JP2018011610A - ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化 - Google Patents

Abstract

【課題】膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を効果的に増加させるか、またはヒト多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。【解決手段】少なくとも、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を、アクチビンＡ等、を用いて増加させる工程を含んでなる、方法。【選択図】なし

Description

本発明は、多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。具体的には本発明は、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供する。

Ｉ型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。

脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ−１７などの多くのマーカーを発現する。

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤｘ１を発現する。ＰＤｘ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤｘ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程となっている。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。

島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、非特許文献１は、マウスの胚性幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。非特許文献２は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。

一例において、非特許文献３は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。

他の例では、非特許文献４が、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。

非特許文献５は、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である。

非特許文献６は、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している。

非特許文献７は、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。非特許文献７はまた、インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７による処理によりＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことも観察している。

非特許文献８は、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に増大させる増殖因子の効果を研究した。彼らは、ＴＧＦ−β２によってＰｄｘ１陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している。

特許文献１は、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下で、マウス胚性幹細胞からｂｒａｃｈｙｕｒｙ⁺／ＨＮＦ−３β⁺内胚葉細胞が誘導されることを示している。

非特許文献９は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。

しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。

非特許文献１０では、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞が単離されている。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者（非特許文献１１）は、胎児性腺組織から、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した。白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみでも分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（特許文献２、特許文献３、特許文献４）。

非特許文献１２は、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、一部の内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、Ｐｄｘ１陽性細胞に更に分化することができる（特許文献５）。

非特許文献１３は、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞に転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。

別の例において、特許文献６は、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に細胞をノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰｄｘ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。

１つの例において、非特許文献１４は、「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている。

Ｇｏｒｄｏｎ、米国特許出願公開２００６／０００３４４６（Ａ１）号 米国特許第６，２００，８０６号 国際公開第９９／２０７４１号 国際公開第０１／５１６１６号 米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号 Ｆｉｓｋら、米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号

Ｌｕｍｅｌｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９、２００１年 Ｓｏｒｉａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７、２０００年 Ｈｏｒｉら、ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２ Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら、ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年 Ｍｉｃａｌｌｅｆら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年 Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０、２００４年 Ｓｋｏｕｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４ Ｓｈｉｒａｋｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６ Ｇｏｒｄｏｎら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐ １６８０６，２００６ Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８年 Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８ Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５ Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６） Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０

したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を確立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。

本発明者らは、膵臓内分泌細胞に向かうヒト胚幹細胞の分化の効率を改善する代替的な手法を採用した。一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させ
る工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。

一実施形態では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、本方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。

本発明で採用される分化プロトコルの概要を示す。 本発明で採用される分化プロトコルの様々なステージに関連付けられるマーカーの、発現量を示す。パネルａ）は、ステージ１へと分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞のＦＡＣＳにより測定されたものとして、ＣＸＣＲ４の発現量を示す。パネルｂ）は、ステージ１へと分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞のリアルタイムＰＣＲにより測定されたものとして、ステージ１に関連付けられるマーカーの発現量を示す。 本発明で採用した分化プロトコルのステージ６へと分化させ、次いでアクチビンＡで処理（ステージ７）したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の、ジチゾン染色を示す。パネルａ）は、４０μｍセルストレイナーで濾過する前にジチゾンで染色した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。パネルｂ）は、４０μｍセルストレイナーにより濾過された、ジチゾン染色した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。パネルｃ）は、４０μｍセルストレイナーにより濾過されなかった、ジチゾン染色した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。 リアルタイムＰＣＲにより測定されるものとして、本発明で採用された分化プロトコルのステージ６へと分化させ、実施例２に記載の方法に従ってステージ６へと分化させた後にアクチビンＡで処理したヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞での、ｐｄｘ−１（パネルａ）、ｎｋｘ６−１（パネルｂ）、Ｐａｘ４（パネルｃ）、ｎｋｘ２．２（パネルｄ）、インスリン（パネルｅ）及びグルカゴン（パネルｆ）の発現量を示す。

開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。

定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。

幹細胞は、発生上の能力によって、（１）全ての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素（例えば、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有するこ
とを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。

分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化していない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわち、その細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。

「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１、及び以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞を含む。

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ１細胞」、又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１ α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」、又は「ステージ５細胞」、又は「ステージ５」とは、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１ αのうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系の細胞が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する：ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１。

本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。

本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。

本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉細胞」、又は「ステージ４細胞」、又は「ステージ４」とは、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＡＸ−４又はＮＫＸ２．２のうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン産生細胞」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを産生することができる細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」、又は「ステージ６細胞」、又は「ステージ６」とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「前腸後部細胞」、又は「ステージ３細胞」、又は「ステージ３」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１、ＰＴＦ−１Ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ−９、ＰＲＯＸ−１のうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「原始腸管細胞」、又は「ステージ２細胞」、又は「ステージ２」とは、以下のマーカー、すなわち、ＨＮＦ−１、又はＨＮＦ−４Ａのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。

本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得
る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．））によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層からの細胞種の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。

増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ、著しく変更されてはいない。

多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞等）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。

一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載されているように生成される。

多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより条件づけした培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。

例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は
、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞層を用いてヒト胚盤胞からの多能性幹細胞系を培養することについて開示している。

Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。

米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー細胞培養中で霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を更に開示している。

別の例として、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。

別の例として、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。

更なる別の例として、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。

Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。

別の例として、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。

米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー細胞培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ繊維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。

別の例として、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。

別の例として、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。

別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。

代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、無フィーダー細胞かつ無血清の培養システムを開示している。

別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。

別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞方法を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有する培地中で細胞を培養し、この培地は、本質的に哺乳動物胎児血清を含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、ここで増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は馴化培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。

別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。

別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「１つの実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外基質成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びに、ヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。

別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。」と述べている。

更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、基本的に無フィーダー細胞かつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基礎培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹
細胞の増殖を支持するうえで充分な量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のアスコルビン酸、を含む培地を開示している。

別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。

多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。

他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。

多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれてもよい。これら全特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。

好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非不可欠アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。

多能性幹細胞からの膵臓ホルモン産生細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞を作製するための方法を提供し、かかる方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。

本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン産生細胞である。別の態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。

本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ
ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわちＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。

膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。

本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，
１６５１〜１６６２（２００４）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５に開示されている。

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に
従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。

分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。

多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば、多能性幹細胞マーカーとしては以下の：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１の１種以上の発現が挙げられる。

多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。

例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。

例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴
的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化させられる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は更に、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で一定時間処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化する。

本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は更に、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で一定時間処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化する。

本発明の１つの態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第６０／９９０，５２９号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に分化させる。

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１βなどの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。

分化効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することにより測定することができる。

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。

膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、
又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系
に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。

本発明の一態様では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、この方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。

ＴＧＦ−β受容体作動剤は、ＴＧＦ−β受容体に結合し、かつこの受容体を活性化することのできる、任意の剤であり得る。一実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、及びアクチビンＣからなる群から選択される。

別の実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、アクチビンＡのペプチド変異体であり得る。このようなペプチド変異体の例は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される。

一実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させるのに十分な量のアクチビンＡで、約１〜約５日間にわたって処理する。あるいは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させるのに十分な量のアクチビンＡで、約３〜約５日間にわたって処理する。あるいは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させるのに十分な量のアクチビンＡで、約５日間にわたって処理する。

別の実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ １１、及びＧＤＦ−１５からなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ １１、及びＧＤＦ−１５、並びに少なくとも１種の他の因子からなる群から選択されるＴＧＦ−β受容体作動剤で処理される。一実施形態では、少なくとも１種の他の因子は環式アニリン−ピリジノトリアジン化合物である。このような環式アニリン−ピリジノトリアジン化合物の例は、米国特許出願番号第６１／０７６，９００号（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃに譲渡）に記載される。別の実施形態では、少なくとも１種の他の因子はアニリン−ピリジノトリアジン化合物である。このようなアニリン−ピリジノトリアジン化合物は、米国特許出願番号第６１／０７６，９０８号（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡）に記載される。別の実施形態では、少なくとも１種の他の因子は、米国特許出願番号第６１／０７６，９１５号（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡）に記載される化合物である。

本発明の一態様では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は続いて濃縮される。濃縮工程は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＴＧＦ−β受容体作動剤で処理する前に実施され得る。あるいは濃縮工程は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＴＧＦ−β受容体作動剤で処理した後に実施され得る。

一実施形態では、濃縮は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の懸濁液を得て、４０μｍセルストレイナーで濾過することにより実施される。

膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵内分泌系に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、膵内分泌系の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵内分泌系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系に特異的なマーカーとしては、例えば、ＮＧＮ−３、ニューロＤ（ＮｅｕｒｏＤ）、Ｉｓｌｅｔ−１などの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。

β細胞系の細胞に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、β細胞系の細胞の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用することができる。β細胞系に特異的な特徴としては、１つ以上の、中でも例えば、Ｐｄｘ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡなどの転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定について当該技術分野で十分に確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。

分化効率は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。あるいは分化効率は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析などの免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。

本発明の一態様では、分化効率は、処理後の所定の細胞培養物中のインスリン陽性細胞の百分率を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１００％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約９０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約８０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約７０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約６０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約４０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約３０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約２０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５％のインスリン陽性細胞を生成する。

本発明の一態様では、分化効率は、グルコース刺激によるインスリン分泌を、細胞が放出するＣ−ペプチドの量を測定することで検出し、測定することにより求められる。一実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ
１ｐｇ当たり約５０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。

治療
一態様では、本発明は、Ｉ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系へと分化させ、β細胞系の細胞を患者に埋め込むことを含む。

更に別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系に分化させ、β細胞系の細胞を患者に埋め込むことを含む。

適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。こうした薬剤としては、例えば、特にインスリン、ＴＧＦ−β１、２及び３などのＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１
０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどが挙げられる。他の医薬化合物としては例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（mimetibody）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。

多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞に分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエント内で行われ得る。

胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として埋め込んでもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターとして編成してもよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。

埋め込まれた細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。所定の実施形態において、増殖因子は、インビボで、投与された細胞を分化させるよう使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で（in situ）で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。

埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。

一態様では、本発明は糖尿病に罹患しているかあるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系に分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に埋め込む前に、インビトロでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、インビトロで更に培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。

本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、インビトロ及びインビボで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３ Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照されたい。

医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成するのに先立ち、薬剤をポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物（例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物）を支持体に組み込む。

支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。

支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。

支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。

支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。

例えば支持体には、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物としては、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−Ｉ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキセンディン４、ｎｏｄａｌ、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。

スキャフォールド内への本発明の細胞の組み込みは、細胞をスキャフォールド上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単純拡散によりスキャフォールド内に入れることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１ Ｐｔ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸スキャフォールド上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＣＣＩ）と呼ばれる、細胞播種法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。

以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定され
るものではない。

（実施例１）
ウシ胎児血清の非存在下での、ヒト胚性幹細胞の細胞株Ｈ１の膵内分泌細胞への分化
継代数５２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）をコートしたディッシュ上で培養し、２％ ＢＳＡ（カタログ＃ １５２４０１，ＭＰ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃ １００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を加えたＲＰＭＩ培地に１日にわたって曝露した後、２％ ＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えたＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理した。次いで培養物をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ ＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）で２日間にわたって処理し、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７＋０．２５μＭシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）中で４日間にわたってインキュベートした。

ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン＋１μＭのＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤）（カタログ＃ ５６５７８４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃ ６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）＋１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）中で３日間にわたってインキュベートし、更にＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）中で７日間にわたってインキュベートすることにより、細胞を膵内分泌細胞へと分化させた。内分泌腺培養物を更に成熟させるために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）での７日間の処理からなる最後のステージを加えた。最後のステージを除き、他のすべてのステージでは毎日培地を交換した。この手順の概要を図１に示す。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ分析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３つ組複製で採取した。

図２のパネルａ及びｂは、ＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲデータにより測定されたものとして、ステージ１に対応する３日目の時点での細胞中の、ＣＸＣＲ４発現について示す。未分化のＨ１ ＥＳ細胞に対する発現の倍数変化が示されている。

（実施例２）
ステージ６の培養物へのアクチビンＡの添加は、膵内分泌マーカーの発現量を有意に増加させた
継代数４３のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、実施例１に記載の方法に従って膵内分泌細胞へと分化させた。ステージ６で、一部の培養物を１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で７日間にわたって処理した。７日目に、細胞を室温で５分間にわたって１Ｘアキュターゼ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で処理した後、続いてアキュターゼは除去してＤＭＥＭ／１２＋１％ Ｂ２７を加えた。接着した細胞をセルスクレーパーを用いて取り外し、穏やかに再懸濁し、４０μｍのセルストレイナーで濾過した。ストレイナーに保持されたフロースルーと細胞を取り外し、サンプルをＰＣＲとジチゾン染色のために回収した。ジチゾン（ＤＴＺ）は、島に存在することが示されてきた亜鉛へと、選択的に結合する色素である。図３のパネルａ〜ｃは、４０μｍセルストレイナーを用いて分離する前、及び
分離した後にＤＴＺ染色した培養物を示す。４０μｍを超えるクラスターの有意な（およそ８０％）部分がＤＴＺに対して陽性に染色された。これは内分泌腺に富むクラスターを濃縮する、迅速で簡単な方法として提供される。図４のパネルａ〜ｆは、ステージ６で＋／−１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで処理し、続いて４０μｍのフィルタを用いて濃縮した細胞の、遺伝子発現プロファイルを示す。ステージ６へのアクチビンＡの添加は、全ての重要な膵内分泌マーカーの発現を、有意に増幅させた。

本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。

Claims (20)

1. 膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法であって、ヒト膵内分泌細胞をアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡのペプチド変異体、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１及びＧＤＦ−１５からなる群より選ばれるＴＧＦ−β受容体アゴニストを含む培地で処理する工程を含んでなり、かつ、膵内分泌系に特徴的なマーカーがＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓ１ｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ４、Ｎｇｎ−３及びＰＴＦ−１αからなる群より選ばれる、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストがアクチビンＡ、アクチビンＢ及びアクチビンＣからなる群より選ばれる、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストがアクチビンＡのペプチド変異体である、方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストがＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１及びＧＤＦ−１５からなる群より選ばれる、方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、培地がアニリン−ピリジノトリアジンをさらに含む、方法。
6. 請求項４に記載の方法であって、培地が環式アニリン−ピリジノトリアジンをさらに含む、方法。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載の方法であって、前記細胞を１〜５日間処理することを含む、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記細胞を３〜５日間処理することを含む、方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストで処理した後に前記細胞を濃縮することをさらに含む、方法。
10. 多能性幹細胞の分化方法であって、
    ａ．ヒト多能性幹細胞をヒト胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
    ｂ．ヒト胚体内胚葉細胞をヒト膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
    ｃ．ヒト膵臓内胚葉細胞をヒト膵内分泌細胞に分化させる工程と、
    ｄ．ヒト膵内分泌細胞をアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡのペプチド変異体、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１及びＧＤＦ−１５からなる群より選ばれるＴＧＦ−β受容体アゴニストを含む培地で処理することにより膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる工程であって、かつ、膵内分泌系に特徴的なマーカーがＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓ１ｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ４、Ｎｇｎ−３及びＰＴＦ−１αからなる群より選ばれる、工程
    を含んでなる、方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストがアクチビンＡ、アクチビンＢ及びアクチビンＣからなる群より選ばれる、方法。
12. 請求項１０に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストがアクチビンＡのペプチド変異体である、方法。
13. 請求項１０に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストがＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１及びＧＤＦ−１５からなる群より選ばれる、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、培地がアニリン−ピリジノトリアジンをさらに含む、方法。
15. 請求項１３に記載の方法であって、培地が環式アニリン−ピリジノトリアジンをさらに含む、方法。
16. 請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法であって、前記細胞を１〜５日間処理することを含む、方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、前記細胞を３〜５日間処理することを含む、方法。
18. 請求項１０に記載の方法であって、ＴＧＦ−β受容体アゴニストで処理した後に前記細胞を濃縮することをさらに含む、方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、濃縮が前記細胞の懸濁物を取得すること及び細胞の懸濁物を４０μｍのセルストレイナーを通過させることを含む、方法。
20. 請求項１０に記載の方法であって、ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、方法。

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