hES en cultivo en suspension. (d) Numero de celulas dos, cuatro y seis d^as despues de cultivar 2 x 105 celulas hES disociadas en placas de 35 mm (n = 3). El dfa 6, se observo la formacion eficaz de agregados celulares con las celulas ES tratadas con Y-27632 (f), pero no con las celulas control (e). Barras, 300 pm. (g) Analisis a lo largo del tiempo de la expresion de Pax6 (verde), Oct3/4 (rojo) y E-cadherina (azul) en celulas hES cultivadas en SFEB-h. (h) Esquema del protocolo de cultivo. (i) Inmunotincion de celulas neurales derivadas de celulas hES inducidas en cultivo de SFEB-h. Bfl (rojo), TuJ1 (verde), DAPI (azul). Barra, 50 pm. Se ha de observar que algunas celulas Bfl + fueron positivas para el marcador neuronal TuJ1. (j - n) Analisis de inmunotincion de celulas neurales inducidas por SFEB-h. Barras, 25 pm. (j) Porcentajes de celulas telencefalicas Bfl+ que fueron positivas para Pax6 y Nkx2.1 (**, P < 0,01 frente a control, n = 3). Inmunocitoqmmica de celulas neurales inducidas por SFEB-h cultivadas sin (k, l) o con (m, n) Shh (30 nM). Bfl (verde; k - n), Pax6 (rojo; k, m) y Nkx2.1 (rojo; l, n).
Figura 4 - Analisis de celulas hES cultivadas en presencia de Y-27632 a baja densidad. (a - c) Inmunotincion de E- cadherina (a), Oct3/ 4 (b) y SSEA-4 (c) en celulas hES tratadas con Y-27632 (KhES-1) despues de pases extendidos (30 veces) a baja densidad con tratamiento de Y-27632. Los paneles inferiores muestran tincion DAPI (azul). (d - g) Analisis histologico (tincion con hematoxilina-eosina, seccion de parafina 5 pM) de tejidos de teratoma formados despues de inyeccion subcapsular de celulas hES (KhES-1) despues de pases extendidos con Y-27632 en testfculos de raton SCID. (d) Cartflago, (e) neuroepitelio, (f) epitelio pigmentado y (g) mucosa tipo intestinal con epitelio columnar. (h, i) Despues de los pases extendidos que implican cultivo de baja densidad con el tratamiento Y-27632, la formacion eficaz de colonias de celulas hES disociadas (32,5 ± 1,7%; KhES-1) se mantuvo dependiente de Y-27632 (i) y se observaron pocas colonias sin ella (h). (j) Relacion dosis-respuesta de dos inhibidores de ROCK selectivos (Y-27632, Fasudil; la eficacia de clonacion fue de 1,3 ± 0,8% y 25,1 ± 1,6% sin y con Fasudil 10 pM; P < 0,001, n = 3) y dos inhibidores de quinasa no relacionados (cAMP-Rp, LY294002) en la formacion de colonias (KhES-1). Eje Y, relaciones de actividad de promocion de la formacion de colonias con Y-27632 10 pM. (k) Mejora de la formacion de colonias mediante Y-27632 a diferentes densidades de placa de celulas hES. ***, P < 0,001 frente a control (sin tratamiento), n = 5. (l) Analisis de bandas G (a niveles de 300-500 bandas) de celulas hES (KhES-3) que muestra un cariotipo normal (100%, n = 5) despues de pases de mantenimiento extendidos con tratamiento de Y-27632 durante tres meses.
Figura 5 - Diferenciacion neural de celulas hES (KhES-1) en cultivo en suspension que implica disociacion/ reagregacion en presencia de Y-27632. (a) Efectos de inhibidores de Nodal (5 pg /ml Lefty, carril 2), Wnt (500 ng/ml Dkk1, carril 3) y BMP (1,5 pg/ml BMPR1A-Fc, carril 4) sobre diferenciacion de celulas hES en progenitores neurales Pax6+. Carril 5, combinacion de los tres factores (*, P < 0,05; **, P < 0,01 frente a control; n = 3 estudios). (b, c) Inmunotincion de agregados SFEB de celulas hES (dfa 24) cultivadas con Y-27632 (dfas 0 - 6) y los tres inhibidores (dfas 0 - 24; SFEB-h). (b) Pax6 (verde) y E-cadherina (rojo). (c) Nestina (verde) y Oct3/4 (rojo).
Ejemplos.
Ejemplo de referencia 1: Mejora en la eficacia de clonacion de celulas madre embrionarias humanas por el inhibidor de ROCK Y-27632.
(Metodo)
Las celulas madre embrionarias humanas utilizadas para los experimentos descritos en el presente texto fueron celulas madre embrionarias (KhES-1, KhES-2 y KhES-3) de blastocistos humanos establecidos en el laboratorio de Norio Nakatsuji, en el Institute for Frontier Medical Sciences, Universidad de Kyoto, que se distribuyeron y utilizaron (principalmente KhES-1) siguiendo las directrices de celulas madre embrionarias humanas del gobierno japones. De acuerdo con el metodo del laboratorio Nakatsuji (Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 345, 926 - 32 (2006)), se cultivaron celulas madre embrionarias humanas indiferenciadas en un disco de cultivo de plastico con fibroblastos embrionarios de raton (inactivados con mitomicina, MEF) sembradas como una capa de celulas alimentadoras. Mas espedficamente, se uso el medio de cultivo que contiene KSR (Invitrogen/Gibco-BRL) en la concentracion final de 20%, 1 X NEAA (aminoacidos no esenciales, Invitrogen/Gibco BRL), acido L-glutammico 2 mM y 2-mercaptoetanol 0,1 mM en D-MEM F12 (Sigma D6421), y el cultivo se realizo a 37 °C, 5% de CO2. El pasaje se realizo cada tres o cuatro dfas, y las celulas madre embrionarias se separaron de la capa alimentadora usando el lfquido de disociacion (que contiene 0,25% de tripsina, 1 mg/ml de solucion de colagenasa IV, CaCl2 1 mM en una solucion salina tamponada con fosfato; todo ello de Invitrogen/Gibco-BRL), seguido de disociacion en racimos pequenos de celulas (de aproximadamente 50 - 100 celulas) pipeteando, y luego se sembro en la capa alimentadora que se habfa formado a partir de MEF de siembra el dfa anterior.
El efecto inhibidor de la muerte celular y la influencia sobre la eficacia de clonacion, del inhibidor de ROCK, para el cultivo de celulas madre embrionarias humanas despues de la disociacion a celulas individuales, se examinaron de la manera siguiente. Las celulas madre embrionarias humanas cultivadas anteriormente se desprendieron de la capa de alimentacion como racimos pequenos de celulas, y despues se adhirieron celulas alimentadoras contaminantes al fondo de una placa de cultivo adhesiva celular (recubierta con gelatina al 0,1%) para su eliminacion, mediante incubacion en el cultivo de mantenimiento medio a 37 °C durante una hora, en donde los racimos de celulas madre embrionarias no se adhieren fuertemente a la placa mientras que las celulas alimentadoras contaminantes se adhieren fuertemente. Los racimos de celulas madre embrionarias se disociaron a celulas individuales por digestion con tripsina (0,25% tripsina - EDTA, a 37 °C durante 5 minutos), y se sembraron en una capa alimentadora MEF en placas de
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cultivo de 96 pocillos a baja densidad (500 celulas/0,32 cm2 en 0,15 ml de medio). El numero de colonias formadas se conto seis dfas despues del cultivo en el medio de cultivo de mantenimiento. Se anadio el inhibidor de ROCK Y-27632 a la concentracion de 10 pM una hora antes de separar las celulas de la capa alimentadora, y se anadio la misma cantidad al cultivo en la misma cantidad despues de la separacion.
Tambien, para evaluar si la promocion de clonacion sena causada por el factor autocrino de la celula madre embrionaria humana, se realizo un experimento similar en placas de cultivo de 96 pocillos a densidad clonal (una celula por pocillo) de celulas madre embrionarias humanas, y se determino la eficacia de la clonacion.
(Resultado)
Despues de seis dfas de cultivo, las eficiencias de clonacion (relaciones del numero de colonias formadas con el numero inicial de celulas madre embrionarias humanas sembradas) fueron 1% y 27% sin y con el inhibidor de ROCK, respectivamente. Las celulas en colonias formadas por el tratamiento con el inhibidor de ROCK expresaron fosfatasa alcalina y Oct3/4, que son marcadores de celulas madre embrionarias no diferenciadas. El efecto superior del inhibidor de ROCK para la eficiencia de la clonacion fue confirmado no solo en KhES-1 sino tambien en KhES-2 y KhES-3 como celulas madre embrionarias humanas.
Tambien, usando placas de 96 pocillos a densidad clonal (una celula por pocillo) de celulas madre embrionarias humanas, las eficiencias de clonacion fueron inferiores al 1% y al 25% sin y con el inhibidor ROCK, respectivamente. Por lo tanto, se considero que el efecto superior del inhibidor de ROCK para la eficacia de la clonacion no se debfa a un factor autocrino de celulas madre embrionarias humanas.
En consecuencia, se encontro que el inhibidor de ROCK Y-27632 mejoro significativamente la tasa de supervivencia de las celulas madre embrionarias humanas.
Referencia.
Ejemplo 2: Activacion de Rho en celulas madre embrionarias humanas disociadas.
(Metodo)
El cultivo de mantenimiento de celulas embrionarias humanas se realizo por pasajes de racimos pequenos de celulas como se describe en el Ejemplo 1.
Como se describe en el Ejemplo 1, las celulas madre embrionarias humanas se disociaron a celulas individuales mediante digestion con tripsina, se suspendieron en el medio de cultivo para cultivo de mantenimiento, y se incubaron a 37 °C. Las celulas se recogieron por centrifugacion despues de 0 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, y 120 minutos de la incubacion, y posteriormente se trataron con el kit de activacion de GTPasa pequeno (Cytoskeleton Company, Denver, CO) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se analizaron por el metodo Pull down”. La activacion de Rho se juzgo sobre la base de aumentos en la relacion de Rho activado (Rho asociado a GTP) a Rho total por transferencia Western. Se preparo una muestra de celulas a partir de una placa de cultivo de 10 cm (aproximadamente 1 x 106 celulas) como un lote.
(Resultado)
Se observo una notable activacion de Rho 15 - 30 minutos despues de la disociacion/incubacion de celulas madre embrionarias humanas.
La activacion de Rho disminuyo lentamente a lo largo de 30 minutos.
Por consiguiente, los resultados indican que el efecto superior de Y-27632 en las celulas madre embrionarias humanas fue debido a la inhibicion de la activacion de Rho, que fue causada por la accion de inhibicion de ROCK de Y-27632.
Referencia
Ejemplo 3: La eficiencia de formacion de colonias de celulas madre embrionarias humanas en el cultivo de mantenimiento por diferentes inhibidores de quinasa.
(Metodo)
Los efectos de otros inhibidores de ROCK sobre la eficacia de clonacion de celulas madre embrionarias humanas en cultivo de mantenimiento se evaluo usando metodos como se describen en el ejemplo 1. Se usaron los inhibidores de ROCK, Fasudil/HA1077 (10 pM) y H-1152 (200 nM). Tambien se usaron inhibidores para otras quinasas como referencia. Los inhibidores para otras quinasas utilizados fueron: cAMP-Rp (1 - 100 pM) y KT5720 (5 - 500 nM), que son inhibidores de la protema quinasa A; bisindolilmaleimida (0,01 - 5 pM) y estaurosporina (1 - 50 nM), que son inhibidores de la protema quinasa C; PD98059 (0,5 - 50 pM), que es un inhibidor de mApK; lY294002 (1 - 50 pM), que es un inhibidor de PI3K; y ML-7 (0,3 - 30 pM), que es un inhibidor de MLCK.
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(Resultado)
En los casos de inhibidores de ROCK (Fasudil/HA1077 y H-1152), se observaron eficiencias de clonacion significativamente mejoradas en comparacion con la ausencia de los inhibidores, si bien en los casos de inhibidores para otras quinasas no se observo mejora.
Por consiguiente, se encontro que el inhibidor de ROCK podna mejorar espedficamente la tasa de supervivencia de celulas madre embrionarias humanas.
Referencia
Ejemplo 4: Supresion de la apoptosis por el inhibidor de ROCK en cultivo en suspension de celulas ES humanas disociadas/reagregadas.
(Metodo)
Las celulas ES humanas sometidas a cultivo de mantenimiento se desprendieron como pequenos racimos de las celulas alimentadoras (agregados) de la misma manera que en el Ejemplo 1 y, despues de la eliminacion de las celulas alimentadoras residuales, se disociaron en celulas individuales por digestion con tripsina. Despues de la centrifugacion, se disociaron 2 x 105 celulas en medio de cultivo libre de suero para la induccion posterior a la diferenciacion (Watanabe et al., Nature Neuroscience 8, 288 - 296, 2005; suplementado con G-MEM, KSR y 2- mercaptoetanol, se anadio KSR a una concentracion del 20%). Las celulas ES humanas disociadas individualmente (1,0 x 105 celulas/ml) se cultivaron en suspension en una placa de cultivo de 35 mm no adhesiva celular para formar agregados, y se cultivaron en el mismo medio de cultivo durante 2 - 6 dfas (metodo SFEB; vease la referencia anterior de Watanabe et al.). Despues de un cultivo de 2 dfas, el porcentaje de celulas apoptoticas se midio mediante el metodo TUNEL (MEBSTAIN Apoptosis kit Direct, MBL). El tratamiento con el inhibidor de ROCK, Y-27632, se inicio 1 hora antes de la separacion de celulas de la misma manera que en el Ejemplo 1, y el inhibidor se anadio al medio de cultivo de mantenimiento tambien despues de la disociacion. Como comparacion, se usaron inhibidores de caspasa (ZVAD; 10 |jM) y BDNF/NT-3/NT-4 (mezcla de 50 ng/ml cada uno), cuyo efecto supresor de la apoptosis ha sido publicado, para llevar a cabo el experimento. Ademas, se conto en cada caso el numero de celulas supervivientes el dfa 6.
(Resultado)
En el control no suplementado, despues de un cultivo de 2 dfas, se observo apoptosis en el 80% de las celulas mediante el metodo TUNEL. En celulas tratadas con inhibidor de ROCK, solo el 9% de las celulas eran TUNEL- positivas. Por otra parte, la suplementacion del inhibidor de caspasa (ZVAD; 10 jM) y BDNF/NT-3/NT-4 (50 ng/ml cada uno) dio como resultado 72% y 69% de celulas positivas para TUNEL, respectivamente. Estos resultados indican una intensa actividad supresora de la muerte celular del inhibidor de ROCK. En consecuencia, en cuanto al numero de celulas supervivientes en el dfa 6, el 8% sobrevivio en el grupo no suplementado al comienzo del cultivo de disociacion, mientras que el 70% sobrevivio en el grupo tratado con el inhibidor de ROCK; sobrevivieron mas celulas. Las celulas supervivientes, tratadas con inhibidor de caspasa o bien con BDNF/NT-3/NT-4, justificaron menos del 10% de las celulas cultivadas en placa. Como se describio anteriormente, se demostro que el inhibidor de ROCK mejoro notablemente la tasa de supervivencia de las celulas ES humanas.
Referencia
Ejemplo 5: Induccion de la diferenciacion en celulas precursoras neuronales y celulas precursoras cerebrales mediante el metodo SFEB usando celulas ES humanas disociadas individualmente.
(Metodo)
Las celulas ES humanas sometidas a cultivo de mantenimiento se separaron de las celulas alimentadoras como racimos pequenos de celulas de la misma manera que en el Ejemplo 4 y, despues de la eliminacion de las celulas alimentadoras residuales, se disociaron en celulas individuales mediante digestion con tripsina. Despues de la centrifugacion, las celulas se disociaron en medio de cultivo para la induccion de la diferenciacion a 2 x 105 celulas/mL, y se cultivaron en suspension usando una placa de cultivo no adherente de celulas para realizar un cultivo libre de suero (metodo SFEB) de agregados suspendidos. Ademas, el inhibidor nodal LeftyA (1 mg/ml, R & D), el inhibidor Wnt Dkk1 (500 ng/ml, R & D) y el inhibidor bMp BMPR1A-Fc (1,5 jg/ml, R & D) se anadieron durante los primeros 10 dfas despues del inicio del cultivo para la induccion de la diferenciacion. Despues de un cultivo en suspension libre de suero durante 16-35 dfas, los agregados celulares se fijaron y se sometieron a inmunotincion por el metodo del anticuerpo de fluorescencia. El tratamiento con el inhibidor de ROCK, Y-27632, se inicio 1 hora antes de la separacion celular de la misma manera que en el Ejemplo 1, y el inhibidor se anadio al medio de cultivo de mantenimiento durante los primeros seis dfas tambien despues de la disociacion.
Para la diferenciacion en celulas precursoras cerebrales, en el dfa 25 del cultivo SFEB se transfirieron agregados de celulas flotantes a un portaobjetos de cultivo revestido con poli-D-lisina/laminina/fibronectina, y se cultivaron en un estado de adhesion durante 10 dfas mas. En el cultivo de adhesion, se uso medio neurobasal como medio de cultivo, suplementado con B27 (libre de vitamina A) y L-glutamina 2 mM (ambos suministrados por Gibco-BRL).
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(Resultado)
El dfa 20 despues del inicio del cultivo de diferenciacion, en casi todos los agregados celulares tratados con el inhibidor de ROCK se expresaron celulas positivas para los marcadores celulares precursores neuronales, nestina y Pax6. El d^a 24 del cultivo de diferenciacion, el numero de estas celulas positivas aumento, y aproximadamente el 80% de las celulas se convirtieron en celulas positivas para Pax6. Por otro lado, el marcador de celulas ES en estado no diferenciado, las celulas positivas para Oct3/4 justificaron menos del 10%. En el dfa 35 del cultivo de diferenciacion, habfa muchos marcadores precursores cerebrales, celulas Bf1 positivas en aproximadamente el 60% de agregados celulares. Esto indica que las celulas ES humanas generan tejidos nerviosos cerebrales. Sin tratamiento inhibidor de ROCK, hubo pocas celulas supervivientes en el dfa 7 de cultivo de diferenciacion.
En celulas no tratadas con el inhibidor de ROCK, pocas sobrevivieron durante 7 dfas o mas, y no se observo una formacion significativa de agregados de celulas flotantes.
Asf, se encontro que el inhibidor de ROCK no alteraba la potencia de diferenciacion de las celulas ES humanas, y las celulas humanas tratadas con el inhibidor de ROCK podfan diferenciarse de manera muy eficiente.
Referencia
Ejemplo 6: Cultivo de celulas ES humanas disociadas individualmente mediante cultivo libre de alimentadoras suplementado con el inhibidor de ROCK.
(Metodo)
Para demostrar si el tratamiento con inhibidor de ROCK permite el cultivo de disociacion unica de celulas ES humanas tambien mediante cultivo libre de alimentador sin usar celulas alimentadoras tales como fibroblastos embrionarios de raton (MEF), se cultivaron celulas ES humanas sobre una matriz extracelular preparada con MEF segun el metodo conocido por la bibliograffa (Xu C-H et al., Nature Biotechnol., 19, 971 - 974 (2001)). Espedficamente, de acuerdo con la bibliograffa anterior, las celulas MEF cultivadas hasta confluencia se lisaron en un plato de cultivo mediante un metodo de desoxicolato para dejar solo la matriz extracelular. Celulas ES humanas disociadas individualmente (500 celulas/pocillo de una placa de 96 pocillos) se sembraron sobre ellas bajo tratamiento con Y-2763 (10 jM o 0 jM) por el mismo metodo que para el cultivo de rutina en celulas MEF (Ejemplo anteriormente mencionado). El medio condicionado, en el cual el medio de mantenimiento de celulas ES humanas y el MEF se cultivaron preliminarmente durante un dfa, se uso como medio de cultivo. Se conto el numero de colonias de celulas ES humanas formadas 5 dfas despues.
(Resultado)
Se observo una alta eficacia de clonacion (10,2%) por celula ES humana sembrada en el grupo tratado con Y-27632. Por otra parte, la eficacia de clonacion en el grupo no tratado con Y-27632 fue inferior al 0,2%. Las colonias formadas en el grupo tratado con Y-27632 fueron fuertemente positivas para el marcador de estado no diferenciado, fosfatasa alcalina. Estos hallazgos indican que el inhibidor de ROCK tuvo efecto no en las celulas alimentadoras sino directamente en las celulas ES humanas, para promover la formacion de colonias. Ademas, incluso sin utilizar el cocultivo con celulas alimentadoras, se demostro que el inhibidor de ROCK permitfa el cultivo de disociacion simple de celulas ES humanas cuando se cultivaban en una matriz extracelular adecuadamente preparada en presencia de factores lfquidos (por ejemplo, factores contenidos en el medio acondicionado).
Referencia.
Ejemplo 7: cultivo de mantenimiento de celulas ES humanas disociadas individualmente mediante tratamiento con inhibidor de ROCK a corto plazo.
(Metodo)
En cuanto al cultivo de mantenimiento de celulas ES humanas disociadas individualmente, para examinar si Y-27632 promueve la supervivencia de las celulas en la fase temprana del cultivo de disociacion, el tiempo de tratamiento con Y-27632 se dividio en los tres grupos que siguen para comparar efectos de promocion de supervivencia celular en el cultivo de mantenimiento.
Grupo 1: el tratamiento con Y-27632 (10 jM, el mismo a continuacion) se realizo como un pretratamiento de una hora y solo durante las primeras 12 horas de cultivo despues de la disociacion en el proceso de cultivo de disociacion de las celulas ES humanas.
Grupo 2: el tratamiento con Y-27632 se realizo como un pretratamiento de 1 hora y durante el penodo completo de cultivo despues de la disociacion en el proceso de cultivo de disociacion de celulas ES humanas.
Grupo 3: no se realizo tratamiento con Y-27632.
En estos grupos, las celulas supervivientes el dfa 3 por celulas sembradas (5 x 104 celulas por pocillo de una placa de
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6 pocillos) se contaron en el sistema de cultivo de mantenimiento en la capa MEF.
(Resultado)
En el Grupo 3 no tratado con Y-27632, no mas del 1% de las celulas sembradas en total sobrevivieron en el dfa 3. En el Grupo 1 tratado con Y-27632 durante 12 horas despues de la disociacion, se contaron el 270% de las celulas sembradas; en el Grupo 2 tratado con Y-27632 continuamente, se contaron el 290% de las celulas sembradas. Estos resultados indican que el tratamiento con Y-27632 tiene un efecto de promocion suficientemente elevado en el primer medio dfa despues del comienzo del cultivo de disociacion en cultivo de mantenimiento de celulas ES humanas mediante cultivo de adhesion.
Referencia.
Ejemplo 8: Actividad promotora del crecimiento celular mediante el tratamiento inhibidor de ROCK en cultivo de mantenimiento de celulas ES humanas.
(Metodo)
En el mismo experimento que en el Ejemplo 7 anterior, se examino el efecto de Y-27632 sobre el crecimiento celular durante 6 dfas despues del comienzo del cultivo de disociacion en los Grupos 1 y 2 prolongando el periodo de cultivo a 6 dfas.
(Resultado)
El numero de celulas en el dfa 6 aumento a un 670% y un 860% del numero de celulas sembradas inicialmente en los Grupos 1 y 2, respectivamente. El tiempo de duplicacion de la poblacion, basado en el numero de celulas durante los dfas 2 a 6 despues del comienzo del cultivo de disociacion, fue 49,0 horas para el Grupo 1 y 41,5 horas para el Grupo 2; el tiempo de duplicacion se acorto a la mitad para el Grupo 2. En ambos Grupos 1 y 2, el porcentaje de apoptosis (el porcentaje de celulas activas Caspasa 3-positivas) en los dfas 3 y 5 fue menos del 1% de las celulas totales. Estos resultados indican que, ademas de la actividad de soporte de la supervivencia celular inmediatamente despues del comienzo del cultivo de disociacion, Y-27632 tiene actividad promotora del crecimiento celular en las celulas de supervivencia a partir de ahT
Asf pues, las celulas madre se cultivan en presencia de un inhibidor de ROCK y la invencion proporciona metodos de cultivo y medios para los mismos.
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Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para cultivar celulas madre pluripotentes humanas, que comprende tratar las celulas madre con un inhibidor de ROCK (Rho-quinasa).
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que las celulas madre estan disociadas.
    5 3. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que las celulas madre son celulas madre individuales o celulas madre
    agregadas.
  3. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas madre se cultivan en cultivo adherente o en cultivo en suspension.
  4. 5. Un metodo para producir una celula diferenciada a partir de una celula madre que tiene una tasa de supervivencia 10 y/o una potencia de proliferacion mejoradas, o una celula madre que tiene una eficacia de diferenciacion mejorada,
    comprendiendo dicho metodo cultivar una celula madre pluripotente humana en presencia de un inhibidor de ROCK.
  5. 6. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el inhibidor de ROCK es Y-27632, Fasudil o H-1152.
  6. 7. Un preparado celular que comprende una celula madre pluripotente humana y un inhibidor de ROCK.
    15 8. Un preparado celular segun la reivindicacion 7, en el que la celula madre esta disociada.
  7. 9. Un preparado celular segun la reivindicacion 7 u 8, en el que el inhibidor de ROCK es Y-27632, Fasudil o H-1152.
  8. 10. Uso de un inhibidor de ROCK (i) para promover y/o mejorar la eficacia de clonacion o la eficacia del pasaje en un cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, (ii) para promover y/o mejorar la formacion de colonias en un cultivo de celulas madre pluripotentes humanas, y/o iii) para promover y/o mejorar la supervivencia de celulas madre
    20 pluripotentes humanas en un cultivo.
  9. 11. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el inhibidor de ROCK es Y-27632, Fasudil o H-1152.
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