MX2011004563A - Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreatico. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madres pluripotentes. Particularmente, la presente invención proporciona un método para incrementar la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático con el uso de agonista receptor TEF_beta tal como la activina A, activina B, activina C, GDF_8, GDF_11 o GDF_15.

Description

DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS AL LINAJE ENDROCRINO PANCREÁTICO La presente invención reivindica la prioridad de la solicitud con número de serie 61/110,278, presentada el 31 de octubre de 2008.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madres pluripotentes. Particularmente, la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus Tipo I y la escasez de islotes de Langerhans para transplantes, han concentrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células ß, adecuadas para la funcionalidad del injerto. Un método es la generación de células funcionales ß a partir de células madre pluripotentes, tales como, por ejemplo, las células madre embrionarias.

En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotencial da origen a un grupo de células que comprenden tres capas de gérmenes (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación de endodermo definitivo. Las células de endodermo definitivo expresan un número de marcadores, tales como, HNF-3beta, GATA4, Mixll , CXCR4 y Sox-17.

La formación del páncreas se origina a partir de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen de la homeosecuencia pancreático-duodenal, PDX1. En ausencia de PDX1 , el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de las yemas ventral y dorsal. Por lo tanto, la expresión de Pdx1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino Los tejidos endocrino y exocrino se originan a partir de la diferenciación de endodermo pancreático.

Las células que tienen las características de células de islotes se ha informado que se derivan de células embrionarias de ratón. Por ejemplo, Lumelsky y otros (Science 292:1389, 2001) informan la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en estructuras que secretan insulina similares a islotes pancreáticos. Soria y otros (Diabetes 49:157, 2000) informan que las células que secretan insulina derivadas a partir de células madre embrionarias de ratón normalizan la glicemia en ratones diabéticos inducidos con estreptozotocina.

En un ejemplo, Hori y otros (PNAS 99: 16105, 2002) describen que el tratamiento de células madre embrionarias de ratón con inhibidores de fosfoinositido 3-quinasa (LY294002) produjo células que se asemejaban a las células ß.

En otro ejemplo, Blyszczuk y otros (PNAS 100:998, 2003) informa la generación de células que producen insulina a partir de células madre embrionarias de ratón que expresan constitutivamente Pax4.

Micallef y otros informan que el ácido retinoico puede regular el compromiso de las células madre embrionarias para formar endodermo pancreático positivo para Pdx1. El ácido retinoico es más efectivo para inducir la expresión de Pdx1 cuando se agrega a cultivos en el día 4 de diferenciación de células madre embrionarias, durante un período correspondiente a la finalización de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54:301 , 2005).

Miyazaki y otros informan una línea de células madre embrionarias de ratón que sobre expresan Pdx1. Sus resultados muestran que la expresión exógena de Pdx1 mejoró evidentemente la expresión de genes de insulina, somatostatina, glucoquinasa, neurogenina 3, p48, Pax6 y HNF6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).

Skoudy y otros informan que la activina A (un miembro de la superfamilia TGF-ß) regula el alza de la expresión de los genes exocrinos del páncreas (p48 y amilasa) y los genes del sistema endocrino (Pdx1 , insulina, y glucagon) células madre embrionarias de ratón. El efecto máximo se observó con el uso de activina A 1nM. También observaron que el nivel de expresión de insulina y Pdx1 ARNm no se vio afectado por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con FGF7 3nM produjo una aumento en el nivel de transcripción para Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).

Shiraki y otros estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que mejoran específicamente la diferenciación de células madre embrionarias en células positivas para Pdx1. Observaron que el TGF-P2 produjo, reproduciblemente, una proporción más alta de células positivas Pdx1 (Genes Cells. junio de 2005; 10(6): 503-16.).

Gordon y otros demostraron la inducción de BrachyuryVHNF-3beta+ en células endodérmicas a partir de células madre embrionarias de ratón en ausencia de suero y en presencia de activina junto con un inhibidor de la señalización de Wnt (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0003446A1).

Gordon y otros (PNAS, Vol. 103, página 16806, 2006) dicen: "Se requirió la señalización simultánea de Wnt y TGF-beta/ nodal/ activina para la generación de la estría primitiva anterior".

Sin embargo, el modelo de ratón de desarrollo de células madre embrionarias puede no imitar exactamente el programa de desarrollo en los mamíferos superiores, tales como, por ejemplo, los humanos.

Thomson y otros aislaron células madre embrionarias de blastocitos humanos (Science 282:114, 1998). De forma coincidente, Gearhart y otros derivaron líneas de células embrionarias germinativas humanas (hEG) a partir de tejido gonadal fetal (Shamblott y oíros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 95:13726, 1998). A diferencia de las células madre embrionarias de ratón, que se puede evitar que se diferencien simplemente cultivándolas con el factor de inhibición de leucemia (LIF), las células madre embrionarias humanas deben mantenerse en condiciones muy especiales (patente de los Estados Unidos núms. 6.200.806; WO 99/20741 ; WO 01/51616).

D'Amour y otros describen la producción de cultivos enriquecidos del endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y baja de suero (Nature Biotechnology 2005). Transplantar esas células debajo de la cápsula del hígado de ratones produjo la diferenciación en células más maduras con características de algunos órganos endodérmicos. Las células de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas pueden, además, diferenciarse en células positivas al Pdx1 después de la adición de FGF-10 (patente de los Estados Unidos núm. US 2005/0266554A1).

D'Amour y oíros (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)) afirman: "Hemos desarrollado un proceso de diferenciación que convierte las células madre embrionarias humanas (hES) en células endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreáticas: insulina, glucagon, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina. Este proceso imita la organogénesis pancreática "in vivo" al dirigir las células a través de etapas que se asemejan al endodermo definitivo, endodermo del tubo digestivo, endodermo pancreático y precursor endocrino hacia las células que expresan hormonas endocrinas." En otro ejemplo, Fisk y otros informan un sistema para producir células de islotes de pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0040387A1). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron primero hacía el endodermo por medio del uso de una combinación de butirato de sodio y activina A. Después, las células se cultivaron con antagonistas del TGF-ß, tales como nogina, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal se indujo mediante nicotinamida.

En un ejemplo, Benvenistry y otros dicen: "Concluimos que la sobreexpresión de Pdx1 mejoró la expresión de genes pancreáticos enriquecidos, la inducción de la expresión de insulina puede requerir señales adicionales que sólo están presentes in vivo" (Benvenistry y otros, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).

Por lo tanto, aún existe una significativa necesidad de desarrollar condiciones para establecer líneas de células madre pluripotentes que se pueden expandir para responder a las necesidades clínicas actuales, mientras que mantienen el potencial de diferenciarse en células endocrinas pancreáticas, células que expresan la hormona pancreática, o células secretoras de hormona pancreática. Hemos seguido un enfoque alternativo para mejorar la eficiencia en diferenciar células madre embrionarias humanas frente a células endocrinas pancreáticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención proporciona un método para diferenciar células madre pluripotentes; el método comprende los pasos de: a. el cultivo de células madres pluripotentes, b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; c. Diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático; y d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino.

En una modalidad la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático, el método comprende tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con un medio que comprende una cantidad suficiente de un agonista del receptor TGF-ß para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una descripción del protocolo de diferenciación empleado en la presente invención.

Las Figuras 2A y 2B muestran la expresión de marcadores asociados con las diferentes etapas del protocolo de diferenciación empleado en la presente invención. La figura 2A muestra la expresión de CXCR4 como se determina por FACS en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se diferenciaron de la etapa 1. La figura 2B muestra la expresión de marcadores asociados con la etapa 1 , como se determina por PCR en tiempo real en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se diferenciaron de la etapa 1.

Las Figuras 3A-3C muestran tinción con ditizona de las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se diferenciaron a la etapa 6 del protocolo de diferenciación empleado en la presente invención y posteriormente tratadas con activina A (etapa 7). La figura 3A muestra una fase de contraste de células teñidas con ditizona antes de pasar por un colador de células 40 pm. La figura 3B muestra una fase de contraste de células teñidas con ditizona que pudieron pasar por un colador de células 40 pm. La figura 3C muestra una fase de contraste de células teñidas con ditizona que no pudieron pasar por un colador de células 40 pm.

Las Figuras 4A-4F muestran la expresión de pdx-1 (figura 4A), nkx6-1 (figura 4B), Pax4 (figura 4C), nkx2.2 (figura 4D), insulina (figura 4E) y glucagon (figura 4F) según se determinó por PCR en tiempo real, en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 que se diferenciaron a la etapa 6 del protocolo de diferenciación empleado en la presente invención y tratadas con activina A seguido de la diferenciación a la etapa 6, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.

Las células madre, según su potencial de desarrollo, se clasifican en: (1) totipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, que se refiere a la capacidad de originar todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un subgrupo de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico en particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotenciales restringidos a glóbulos rojos y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un subgrupo más restringido de linajes celulares que las células madre multipotenciales; y (5) unipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

La diferenciación es un proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto en donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.

"El linaje celular ß" se refiere a células con expresión de los genes positivos para el factor de transcripción. PDX-1 y por lo menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1 , NeuroD, Isl-1 , HNF-3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. Las células que expresan marcadores característicos del linaje de células ß incluyen células ß.

"Células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo", o "células de la etapa 1", o "etapa 1", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: SOX- 7, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, braquiuria, proteína de homosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, o OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen células precursoras de la línea primitiva, células de la línea primitiva, células mesendodérmicas y células endodérmicas definitivas.

"Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX- , HNF-1beta, PTF-1 alfa, HNF-6, o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen células del endodermo pancreático, células del tubo intestinal primitivo y células del intestino posterior.

"Células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático", o "células de la etapa 5", o "etapa 5", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: NGN-3, NeuroD, lslet-1 , PDX-1 , NKX6.1 , Pax-4, NGn-3, o PTF-1 alfa. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen las células endocrinas pancreáticas, células que expresan hormonas pancreáticas, células secretoras de hormonas pancreáticas y células del linaje de células ß.

"Endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que portan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: beta HNF-3, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MixU.

"Endodermo extraembrionario", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: SOX-7, AFP y SPARC.

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o de polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

"Célula del mesendodermo", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina(EOMES), SOX- 7, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.

"Célula endocrina pancreática", o "célula que expresa la hormona pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático.

"Célula del endodermo pancreático", o "células de la etapa 4", o "etapa 4", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar por lo menos uno de los siguientes marcadores: NGN-3, NeuroD, lslet-1, PDX-1 , PAX-4, NKX2.2.

La "célula productora de hormonas pancreáticas", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de producir por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático.

La "célula secretora de hormonas pancreáticas" o "células de la fase 6", o "etapa 6", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina, y polipéptido pancreático.

"Célula posterior del intestino anterior" o "células de la fase 3", o "fase 3", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX- , HNF- , PTF-1A, HNF-6, HB-9, PROX-1.

"Célula de la línea preprimitiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: Nodal o FGF8 "Célula del tubo intestinal primitivo" o "células de la etapa 2", o "etapa 2", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos uno de los siguientes marcadores: HNF-1 , o HNF-4A.

"Célula de la línea primitiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: braquiuria, proteína de homeosecuencia tipo mezcla o FGF4.

Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes Caracterización de las células madre pluripotentes Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4 y los marcadores detectables por medio del uso de los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282:1145, 1998). La diferenciación de las células madre pluripotentes in vitro resulta en la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra-10-60, y Tra-1-81 (si existiera) y el aumento de la expresión de SSEA- . Las células madre pluripotentes no diferenciadas típicamente tienen actividad de fosfatasa alcalina, la cual se puede detectar por la fijación de las células con paraformaldehído al 4 % y después desarrollarlas con el Vector Rojo como sustrato, según se describe por el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame California) Las células madre pluripotentes no diferenciadas también expresan típicamente Oct-4 y TERT, según se detectó por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre pluripotentes puede confirmarse, por ejemplo, inyectando células en ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID, por sus siglas en inglés), fijando los teratomas que se forman por medio del uso de paraformaldehído al 4 % y luego examinándolas histológicamente para ver si hay evidencias de tipos de células de las tres capas de gérmenes. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de células madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G y por la comparación con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo cual significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados.

Fuentes de las células madre pluripotentes Los tipos de células madre pluripotentes que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido pre-embrionario (tal como, por ejemplo, un biastocito), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son las líneas de células madre embrionarias humanas establecidas o células de germen embrionario humano, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. También adecuadas son las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivada, en ausencia de células alimentadoras.

También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).

En una modalidad las células madre embrionarias humanas se preparan como se describen en Thomson y otros (patente de los Estados Unidos, núm. 5.843.780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 92:7844, 995).

Cultivo de células madre pluripotentes En una modalidad las células madre pluripotentes se cultivan, típicamente, en una capa de células alimentadoras que soportan a las células madre pluripotentes de diferentes maneras. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras pero, sin embargo, soporta la proliferación de las células madre pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, se soporta con el uso de un medio acondicionado mediante el cultivo previo de otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de las células madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, se soporta por medio del uso de un medio definido químicamente.

Por ejemplo, Reubinoff y otros (Nature Biotechnology 8: 399 -404 (2000)) y Thompson y otros (Science 6 November 1998: Vol. 282. núm. 5391 , págs. 1145 - 1147) describen el cultivo de líneas de células madre pluripotentes a partir de blastocitos humanos con el uso de una capa de células alimentadoras de fibroblastos de embrión de ratón.

Richards y otros, (Stem Cells 21 : 546-556, 2003) evaluaron un panel de 11 capas alimentadoras de células diferentes de adultos, fetales y neonatales humanas para estudiar su capacidad para soportar el cultivo de células madre pluripotentes humanas. Richards y otros dicen: "las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre alimentadores de fibroblastos de piel adulta retienen la morfología de la célula madre embrionaria humana y permanecen pluripotentes".

La patente de los Estados Unidos núm. 200200721 7 describe líneas de células que producen medios que soportan el crecimiento de las células madre pluripotentes de primate en un cultivo libre de alimentador. Las líneas celulares empleadas son líneas de células mesenquimales y tipo fibroblasto, obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madre embrionarias. La patente de los Estados Unidos núm. 200200721 17 también describe el uso de líneas de células como una capa alimentadora de células primaria.

En otro ejemplo, Wang y otros (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) describe métodos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas sobre una capa alimentadora de células derivadas de células madre embrionarias humanas.

En otro ejemplo, Stojkovic y otros (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) describen un sistema de células alimentadoras derivadas de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas.

En otro ejemplo, iyamoto y otros (Stem Cells 22: 433-440, 2004) describen un origen de células alimentadoras obtenidas a partir de placenta humana.

Amit y otros (Biol. Reprod. 68: 2150-2156, 2003) describen una capa de células alimentadora derivada de prepucio humano.

En otro ejemplo, Inzunza y otros (Stem Cells 23: 544-549, 2005) describen una capa alimentadora de células a partir de fibroblastos de prepucio postnatal humano.

La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 describe los medios que soportan el crecimiento de las células madre pluripotentes de primate (pPS) en un cultivo libre de alimentador y las líneas de células útiles para la producción de tales medios. La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 establece: "Esta invención incluye líneas de células mesenquimales y tipo fibroblasto obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madre embrionarias. Los métodos para derivar tales líneas de células, procesar los medios y hacer crecer las células madre por medio del uso de los medios acondicionados se describen e ilustran en esta descripción".

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005014799 describe el medio acondicionado para el mantenimiento, proliferación y diferenciación de células de mamíferos. La patente WO20050 4799 establece: "El medio de cultivo producido de acuerdo con la presente invención está acondicionado mediante la actividad de secreción celular de células murinas, en especial aquellas diferenciadas y hepatocitos transgénicos inmortalizados, llamados m H (hepatiocito murino met, por sus siglas en inglés)." En otro ejemplo, Xu y otros (Stem Cells 22: 972-980, 2004) describen un medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que han sido modificadas genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa reversa telomerasa humana.

En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 20070010011 describe un medio de cultivo definido químicamente para el mantenimiento de células madre pluripotentes.

Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento, capaz de promover la proliferación de células madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI:10.1095/b¡olreprod. 05.046870, 19 de octubre de 2005) describen sistema de cultivo libre de alimentador y libre de suero, en el cual se mantienen las células madre embrionarias en un medio de reemplazo de suero (SR) sin acondicionar, complementado con diferentes factores de crecimiento, capaz de iniciar la autorrenovación de las células madre embrionarias.

En otro ejemplo, Levenstein y oíros (Stem Cells 24: 568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos, o un medio acondicionado, por medio del uso de medios complementados con bFGF.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050148070 describe un método para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras del fibroblasto; el método comprende: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, por lo menos una transferina o sustituto de transferina, por lo menos un insulina o sustituto de insulina; el medio de cultivo está esencialmente libre de suero fetal de mamífero y contiene por lo menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento del fibroblasto capaz de activar un receptor del señalizador del factor de crecimiento del fibroblasto, en donde el factor de crecimiento se suministra de otra fuente que sólo la capa alimentadora del fibroblasto, el medio soporta la proliferación de células madre en estado indiferenciado, sin células alimentadoras ni un medio acondicionado.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm.

US20050233446 describe un medio definido útil para cultivar células madre, incluso células madre primordiales de primate indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que se cultivan. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesario para soportar el crecimiento indiferenciado de células madre primordiales.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos US 6800480 establece: "En una modalidad se proporciona un medio de cultivo celular para el cultivo de células madre primordiales derivadas de primates en un estado indiferenciado sustancialmente, el cual incluye un medio básico bajo endotoxinas de baja presión osmótica, que es eficaz para soportar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primates. El medio básico se combina con un suero nutriente eficaz para soportar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste de células alimentadoras y un componente de la matriz extracelular derivado de las células alimentadoras. El medio además incluye aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento, seleccionado del grupo formado por nucleósidos y una sal de piruvato".

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. US20050244962 indica: "En un aspecto, la invención proporciona un método de cultivar células madre de embriones de primates. Se cultivan las células madre en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero (preferentemente también esencialmente libre de cualquier suero animal) y en presencia del factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra desde una fuente diferente de simplemente una capa alimentadora de fibroblastos. En una forma preferida, la capa alimentadora de fibroblastos, previamente requerida para mantener un cultivo de células madre, es innecesaria por la adición de suficiente factor de crecimiento fibroblástico." En aún otro ejemplo, la patente núm. WO2005065354 describe un medio de cultivo isotónico y definido, que está esencialmente libre de alimentador y libre de suero, que comprende: a. un medio basal; b. una cantidad suficiente de bFGF para soportar el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente indiferenciadas; c. una cantidad suficiente de insulina para soportar el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente indiferenciadas; y d. una cantidad suficiente de ácido ascórbico para soportar el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente indiferenciadas.

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, dicho método comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor transformador del crecimiento beta (TGF-ß), un miembro de la familia de proteínas de crecimiento de fibroblastos (FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.

Las células madre pluripotentes pueden colocarse en placas sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una modalidad el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal como, por ejemplo, aquellos derivados de la membrana de base o que pueden formar parte de la adhesión molecular de los acoplamientos receptor-ligando. En una modalidad, el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se hace gel a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.

Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Dependiendo del tipo de célula que se está proliferando, éste puede incluir laminina, fibronectina, proteoglican, entactina, sulfato de heparán y similares, solos o en diferentes combinaciones.

Las células madre pluripotentes pueden colocarse en placas sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueve la supervivencia, propagación y retención de las células con las características deseables. Todas estas características se benefician de la atención prestada en la distribución de sembrado y se puede determinar rápidamente mediante alguien con conocimiento en la materia.

Los medios de cultivo adecuados se pueden elaborar de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 11965-092; el medio de Eagle modificado por Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gibco núm. 10829-018; medio basal DMEM F12/50 % de Ham; 200 mM de L-glutamina, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 11140-050; ß-mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor recombinante de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), Gibco núm. 13256-029.

Formación de células productoras de hormonas pancreáticas a partir de células madre pluripotentes En una modalidad la presente invención proporciona un método para producir células productoras de hormonas pancreáticas a partir de células madre pluripotentes, en donde el método comprende las etapas de: a. cultivar células madre pluripotentes, b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; c. Diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático; y d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino.

En un aspecto de la presente invención la célula endocrina pancreática es una célula productora de hormonas pancreáticas. En un aspecto alternativo la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa Pdx1 y por lo menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, lsl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß es una célula ß.

Las células madre pluripotentes adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07) y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). También adecuadas para usar en la presente invención, son las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste de SOX-17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1 , Nodal, FGF8, braquiuna, proteína de homosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste de Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 y PROX1. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.

Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste de NGN-3, NeuroD, lslet-1 , Pdx- . NKX6.1 , Pax-4, NGN-3, y PTF-1 alfa. En una modalidad una célula endocrina pancreática es capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que expresa la hormona pancreática. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormona pancreática.

En un aspecto de la presente invención, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa Pdx1 y por lo menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, lsl-1 , HNF-3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß es una célula ß.

Formación de células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante cualquier método en la materia o mediante cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en Shinozaki y otros, Development 131 , 1651 - 1662 (2004).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en McLean y otros, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por medio de cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego cultivar la células con activina A y suero, y luego cultivar las células con activina A y suero de una concentración diferente. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por medio de cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego cultivar las células con activina A y suero de diferente concentración. Un ejemplo de este método se describe D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2005.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por medio de cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, luego eliminar el ligando Wnt y cultivar la células con activina A y suero. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 11/736,908 cedida a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 1 /779,311 , cedida a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/990,529.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,889.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,900.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,908.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,915.

Diferenciación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo La formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se puede determinar por medio de pruebas en presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo específico. Las células madre pluripotentes no expresan, típicamente, tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de las células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expreso mediante células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen una reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Northern., in situ por hibridación (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros., eds. 2001 supplement)), y inmunoensayos tales como análisis inmunohistoquímico material seccionado, de Transferencia (de tipo) Western, y para los marcadores que son accesibles en las células intactas, el análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Las características de las células madre pluripotentes son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y las características adicionales de las células madre pluripotentes continúan por ser identificadas. Los marcadores de las células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de las siguientes: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.

Después de tratar las células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas en un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Formación de células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático mediante cualquier método en la materia o cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático al tratar las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor KAAD-ciclopamina de la vía de señalización hedgehog, luego, al eliminar el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina y, posteriormente, cultivar las células en un medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante un período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 11/736,908 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante un periodo de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 11/779,311 , cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo, de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los EE.UU. núm. de serie 60/990,529.

Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del linaje del endodermo pancreático todavía no han sido identificadas. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje del endodermo pancreático. Los marcadores específicos del linaje del endodermo pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar por medio de exponer una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen una reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Northern., in situ por hibridación (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y oíros., eds. 2001 supplement)), y inmunoensayos tales como análisis inmunohistoquímico material seccionado, de Transferencia (de tipo) Western, y para los marcadores que son accesibles en las células intactas, el análisis de cítometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endócrino pancreático Las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino mediante cualquier método en la materia o mediante cualquier método explicado en esta invención.

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y oíros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático al cultivar las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT y exendin 4, luego al eliminar el medio que contiene DAPT y exendin 4 y, posteriormente, al cultivar células en un medio que contiene exendin 1, IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático al cultivar las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene exendin 4, luego al eliminar el medio que contiene exendin 4 y, posteriormente, al cultivar las células en un medio que contiene exendin 1 , IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino, por medio del cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT y exendin 4. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene exendin 4. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático además se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización notch, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 1/736,908 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático además se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización notch, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 11/779,311 , cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático además se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización notch, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 60/953,178 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los EE.UU. núm. de serie 60/990,529.

En un aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático, el método comprende tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con un medio que comprende una cantidad suficiente de un agonista del receptor TGF-ß para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático.

El agonista del receptor TGF-ß puede ser cualquier agente capaz de unirse a, y activar el receptor TGF-ß. En una modalidad el agonista del receptor TGF-ß se selecciona del grupo que consiste de activina A, activina B, y activina C.

En una modalidad alterna el agonista del receptor TGF-ß puede ser una variante de péptido de activina A. Los ejemplos de tales variantes de péptidos se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 61/076,889, asignada a Centocor R&D, Inc.

En una modalidad las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con una cantidad suficiente de activina A para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático por aproximadamente uno a cinco días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con una cantidad suficiente de activina A para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático por aproximadamente tres a cinco días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con una cantidad suficiente de activina A para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático por aproximadamente cinco días.

En una modalidad alterna el agonista del receptor TGF-ß se selecciona del grupo que consiste de GDF-8, GDF 11 y GDF-15. En una modalidad, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se tratan con el agonista receptor TGF-ß seleccionado del grupo que consiste de GDF-8, GDF 1 y GDF-15 y por lo menos otro factor. En una modalidad, por lo menos uno de los otros factores es por lo menos un compuesto cíclico de anilina-triazina-piridina. Los ejemplos de tales compuestos cíclicos anilina-triazina-piridina se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie. 61/076,900, asignada a Centocor R&D, Inc. En una modalidad alterna, el por lo menos otro factor, es un compuesto de anilina-triazina-piridina. Los ejemplos de tales compuestos cíclicos anilina-triazina-piridina se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie. 61/076,908, asignada a Centocor R&D, Inc. En una modalidad alterna, el por lo menos otro factor, es un compuesto descrito en la patente de Estados Unidos núm. de serie. 61/076,915, asignada a Centocor R&D, Inc.

En otro aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático son posteriormente enriquecidos. La etapa de enriquecimiento se puede realizar antes del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con el agonista receptor TGF-ß. Alternativamente, la etapa de enriquecimiento se puede realizar después de que las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se han tratado con el agonista receptor TGF-ß.

En una modalidad el enriquecimiento se logra mediante la obtención de una suspensión de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático y pasar la suspensión de células a través de un colador de células 40 pm.

Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino.

Los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del linaje pancreático endocrino continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje pancreático endocrino. Los marcadores específicos del linaje pancreático endocrino incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, NGN-3, NeuroD, lslet-1.

Los marcadores característicos de las células del linaje celular ß son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia y los marcadores característicos del linaje celular ß continúan siendo identificados. Estos marcadores pueden usarse para confirmar que las células tratadas de acuerdo con el presente invento se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje celular ß. Las características específicas del linaje celular ß incluyen a la expresión de uno o más factores de transcripción como, por ejemplo, Pdx1 (gen homeótico pancreático y duodenal -1), Nkx2.2, Nkx6.1 , Isl1 , Pax6, Pax4, NeuroD, Hnflb, Hnf-6, Hnf-3beta y MafA, entre otros. Estos factores de transcripción se establecen bien en la materia para la identificación de las células endocrinas. Ver, por ejemplo, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino. Alternativamente, la eficacia de la diferenciación puede determinarse mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (como un anticuerpo) que específicamente reconozca un marcador proteínico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje celular ß.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen una reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Northern., in situ por hibridación (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros., eds. 2001 supplement)), y inmunoensayos tales como análisis ¡nmunohistoquímico material seccionado, de Transferencia (de tipo) Western, y para los marcadores que son accesibles en las células intactas, el análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 998)).

En un aspecto de la presente invención la eficacia de la diferenciación se determina al medir el porcentaje de células positivas a la insulina en un cultivo de células dado después del tratamiento. En una modalidad los métodos de la presente invención producen aproximadamente 100 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 90 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 80 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 70 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 60 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 50 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 40 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 30 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 20 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 10 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 5 % de células positivas a la insulina en un cultivo dado.

En un aspecto de la presente invención la eficacia de la diferenciación se determina al medir la secreción de insulina estimulada por glucosa, como se detecta al medir la cantidad del péptido C liberado por las células. En una modalidad las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 1000ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 90ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 800ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 700ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 600ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 500ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 400ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 500ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 400ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 300ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 200ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 100ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 90ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 80ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 70ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 60ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 50ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 40ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 30ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 20ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 0ng de péptido C/pg de ADN.

Terapias En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar diabetes Tipo 1. Este método implica el cultivo de células madre pluripotentes, la diferenciación in vitro de células madre pluripotentes en un linaje celular ß y la implementación en un paciente de células de un linaje celular ß.

Aún en otro aspecto esta invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar, diabetes del Tipo 2. Este método implica el cultivo de células madre pluripotentes, la diferenciación de células cultivadas in vitro en un linaje celular ß y la implementación en un paciente de células de un linaje celular ß.

Si fuese apropiado, el paciente puede, además, ser tratado con agentes farmacéuticos o bioactivos que facilitan la supervivencia y función de las células transplantadas. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo, insulina, miembros de la familia de TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, proteínas morfogénicas del hueso (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11 , -12 y -13), factores de crecimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas t -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II), factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de las células endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, péptido -I y -II del tipo glucagon (GLP-1 , mimetibody GLP-1 y 2, Exendin-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, inhibidores MAPK, tales como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0132729.

Las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células productoras de insulina antes del transplante en un receptor. En una modalidad específica las células madre pluripotentes son plenamente diferenciadas en células ß antes de ser trasplantadas al receptor. Alternativamente, las células madre pluripotentes se pueden transplantar en un receptor en un estado no diferenciado o parcialmente diferenciado. Otra diferenciación puede ocurrir en el receptor.

Las células endodérmicas definitivas o bien las células endodérmicas pancreáticas o bien las células ß pueden implantarse como células dispersas o formarse en grupos que puedan infundirse en la vena porta hepática. Alternativamente, las células se pueden proporcionar en soportes poliméricos degradables biocompatibles, dispositivos no degradables porosos o encapsulados para protegerlas de la respuesta inmune del huésped. Las células se pueden implantar en un lugar apropiado en un receptor. Los lugares de implante incluyen, por ejemplo, el hígado, páncreas natural, espacio subcapsular renal, omento, peritoneo, espacio subseroso, intestino, estómago o un bolsillo subcutáneo.

Para aumentar otra diferenciación, la supervivencia o actividad de las células implantadas se pueden administrar factores adicionales tales como factores de crecimiento, agentes antioxidantes o antiinflamatorios antes de, simultáneamente con, o después de la administración de las células. En ciertas modalidades los factores de crecimiento son usados para diferenciar las células administradas in vivo. Estos factores pueden secretarse por células endógenas y exponerse a las células administradas in situ. Las células implantadas se pueden inducir para diferenciarlas mediante cualquier combinación de factores de crecimiento conocidos en la materia administrados exógena y endógenamente.

La cantidad de células usadas en el implante depende de un número de factores diversos, incluso la condición y respuesta del paciente a la terapia, y puede determinarla una persona con experiencia en la materia.

En un aspecto, esta invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar diabetes. Este método implica el cultivo de células madre pluripotentes, la diferenciación de células cultivadas in vitro en un linaje celular ß y la incorporación de células en un soporte tridimensional. Las células se pueden mantener in vitro en este soporte antes de su implante en el paciente. Alternativamente, el soporte que contiene las células se puede implantar directamente en el paciente sin cultivo adicional in vitro. El soporte se puede incorporar opcionalmente con por lo menos un agente farmacéutico que facilita la supervivencia y la función de las células transplantadas.

Los materiales de soporte adecuados para uso a los fines de la presente invención incluyen patrones de tejidos, conductos, barreras, y depósitos útiles para la reparación del tejido. En particular, los materiales naturales y sintéticos en forma de espumas, esponjas, geles, hidrogeles, tejidos, y estructuras no tejidas, los cuales han sido usados in vitro e in vivo para reconstruir o regenerar tejido biológico, así como para proporcionar agentes quimiotácticos para inducir el crecimiento del tejido, son adecuados para su uso en la práctica de los métodos de la presente invención. Ver, por ejemplo, los materiales descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,770,417, patente de los Estados Unidos núm. 6,022,743, patente de los Estados Unidos núm. 5,567,612, patente de los Estados Unidos núm. 5,759,830, patente de los Estados Unidos núm. 6,626,950, patente de los Estados Unidos núm. 6,534,084, patente de los Estados Unidos núm. 6,306,424, patente de los Estados Unidos núm. 6,365,149, patente de los Estados Unidos núm. 6,599,323, patente de los Estados Unidos núm. 6,656,488, solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0062753 A1, patente de los Estados Unidos núm. 4,557,264 y patente de los Estados Unidos núm. 6,333,029.

Para formar un soporte incorporado con un agente farmacéutico, este agente se puede mezclar con la solución polimérica antes de formar el soporte. Alternativamente, un agente farmacéutico se podría recubrir sobre un soporte prefabricado, preferentemente, en presencia de un portador El agente farmacéutico puede estar presente como un líquido, un sólido dividido con precisión, o de cualquier otra forma física apropiada. Alternativamente, los excipientes se pueden agregar al soporte para cambiar la tasa de liberación del agente farmacéutico. En una modalidad alterna el soporte se incorpora con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiinflamatorio, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,509,369.

El soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiapoptotico, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,793,945.

Además, el soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un inhibidor de fibrosis, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,331 ,298.

Además el soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es capaz de aumentar la angiogénesis, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0220393 y solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901.

Además el soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto inmunosupresor, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0171623.

El soporte puede también incorporarse a al menos un compuesto farmacéutico que sea un factor de crecimiento tal como, por ejemplo, los miembros de la familia TGF-ß, que incluyen TGF-ß?, 2 y 3, proteínas morfogénicas del hueso (BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -11 , -12 y -13), factores de crecimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II) factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -6, -8, - 0, -15), factor de crecimiento derivado de las células endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, factor 1-alfa inducible por hipoxia, péptido -I del tipo glucagon (GLP-1), mimetibody GLP-1 and GLP-2, y II, Exendin-4, nodal, nogina, NGF, ácido retinoico, hormona paratiroidea, tenascina C, tropoelastina, péptidos derivados de la trombina, catelicidinas, defensinas, laminina, péptidos biológicos que contienen dominios de unión a célula y a heparina de proteínas adhesivas extracelulares tales como fibronectina y vitronectina, inhibidores MAPK, tales como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0 32729.

La incorporación de las células de la presente invención en un supercóntigo se puede lograr mediante el depósito simple de las células en el supercóntigo. Las células pueden entrar al supercóntigo por difusión simple (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Se han desarrollado otros enfoques para aumentar la eficiencia de la propagación de la célula. Por ejemplo, los frascos de agitación se han usado en la propagación de condrocitos en supercóntigos de ácidos poliglicólicos (Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). Otro enfoque para la propagación de las células es el uso de la centrifugación, la cual produce un esfuerzo mínimo en las células sembradas y aumenta la eficiencia de la propagación. Por ejemplo, Yang y otros desarrollaron un método de sembrado de células (J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)), denominado Inmovilización celular centrífuga (CCI).

La presente invención se ilustra, pero no está limitada a, los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Diferenciación de la línea celular de células madre embrionarias humanas H1 a células endocrinas pancreáticas en la ausencia de suero fetal bovino.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en un pasaje 52 se cultivaron en platos recubiertos con MATRIGEL™ (1:30 dilución) y expuestos a medio con RPMI suplementado con 2 % BSA (catálogo núm. 152401 , MP Biomedical, Ohio), y 100 ng/ml activina A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml WNT-3a (catálogo núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (catálogo núm. 100-18B, PeproTech, NJ), por un día, seguido por tratamiento con medio de RPMI suplementado con 2 % BSA y 100 ng/ml activina A plus 8 ng/ml de bFGF por dos días adicionales. Los siguientes cultivos se trataron con DMEM/F12 + 2 % BSA + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 µ? Ciclopamina- KAAD (núm. 239804, Calbiochem, CA) por dos días, seguido por cuatro días de incubación en DMEM/F12 + 1 % B27 (Invitrogen, CA) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 µ? ciclopamina- KAAD + 2 µ? ácido retinoico(RA) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN).

Las células de diferenciaron en células endocrinas pancreáticas mediante la incubación de las células en DMEM/F12 + 1 % B27 (Invitrogen, CA) + 100 ng/ml Noggin + 1 µ? DAPT (un inhibidor de gamma-secretasa) (catálogo núm. 565784, Calbiochem, CA) + 1 pm inhibidor M ALK5 II (catálogo núm. 616452, Calbiochem, Ca) + 100 ng/ml of Netrin-4 (R&D Systems, MN) por tres días seguidos por siete días adicionales de incubación en DMEM/F 2 + 1 % B27 (Invitrogen, CA) + 1 pm inhibidor ALK5 II (Calbiochem, Ca). Se adicionó una última etapa para madurar más los cultivos endocrinos, que consistió de un tratamiento de siete días con DMEM/F12 + 1 % B27 (Invitrogen, CA). Excepto por la última etapa, todas las otras etapas incluyeron cambios diarios del medio. Un resumen del procedimiento se ilustra en la Figura 1. En cada etapa, el número de células se calculó con el uso de un hemocitómetro y el RNA se recolectó por análisis de PCR. Todas las muestras se recolectaron por triplicado.

Las Figuras 2A y 2B muestran la expresión CXCR4 en células según se midió por FACS y datos de PCR en tiempo real para el momento específico en el tercer día, que corresponde a la etapa 1. El número de veces de cambio en la expresión se muestra con relación a células H1 ES indiferenciadas.

Ejemplo 2 La adición de Activina A a los cultivos de la etapa 6 mejoró significativamente la expresión de los marcadores pancreáticos endocrinos Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en el pasaje 43 se cultivaron en platos recubiertos de MATRIGEL™ (1 :30 dilución) y se diferenciaron a células endocrinas pancreáticas de conformidad con los métodos descritos en el ejemplo 1. En la etapa 6, algunos de los cultivos se trataron con 10 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN) por siete días. En el día 7 las células se trataron por 5 min a temperatura ambiente con 1X Accutase (Sigma, MO) seguido de la eliminación de Accutase y la adición de DMEM/12 + 1 % B27. Las células unidas se eliminaron con el uso de una rasqueta celular y suavemente resuspendido y pasado por un colador de células 40 µ?t?. El flujo a través de las células y retenido en el colador, se retiró y recolectaron muestras para PCR y tinción por ditizona. La ditizona (DTZ) es un tinte que se une selectivamente al zinc, que se ha mostrado que está presente en los islotes. Las Figuras 3A-3C describen los cultivos teñidos con DTZ antes y después de la separación con el uso de un colador de células 40 m. Una porción significativa (aproximadamente el 80 %) de los agregados mayores que 40 µ?? se tiñeron positivo para DTZ. Esto proporciona un método rápido y simple de enriquecimiento de agregados endocrinos ricos. Las Figuras 4A-4F muestran el perfil de expresión génica tratado en la etapa 6 +/- 10 ng/ml de activina A y posteriormente enriquecido con el uso de un filtro 40 µ?t?. La adición de activina A a la etapa 6, aumentó significativamente la expresión de todos los marcadores endocrinos pancreáticos.

Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad. Aunque los diferentes aspectos de la invención se ilustraron anteriormente con referencia a los ejemplos y las realizaciones preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones redactadas bajo los principios de la ley de patentes.

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático, el método comprende tratar las células que expresan marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático con un medio que comprende una cantidad suficiente de un agonista del receptor TGF-ß para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caractenzado además porque el agonista receptor TGF-ß se selecciona del grupo que consiste de activina A, activina B, activina C, variantes del péptido de activina A, GDF-8, GDF-11 y GDF- 5.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células que expresan marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático están enriquecidas.

4. Un método para diferenciar células madre pluripotentes; el método comprende las etapas de: a. cultivar células madres pluripotentes, b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; c. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático; y d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático se incrementa mediante tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con un medio que comprende una cantidad suficiente de un agonista del receptor TGF-ß para causar un incremento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el agonista receptor TGF-ß se selecciona del grupo que consiste de activina A, activina B, activina C, variantes del péptido de activina A, GDF-8, GDF-11 y GDF-15.

7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque las células que expresan marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático están enriquecidas.