CN114206480B - 生物相容性膜复合材料 - Google Patents

Abstract

提供一种包括第一层(细胞不可渗透层)、第二层(缓解层)和第三层(血管化层)的生物相容性膜复合材料。缓解层可以位于细胞不可渗透层和血管化层之间。在一些实施方式中，细胞不可渗透层和缓解层紧密结合以形成具有紧密/开放结构的复合层。加强组件可以任选地位于生物相容性膜复合材料的任一侧上或生物相容性膜复合材料内以提供对膜复合材料的支撑并防止其扭曲。生物相容性膜复合材料可用于或形成用于封装生物体的装置，所述生物体包括但不限于胰腺谱系型细胞，例如胰腺祖细胞。

Description

生物相容性膜复合材料

技术领域

本公开一般涉及可植入医疗装置领域，尤其涉及生物相容性膜复合材料及其用途。

背景技术

生物疗法是治疗外周动脉疾病、动脉瘤、心脏病、阿尔茨海默病和帕金森病、自闭症、失明、糖尿病和其他疾病的越来越可行的方法。

对于一般的生物疗法，细胞、病毒、病毒载体、细菌、蛋白质、抗体和其他生物活性实体可以通过将生物活性部分置于患者组织床中的手术或介入方法引入患者体内。通常，生物活性实体首先放置在装置中，然后再插入患者体内。或者，可以先将装置插入患者体内，然后再添加生物活性实体。该装置由一种或多种生物相容性膜或其他生物相容性材料形成，这些膜或材料允许营养物通过但阻止封装的细胞通过。

为了维持具有活力和生产力的生物活性实体(例如细胞)群，生物活性实体必须保持对通过宿主血管输送的营养物质(例如氧)的获取。为了最大限度地提高植入的封装细胞的活力和生产力，有必要通过确保血管的形成尽可能接近细胞从而使氧和营养物质被输送到植入的封装细胞所需的扩散距离和时间最小化来最大限度地获取氧和营养物质源。

将外部装置(例如，细胞封装装置)植入体内会触发免疫反应，在该免疫反应中异物巨细胞形成并至少部分地包封植入的装置。在细胞不可渗透的界面处或附近存在异物巨细胞使得血管在靠近封装细胞的地方很难形成(如果不是不可能形成的话)，从而限制对维持封装细胞活力和健康所需的氧和营养物质的获取。

因此，本领域仍然需要一种材料，该材料提供封装细胞与宿主免疫细胞的充分免疫隔离，同时提供能够减轻或调整异物反应的环境，使得在细胞封装装置的表面处或附近发生足够的血管化，从而使得封装的细胞能够存活并分泌治疗有用的物质。

发明内容

根据一个方面(“方面1”)，生物相容性膜复合材料包括：(1)具有小于约1微米的MPS(最大孔径)的第一层，(2)第二层，该第二层具有第一实体特征体，该第一实体特征体的大部分第一实体特征体间距小于约50微米，其中大部分第一实体特征体具有约3微米至约20微米的代表性短轴，以及(3)第三层，该第三层具有有效直径大于约5微米的孔径和第二实体特征体，该第二实体特征体的大部分第二实体特征体间距大于约50微米。第二层位于第一层和第三层之间。

根据方面1的进一步的另一方面(“方面2”)，第一层的单位面积质量(MpA)小于约5g/m²。

根据方面1或方面2的进一步的另一方面(“方面3”)，第一层具有小于约10微米的第一厚度。

根据方面1到方面3中任一方面的进一步的另一方面(“方面4”)，第二层具有小于约60微米的第二厚度。

根据方面1到方面4中任一方面的进一步的另一方面(“方面5”)，生物相容性膜复合材料在最弱轴上的最大拉伸载荷大于40N/m。

根据方面1到方面5中任一方面的进一步的另一方面(“方面6”)，第一层具有大于约50％的第一孔隙率。

根据方面1到方面6中任一方面的进一步的另一方面(“方面7”)，第二层具有大于约60％的第二孔隙率。

根据方面1到方面7中任一方面的进一步的另一方面(“方面8”)，生物相容性膜复合材料的复合z强度测量值大于100KPa。

根据方面1到方面8中任一方面的进一步的另一方面(“方面9”)，第二层的实体特征体各自包括分别具有代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度的实体特征体，其中第二层的代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度中的至少两者的大部分大于约5微米。

根据方面1到方面9中任一方面的进一步的另一方面(“方面10”)，与第一层接触的第一实体特征体的至少一部分是结合的实体特征体。

根据方面1到方面10中任一方面的进一步的另一方面(“方面11”)，第二层具有有效直径为约1微米至约9微米的孔径。

根据方面1到方面11中任一方面的进一步的另一方面(“方面12”)，实体特征体通过原纤维连接并且原纤维是可变形的。

根据方面1到方面12中任一方面的进一步的另一方面(“方面13”)，第三层具有约30微米到约200微米的第三厚度。

根据方面1到方面13中任一方面的进一步的另一方面(“方面14”)，第三层的大部分第二实体特征体间距大于约50微米。

根据方面1到方面14中任一方面的进一步的另一方面(“方面15”)，第三层中大部分第二实体特征体具有小于约40微米的代表性短轴。

根据方面1到方面15中任一方面的进一步的另一方面(“方面16”)，第一层、第二层和第三层中的至少两者紧密结合。

根据方面1到方面16中任一方面的进一步的另一方面(“方面17”)，第一层和第二层紧密结合。

根据方面1到方面17中任一方面的进一步的另一方面(“方面18”)，第三层的第三厚度大于第一层的第一厚度与第二层的第二厚度之和。

根据方面1到方面18中任一方面的进一步的另一方面(“方面19”)，第三层的第三厚度是第一层和第二层的总厚度的至少两倍。

根据方面1到方面19中任一方面的进一步的另一方面(“方面20”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者包括聚合物、含氟聚合物膜、非含氟聚合物膜、织造纺织品、非织造纺织品、纤维或纱线的织造或非织造集合、纤维基质以及它们的组合。

根据方面1到方面20中任一方面的进一步的另一方面(“方面21”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者是聚合物。

根据方面21的进一步的另一方面(“方面22”)，聚合物是选自以下的含氟聚合物膜：膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜、氟化乙烯丙烯(FEP)膜和改性的ePTFE膜。

根据方面1到方面22中任一方面的进一步的另一方面(“方面23”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者是膨胀聚四氟乙烯膜。

根据方面1到方面23中任一方面的进一步的另一方面(“方面24”)，第三层是纺粘非织造聚酯材料。

根据方面1到方面24中任一方面的进一步的另一方面(“方面25”)，第三层的第二实体特征体包括非织造或织造纺织品的纤维。

根据方面1到方面25中任一方面的进一步的另一方面(“方面26”)，第三层的第二实体特征体包括织造或非织造纺织品，第二代表性短轴是织造或非织造纺织品中纤维的直径。

根据方面1到方面26中任一方面的进一步的另一方面(“方面27”)，包括在其上的加强组件。

根据方面27的进一步的另一方面(“方面28”)，加强组件的刚度为约0.01N/cm至约5N/cm。

根据方面27或方面28的进一步的另一方面(“方面29”)，加强组件是织造或非织造纺织品。

根据方面1到方面29中任一方面的进一步的另一方面(“方面30”)，包括第一加强组件和第二加强组件。

根据方面1到方面30中任一方面的进一步的另一方面(“方面31”)，第二层的第一实体特征体包括选自以下的一种：热塑性聚合物、聚氨酯、硅酮、橡胶、环氧树脂(epoxies)及其组合。

根据方面1到方面31中任一方面的进一步的另一方面(“方面32”)，包括在其上的表面涂层，所述表面涂层包括选自以下的一种或多种：抗微生物剂、抗体、药物和生物活性分子。

根据方面1到方面32中任一方面的进一步的另一方面(“方面33”)，包括在其上的亲水性涂层。

根据方面1到方面33中任一方面的进一步的另一方面(“方面34”)，生物相容性膜复合材料是细胞封装装置的形式。

根据一个方面(“方面35”)，生物相容性膜复合材料包括(1)第一层，(2)第二层，该第二层具有有效直径为1微米至9微米的孔径，小于约60微米的第一厚度，以及第一实体特征体，该第一实体特征体的大部分第一实体特征体间距小于约50微米，其中第一实体特征体的大部分具有约3微米到约20微米的第一代表性短轴，以及(3)第三层。第二层位于第一层和第三层之间。

根据方面35的进一步的另一方面(“方面36”)，第一层具有直径小于约1微米的MPS(最大孔径)。

根据方面35或方面36的进一步的另一方面(“方面37”)，第一层的单位面积质量(MpA)小于约5g/m²。

根据方面35到方面37中任一方面的进一步的另一方面(“方面38”)，第一层具有小于约10微米的第二厚度。

根据方面35到方面38中任一方面的进一步的另一方面(“方面39”)，生物相容性膜复合材料在最弱轴上的最大拉伸载荷大于约40N/m。

根据方面35到方面39中任一方面的进一步的另一方面(“方面40”)，第一层具有大于约50％的第一孔隙率。

根据方面35到方面40中任一方面的进一步的另一方面(“方面41”)，第二层具有大于约60％的第二孔隙率。

根据方面35到方面41中任一方面的进一步的另一方面(“方面42”)，生物相容性膜复合材料的复合z强度测量值大于100KPa。

根据方面35到方面42中任一方面的进一步的另一方面(“方面43”)，第二层的实体特征体各自包括代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度，其中第二层的代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度中的至少两者的大部分大于约5微米。

根据方面35到方面42中任一方面的进一步的另一方面(“方面44”)，第三层具有有效直径大于约9微米的孔径。

根据方面35到方面44中任一方面的进一步的另一方面(“方面45”)，与第一层接触的第一实体特征体的至少一部分是结合的实体特征体。

根据方面35到方面45中任一方面的进一步的另一方面(“方面46”)，第二层的第一实体特征体通过原纤维连接并且原纤维是可变形的。

根据方面35到方面46中任一方面的进一步的另一方面(“方面47”)，第三层具有约30微米到约200微米的第三厚度。

根据方面35到方面47中任一方面的进一步的另一方面(“方面48”)，第三层包括第二实体特征体，所述第二实体特征体的大部分第二实体特征体间距大于约50微米。

根据方面35到方面48中任一方面的进一步的另一方面(“方面49”)，第三层中大部分第二实体特征体具有小于约40微米的代表性短轴。

根据方面48或方面49的进一步的另一方面(“方面50”)，第三层的第二实体特征体包括非织造或织造纺织品的纤维。

根据方面48到方面50中任一方面的进一步的另一方面(“方面51”)，第三层的第二实体特征体包括织造或非织造纺织品，其中第二代表性短轴是织造或非织造纺织品中纤维的直径。

根据方面35到方面51中任一方面的进一步的另一方面(“方面52”)，第一层、第二层和第三层中的至少两者紧密结合。

根据方面35到方面52中任一方面的进一步的另一方面(“方面53”)，第一层和第二层紧密结合。

根据方面35到方面53中任一方面的进一步的另一方面(“方面54”)，第三层的第三厚度大于第一层的第二厚度与第二层的第一厚度之和。

根据方面35到方面54中任一方面的进一步的另一方面(“方面55”)，第三层的第三厚度是第一层的第二厚度和第二层的第一厚度的总厚度的至少两倍。

根据方面35到方面55中任一方面的进一步的另一方面(“方面56”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者包括聚合物、含氟聚合物膜、非含氟聚合物膜、织造纺织品、非织造纺织品、纤维或纱线的织造或非织造集合、纤维基质以及它们的组合。

根据方面35到方面56中任一方面的进一步的另一方面(“方面57”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者是聚合物。

根据方面57的进一步的另一方面(“方面58”)，聚合物是选自以下的含氟聚合物膜：膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜、氟化乙烯丙烯(FEP)膜和改性的ePTFE膜。

根据方面35到方面58中任一方面的进一步的另一方面(“方面59”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者是膨胀聚四氟乙烯膜。

根据方面35到方面59中任一方面的进一步的另一方面(“方面60”)，第三层是纺粘非织造聚酯材料。

根据方面35到方面60中任一方面的进一步的另一方面(“方面61”)，包括加强组件。

根据方面61的进一步的另一方面(“方面62”)，加强组件的刚度为约0.01N/cm至约5N/cm。

根据方面35到方面62的进一步的另一方面(“方面63”)，包括外部加强组件和内部加强组件。

根据方面35到方面63中任一方面的进一步的另一方面(“方面64”)，第二层的第一实体特征体包括选自以下的一种：热塑性聚合物、聚氨酯、硅酮、橡胶、环氧树脂(epoxies)及其组合。

根据方面35到方面64中任一方面的进一步的另一方面(“方面65”)，包括在其上的表面涂层，所述表面涂层选自抗微生物剂、抗体、药物和生物活性分子。

根据方面35到方面65中任一方面的进一步的另一方面(“方面66”)，包括在其上的亲水性涂层。

根据方面35到方面66中任一方面的进一步的另一方面(“方面67”)，生物相容性膜复合材料是细胞封装装置的形式。

根据一个方面(“方面68”)，细胞封装装置包括(1)第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料，所述第一生物相容性膜复合材料沿其外周的至少一部分与第二生物相容性膜复合材料沿其外周的至少一部分相密封，以在它们之间限定内腔，和(2)至少一个与所述内腔流体连通的填充管，其中第一和第二生物相容性膜中的至少一个包括：具有小于约1微米的MPS(最大孔径)的第一层；具有第一实体特征体的第二层，所述第一实体特征体的大部分第一实体特征体间距小于约50微米，其中大部分第一实体特征体具有约3微米到约20微米的第一短轴；和第三层，该第三层具有有效直径大于约9微米的孔径和第二实体特征体，其中第二实体特征体的大部分第二实体特征体间距大于约50微米。第二层位于第一层和第三层之间。

根据方面68的进一步的另一方面(“方面69”)，第一层的单位面积质量(MpA)小于约5g/m²。

根据方面68到方面69中任一方面的进一步的另一方面(“方面70”)，第一层具有小于约10微米的第一厚度。

根据方面68到方面70中任一方面的进一步的另一方面(“方面71”)，第二层具有小于约60微米的第二厚度。

根据方面68到方面71中任一方面的进一步的另一方面(“方面72”)，生物相容性膜复合材料在最弱轴上的最大拉伸载荷大于约40N/m。

根据方面68到方面72中任一方面的进一步的另一方面(“方面73”)，第一层具有大于约50％的第一孔隙率。

根据方面68到方面73中任一方面的进一步的另一方面(“方面74”)，第二层具有大于约60％的第二孔隙率。

根据方面68到方面74中任一方面的进一步的另一方面(“方面75”)，第二层的第一实体特征体各自具有代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度，其中第二层的代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度中的至少两者的大部分大于约5微米。

根据方面68到方面75中任一方面的进一步的另一方面(“方面76”)，至少一部分的第一实体特征体是紧密结合到第一层的结合的实体特征体。

根据方面76的进一步的另一方面(“方面77”)，第二层的第一实体特征体通过原纤维连接并且原纤维是可变形的。

根据方面68到方面77中任一方面的进一步的另一方面(“方面78”)，第二层具有有效直径为约1微米至约9微米的孔径。

根据方面68到方面78中任一方面的进一步的另一方面(“方面79”)，第三层具有约30微米到约200微米的第三厚度。

根据方面68到方面79中任一方面的进一步的另一方面(“方面80”)，第三层的大部分第二实体特征体间距为约50微米至约90微米。

根据方面68到方面80中任一方面的进一步的另一方面(“方面81”)，第三层中大部分第二实体特征体具有小于约40微米的代表性短轴。

根据方面68到方面81中任一方面的进一步的另一方面(“方面82”)，第一层、第二层和第三层中的至少两者紧密结合。

根据方面68到方面82中任一方面的进一步的另一方面(“方面83”)，第三层的第三厚度大于第一层的第一厚度与第二层的第二厚度之和。

根据方面68到方面83中任一方面的进一步的另一方面(“方面84”)，第三层的第三厚度是第一层的第一厚度和第二层的第二厚度的总厚度的至少两倍。

根据方面68到方面84中任一方面的进一步的另一方面(“方面85”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者包括聚合物、含氟聚合物膜、非含氟聚合物膜、织造纺织品、非织造纺织品、纤维或纱线的织造或非织造集合、纤维基质以及它们的组合。

根据方面68到方面85中任一方面的进一步的另一方面(“方面86”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者是聚合物。

根据方面86的进一步的另一方面(“方面87”)，聚合物是选自以下的含氟聚合物膜：膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜、氟化乙烯丙烯(FEP)膜和改性的ePTFE膜。

根据方面68到方面87中任一方面的进一步的另一方面(“方面88”)，第一层、第二层和第三层中的至少一者是膨胀聚四氟乙烯膜。

根据方面68到方面88中任一方面的进一步的另一方面(“方面89”)，第三层是纺粘非织造聚酯材料。

根据方面68到方面89中任一方面的进一步的另一方面(“方面90”)，第三层的第二实体特征体包括非织造或织造纺织品的纤维。

根据方面68到方面90中任一方面的进一步的另一方面(“方面91”)，第三层的第二实体特征体包括织造或非织造纺织品，第一实体特征体的第二代表性短轴是织造或非织造纺织品中纤维的直径。

根据方面68到方面91中任一方面的进一步的另一方面(“方面92”)，第二层的第一实体特征体包括选自以下的一种：热塑性聚合物、聚氨酯、硅酮、橡胶、环氧树脂(epoxies)及其组合。

根据方面68到方面92中任一方面的进一步的另一方面(“方面93”)，包括在其上的表面涂层，所述表面涂层包括选自以下的一种或多种：抗微生物剂、抗体、药物和生物活性分子。

根据方面68到方面93中任一方面的进一步的另一方面(“方面94”)，包括在其上的亲水性涂层。

根据方面68到方面94的进一步的另一方面(“方面95”)，包括在第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料中至少一者的外部的加强组件。

根据方面68到方面95的进一步的另一方面(“方面96”)，包括内部加强组件。

根据方面96的进一步的另一方面(“方面97”)，内部加强组件包括填充管。

根据方面68到方面97中任一方面的进一步的另一方面(“方面98”)，第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料中的至少一者包括内部加强组件和外部加强组件两者。

根据方面68到方面98中任一方面的进一步的另一方面(“方面99”)，加强组件是织造或非织造纺织品。

根据方面68到方面99中任一方面的进一步的另一方面(“方面100”)，细胞封装装置包括第一熔接膜和第二熔接膜，所述第一熔接膜在第一生物相容性膜复合材料和位于第一生物相容性膜复合材料外部的第一加强组件之间，所述第二熔接膜在第二生物相容性膜复合材料和位于第二生物相容性膜复合材料外部的第二加强组件之间。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面101”)，一种用于降低哺乳动物中血糖水平的方法包括移植细胞封装装置，所述细胞封装装置包含前述方面中任一方面的生物相容性膜复合材料，封装在其中的细胞包括PDX1阳性胰腺内胚层细胞群，其中胰腺内胚层细胞成熟为胰岛素分泌细胞，从而降低血糖。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面102”)，PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞混合物,所述细胞混合物进一步包括内分泌和/或内分泌前体细胞，其中内分泌和/或内分泌前体细胞表达嗜铬粒蛋白A(CHGA)。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面103”)，一种用于降低哺乳动物中血糖水平的方法包括移植如权利要求1所述的细胞封装装置，封装在其中的细胞包括PDX1阳性胰腺内胚层细胞群，其中胰腺内胚层细胞成熟为胰岛素分泌细胞，从而降低血糖。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面104”)，PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞混合物，所述细胞混合物进一步包括内分泌和/或内分泌前体细胞，其中内分泌和/或内分泌前体细胞表达嗜铬粒蛋白A(CHGA)。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面105”)，一种用于降低哺乳动物中血糖水平的方法包括将细胞封装装置移植，所述细胞封装装置包括：具有小于约1微米的MPS(最大孔径)的第一层；具有第一实体特征体的第二层，所述第一实体特征体的大部分第一实体特征体间距小于约50微米，其中大部分第一实体特征体具有约3微米到约20微米的代表性短轴；和第三层，该第三层具有有效直径大于约5微米的孔径和第二实体特征体，该第二实体特征体的大部分第二实体特征体间距大于约50微米，其中第二层位于第一层和第三层之间，其中至少一部分的结合的特征体与第一层紧密结合，以及包括PDX1阳性胰腺内胚层细胞的细胞群，并且其中胰腺内胚层细胞成熟为胰岛素分泌细胞，从而降低血糖。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面106”)，PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞混合物，所述细胞混合物进一步包括内分泌和/或内分泌前体细胞，其中内分泌和/或内分泌前体细胞表达嗜铬粒蛋白A(CHGA)。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面107”)，一种用于降低哺乳动物中血糖水平的方法包括将生物相容性膜复合材料移植，所述生物相容性膜复合材料包括：具有小于约1微米的MPS(最大孔径)的第一层；具有第一实体特征体的第二层，所述第一实体特征体的大部分第一实体特征体间距小于约50微米，其中大部分第一实体特征体具有约3微米到约20微米的代表性短轴；和第三层，该第三层具有有效直径大于约5微米的孔径和第二实体特征体，该第二实体特征体的大部分第二实体特征体间距大于约50微米，其中第二层位于第一层和第三层之间，以及包括PDX1阳性胰腺内胚层细胞的细胞群，其中胰腺内胚层细胞成熟为胰岛素分泌细胞，从而降低血糖。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面108”)，PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞混合物，所述细胞混合物进一步包括内分泌和/或内分泌前体细胞，其中内分泌和/或内分泌前体细胞表达嗜铬粒蛋白A(CHGA)。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面109”)，封装的体外PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞亚群的混合物，其至少包括共表达PDX-1/NKX6.1的胰腺祖细胞群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面110”)，封装的体外PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞亚群的混合物，其至少包括共表达PDX-1/NKX6.1的胰腺祖细胞群和表达PDX-1/NKX6.1和CHGA的胰腺内分泌和/或内分泌前体群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面111”)，群的至少30％包括共表达PDX-1/NKX6.1的胰腺祖细胞群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面112”)，群的至少40％包括共表达PDX-1/NKX6.1的胰腺祖细胞群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面113”)，群的至少50％包括共表达PDX-1/NKX6.1的胰腺祖细胞群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面114”)，群的至少20％包括表达PDX-1/NKX6.1/CHGA的内分泌和/或内分泌前体群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面115”)，群的至少30％包括表达PDX-1/NKX6.1/CHGA的内分泌和/或内分泌前体群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面116”)，群的至少40％包括表达PDX-1/NKX6.1/CHGA的内分泌和/或内分泌前体群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面117”)，胰腺祖细胞和/或内分泌或内分泌前体细胞能够在体内成熟为胰岛素分泌细胞。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面118”)，一种体内产生胰岛素的方法包括移植细胞封装装置，该装置包括前述方面中任一方面的生物相容性膜复合材料和成熟为胰岛素分泌细胞的PDX-1胰腺内胚层细胞群，其中胰岛素分泌细胞响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面119”)，PDX1阳性胰腺内胚层细胞包括细胞混合物，所述细胞混合物进一步包括内分泌和/或内分泌前体细胞，其中内分泌和/或内分泌前体细胞表达嗜铬粒蛋白A(CHGA)。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面120”)，群的至少约30％是表达PDX-1/NKX6.1/CHGA的内分泌和/或内分泌前体群。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面121”)，体外人PDX1阳性胰腺内胚层细胞培养物包括PDX-1阳性胰腺内胚层细胞和至少一种转化生长因子β(TGF-β)受体激酶抑制剂的混合物。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面122”)，还包括骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面123”)，TGF-β受体激酶抑制剂是TGF-β受体1型激酶抑制剂。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面124”)，TGF-β受体激酶抑制剂是ALK5i。

根据前述方面中任一方面的进一步的另一方面(“方面125”)，BMP抑制剂是头蛋白(noggin)。

附图简要说明

包括附图以提供对本公开的进一步理解，附图被并入本说明书中并构成本说明书的一部分，附图示出了实施方式，并且与说明书一起用于解释本公开的原理。

图1A是依据本文所述的实施方式，描绘实体特征体间距的确定的示意图，其中三个相邻实体特征体代表三角形的角，三角形的外接圆的内部没有另外的实体特征体，实体特征体间距是形成三角形的实体特征体中的两个实体特征体之间的直线距离；

图1B是依据本文所述实施方式，描绘非相邻实体特征体的确定的示意图，其中实体特征体形成三角形的角，三角形的外接圆包含至少一个另外的实体特征体；

图2是根据本文描述的实施方式的ePTFE膜中实体特征体(白色形状)之间的间距(白线)的扫描电子显微照片；

图3A是描绘根据本文描述的实施方式的确定实体特征体的长轴和短轴的方法的示意图；

图3B是描绘根据本文描述的实施方式的实体特征体的深度的示意图；

图4是根据本文描述的实施方式的孔的有效直径的示意图；

图5是显示根据本文描述的实施方式的孔径的扫描电子显微照片(SEM)；

图6A是根据本文描述的实施方式定位在细胞不可渗透层表面上的实体特征体形式的热塑性聚合物的示意图；

图6B-6H是根据本文描述的实施方式用于在细胞不可渗透层上形成实体特征体的样品几何结构的示意图；

图7是根据本文描述的实施方式的生物相容性膜复合材料的示意图，该生物相容性膜复合材料中具有结合的实体特征体，其与细胞不可渗透层的表面紧密结合；

图8是根据本文描述的实施方式的生物相容性膜复合材料的示意图，其中缓解层中具有不同高度和宽度的实体特征体；

图9是根据本文描述的实施方式的生物相容性膜复合材料的示意图，该生物相容性膜复合材料具有缓解层，该缓解层中包含作为节点的实体特征体；

图10A-10D是根据本文描述的实施方式的生物相容性膜复合材料的示意图，显示了加强组件的不同位置；

图11A是根据本文描述的实施方式的位于细胞不可渗透层上的缓解层的截面示意图，其中缓解层的特征至少在于实体特征体尺寸、实体特征体间距、实体特征体深度和厚度；

图11B是根据本文描述的实施方式的位于细胞不可渗透层上的缓解层的截面示意图，其中缓解层的特征至少在于实体特征体尺寸、实体特征体间距、实体特征体深度、厚度和孔径；

图12是根据本文描述的实施方式的包含血管化层、缓解层和细胞不可渗透层的生物相容性膜复合材料的横截面示意图，其中血管化层的特征至少在于厚度、孔径、实体特征体尺寸和实体特征体间距；

图13A是根据本文描述的实施方式的细胞封装装置的俯视示意图；

图13B是根据本文所述的实施方式的图13A的电池封装装置的横截面示意图，示出了生物相容性膜复合材料的层的取向和细胞的放置；

图14是根据本文描述的实施方式的由膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜形成的可比较的细胞不可渗透层的顶表面的扫描电子显微照片(SEM)；

图15是根据本文描述的实施方式的由非织造聚酯形成的血管化层的顶表面的SEM图像；

图16是根据本文描述的实施方式的封装装置的分解示意图；

图17是显示根据本文描述的实施方式的比较例1的细胞不可渗透层的表面上存在异物巨细胞的代表性组织学图像；

图18是根据本文描述的实施方式的比较例2的缓解层上具有氟化乙烯丙烯(FEP)不连续层的缓解层的顶表面的SEM图像；

图19是根据本文描述的实施方式的比较例2、实施例2、实施例4和实施例5中所用的ePTFE细胞不可渗透层的顶表面的SEM图像；

图20是根据本文描述的实施方式的比较例2中使用的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图21是根据本文描述的实施方式的比较例2中形成的两层ePTFE复合材料的横截面的SEM图像；

图22是显示根据本文描述的实施方式的比较例2的在细胞不可渗透层上形成的异物巨细胞的代表性组织学图像；

图23是根据本文描述的实施方式的实施例1中使用的ePTFE细胞不可渗透层的顶表面的SEM图像；

图24是根据本文描述的实施方式的实施例1中使用的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图25是根据本文描述的实施方式的实施例1中形成的两层ePTFE复合材料的横截面的SEM图像；

图26是显示根据本文描述的实施方式的实施例1的细胞不可渗透层上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图27是根据本文描述的实施方式的实施例2的其上具有氟化乙烯丙烯(FEP)不连续层的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图28是根据本文描述的实施方式的实施例2的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图29是根据本文描述的实施方式的实施例2中形成的两层ePTFE复合材料的横截面的SEM图像；

图30是根据本文描述的实施方式的实施例3中形成的ePTFE细胞不可渗透层的顶表面的SEM图像；

图31是根据本文描述的实施方式的实施例3中形成的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图32是根据本文描述的实施方式的实施例3中形成的两层ePTFE复合材料的横截面的SEM图像；

图34是根据本文描述的实施方式的实施例4中形成的其上具有FEP不连续层的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图34是根据本文描述的实施方式的实施例4中形成的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图35是根据本文描述的实施方式的实施例4中形成的两层ePTFE复合材料的横截面的SEM图像；

图36是显示根据本文描述的实施方式的实施例4的细胞不可渗透层上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图37是根据本文描述的实施方式的实施例5的其上具有FEP不连续层的ePTFE缓解层的顶表面的SEM图像；

图38是根据本文描述的实施方式的实施例5中使用的ePTFE血管化层的顶表面的SEM图像；

图39是根据本文描述的实施方式的实施例5中形成的三层复合材料的横截面的SEM图像；

图40是根据本文描述的实施方式的插入式加强组件的俯视示意图；

图41是根据本文描述的实施方式的平面装置的分解示意图；

图42是根据本文描述的实施方式的平面装置的表面的俯视图像；

图43A是根据本文描述的实施方式的沿线A-A截取的图42的平面装置的横截面图像，显示了单个点结合和内腔；

图43B是根据本文描述的实施方式的沿线B-B截取的图42的平面装置的横截面图像，显示了两个点结合和内腔；

图44是显示根据本文描述的实施方式的实施例6的细胞不可渗透层上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图45是显示根据本文描述的实施方式的实施例2的不可渗透层的表面上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图46是显示根据本文描述的实施方式的实施例3的不可渗透层的表面上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图47是显示根据本文描述的实施方式的实施例5的不可渗透层的表面上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图48是显示根据本文描述的实施方式的实施例6的不可渗透层的表面上不存在异物巨细胞形成的代表性组织学图像；

图49A是显示根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体A中的体内细胞活力的代表性组织学图像；

图49B是显示根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体B中的体内细胞活力的代表性组织学图像；

图49C是显示根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体C中的体内细胞活力的代表性组织学图像；

图50是根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体A中的第三ePTFE膜的节点和原纤维结构的代表性SEM图像；

图51是根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体B中的第三ePTFE膜的节点和原纤维结构的代表性SEM图像；

图52是根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体C中的第三ePTFE膜的节点和原纤维结构的代表性SEM图像；

图53是根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体A的第三ePTFE膜的横截面的SEM图像；

图54是根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体B的第三ePTFE膜的横截面的SEM图像；

图55是根据本文描述的实施方式的实施例7的构建体C的第三ePTFE膜的横截面的SEM图像；

图56是显示根据本文描述的实施方式在其上具有FEP的构建体A、B和C的第二ePTFE层的代表性表面微结构的SEM图像。

具体实施方式

本领域的技术人员容易理解，可通过构造以实施所需作用的任何数量的方法和设备来实现本公开内容的各个方面。还应注意，本文参考的附图不一定是按比例绘制，而是有可能放大以说明本公开的各个方面，就此而言，附图不应视为限制性的。诸如“上”、“下”、“顶”、“左”、“右”、“前”和“后”等方向描述旨在指代组件和方向所涉及的图(或多个图)中所示和描述的取向。应当理解，术语“生物相容性膜复合材料”和“膜复合材料”在本文中可互换使用。应当注意，本文描述的所有范围本质上都是示例性的并且包括其间的任何和所有值。此外，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。

本公开涉及一种生物相容性膜复合材料。该膜复合材料包含第一层、第二层和第三层。每一层都是不同的，并为封装细胞的存活提供必要的功能。在某些实施方式中，第一层起到细胞不可渗透层的作用，第二层起到缓解层的作用，第三层起到血管化层的作用。在本文中，为方便起见，术语“第一层”与“细胞不可渗透层”可互换使用，术语“第二层”与“缓解层”可互换使用，术语“第三层”与“血管化层”可互换使用。每一层都是独特的，提供支持封装细胞存活的独特功能。缓解层位于细胞不可渗透层和血管化层之间，减少细胞不可渗透层表面上异物巨细胞的形成。在至少一个实施方式中，缓解层包括存在于形成缓解层的膜中的实体特征体(例如，节点)。在另一些实施方式中，缓解层包括在细胞不可渗透层的表面上提供和/或形成的实体特征体(例如，印刷的实体特征体)。在一些实施方式中，细胞不可渗透层和缓解层彼此紧密结合或以其他方式彼此连接以形成具有紧密/开放结构的复合层。如本文所用，术语“紧密结合”和“紧密地结合”是指生物相容性复合材料的层或生物相容性复合材料内的实体特征体在其表面上的任何点处都不易分离或脱离。加强组件可以任选地位于生物相容性膜复合材料的任一侧上(即，外部)或生物相容性膜复合材料内(即，内部)以提供对膜复合材料的支撑并防止其扭曲。在本文中，“加强组件”可以进一步描述为在细胞封装装置的外部或内部，并且可以是营养物质不可渗透的或营养物质可渗透的。生物相容性膜复合材料可用于或形成用于封装生物体和/或细胞群的装置。应当理解，本文所用的术语“约”表示指定测量单位的+/-10％。

适用于生物相容性膜复合材料的生物体包括但不限于细胞、病毒、病毒载体、基因治疗、细菌、蛋白质、多糖、抗体和其它活性生物体。应当理解，如果本文选择使用除细胞之外的生物体，则生物体的生物活性组分或产物需要能够穿过细胞不可渗透层，而不是生物体本身。为简单起见，本文将生物体称为细胞，但本说明书中的任何内容均不将生物体限制为细胞或任何特定类型的细胞，并且以下描述也适用于不是细胞的生物体。

各种类型的原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞和/或干细胞可以与本文所述的生物相容性膜复合材料一起使用。在一些实施方式中，细胞分泌治疗有用的物质。此类治疗有用的物质包括激素、生长因子、营养因子、神经递质、淋巴因子、抗体或为装置接受者提供治疗益处的其他细胞产品。此类治疗性细胞产物的实例包括但不限于胰岛素和其他胰腺激素、生长因子、白细胞介素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、转铁蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、原弹性蛋白、外泌体、囊泡、遗传片段和因子VIII。合适的生长因子的非限制性实例包括血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、血小板活化因子、转化生长因子骨形态发生蛋白、激活素、抑制素、成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、胶质细胞源性神经营养因子、生长分化因子-9、表皮生长因子和它们的组合。

如上所述，生物相容性膜复合材料包括第一层(即细胞不可渗透层)。细胞不可渗透层用作微孔性免疫隔离屏障，不受血管向内生长的影响，并防止细胞与宿主接触。在本文中，不具有足够大以允许细胞向内生长的开口的层可被称为“紧密”层。细胞不可渗透层的孔足够小，以允许细胞营养物、氧气、废物和治疗物质从中通过而不允许任何细胞通过。因为细胞不可渗透层具有足够小以防止血管向内生长的MPS，所以有必要平衡细胞不可渗透层的参数，这些参数也可能对细胞不可渗透层的传质和扩散特性产生负面影响。例如，虽然MPS足够小以防止细胞进入或血管向内生长，但细胞不可渗透层足够开放以允许分子(即营养物质和治疗分子)从中通过。具有足够大以允许细胞向内生长的开口的层可被称为“开放”层。

通过使细胞不可渗透层保持薄、多孔和低质量，进一步尽可能减小扩散阻力。应当理解，细胞不可渗透层的足够孔隙率被保持以允许分子通过。在某些实施方式中，细胞不可渗透层的孔隙率大于约50％、大于约60％、大于约70％或大于约80％。此外，孔隙率可以在约50％至约98％、约50％至约90％、约50％至约80％或约60％至约90％的范围内。还应理解，细胞不可渗透层的足够耐久性和强度得以维持，从而通过确保该紧密层的完整性，在预期使用中在体内提供免疫隔离。因此，有必要在强度和扩散阻力的竞争特性之间进行权衡平衡。在某些实施方式中，细胞不可渗透层的最弱轴的最大拉伸载荷大于约40N/m、大于约130N/m、大于约260N/m、大于约600N/m、或大于约1000N/m。此外，最弱轴的最大拉伸载荷范围可以从约40N/m到约2000N/m，40N/m到约780N/m，40N/m到约350N/m，约130N/m到约2000N/m，约130N/m到约450N/m，或约260N/m到约2000N/m。

在某些实施方式中，细胞不可渗透层具有正交方向(D1,D2)的拉伸强度组合，其导致几何平均拉伸强度大于约20MPa、大于约50MPa、大于约100MPa、或大于约150MPa，几何平均拉伸强度由下式定义：

细胞不可渗透层的几何平均拉伸强度可以在约20MPa至约180MPa、约30MPa至约150MPa、约50MPa至约150MPa、或约100MPa至约150MPa的范围内。

在一些实施方式中，通过孔隙率测定法测量的细胞不可渗透层的MPS小于约1微米、小于约0.50微米、小于约0.30微米或小于约0.10微米。通过孔隙率测定法测量的MPS可为约0.05微米至约1微米，约0.1微米至约0.80微米，约0.1微米至约0.6微米，约0.1微米至约0.5微米，或约0.2微米至约0.5微米。

另外，细胞不可渗透层具有小于约30微米、小于约20微米、小于约10微米或小于约5微米的厚度。厚度可以为约1微米至约30微米、约1微米至约20微米、约1微米至约10微米、约5微米至约10微米、或约1微米至约5微米。细胞不可渗透层的单位面积质量(MpA)可以小于约25g/m²、小于约20g/m²、小于约10g/m²、小于约5g/m²或小于约3g/m²。MpA可以在约3g/m²至约25g/m²、约0.5g/m²至约20g/m²、约0.5g/m²至约10g/m²、或约0.5g/m²至约5g/m²的范围内。

如前所述，生物相容性膜复合材料包括第二层(即缓解层)，其足够多孔以允许血管组织生长到缓解层中，并且在一些情况中，也用作初始血管化层。缓解层创建合适的环境以最小化、减少、抑制或者甚至防止异物巨细胞的形成，同时允许进入细胞不可渗透层处的血管。血管组织向内生长到缓解层中促进了营养物质通过细胞不可渗透层的转移。在本文中，具有足够大以允许血管向内生长的开口的层可被称为“开放”层。血管是用于植入细胞的氧和营养物质的来源，需要在缓解层中形成，以便它们足够靠近细胞不可渗透层，从而使营养物质扩散到任何封装细胞的距离最小化。细胞不可渗透层的薄化有助于减小必然发生扩散的距离。

血管组织通过缓解层向内生长直至细胞不可渗透层促进了营养物质通过细胞不可渗透层的转移。缓解层创造了一种环境，该环境使得血管能够充分形成到与细胞不可渗透层相邻的缓解层中，而不是形成异物巨细胞。结果，如实施例中所示，异物巨细胞没有形成在细胞不可渗透层和缓解层的界面处，由此避免异物细胞阻碍充分的血管化。需要注意的是，异物巨细胞可以独立地形成在细胞不可渗透层和缓解层的界面处，但它们不会阻碍或阻止封装的细胞生长所需的血管化。

缓解层的特征至少部分在于包括多个具有实体特征体间距的实体特征体，这将在下文中详细讨论。如本文所用，“实体特征体”可定义为缓解层和/或血管化层内的三维组件，当暴露于环境力例如但不限于细胞运动(例如细胞迁移和向内生长、宿主血管化/内皮血管形成)时，这些三维组件通常是不可移动且不易变形的。为了促进减少或减轻异物巨细胞屏障在细胞不可渗透层处的形成，与缓解层相邻的细胞不可渗透层表面邻接的实体特征体有助于防止多个巨噬细胞在该界面处融合成多核异物巨细胞。在一些实施方式中，与细胞不可渗透层邻接的缓解层中的实体特征体紧密地邻接到细胞不可渗透层,在本文中被称为“结合的实体特征体”。“非结合的实体特征体”是缓解层内未结合(未紧密结合或未以其他方式结合)到细胞不可渗透层的那些实体特征体。缓解层中的实体特征体可由例如热塑性聚合物、聚氨酯、硅酮、橡胶、环氧树脂及其组合形成。

在一些实施方式中，缓解层的实体特征体从由细胞不可渗透层限定的平面向外突出。在这样的实施方式中，从细胞不可渗透层突出的缓解层的实体特征体可以与细胞不可渗透层紧密结合并间隔开，使得它们在这个紧密的、细胞不可渗透的界面处对异物巨细胞的形成提供阻挡或屏障。在一些实施方式中，实体特征体可以是缓解层的特征体(例如节点)，并且可以彼此连接，例如通过原纤维或纤维连接。在另一些实施方式中，可以在细胞不可渗透层的表面上提供和/或以其他方式形成实体特征体(例如，印刷的实体特征体)，使得实体特征体从由细胞不可渗透层限定的平面向外突出。

在缓解层具有节点和原纤维微结构(例如由原纤化聚合物形成)的实施方式中，节点是实体特征体，原纤维不是实体特征体。实际上，在一些实施方式中，可以去除原纤维，仅在缓解层中留下节点。在缓解层内的节点是实体特征体的实施方式中，结合到细胞不可渗透层的那些节点是结合的实体特征体。在至少一个实施方式中，缓解层由具有节点和原纤维微结构的膨胀四氟乙烯(ePTFE)膜形成。

对于需要快速扩散时间的应用，缓解层的实体特征体不会对生物相容性膜复合材料的整体扩散阻力产生负面影响。缓解层的实体特征体具有足够小的尺寸，使得它们不会干扰扩散穿过细胞不可渗透层所需的多孔区域的量。此外，缓解层的厚度足够薄，以便在植入后的急性期最大限度地从间质将氧和营养物质大量传输到封装细胞。实体特征体之间的空间足够开放，以允许宿主组织容易和快速地穿透/整合到细胞不可渗透层(即紧密层)，从而缩短急性期的持续时间。“急性期”在本文中定义为宿主细胞/血管浸润之前的时间段。

与细胞不可渗透层相邻的实体特征体的大部分实体特征体间距小于约50微米，小于约40微米，小于约30微米，小于约20微米或小于约10微米。如本文所用，术语“大部分”意在描述超过一半(即，大于50％)的量为被测量参数的测量值。另外，短语“实体特征体间距”在本文中被定义为两个相邻实体特征体之间的直线距离。在本公开中，如果实体特征体的质心表示外接圆具有空内部的三角形的角，则实体特征体被认为是相邻的。如图1A所示，指定的实体特征体(P)连接到相邻实体特征体(N)以形成三角形100，其中外接圆110内不包含实体特征体。实体特征体(X)表示不是相邻实体特征体的实体特征体。因此，在图1A所示的情况中，实体特征体间距130是指定实体特征体(P)、(N)之间的直线距离。相比之下，图1B中所示的从三角形160绘出的外接圆150在其内部包含实体特征体(N)，因此不能用于确定缓解层(或血管化层)中的实体特征体间距。图2是描绘测量距离的扫描电子显微照片，例如由膨胀聚四氟乙烯膜形成的缓解层中的实体特征体210(白色形状)之间的白线200。在一些实施方式中，大部分实体特征体间距的范围可以为约5微米到约45微米、约10微米到约40微米、约10微米到约35微米、或约15微米到约35微米。

实体特征体还包括代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度。实体特征体的代表性短轴在本文中被定义为拟合到实体特征体的椭圆的短轴的长度，其中该椭圆具有与实体特征体相同的面积、取向和质心。实体特征体的代表性长轴在本文中被定义为拟合到实体特征体的椭圆的长轴的长度，其中该椭圆具有与实体特征体相同的面积、取向和质心。长轴的长度大于或等于短轴的长度。层的代表性短轴和代表性长轴是该层中所有测量的代表性短轴和代表性长轴的各自的中值。拟合实体特征体310的椭圆320的短轴和长轴在图3A中以图形方式示出。实体特征体310的代表性短轴由箭头300描绘，而实体特征体310的代表性长轴由箭头330描绘。缓解层中大部分实体特征体的短轴的尺寸范围为约3微米到约20微米，约3微米到约15微米，或约3微米到约10微米。实体特征体深度是实体特征体在垂直于层(例如，缓解层或血管化层)表面的轴上的投影长度。实体特征体310的实体特征体深度在图3B中以图形方式示出。实体特征体310的深度由线340描绘。在至少一个实施方式中，实体特征体的深度等于或小于缓解层的厚度。层的实体特征体深度是该层中所有测量的实体特征体深度的中值。在至少一个实施方式中，层中代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度中的至少两者的大部分大于5微米。

在实体特征体通过原纤维或纤维互连的实施方式中，连接实体特征体的边界产生孔。这些孔必须足够开放，以允许细胞快速向内生长和血管化，并且不会对氧和营养物质的传质产生阻力。孔有效直径通过定量图像分析(QIA)测量并在扫描电子显微照片(SEM)图像上进行。孔的“有效直径”定义为面积等于表面孔的测量面积的圆的直径。这种关系由以下等式定义：

参考图4，有效直径是圆400的直径，表面孔由附图标记420表示。表面的总孔面积是该表面上所有孔的面积之和。层的孔径是孔的有效直径，其定义了满足以下条件的一个孔径：总孔面积的大约一半由直径小于该孔径的孔组成，并且总孔面积的一半由直径大于或等于该孔径的孔组成。图5示出了孔径500(白色)、孔径较小的孔510(以浅灰色显示)和孔径较大的孔520(以深灰色显示)。与图像530的边缘相交的孔被排除在分析之外并以黑色显示。

缓解层的孔径可以在约1微米至约9微米的有效直径、约3微米至约9微米的有效直径、或约4微米至约9微米的有效直径的范围内，所述有效直径是通过在SEM图像上进行的定量图像分析(QIA)测量的。此外，缓解层具有小于约60微米、小于约50微米、小于约40微米、小于约30微米或小于约20微米的厚度。缓解层的厚度范围可以为约3微米到约60微米，约10微米到约50微米，约10微米到约40微米，或者约15微米到约35微米。在一些实施方式中，缓解层具有大于约60％的孔隙率。在其他实施方式中，缓解层具有大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％的孔隙率。在一些实施方式中，孔隙率可以是约98％或约99％。缓解层的孔隙率可以在约60％至约98％、约70％至约98％、或约80％至约98％的范围内。

如上所述，生物相容性膜复合材料还包括第三层(即血管化层)。血管化层是“开放”层，其允许来自宿主的额外血管渗透以及生物相容性膜复合材料在宿主组织内快速锚定和附着。此外，血管化层提供多孔基质以容纳足够量的额外新血管的生长，以喂养封装细胞。血管化层被设计成具有实体特征体，从而能够实现宿主的整合和附着。由于血管化层不满足与缓解层相同的标准，因此两者是独立且不同的层。与缓解层的实体特征体相比，血管化层的实体特征体之间具有增加的间距和孔径，以促进组织或血管更快速地向内生长到血管化层中。在一些实施方式中，血管化层中实体特征体的大部分实体特征体间距大于约50微米，大于约60微米，大于约70微米或大于约80微米。血管化层中的大部分实体特征体的实体特征体间距在约50微米到约90微米、约60微米到约90微米、或约70微米到约90微米的范围内。

血管化层的孔径和总厚度足以提供空间来容纳必要量的额外血管，从而为细胞提供营养和氧。血管化层的孔径可以为大于约9微米的有效直径、大于约25微米的有效直径、大于约50微米的有效直径、大于约75微米的有效直径、大于约100微米的有效直径、大于约125微米的有效直径，大于约150微米的有效直径、大于约175微米的有效直径，或大于约200微米的有效直径，所述有效直径是通过在SEM图像上进行的QIA来测量的。在一些实施方式中，血管化层的孔径的范围可以为约9微米的有效直径到约200微米的有效直径，约9微米的有效直径到约50微米的有效直径，约15微米的有效直径到约50微米的有效直径，约25微米的有效直径到约50微米的有效直径，约50微米的有效直径到约200微米的有效直径，约75微米的有效直径到约175微米的有效直径，所述有效直径是通过在SEM图像上进行的QIA来测量的。

此外，血管化层的厚度可以大于约30微米、大于约50微米、大于约75微米、大于约100微米、大于约125微米、大于约150微米或大于约200微米。此外，血管化层的厚度可在约30微米至约300微米、约30微米至约200微米、约30微米至约100微米、约100微米至约200微米、或约100微米至约150微米的范围内。在至少一个实施方式中，血管化层的厚度是细胞不可渗透层和缓解层的总厚度的至少两倍。在一些实施方式中，血管化层的厚度大于细胞不可渗透层的厚度和缓解层的厚度之和。此外，血管化层中的大部分实体特征体具有小于50微米、小于约40微米、小于约30微米、小于约20微米、小于约10微米、小于约5微米、或小于约3微米的代表性短轴。在一些实施方式中，血管化层中的大部分实体特征体的代表性短轴的尺寸范围为约3微米至约40微米、约3微米至约30微米、约3微米至约20微米，约3微米至约10微米，或约20微米至约40微米。血管化层中存在的实体特征体还具有长轴，该长轴的长度大于短轴，并且可能实际上长度是无限的，例如非织造物的连续纤维。血管化层中的实体特征体还具有小于或等于血管化层总厚度的深度。

在一些实施方式中，包括细胞不可渗透层的生物相容性膜复合材料被穿孔而具有离散设置的孔。可以选择穿孔的尺寸、数量和位置以优化细胞功能。可能存在少至一(1)个穿孔。穿孔具有足够的尺寸以允许宿主血管组织(例如毛细血管)穿过生物相容性膜复合材料以支持例如封装的胰腺细胞类型。虽然细胞不可渗透层在不存在穿孔的位置保持其作为微孔免疫隔离屏障的功能，但由于在细胞不可渗透层已被去除的一些部分的离散穿孔，细胞不可渗透层整体不再是细胞不可渗透的，因为离散的穿孔允许宿主的血管向内生长和细胞接触通过生物相容性膜复合材料。因为包含穿孔的细胞不可渗透层的细胞封装装置实施方式允许宿主免疫细胞与细胞接触，细胞不再受到保护免于免疫排斥，除非宿主免疫受损或用免疫抑制药物进行了处理。

可向生物相容性膜复合材料提供任选的加强组件以使体内变形最小化，从而保持细胞床厚度(例如，在封装的装置中)。这种额外的任选的加强组件为生物相容性膜复合材料提供了大于生物相容性膜复合材料本身的刚度，从而提供机械支撑。这种任选的加强组件在本质上可以是连续的，或者其可以存在于生物相容性膜复合材料上的离散区域中，例如，在生物相容性膜复合材料的整个表面上形成图案或位于多个特定位置，例如围绕生物相容性膜复合材料的周边。适用于膜复合材料表面上的加强组件的非限制性图案包括点、直线、斜线、曲线、虚线、网格等。形成加强组件的图案可以单独使用或组合使用。此外，加强组件本质上可以是暂时的(例如，由生物可吸收材料形成)或本质上可以是永久性的(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)网或镍钛诺(Nitinol))。如本领域普通技术人员所理解的，组件刚度的影响不仅取决于单个组件的刚度，还取决于加强组件在最终装置形式中的位置和约束。为了使组件(例如，加强组件)实际上可用于增加生物相容性复合膜的刚度，该加强组件应具有大于约0.01N/cm的刚度，尽管所需刚度的最终确定将取决于在成品细胞封装装置中的位置和约束。在一些实施方式中，加强组件可以具有约0.01N/cm到约5N/cm、约0.05N/cm到约4N/cm、约0.1N/cm到约3N/cm，或约0.3N/cm到约2N/cm的刚度。

在至少一个实施方式中，可以在血管化层的外表面上提供加强组件以增强生物相容性膜复合材料对环境力的抵抗。在该方向上，加强组件具有足以允许血管向内生长的孔径，因此被认为是“开放”层。可用作加强组件的材料包括相对于生物相容性膜复合材料具有显著更高的刚度的材料。此类材料包括但不限于单独或组合的开放网状生物材料纺织品、织造纺织品、非织造纺织品(例如，纤维或纱线的集合)和纤维基质。在另一个实施方式中，图案化的网格、筛网、股线或棒可以用作加强组件。加强组件可以定位在与细胞不可渗透层相邻的生物相容性膜的外表面上(参见例如图10C)。在该取向中，加强组件可以是细胞不可渗透和营养不可渗透的致密层，只要在加强组件和细胞不可渗透层之间存在足够的间距以供细胞驻留即可。此外，加强组件可以在离散区域处的复合层内或复合层之间定向，或者复合层本身也可以是加强组件(参见例如图10A、10B和10D)。应当理解，加强组件可以位于生物相容性膜的外部、内部或之中，或上述情况的组合。

在至少一个实施方式中，细胞不可渗透层、缓解层和血管化层通过一种或多种生物相容性粘合剂结合在一起以形成生物相容性膜复合材料。粘合剂可以以在层之间产生离散或紧密结合的方式施加到细胞不可渗透层、缓解层和血管化层中的一者或多者的表面上。如本文所用，短语“离散结合”或“离散地结合”意在包括围绕限定区域的连续周边的点和/或线的有意图案的结合或连接。合适的生物相容性粘合剂的非限制性示例包括氟化乙烯丙烯(FEP)，聚碳酸酯聚氨酯，由TFE和PAVE组成的热塑性含氟聚合物，EFEP(乙烯氟化乙烯丙烯)，PEBAX(聚醚酰胺)，PVDF(聚偏二氟乙烯)，(硅酮聚碳酸酯聚氨酯)，Elasthane^TM(聚醚聚氨酯)，/>(硅酮聚醚聚氨酯)，聚乙烯，高密度聚乙烯(HDPE)，乙烯氯四氟乙烯(ECTFE)，全氟烷氧基(PFA)，聚丙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)以及它们的组合。缓解层可以与细胞不可渗透层紧密结合。血管化层可以紧密或离散地结合到缓解层。在至少一个实施方式中，缓解层与细胞不可渗透层紧密结合。在一些实施方式中，细胞不可渗透层和缓解层作为复合层共同膨胀。在细胞不可渗透层和缓解层或细胞不可渗透层、缓解层和血管化层的实施方式中，测量的复合z-强度可以大于100kPa。另外，测量的复合z-强度的范围可以为约100kPa到约1300kPa，约100kPa到约1100kPa，约100kPa到约900kPa，约100kPa到约700kPa，约100kPa到约500kPa，约100kPa到约300kPa，或约100kPa到约200kPa。

细胞不可渗透层、缓解层和血管化层中的至少一者可以由聚合物膜、或者纤维或纱线的织造或非织造集合、或者纤维基质单独或组合地形成。可以用于细胞不可渗透层、缓解层和血管化层中的任一者或全部的聚合物的非限制性实例包括但不限于藻酸盐；醋酸纤维素；聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇和聚丙二醇；泛乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇；壳聚糖；聚丙烯酸酯，例如聚甲基丙烯酸羟乙酯；琼脂糖；水解聚丙烯腈；聚丙烯腈共聚物；聚乙烯基丙烯酸酯，例如聚乙烯-共-丙烯酸，聚烯烃，例如聚丙烯、聚乙烯；聚偏二氟乙烯；氟化乙烯丙烯(FEP)；全氟烷氧基烷烃(PFA)；聚酯砜(PES)；聚氨酯；聚酯；以及它们的共聚物和组合。

在一些实施方式中，形成细胞不可渗透层、缓解层和/或血管化层的聚合物膜的聚合物是可原纤化的聚合物。如本文所用的，可原纤化是指将原纤维引入聚合物膜的能力，例如但不限于将实体特征体的一些部分转化为原纤维。例如，原纤维是跨越实体特征体之间的间隙的实体元件。原纤维在暴露于环境力时通常对变形没有抵抗力，因此是可变形的。大部分可变形原纤维的直径可小于约2微米、小于约1微米、小于约0.75微米、小于约0.50微米或小于约0.25微米。在一些实施方式中，原纤维可具有约0.25微米至约2微米、约0.5微米至约2微米、或约0.75微米至约2微米的直径。

可用于形成细胞不可渗透层、缓解层和血管化层中的一者或多者的可原纤化聚合物的非限制性实例包括但不限于四氟乙烯(TFE)聚合物，例如聚四氟乙烯(PTFE)，膨胀PTFE(ePTFE)，改性的PTFE，TFE共聚物，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚(对二甲苯)(ePPX)(如Sbriglia的美国专利公开第2016/0032069号中教导的)，多孔超高分子量聚乙烯(eUHMWPE)(如Sbriglia的美国专利第9,926,416号中教导的)，多孔乙烯四氟乙烯(eETFE)(如Sbriglia的美国专利第9,932,429号中教导的)，以及多孔偏二氟乙烯-共-四氟乙烯或三氟乙烯[VDF-共-(TFE或TrFE)]聚合物(如Sbriglia的美国专利第9,441,088号中教导的)，以及它们的组合。

在一些实施方式中，可原纤化聚合物是含氟聚合物膜，例如膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜。膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜(和其他原纤化的聚合物)具有节点和原纤维微结构，其中节点通过原纤维相互连接，孔是整个膜中位于节点和原纤维之间的空间。如本文所用，术语“节点”旨在表示主要由聚合物材料组成的实体特征体。当存在可变形的原纤维时，这些节点位于多个原纤维的接合处。在一些实施方式中，可以从膜去除原纤维，例如通过等离子体蚀刻来进行。在至少一个实施方式中，在细胞不可渗透层、缓解层和血管化层中的一者或多者中使用膨胀聚四氟乙烯膜。在本文中可以使用膨胀聚四氟乙烯膜，例如但不限于根据以下专利文献中描述的方法制备的那些：戈尔(Gore)的美国专利第3,953,566号，Bacino等人的美国专利第7,306,729号，Bacino的美国专利第5,476,589号，Bacino的WO94/13469，Branca等人的美国专利第5,814,405号，或Branca等人的美国专利第5,183,545号。

在一些实施方式中，细胞不可渗透层、缓解层和血管化层中的一者或多者由含氟聚合物膜形成，例如但不限于膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜，改性ePTFE膜，四氟乙烯(TFE)共聚物膜，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或氟化乙烯丙烯(FEP)膜。在另一些实施方式中，血管化层可以包括生物相容性纺织品，包括织造织物和非织造织物(例如纺粘非织造物、熔喷纤维材料、电纺纳米纤维等)，非含氟聚合物膜，例如聚偏二氟乙烯(PVDF)，纳米纤维，聚砜，聚醚砜，聚芳基砜，聚醚醚酮(PEEK)，聚乙烯，聚丙烯和聚酰亚胺。在一些实施方式中，血管化层是纺粘聚酯或膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)膜。

在一些实施方式中，缓解层、血管化层或加强组件中的至少一者由非织造织物形成。有许多类型的非织造织物，每种非织造织物在编织的紧密度和片材的厚度方面可能不同。长丝的横截面可以是三叶形的。非织造织物可以是结合织物、成形织物或通过除编织或针织以外的工艺制造的工程织物。在一些实施方式中，非织造织物是多孔的、类似纺织品的材料，通常呈平板形式，主要或完全由纤维组成，例如组装成网、片或毡的短纤维。非织造织物的结构基于例如通常随机排列的短纤维的排列。此外，非织造织物可以通过纺织工业中已知的各种技术制造。各种方法可以产生梳理、湿法成网、熔喷、纺粘或气流成网的非织造材料。非限制性方法和基材在例如授予Colter等人的美国专利公开第2010/0151575号中有所描述。在一个实施方式中，非织造织物是聚四氟乙烯(PTFE)。在另一个实施方式中，非织造织物是纺粘聚酯。非织造织物的密度可根据加工条件而变化。在一个实施方式中，非织造织物是纺粘聚酯，其基重为约0.40至约1.00(oz/yd²)，标称厚度为约127微米至约228微米，且纤维直径为约0.5微米至约26微米。长丝的横截面是三叶形的。在一些实施方式中，非织造织物是生物可吸收的。

在一些实施方式中，可能希望血管化层和加强组件中的一者或多者是非永久性的(例如，可生物降解的)。在这种情况下，可以使用可生物降解材料来形成血管化层和/或加强组件。可生物降解材料的合适例子包括但不限于聚乙交酯:三亚甲基碳酸酯(PGA:TMC)，聚α羟基酸，例如聚乳酸，聚乙醇酸，聚(乙交酯)和聚(丙交酯-共-己内酯)，聚(己内酯)，聚(碳酸酯)，聚(二噁烷酮)，聚(羟基丁酸酯)，聚(羟基戊酸酯)，聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)，膨胀聚对二甲苯(ePLLA)，例如Sbriglia的美国专利公开第2016/0032069号中教导的，以及它们的共聚物和共混物。或者，血管化层可以涂覆有生物可吸收材料，或者生物可吸收材料可以以粉末形式结合到血管化层中或结合到血管化层上。涂覆的材料可促进感染部位减少、血管形成和有利的1型胶原沉积。

生物相容性膜复合材料可至少部分地在其上具有表面涂层，例如两性离子防污涂层、亲水性涂层或/肝素涂层(可从W.L.戈尔及同仁股份有限公司(W.L.Gore&Associates,Inc.)商购获得)。作为附加或替代方式，表面涂层可以包含抗微生物剂、抗体(例如抗CD 47抗体(抗纤维化))、药物和其他生物活性分子(例如血管化刺激剂，例如FGF、VEGF、内皮糖蛋白、PDGF、血管生成素、和整联蛋白；抗纤维化剂，例如TGFb抑制剂、西罗莫司、CSF1R抑制剂和抗CD 47抗体；抗炎/免疫调节剂(例如CXCL12和皮质类固醇)以及它们的组合。

在一些实施方式中，缓解层和血管化层中的一者或两者的实体特征体可通过以下方式来形成：将聚合物(例如，热塑性材料)微光刻、微成型、机械加工或印刷(或以其他方式铺设)到细胞不可渗透层上以形成至少一部分的实体特征体。可以利用任何常规印刷技术，例如转移涂布、丝网印刷、凹版印刷、喷墨印刷、图案化吸收和刮刀涂布，将热塑性聚合物设置在细胞不可渗透层上。图6A示出了位于细胞不可渗透层610上的实体特征体620形式的热塑性聚合物(在印刷完成之后)，其中实体特征体620具有特征体间距630。用于形成实体特征体的几何结构的非限制性示例包括但不限于虚线(参见图6B)、点和/或虚线(参见图6C、6G)、几何形状(参见图6H)、直线(参见图6D)、斜线(参见图6F)、曲线、网格(参见图6E)等，以及它们的组合。

用于形成缓解层的实体特征体的材料包括但不限于聚氨酯，聚丙烯，聚乙烯，聚醚酰胺，聚醚醚酮，聚苯砜，聚砜，硅酮聚碳酸酯聚氨酯，聚醚聚氨酯，聚碳酸酯聚氨酯，硅酮聚醚聚氨酯，聚酯，聚酯对苯二甲酸酯，可熔融加工的含氟聚合物，例如氟化乙烯丙烯(FEP)，四氟乙烯-(全氟烷基)乙烯基醚(PFA)，乙烯和四氟乙烯的交替共聚物(ETFE)，四氟乙烯(TFE)、六氟丙烯(HFP)和偏二氟乙烯(THV)的三元共聚物，聚偏二氟乙烯(PVDF)以及它们的组合。在一些实施方式中，聚四氟乙烯可用于形成图案特征。在另一些实施方式中，实体特征体可以单独形成并粘附到细胞不可渗透层的表面(未示出)。

图7中描绘了生物相容性膜复合材料700，其包括细胞不可渗透层710、缓解层720、血管化层730和任选的加强层740。在所描绘的实施方式中，实体特征体750结合到细胞不可渗透层710的表面以形成缓解层720内的结合特征体。在一些实施方式中，实体特征体750不渗透到血管化层730的孔中。实体特征体750在图7中描绘为基本上具有相同的高度和宽度，并且在细胞不可渗透层710和血管化层730之间延伸，但是应当理解这是一个示例，实体特征体750可以在高度和/或宽度上变化。实体特征体750之间的距离是实体特征体间距760。

图8是另一种生物相容性膜复合材料800，其包括细胞不可渗透层810、缓解层820、血管化层830和任选的加强层840。在所描绘的生物相容性膜复合材料中，实体特征体850，880是高度和宽度不同的节点，并且可以延伸细胞不可渗透层810和血管化层830之间的距离或不延伸细胞不可渗透层810和血管化层830之间的距离。实体特征体850，880由原纤维870连接。在图8中，大部分实体特征体深度小于缓解层820的总厚度。实体特征体880是结合的实体特征体。

参考图9，描绘了一种生物相容性膜复合材料900，其包括细胞不可渗透层910、缓解层920、血管化层930和任选的加强层940。在该实施方式中，缓解层920内的实体特征体是缓解层920的节点，其形成在ePTFE膜中。节点950，980通过原纤维970互连。节点950、980位于缓解层920内。但是，节点980不仅在缓解层920内，而且还与细胞不可渗透层910接触并且与之紧密结合。

如上所述，加强部件可以在离散区域处的复合层内或复合层之间定向。在图10A所示的一个非限制性实施方式中，加强组件1030形成为细胞不可渗透层1000上的离散区域，并且位于生物相容性膜复合材料1050中的缓解层1010内。显示血管化层1020仅供参考。在图10B所示的实施方式中，加强组件1030作为离散区域位于缓解层1010上并且位于生物相容膜复合材料1050的血管化层1020内。显示细胞不可渗透层1000仅供参考。在图10C所示的另一个非限制性实施方式中，加强组件1030在生物相容性膜复合材料1050的外部。具体而言，加强组件1030位于细胞不可渗透层1000的与缓解层1010相背的一侧。显示血管化层1020仅供参考。参考图10D，加强组件1030位于生物相容性膜复合材料1050的缓解层1010和血管化层1020之间。显示细胞不可渗透层1000仅供参考。

在本文所述的实施方式中，缓解层1100可以通过将聚合物以一种图案(如上所述)放置或以其他方式沉积来形成，该图案的特征在于以下一项或多项：实体特征体尺寸(即，短轴)1110，实体特征体间距1120，实体特征体深度1160，厚度1130，原纤维的缺失和/或孔径(如通过在SEM图像上进行的定量图像分析(QIA)所测量的)，如图11A中总体描绘的。显示细胞不可渗透层1150仅供参考。

图11B描绘了由具有节点和原纤维微结构的聚合物形成的缓解层1200，其特征在于以下一项或多项：实体特征体尺寸(即，短轴)1210，实体特征体间距1220，实体特征体深度1270，厚度1230，存在原纤维1260和/或孔径(如通过在SEM图像上进行的定量图像分析(QIA)所测量的)1240。在图11B中显示细胞不可渗透层1250仅供参考。

此外，在本文所述的实施方式中，血管化层1300的特征可以是以下一项或多项：厚度1310、孔径1320、实体特征体尺寸(即短轴)1340和实体特征体间距1330，如在图12中总体描绘的。显示细胞不可渗透层1350和缓解层1360仅供参考。

生物相容性膜复合材料可以制造成各种形式，包括但不限于外壳、腔室、袋、管或盖。在一个实施方式中，生物相容性膜复合材料形成如图13A所示的细胞封装装置。图13A是细胞封装装置1400的俯视图，该装置由沿其外周1410的一部分密封的两层生物相容性膜复合材料形成。图13A中仅显示了生物相容性膜复合材料1420的外层。细胞封装装置1400包括用于容纳细胞的内室(未示出)和端口1430，端口1430延伸到内室中并与其流体连通。

图13B是图13A的电池封装装置的截面图。如图所示，第一生物相容性膜复合材料1450与第二生物相容性膜复合材料1460相邻地定位。生物相容性膜复合材料1450、1460各自包括细胞不可渗透层1470、缓解层1480和血管化层1490。任选的加强组件未在图13B中描绘，尽管其可以用在该实施方式中。室1435(即内腔)位于两个膜复合材料1450、1460之间，用于放置细胞(和/或其他生物体)。

上面大体描述了本发明，参照以下具体实施例可以更进一步理解本发明,除非另外说明，否则，以下实施例仅仅是出于说明的目的，而不是包括所有例子或构成限制。

测试方法

孔隙率

层的孔隙率在本文中定义为由孔隙空间构成的层体积与层总体积相比的比例。孔隙率是通过比较由实心部分和空隙部分组成的多孔结构的堆积密度与实心部分的密度使用以下等式来计算的：

厚度

通过横截面SEM图像的定量图像分析(QIA)测量复合材料中的层厚度。横截面SEM图像是通过以下方式产生的：将膜固定到粘合剂上，使用液氮冷却的剃须刀片手动切割膜，然后将粘合剂背衬的膜在一端竖立起来，使得横截面是垂直的。然后使用Emitech K550X溅射涂布机(可从英国Quorum技术有限公司(Quorum Technologies Ltd)商购)和铂靶对样品进行溅射涂布。然后使用来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的FEI Quanta400扫描电子显微镜对样品进行成像。

然后使用美国国立卫生研究院(NIH)的ImageJ 1.51h测量横截面SEM图像内的层的厚度。图像比例是根据SEM提供的比例设置的。使用手动工具隔离和裁剪感兴趣的层。然后在层厚的方向上绘制多个(至少十个)等距的线。测量所有线的长度并取平均值以定义层厚度。

最大拉伸载荷

使用5500系列机电测试系统测试材料的最大拉伸载荷。使用D412F或D638-V狗骨状模具沿感关注的轴定向切割样品。然后将样品装入/>测试仪夹具并以20英寸/分钟(对于D412F样品)或3英寸/分钟(对于D683-V样品)的恒定速率进行测试，直到失败。测试期间持续的最大载荷通过试样规格宽度(D412F样品为6.35mm，D638-V样品为3.175mm)标准化，以定义最大拉伸负载。

拉伸强度

使用5500系列机电测试系统测试材料的拉伸强度。除非另有说明，否则在施加任何涂层之前测试材料的拉伸强度。使用D412F或D638-V狗骨状模具切割样品。然后将样品装入/>测试仪夹具并以20英寸/分钟(对于D412F样品)或3英寸/分钟(对于D683-V样品)的恒定速率进行测试，直到失败。最大载荷通过测试面积(定义为规格宽度乘以材料厚度)标准化以定义拉伸应力。材料在垂直方向(D1和D2)进行测试，每个方向的最大应力用于根据以下等式计算材料的几何平均拉伸强度：

复合结合强度(Z-强度)

使用5500系列机电测试系统测试材料的复合结合强度。除非另有说明，否则在施加任何涂层之前测试材料的拉伸强度。使用3M 9500PC双面胶带将样品固定在1”x1”压板上，然后装入具有相对的1”x1”钢板的/>中，在该相对钢板的表面上具有3M9500PC双面胶带。施加1001N的特征压缩载荷60秒，以使粘合剂对渗透结构进行部分的渗透。在这种结合之后，压板以20英寸/秒的恒定速率分离，直到失效。最大载荷通过测试区域(定义为1”x 1”测试区域)标准化，以定义复合材料的结合。

质量/面积

样品被切割(通过手工、激光或模具进行)成已知的几何形状。除非另有说明，否则在施加任何涂层之前测试材料的拉伸强度。测量或验证样品的尺寸，并以m²计算面积。然后在校准的秤上以克为单位对样品称重。以克为单位的质量除以以m²为单位的面积，以计算单位面积的质量，以g/m²为单位。

SEM样品制备

通过以下方式来制备SEM样品：首先将膜复合材料或膜复合材料层固定到粘合剂以便于操作，其中与用于成像的一侧相反的一侧面向粘合剂。然后切割膜以提供大约3mm x3mm的区域用于成像。然后使用Emitech K550X溅射涂布机和铂靶对样品进行溅射涂布。然后使用来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的FEI Quanta 400扫描电子显微镜以特定的放大倍率和分辨率拍摄图像，该放大倍率和分辨率允许对足够数量的特征体进行可视化以进行稳健的分析，同时确保每个分析的特征体的最小尺寸至少为五个像素的长度。

实体特征体间距

通过在美国国立卫生研究院(NIH)的ImageJ 1.51h中分析SEM图像来确定实体特征体间距。图像比例是根据SEM图像提供的比例设置的。通过基于尺寸/阴影和/或手动识别的阈值组合来识别和区分特征体。在结构由连续结构(例如非织造表面或蚀刻表面)组成的情况下，与具有离散实体特征体的结构相反，实体特征体被定义为围绕空隙的结构部分，它们的相应间距从空隙的一侧延伸到相对侧。在区分出特征体后，进行德劳内(Delaunay)三角剖分以识别相邻特征体。在分析中忽略外接圆超出图像边缘的三角剖分。在相邻特征体的最近边缘之间画线并测量长度以定义相邻特征体之间的间距(参见例如图1A)。所有测量的实体特征体间距的中值标记的值小于或等于一半的测量的实体特征体间距且大于或等于一半的测量的实体特征体间距。因此，如果测量的中值高于或低于某个值，则大部分测量值同样高于或低于该值。因此，中值用作汇总统计量来表示大部分实体特征体间距。

代表性短轴和代表性长轴的测量

通过在NIH的ImageJ 1.51h中分析膜表面的SEM图像来测量代表性短轴。图像比例是根据SEM图像提供的比例设置的。通过基于尺寸/阴影和/或手动识别的阈值组合来识别和区分特征体。在区分出特征体后，利用内置的粒子分析功能来确定代表性椭圆的长轴和短轴。该椭圆的短轴是被测特征体的代表性短轴。该椭圆的长轴是被测特征体的代表性长轴。所有测量的短轴的中值标记的值小于或等于一半的测量的短轴且大于或等于一半的测量的短轴。类似地，所有测量的长轴的中值标记的值小于或等于一半的测量的长轴且大于或等于一半的测量的长轴。在这两种情况下，如果测量的中值高于或低于某个值，则大部分测量值同样高于或低于该值。因此，中值用作汇总统计量来表示大部分实体特征体代表性短轴和代表性长轴。

实体特征体深度

通过使用膜横截面的SEM图像的定量图像分析(QIA)来确定实体特征体深度。横截面SEM图像是通过以下方式产生的：将膜固定到粘合剂上，使用液氮冷却的剃须刀片手动切割膜，然后将粘合剂背衬的膜在一端竖立起来，使得横截面是垂直的。然后使用EmitechK550X溅射涂布机(可从英国Quorum技术有限公司(Quorum Technologies Ltd)商购)和铂靶对样品进行溅射涂布。然后使用来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的FEIQuanta 400扫描电子显微镜对样品进行成像。

然后使用美国国立卫生研究院(NIH)的ImageJ 1.51h测量横截面SEM图像内的特征体的深度。图像比例是根据SEM提供的比例设置的。通过基于尺寸/阴影和/或手动识别的阈值组合来识别和区分特征体。在区分出特征体后，利用内置的粒子分析功能来计算每个实体特征体的弗里特(Feret)直径和由弗里特直径轴定义的轴与水平面之间形成的角。弗里特直径是SEM图像平面中特征体边界上任意两点之间的最远距离。弗里特直径轴是由这两个点定义的线。每个实体特征体的弗里特直径在层厚度方向上的投影是根据以下等式计算的：

投影_厚度＝sinθ*长度_最长轴。

最长轴在层厚度方向上的投影是被测特征体的实体特征体深度。所有测量的实体特征体深度的中值标记的值小于或等于一半的测量的实体特征体深度且大于或等于一半的测量的实体特征体深度。因此，如果测量的中值高于或低于某个值，则大部分测量值同样高于或低于该值。因此，中值用作汇总统计量来表示大部分实体特征体深度。

孔径

通过在NIH的ImageJ 1.51h中分析膜表面的SEM图像来测量孔径。图像比例是根据SEM图像提供的比例设置的。通过基于尺寸/阴影和/或手动识别的阈值组合来对孔进行识别和隔离。在将孔隔离后，利用内置的粒子分析功能来确定每个孔的面积。根据以下等式，将测量的孔面积转换为“有效直径”：

将孔面积相加以定义由孔限定的表面的总面积。这是表面的总孔面积。层的孔径是孔的有效直径，其定义了这样一个孔径：总孔面积的大约一半由直径小于该孔径的孔组成，并且总孔面积的大约一半由直径大于或等于该孔径的孔组成。

MPS(最大孔径)

根据ASTM F316，使用来自安东帕(Anton Paar)的Quantachrome 3Gzh孔隙率计并使用硅油(20.1达因/厘米)作为润湿溶液来测量最大孔径或MPS。

刚度

刚度测试根据ASTM D790-17标准测试方法进行，对未加强和加强的塑料和电绝缘材料的弯曲性能进行测试。该方法用于确定生物相容性膜复合材料层和/或最终装置的刚度。

遵循ASTM方法的程序B，包括大于5％的应变和用于偏转的1型十字头位置。固定装置的尺寸被调整为具有16mm的跨度和1.6mm的支撑和鼻梁架半径。所使用的测试参数为3.14mm的偏转和96.8毫米/分钟的测试速度。在样品宽度与标准1cm不同的情况下，力通过线性比率归一化为1cm样品宽度。

在最大偏转下以N/cm为单位报告载荷。

生物相容性膜复合材料整合成装置形式

为了评估体内效用，将各种生物相容性膜复合材料制造成适合用作用于递送细胞疗法的可植入封装装置的装置形式。在这种测试形式中，两个相同的膜复合材料围绕周边区域密封，以形成开放的内腔空间，该空间可通过填充管或端口进入，从而能够加载细胞。

热塑性膜充当结合组件，在熔接操作期间在装置周围形成周边密封。使用的膜是聚碳酸酯聚氨酯膜。挤出管的外径为1.60mm，内径为0.889mm。

此外，在封装装置的外部增加具有合适刚度的加强机械支撑。具体而言，将具有彼此间隔约300微米的120微米纤维的聚酯单丝织造网置于两个复合膜的外侧(即装置的外部)。该层的刚度为0.097N/cm。

使用激光切割台将所有层切割到大约22mm x 11mm的卵形外部尺寸。将膜切割成2mm宽的卵形环轮廓，并以插入堆叠的模式放置在生物相容性膜复合材料的两侧以及聚酯网(加强组件)周围。组件的这种插入堆叠模式允许在每个复合层以及周边位置的网周围形成熔融膜结合。生物相容性膜复合材料的层相对于填充管对称地堆叠，使得生物相容性膜复合材料的细胞不可渗透的紧密层内部朝向内腔。封装装置的分解图如图16所示。如图16所示，细胞封装装置形成为第一生物相容性膜复合材料1600沿其外周的一部分与第二生物相容性膜复合材料1610沿其外周的一部分相密封。内室形成在两个生物相容性膜1600、1610之间，可通过填充管1630进入。细胞封装装置还可包括至少一个熔接膜1640，其至少位于第一生物相容性膜复合材料1600和加强组件1650之间，并且在第二生物相容性膜复合材料1610和另一个加强组件1650之间。熔接膜1640也可以用于将第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料围绕它们的外周相粘附。

通过使用超声波焊机(赫尔曼超声公司(Herrmann Ultrasonics))或热铆焊机形成围绕装置的整体周边密封。在这两种工艺中，热能或振动能和力被施加到层状堆叠体上，以使热塑性膜在高于其软化温度的温度熔化和流动，从而将所有层熔接在一起。该装置以两步熔接工艺构建，其中从一侧施加能量或热量，使得第一复合膜整合到装置的一侧，然后将第二复合膜整合到装置的相反侧上。通过使用USON Sprint iQ泄漏测试仪在5psi的测试压力下使用压力衰减测试对装置的完整性进行测试来评估熔接的最终适用性。

评估宿主组织反应的体内猪研究

使用射频(RF)焊机在填充管处密封已灭菌的空封装装置(即无细胞)，并使用套管针递送技术将其皮下植入猪的背部。30天后，将动物安乐死，取回带有周围组织的装置进行组织学成像。

处理组织样本，使得皮肤和皮下组织被反射以暴露植入的封装装置。在整体移除封装装置和周围组织之前，在需要时使用数字射线照相(Faxitron UltraFocus系统)识别这些装置。设备方向标有订书钉。将所有外植装置和周围组织浸入10％中性缓冲福尔马林中。每个装置试样都被分配了一个唯一的登录号。

每个试样取三个切片。每个装置的三个切片一起嵌入石蜡中，切成5-10微米厚的切片，放在载玻片上，用苏木精和伊红(H&E)和马森三色染色。

使用尼康DS-Fi系列相机和尼康NIS元素显微镜成像软件(Nikon NIS ElementsMicroscope Imaging software)捕获载玻片图像。每张载玻片至少捕获三个放大图像。使用尼康NIS元素显微镜成像软件进行测量，该软件使用经过认证的显微镜测微计进行校准，并且每个图像上都包含比例尺。

人PDX1阳性胰腺内胚层和内分泌细胞的体外生产

本文针对多能干细胞(例如hES和iPS细胞)的定向分化方法可以描述为至少四个或五个或六个或七个阶段，这取决于最终阶段的细胞培养或所需的细胞群(例如PDX1阳性胰腺内胚层细胞群(或PEC)，或内分泌前体细胞群，或内分泌细胞群，或未成熟β细胞群或成熟内分泌细胞群)。

阶段1是从多能干细胞产生定形内胚层，需要大约2至5天，优选2天或3天。多能干细胞悬浮在包含RPMI、TGFβ超家族成员生长因子如激活素A、激活素B、GDF-8或GDF-11(100ng/mL)、Wnt家族成员或Wnt通路激活剂如Wnt3a(25ng/mL)和替代的rho-激酶或ROCK抑制剂如Y-27632(10μM)的培养基中，以增强生长、和/或存活和/或增殖、和/或细胞-细胞粘附。约24小时后，将培养基更换为包含RPMI和血清(例如0.2％FBS)以及TGFβ超家族成员生长因子如激活素A、激活素B、GDF-8或GDF-11(100ng/mL)和替代的rho-激酶或ROCK抑制剂的培养基，继续持续24小时(第1天)至48小时(第2天)。或者，在包含激活素/Wnt3a的培养基中约24小时后，在随后的24小时期间在仅包含激活素的培养基(即，培养基不包含Wnt3a)中培养细胞。重要的是，定形内胚层的生产需要血清含量低的细胞培养条件，因此胰岛素或胰岛素样生长因子的含量也低。参见McLean等人，(2007)干细胞(Stem Cells)25:29-38。McLean等人还表明，在第1阶段，将hES细胞与浓度低至0.2μg/mL的胰岛素接触可能不利于定形内胚层的产生。本领域的其他技术人员基本上如本文和以下文献中所述修改了多能细胞向定形内胚层的第1阶段分化：D’Amour等人(2005)，例如至少Agarwal等人，从人胚胎干细胞有效分化功能性肝细胞(Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes fromHuman Embryonic Stem Cells)，Stem Cells(2008)26:1117-1127；Borowiak等人，小分子有效地指导小鼠和人胚胎干细胞的内胚层分化(Small Molecules Efficiently DirectEndodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells)，(2009)Cell Stem Cell 4:348-358；Brunner等人，不同的DNA甲基化模式表征分化的人胚胎干细胞和发育中的人胎儿肝脏(Distinct DNA methylation patterns characterizedifferentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver)，(2009)Genome Res.19:1044-1056，Rezania等人，用人多能干细胞体外衍生的胰岛素产生细胞逆转糖尿病(Reversal of Diabetes with Insulin-producing Cells Derived InVitro from Human Pluripotent Stem Cells)(2014)Nat Biotech 32(11):1121-1133(GDF8&GSK3β抑制剂,例如CHIR99021)；和Pagliuca等人，(2014)体外产生功能人胰腺B细胞(Generation of Function Human Pancreatic B-cell In Vitro),Cell 159:428-439(激活素A&CHIR)。为了获得其他内胚层谱系细胞，必须进行正确的分化、规格化、表征和定性鉴定。在此阶段的定形内胚层细胞共表达SOX17和HNF3β(FOXA2)，并且至少不明显表达HNF4alpha、HNF6、PDX1、SOX6、PROX1、PTF1A、CPA、cMYC、NKX6.1、NGN3、PAX3、ARX、NKX2.2、INS、GSC、GHRL、SST或PP。定形内胚层中HNF4α表达的缺失至少在以下文献中得到了支持和详细描述：Duncan等人(1994)，转录因子HNF-4在发育中的小鼠胚胎的胚外内胚层、肠道和肾源性组织中的表达：HNF-4是植入胚泡中初级内胚层的标志物(Expression oftranscription factor HNF-4 in the extraembryonic endoderm,gut,and nephrogenictissue of the developing mouse embryo:HNF-4is a marker for primary endodermin the implanting blastocyst)”Proc.Natl.Acad.Sci,91:7598-7602和Si-Tayeb等人(2010)，从诱导多能干细胞高效生成人肝细胞样细胞(Highly Efficient Generation ofHuman Hepatocyte-Like cells from Induced Pluripotent Stem Cells)”，Hepatology51:297-305。

第2阶段采用第1阶段的定形内胚层细胞培养物，通过将悬浮培养物与低血清水平的RPMI(例如0.2％FBS，在1:1000的ITS中稀释)、25ng KGF(或FGF7)和替代的ROCK抑制剂一起孵育24小时(第2天至第3天)，产生前肠内胚层或PDX1阴性前肠内胚层。24小时后(第3天至第4天)，将培养基更换为相同的培养基，但不含TGFβ抑制剂，但仍含有ROCK抑制剂以增强细胞的生长、存活和增殖，再持续24天(第4天至第5天)到48小时(第6天)。正确规范前肠内胚层的关键步骤是去除TGFβ家族生长因子。因此，可以将TGFβ抑制剂添加到第2阶段细胞培养物中，例如2.5μM TGFβ抑制剂4号或5μM SB431542，激活素受体样激酶(ALK)的特异性抑制剂，其是一种TGFβI型受体。由第2阶段产生的前肠内胚层或PDX1阴性前肠内胚层细胞共表达SOX17、HNF1β和HNF4α，并且至少不明显共表达SOX17和HNF3β(FOXA2)，也不明显共表达HNF6、PDX1、SOX6、PROX1、PTF1A、CPA、cMYC、NKX6.1、NGN3、PAX3、ARX、NKX2.2、INS、GSC、GHRL、SST或PP，它们是定形内胚层、PDX1阳性胰腺内胚层或胰腺祖细胞或内分泌祖细胞/前体以及典型的多激素型细胞的标志。

PEC生产的第3阶段(第5-8天)采用第2阶段的前肠内胚层细胞培养物，并通过DMEM或RPMI(在1％B27中)，0.25μM KAAD环巴胺，类视黄醇如0.2μM视黄酸(RA)或视黄酸类似物，诸如3nM的TTNPB(或CTT3，其是KAAD环巴胺和TTNPB的组合)和50ng/mL的头蛋白(Noggin)处理约24小时(第7天)至48小时(第8天)产生PDX1阳性前肠内胚层细胞。具体而言，申请人从大约2003年以来一直使用DMEM-高葡萄糖，并且当时所有专利和非专利公开都采用DMEM-高葡萄糖，即使没有提及“DMEM-高葡萄糖”等也是如此。这部分是因为吉布可(Gibco)等制造商没有这样命名他们的DMEM，例如DMEM(目录号11960)和Knockout DMEM(目录号10829)。值得注意的是，截至本申请的申请日，Gibco提供了更多的DMEM产品，但仍然没有在他们的某些含有高葡萄糖的DMEM产品中注明“高糖”，例如Knockout DMEM(目录号10829-018)。因此，可以假设在各情况中描述DMEM，是指具有高葡萄糖的DMEM，并且对该领域进行研究和开发的技术人员来说是很明显的。同样，ROCK抑制剂或rho-激酶抑制剂如Y-27632可用于增强生长、存活、增殖和促进细胞间粘附。其他试剂和因素包括但不限于抗坏血酸(例如维生素C)、BMP抑制剂(例如头蛋白(Noggin)、LDN、腱蛋白(Chordin))、SHH抑制剂(例如SANT、环巴胺、HIP1)；和/或PKC激活剂(例如PdBu、TBP、ILV)或其任何组合。或者，第3阶段已经在没有SHH抑制剂(例如第3阶段中的环巴胺)的情况下进行。从第3阶段产生的PDX1阳性前肠细胞共表达PDX1和HNF6以及SOX9和PROX，并且不明显共表达指示定形内胚层或前肠内胚层(PDX1阴性前肠内胚层)细胞或PDX1阳性前肠内胚层细胞的标志物，如上文第1阶段和第2阶段中所述。

上述第3阶段方法是PEC群生产的四个阶段之一。为了产生如下详述的内分泌祖细胞/前体和内分泌细胞，除了头蛋白(Noggin)、KAAD-环巴胺和类视黄醇外，还可以单独和/或组合使用激活素、Wnt和调蛋白(Heregulin)、甲状腺激素、TGFb受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、维生素C和ROCK抑制剂来抑制早期表达NGN3并增加CHGA阴性类型的细胞。

第4阶段(大约第8-14天)PEC培养生产从第3阶段获取培养基，并将其更换为含有以下组分的培养基：DMEM(在1％体积/体积B27补充剂中),外加50ng/mLKGF和50ng/mLEGF，有时还含有50ng/mL头蛋白(Noggin)和ROCK抑制剂，还包括单独的激活素或与调蛋白结合的激活素。或者，可以使用KGF、RA、SANT、PKC激活剂和/或维生素C或其任意组合进一步分化第3阶段细胞。这些方法产生至少共表达PDX1和NKX6.1以及PTF1A的胰腺祖细胞。这些细胞不明显表达指示定形内胚层或前肠内胚层(PDX1阴性前肠内胚层)细胞的标志物，如上文第1、2和3阶段中所述。

第5阶段生产采用上述第4阶段PEC细胞群，并将它们在含有DMEM(具有1％体积/体积B27补充剂)、头蛋白(Noggin)、KGF、EGF、RO(一种γ分泌酶抑制剂)、烟酰胺和/或ALK5抑制剂，或其任何组合(例如头蛋白和ALK5抑制剂)的培养基中进一步分化约1至6天(优选约2天，即第13-15天)，以产生内分泌祖细胞/前体或祖细胞型细胞和/或单激素和多激素胰腺内分泌型细胞。或者，可以使用视黄酸(例如RA或其类似物)、甲状腺激素(例如T3、T4或其类似物)、TGFb受体抑制剂(ALK5抑制剂)、BMP抑制剂(例如头蛋白、腱蛋白、LDN)，或γ分泌酶抑制剂(例如XXI、XX、DAPT、XVI、L685458)和/或β细胞素，或其任何组合将第4阶段的细胞进一步分化。从第5阶段产生的内分泌祖细胞/前体至少共表达PDX1/NKX6.1并表达CHGA、NGN3和Nkx2.2，并且不明显表达指示定形内胚层或前肠内胚层(PDX1阴性前肠内胚层)的标志物，如上文PEC生产的第1、2、3和4阶段中所述。

通过添加试剂或因子的任意组合，第6阶段和第7阶段可以进一步分化第5阶段的细胞群，所述试剂或因子包括但不限于PDGF+SSH抑制剂(例如SANT、环巴胺、HIP1)，BMP抑制剂(例如头蛋白、腱蛋白、LDN)，烟酰胺，胰岛素样生长因子(例如IGF1、IGF2)，TTNBP，ROCK抑制剂(例如Y27632)，TGFb受体抑制剂(例如ALK5i)，甲状腺激素(例如T3、T4及其类似物)和/或γ分泌酶抑制剂(XXI、XX、DAPT、XVI、L685458)或其任意组合，从而实现内分泌细胞、内分泌前体和未成熟β细胞的细胞培养群或适当比例。

第7阶段或未成熟β细胞被认为是内分泌细胞，但是对于以生理方式对葡萄糖作出反应来说，可能足够成熟或可能不够成熟。第7阶段的未成熟β细胞可以表达MAFB，而表达MAFA和MAFB的细胞是完全成熟的细胞，能够以生理方式对葡萄糖作出反应。

第1阶段到第7阶段的细胞群来源于人多能干细胞(例如人胚胎干细胞、诱导多能干细胞、转基因干细胞，例如使用现在可得或以后开发的任何基因编辑工具和应用程序)，并且可能没有它们的确切的自然发生的相应细胞类型，因为它们来自体外(即在人工组织培养中)产生的永生人多能干细胞，而不是体内的内细胞团(即体内人发育不具有人ES细胞等效物)。

可使用第4、5、6或7阶段细胞群中的任何一个将本文中预期的胰腺细胞疗法替代物封装在本文所述的装置中，该装置由本文所述的膜组成，并装载和完全包含在大封装装置中并移植到患者体内，胰腺内胚层谱系细胞在体内(也称为“体内功能”)成熟为胰腺激素分泌细胞或胰岛，例如胰岛素分泌β细胞，并且能够正常响应血糖。

在2009年11月13日提交的题为“来自人多能干细胞的胰腺谱系细胞的封装(ENCAPSULATION OF PACREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEMCELLS)”的美国申请第12/618,659号('659申请)中详细描述了胰腺内胚层谱系细胞的封装和体内胰岛素的产生。'659申请要求以下申请的优先权：2008年11月14日提交的题为“来自HES细胞的胰腺祖细胞的封装(ENCAPSULATION OF PACREATIC PROGENITORS DERIVED FROMHES CELLS)”的临时专利申请第61/114,857号；和2008年12月9日提交的题为“胰腺内胚层细胞的封装(ENCAPSULATION OF PACREATICENDODERM CELLS)”的美国临时专利申请第61/121,084号；现在是美国专利8,278,106和8,424,928。本文描述的方法、组成和装置目前代表了优选的实施方式并且是示例性的，不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途，它们包含在本发明的精神内并且由本公开的范围限定。因此，对本领域的普通技术人员而言显而易见的是，可以对本文公开的本发明进行各种取代和修改而不会偏离本发明的范围和精神。

此外，本文所述的实施方式不限于任何一种类型的多能干细胞或人多能干细胞，并且包括但不限于人胚胎干(hES)细胞和人诱导多能干(iPS)细胞或以后开发的其他多能干细胞。本领域还众所周知，在提交本申请时，可以在不破坏人胚胎的情况下进行制备人多能干细胞的方法，并且预期此类方法可用于生产任何人多能干细胞。

从人多能细胞产生胰腺细胞谱系的方法基本上至少按照所列的属于维亚赛特公司(ViaCyte,Inc.)的公开文本中的描述进行，包括但不限于：PCT/US2007/62755(WO2007101130)，PCT/US2008/80516(WO2009052505)，PCT/US2008/82356(WO2010053472)，PCT/US2005/28829(WO2006020919)，PCT/US2014/34425(WO2015160348)，PCT/US2014/60306(WO2016080943)，PCT/US2016/61442(WO2018089011)，PCT/US2014/15156(WO2014124172)，PCT/US2014/22109(WO2014138691)，PCT/US2014/22065(WO2014138671)，PCT/US2005/14239(WO2005116073)，PCT/US2004/43696(WO2005063971)，PCT/US2005/24161(WO2006017134)，PCT/US2006/42413(WO2007051038)，PCT/US2007/15536(WO2008013664)，PCT/US2007/05541(WO2007103282)，PCT/US2008/61053(WO2009131568)，PCT/US2008/65686(WO2009154606)，PCT/US2014/15156(WO2014124172)，PCT/US2018/41648(WO2019014351)，PCT/US2014/26529(WO2014160413)，PCT/US2009/64459(WO2010057039)；和d’Amour等人，2005 Nature Biotechnology 23:1534-41；D'Amour等人，2006 Nature Biotechnology 24(11):1392-401；McLean等人，2007 Stem Cells 25:29-38，Kroon等人，2008 Nature Biotechnology 26(4):443-452,Kelly等人，2011 NatureBiotechnology 29(8):750-756,Schulz等人，2012 PLos One 7(5):e37004；和/或Agulnick等人，2015 Stem Cells Transl.Med.4(10):1214-22。

从人多能细胞产生胰腺细胞谱系的方法基本上至少按照以下所列的属于杨森(Janssen)的公开文本中的描述进行，包括但不限于：PCT/US2008/68782(WO200906399)，PCT/US2008/71775(WO200948675)，PCT/US2008/71782(WO200918453)，PCT/US2008/84705(WO200970592)，PCT/US2009/41348(WO2009132063)，PCT/US2009/41356(WO2009132068)，PCT/US2009/49183(WO2010002846)，PCT/US2009/61635(WO2010051213)，PCT/US2009/61774(WO2010051223)，PCT/US2010/42390(WO2011011300)，PCT/US2010/42504(WO2011011349)，PCT/US2010/42393(WO2011011302)，PCT/US2010/60756(WO2011079017)，PCT/US2011/26443(WO2011109279)，PCT/US2011/36043(WO2011143299)，PCT/US2011/48127(WO2012030538)，PCT/US2011/48129(WO2012030539)，PCT/US2011/48131(WO2012030540)，PCT/US2011/47410(WO2012021698)，PCT/US2012/68439(WO2013095953)，PCT/US2013/29360(WO2013134378)，PCT/US2013/39940(WO2013169769)，PCT/US2013/44472(WO2013184888)，PCT/US2013/78191(WO2014106141)，PCTU/S2014/38993(WO2015065524)，PCT/US2013/75939(WO2014105543)，PCT/US2013/75959(WO2014105546)，PCT/US2015/29636(WO2015175307)，PCT/US2015/64713(WO2016100035)，PCT/US2014/41988(WO2015002724)，PCT/US2017/25847(WO2017180361)，PCT/US2017/37373(WO2017222879)，PCT/US2017/37373(WO2017222879)；PCT/US2009/049049(WO2010/002785)，PCT/US2010/060770(WO2011/079018)，PCT/US2014/042796，(WO2015/065537)，PCT/US2008/070418(WO2009/012428)；Bruin等人，2013Diabetologia.56(9):1987-98，Fryer等人，2013 Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes.20(2):112-7，Chetty等人，2013Nature Methods.10(6):553-6，Rezania等人，2014 Nature Biotechnologyy 32(11):1121-33，Bruin等人，2014 Stem Cell Res.12(1):194-208，Hrvatin 2014Proc.Natl.Acad.Sci.USA.111(8):3038-43，Bruin等人，2015Stem Cell Reports.5,1081–1096，Bruin等人，2015Science Transl.Med.,2015,7,316ps23，和/或Bruin等人，2015Stem Cell Reports.14；4(4):605-20。

在一个实施方式中，人多能细胞根据以下优选条件A和/或B之一分化为PDX1阳性胰腺内胚层细胞，包括胰腺祖细胞和内分泌前体。

表1

表1图例：r0.2FBS：RPMI 1640(Mediatech)；0.2％FBS(HyClone)，1x GlutaMAX-1(生命技术(Life Technologies))，1％v/v青霉素/链霉素；db：DMEM高葡萄糖(HyClone)，辅以0.5x B-27补充剂(生命技术(Life Technologies))；A100，A50，A5：100ng/mL重组人激活素A(R&D系统公司(R&D Systems))；A5i：1uM，5uM，10uM ALK5抑制剂；TT3：3nM TTNPB(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))；E50：50ng/mL重组人EGF(R&D系统公司)；ITS：胰岛素-转铁蛋白-硒(生命技术)，按1:5000或1:1000稀释；IV：2.5mM TGF-b RI激酶抑制剂IV(EMD生物科学公司(EMD Bioscience))；K50，K25：50ng/mL，25ng/mL重组人KGF(R&D系统公司或派普泰克公司(Peprotech))；N50，N100：50ng/mL或100ng/mL重组人头蛋白(R&D系统公司)；W50：50ng/mL重组小鼠Wnt3A(R&D系统公司)。

本领域普通技术人员将理解，可能存在其他方法产生PDX1阳性胰腺内胚层细胞或PDX1阳性胰腺内胚层谱系细胞，包括胰腺祖细胞或者甚至内分泌和内分泌前体细胞；以及至少Kroon等人2008，Rezania等人2014(同上)和Pagliuca等人2014Cell159(2):428-439(同上)描述的那些PDX1阳性胰腺内胚层细胞。

本领域普通技术人员还将理解，本文描述的用于产生PDX1阳性胰腺内胚层细胞的实施方式由混合群或亚群的混合物组成。并且因为与沿前后轴发生的哺乳动物体内发育不同，并且细胞和组织也因此命名，任何培养容器中的细胞培养都缺乏这种定向模式，因此特别是由于它们的标志物表达而被表征。因此，在体内不会发生任何分化阶段的混合细胞亚群。因此，PDX1阳性胰腺内胚层细胞培养物包括但不限于：i)内分泌前体(例如，如早期内分泌标志物，嗜铬粒蛋白A或CHGA所示)；ii)表达任何典型的胰腺激素如胰岛素(INS)、生长抑素(SST)、胰腺多肽(PP)、胰高血糖素(GCG)或甚至胃泌素、肠促胰岛素、促胰液素或胆囊收缩素的单激素多激素细胞；iii)胰腺前细胞，例如，表达PDX-1但不表达NKX6.1或CHGA的细胞；iv)共表达PDX-1/NKX6.1和CHGA(PDX-1/NKX6.1/CHGA)的内分泌细胞，或非内分泌细胞，例如表达PDX-1/NKX6.1但不表达CHGA(PDX-1+/NKX6.1+/CHA-)；和v)仍然存在不表达PDX-1、NKX6.1或CHGA的细胞(例如三阴性细胞)。

这种PDX1阳性胰腺内胚层细胞群及其混合细胞亚群大多至少表达PDX-1，特别是表达PDX-1/NKX6.1的亚群。PDX1/NKX6.1亚群也被称为“胰腺祖细胞”、“胰腺上皮细胞”或“PEC”或PEC的各版本，例如PEC-01。尽管表1描述了第4阶段的细胞群，但这些不同的亚群不仅仅限于第4阶段。这些亚群中的某些可以例如早在第3阶段和包括第5、6和7阶段在内的之后的阶段中发现(未成熟β细胞)。每个亚群的比例将根据所采用的细胞培养基条件而有所不同。例如，在Agulnick等人2015(同上)中，73-80％的PDX-1/NKX6.1细胞被用于进一步分化为胰岛样细胞(IC)，其中一般含有74-89％的内分泌细胞，并且其中的40-50％表达胰岛素(INS)。因此，不同的细胞培养条件能够产生不同比例的细胞亚群，这可能会影响体内功能，从而影响血清c肽水平。并且只有使用下文更详细描述的体内研究才能确定用于制造PDX1阳性胰腺内胚层谱系细胞培养群的修改方法是否会影响体内功能。此外，不能假设也不应该假设仅仅因为某种细胞类型已经制成并且得到良好的表征，这种方法就会产生相同的细胞中间体，除非这也得到很好的表征。

一方面，提供了一种在体内产生成熟β细胞的方法。该方法包括在体外制造源自人多能干细胞的人定形内胚层谱系细胞，该方法使用至少一个TGFβ超家族成员和/或至少一个TGFβ超家族成员和Wnt家族成员，优选TGFβ超家族成员和Wnt家族成员，优选激活素A、B或GDF-8、GDF-11或GDF-15和Wnt3a，优选激活素A和Wnt3a，优选GDF-8和Wnt3a。从定形内胚层细胞制备PDX1阳性胰腺内胚层细胞的方法，至少使用KGF、BMP抑制剂和视黄酸(RA)或RA类似物，优选KGF、头蛋白和RA。该方法可以进一步用甲状腺激素和/或TGFb-RI抑制剂、BMP抑制剂、KGF、EGF、甲状腺激素和/或蛋白质激酶C激活剂，优选用头蛋白、KGF和EGF，优选额外使用T3或T4和ALK5抑制剂或单独的T3或T4或单独的ALK5抑制剂，或T3或T4、ALK5抑制剂和PKC激活剂例如ILV、TPB和PdBu将PDX1阳性胰腺内胚层细胞分化为未成熟的β细胞或MAFA表达细胞。或者优选使用头蛋白和ALK5i并将PDX1阳性胰腺内胚层细胞或MAFA未成熟β细胞群植入哺乳动物宿主体内并使其成熟以产生包括能够对血糖作出反应的胰岛素分泌细胞的细胞群。

一方面，提供了表达INS和NKX6.1但基本上不表达NGN3的单能人未成熟β细胞或PDX1阳性胰腺内胚层细胞。在一个实施方式中，单能人未成熟β细胞能够成熟为成熟β细胞。在一个实施方式中，单能人未成熟β细胞进一步在体外和体内表达MAFB。在一个实施方式中，未成熟β细胞表达INS、NKX6.1和MAFA并且基本上不表达NGN3。

一方面，至少表达CHGA(或CHGA+)的胰腺内胚层谱系细胞是指内分泌细胞；不表达CHGA(或CHGA-)的胰腺内胚层细胞是指非内分泌细胞。在另一方面，这些内分泌和非内分泌亚群可以是多能祖细胞/前体亚群，例如非内分泌多能胰腺祖细胞亚群或内分泌多能胰腺祖细胞亚群；或者它们可以是单能亚群，例如未成熟的内分泌细胞，优选未成熟的β细胞、未成熟的胰高血糖素细胞等。

一方面，胰腺内胚层或PDX1阳性胰腺内胚层细胞群(第4阶段)中超过10％，优选超过20％、30％、40％，更优选超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的细胞是非内分泌(CHGA-)多能祖细胞亚群，当植入哺乳动物宿主时，它们会产生成熟的胰岛素分泌细胞并在体内对葡萄糖作出反应。

一个实施方式提供了一种组合物和方法，用于在体外将多能干细胞基本上分化为胰腺内胚层培养物，并进一步在体外将胰腺内胚层培养物分化为内分泌或内分泌前体细胞。一方面，内分泌前体或内分泌细胞表达CHGA。一方面，内分泌细胞可以在体外产生胰岛素。一方面，体外内分泌胰岛素分泌细胞可响应葡萄糖刺激产生胰岛素。一方面，细胞群中超过10％、优选超过20％、30％、40％、更优选超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的细胞是内分泌细胞。

本文所述的实施方式提供将多能人干细胞在体外分化为内分泌细胞的组合物和方法。一方面，内分泌细胞表达CHGA。一方面，内分泌细胞可以在体外产生胰岛素。一方面，内分泌细胞是未成熟的内分泌细胞，例如未成熟的β细胞。一方面，体外产生胰岛素的细胞可以响应葡萄糖刺激产生胰岛素。

一个实施方式提供了一种在哺乳动物体内产生胰岛素的方法，该方法包括：(a)将胰腺内胚层细胞或内分泌细胞或内分泌前体细胞群加载到可植入的半渗透装置中；(b)将带有细胞群的装置植入哺乳动物宿主中；和(c)在体内使装置中的细胞群成熟，其中至少一些内分泌细胞是胰岛素分泌细胞，其响应体内葡萄糖刺激而产生胰岛素，从而在体内为哺乳动物产生胰岛素。在一方面，内分泌细胞源自包含具有更高的非内分泌多能胰腺祖细胞亚群(CHGA-)的PEC的细胞组合物。在另一方面，内分泌细胞源自包含具有减少的内分泌亚群(CHGA+)的PEC的细胞组合物。在另一方面，内分泌细胞是未成熟的内分泌细胞，优选未成熟的β细胞。

一方面，与PDX-1阳性胰腺内胚层群或PDX1/NKX6.1阳性的非内分泌(CHGA-)亚群相比，由多能干细胞体外制备的内分泌细胞表达更多的PDX1和NKX6.1。一方面，与PEC非内分泌多能胰腺祖细胞亚群(CHGA-)相比，由多能干细胞体外制备的内分泌细胞表达PDX1和NKX6.1相对更多。一方面，将骨形态发生蛋白(BMP)和视黄酸(RA)类似物单独或组合添加到细胞培养物中以获得与PEC非内分泌多能祖细胞亚群(CHGA-)相比具有增加的PDX1和NKX6.1表达的内分泌细胞。一方面，BMP选自下组：BMP2、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8和BMP4，更优选为BMP4。一方面，视黄酸类似物选自下组：全反式视黄酸和TTNPB(4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-l-丙烯基]苯甲酸芳维甲酸)，或0.1-10μM AM-580(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)，更优选是TTNPB。

一个实施方式提供了一种用于在体外将多能干细胞分化为内分泌细胞和未成熟内分泌细胞，优选未成熟β细胞的方法，包括聚集体解离和重新结合。一方面，解离和重新结合发生在第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段、第5阶段、第6阶段或第7阶段或它们的组合。一方面，定形内胚层、PDX1-阴性前肠内胚层、PDX1-阳性前肠内胚层、PEC和/或内分泌和内分泌祖细胞/前体细胞被解离和重新结合。一方面，与内分泌(CHGA+)亚群相比，第7阶段解离和重新聚集的细胞聚集体由更少的非内分泌(CHGA-)亚群组成。一方面，细胞群中超过10％、优选超过20％、30％、40％、更优选超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的细胞是内分泌(CHGA+)细胞。

一个实施方式提供了一种通过去除在第4阶段PEC生产过程中产生的内分泌细胞从而富集PDX1+和NKX6.1+的非内分泌多能胰腺祖细胞(CHGA-)亚群来在体外将多能干细胞分化为内分泌细胞的方法。

在一个实施方式中，通过在第3阶段和/或第4阶段不添加头蛋白(Noggin)家族成员来制备富集非内分泌多能祖细胞亚群(CHGA-)的PEC培养物。在一个实施方式中，通过在第3阶段和/或第4阶段不添加头蛋白家族成员来制备相对充满定型为内分泌谱系(CHGA+)的细胞的PEC培养物。一方面，头蛋白家族成员是选自下组的化合物：头蛋白(Noggin)、腱蛋白(Chordin)、卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素样蛋白、Cerberus、Coco、Dan、Gremlin、骨硬化蛋白(Sclerostin)、PRDC(与Dan和Cerberus相关的蛋白)。

一个实施方式提供了一种通过在包含外源高水平葡萄糖的培养基中培养内分泌细胞来维持培养中的内分泌细胞的方法，其中添加的外源葡萄糖为约1mM至25mM、约1mM至20mM、约5mM至15mM、约5mM至10mM、约5mM至8mM。一方面，培养基是基于DMEM、CMRL或RPMI的培养基。

一个实施方式提供了一种在体外将多能干细胞分化为内分泌细胞的方法，其中进行和不进行细胞聚集体的解离和重新结合。一方面，未解离的或解离和重新结合的细胞聚集体在第6阶段和/或第7阶段被冷冻保存或冷冻，而不影响内分泌细胞的体内功能。一方面，冷冻保存的内分泌细胞培养物被解冻、培养并且当移植时在体内起作用。

另一个实施方式提供了一种用于将多能干细胞分化为内分泌细胞的培养系统，该培养系统至少包含能够在分化的早期阶段阻抑或抑制内分泌基因表达的试剂和能够在分化的后期阶段诱导内分泌基因表达的试剂。一方面，将能够阻抑或抑制内分泌基因表达的试剂加入由胰腺PDX1阴性前肠细胞组成的培养系统。一方面，将能够诱导内分泌基因表达的试剂加入由PDX1阳性胰腺内胚层祖细胞或PEC组成的培养系统。一方面，能够阻抑或抑制内分泌基因表达的试剂是激活TGFβ受体家族的试剂，优选其是激活素，优选其是高水平的激活素，然后是低水平的激活素。一方面，能够诱导内分泌基因表达的试剂是γ分泌酶抑制剂，其选自下组：N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)，RO44929097，DAPT(N--[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)，1-(S)-内(endo)-N-(1,3,3)-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯基磺酰胺，WPE-III31C，S-3-[N'-(3,5-二氟苯基-α-羟基乙酰基)-L-丙氨酰基]氨基-2,3-二氢-1-甲基-5-苯基-1H-1,4-苯并二氮杂-2-酮，(N)-[(S)-2-羟基-3-甲基-丁酰基]-1-(L-丙氨酰基)-(S)-1-氨基-3-甲基--4,5,6,7-四氢-2H-3-苯并氮杂/>-2-酮，BMS-708163(艾瓦甲西特(Avagacestat)),BMS-708163，司马西特(Semagacestat)(LY450139)，司马西特(Semagacestat)(LY450139)，MK-0752，MK-0752，YO-01027，YO-01027(二苯并氮杂/>DBZ)，LY-411575，LY-411575或LY2811376。一方面，高水平的激活素是指高于40ng/mL、50ng/mL和75ng/mL的水平。一方面，在第3阶段期间或在产生胰腺前肠内胚层细胞之前使用高水平的激活素。一方面，低水平的激活素是指低于30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL和5ng/mL。一方面，在第4阶段期间或PEC的生产中使用低水平的激活素。一方面，被抑制或诱导的内分泌基因是NGN3。在另一方面，激活素A和Wnt3A单独或组合使用以抑制内分泌表达，优选在胰腺前肠内胚层细胞产生之前或优选在第3阶段期间抑制NGN3表达。一方面，γ分泌酶抑制剂，优选RO44929097或DAPT，在培养系统中用于在PEC产生后，或优选在第5、6和/或7阶段期间诱导内分泌基因表达。

一种包含内分泌细胞的体外细胞培养物，其中至少5％的人细胞表达选自下组的内分泌标志物：胰岛素(INS)，NK6同源异型盒1(NKX6.1)，胰腺和十二指肠同源异型盒1(PDX1)，转录因子相关基因座2(NKX2.2)，配对盒4(PAX4)，神经源性分化1(NEUROD)，叉头盒A1(FOXA1)，叉头盒A2(FOXA2)，蜗牛家族锌指2(SNAIL2)和肌腱膜纤维肉瘤癌基因家族A和B(MAFA和MAFB)，并且基本上不表达选自下组的标志物：神经元素3(NGN3)，胰岛1(ISL1)，肝细胞核因子6(HNF6)，GATA结合蛋白4(GATA4)，GATA结合蛋白6(GATA6)，胰腺特异性转录因子1a(PTF1A)和SRY(性别决定区Y)-9(SOX9)，其中内分泌细胞是单能的，可以成熟为胰腺β细胞。

评估功能反应的体内裸鼠研究

至少如授予Martinson等人的美国专利第8,278,106号的教导中所述，封装装置离体装载有6-7x10⁶个细胞(或约20μL)的胰腺祖细胞。在培养基中保持少于24-96小时后，将两个装置皮下植入每只雄性免疫缺陷无胸腺裸鼠中。胰腺祖细胞被允许在体内发育和成熟，移植物的功能性能通过在植入后12、16、20和23-24周进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测定来测量。

裸鼠外植体组织学

在植入后的指定时间点，对裸鼠实施安乐死并移出装置。修剪掉多余的组织，并将装置置于中性缓冲的10％福尔马林中6-30小时。在莱卡生物系统公司(Leica Biosystems)的ASP300S组织处理器中对固定的装置进行处理以用于石蜡包埋。将经过处理的装置切成4-6块，每块大约5mm，并一起埋入石蜡块中。从每个块上切下多个3-10微米的横截面，放在载玻片上并用苏木精和伊红(H&E)染色。使用Hamamatsu Nanozoomer 2.0-HT数字载玻片扫描仪捕获载玻片的图像。

GSIS测定和C肽分泌的测量

已植入封装的胰腺祖细胞的动物在装置植入后12、16、20和23-24周进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定，以监测移植物功能。动物禁食4-16小时，通过颈静脉静脉穿刺采集血样，然后通过腹膜内注射无菌30％葡萄糖溶液以3g/kg体重的剂量施用葡萄糖。在施用葡萄糖后90分钟、或60分钟和90分钟、或30分钟和60分钟再次抽取血样。从全血中分离血清，然后使用市售的ELISA试剂盒(Mercodia，目录#10-1141-01，瑞典乌普萨拉)测定人c肽。β-细胞以等摩尔比从胰岛素原中共同释放c-肽与胰岛素，并且c-肽由于其在血液中的较长半衰期而作为胰岛素分泌的替代物被测量。

实施例

比较例1：

制造膜复合材料

构建具有两个不同层的复合材料。第一层(细胞不可渗透层)是市售的微孔亲水ePTFE膜，其MPS为0.4微米，以商品名由密理博公司(爱尔兰科克)出售。该第一层提供了紧密的、细胞不可渗透的界面，同时仍然能够通过该界面大量运输氧和营养物质。形成细胞不可渗透层的ePTFE膜表面的代表性扫描电子显微照片(SEM)显示在图14中。

第二层(血管化层)是市售的纺粘聚酯非织造材料。该第二层是提供组织锚定并使生物相容性膜复合材料充分血管化的开放层。形成血管化层的非织造材料表面的代表性SEM示于图15中。

使用加热层压工艺将两层(细胞不可渗透层和血管化层)组装成复合材料。将非织造材料的纤维加热至高于其熔融温度的温度，以使它们在ePTFE膜的整个表面区域上粘附到ePTFE膜，其中纺粘非织造物的纤维与ePTFE膜的表面接触。使用的层压机的两个示例是Galaxy平板层压机和HPL平板层压机。调节条件以使足够的压力和温度以给定的运行速度将聚酯纤维加热并熔化到ePTFE膜中。合适的温度范围确定在150℃-170℃之间，压区压力在35kPA至355kPA之间，运行速度为每分钟1-3米。

生物相容性膜复合材料的表征

两层复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法根据上述“测试方法”部分中描述的方法进行。比较例1的结果总结在表2中。

表2

体内复合膜性能的评估

根据以上测试方法部分中提出的“生物相容性膜复合材料整合成装置形式”，将生物相容性膜复合材料超声熔接成装置形式并进行体内评估。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了装置的所有层，直至细胞不可渗透层。在该界面处，在细胞不可渗透层观察到异物巨细胞的存在，为新血管形成产生了屏障。如图17所示，异物巨细胞(用箭头表示)1710位于细胞不可渗透层1720上。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估功能反应。表3中的结果显示了移植装置在约12、16、20和23周时在动物体内的体内功能。不同时间点的人C肽水平指示装置中存在的胰岛素产生细胞的水平。

在比较例1中，c-肽水平在植入后第20周左右达到峰值。之后时间点的低c肽水平表明装置中存在低水平的胰岛素产生细胞。

表3

**60分钟GSIS时间

**大鼠在GSIS测定前不禁

食

比较例2

制造生物相容性膜复合材料

构建具有三个不同的层的复合材料。根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导形成第一ePTFE膜层(细胞不可渗透层)。

根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导制备第二ePTFE膜(缓解层)。在初始机器方向(MD)膨胀步骤中，将氟化乙烯丙烯(FEP)膜施加到第二ePTFE膜上。根据Bacino的WO/94/13469的教导，随后通过机器方向(MD)膨胀和横向(TD)膨胀对第二ePTFE膜和FEP进行共加工，由此FEP在第二ePTFE膜的表面上变得不连续。图18是其上具有不连续的FEP层1800的第二ePTFE层1810表面的代表性图像。

通过使材料(FEP位于两层之间)在高于FEP熔点的温度下接触，将其上包括不连续FEP的第二ePTFE层层压到第一层。两个ePTFE层都保持在张力下，以防止在该层压过程中发生意外变形。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该复合材料随后被赋予亲水性。图19所示的SEM图像是第一ePTFE层(细胞不可渗透层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图20所示的SEM图像是第二ePTFE层(缓解层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图21是包括第一ePTFE层2110(细胞不可渗透层)和第二ePTFE层2120(缓解层)的两层复合材料2100的横截面结构的代表性图像的SEM图像。

第三层(血管化层)是市售的纺粘聚酯非织造材料。第三层的代表性表面微结构显示在图15的SEM图像中。通过以下方式将第三层组装到具有第一层和第二层的复合材料中：将第三层放置在第二层的顶部上，并在上文测试方法部分中描述的复合材料整合成装置形式的过程中将第三层仅在周边位置离散地熔接到复合材料。

生物相容性膜复合材料的表征

生物相容性膜复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法是根据上述测试方法部分中所述的方法进行的。结果总结在表4中。

表4

体内生物相容性膜复合材料的评估

根据以上测试方法部分中提出的生物相容性膜复合材料整合成装置形式，将生物相容性膜复合材料热熔接成装置形式并进行体内评估。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了装置的所有层，直至细胞不可渗透的ePTFE紧密层。在该界面处，在细胞不可渗透层上仍然可以看到异物巨细胞，对新血管形成产生了屏障，如比较例1中所见。图22是观察与细胞不可渗透层2220邻接的异物巨细胞(由箭头2210表示)的代表性组织学图像。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估功能反应。结果显示在表3中。低水平的c-肽表明装置中存在低水平的胰岛素产生细胞。与比较例1相比，功能没有明显增加。

实施例1

制造生物相容性膜复合材料

构建具有三个不同层的生物相容性膜复合材料。首先，通过分层然后使第一ePTFE层(细胞不可渗透层)和第二ePTFE层(缓解层)共膨胀来制备两层ePTFE复合材料，该第一ePTFE层由根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导制备的干燥的双轴膨胀膜构成，该第二ePTFE层由根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导制备的糊状挤出压延带构成。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该两层ePTFE复合材料双轴膨胀，随后被赋予亲水性。该第一ePTFE层提供了紧密的、细胞不可渗透的界面，同时仍然能够进行氧和营养物质的传质。第一层的代表性表面微结构显示在图23的SEM图像中。第二层ePTFE膜(缓解层)减少了在第一层ePTFE层界面处异物巨细胞的形成。第二ePTFE膜的代表性表面微结构如图24所示。显示包括第一ePTFE膜2510(细胞不可渗透层)和第二ePTFE膜2520(缓解层)的复合材料2500的微结构的代表性横截面显示在图25的SEM图像中。

第三层(血管化层)是市售的纺粘聚酯非织造材料。第三层的代表性表面微结构显示在图15的SEM图像中。通过以下方式将该第三层组装到具有第一层和第二层的复合材料中：将纺粘聚酯非织造物放置在第二层的顶部上，并在上文测试方法部分中描述的复合材料整合成装置形式的过程中将纺粘聚酯非织造物仅在周边处离散地熔接到复合材料。

生物相容性膜复合材料的表征

生物相容性膜复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法根据上述“测试方法”部分中描述的方法进行。结果总结在表5中。

表5

复合膜性能的评估

根据以上测试方法部分中提出的生物相容性膜复合材料整合成装置形式，将生物相容性膜复合材料热熔接成装置形式并进行体内评估。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了聚酯织造网加强组件、聚酯非织造血管化层和开放ePTFE缓解层，直至紧密ePTFE细胞不可渗透层。虽然异物巨细胞存在于聚酯织造网(加强组件)和聚酯非织造层(血管化层)内，但没有观察到沿着紧密ePTFE层(细胞不可渗透层)的异物巨细胞。图26所示的组织学图像是该观察的代表性图像，其中箭头2610指示异物巨细胞相对于生物相容性膜复合材料2600的每一层的位置。另外，如图26所示，在细胞不可渗透层2620的表面上没有形成异物巨细胞(由箭头2610指示)。

可以得出结论，本实施例中所述的由细胞不可渗透层、缓解层和血管化层形成的生物相容性膜复合材料2600减少了细胞不可渗透层2620的表面上异物巨细胞(由箭头2610指示)的形成。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估功能反应。表3所示的结果表明与比较例相比功能反应的阶跃变化，这表明产生胰岛素的细胞的活力显著增加。在植入后23周，响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌来测量c-肽血清浓度，平均为488.8pM，是没有缓解层的比较例1的3.9倍。

实施例2

制造生物相容性膜复合材料

构建具有三个不同层的复合材料。根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导形成第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)。

根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导制备第二ePTFE膜(缓解层)。在机器方向(MD)膨胀处理中，将氟化乙烯丙烯(FEP)膜施加到第二ePTFE膜上。根据Bacino的WO/94/13469的教导，随后通过机器方向(MD)膨胀和横向(TD)膨胀对第二ePTFE膜和FEP进行共加工，由此FEP在第二ePTFE膜上变得不连续。图27所示的SEM图像是其上具有不连续的FEP层2700的第二ePTFE膜表面2710的代表性图像。

通过使材料(FEP位于两个ePTFE膜之间)在高于FEP熔点的温度下接触，将其上包括不连续FEP层的第二ePTFE层层压到第一ePTFE层上。在层压过程中，两个ePTFE层在横向上不受限制。然后将层压件在高于聚四氟乙烯(PTFE)熔点的条件下横向膨胀，使得每个ePTFE层恢复到在任何通过层压持续的颈缩之前的宽度。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该复合材料随后被赋予亲水性。图19所示的SEM图像是第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图28所示的SEM图像是第二ePTFE膜(缓解层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图29所示的SEM图像是两层复合材料2900(即，第一ePTFE膜2910(细胞不可渗透层)和第二ePTFE膜2920(缓解层))的横截面结构的代表性图像。

第三层(血管化层)是市售的纺粘聚酯非织造材料。第三层的代表性表面微结构显示在图15的SEM图像中。通过以下方式将该第三层组装到具有第一层和第二层的复合材料中：将纺粘聚酯非织造材料放置在第二ePTFE层的顶部上，并在上文测试方法部分中描述的复合材料整合成装置形式的过程中将纺粘聚酯材料在周边位置处离散地熔接。

生物相容性膜复合材料的表征

生物相容性膜复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法根据上述测试方法中描述的进行。结果总结在表6中。

表6

复合膜性能的评估

根据以上测试方法部分中提出的生物相容性膜复合材料整合成装置形式，将生物相容性膜复合材料热熔接成装置形式并进行体内评估。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了聚酯织造网加强组件、聚酯非织造血管化层和开放ePTFE缓解层，直至紧密ePTFE细胞不可渗透层。虽然异物巨细胞存在于聚酯织造网(加强组件)和聚酯非织造层(血管化层)内，但没有观察到沿着紧密ePTFE层(细胞不可渗透层)的异物巨细胞。图45所示的组织学图像是该观察的代表性图像，其中箭头4510指示异物巨细胞相对于生物相容性膜复合材料4500的每一层的位置。另外，如图45所示，在细胞不可渗透层4520的表面上没有形成异物巨细胞(由箭头4510指示)。可以得出结论，本实施例中所述的由细胞不可渗透层、缓解层和血管化层形成的生物相容性膜复合材料4500减少了细胞不可渗透层4520的表面上异物巨细胞(由箭头4510指示)的形成。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估功能反应。表3所示的结果表明与比较例相比功能反应的阶跃变化，这表明产生胰岛素的细胞的活力显著增加。在植入后24周，响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌而测量的c-肽血清浓度平均为615pM，明显高于没有缓解层的比较例1的结果。得出的结论是，为了实现这种功能反应程度的增加，缓解层能够成功地减轻细胞不可渗透界面处异物巨细胞的形成。

实施例3

制造生物相容性膜复合材料

构建具有三个不同层的生物相容性膜复合材料。首先，通过分层然后使第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)和第二ePTFE层(缓解层)共膨胀来制备两层ePTFE复合材料，该第一ePTFE膜由根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导制备的干燥的双轴膨胀膜构成，该第二ePTFE层由根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导制备的糊状挤出压延带构成。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该两层ePTFE复合材料双轴膨胀，随后被赋予亲水性。该第一ePTFE膜提供了紧密的、细胞不可渗透的界面，同时仍然能够进行氧和营养物质的传质。第一ePTFE膜的代表性表面微结构显示在图30的SEM图像中。第二ePTFE膜的代表性表面微结构如图31所示。包括第一ePTFE膜3210(细胞不可渗透层)和第二ePTFE膜3220(缓解层)的两层ePTFE复合材料3200的代表性横截面显示在图32所示的SEM图像中。

第三层(血管化层)是市售的纺粘聚酯非织造材料。纺粘聚酯非织造材料的代表性表面微结构显示在图15的SEM图像中。通过以下方式将该第三层组装到具有两层复合材料的复合材料中：将纺粘聚酯非织造材料放置在两层复合材料的第二ePTFE膜的顶部上，并在上文测试方法部分中描述的复合材料整合成装置形式的过程中在周边位置处进行离散地熔接。

生物相容性膜复合材料的表征

生物相容性膜复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法根据上述“测试方法”部分中描述的方法进行。结果总结在表7中。

表7

复合膜性能的评估

根据以上测试方法部分中提出的生物相容性膜复合材料整合成装置形式，将生物相容性膜复合材料热熔接成装置形式并进行体内评估。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了聚酯织造网加强组件、聚酯非织造血管化层和开放ePTFE缓解层，直至紧密ePTFE细胞不可渗透层。虽然异物巨细胞存在于聚酯织造网(加强组件)和聚酯非织造层(血管化层)内，但没有观察到沿着紧密ePTFE层(细胞不可渗透层)的异物巨细胞。图46所示的组织学图像是该观察的代表性图像，其中箭头4610指示异物巨细胞相对于生物相容性膜复合材料4600的每一层的位置。另外，如图46所示，在细胞不可渗透层4620的表面上没有形成异物巨细胞(由箭头4610指示)。可以得出结论，本实施例中所述的由细胞不可渗透层、缓解层和血管化层形成的生物相容性膜复合材料4600减少了细胞不可渗透层4620的表面上异物巨细胞(由箭头4610指示)的形成。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估功能反应。表3所示的结果表明与比较例相比功能反应的阶跃变化，这表明产生胰岛素的细胞的活力显著增加。在植入后24周，响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌而测量的c-肽血清浓度平均为556pM，是不存在缓解层的比较例1的4.5倍。为了实现这种程度的功能反应，得出的结论是，缓解层能够成功地减轻细胞不可渗透界面处异物巨细胞的形成。

实施例4

制造生物相容性膜复合材料

构建具有三个不同层的生物相容性膜复合材料。根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导形成由ePTFE膜构成的第一层(细胞不可渗透层)。

根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导制备第二ePTFE膜(FBGC缓解层)。在初始机器方向(MD)膨胀步骤中，将氟化乙烯丙烯(FEP)膜施加到第二ePTFE膜上。根据Bacino的WO/94/13469的教导，随后通过机器方向(MD)膨胀和横向(TD)膨胀对第二ePTFE膜和FEP进行共加工，由此FEP在第二ePTFE膜上变得不连续。图33所示的SEM图像是其上具有不连续的FEP 3310的第二ePTFE膜3300的表面的代表性图像。

通过使两个ePTFE膜材料在高于FEP熔点的温度下接触(FEP位于两个ePTFE膜之间)，将包括不连续FEP层的第二ePTFE层层压到第一ePTFE层上。两个ePTFE层都保持在张力下，以防止在该层压过程中发生意外变形。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该层压件随后被赋予亲水性。图19所示的SEM图像是第一ePTFE层(细胞不可渗透层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图34所示的SEM图像是第二ePTFE膜(缓解层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图35所示的SEM图像是具有第一ePTFE膜3510(细胞不可渗透层)和第二ePTFE膜3520(缓解层)的双层ePTFE层压件3500的横截面结构的代表性图像。

第三层(血管化层)是市售的纺粘聚酯非织造材料。第三层的代表性表面微结构显示在图15的SEM图像中。通过以下方式将该第三层和ePTFE层压件组装到具有第一和第二ePTFE层的生物相容性膜复合材料中：将纺粘聚酯非织造材料放置在第二ePTFE膜的顶部上，并在上文测试方法部分中描述的生物相容性膜复合材料整合成装置形式的过程中将纺粘聚酯非织造材料在周边处离散地熔接到两层ePTFE复合材料的第二ePTFE膜上。

生物相容性膜复合材料的表征

生物相容性膜复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法根据上述测试方法部分中描述的进行。结果总结在表8中。

表8

复合膜性能的评估

根据以上测试方法部分中提出的生物相容性膜复合材料整合成装置形式，将生物相容性膜复合材料热熔接成装置形式并进行体内评估。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了聚酯织造网加强组件、聚酯非织造血管化层和开放ePTFE缓解层，直至紧密ePTFE细胞不可渗透层。虽然异物巨细胞存在于聚酯织造网(加强组件)和聚酯非织造层(血管化层)内，但沿着紧密ePTFE层(细胞不可渗透层)没有观察到异物巨细胞的形成。图36的组织学图像是该观察的代表性图像，其中箭头3610指示异物巨细胞相对于生物相容性膜复合材料的每一层的位置。另外，如图36所示，在细胞不可渗透层3620的表面上没有形成异物巨细胞3610。可以得出结论，本实施例中所述的由细胞不可渗透层、缓解层和血管化层形成的生物相容性膜复合材料减少了细胞不可渗透层的表面上异物巨细胞的形成。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估功能反应。表3的结果表明与比较例相比功能反应的阶跃变化，这表明产生胰岛素的细胞的活力显著增加。在植入后24周，响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌来测量c-肽血清浓度，其平均为208pM，明显高于没有缓解层的比较例1的结果。

实施例5

制造生物相容性膜复合材料

构建具有三个不同层的生物相容性膜复合材料。根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导形成第一层(细胞不可渗透层)，该第一层由ePTFE膜形成。

形成由第二ePTFE膜(缓解层)和第三ePTFE层(血管化层)构成的两层复合材料。根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导制备第二ePTFE膜。根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导，通过低于熔点(below-the-melt)的MD膨胀步骤对第二ePTFE层的ePTFE带前体进行处理。在第二ePTFE带前体的低于熔点MD膨胀步骤期间，根据Bacino的WO 94/13469的教导施加FEP膜。根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导，通过非晶态锁定步骤步骤对第三ePTFE层的ePTFE带前体进行处理。在第三ePTFE带前体的第一低于熔点MD膨胀步骤期间，根据Bacino的WO/94/13469的教导施加FEP膜。将第三ePTFE膜的膨胀ePTFE带前体层压到第二ePTFE膜的膨胀ePTFE带前体上，使得第三ePTFE带的FEP侧与第二ePTFE膜的ePTFE带前体的PTFE侧接触。然后将两层复合材料在高于PTFE熔点的温度下沿机器方向和横向共膨胀。其上具有FEP 3710的第二ePTFE层3700的代表性表面微结构显示在图37的SEM图像中。

将由第二ePTFE膜(缓解层)和第三ePTFE膜(血管化层)构成的两层复合材料层压到第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)上。通过首先使两层ePTFE复合材料与第三ePTFE层(FEP位于两层之间)在高于FEP熔点的温度下接触并且ePTFE膜在横向上不受限制，将其上包括不连续FEP层的第二ePTFE膜的一侧层压到第一ePTFE层上。然后将层压件在高于PTFE熔点的条件下横向膨胀，使得各层恢复到在任何通过层压持续的颈缩之前的宽度。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该复合材料随后被赋予亲水性。图19所示的SEM图像是第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图38所示的SEM图像是第三ePTFE膜(血管化层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图39所示的SEM图像是三层生物相容性膜复合材料的横截面结构3900的代表性图像，所述三层生物相容性膜复合材料包括第一ePTFE膜3910(细胞不可渗透层)、第二ePTFE膜3920(缓解层)和第三ePTFE膜3930(血管化层)。

生物相容性膜复合材料的表征

生物相容性膜复合材料的每一层都被评估并表征了各层功能所需的相关参数。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关参数的方法根据上述“测试方法”部分中描述的方法进行。结果总结在表9中。

表9

复合膜性能的评估

根据以上测试方法部分中提出的生物相容性膜复合材料整合成装置形式，将生物相容性膜复合材料热熔接成装置形式并评估体内功能性能。

根据上文测试方法部分中提出的体内猪研究对宿主组织反应进行评估。装置界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了聚酯织造网加强组件、开放ePTFE血管化层和开放ePTFE缓解层，直至紧密ePTFE细胞不可渗透层。虽然异物巨细胞存在于聚酯织造网(加强组件)内，但没有观察到沿着紧密ePTFE层(细胞不可渗透层)的异物巨细胞。图47所示的组织学图像是该观察的代表性图像，其中箭头4710指示异物巨细胞相对于生物相容性膜复合材料4700的每一层的位置。另外，如图47所示，在细胞不可渗透层4720的表面上没有形成异物巨细胞(由箭头4710指示)。可以得出结论，本实施例中所述的由细胞不可渗透层、缓解层和血管化层形成的生物相容性膜复合材料4700减少了细胞不可渗透层4720的表面上异物巨细胞(由箭头4710指示)的形成。

根据上文测试方法部分中提出的体内裸鼠研究在体内评估装载有细胞的装置的功能反应。表3的结果表明与比较例相比功能反应的阶跃变化，这表明产生胰岛素的细胞的活力显著增加。在植入后24周，响应于葡萄糖刺激的胰岛素分泌而测量的c-肽血清浓度平均为337pM，是不存在缓解层的比较例1的2.7倍。得出的结论是，为了实现这种功能反应程度的增加，缓解层能够成功地减轻细胞不可渗透表面处异物巨细胞的形成。

实施例6

制造生物相容性膜复合材料

制备实施例5中描述的生物相容性膜复合材料并使其形成为平面装置4100，该装置包括加强组件4130，总体上如图41所示。该实施例中描述的平面装置与之前描述的装置(即实施例1-5中的装置)的区别在于平面装置基于加强组件(如图40所示)，该加强组件位于与生物相容性膜复合材料的细胞不可渗透层相邻的位置。与在前面的实施例中由织造聚酯网提供的外部加强组件相反，该加强组件位于平面装置(例如，内骨骼)的内腔内。加强组件4000包括加强组件4010和一体式填充管4020，该填充管具有流通孔4030以到达加强组件4000的两侧。

平面装置4100总体上在图41中示出(分解图)。如图41所示，平面装置4100包括第一生物相容性膜复合材料4110、第二生物相容性膜复合材料4140和加强组件4130，该加强组件4130包括加强组件4120和一体式填充管4150，该填充管具有流通孔4160，从而在生物相容性膜4110、4140整合成最终的装置形式时，该流通孔进入形成在加强组件4130两侧上的双内腔(未示出)。

通过将一片TFE、HFP和VDF的含氟热塑性三元共聚物放入模腔中并在设定温度高于聚合物软化温度的热压机(Wabash C30H-15-CPX)中压缩三元共聚物以使其符合最终尺寸和形状来构建加强组件。所得加强组件的厚度约为270微米，刚度为0.7N。

将两个生物相容性膜复合材料切成约1”x 2”(2.54cm X 5.08cm)并设置在加强组件的两侧，各膜复合材料的细胞不可渗透层向内朝向内腔和平面加强组件。平面装置4100的各个组件的分解图如图41所示。

平面装置如图42所示。为了产生平面装置4200，通过以下方式形成熔接：使用脉冲熔接机沿周边4210对图41所示的材料堆叠体进行压缩并施加温度和压力以使加强组件热塑性软化到足以在各复合膜中形成结合。通过用热头装置施加轻微的手动压力，将加强组件的内部点结合到每个膜复合材料表面，以在每侧12个位置处产生直径约1mm的内部点结合4220，间隔至少1.45mm。通过测试在5psi的内部压力下浸没在异丙醇中时视觉上检测为气泡流的泄漏是否存在来评估熔接的完整性是否合适。加强组件4310和内腔4330的内部几何结构在图43A和图43B中示出。图43A描绘了沿线A-A截取的平面装置4200的横截面，示出了单个点结合4320和内腔4330。图43B是沿线B-B截取的平面装置4200的横截面图像，示出了两个点结合3620和内腔3630。图42中所示的成品平面装置填充有低粘度硅橡胶，以允许更好地可视化和成像图42A和42B中所示的加强组件4210。

体内复合膜性能的评估

在上述方法部分中阐述的评估宿主组织反应的体内猪研究中评估了整合到上述平面装置中的生物相容性复合膜的功能性能。平面装置与宿主组织界面处的宿主组织反应表明宿主组织穿透了开放ePTFE血管化层和缓解层，直至紧密ePTFE细胞不可渗透层。在膜复合材料中观察到的异物巨细胞很少。图44所示的组织学图像是观察的代表性图像，其中没有宿主穿透ePTFE血管化层4430和ePTFE缓解层4420，并且没有明显观察到在膜复合材料中或周围(包括在细胞不可渗透界面4410处)形成异物巨细胞。可以得出结论，本实施例中所述的由细胞不可渗透层4410、缓解层4420和血管化层形成4430形成的生物相容性膜复合材料4400减少了细胞不可渗透层4410的表面上异物巨细胞的形成。还显示内腔4440以供参考。

根据上文测试方法部分中提出的裸鼠外植体组织学来评估载有细胞的平面装置4200的功能性能。所述装置的横截面的代表性组织学图像在图48中示出。从组织学图像的评估中，可以得出结论，在平面装置4200的内腔中包含内部加强组件成功地实现了24周时的体内细胞活力，如图48中的活细胞4810所证明的。

实施例7

制造生物相容性膜复合材料

使用具有三层的三种不同复合膜来构建实施例6中描述的细胞封装装置形式。第一层(细胞不可渗透层)和第二层(缓解层)在所有三个构建体中都是相似的。但是，第三层(血管化层)在三个构建体中是不同的。这些构建体在本部分中将被称为构建体A、构建体B和构建体C。

对于所有三个构建体，根据戈尔的美国专利第3,953,566号的教导形成第一层(细胞不可渗透层)，该第一层由ePTFE膜形成。

对于所有三个构建体，形成由第二ePTFE膜(缓解层)和第三ePTFE层(血管化层)构成的两层复合材料。根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导制备第二ePTFE膜。根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导，通过低于熔点(below-the-melt)的MD膨胀步骤对第二ePTFE层的ePTFE带前体进行处理。在第二ePTFE带前体的低于熔点MD膨胀步骤期间，根据Bacino的WO 94/13469的教导施加FEP膜。根据Branca等人的美国专利第5,814,405号的教导，通过非晶态锁定步骤和高于熔点(above-the-melt)MD膨胀步骤对第三ePTFE层的ePTFE带前体进行处理。每个构建体的第三层在成层之前的加工过程中经受不同的工艺条件，以在构建体A、构建体B和构建体C的第三层中实现所需的微结构。在第三ePTFE带前体的第一低于熔点MD膨胀步骤期间，根据Bacino的WO94/13469的教导施加FEP膜。将第三ePTFE膜的膨胀ePTFE带前体层压到第二ePTFE膜的膨胀ePTFE带前体上，使得第三ePTFE带的FEP侧与第二ePTFE膜的ePTFE带前体的PTFE侧接触。然后将两层复合材料在高于PTFE熔点的温度沿机器方向和横向共膨胀。构建体A、构建体B和构建体C的其上具有FEP 5620的第二ePTFE层的代表性表面微结构显示在图56的扫描电子显微照片(SEM)图像中。

将由第二ePTFE膜(缓解层)和第三ePTFE膜(血管化层)构成的两层复合材料层压到第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)上。通过首先使两层ePTFE复合材料与第三ePTFE层(FEP位于两层之间)在高于FEP熔点的温度下接触并且ePTFE膜在横向上不受限制，将其上包括不连续FEP层的第二ePTFE膜的一侧层压到第一ePTFE层上。然后将层压件在高于PTFE熔点的条件下横向膨胀，使得各层恢复到在任何通过层压持续的颈缩之前的宽度。根据Butler等人的美国专利第5,902,745号中的教导，该复合材料随后被赋予亲水性。图19所示的SEM图像是第一ePTFE膜(细胞不可渗透层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图50，图51和图52显示的SEM图像分别是各构建体A、B和C的第三ePTFE膜(血管化层)的节点和原纤维结构的代表性图像。图53、图54和图55所示的SEM图像是三层生物相容性膜复合材料的横截面结构的代表性图像，所述三层生物相容性膜复合材料包括第一ePTFE膜5320、5420和5520(细胞不可渗透层)、第二ePTFE膜5340、5440和5540(缓解层)和第三ePTFE膜5360、5460和5560(血管化层)。

生物相容性膜复合材料的表征

每个生物相容性膜复合材料都针对每一层的相关性质进行了评估和表征。如果层的参数与该层的特定功能无关，则将其标记为“N/A”。如果由于复合材料层的处理方式而实际上无法获得层的参数，则将其标记为“—”。用于表征相关性质的方法根据上述测试方法部分中描述的方法进行。

表10说明了三(3)种不同的生物相容性膜复合材料。所有三种生物相容性膜复合材料都具有相同的细胞不可渗透层和FBGC缓解层，但血管化层在构建体A(血管化A)、构建体B(血管化B)和构建体C(血管化C)中有所不同。三种生物相容性膜复合材料的组件的性质示于表10中。

表10

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请注意，每个构建体下列出的这些性质的值是针对每个构建体中所有三层的体相值(bulk value)，而不仅仅是第三层(血管化层)

体内复合膜性能的评估

如实施例6所述，将三种生物相容性膜复合材料整合成细胞封装装置。

根据上文测试方法部分中提出的裸鼠外植体组织学来评估载有细胞的装置(构建体A、B和C)的功能性能。具有不同血管化层的装置即构建体A、B和C的横截面的代表性组织学图像分别显示在图49A、49B和49C中。从组织学图像的评估中，可以得出结论，异物巨细胞(FBGC)在细胞不可渗透层上的形成得到减轻，并且包括位于平面装置构建体A 4900、构建体B 4910和构建体C 4930的内腔中的内部加强组件成功地实现了体内细胞活力，如图49A、49B和49C中的活细胞4920、4940和4960所证明的。

上文中已经概括性地并且结合具体实施方式描述了本申请的发明。对本领域的技术人员来说显而易见的是，可以在不偏离本公开的范围的情况下，对实施方式进行各种修改和变动。因此，实施方式旨在覆盖对本发明的这些修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求及其等同方案的范围之内。

Claims (31)

1.一种生物相容性膜复合材料，其包括：

第一层，所述第一层是细胞不可渗透的；

第二层，所述第二层具有有效直径为1微米至9微米的孔径，具有小于60微米的第一厚度，以及第一实体特征体，所述第一实体特征体的大于50%的第一实体特征体间距小于50微米；和

第三层，所述第三层具有有效直径大于9微米到200微米的孔径，具有第二实体特征体，所述第二实体特征体的大于50%的第二实体特征体间距大于50微米，

其中大于50%的第一实体特征体具有3微米到20微米的代表性短轴，

其中大于50%的第二实体特征体具有大于或等于20微米且小于40微米的代表性短轴，以及

其中，第二层位于第一层和第三层之间。

2.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第一层具有孔，所述孔具有直径小于1微米的最大孔径(MPS)。

3. 如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第一层的单位面积质量(MpA)小于5 g/m²。

4.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第一层具有小于10微米的第二厚度。

5. 如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，生物相容性膜复合材料在最弱轴上的最大拉伸载荷大于40 N/m。

6.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第二层的第一实体特征体各自包括代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度，并且

其中，第二层的第一实体特征体的大部分具有的代表性短轴、代表性长轴和实体特征体深度中的至少两者大于5微米。

7.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，与第一层接触的第一实体特征体的至少一部分是结合的实体特征体。

8.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第二层的第一实体特征体通过原纤维连接并且原纤维是可变形的。

9.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，所述第三层具有30微米到200微米的第三厚度。

10.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第三层的第二实体特征体包括织造或非织造纺织品，并且其中第三层的第二实体特征体的第二代表性短轴是织造或非织造纺织品中纤维的直径。

11.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第一层、第二层和第三层中的至少两者紧密结合。

12.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第一层和第二层紧密结合。

13.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第三层的第三厚度大于第一层的第二厚度与第二层的第一厚度之和。

14.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第一层、第二层和第三层中的至少一者是含氟聚合物膜。

15.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，所述第三层是纺粘非织造聚酯材料。

16.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其包括加强组件。

17.如权利要求16所述的生物相容性膜复合材料，其中，所述加强组件包括织造或非织造纺织品。

18.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，第二层的第一实体特征体包括选自热塑性聚合物、聚氨酯、硅酮、橡胶、环氧树脂及其组合的一种。

19.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，所述生物相容性膜复合材料在其上具有表面涂层，所述表面涂层选自抗微生物剂、抗体、药物和生物活性分子。

20.如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，其中，所述生物相容性膜复合材料具有至少部分在其上的亲水性涂层。

21.一种细胞封装装置，其包括如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料。

22. 如权利要求21所述的细胞封装装置，其中，所述装置包含PDX1 阳性胰腺内胚层细胞、胰腺祖细胞、内分泌前体细胞、内分泌细胞、未成熟β细胞或成熟内分泌细胞。

23. 一种细胞封装装置，其包括：

第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料，所述第一生物相容性膜复合材料沿其外周的至少一部分与第二生物相容性膜复合材料沿其外周的至少一部分相密封，以在它们之间限定内腔；和

至少一个与所述内腔流体连通的端口，

其中，第一生物相容性膜和第二生物相容性膜中的至少一个包括如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料。

24.如权利要求23所述的细胞封装装置，其包括内部加强组件。

25.如权利要求24所述的细胞封装装置，其中，内部加强组件包括填充管。

26.如权利要求23所述的细胞封装装置，其中，第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料中的至少一者包括内部加强组件。

27.如权利要求23所述的细胞封装装置，其中，第一生物相容性膜复合材料和第二生物相容性膜复合材料中的至少一者包括外部加强组件。

28.如权利要求23所述的细胞封装装置，其包括熔接膜，所述熔接膜构造为将第一生物相容性膜与第二生物相容性膜熔接。

29.如权利要求23所述的细胞封装装置，其中，所述细胞封装装置包括第一熔接膜和第二熔接膜，所述第一熔接膜在第一生物相容性膜复合材料和位于第一生物相容性膜复合材料外部的第一加强组件之间，所述第二熔接膜在第二生物相容性膜复合材料和位于第二生物相容性膜复合材料外部的第二加强组件之间。

30.一种用于降低哺乳动物中血糖水平的方法，所述方法包括：

移植包含如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料的细胞封装装置，

其中封装在其中的细胞包括PDX1阳性胰腺内胚层细胞、胰腺祖细胞、内分泌前体细胞、内分泌细胞、未成熟β细胞或成熟内分泌细胞的群，并且

其中所述PDX1阳性胰腺内胚层细胞、胰腺祖细胞、内分泌前体细胞、内分泌细胞、未成熟β细胞或成熟内分泌细胞成熟为胰岛素分泌细胞，从而降低血糖。

31.一种在体内产生胰岛素的方法，所述方法包括：

将细胞封装装置移植，所述细胞封装装置包括如权利要求1所述的生物相容性膜复合材料，

其中，封装在其中的细胞包括成熟为胰岛素分泌细胞的PDX-1胰腺内胚层细胞、胰腺祖细胞、内分泌前体细胞、内分泌细胞、未成熟β细胞或成熟内分泌细胞的群，并且

其中胰岛素分泌细胞响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素。