CN110167455B - 含有pdx1胰腺内胚层细胞的细胞递送装置及其方法 - Google Patents

Abstract

公开了将细胞(诸如胰腺内胚层细胞)移植至宿主内的装置和方法。所述装置包括位于排斥细胞的膜外部的非纺织织物，并且所述非纺织织物和/或排斥细胞的膜可以是穿孔的。用免疫抑制试剂治疗宿主不危害移植的胰腺内胚层细胞的成熟或功能，所述免疫抑制试剂是抑制由于细胞递送装置中的穿孔而造成的同种异体移植排斥所必需的。

Description

含有PDX1胰腺内胚层细胞的细胞递送装置及其方法

技术领域

本发明涉及用于递送细胞(诸如胰腺内胚层细胞)的装置及它们的用途的领域。

支持声明

本发明部分由加州再生医学研究所(the California Institute ofRegenerative Medicine)资助。

发明背景

已经尝试了几种方法用于在装置中植入活细胞或组织。例如，先前已经报道了穿孔的细胞递送装置。参见美国申请第12/618,659号和WO 1993002635，其通过引用整体并入本文中。在这些公开中，细胞递送装置的每层都是穿孔的，即，穿孔贯穿装置的每个壁或整个装置(所有层)。当装置的每层都是穿孔的时，细胞可从装置逃逸。

Valentini等人在美国专利第4,877,029号(其通过引用整体并入本文中)中描述了半渗透的神经导引通道或管，其由细胞不可渗透的平滑内膜面和形成骨小梁配置的具有孔的外表面组成，所述孔的大小范围为1-20微米。该骨小梁配置不包括贯穿管的厚度的孔洞(孔)，并因此该配置不允许血管生长至内隔室内。

非纺织织物已被用于细胞递送装置内。非纺织织物在递送装置内提供了惰性支架，其提供了用于将细胞在装置内贴附和分配的结构。参见美国专利第5,853,717号(通过引用整体并入)。

非纺织织物也已被用于环绕葡萄糖监测装置。美国专利第8,527,026号(其通过引用整体并入本文中)描述了由膨体聚四氟乙烯(ePTFE)的血管生成层环绕的传感器，并且NWF可被层压在ePTFE上。在‘026专利中，通过传感器测量患者的血糖水平。

尽管已经开发出了许多策略来封装细胞并促进它们的体内存活，但是仅报道了好坏参半的结果。因此，仍然需要用于促进移植的细胞的成熟或功能的移植细胞装置和方法。

发明概述

提供了递送细胞的医疗装置以及促进植入细胞的细胞存活、分化和成熟的方法。具体而言，本文所描述的实施方案通过在排斥细胞的膜外部提供非纺织织物(NWF)(例如非纺织聚酯织物(NWPF))，改善了宿主的组织和递送装置之间的界面，以改善移植体的血管形成。本文所描述的实施方案包括仅在NWF和排斥细胞的膜中的穿孔，以改善移植体的血管形成。本文所描述的实施方案调控宿主免疫应答，其改善细胞存活。

在一些实施方案中，公开了组合产品，其包括：(a)包含非纺织织物层的细胞递送装置，和(B)PDX1阳性的胰腺内胚层细胞。

在其他实施方案中，公开了在哺乳动物中产生胰岛素的方法。该方法包括：a)向哺乳动物宿主施用免疫抑制药；b)将包含胰腺内胚层细胞的穿孔装置植入所述哺乳动物宿主内；和c)使所述穿孔装置中的胰腺内胚层细胞群在哺乳动物宿主内成熟，使得祖细胞群产生分泌胰岛素的细胞。

附图说明

图1A-1D示出了与本公开一致的递送装置。

图2A-2D各自为穿孔细胞递送装置的实施方案。

图3的图显示了总C-肽蛋白含量与被表示为胰岛当量(IEQ)的β细胞质量之间相关性。该图可被用于确定在穿孔细胞封装装置中植入胰腺细胞后产生的β细胞质量，其被表示为胰岛当量(IEQ)。

图4为具有添加的非纺织织物层的细胞递送装置的横截面的图像。

图5的图显示了植入在针穿孔递送装置(对照，CON)和在激光穿孔装置中递送的胰腺祖细胞的大鼠血清中人c-肽的浓度。移植后12周在空腹时以及在腹膜内葡萄糖施用后60min分析分泌的C-肽水平。平均c-肽浓度(+/-SEM)。“M”是指用针手动形成的孔洞，并且近似2mm的间距。

图6的图显示了植入在针(手动地)穿孔递送装置(对照，CON)和在激光穿孔装置中递送的胰腺祖细胞的大鼠血清中人c-肽的浓度。移植后34周在空腹时，在腹膜内葡萄糖施用后15min和30min分析分泌的C-肽水平。“M”是指用针手动形成的孔洞，并且约近似2mm的间距。

图7的图显示了在植入后10、16、36和39周，来自先前已植入了在穿孔装置中递送的胰腺祖细胞的大鼠的外植移植体中的总C-肽蛋白含量。用于产生第10和16周数据的穿孔装置类似于图1D，除了NWF未被层压至排斥细胞的膜，且具有隔开2mm的孔洞。使用的NWPF具有1.00oz/yd²的基本重量，和228μm的公称厚度，以及26μm的纤维直径。用于产生第36周数据的穿孔装置与第16周的装置相同，除了它们不具有NWF。用于产生第39周数据的穿孔装置与第16周的装置相同，除了使用的NWF具有0.75oz/yd²的基本重量，并且孔洞间距为2mm。

图8的图显示了与植入小鼠内类似时间段的完整的装置相比，通过将在穿孔装置中的胰腺内胚层细胞植入大鼠大约9个月，在个体移植体中实现了β细胞质量的约5倍增加。

图9为在c-肽已经达到稳定时期后完整和穿孔细胞递送装置的横截面的图片。与完整的装置相比，穿孔装置已经膨胀，并且含有更多的产生胰岛素的细胞(β细胞)。

图10A和10B的图显示了被植入了在穿孔递送装置中递送的胰腺内胚层的喂食正常食物(对照)或含有250mg/kg环孢霉素A(CsA-250)的食物的裸大鼠血清中大鼠或人c-肽的浓度。图10A显示了在第12周时接受环孢霉素A的动物中完全缺乏内源性大鼠β细胞的功能。图10B显示了CsA治疗的大鼠具有轻微升高的人c-肽水平，这是由于内源性β细胞的CsA毒性。

图11的图显示了被植入了在穿孔递送装置中的胰腺内胚层的喂食正常食物(对照)，或含有250mg/kg环孢霉素A(CsA-250)的食物，或含有250mg/kg环孢霉素A和500mg/kg霉酚酸酯(CsA-250+MMF500)的食物，或含有150mg/kg他克莫司和500mg/kg霉酚酸酯(TAC-150+MMF500)的食物的大鼠血清中人c-肽的浓度。CsA治疗的大鼠具有轻微升高的血糖水平，这是由于内源性β细胞的ISD毒性。

图12的图显示了在第11周(◆)、第14周(■)和第18周(●)时被植入了在穿孔的或未穿孔的(完整的)递送装置中递送的胰腺内胚层的喂食正常食物(对照)或含有CsA-MMF的食物的裸大鼠血清中人c-肽的浓度。

发明详述

现在将详细的介绍本公开的实施方案，其实例在附图中示出。只要有可能，在整个附图中将使用相同的参考号来指相同或相似的部分。

术语解释

除非另有注释，否则根据常规用法来使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可见于：Benjamin Lewin,Genes V，由牛津大学出版社(Oxford University Press)出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of MolecularBiology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

治疗剂：在一些实施方案中，细胞递送装置包含治疗剂。术语“治疗剂”是指提供针对给定疾病或致病剂(诸如微生物)的治疗性或预防性结果的任何试剂。优选地，治疗剂为封装的细胞、细胞聚集体、类器官、簇、团块、组织或针对癌细胞的毒素(诸如阿霉素、道诺霉素、表柔比星、长春花碱、长春新碱、米托蒽醌、博来霉素、丝裂霉素、二氯甲基二乙胺等)。治疗剂可以为抗体或其片段、DNA分子或RNA分子。另外，治疗剂还可包含抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂，或进一步促进细胞疾病或病症的治疗或预防的任何其他试剂。在一些实施方案中，治疗剂为如下文定义的待植入的细胞。

植入的细胞：在一个实施方案中，移植位点或递送装置装载有“细胞”，其也称为“植入的细胞”，或“外源性细胞”，或“适合移植的细胞”，或“移植的细胞”，或“植入的细胞”，或“治疗性细胞”，或“植入的封装的细胞”，或“封装的细胞”，或“治疗性同种异体细胞”，或“治疗性自体细胞”。在本公开的方法中可以使用多种细胞。植入的细胞可以为同源的或异源的细胞群，或者产生一种或多种目标生物活性物质的细胞。植入的细胞(例如胰腺祖细胞或PDX1阳性的胰腺内胚层)在首次被植入时可能最初不具有治疗活性，但是一旦被移植，它们进一步发育和成熟并具有治疗作用。如本文中所使用的，“待植入的细胞”是指细胞或细胞群，其具有能用于代谢性病症的体内治疗的足够的活力和/或功能，或者将变得有功能。

“诱导的多能干细胞”、或“iPS细胞”、或“iPSC”，是指通过插入被称为重编程因子的某些基因或基因产品，从非多能细胞(通常为成年体细胞)或终末分化的细胞(诸如纤维母细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的多能干细胞类型。参见Takahashi等人,Cell 131:861–872(2007)；Wernig等人，Nature 448:318–324(2007)；Park等人，Nature 451:141–146(2008)，也参见PCT公开第WO 2010048567号、PCT申请第PCT/US2009/061935号、PCT申请第PCT/JP2009/063906号，和美国公开的专利申请第2011/0039338US号、第2011/0039338号，其均通过引用整体并入本文中。这些和其他已知的制备iPSC的方法是众所周知的，并且其中衍生或产生iPSC的方式不限于所公开的方法。人iPSC提供了多能干细胞来源，而无需胚胎的相关使用。

植入的细胞包括重编程细胞。如本文中所使用的，术语“重编程(reprogramming)”、“重编程的(reprogrammed)”，或以上的等同物，是指这样的过程，即赋予细胞在培养物中或在体内形成至少一种新的细胞类型的后代的可测量的增加的能力，然后它在相同的条件下无需重新编程就会具有上述能力。

植入的细胞包括分化的、去分化的和转分化的细胞。因此，如本文中所使用的，短语“分化”是指通过其较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。相反，短语“去分化”是指其中部分或终末分化的细胞回复至较早发育阶段(诸如具有多能性或多潜能性)的细胞过程。进一步相反，短语“转分化”是指将一种分化的细胞类型转化成另一种分化的细胞类型的过程。

植入的细胞包括单激素或多激素细胞。如本文中所使用的，“单激素”细胞或其等同物是指仅表达一种激素的细胞(例如，未成熟的β细胞和β细胞仅表达胰岛素蛋白，但不表达胰高血糖素或生长激素抑制素蛋白)。如本文中所使用的，“多激素”细胞表达多于一种或多种激素(例如，内分泌前体或祖细胞具有在相同细胞上表达2、3或4种或更多种激素的细胞亚群)。

植入的细胞包括中内胚层细胞。术语“中内胚层细胞”或其等同物是指与SOX17低、CXCR4低、FOXA2低、SOX7低和SOX1低相比，具有相对较高表达水平的brachyury、FGF4、SNAI1MIXL1和/或WNT3标志基因的多潜能细胞。

植入的细胞包括定型内胚层细胞。术语“定型内胚层”，或“DE”，或“定型内胚层谱系”，或以上的等同物，是指可以分化成肠管的细胞或来源于肠管的器官的多潜能内胚层谱系细胞。

植入的细胞包括PDX1阴性前肠内胚层细胞。术语“PDX1阴性前肠内胚层细胞”，或“前肠内胚层细胞”，或以上的等同物，是表达SOX17、HNF1β(HNF1B)、HNF4α(HNF4A)和FOXA1标志物，但不大量表达PDX1、AFP、SOX7或SOX1的细胞。PDX1阴性前肠内胚层细胞群及其产生的方法被描述于于2006年10月27日递交的标题为表达PDX1的背侧和腹侧前肠内胚层(PDX1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm)的美国申请第11/588,693号中，其通过引用整体并入。

植入的细胞包括PDX1阳性的、背侧偏向的前肠内胚层细胞。术语“PDX1阳性的、背侧偏向的前肠内胚层细胞”(背侧PDX1阳性的前肠内胚层细胞)是这样的细胞，其表达选自2013年2月6日递交的美国申请第13/761,078号，不是美国专利第9,109,245号(其通过引用整体并入)的表1的一种或多种标志物。

植入的细胞包括胰腺内胚层细胞。术语“胰腺内胚层”、“胰腺上皮(epithelial)”、“胰腺上皮细胞(epithelium)”(均可简写为“PE”)、“胰腺祖细胞”、“PDX1阳性的胰腺内胚层”，或“PEC细胞产物”，或以上的等同物(诸如“胰腺内胚层细胞”(PEC))，均为前体或祖胰腺细胞。如本文中所描述的PEC是第4阶段分化(约为第12-14天)后的祖细胞群，并且包括至少两种主要的独特群体：i)表达PDX1和NKX6.1但不表达CHGA(或CHGA阴性，CHGA-)的胰腺祖细胞、或“非内分泌多潜能祖细胞亚群(CHGA-)”、或“非内分泌(CHGA-)亚群”、或“非内分泌(CHGA-)细胞”、或以上的等同物；以及ii)表达CHGA(CHGA阳性，CHGA+)的多激素内分泌细胞、或“内分泌多潜能祖细胞亚群(CHGA+)”、或“内分泌(CHGA+)亚群”、或“内分泌(CHGA+)细胞”、或以上的等同物。表达PDX1和NKX6.1，但不表达CHGA的PEC胰腺祖细胞亚群也被称为“非内分泌多潜能胰腺祖细胞亚群(CHGA-)”或“非内分泌祖细胞亚群”、“非内分泌(CHGA-)亚群”、“非内分泌(CHGA-)亚群”、“多潜能祖细胞亚群”等。表达CHGA的PEC多激素内分泌细胞亚群也被称为“定向为内分泌谱系(CHGA+)的细胞”、或“内分泌细胞”，或“CHGA+细胞”等。不受到理论的束缚，假定表达NKX6.1但不表达CHGA的细胞群是PEC的更为活跃或治疗性组分，而假定CHGA阳性的多激素内分泌细胞群在体内进一步分化和成熟为表达胰高血糖素的胰岛细胞。参见2011年7月31日在线出版的Kelly等人(2011)Cell-surface markers forthe isolation of pancreatic types derived from human embryonic stem cells,NatBiotechnol.29(8):750-756，以及Schulz等人(2012),A Scalable System forProduction of funtional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic StemCells,PLosOne 7(5):1-17,e37004，它们通过引用整体并入本文中。

仍然，有时使用胰腺内胚层细胞而与如上文所述的PEC无关，但通常是指至少第3和第4阶段类型细胞。从上下文中可以清楚地看出其用途和含义。胰腺内胚层具有高水平表达的选自PDX1、NKX6.1、PTF1A、CPA1、cMYC、NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2标志物的标志物，但基本上不表达为胰腺内分泌细胞的标志的基因(例如CHGA、INS、GCG、GHRL、SST、MAFA、PCSK1和GLUT1)。另外，一些表达NGN3的“内分泌祖细胞”可分化成其他的非胰腺结构(例如，十二指肠)。胰腺内胚层或内分泌祖细胞群及其方法也被描述于2007年7月5日递交的标题为产生胰腺激素的方法(Methods of producing pancreatic hormones)的美国专利申请第11/773,944号，以及2008年4月21日递交的标题为纯化来源于人胚胎干细胞的内胚层和胰腺内胚层细胞的方法(METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLSDERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS)的美国专利申请第12/107,020号中，它们通过引用整体并入本文中。

植入的细胞包括内分泌祖/前体细胞。如本文中所使用的“内分泌祖/前体细胞”或其等同物，是指表达来自由以下组成的列表中的至少一种标志物的定型内胚层谱系的多潜能细胞：神经源素3(NEUROG3)、PDX1、PTF1A、SOX9、NKX6.1、HNF1b、GATA4、HNF6、FOXA1、FOXA2、GATA6、MYT1、ISLET1、NEUROD、SNAIL2、MNX1、IA1、RFX6、PAX4、PAX6、NKX2.2和MAFB，所述多潜能细胞可以进一步分化成内分泌系统的细胞，包括但不限于，表达胰岛激素的细胞。内分泌祖/前体细胞至少详细描述于申请人的于2012年3月6日发布的标题为内分泌前体细胞、表达胰腺激素的细胞及其产生方法(ENDOCRINE PRECURSON CELLS,PANCREATICHORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION)的美国专利第8,129,182号，以及于2014年10月14日发布的标题为多能干细胞体外分化为胰腺内胚层细胞(PEC)和内分泌细胞(IN VITRO DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATICENDODERM CELLS(PEC)AND ENDOCRINE CELLS)的美国专利第8,859,286号中，它们通过引用整体并入本文中。

植入的细胞包括内分泌细胞。术语“内分泌细胞”或“表达胰岛激素的细胞”、“胰腺内分泌细胞”、“胰岛细胞”、“胰岛”、“干细胞来源的β细胞”、“β细胞”(“β细胞”)，或“SC-β细胞”，或以上的等同物，是能够表达胰岛素，但不表达胰高血糖素、生长激素抑制素、胃饥饿素和胰多肽的胰腺内分泌细胞。表达β细胞特征性标志物的胰腺内分泌细胞的特征可以在于它们表达胰岛素和以下转录因子中的至少一种：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3β、HB9、MAFA和PAX6。

植入的细胞为适当地指定内分泌细胞。如本文中所使用的，短语“适当指定的内分泌细胞”、或“第7阶段培养物”、或“包括“未成熟的β细胞”的未成熟的内分泌细胞”、或以上的等同物，是指体外制备的能够在体内发挥功能的内分泌细胞群，例如，未成熟的β细胞在移植时响应血糖而分泌胰岛素。适当指定的内分泌细胞或第7阶段培养物可以具有包括以下方面的另外的特征。在一个实施方案中，在移植时，适当指定的内分泌细胞发育并成熟为功能性胰岛细胞。在一个实施方案中，从适当指定的内分泌细胞群富集内分泌细胞(或耗尽非内分泌细胞)。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞群中大于约50％的细胞为CHGA+。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞群中大于约60％、或70％、或80％、或90％、或95％、或98％、或100％的细胞为CHGA+。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞群中少于约50％的细胞为CHGA-。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞群中少于约15％的细胞为CHGA-。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞群中少于约10％、或5％、或3％、或2％、或1％、或0.5％、或0％的细胞为CHGA-。此外，在适当指定的内分泌细胞中某些标志物的表达可能被抑制，诸如第3阶段期间的NGN3的表达。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞在第5阶段具有增加的NGN3的表达。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞为单激素的(例如，仅INS、仅GCG或仅SST)。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞共表达其他未成熟的内分泌细胞标志物(包括NKX6.1和PDX1)。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞可以为单激素的并且共表达其他未成熟的内分泌细胞标志物(包括NKX6.1和PDX1)。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞可以具有占更多总INS群的百分比的表达单激素的INS细胞。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞具有占至少50％的总INS群的百分比的表达单激素的INS细胞。在一个实施方案中，适当指定的内分泌细胞为CHGA+/INS+/NKX6.1+(三阳性的)。在一个实施方案中，细胞群中大于约25％的细胞为CHGA+/INS+/NKX6.1+(三阳性的)。在一个实施方案中，细胞群中大于约30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或95％、100％的细胞为CHGA+/INS+/NKX6.1+(三阳性的)。

植入的细胞包括未成熟的内分泌细胞。术语“未成熟的内分泌细胞”，具体为“未成熟的β细胞”，或以上的等同物，是指来源于任何其他内分泌细胞前体(包括内分泌祖/前体细胞、胰腺内胚层(PE)细胞、胰腺前肠细胞、定型内胚层细胞、中内胚层细胞，或者下述的任何更早期来源的细胞)的细胞，其表达选自以下的至少一种标志物：INS、NKX6.1、PDX1、NEUROD、MNX1、NKX2.2、MAFA、PAX4、SNAIL2、FOXA1或FOXA2。优选地，本文中所描述的未成熟的β细胞表达INS、NKX6.1和PDX1，并且更优选地它共表达INS和NKX6.1。术语“未成熟的内分泌细胞”、“未成熟的表达胰腺激素的细胞”，或“未成熟的胰岛”，或以上的等同物，是指例如如美国专利第8,859,286号(其通过引用整体并入本文中)的图45中所描述的至少一种单能性未成熟的β细胞或前β细胞，并且不包括其他未成熟的细胞，例如，该术语不包括未成熟的α(胰高血糖素)细胞、或未成熟的δ(生长激素抑制素)细胞、或未成熟的ε(胃饥饿素)细胞、或未成熟的胰多肽(PP)。将多能细胞分化成胰腺内分泌前体细胞和胰腺内分泌细胞的方法还被描述于美国专利第9,012,218号、第9,181,528号、第9,234,178号、第9,150,833号、第9,096,832号、第9,062,290号中，其各自通过引用整体并入本文中。

植入的细胞包括功能性β细胞。术语“功能性β细胞”，或“成熟的β细胞”，或以上的等同物，是这样的胰腺内分泌细胞，其展示确保快速和受控的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(“GSIS”)(具体而言，在线粒体呼吸/活性增加之后第一期和第二期的胰岛素分泌(“双相GSIS”))的确立已久的过程。详细地，功能性β细胞展现以下双相GSIS的特征中的至少一种：(i)将线粒体呼吸/活性与胰岛素分泌相连接；(ii)对提高的需求(这里限定为高葡萄糖浓度)响应的快速胰岛素分泌；(iii)在需求消退后快速关闭胰岛素分泌的能力；(iv)多轮的胰岛素分泌“开-关”切换的能力；(v)根据需要分泌正确量的胰岛素的能力；和(vi)对多种胰岛素促分泌素(例如，毒蜥外泌肽-4(Exendin-4)、或氨基酸–L-谷氨酰胺和L-精氨酸)响应的能力。功能性β细胞的特征可以在于它们表达胰岛素和以下转录因子中的至少一种：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3β、HB9、PAX6、MAFA、SLC2A1、UCN3和GLP1R。

如本文中所使用的，术语“从多能细胞发育”、“从多能细胞分化”、“从多能细胞成熟”，或“从多能细胞产生”、“来源于多能细胞”、“从多能细胞分化的”和等同的表达，是指在体外或体内从多能细胞产生分化的细胞类型。

植入的细胞包括细胞聚集体。细胞聚集体可以为以上鉴定的任何细胞类型的聚集体。聚集体可以基本上为一种细胞类型，或可以为混合的细胞群。如本文中所使用的，术语“簇”和“团块”、或“聚集体”、或以上的任何等同物可互换使用，并且通常是指已离解成单细胞，并随后聚集形成簇，或具有紧密的细胞间接触的细胞群。如本文中所使用的术语“再聚集”是指簇、团块和/或聚集体离解成较小的簇、团块和/或聚集体或单细胞，并随后通过再聚集成簇、团块和/或聚集体而形成新的细胞间接触。该离解事实上通常为手动的(诸如使用巴斯德吸管)，但考虑其他的离解方法。聚集体悬浮多能或多潜能细胞培养物基本上被描述于标题为培养分化细胞的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURINGDIFFERENTIAL CELLS)的国际公开PCT/US2007/062755，以及标题为干细胞聚集体悬浮液组合物及其分化方法(STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OFDIFFERENTIATION THEREOF)的国际公开PCT/US2008/082356中。

植入的细胞包括单细胞悬浮液。术语“单细胞悬浮液”或其等同物是指通过任何机械或化学手段的多能、多潜能或终末分化的单细胞悬浮液，或来源于多能或多潜能细胞的单细胞悬浮液。其更详细地描述于标题为培养和产生人胚胎干细胞的单细胞群的方法(Methods for culture and production of single cell populations of humanembryonic stem cells)并且于2011年6月21日递交的美国专利第7,964,402号中。

“细胞”是指个体细胞、细胞系或来源于此类细胞的培养物。“培养物”是指包含分离的相同或不同类型细胞的组合物。如本文中所使用的“培养物”、“群”或“细胞群”可以是并且是互换使用的，且它的含义根据上下文将变得清楚。例如，术语“群”可以为具有相同鉴定特征的多于一个细胞的细胞培养物，或它可以为具有不同鉴定特征的多于一种细胞类型的培养物。术语“亚群”当用于描述细胞培养物或细胞群内的某些细胞类型时，是指细胞培养物或群的子集。

如本文中所使用的术语“细胞谱系”是指从最早的前体细胞到完全成熟的细胞(即特化的细胞)的细胞类型发育的所有阶段。例如，“定型内胚层谱系细胞”、或“PDX1阴性内胚层谱系细胞”、或“PDX1阳性的胰腺内胚层谱系细胞”、或“内分泌前体谱系细胞”、或“内分泌谱系细胞”、或“未成熟的β谱系细胞”等，是指来源于定型内胚层细胞、PDX1阴性内胚层细胞、PDX1阳性的胰腺内胚层细胞等的细胞或自定型内胚层细胞、PDX1阴性内胚层细胞、PDX1阳性的胰腺内胚层细胞等分化而来的细胞。定型内胚层细胞是它的前体中的一种的中内胚层细胞的谱系。PDX1阳性的胰腺内胚层细胞是它的前体中的一种的定型内胚层细胞的谱系。PDX1阳性的胰腺细胞谱系中的内分泌前体、定型内胚层细胞和中内胚层细胞，均为它的前体。内分泌前体细胞谱系中的未成熟的β细胞、PDX1阳性的胰腺细胞、定型内胚层细胞和中内胚层细胞，均为它的前体。β细胞是例如未成熟的β细胞的唯一谱系。然而，本文中所描述的所有内胚层谱系细胞均为hES谱系细胞。

术语“治疗”、或“改善”、或“治愈”，或以上的等同物，是指改善病征或症状的治疗性干预。“改善”是指病征或症状的数量或严重性的降低。

术语“患者”、或“宿主”、或“哺乳动物宿主”、或“对象”、或以上的等同物，是指活的多细胞脊椎动物生物体，分类包括人类和非人类的哺乳动物。在一些实施方案中，对象为人类对象。优选的治疗患者是人。植入了穿孔组合产品的患者是“高风险的需要胰岛素的患者”，并且样本群体包括未察觉低血糖、不稳定的(脆弱的)T1D和移植患者。目标患者群体可以以不依赖于穿孔组合产品自身，但与免疫抑制方案的性质相关的方式，随临床使用/经验的时间而改变。例如，可以在使用实现了操作耐受的ISD方案“所有T1D”群体中使用穿孔组合产品。

术语“有效量”、或“治疗有效量”、或以上的等同物是指足以在正在治疗的对象或细胞中实现所期望的效应的试剂的量。例如，这可以为抑制或可测量地降低血糖水平并最终实现自我平衡的血糖控制所必需的细胞的量。它也可以意指改变细胞或对象的功能或结构的试剂的有效量。可以在单剂量，或在几次剂量中施用治疗有效量的试剂。然而，有效量将依赖于应用的特定试剂、正治疗的对象、痛苦的严重性和类型，以及施用方式。

如本文中所使用的，“生物淤积”、或“装置淤积”、或以上的等同物是指在可植入的生物医疗装置与生物环境(例如，宿主环境，包括但不限于皮下环境等)的界面处的过程，其部分是由于促进随后的宿主细胞(诸如巨噬细胞和纤维母细胞)贴附至装置表面上的蛋白非特异性吸附至装置材料所引起的。该过程通常被称为外来物应答。因此，本文中所描述的实施方案是包含抗生物淤积的表面封装装置。可以基于表面亲水性和电荷、生物分子功能化和药物洗脱产生或使用此类表面。减少的装置的生物淤积通常减少了外来物应答，并恢复或维持细胞存活、发育、成熟和功能化。本文中的实施方案讨论了使用非纺织织物用于抑制或减少装置表面淤积、促进血管生成，并因而在其中整合装置和细胞的目的。

如本文中所使用的，“减少的低血糖症”意指低血糖发作次数的减少以及无血糖控制恶化，限定为HbA1c的≤0.2％的增加。

如本文中所使用的，“降低的胰岛素依赖性”意指外源胰岛素注射次数和/或剂量的减少以及无血糖控制恶化，限定为HbA1c的≤0.2％的增加。

如本文中所使用的，“保留”意指保持在穿孔组合产品内的PEC细胞的量。穿孔装置在配制、保存期限、手术植入、成熟和功能期间应当保留细胞产品。

如本文中所使用的，“组织囊”意指在植入体周围形成的外来物囊。在植入期间，穿孔装置和大多数它的细胞内容物旨在被保留在囊内。在囊形成之前的最初移植期间，装置应当将细胞产品保留在它的内腔内。

“移植”是指祖细胞群或未成熟的细胞群分化为成熟的细胞类型。例如，成熟为胰腺内分泌细胞群的PDX1阳性的胰腺内胚层细胞群的移植。

“移植体”是指在本文的装置内封装或递送的分化的细胞群。例如，成熟的胰腺内分泌细胞移植体。

术语“本质上”或“基本上”意指任何细胞群或培养物中存在的主要地或最小量或减少量的组分或细胞，例如，未成熟的β细胞培养物是“本质上或基本上表达INS、NKX6.1和PDX1并且本质上或基本上不表达NGN3的未成熟的β细胞”。其他实例包括但不限于“本质上或基本上为hES细胞”、“本质上或基本上为定型内胚层细胞”、“本质上或基本上为前肠内胚层细胞”、“本质上或基本上为PDX1阴性前肠内胚层细胞”、“本质上或基本上为PDX1阳性的胰腺内胚层细胞”、“本质上或基本上为胰腺内分泌前体细胞”、“本质上或基本上为胰腺内分泌细胞”等。

关于在细胞培养物或细胞群中的细胞，术语“基本上没有”意指细胞培养物或细胞群不含的特定细胞类型，其存在量小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或少于约1％的细胞培养物或细胞群中存在的细胞总数。术语“非纺织织物”或其等同物包括但不限于通过除纺织或针织外的工艺制造的粘合织物、成形织物，或工程化织物。

除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。单数术语“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示对象，除非上下文另有明确指示。类似地，单次“或者(or)”旨在包括“和(and)”，除非上下文另有明确指示。还应理解给予核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且为描述而提供。尽管类似于或等同于本文中描述的那些的方法和材料可以用于实施或测试本公开，但下文中描述了合适的方法和材料。术语“包含(comprises)”意指“包括(includes)”。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。在存在冲突的情况下，将以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实例仅为说明性的，且不试图为限制性的。

如以下权利要求和整个本公开中所使用的，短语“基本上由…组成”意在包括该短语后列出的任何元素，且限于不干扰或有助于所列元素在公开中指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由…组成”表明所列的元素是需要的或强制性的，但其他的元素是任选的，且可能存在或可能不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。

细胞递送装置

细胞递送装置(也称为细胞封装装置、或细胞保留装置、或细胞容纳装置、或人工生物器官)是提供了完全或部分封装来自宿主(包括但不限于宿主免疫系统)的细胞的外壳的装置。

细胞可以为任何目标细胞。细胞可以为同源的或异源的细胞群，或产生一种或多种目标生物活性物质的细胞。植入的细胞(例如胰腺祖细胞或PDX1阳性的胰腺内胚层)在首次被植入时可能最初不具有治疗活性，但是一旦被移植，它们进一步发育和成熟并具有治疗作用。植入的细胞可以为悬浮液或细胞聚集体中的个体细胞。

例如，在植入适合移植至患有糖尿病的对象中的细胞后一段时间，糖尿病或其一种或多种症状可以被改善或减少。在一个实施方案中，细胞递送装置装载有PDX1阳性的胰腺内胚层细胞。在一个实施方案中，细胞递送装置装载有胰腺祖细胞。在一个实施方案中，细胞递送装置装载有胰内分泌前体细胞。在一个实施方案中，细胞递送装置装载有胰腺内分泌细胞。在一个实施方案中，细胞递送装置装载有成熟的β细胞。

在一个实施方案中，植入的细胞包括全能细胞。在一个实施方案中，植入的细胞包括多能细胞。在一个实施方案中，植入的细胞包括多潜能细胞。多潜能细胞包括内分泌前体细胞、PDX1阳性的胰腺内胚层细胞、定型内胚层细胞，或中内胚层细胞，其可以产生胰腺α、β、δ和γ胰岛细胞中的每一种。在一个实施方案中，植入的细胞包括单能细胞。单能细胞包括未成熟的β细胞，其具有仅分化成胰岛素β细胞但不分化成例如胰高血糖素(α)细胞、生长激素抑制素(δ)细胞和胰多肽(γ)细胞的能力。在一个实施方案中，植入的细胞包括终末分化的细胞。

在一个实施方案中，植入的细胞是众所周知的，可公开获得的永生化的细胞系。本文中所描述的发明可利用所有hES细胞系和至少hESC和iPSC，例如CyT25、CyT203、CyT212、BG01、BG02、BG03，其可以在万维网(the world wide web)上于wicell.org/home/stem-cell-lines/order-stem-cell-lines/obtain-stem-cell-lines.c msx下，从WiCell商购获得。适合实施本发明的细胞为任何现在已知的或随后产生的多能细胞。WiCell列出了成百上千的其他可商购获得的hES干细胞系。从文献和可公开获取的数据库，包括例如国立卫生研究院(NIH)干细胞注册中心(the National Institutes of Health(NIH)Stem CellRegistry)、人类胚胎干细胞注册中心(the Human Embryonic Stem Cell Registry)，以及位于美国马萨诸塞州伍斯特市的马萨诸塞大学医学院的国际干细胞注册中心(theInternational Stem Cell Registry located at the University of MassachusettsMedical School,Worcester,Massachusetts,USA)，技术人员知道如何查找和购买可商购获得的干细胞用于本发明。当细胞系变得可获得并且得到注册时，这些数据库定期更新。国际干细胞注册中心登记了至少254种iPSC可商购获得的系，以及1211种可商购获得的hESC系。在一个实施方案中，多能植入的细胞为人胚胎干(hES)细胞、人胚胎生殖(hEG)细胞、诱导的多能干细胞(又叫做“iPS细胞”或“iPSCs细胞)、孤雌生殖细胞、通过体细胞核移植得到的胚胎等。在一个实施方案中，植入的细胞为分化的细胞，其来源于多能细胞，诸如人胚胎干(hES)细胞、人胚胎生殖(hEG)细胞、诱导的多能干细胞(又叫做“iPS细胞”或“iPSCs细胞)、孤雌生殖细胞、通过体细胞核移植得到的胚胎等。多能性也可以通过定征细胞关于表面标志物、转录标志物、核型以及分化成三种胚层细胞的能力的细胞的表征来确定。这些特征为本领域普通技术人员所熟知的。例如，可以通过形成确保抑制引起分化和多能性维持的基因的核心调控复合物的几种转录因子和细胞表面蛋白(包括转录因子Oct-4、Nanog和Sox-2)以及细胞表面抗原(诸如糖脂SSEA3、SSEA4和硫酸角抗原抗原、Tra-1-60和Tra-1-81，以及碱性磷酸酶)的存在来限定或表征人多能干细胞。

因此，技术人员可以进行公开的方法和使用公开的装置而无需使用人胚胎，且无需假定在任何较早的时间点已经发生人胚胎的破坏性使用。确实，从孤雌生殖激活的卵母细胞衍生的hES细胞系是实现本发明的一种这样的方法(例如，根据WO 03/046141，其通过引用整体并入本文中)。存在衍生多能干细胞(诸如哺乳动物ES细胞)的其他方法而不破坏胚胎。简而言之，Advancedc Cell Technology(伍斯特市(Worcester),马萨诸塞州(Massachusetts),USA)发表了3篇科学期刊文章，其描述了从单个卵裂球衍生小鼠和人ES细胞，而保持胚胎完整，并因此未造成它的破坏。在2005年年末，Chung等人首次描述了从单个卵裂球制备小鼠ES细胞的方法。参见Chung等人(2006)Nature 439:216-219，2005年10月16日在线发表。Chung等人(2006)描述了使用类似于用于植入前遗传诊断(PGD)的技术的显微操纵技术，从胚胎采集活检样品；参见第217页。在那时，Chung等人(2006)将卵裂球细胞系与其他胚胎干细胞共培养。参见Chung等人(2008),Human Embryonic Stem Cell LinesGenerated without Embryo Destruction,Cell Stem Cell 2:113-117。但稍后相同作者Chung等人(同上)的2008年的研究证明了hES细胞系根本不需要与ES细胞共培养，因为在具有层粘连蛋白的培养基中培养分离的卵裂球增强了它们产生hESC的能力。参见Chung等人(2008),Human Embryonic Stem Cell Lines Generatedd without Embryo Destruction,Cell Stem Cell(2):113-117,p.116,2008年1月10日在线发表。此外，以这种方式获得的那些hES细胞具有与其他人多能干细胞(包括hES细胞的)相同的特征，其包括能够维持未分化状态超过六(6)个月，并且显示正常的核型和多能性标志物(包括Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog和碱性磷酸酶)的表达，；以及可以在体外分化并形成所有三(3)种胚胎胚层的衍生物，并可以在体内畸胎瘤中形成。

植入的细胞可以包括分化的、去分化的和转分化的细胞。在另外的实施方案中，植入的细胞可包括单激素或多激素细胞。在其他实施方案中，植入的细胞包括重编程细胞。在一些实施方案中，植入的细胞包括中胚层细胞。

在其他的实施方案中，植入的细胞包括定型内胚层细胞。根据某些实施方案，定型内胚层细胞为哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，定型内胚层细胞为人类细胞。在一些实施方案中，在定型内胚层细胞中表达选自SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3β、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的一种或多种标志物。在其他实施方案中，在定型内胚层细胞中不表达或不显著表达选自OCT4、α-甲胎蛋白(AFP)、血栓调节蛋白(TM)、SPARC、SOX7和HNF4α的一种或多种标志物。定型内胚层细胞群及其产生方法还被描述于2004年12月23日递交的标题为定型内胚层(DEFINITIVE ENDODERM)的美国申请第11/021,618号(其通过引用整体并入)。

在一些实施方案中，植入的细胞包括内分泌祖细胞/前体细胞。在其他实施方案中，植入的细胞包括功能性β细胞。在其他实施方案中，植入的细胞包括但不限于胰岛，诸如朗格汉斯(Langerhans)人胰岛、猪胰岛和大鼠胰岛。它们可以包括终末分化的α、β、δ和/或胰肽(PP)细胞。在一个方面，与本公开一致的实施方案可被用于朗格汉斯胰岛细胞的移植。在一些实施方案中，植入的细胞包括其他的细胞类型，诸如肝细胞、脾、胰腺、胆囊、肾脏和具有外分泌功能的其他组织。在一些实施方案中，植入的细胞包括神经内分泌细胞，分泌激素、细胞因子、淋巴因子、细胞生长调节因子的增殖性细胞和细胞系，或具有代谢功能的其他细胞。如对本领域普通技术人员显而易见的，可以从哺乳动物组织、原代培养的细胞、产生生物产物的培养的细胞系和基因工程化的培养的细胞系获得这些细胞和组织。植入的细胞也可经基因工程化来产生所期望的分子，诸如蛋白、肽、核酸或其他生物活性试剂。实例包括经工程化以表达受体中缺少或有缺陷的酶的细胞，或表达针对癌细胞的治疗剂(诸如毒素)的细胞。

在一些实施方案中，植入的细胞包括PDX1阴性的前肠内胚层细胞，诸如表达SOX17、HNF1β(HNF1B)、HNF4α(HNF4A)和FOXA1标志物但基本上不表达PDX1、AFP、SOX7或SOX1的细胞。在其他的实施方案中，植入的细胞包括PDX1阳性的背侧偏向的前肠内胚层细胞。

在实施方案中，植入的细胞处于无动物来源产物的培养基中。在另一个实施方案中，植入的细胞处于无外源性物质物的培养基中。植入的细胞可以处于补充有生长因子的培养基中。术语“补充性生长因子”在其最广义背景中使用，并且是指有效促进多能细胞生长、维持细胞存活、刺激细胞分化，和/或刺激细胞分化逆转的物质。此类物质包括但不限于细胞因子、趋化因子、小分子、中和抗体和蛋白。生长因子还可以包括细胞间信号传导多肽，其控制细胞的发育和维持以及组织的形成和功能。在优选的实施方案中，补充性生长因子选自：steel细胞因子(SCF)、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、白细胞介素-6(IL-6)与可溶性白细胞介素-6受体(IL-6R)的组合、纤维母细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在一个实施方案中，植入的细胞基本上类似于D'Amour等人“Production ofPancreatic Hormone-Expressing Endocrine Cells From Human Embryonic StemCells”(2006年11月1日)Nature Biotechnology 24,1392-1401(其通过引用整体并入本文中)中描述的那样。D′Amour等人描述了5步法分化方案：第1阶段(主要造成定型内胚层产生)，第2阶段(主要造成PDX1阴性的前肠内胚层产生)，第3阶段(主要造成大多PDX1阳性的前肠内胚层产生)，第4阶段(主要造成胰腺内胚层(也被称为多潜能胰腺祖细胞或胰腺内分泌祖细胞)产生)和第5阶段(主要造成表达激素的内分泌细胞产生)。

在一个实施方案中，植入的细胞基本上类似于Schulz等人A Scalable Systemfor Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic StemCells PLoS One 7:5 1-17(2012)(其通过引用整体并入本文中)中描述的那样。Schulz等人描述了hESC扩增和储备(banking)方法和基于悬浮液的分化系统。具体而言，将未分化的多能细胞在动态转动的悬浮培养物中聚集成簇，然后采用四阶段方案一同分化两周。简而言之，来自hES细胞聚集体悬浮液，将hESC单层用Accutase(Innovative CellTechnologies)离解，收集并以1x10⁶个细胞/mL重悬于StemPro hESC SFM(LifeTechnologies；组合的DMEM/F12，其含有Glutamax、StemPro hESC补充物、BSA和1％(v/v)青霉素/链霉素；省去FGF-2和2-巯基乙醇)中。将单细胞悬浮液分配至非TC处理的6孔板(5.5mL/孔)并以95rpm在Innova 2000旋转仪(New Brunswick Scientific)上旋转，或者分配至500mL Nalgene过滤接收器储存瓶(150mL/瓶)并以65rpm在Sartorius Certomat RM-50旋转仪(配置有5cm旋转轴)上旋转。将细胞在37℃/8％CO₂保温箱中旋转过夜，并形成大约100-200μm的聚集体。对于100-200μm的聚集体直径，6孔盘可以使用60-140rpm的旋转速度；500mL瓶可以使用5-20rpm的旋转速度。悬浮聚集体的分化仅涉及来自D’Amour一些修饰。在第2阶段期间包括TGF-βRI激酶抑制剂IV，并在第3阶段期间将视磺酸替换为更稳定的类维生素A类似物TTNPB(3nM)。将生长因子KGF(50ng/mL)和EGF(50ng/mL)添加至第4阶段以保护细胞团块。在第4阶段还包括Noggin(50ng/mL)。

在一个实施方案中，植入的细胞基本上类似于Agulnick等人Insulin-ProducingEndocrine Cells Differentiated In Vitro From Human Embryonic Stem CellsFunction in Macroencapsulation Devices In Vivo Stem CellsTranslationalmedicine 4:1–9(2015)(其通过引用整体并入本文中)中描述的那样。Agulnick等人描述了制备胰腺祖细胞的修改的方案，使得73％–80％的细胞群由PDX1阳性的(PDX1+)和NKX6.1+胰腺祖细胞组成。胰腺祖细胞进一步分化成胰岛样细胞(IC)，其可再生地含有73％–89％的内分泌细胞，其中大约40％–50％表达胰岛素。这些胰岛素阳性的细胞中的很大一部分为单激素阳性的，并且表达转录因子PDX1和NKX6.1。我们修改了制备胰腺祖细胞的方案，使得73％–80％的细胞群由PDX1阳性的(PDX1+)和NKX6.1+PP组成。PP进一步分化成胰岛样细胞(IC)，其可再生地含有73％–89％的内分泌细胞，其中大约40％–50％表达胰岛素。这些胰岛素阳性的细胞中的很大一部分为单激素阳性的，并且表达转录因子PDX1和NKX6.1。Agulnick等人描述了这样的方案，其中通过另外地在第3阶段(第5–7天)用激活素A、Wnt3A和调蛋白β1处理以及在第4阶段(第7–13天)以激活素A和调蛋白β1处理，对Schulz等人2012的方案进行了修改。

在本文中描述了来源于多能干细胞的各种细胞组合物，并且可以在申请人的以下申请中找到：以下美国专利申请：于2002年8月6日递交的标题为在饲养层细胞上培养HESC的方法(METHODS FOR CULTURE OF HESC ON FEEDER CELLS)的第10/486,408号；于2004年12月23日递交的标题为定型内胚层(DEFINITIVE ENDODERM)的第11/021,618号；于2005年4月26日递交的标题为表达PDX1的内胚层(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)的第11/115,868号；于2005年6月23日递交的标题为鉴别内胚层分化的因子的方法(METHODS FOR IDENTIFYINGFACTORS FOR DIFFERENTIATING ENDODERM)的第11/165,305号的；于2005年8月15日递交的标题为用PI-3激酶抑制剂增加多能人胚胎干细胞的定型内胚层分化的方法(METHODS FORINCREASING DEFINITIVE ENDODERM DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT HUMAN EMBRYONICSTEM CELLS WITH PI-3 KINASE INHIBITORS)的第11/573,662号；于2005年10月27日递交的标题为表达PDX1的背侧和腹侧前肠内胚层(PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRALFOREGUT ENDODERM)的第12/729,084号；于2005年11月14日递交的标题为定型内胚层的标志物(MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM)的第12/093,590号；于2006年6月20日递交的标题为胚胎干细胞培养组合物及其使用方法(EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONSAND METHODS OF USE THEREOF)的第11/993,399号；于2006年10月27日递交的标题为表达PDX1的背侧和腹侧前肠内胚层(PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUTENDODERM)的第11/588,693号；于2007年3月2日递交的标题为内分泌祖细胞/前体细胞、表达胰腺激素的细胞及产生方法(ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS,PANCREATICHORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION)的第11/681,687号；于2007年5月24日递交的标题为培养和产生HESC单细胞群的方法(METHODS FOR CULTURE ANDPRODUCTION OF SINGLE CELL POPULATIONS OF HESC)的第11/807,223号；于2007年7月5日递交的标题为产生胰腺激素的方法(METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES)的第11/773,944号；于2007年9月24日递交的标题为增加定型内胚层产生的方法(METHODS FORINCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTION)的第11/860,494号；于2008年4月8日递交的标题为产生胰腺激素的方法(METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES)的第12/099,759号；于2008年4月21日递交的标题为纯化来源于人胚胎干细胞的内胚层和胰腺内胚层细胞的方法(METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLSDERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS)的第12/107,020号；于2009年11月13日递交的标题为来源于人多能干细胞的胰腺谱系细胞的封装(ENCAPSULATION OF PANCREATICLINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS)的第12/618,659号；于2010年4月22日和2013年2月6日递交的标题均为来自去分化的重编程细胞的细胞组合物(CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS)的第12/765,714号和第13/761,078号；于2007年8月13日递交的标题为用于培养可分化细胞的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS)的第11/838,054号；于2008年11月4日递交的标题为干细胞聚集体悬浮液组合物及其分化方法(STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATIONTHEREOF)的第12/264,760号；于2010年4月27日递交的标题为小分子支持的多能细胞生长(SMALL MOLECULES SUPPORTING PLURIPOTENT CELL GROWTH)的第13/259,15号；于2011年2月21日递交的标题为用于封装装置的装载系统(LOADING SYSTEM FOR AN ENCAPSULATIONDEVICE)的第PCT/US11/25628号；于2010年12月28日递交的标题为用于抑制多能干细胞的试剂和方法(AGENTS AND METHODS FOR INHIBITING PLURIPOTENT STEM CELLS)的第13/992,931号；以及以下美国设计申请：于2011年12月12日递交的第29/408,366号；于2011年12月12日递交的第29/408,368号；于2012年5月31日递交的第29/423,365号；和于2013年3月13日递交的第29/447,944号；以及美国申请：于2014年3月7日递交的标题为三维大容量细胞封装装置组装(3-DIMENSIONAL LARGE CAPACITY CELL ENCAPSULATION DEVICEASSEMBLY)的第14/201,630号；和美国申请：于2013年12月13日递交的标题为多能干细胞体外分化为胰腺内胚层细胞(PEC)和内分泌细胞(IN VITRO DIFFERENTIATION OFPLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATIC ENDODERM CELLS(PEC)AND ENDOCRINE CELLS)的第14/106,330号；以上所有均通过引用整体并入本文中。

在本文中描述了来源于多能干细胞的各种细胞组合物，并且可以在申请人专有许可的以下申请中找到：于2008年4月24日递交的标题为多能细胞(Pluripotent cells)的美国专利公开第2009/0269845号；于2010年7月20日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiation of Human Embryonic Stem Cells)的美国专利公开第2011/0014703号；于2010年7月19日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiation of HumanEmbryonic Stem Cells)的美国专利公开第2011/0014702号；于2010年12月16日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiation of Human Embryonic Stem Cells)的美国专利公开第2011/0151561号；于2009年10月22日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiation of Human Embryonic Stem Cells)的美国专利公开第2010/0112692号；于2011年8月17日递交的标题为多能干细胞的分化(Differentiation of PluripotentStem Cells)的美国专利公开第2012/0052576号；于2009年10月23日递交的标题为人多能干细胞的分化(Differentiation of human pluripotent stem cells)的美国专利公开第2010/0112693号；于2010年12月16日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiationof human embryonic stem cells)的美国专利公开第2011/0151560号；于2008年7月31日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiation of human embryonic stem cells)的美国专利公开第2010/0015100号；于2008年11月25日递交的标题为人胚胎干细胞的分化(Differentiation of human embryonic stem cells)的美国专利公开第2009/0170198号；于2015年5月07日递交的标题为使用小分子增强胰腺内分泌细胞中Mafa表达(Use ofSmall Molecules to Enhance Mafa Expression in Pancreatic Endocrine Cells)的美国专利公开第2015/0329828号；于2013年6月06日递交的标题为人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞(Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into PancreaticEndocrine Cells)的美国专利公开第U.S.2013/0330823号；于2013年6月13日递交的标题为人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞(Differentiation of human embryonic stemcells into pancreatic endocrine cells)的国际专利公开第WO 2013/192005号；于2013年12月30日递交的标题为用于分化成胰腺内分泌细胞的悬浮和聚集的人多能干细胞(Suspension and clustering of human pluripotent stem cells fordifferentiation into pancreatic endocrine cells)的美国专利公开第U.S.2014/0242693号；于2014年6月17日递交的标题为用于分化成胰腺内分泌细胞的悬浮和聚集的人多能干细胞(Suspension and clustering of human pluripotent stem cells fordifferentiation into pancreatic endocrine cells)的美国专利公开第U.S.2014/0295552号；于2014年5月21日递交的标题为用于分化成胰腺内分泌细胞的悬浮和聚集的人多能干细胞(Suspension and clustering of human pluripotent stem cells fordifferentiation into pancreatic endocrine cells)的国际专利申请第WO 2015/065524号；于2013年6月6日递交的标题为人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞(Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic EndocrineCells)的美国专利公开第U.S.2013/0330823号；于2013年12月18日递交的标题为人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞(Differentiation of Human Embryonic Stem Cells IntoPancreatic Endocrine Cells Using HB9Regulators)的美国专利公开第U.S.2014/0186953号；215年12月9日递交的美国申请第14/963730号；于2015年12月11日递交的美国申请第14/898,015号；以上所有均通过引用整体并入本文中。

在一个实施方案中，使用生物相容的聚乙二醇(PEG)封装植入的细胞。基于PEG的封装更详细地描述于以下中：标题为用于治疗疾病的封装生物材料的植入(IMPLANTATIONOF ENCAPSULATED BIOLOGICAL MATERIALS FOR TREATING DISEASES)的美国专利第7,427,415号；标题为用于生物材料封装的凝胶(GELS FOR ENCAPSULATION OF BIOLOGICALMATERIALS)的美国专利第6,911,227号；以及标题为用于生物材料封装的凝胶(GELS FORENCAPSULATION OF BIOLOGICAL MATERIALS)的美国专利第6,911,227号、第5,529,914号、第5,801,033号、第6,258,870号，以上均通过引用整体并入本文中。

在另一个实施方案中，递送装置为TheraCyte(以前称为Baxter)装置(尔湾(Irvine),加利福尼亚州(Calif.))。TheraCyte细胞递送装置还被描述于以下美国专利中：第6,773,458号；第6,156,305号；第6,060,640号；第5,964,804号；第5,964,261号；第5,882,354号；第5,807,406号；第5,800,529号；第5,782,912号；第5,741,330号；第5,733,336号；第5,713,888号；第5,653,756号；第5,593,440号；第5,569,462号；第5,549,675号；第5,545,223号；第5,453,278号；第5,421,923号；第5,344,454号；第5,314,471号；第5,324,518号；第5,219,361号；第5,100,392号；和第5,011,494号；以上均通过引用整体并入本文中。

在另一个实施方案中，递送装置为基本上如美国专利第8,278,106号中描述的装置，以及如2014年3月7日递交的美国申请第14/201,630号和以下美国设计中描述的装置：第29/447,944号、第29/509,102号、第29/484,363号、第29/484,360号、第29/484,359号、第29/484,357号、第29/484,356号、第29/484,355号、第29/484,362号、第29/484,358号、第29/408,366号、第29/517,319号、第29/408,368号、第29/518,513号、第29/518,516号、第29/408,370号、第29/517,144号、第29/423,365号、第29/530,325号，以上均通过引用整体并入本文中。

本文中所描述的细胞递送装置的实施方案不旨在限于用于制作细胞递送装置的某些大小、形状、设计、容积容量和/或材料，只要植入的细胞能够响应血糖而产生胰岛素。

可以将细胞递送装置核心(也被称为细胞室或内腔)中的组织、移植体或细胞固定于固定化基质(诸如水凝胶或胞外基质组分)上。另外，细胞递送装置的核心可以含有插入物来在核心的中心产生“无细胞”区域，以便进一步降低装置中心内坏死细胞核心的可能性。

细胞递送装置可以具有适合维持生物活性并提供递送产品或功能的通路的任何配置，其包括例如，圆柱形的、矩形的、盘状的、贴片状的、卵形的、星形的或球形的。此外，细胞递送装置可以为卷曲的或管状的，或包裹成网样或嵌套结构。如果要在它植入后的某些时间取回细胞递送装置，则应当避免倾向于引起细胞递送装置从植入位点移动的配置(诸如足够小而在受体的血管中行进的球形装置)。本发明的实施方案包括提供高结构完整性且易于从宿主取回的形状。此类形状包括矩形贴片、盘、圆柱体和平板。

在其他实施方案中，细胞递送装置或大容量组装体由进一步分隔成细胞递送装置的内腔一个或两个或更多个密封件(即分隔密封件)组成。参见，例如申请人的美国设计申请第29/408366号、第29/408368号、第29/408370号和第29/423,365号。

可以经皮下植入的细胞递送装置，但其他的位置(诸如腹膜内腔或壁、肌肉内的部位、腹部脂肪垫或另一合适的位置)可能适合于植入。可替代地，公开的细胞递送装置可以部分经腹膜内植入宿主身体，包括进入网膜或其他合适的部位，并延伸至皮下环境中。在一个实施方案中，可以将细胞装载至装置延伸至皮下环境中的部分内，而装置的剩余部分在腹膜内环境中。在另一实施方案中，可以根据需要将细胞递送装置植入脑、脊髓区域或任何其他的器官中以引起来自移植的细胞的治疗性效应。在大多数情况下，宿主为人，但可以为另外的哺乳动物或非哺乳动物。

膨胀装置：在一个实施方案中，提供了可膨胀的细胞递送装置或大容量组装体。

可再次填充的装置：可以通过从细胞递送装置去除细胞，并随后例如经真皮下(subdermally)或皮下(subcutaneously)将治疗剂或细胞直接注射至植入的细胞递送装置的储备库、室、内腔、容器或隔室来完成植入的细胞递送装置内细胞的交换。可以使用插入端口(port)的注射器实现细胞/治疗剂的注射。

可替代地，在另一个实施方案中，本文中提供的装置或组装体不含有进入或离开的端口，即，装置被称为是无端口(port-less)的；并且在将它们植入至植入部位中之前将细胞装载至递送装置内。

多室模块化装置

在一个实施方案中，植入的细胞在大细胞封装/递送装置中递送，所述装置也被称为大容量组装体或大容量装置。如本文中所使用的，术语“大容量组装体”或“大容量装置”是指由多重或多个细胞室组成的细胞封装装置。在一个实施方案中，大容量组装体由至少1、2、4、5、6、7、8、9、10个或更多个细胞室组成。在另一个实施方案中，制成了大容量组装体，使得大容量组装体可以由任何数目的细胞室(或模块单元)组成。例如，如美国专利第8,278,106号(其通过引用整体并入本文中)中所描述的，模块单元可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个细胞室组成，其可以取决于治疗疾病所需的细胞数目或剂量。基于待移植的细胞的体积和/或数目来确定递送装置中室的数目。

3维大容量装置：在一个实施方案中，提供了细胞递送装置或大容量组装体，其含有通过无细胞区(例如如2014年3月7日递交的美国申请第14/201,630号中所描述的褶皱和弯曲)连通的多个或多重细胞室。在一个实施方案中，大容量组装体包含至少两个细胞室和褶皱的和未褶皱的至少两种配置，其中褶皱的配置比未褶皱的配置具有更小的覆盖区。因此，如本文中所使用的，术语“细胞封装装置”或“细胞递送装置”可以意指由一个细胞室组成的单个装置或这样的一个装置，其由如2014年3月7日递交的美国专利第8,278,106号和美国申请第14/201,630号(其均通过引用整体并入本文中)中所描述的3维装置或装置组装体中的大容量装置或多重细胞室中的多重细胞室组成。因此，细胞递送装置、大容量组装体和3维装置可互换使用。

各种细胞递送装置配置

细胞递送装置包扩各种层，其中的每种起一种功能或多重功能。在一些实施方案中，细胞递送装置包括排斥细胞的膜和非纺织织物。

排斥细胞的膜：该层抑制免疫系统的细胞组分(诸如T-细胞等)进入装置。该层还用于防止治疗性细胞离开装置。该层允许封装的目标生物活性物质通过(例如，胰岛素、胰高血糖素、胰多肽等)，使得活性物质可用于细胞递送装置外和患者的身体内的靶标细胞。该层理想地允许宿主中天然存在的营养物通过膜为封装的细胞提供必需的营养物。排斥细胞的膜在本领域中已有描述，其包括先前在上文中描述的Baxter的那些专利，包括美国专利第6,773,458号；第6,520,997号；第6,156,305号；第6,060,640号；第5,964,804号；第5,964,261号；第5,882,354号；第5,807,406号；第5,800,529号；第5,782,912号；第5,741,330号；第5,733,336号；第5,713,888号；第5,653,756号；第5,593,440号；第5,569,462号；第5,549,675号；第5,545,223号；第5,453,278号；第5,421,923号；第5,344,454号；第5,314,471号；第5,324,518号；第5,219,361号；第5,100,392号和第5,011,494号，以上均通过引用整体并入本文中。在一些实施方案中，该层是穿孔的。

薄膜：在一些实施方案中，细胞递送装置包含薄膜层、薄膜环或薄膜胶接处(weld)。薄膜为仅在胶接处中存在的、帮助将至少两层或更多层粘合或结合在一起的结合或粘合层。在一些实施方案中，薄膜仅位于非纺织织物的内面(朝向室)上(见下文)，以消除如果它位于外面时产生的平滑表面(朝向宿主)，这抑制了锚定。在一些实施方案中，薄膜位于排斥细胞的膜的内面(朝向室)上。薄膜并非室的一部分；其位于胶接处中。

网状物(Mesh)：纺织网状物为每个装置提供了结构刚性，并通过用作保护性外骨骼而保护排斥细胞的膜。在一些实施方案中，非纺织网状物未被包括在装置配置中。为了解决由于不包括来自装置设计的纺织网状物而导致的刚性损失，可以使用位于装置外部上的双层的非纺织织物和/或非纺织织物环。

非纺织织物：提供在植入后变得良好地整合到宿主中的细胞封装装置。为此，减少、抑制或降低装置-宿主界面处的生物淤积对装置整合至关重要。在一个实施方案中，非纺织织物被用于探索在提供结构完整性的同时，它是否可以增加血管生成和降低或抑制生物淤积。在一个实施方案中，非纺织织物提供了对排斥细胞的膜的保护，使其免于与纺织网状物以及用于锚定至宿主的装置或装置整合的另外的材料直接接触。存在众多类型的非纺织织物，其纺织的紧密度和薄片厚度存在变化。在一个实施方案中，丝状物的横截面为三叶形。非纺织织物可以为粘合织物、成形织物或工程化织物，其通过除纺织或针织外的工艺制造。在一些实施方案中，非纺织织物为多孔的、纺织品样材料，通常为平板形式，主要或完全由纤维组成，诸如组装成网、薄片或棉胎(batt)的短纤维(staple fibers)。非纺织织物的结构是基于例如，通常或多或少随机布置的短纤维的布置。

可以通过纺织工业领域已知的多种技术来制造非纺织织物。各种方法可以产生梳理的、湿法成网、熔喷的、纺粘的或气流成网的非纺织物。示例性方法和基质被描述于美国申请公开2010/0151575号中，其教导通过引用并入本文中。在一个实施方案中，非纺织织物为聚四氟乙烯(PTFE)。在一个实施方案中，非纺织织物为纺粘的(spunbound)聚酯。

非纺织织物的密度可以根据处理条件而变化。在一个实施方案中，非纺织织物为纺粘的聚酯，其具有约0.40至约1.00(oz/yd²)的基本重量、约127至约228μm的公称厚度和约0.5至约26μm的纤维直径。在一个实施方案中，丝状物的横截面为三叶形。在一些实施方案中，非纺织织物为生物相容的和/或生物可吸收的。

历史上，细胞递送装置具有简单的配置，其包括仅用于治疗性细胞容纳的排斥细胞的膜、用于胶接的薄膜和纺织网状物(EN-A配置)。

图1A-D是细胞递送装置的某些实施方案的分解视图。图描绘了EN20，其为未穿孔形式的、一经成熟具有支持约20微升(20μl)的植入细胞的能力的药物递送装置的简写。如图1A-D中所示的，装置可以具有另外的各种网状物、薄膜、膜和非纺织织物层。每种配置被制造成“三明治”，其组装成一堆材料并密封。

以下表1描述了细胞递送装置配置。装置的每个壁可以包含相同数目的层和相同类型的材料，或不同数目和类型的层，这取决于层所需要和赋予的功能。通过胶接或粘合外围而产生装置室或外壳，并通过端口管道来完成室的装载。一经植入，表1的第一行和底行是暴露于宿主或将与宿主接触的层。

表1：细胞递送装置材料的变化

例如在图1A中：递送装置(EN20B1)具有非纺织织物环51、薄膜环52、其中非纺织织物的两层被层压(诸如热层压)至排斥细胞的膜(53)的膜层(非纺织织物层向外朝向宿主，而排斥细胞的膜层在内朝向室或植入的细胞)以及在外围或胶接处的薄膜环(54)。然后重复该模式以用于其他的装置壁。装置的相对侧包括非纺织织物环58、薄膜环57、膜层，其中非纺织织物的两层被层压(诸如热层压)至排斥细胞的膜(56)的膜层(非纺织织物层向外朝向宿主，而排斥细胞的膜层在内朝向室或植入的细胞)。如上所述的，在外围或胶接处存在薄膜环(55)。即，室的两侧或壁为彼此的镜像，其中用于在其间装载细胞的端口(85)形成治疗剂所在的内腔(86)。参见图1A。在该实施方案中，未包括网状物层。在一些实施方案中，并非非纺织织物环，递送装置的整个表面覆盖有非纺织织物(比较图1A和1B，51和59)。

图1B是一个实施方案，其显示了具有非纺织织物层(59)、薄膜环(60)、网状物层(61)、排斥细胞的膜层(其中非纺织织物层被层压(诸如热层压)至膜(62))以及在胶接处外围的薄膜环(63)的递送装置(EN20B2)。室的两侧或壁为彼此的镜像，其中用于在其间装载细胞的端口(85)形成治疗剂所在的内腔(86)。因此，装置的相对侧包括非纺织织物层(68)、薄膜环(67)、网状物层(66)、其中非纺织织物层被层压(诸如热层压)至膜(65)的排斥细胞的膜层以及在胶接处外围的薄膜环(64)。类似于图1A，室的两侧为彼此的镜像。

图1C是一个实施方案，其显示了具有网状物层(69)、薄膜环(70)、其中非纺织织物层被层压(诸如热层压)至膜(71)的排斥细胞的膜层、在胶接处外围的薄膜环(72)的递送装置(EN20B3)。因此，显示了另一个网状物层(76)、薄膜环(75)、其中非纺织织物层被层压(诸如热层压)至膜(74)的排斥细胞的膜层以及薄膜环(73)。室的两侧或壁为彼此的镜像，其中用于在其间装载细胞的端口(85)形成治疗剂所在的内腔(86)。类似于图1A-B，室的两侧为彼此的镜像。

图1D是一个实施方案，其显示了具有与EN20B3相同的配置，但是相比，非纺织织物层(79和82)具有与EN20B3中的非纺织织物层的密度不同的密度的递送装置(EN20B4)。网状物层(71和84)、薄膜环(78、80、81和83)类似于图1C中显示的相应的元件。

在一个实施方案中，非纺织织物和排斥细胞的膜可以诸如使用热层压或热压力(例如，来自Plastic Assembly Systems的ARB Arbor压力机)进行层压。压力机被加热至约305-320华氏度。以3英尺/分钟或10英尺/分钟的速率将0-6PSI的压力应用到非纺织织物和膜。然而，非纺织织物和排斥细胞的膜不需要层压。

在一个实施方案中，非纺织织物层向外朝向宿主，而排斥细胞的膜层在内朝向室或植入的细胞，但技术人员使用本公开可以预想不同的配置，例如，非纺织织物层可以向内朝向室或植入的细胞，而排斥细胞的膜层向外朝向宿主。在一些实施方案中，非纺织聚酯织物位于排斥细胞的膜外部，并被层压至膜。

在一些实施方案中，排斥细胞的膜和/或非纺织织物被层压在一起然后被穿孔。在一些实施方案中，排斥细胞的膜首先被穿孔，然后被层压至非纺织织物。在一些实施方案中，仅非纺织织物被穿孔，然后被层压至排斥细胞的膜。当排斥细胞的膜被穿孔时，哺乳动物宿主是免疫功能不全的，或用免疫抑制药治疗的。

在如图1A-D中所示的细胞递送装置中使用的非纺织织物为基本上平的，但它可被进一步操作来提供厚度。例如，非纺织织物可以为有褶的、波状外形的或有浮饰的。此外，可将具有如地毯制造中的绒毛、毛圈织物、簇绒的织物用于产生具有绒毛和其他三维结构的织物。参见，例如美国专利第7,754,937号，其通过引用整体并入本文中。

本文中考虑的装置可以具有许多保持治疗剂的不同的配置和不同的容量。ENCAPTRA EN20或EN20或EN20装置或小的递送装置是指具有约20μl的功能性体积的装置，并且可以含有约2,500至3,500IEQ的β细胞质量，或大于80,000IEQ/kg小鼠。ENCAPTRAEN250或EN250或EN250装置或大的递送装置具有约250μL的功能性体积，并且比EN20装置大约12.5倍(12.5X)，并且可以含有多达约-30,000至45,000IEQ/kg小鼠。ENCAPTRA EN100或EN100或EN100装置具有约100μL的功能性体积，比EN20装置大约6.5倍(6.5X)，并且可以含有多达约16,250至22,750IEQ/kg小鼠。EN-大容量或EN-LC装置比EN20大约48.4倍(48.4X)。含有4个细胞室的EN-LC装置可以含有多达约121,000至169,400IEQ，等等。因此，为了待递送治疗有效剂量至患者，预期将需要使用至少约4个、约5个、约6个、约7个、约8个EN250装置或约2个EN-LC装置的封装来递送足够的PEC量。

除了增加装置的大小以增加剂量容量外，给装置穿孔增加了剂量容量。穿孔的EN20装置具有未穿孔的EN20装置的剂量容量约5x的剂量容量(意指成熟时达到的β细胞质量)。换句话说，穿孔装置的剂量为完整装置的约1/5。

穿孔的细胞递送装置

为了促进植入后不久的血管生成，将细胞植入提供了宿主脉管系统和封装的细胞之间的直接的细胞间接触的穿孔的细胞递送装置。在一些实施方案中，并非装置的所有层都是穿孔的。例如，提供的穿孔细胞递送装置仅在一层(例如排斥细胞的膜)中或者仅在排斥细胞的膜和非纺织织物层中具有穿孔。这帮助保留植入的细胞/组织，同时允许与宿主的交换，诸如进入脉管系统、巨噬细胞等。

通过激光钻出穿孔，可以选择穿孔大小、数目和位置。穿孔的大小足以允许宿主血管组织(诸如毛细血管)和支持胰腺细胞类型的基质细胞进入装置内腔。在一个实施方案中，穿孔的大小使得宿主巨噬细胞和其他吞噬细胞也可以进入装置，并从穿孔装置内腔去除坏死的碎片。在一个实施方案中，穿孔的大小也允许移植体产生的治疗剂(诸如胰岛素)离开细胞递送装置。允许血管结构生长至装置内腔中的穿孔帮助将装置锚定至宿主，并抑制装置的移动。在一个实施方案中，穿孔的大小也是基于细胞聚集体的直径以使细胞保留最大化。

在一些实施方案中，装置包括细胞外壳(其由适合植入宿主并且基本上含有可能为与宿主免疫相容的或不相容的治疗剂的生物相容性材料制成)，具有包含排斥细胞的膜和任选地网状物单层或多层的壁的室以及薄膜胶接处，所述壁具有仅穿过排斥细胞的膜的孔洞；其中所述孔洞在最窄点的内径足够大以允许宿主毛细血管穿过壁的厚度，并且其中所述孔洞的数量足够多以允许所述宿主毛细血管支持可能包含于其中的治疗剂的活力。

在一个实施方案中，提供了穿孔的递送装置，其中递送装置的一层或多层是穿孔的。在一个实施方案中，提供了穿孔的递送装置，其中递送装置的一层或多层无穿孔。在一个实施方案中，仅排斥细胞的膜是穿孔的。在一个实施方案中，提供了包含未穿过装置的每个壁的孔洞的细胞递送装置。在一个实施方案中，细胞递送装置中的穿孔由孔洞组成，所述孔洞不穿过装置的每个壁，但仍然发生宿主脉管系统生长至细胞递送装置的内腔中。在一个实施方案中，公开了不包含非纺织织物的细胞递送装置。在一个实施方案中，公开了不包含非纺织织物但是排斥细胞的膜是穿孔的细胞递送装置。在此类实施方案中，排斥细胞的膜中的孔洞直径被用于保留细胞，即装置中的洞小于其中含有的细胞聚集体。

在一个实施方案中，穿孔递送装置中的细胞由PDX1/NKX6.1共阳性的胰腺祖细胞组成。在一个实施方案中，穿孔递送装置中的细胞由表达胰岛素(INS)和NKX6.1的未成熟的β细胞组成，或由表达INS、NKX6.1和MAFB的未成熟的β细胞组成。在一个实施方案中，穿孔递送装置中的细胞由表达INS和MAFA或INS、NKX6.1和MAFA的成熟的β细胞组成。在一个实施方案中，穿孔递送装置中的细胞由胰腺内分泌细胞组成。在一个实施方案中，穿孔递送装置中的细胞由胰腺胰岛素分泌细胞组成。在一个实施方案中，穿孔递送装置中的细胞由能够响应血糖水平而分泌胰岛素的胰腺β或胰岛素细胞组成。

由非纺织织物围绕的穿孔装置

在这些实施方案中，非纺织织物位于细胞递送装置的外部。非织造织物不是影响植入的细胞，而是增强细胞外壳周围的宿主血管生成。

在一个实施方案中，公开了包含非纺织织物的细胞递送装置。在一个实施方案中，公开了包含非纺织聚酯织物(NWPF)的细胞递送装置。聚丙烯、聚乙烯、尼龙、聚氨酯、聚酰胺是可以使用的非纺织聚酯织物的一些实例。在一个实施方案中，用非纺织织物围绕(或覆盖)排斥细胞的膜，即非纺织织物位于排斥细胞的膜外部。换句话说，非纺织织物朝向宿主而非植入的细胞。在一个实施方案中，非纺织织物在排斥细胞的膜周围形成护套。在一个实施方案中，仅排斥细胞的膜是穿孔的，包括非纺织织物的装置的其他层无穿孔。在一个实施方案中，仅排斥细胞的膜和非纺织织物是穿孔的，并且装置的其他层未穿孔。

在一个实施方案中，孔洞/穿孔小于装置中包含的细胞聚集体，诸如其中包含的hPSC来源的聚集体，例如定型的内胚层谱系细胞聚集体。在一个实施方案中，孔洞小于其中包含的PDX1阳性的胰腺内胚层细胞聚集体。在一个实施方案中，孔洞小于其中包含的胰腺祖细胞聚集体。在一个实施方案中，孔洞小于其中包含的胰腺内分泌细胞聚集体。在一个实施方案中，孔洞小于其中包含的成熟的β细胞聚集体。

在一个实施方案中，孔洞直径足够小以保留细胞，但是足够大以确保实现所期望的治疗效果。例如，在糖尿病患者情况下，孔洞直径由植入的细胞响应血糖水平而成熟和/或产生胰岛素的能力决定。

在一个实施方案中，穿孔的细胞递送装置被植入大鼠或人中。在一个实施方案中，提供了植入大鼠或人中的穿孔的细胞递送装置，其仅在排斥细胞的膜和非纺织聚酯织物中含有穿孔(装置的其他层无穿孔)，并且其中孔洞间隔约2mm(测量孔洞的中心到中心)或更多，并且其中孔洞直径为小于约100微米。在一个实施方案中，植入大鼠或人中的穿孔的细胞递送装置仅在排斥细胞的膜和非纺织聚酯织物中含有穿孔(装置的其他层无穿孔)，并且其中孔洞间隔约2mm或更多。在一个实施方案中，提供了植入大鼠或人中的穿孔的细胞递送装置，其仅在排斥细胞的膜和非纺织聚酯织物中含有穿孔(装置的其他层无穿孔)，并且其中孔洞直径小于约100微米。

在一个实施方案中，提供了植入大鼠或人中的穿孔的细胞递送装置，其仅在排斥细胞的膜中含有穿孔(装置的其他层无穿孔)，并且其中孔洞间隔约2mm或更多，并且其中孔洞直径为小于约100微米。

在一个实施方案中，细胞递送装置包含穿孔的排斥细胞的膜和PDX1阳性的胰腺内胚层细胞，其可以被植入至人类患者中，其中PDX1阳性的胰腺内胚层细胞在体内成熟为产胰岛素的细胞。在一个实施方案中，细胞递送装置仅包含穿孔的排斥细胞的膜和穿孔的NWF层，以及PDX1阳性的胰腺内胚层细胞，其中所述细胞递送装置可以被植入至人类患者中，其中PDX1阳性的胰腺内胚层细胞在体内成熟为产胰岛素的细胞。

层压装置

在一个实施方案中，排斥细胞的膜被层压至非纺织织物。在一个实施方案中，排斥细胞的膜被层压至NWF。当排斥细胞的膜被层压至非纺织织物时，排斥细胞的膜保持平整。无层压时，排斥细胞的膜可能变形出平面，其产生可能引起细胞的不均匀分布的障碍。细胞的不均匀分布可能导致坏死区域、细胞死亡，并且在其他情况下可能降低效力。细胞递送装置的室或内腔内的细胞分布的控制也被称为细胞递送装置内细胞的空间位置。在一个实施方案中，提供了控制细胞递送装置内细胞分布(细胞位置)的方法，其包括将排斥细胞的膜层压至非纺织织物。在一个实施方案中，提供了控制细胞递送装置内细胞分布(细胞位置)的方法，其包括将排斥细胞的膜层压至NWF。

通过实现细胞递送装置的内腔中的细胞的均匀分布，需要植入更少的细胞。使用更少的细胞产生更少的细胞碎片。另一个好处是营养物质向细胞的扩散增强，因为细胞均匀分布，并且与膜更紧密接触。营养物质向细胞的扩散增强引起提高的细胞存活。

可以实现内腔的完全填充，这与并入层压的膜的装置一致，造成植入的细胞的治疗效力最大化。可以用并入层压的膜的装置填充较长的和较大的内腔。

穿孔的和层压的装置

穿孔也被称为孔洞、孔、开口、小孔、穴或通道。

应理解前述装置为非限制性公开，并且符合本文中所描述的实施方案的其他的装置也被本公开呈现。本公开预想了上述装置的组合。例如，在一个实施方案中，将排斥细胞的膜和非纺织织物层压在一起然后穿孔。在一个实施方案中，将穿孔的排斥细胞的膜和未穿孔的NWF层压在一起。

装载了治疗性细胞的穿孔装置的潜在治疗价值对于1型糖尿病(T1D)群体具有重要的价值，其中长期免疫抑制的副作用是可接受的，或者由于先前的器官移植(例如，肾移植)，已需要免疫抑制。重要地，来源于多能干细胞的治疗性细胞克服了与使用死亡的器官供体相关的限制，这主要是：(1)相对于需求的严重受限的合适的尸体胰岛的供应；和(2)与捐赠的器官相关的患者风险(例如，供体来源的病原体在移植前对筛选捐赠的组织具有限制能力)。此外，递送装置和皮下施用的植入途径与当前的临床胰岛移植相比提供了几种优势，包括对移植位点的非侵入性监测和成像、植入和移植/活组织检查的手术容易性以及门静脉血栓形成事件的消除，以及门静脉血栓形成事件的消除。确实，胰岛移植领域长期在寻找门静脉内移植位点的替代选择。Cantarelli等人，Alternative transplantation sitesfor pancreatic islet grafts Curr Diab Rep.2011Oct；11(5):364-74。

为了确定所期望的装置穿孔的几何形状，对孔洞的直径、数量和分布进行了表征。图2A-D各自为描绘了具有一定密度的洞的装置的实施方案，其示出了。虽然该图中所示的洞的形状和大小一致，研究显示：i)孔洞的大小或形状不必一致；并且ii)在组装装置时，装置的两侧上的孔洞不必排列(为有序阵列)；iii)每个装置中孔洞的数目或密度可以为最小数目，并且仍然促进直接的宿主-植入体细胞间接触和血管生成；iv)并且孔洞的直径将取决于其中封装的细胞或组织(例如，细胞簇或聚集体的大小)，但是封装的细胞不必通过穿孔从装置漏出，相反与在装置的外部上移植的细胞相比，在装置的内部发现了更多的宿主来源的细胞；并且v)在组装装置时排斥细胞的膜和非纺织织物中的孔洞不必排列，并且可以从装置室的外部至内部形成不规则的通道。此外，虽然装置显示为卵形形状，但是装置可以为任何形状，诸如圆形、矩形、正方形、三角形等。

在一个实施方案中，穿孔为圆形或卵形或椭圆形形状。应注意穿孔可以具有其他的形状，诸如矩形或六角形或多边形或狭缝。在一个实施方案中，穿孔具有一致的形状。在一个实施方案中，穿孔不具有一致的形状。在一个实施方案中，穿孔一致地分布于排斥细胞的膜上。在一个实施方案中，穿孔在排斥细胞的膜上可变地间隔开，例如，它们可以聚集在装置的中心或装置的末端。在一个实施方案中，多个穿孔以一系列行和列间隔开，形成网格布置或同心圆或任何其他几何构型或此类构型的组合。在一个实施方案中，多个穿孔随机分布。在一个实施方案中，穿孔并非位于每个排斥细胞的膜上，但仅位于装置的一侧。

在一个实施方案中，细胞递送装置包含其中仅排斥细胞的膜被穿孔成有孔洞的层。在一个实施方案中，细胞递送装置包含薄膜环、网状物和排斥细胞的膜，其中仅排斥细胞的膜被穿孔成有孔洞。在一个实施方案中，细胞递送装置包含薄膜环、网状物、非纺织织物和排斥细胞的膜，其中仅排斥细胞的膜和非纺织织物层被穿孔成有孔洞。在一个实施方案中，细胞递送装置包含非纺织织物和排斥细胞的层，其中仅排斥细胞的膜和非纺织织物层被穿孔成有孔洞。在一个实施方案中，细胞递送装置包含位于排斥细胞的膜外的非纺织织物，其中仅排斥细胞的膜和非纺织织物层被穿孔成有孔洞。在一个实施方案中，细胞递送装置包含彼此层压的非纺织织物和排斥细胞的层，其中仅排斥细胞的膜和非纺织织物层被穿孔成有孔洞。在一个实施方案中，细胞递送装置包含位于排斥细胞的层外且层压至排斥细胞的膜的非纺织织物，其中仅排斥细胞的膜和非纺织织物层被穿孔成有孔洞。

在一个实施方案中，细胞递送装置包含层，其中仅排斥细胞的膜和非纺织织物层被穿孔成有孔洞，其中所述孔洞用激光制成。

穿孔的直径

使用穿孔细胞递送装置具有某些缺点(诸如细胞逃逸和较少如此地，致肿瘤性)。因此，穿孔的孔径应当使得排斥细胞的膜能够保留封装的元素，而同时允许与宿主的交换(诸如进入脉管系统、巨噬细胞和能够从穿孔装置内腔去除坏死的碎片的其他的吞噬细胞，以及支持胰细胞类型的基质细胞)。在一个实施方案中，穿孔直径小于约100μM，以允许毛细血管向内生长。申请人先前已公开了胰腺祖细胞聚集体平均直径大约为180μm，其四分位数范围大约为100-200μm(Schulz等人(2012)，同上)，因此约100μm或更小的孔洞直径提供对细胞产品的大量保留，同时仍然实现上述的其他益处，并因此促进细胞的递送和取回，以及允许毛细血管向内生长。因此，细胞暴露于宿主组织(诸如宿主血管)，但由于它们较大的尺寸，细胞逃逸的风险低至最小。在一个实施方案中，孔洞具有足够大的内径以允许宿主毛细血管的向内生长和外出，并且足够大以允许治疗剂产生的激素离开装置内腔/室。

孔径(直径)可根据细胞功能而变化。例如，如果完全的细胞容纳不是必需的，则关于孔洞直径和密度的限制更少。特定装置中的孔洞可以具有相同的直径，或可以在装置的不同部分中具有不同的直径。例如，如果大多数封装的细胞、细胞聚集体、类器官、簇、团块和组织倾向于位于大约装置的中心，则与可能具有更少和/或更小孔洞的装置的近端和远端相比，对于装置的那一区域中的细胞存活更多的孔洞可能是必要的。由此，穿孔的大小、密度和分布存在许多的灵活性，只要在移植后不久建立宿主-植入体细胞细胞间的血管生成。再次地，图2A和2B显示了穿孔装置的实施方案。图2B显示了减少细胞池面积的双内腔和双端口。

在其他的实施方案中，与装置中的穿孔的平均孔洞直径相比，胰腺祖细胞聚集体的尺寸更大。在一个实施方案中，细胞递送装置被穿孔成有孔洞，所述孔洞的直径小于约300微米、小于约200微米、小于约150微米、小于约100微米，或小于约75微米，或小于约60微米，或小于约50微米。在一个实施方案中，细胞递送装置被穿孔成有孔洞，所述孔洞的直径为约300-50微米，或约200-50微米，或约200-75微米，或约70-80μm。在一个实施方案中，孔洞的直径大于约200微米。在一个实施方案中，孔洞的直径为约200-400微米。

在一个实施方案中，穿孔的直径为约40至150μm。在一个实施方案中，穿孔具有一致的直径。在一个实施方案中，穿孔不具有一致的直径。

穿孔的密度

在一个实施方案中，少于0.4％的装置的表面区域是穿孔的，并且孔洞间隔约2mm(测量孔洞的中心到中心)；然而，它们可以间隔少于或多于2mm，并且仍然促进宿主-植入体细胞细胞间的血管生成。在一些实施方案中，少于约5.0％、少于约4.0％、少于约3.0％、少于约2.0％、少于约1.0％、少于约0.8％、少于约0.3％、少于约0.2％、少于约0.1％、少于约0.05％的装置表面区域是穿孔的。在一些实施方案中，约5.0-0.5％、约5.0-3.5％、约4.0-2.0％的装置表面区域是穿孔的。

在一个实施方案中，通过用高渗透膜替换排斥细胞的膜而避免穿孔。例如，在膜中由80-120微米的孔组成的膜，此类孔出现的密度非常类似于本文中描述的那些。

实施例1显示穿孔可以相对很少，并且仍然提供所期望的直接的宿主血管生成，同时增强细胞存活的益处。在植入后12和34周时的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测试(如实施例1中所述的)表明，在无胸腺的裸大鼠中，直径大约100μm且彼此间隔开大约1、1.5或2mm(测量孔洞的中心到中心)的孔洞产生功能性移植体。确实，即使最低密度的孔洞(即2mm间隔)，显示直接的血管生成和强的c-肽水平。从临床安全性角度来看，较少的孔洞降低细胞从细胞递送装置逃逸的的风险(如果存在的话)，因此用于穿孔装置的最低密度的孔洞(2mm间隔)是优选的。

在一个实施方案中，细胞递送装置包含穿孔的排斥细胞的膜，其具有间隔约0.5mm、1.0mm、1.5mm、2mm、4mm、8mm或更多的孔洞(测量孔洞的中心到中心)。在一个实施方案中，细胞递送装置包含穿孔的排斥细胞的膜和穿孔的NWF层，它们具有间隔约0.5mm、1.0mm、1.5mm、2mm、4mm、8mm或更多的孔洞。在一个实施方案中，细胞递送装置包含层压至穿孔的NWF层的穿孔的排斥细胞的膜，其具间隔为约0.5mm、1.0mm、1.5mm、2mm、4mm、8mm或更多的孔洞。在一个实施方案中，提供了由孔洞或穿孔组成的细胞递送装置，其中所述孔洞间隔约0.5mm-4mm，或约0.5mm-2mm，或约1.0mm-2mm。

孔洞的数目/密度可以为5-200或20-100个孔洞/装置，并且将部分取决于装置的大小(内腔表面积)。确实，孔洞的数目/密度可以为20-50-100个孔洞/装置内腔。孔洞的数目/密度可以为5-200或20-100个孔洞/装置内腔。技术人员可以确定孔洞的数目/密度来实现所期望的效果。在糖尿病患者的情况下，由植入的细胞响应血糖水平而成熟和/或产生胰岛素的能力决定孔洞的数目/密度。

在一个实施方案中，提供了包含孔洞或穿孔的细胞递送装置，其中所述孔洞间隔约0.5mm、1.0mm、1.5mm、2mm或更多，并且其中孔洞的直径为小于约200微米、小于约150微米、小于约100微米，或小于约75微米。在一个实施方案中，提供了包含穿孔的细胞递送装置，其中孔洞的间隔约2mm或更多，并且其中孔洞的直径为小于约200微米。在一个实施方案中，提供了包含孔洞或穿孔的细胞递送装置，其中所述孔洞的间隔约2mm或更多，并且其中孔洞的直径小于约100微米(测量孔洞的中心到中心)。

穿孔细胞递送装置的制造

本领域已知的制造方法可被用于产生所公开的穿孔装置。历史上，将装置组装、装载上细胞，然后使用针手动地向完整的装置添加穿孔。由此，装置的所有层均是穿孔的。参见美国申请第12/618,659号和PCT申请第WO/1993/002635号。此外，因为在制作穿孔时细胞位于装置内部，一经穿孔一部分封装的细胞位于针通路中，并且针可能损害一些封装的细胞。在插入针以制作孔洞然后去除时，该方法还可能引起无意的污染(细胞离开装置)。

本文中的实施方案描述了使用激光，其提供对孔洞大小和分布的控制，并且不对装置的每一层穿孔；并且在装载细胞后不对装置穿孔。以这种方式，通过形成穿孔，无细胞受伤或破坏，潜在的污染减少，并且仅排斥细胞的膜(或仅排斥细胞的膜和非纺织织物层)是穿孔的，使得一经植入其他层可以帮助将封装的细胞保留在递送装置内。

可以以多种尺寸配置构建穿孔细胞递送装置，诸如用于临床前啮齿动物模型(具有公称的20μL容量)，和用于临床研究的较大装置(EN250)。穿孔和未穿孔的细胞递送装置共有相同的材料、制造技术和厚度。

通过使用激光而非针，公开了穿孔细胞递送装置的制造，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。在一些实施方案中，非纺织织物被层压至排斥细胞的膜，并且仅这两层是穿孔的。在一个实施方案中，装置层中孔洞的制造是自动化的。

在一个实施方案中，穿孔为圆形或卵形或椭圆形形状。应注意穿孔可以具有其他的形状，诸如矩形或六角形或多边形或狭缝。在一个实施方案中，穿孔具有一致的形状。在一个实施方案中，穿孔不具有一致的形状。在一个实施方案中，穿孔一致地分布于排斥细胞的膜上。在一个实施方案中，穿孔在排斥细胞的膜上可变地间隔开，例如，它们可以聚集在装置的中央或装置的末端。在一个实施方案中，多个穿孔以一系列行和列间隔开，形成网格布置或同心圆或任何其他几何构型或此类构型的组合。在一个实施方案中，多个穿孔成随机分布。在一个实施方案中，穿孔并非位于每个排斥细胞的膜上，但仅位于装置的一侧。

在一个实施方案中，在装置中有多种不同的细胞群体。在一个实施方案中，在装置中有多个室，并且每个室被无细胞区域或岛状物隔开，并且每个室是穿孔的。在一个实施方案中，在装置中有多个室，并且每个室被无细胞区域隔开，并且并非所有室是穿孔的。在一个实施方案中，胰腺祖细胞被封装在一个室中，并且不同的治疗剂被封装于另一个室中。在这种情况下，仅包含胰腺祖细胞的室将是穿孔的。

改善的剂量特性(Dosing Profile)

使用用于递送胰腺内胚层谱系细胞的穿孔装置的一个优势为细胞的增殖能力增加。孔洞允许与宿主脉管系统的细胞间接触，这提高了它们的存活。孔洞还允许装置内室的膨胀增加，因此，在穿孔装置内有空间用于更多的细胞。细胞增殖能力的这一增加引起细胞质量的增加，和对应于细胞体积增加的细胞质量增加。申请人已显示当将近似的细胞体积装载至相同尺寸的装置(例如，EN20、EN100、EN250等)中时，与完整的或非穿孔的装置相比，穿孔装置中最终的细胞体积(成熟细胞，植入后约12-16周)显著更高。事实上，与非穿孔或完整的装置相比，在穿孔装置中最终(成熟)细胞体积多约5-6x。这显著提高了其他方面相同大小的细胞递送装置的剂量容量。

在胰岛移植程序中，胰岛数目或体积常常表示为胰岛当量或IEQ。一个IEQ被认为相当于直径为150μm的胰岛。假定健康人具有约1百万IEQ，且诊断患有T1D的患者具有约80％的胰岛细胞损失。治疗不必修复完全的胰岛质量/功能。已显示修复约20％的胰岛细胞质量/功能(即约200,000IEQ)为T1D患者的功能性治愈。Gillard等人Minimal functionalβ-cell mass in intraportal implants that reduces glycemic variability in type1diabetic recipients Diabetes Care 2013(11)3483-8显示具有功能性β细胞植入的受体显示对应于正常对照对象中18％的功能性β细胞质量(四分间距范围为10％-33％)的平均功能性β细胞质量。

申请人寻求基于由植入的成熟PEC移植体所释放的c-肽计算IEQ，如Kroon等人(2008)(同上)先前所描述的。申请人显示存在将装置中产生的c-肽与相对IEQ数目相关联的线性标度。参见图3。为了产生该图，申请人购买了特定量的等分试样的尸体胰岛。将6个不同的胰岛制剂碾碎，并从每个样品测量总的c-肽。将每个岛样品的c-肽的测量值制图，且显示c-肽水平相对于人胰岛当量的相关性具有线性关系。参见图3。以下方程式定义了c-肽水平(皮摩尔)和人胰岛数目(IEQ)之间的线性关系：

c-肽＝0.3889x+245.53

该方程式具有0.9852的决定相关性R²。R²决定系数是回归线近似实际数据点的良好性的统计学度量。R²为1表明回归线与数据完全吻合。因此，如方程式所代表的c-肽和IEQ之间的相关性具有强的或高的置信水平。

在一个实施方案中，可以通过c-肽水平与胰岛IEQ的线性关系来推测或推导IEQ的数目；并且IEQ的数目是在含有治疗性细胞的任何一个穿孔或非穿孔装置中达到的细胞剂量的相对量度。因此，例如，2000皮摩尔的c-肽为如下所示的约4500IEQ或人胰岛：

2000＝0.3889x+245.53→(2000-245.53)/0.3889＝x→x＝4511.36IEQ

在一个实施方案中，与完全的(非穿孔的)细胞递送装置相比，穿孔细胞递送装置剂量容量提高了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更多倍。例如，穿孔的EN20装置或小的递送装置具有约20μl的公称填充体积，并且可以含有约7,000至47,000IEQ的β细胞质量(均值为约23,000)或大于250,000IEQ/kg大鼠。具有300μl的公称填充体积的较大的递送装置可以含有多达700,000IEQ的β细胞质量。因此，为了将治疗有效剂量递送至患者，预期将需要仅一个或两个大的穿孔装置来递送足够的PEC量。

在一个实施方案中，在植入了穿孔的细胞递送装置后哺乳动物中的c-肽产生未达到稳定时期，直至约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周之后。

在一个实施方案中，在植入后约30周、植入后约31周、植入后约32周、植入后约33周、植入后约34周、植入后约35周、植入后约36周、植入后约37周、植入后约38周、植入后约39周、植入后约40周时，在植入了穿孔细胞递送装置后哺乳动物中的c-肽产生达到稳定时期。在一个实施方案中，在植入后约30-40周，在植入了穿孔细胞递送装置后哺乳动物中的c-肽产生达到稳定时期。在一个实施方案中，在植入后约35-45周、在植入后约30-45周，在植入了穿孔细胞递送装置后哺乳动物中的c-肽产生达到稳定时期。

假设穿孔的细胞递送装置可以在装置内腔内提供一类保护性小生境(niche)，以在植入后立即将植入的细胞与否则会是严苛的皮下宿主环境屏蔽开。确实，当申请人相对于根本无细胞封装比较穿孔装置(即，在附睾脂肪垫下移植的无装置/“裸细胞”)，与裸细胞相比，在穿孔装置中具有改善的细胞功能(数据未显示)。因此，仅细胞的更直接的宿主-植入体细胞细胞间接触(例如，直接的血管生成)并非体内改善的细胞功能的解决方案，否则将预期相比穿孔装置中的细胞，裸细胞将具有改善的功能。参见申请人的美国系列第12/618,659号(同上)的实施例1。

递送装置可被在疾病状态的校正中的组织或细胞替代。当前最通常通过输注至门脉循环来进行用于校正疾病状态的细胞器或无细胞的同种异体移植植入，以允许细胞寄存于肝中。本发明允许使用可以容易地使用的交替的植入位点，且具有其内容物的递送装置在必要时可以去除。递送装置允许宿主为植入的组织提供充足的营养支持，以校正疾病状态。因此，递送装置可被用于人组织的同种异体移植物移植。

递送装置还可被用于植入患者自己的细胞，其已经遗传改变以便它们产生治疗性产物。一旦细胞转换成表达基因并分泌治疗性产物，用于那些细胞的可去除的容器是可取的。该递送装置也可被用于构建混合型的生物人工器官。递送装置允许宿主为生物人工器官供应紧密的脉管系统，以便将营养物递送至器官，去除代谢废物，且将器官产生的治疗性产物递送至宿主。

关于生物免疫保护性策略的另外的开拓性工作可以消除未来对长期免疫抑制的需求。参见Rong,An effective approach to prevent immune rejection of human ESC-derived allografts Cell Stem Cell 2014 14(1):121–130，其通过引用整体并入本文中。

除非另有说明，非穿孔装置或完整的装置意指没有穿孔(孔洞)的装置。

组合产品

本文中所描述的实施方案公开了组合产品，其是指装载有细胞或治疗剂的装置，即，每个单独可以为候选的医疗装置或细胞产品，但一起使用时他们组成组合产品。在一个实施方案中，组合产品是指装载有细胞的穿孔装置。这被称为“穿孔的组合产品”。装置(穿孔的或未穿孔的)可以为本文中所描述的任何大的细胞递送装置，包括但不限于EN20、EN100、EN250或EN-大容量。组合产品可以指定装置大小，例如VC-01-20意指装载了细胞的EN20。装载至装置(穿孔的或未穿孔的)中的细胞可以为以上讨论的任何细胞，包括但不限于定型内胚层、PDX1阳性的内胚层、PDX1阳性的前肠内胚层、胰腺内胚层、表达PDX1和NKX6.1的胰腺内胚层细胞、内分泌祖细胞、表达NKX6.1和INS的内分泌祖细胞、未成熟的β细胞、表达NKX6.1、INS和MAFB的未成熟的β细胞、成熟的内分泌细胞、表达INS、GCG、SST和PP的成熟的内分泌细胞，以及成熟的β细胞和成熟的表达INS和MAFA的成熟的β细胞。

装载有在体内植入时成熟的胰腺内胚层细胞的穿孔递送装置(“穿孔组合产品”)旨在降低胰岛素依赖性和/或减少患未察觉的低血糖症、不稳定的(脆弱的)，或接受了器官移植，以及能够耐受且或已经在接受免疫抑制疗法的高风险I型糖尿病患者中的低血糖症。主要的作用方法是经由人胰腺内胚层细胞(PEC)或胰腺祖细胞，其包含于促进直接的宿主血管生成的可渗透的、耐用的、可植入的医疗装置中。PEC细胞在植入后分化和成熟为治疗性葡萄糖响应的、释放胰岛素的细胞。由此，穿孔的组合产品支持人胰岛素的分泌。穿孔的组合产品限制PEC细胞在体内的分布(外出)。将穿孔的组合产品植入位置，所述位置允许足够的血管移植以维持装置内的治疗性细胞群，并促进胰岛素和其他胰腺产物分配至血流中。穿孔的组合产品旨在为用常规外科工具进行植入和移植，并提供用于两年或更多年的治疗性剂量。装置旨在在配制、保存期限、处理和手术植入期间保持足够剂量的PEC细胞产品来实现临床功效，并确保细胞产品装载在组织囊中以满足安全要求。

穿孔的组合产品由含有一剂PEC、人胰腺祖细胞治疗产品的穿孔装置(PD)组成。在植入至患者内后，穿孔的组合产品被设计成使得装置能够整合，且植入的细胞产品能够直接进行血管生成，以允许PEC细胞分化和成熟为响应葡萄糖的、产生胰岛素的的细胞，以用于治疗需要胰岛素的患者。

穿孔装置(PD)被限定为耐用的、生物相容的、易于去除的植入装置，其由黏合在一起形成含细胞的内腔的堆积的材料层组成。装置由旨在长期植入的生物相容的和生物稳定的材料组成。半渗透膜允许营养物在植入后立即扩散至内腔，以维持植入的细胞的活力，而并行地，膜中的穿孔使得宿主血管能够生长至装置内腔内，并直接至植入的细胞，改善植入的细胞产品(包括胰岛素)输注和释放至血流中。

因为PD含有允许宿主血管侵入或进入的足够的穿孔，其他的宿主细胞(包括免疫细胞)将迁移至装置的含细胞的内腔，使得必须使用免疫抑制药物。

穿孔的组合产品预期植入期为5年，但需要满足其至少2年的预期使用。PD的设计意图是在囊形成期间提供确定的、受保护的用于植入细胞的早期存活和分化/成熟的空间，并在整个移植期保留大部分此类细胞。装置组分必须为生物相容的。正在开发两种装置配置以用于临床研究：具有足够的体积来潜在地实现治疗性给药以及适合易于植入体和外植体在中间时间点(前哨(sentinel))经由组织学评估移植和宿主组织应答的较小单元的装置。应当选择装置中的穿孔的大小和数目，以允许充足量的宿主血管直接进入至植入的细胞，而不损害穿孔装置保留充足的细胞剂量以提供效力的能力。此外，穿孔装置应当确保在产品移植期间从身体去除充足量的植入的细胞，这将包括周围的宿主组织囊，以满足安全要求。

相对于它们与完整的(无孔洞)细胞递送装置的相似性，PD和穿孔的组合产品的设计具有另外的优势。这些包括：

PD利用申请人在美国专利第8278106号和美国申请第14/201,630号中先前公开的为完整的细胞封装装置确立的相同的材料、类似的制造工艺和大量的生物相容性测试。

因为完整的和穿孔的装置共有相似的几何学和操作特征，用于植入体和外植体的手术程序对于两种产品预期为相同的。总之，穿孔的组合产品被设计成利用现有的用于细胞产品递送的完整的细胞封装装置的制造工艺和临床经验。

以下参照编号的段落描述其他的实施方案：

包含非纺织织物的细胞递送装置。

第24段的细胞递送装置，还包含排斥细胞的膜，其中所述非纺织织物位于所述排斥细胞的膜外部。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和位于所述排斥细胞的膜外部的非纺织织物，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。

第26段的细胞递送装置，其中宿主血管与细胞递送装置的内腔直接接触。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和位于所述排斥细胞的膜外部的非纺织织物，其中仅所述非纺织织物是穿孔的。

第28段的细胞递送装置，其中宿主血管与细胞递送装置的外表面直接接触。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜、位于所述排斥细胞的膜外的非纺织织物，以及网状物层、薄膜胶接处，或者二者，其中所述非纺织织物和排斥细胞的膜是穿孔的。

第30段的细胞递送装置，其中宿主血管与细胞递送装置的内腔直接接触。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和位于所述排斥细胞的膜外部的非纺织织物，其中仅所述非纺织织物和排斥细胞的膜是穿孔的。

第32段的细胞递送装置，其中宿主血管与细胞递送装置的外表面直接接触。

第32段的细胞递送装置，其中宿主血管形成完全通过细胞递送装置，并且与装载至细胞递送装置中的治疗剂直接接触。

第32段的细胞递送装置，其中所述非纺织织物被层压至排斥细胞的膜。

第32段的细胞递送装置，其中所述细胞递送装置被植入至用至少一种免疫抑制药治疗的哺乳动物宿主。

第36段的细胞递送装置，其中所述免疫抑制药选自：钙调神经磷酸酶抑制剂、抗代谢物免疫抑制剂，及以上的组合。

第37段的细胞递送装置，其中所述免疫抑制药选自：环孢霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、他克莫司(TAC)，及以上的组合。

细胞递送装置，其包含植入至用免疫抑制药治疗的宿主的穿孔的非纺织织物。

细胞递送装置，其包含植入至用免疫抑制药治疗的宿主的位于排斥细胞的膜外部的非纺织织物。

第39或40段的细胞递送装置，其中所述非纺织织物是穿孔的。

第41段的细胞递送装置，其中所述排斥细胞的膜是穿孔的。

第42段的细胞递送装置，其中所述排斥细胞的膜和非纺织织物是穿孔的。

第39或40段的细胞递送装置，其中所述免疫抑制药选自：钙调神经磷酸酶抑制剂、抗代谢物免疫抑制剂及以上的组合。

第44段的细胞递送装置，其中所述免疫抑制药选自：环孢霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、他克莫司(TAC)，及以上的组合。

第39或40段的细胞递送装置，其中所述细胞递送装置包含排斥细胞的膜，其中所述非纺织织物被层压至排斥细胞的膜。

促进哺乳动物中移植的细胞体内存活的方法，所述方法包括：a)将细胞装载至穿孔细胞递送装置；和b)将含有细胞的穿孔装置植入至哺乳动物宿主，从而促进移植的细胞的细胞存活。

第47段的方法，其中所述细胞为胰腺内胚层细胞。

第47段的方法，其中所述哺乳动物不是小鼠。

第47段的方法，其中所述哺乳动物为人或大鼠。

降低哺乳动物中的血糖的方法，其包括：1)将细胞装载至细胞递送装置，其中所述装置包含穿孔的排斥细胞的膜和位于所述排斥细胞的膜外部的穿孔的非纺织织物，并且无其他的穿孔层；b)将细胞递送装置植入至哺乳动物宿主；以及c)使植入的细胞成熟，从而降低哺乳动物中的血糖。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和位于所述排斥细胞的膜外部的非纺织织物，其中所述非纺织织物被层压至所述排斥细胞的膜。

第52段的细胞递送装置，其中所述非纺织织物和所述排斥细胞的膜是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜并且无NWF，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜并且无植入至用ISD治疗的哺乳动物的NWF，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜并且无植入至用ISD治疗的大鼠或人的NWF，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜并且无植入至未用ISD治疗的哺乳动物的NWF，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜并且无植入至未用ISD治疗的大鼠或人的NWF，其中仅排斥细胞的膜是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和NWF，其中仅排斥细胞的膜和NWF是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和植入至用ISD治疗的哺乳动物的NWF，其中仅排斥细胞的膜和NWF是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和植入至用ISD治疗的大鼠或人的NWF，其中仅排斥细胞的膜和NWF是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和植入至未用ISD治疗的哺乳动物的NWF，其中仅排斥细胞的膜和NWF是穿孔的。

细胞递送装置，其包含排斥细胞的膜和植入至未用ISD治疗的大鼠或人的NWF，其中仅排斥细胞的膜和NWF是穿孔的。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜并且无NWF.

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜并且无植入至用ISD治疗的哺乳动物的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜并且无植入至用ISD治疗的大鼠或人的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜并且无植入至未用ISD治疗的哺乳动物的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜并且无植入至未用ISD治疗的大鼠或人的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜和完整的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜和植入至用ISD治疗的哺乳动物的完整的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜和植入至用ISD治疗的大鼠或人的完整的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜和植入至未用ISD治疗的哺乳动物的完整的NWF。

细胞递送装置，其包含完整的排斥细胞的膜和植入至未用ISD治疗的大鼠或人的完整的NWF。

免疫抑制

植入成熟胰岛细胞同时也用免疫抑制化合物治疗宿主在先前已有公开。参见美国专利第9,062,290号，其通过引用整体并入本文中。但是，已报道钙调神经磷酸酶抑制剂：(1)为致糖尿病的(产生糖尿病)(综述于Crutchlow MF,Transplant-associatedhyperglycemia:a new look at an old problem Clin J Am Soc Nephrol.2(2):343-55(2007)中)，和(2)对小鼠中的内源性胰腺再生有负面影响(参见Heit J,Calcineurin/NFATsignaling regulates pancreatic beta-cell growth and function Nature 21；443(7109):345-9(2006)和Nir T,Recovery from diabetes in mice by beta cellregeneration J Clin Invest 117(9):2553-61(2007))。由此，还未知且不能够预测未成熟的胰腺祖细胞是否能够在钙调神经磷酸酶抑制剂的存在下在体内成熟，并且如果它们真的成熟，在用免疫抑制剂治疗宿主时成熟的移植体是否能够存活和发挥功能。

即使用胰岛同种异体移植物治疗I型糖尿病在使许多患者免于长时期的外源胰岛素注射中也是无效的。一个问题在于抑制同种异体移植物排斥所需的免疫抑制试剂能够严重地危害移植的胰岛细胞功能。Cellular and Molecular Approaches to AchievingEuglycemia(1997),NIH指南26(38)。

本文中所描述的实施方案涉及植入的含有细胞的穿孔装置，其中宿主用免疫抑制药治疗。在一个实施方案中，穿孔装置包含至少一层朝向宿主的非纺织织物(诸如NWF)，其中宿主用免疫抑制药治疗。在一个实施方案中，穿孔装置包含至少一层被层压至排斥细胞的膜并朝向宿主的NWF，其中宿主用免疫抑制药治疗。在一个实施方案中，免疫抑制药选自钙调神经磷酸酶抑制剂、抗代谢物免疫抑制剂及以上的组合。在一个实施方案中，免疫抑制药选自环孢霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、他克莫司(TAC)及以上的组合。在一个实施方案中，向植入了未穿孔装置的宿主施用免疫抑制药。

在一个实施方案中，公开了向用免疫抑制药治疗的宿主施用在穿孔细胞递送装置中的治疗有效量的治疗剂的方法。

以下参考编号的段落描述其他的实施方案：

在哺乳动物中体内产生胰岛素的方法，所述方法包括：a)向哺乳动物宿主施用免疫抑制药；b)将含有胰腺内胚层细胞的穿孔装置植入至哺乳动物宿主中；和c)使胰腺内胚层细胞群在所述穿孔装置中体内成熟，使得祖细胞群成熟为分泌胰岛素的细胞，从而在哺乳动物中体内产生胰岛素。

第62段的方法，其中所述免疫抑制药选自钙调神经磷酸酶抑制剂、抗代谢物免疫抑制剂和以上的组合。

第63段的方法，其中所述免疫抑制药选自：环孢霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、他克莫司(TAC)及以上的组合。

第62段的方法，其中所述穿孔装置包含至少一层排斥细胞的膜和位于所述排斥细胞的膜外部的非纺织织物。

第665段的方法，其中所述非纺织织物被层压至排斥细胞的膜。

穿孔细胞递送装置，其包含植入用免疫抑制药治疗的宿主内的胰腺内胚层细胞。

第67段的穿孔细胞递送装置，其中所述免疫抑制药选自钙调神经磷酸酶抑制剂、抗代谢物免疫抑制剂及以上的组合。

第68段的穿孔细胞递送装置，其中所述免疫抑制药选自：环孢霉素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、他克莫司(TAC)及以上的组合。

第67段的穿孔细胞递送装置，其中所述穿孔装置包含至少一层非纺织织物。

第70段的穿孔细胞递送装置，其中所述穿孔装置包含排斥细胞的膜，其中所述非纺织织物被层压至排斥细胞的膜。

改善治疗性细胞在哺乳动物对象中的存活的方法，其包括向所述对象施用在穿孔细胞递送装置中的有效量的治疗性细胞和有效量的免疫抑制剂，其中所述有效量的免疫抑制剂不危害治疗性细胞在体内存活和成熟的能力。

在哺乳动物产生胰岛素的方法，其包括以下步骤：向宿主植入胰腺内胚层；向宿主施用有效剂量的免疫抑制剂，并允许胰腺内胚层在哺乳动物中成熟为产胰岛素的细胞，从而在哺乳动物中产生胰岛素。

抑制或调节宿主对植入的外源性或同种异体细胞的免疫或炎症反应的方法，其包括：在穿孔的细胞递送装置中递送细胞，并向宿主施用有效量的抗炎因子或免疫抑制药，其中所述细胞为胰腺内胚层。

治疗对象的糖尿病的方法，其包括：(a)向糖尿病对象施用免疫抑制药；和(b)向对象施用在穿孔细胞递送装置中的胰腺内胚层细胞，其中胰腺内胚层细胞成熟为产胰岛素细胞，从而治疗对象的糖尿病。

本文中所描述的实施方案的另外的特征和优势从详细描述、附图和实施例将变得显而易见。

在正常人类患者中使用穿孔装置将需要长期的免疫抑制药(ISD)治疗。由于ISD造成的不利影响，目前尚不清楚植入接受了ISD的宿主内的申请人专有的PDX1阳性的胰腺内胚层细胞或胰腺祖细胞(亦称“PEC”)是否(1)能够成熟，和(2)成熟细胞是否会保持活力和生物学活性，并响应血糖水平而产生胰岛素，因为先前的工作显示某些钙调神经磷酸酶抑制剂为致糖尿病的(产生糖尿病)，参见Crutchlow等人(2007)，同上)，并对小鼠中的内源性胰腺再生有负面影响(Heit(2006)同上)。申请人出人意料地发现在接受ISD的裸大鼠中，在穿孔装置中植入的PEC继续分化和发挥功能，如通过以下事实所证实：环孢霉素A治疗的动物中人c-肽的血清水平类似于未治疗的对照大鼠中测量的水平。此外，在CsA治疗的大鼠中观察到的最初高血糖症得到逆转。在植入后至少30周仍然保持如此，表明缺少对超过治疗水平的通过环孢霉素A的钙调神经磷酸酶抑制的移植体灵敏性。后续的研究进一步测试了在穿孔装置中并植入至接受了CsA或他克莫司(TAC)与霉酚酸酯(MMF)的组合的宿主的胰腺内胚层。该研究确立了胰腺内胚层和移植体对测试的所有ISD方案的耐受性。总之，胰腺内胚层和移植体的功能似乎不受联合存在的高血糖症和钙调神经磷酸酶抑制的负面影响，这与从先前文献报道所预期的结果相反。由此，技术人员将预期胰腺内胚层和移植体的功能将不受到大多数用以维持免疫抑制的常用药物的负面影响。

在一个实施方案中，装置被植入腹膜前。

相关文献

来源于人多能干细胞的胰腺细胞的封装描述于Martinson等人2012年10月2日发布的美国专利第8278106号中。用于可植入的封装装置的工具和仪器描述于2014年4月16日递交的美国申请第14/254,844号和美国设计第29/488,209号、第29/488,217号、第29/488,191号、第29/488,204号中。用于装载细胞至可植入的装置的仪器和方法描述于2014年10月13日递交的PCT/US2014/060306中。用于封装装置的装载系统描述于2013年8月21日递交的美国申请第14/000,864号中。3维大容量细胞封装装置组装体描述于2014年3月7日递交的美国申请第14/201,630号以及美国设计第29/447,944号、第29/509,102号、第29/484,363号、第29/484,360号、第29/484,359号、第29/484,357号、第29/484,356号、第29/484,355号、第29/484,362号和第29/484,358号中。细胞封装装置描述于美国设计第29/408,366号、第29/517,319号、第29/408,368号、第29/518,513号、第29/518,516号、第29/408,370号、第29/517,144号、第29/423,365号、第29/530,325号中。将人胚胎干细胞培养成胰腺内分泌细胞描述于第13/998,884号和第62/352,968号中。有孔植入体描述于在WO1993/02635中。每个以上提及的专利/申请均通过引用整体并入本文中。

本说明书中提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文中。

实施例

还应理解前述涉及说明性的实施方案，并且在其中可进行许多改变，而不脱离本发明的范围。通过以下实施例进一步说明了本发明，其不应以任何方式被解释为对其范围施加限制。相反，可以很清楚地理解可以采用各种其他的实施方案、修改及其等同物，在阅读本文的描述后，可以将它们提示给本领域技术人员，而不脱离说明性的实施方案的精神和/或所附权利要求的范围。

实施例1：具有各种密度非纺织织物的细胞递送装置

EN20装置通常由3层组成：1)内部排斥细胞的膜；2)中间薄膜环；和3)和外层的纺织网状物。在制造过程中，当3种组分被超声胶接(或密封)在一起时，排斥细胞的膜可能通过更硬的网状物成为压缩的，特别是在胶接处和内腔之间的过渡区域附近。装置的极度弯曲也可能导致膜中的压缩区域。这些压缩区域可能潜在地导致膜的破坏，危害装置完整性(例如，细胞漏出装置)。为了改善装置的结构完整性同时维持它的功能性(排斥细胞的、血管生成、生物相容的等)，研究了另外的材料和/或层。非纺织织物被认定为潜在的干预缓冲层。

使用非纺织织物制作了新的装置。如上文所讨论的，装置组分(非纺织织物、薄膜、网状物和膜)可以以各种模式排列。在此，使用多种纤维密度(0.40、0.75和1.00oz/yd^2)将非纺织织物添加至外部纺织网状物层和排斥细胞的膜的外表面之间。参见图4，其显示了具有添加的非纺织织物的递送装置的横截面。

非纺织织物要么未被层压至排斥细胞的膜，要么使用定制聚乙烯、干燥粘合网(例如，零件编号Spunfab PO4605,SpunFab,Inc.)，被热层压至排斥细胞的膜。参见表5。选择该粘合剂是因为它低的基本重量(0.145oz/yd^2)，以抑制层压过程中排斥细胞的膜孔的闭塞。

本研究在两个组群SCID-Bg小鼠中进行。将冷冻保存的胰腺内胚层细胞(被称为“PEC”)解冻，在包含DMEM/HI葡萄糖(27mM)和B27的Dulbecco培养基中培养，并装载至EN20尺寸装置中以分别用于每个组群。

表6：第1组群的各种装置配置

表7：第2组群的各种装置配置

为了确定各种配置的功能，如Kroon等人，2009(同上)和Agulnick等人2015(同上)中所描述的，在植入后约8、13、16和22周进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测定。特别地，在GSIS测定之前，小鼠空腹大约15–18小时。以约3.0g/kg体重的剂量经由腹膜内注射约30％右旋糖(Hospira)溶液来施用葡萄糖，并在葡萄糖施用前(空腹的)和葡萄糖施用后30和/或60分钟采集血液。通过在异氟烷麻醉下眼眶后窦穿刺采集大约50μL的血液样品，并转移至含有血液/血清分离凝胶的微量滴定管(BD Biosciences，cat#365956)。在将这些管以4000–6000x g旋转10分钟后采集血清。使用ELISA测定(Mercodia超灵敏人c-肽ELISA，cat#10-1141-01)分析来自血液样品的血清的人c-肽。

表8显示了与对照装置(未使用NWF)相比，并入NWF的装置给出改善的功能，如通过葡萄糖刺激后血清中的人c-肽所测量的。

例如，从植入了EN20-NWF(2)(0.75oz/yd^2，未被层压至排斥细胞的膜)的小鼠实现了最大c-肽值。在植入后13周(1945pM相对于841pM)和16周(3697pM相对于1326pM)时，c-肽值比EN20对照-1装置大约2.5倍。在植入后13周(1314pM相对于841pM)和16周(1696pM相对于1326pM)时，植入了EN20-NWF(2)-SB(用聚乙烯粘合网将非纺织PET材料层压至排斥细胞的膜)的小鼠具有高出约1.5倍的人c-肽血清值。

类似地，当使用其他密度的非纺织PET材料(NWF(3)和NWF(1)，分别为0.40和1.00oz/yd^2，未被层压至排斥细胞的膜)时，在植入后13周(具有NWF(3)的装置的1603pM相对于EN20对照-2的644pM，以及具有NWF(1)的装置的1482pM相对于EN20对照-2的644pM)和16周(具有NWF(3)的装置的2186pM相对于EN20对照-2的826pM，以及具有NWF(1)的装置的2285pM相对于EN20对照-2的826pM)时，c-肽值比植入了EN20对照-2装置的小鼠高约2.5倍。(参见表8)。

表8：植入了用各种密度的NWF制作的细胞递送装置的小鼠的GSIS数据

相对于EN20对照-1组的对照值％^a。相对于EN20对照-2组的对照值％^b。

移植的移植体的组织学分析表明与无NWF的对照装置相比，含有在排斥细胞的膜和网状物层之间的NWF的装置周围的血管生成增加，这表明NWF有助于装置的功能性能改善，如通过葡萄糖刺激后与对照相比的显著更高的人-C肽血清水平所表明的。

尽管排斥细胞的膜与外部网状物之间的NWF改善了EN20装置的体内功能性能，各种不同密度(基本重量)的NWF(1)、(2)或(3)似乎未显著影响功能性能(比较表8中的第2组群中的EN20-NWF(3)和EN20-NWF(1))。出人意料地，与其中用聚乙烯粘合网将非纺织PET层层压(第1组群的EN20-NWF(2)-SB)至排斥细胞的膜的装置相比，其中NWF未被层压至细胞膜层的的那些装置(第1组群的EN20-NWF(2)；和第2组群的EN20-NWF(3)、EN20-NWF(1))具有改善的功能性能(比血清人c-肽高2.5倍和1.5倍)。由此，可得出结论，即NWF(层压的或未层压的)的存在对递送细胞的功能性具有最显著的影响。

实施例2：细胞递送装置中将非纺织织物层压至排斥细胞的膜

进一步研究将了NWF层层压至排斥细胞的膜层的影响。构建了至少3种配置的小型20μL细胞递送装置(“EN20”)。对照装置由最内层的排斥细胞的膜和最外层的网状物组成(“EN20对照”)。实验装置由最内层的排斥细胞的膜、中间的NWF和最外层的网状物组成。在一种配置中，NWF未被层压至排斥细胞的膜(“EN20-NWF(2)”)。在另一种配置中，使用热和压力将NWF层压至排斥细胞的膜(“EN20-NWF(2)-HL”)。使用标准的热压机(例如，ARB Arbor压力机，Plastic Assembly Systems)进行排斥细胞的膜和NWF的热层压(亦称热堆积)。将压力机加热至305-320°F，并以3英尺/分钟或10英尺/分钟的速率应用0-6PSI的压力。

对所有完成的装置灭菌，并在无菌下装载来源于人多能干细胞的研究级别胰腺祖细胞，并植入SCID-Bg小鼠，如先前至少详细描述于Kroon等人2008(同上)和Agulnick等人2015(同上)中。如实施例1中所描述的，为了确定各种配置的功能性，在植入后约12和16周进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测定。

在植入后12和16周，从植入了EN20-NWF(2)(未热层压的)装置的小鼠获得的最大c-肽值比EN20对照装置分别大约2.4倍和1.9倍(比较241％相对于100％和185％相对于100％)；而在植入后12和16周时，植入了EN20-NWF(2)-HL(热层压的)的小鼠相对于对照分别具有高约2.8倍和2.30倍的值(比较278％相对于100％和229％相对于100％)。

这证明将非纺织织物层压至排斥细胞的膜对装置中细胞的功能性具有提高的影响(比较12周时241％相对于278％，和16周时185％相对于229％)。然而，如上文所述，是非纺织织物(层压的或未层压的)的存在对细胞的功能性具有最显著的影响。即，，具有非纺织织物的装置比无非纺织织物的对照装置具有大至少1.9倍的c-肽值。

表9：植入了具有被层压或未被层压至排斥细胞的膜的非纺织织物的细胞递送装置的小鼠的GSIS数据

^*标准偏差

^**表示为对照GSIS响应的百分比的结果

似乎非纺织织物通过改善装置的宿主血管生成，从而改善装置内的细胞活力、增殖、发育、成熟和功能，而改善了装置的移植。

实施例3：穿孔装置中孔洞密度的最优化

申请人寻求表征大细胞递送装置的最优穿孔数目(密度)。以下表2描述了有和无穿孔的非纺织织物的穿孔细胞递送装置，其中密度(每个装置的每个尺寸大约100微米的穿孔数目)是变化的。应注意，通常，NWF层具有不一致的孔或孔隙，这是由于其非纺织结构。因此，一些孔或孔隙可能小于100微米，而其他的则大于100微米。NWF层可能具有约0.4-0.75oz/yd^2的基本重量、约127-228μm的公称厚度和26μm的纤维直径。存在各种用于对装置穿孔的方法，例如，首先可将所有层层叠于彼此上方，然后对装置的两侧或壁的每层进行穿孔。可替代地，仅对排斥细胞层进行穿孔，然后与装置的其他非穿孔层(包括NWF层)组合。用激光穿孔提供了对孔洞大小径(直径)和穿孔数目(密度)的更大控制。在下表2的第1-3组中，仅排斥细胞的膜被激光穿孔，以形成具有约87μm的平均直径和范围为约50至120μm，并且彼此间隔大约1mm、1.5mm或2mm的孔洞。使用小规格皮下注射针在对照组(第4组和第5组)的每层中手动产生彼此距离大约2mm的孔洞。

表2：穿孔装置的参数

所有动物(无胸腺的裸大鼠)均接受测试或对照EN20装置的两个皮下移植体，每个包含约20μL固定的胰腺祖细胞聚集体。

如图5中所示的人c-肽水平所表明的，所有装置配置(激光生成的间隔约1、1.5和2mm的孔洞，以及间隔约2mm的针孔洞)允许胰腺祖细胞在无胸腺的裸大鼠中存活、增殖、发育和成熟为功能性胰腺内分泌细胞。当在植入后34周进行GSIS测定(如Kroon等人(2008)同上；Agulnick等人(2015)同上中大量描述的)时，在葡萄糖挑战后15和30分钟，不依赖于孔洞密度的所有穿孔装置中的细胞与对照装置执行得同样好。参见图6。

本领域技术人员将假设如果增加植入的细胞和宿主细胞(具体为宿主脉管系统)之间的细胞间接触引起增加的细胞存活、增殖和成熟，然后任何装置中的孔洞越多越好。因此，出人意料的是申请人发现具有较低孔洞密度的装置中的细胞与具有更高密度的孔洞的装置执行得同样好。例如，具有2mm间隔的孔洞(间隔更远的孔洞意味着更少的孔洞和较低的密度)的装置与具有间隔小于2mm孔洞(更近在一起意味着更多的孔洞和更高的密度)的那些装置执行得同样好。由此，申请人发现孔洞密度或穿孔数目可能相对少(在小的EN20尺寸装置中，装置的每个壁大约20个穿孔，即少于约0.4％的装置表面积时穿孔的)，并仍然提供所期望的直接宿主血管生成和细胞存活的益处。出乎意料的，因为本领域普通技术人员将会预期具有更多的孔洞(更大的密度)意味着更多和/或更快的宿主血管生成，其有助于递送氧气和其他营养物至植入的细胞，从而增加细胞存活和分化。

具有较少孔洞密度的装置可能是优选的，因为通过减少或抑制细胞从装置逃逸，较少的孔洞提供了改善的安全性。此外，将细胞保留在装置内是可取的，其允许在去除整个植入体时回收整个移植体。

实施例4：穿孔装置相比未穿孔装置具有改善的剂量特性

与小鼠中完整的装置(参见，例如对于完整装置为图7中的虚线)相比，植入了实施例3中所描述的穿孔递送装置(上面的表2)的大鼠随时间变化显示增加的人c-肽含量。图7显示了由各种穿孔配置产生的c-肽，并证明了在具有NWF层的穿孔装置中，c-肽(其指示胰岛素含量)随多达约30或35或40周的时间变化而增加。在约15周时，在穿孔装置中的细胞产生比在非穿孔装置中植入的细胞多约50％的c-肽。在16周时，由穿孔装置中的细胞产生的平均c-肽为2,696皮摩尔(图7，SP-2016-149)，其基于如图3中所描述的c-肽水平与IEQs的线性关系，为约6,300IEQ/装置，即，细胞剂量为约6300IEQ。到约39周，穿孔装置中的细胞具有9,244皮摩尔的平均c-肽值(图7，SP-2015-128)，其再次基于图3，为约23,100IEQ/装置的剂量。

虽然植入了保留细胞的穿孔装置的大鼠中产生的c-肽高于完整的包含细胞的装置，c-肽水平在穿孔装置中达到稳定时期需要花费更长的时间(约35周)(图7，SP-2015-128)。换句话说，穿孔的和非穿孔的(完整的)细胞装置具有相似的人c-肽水平，直到约16周，然后，完整的细胞装置达到稳定时期，而穿孔装置继续增加。

穿孔装置中实现的更高的c-肽浓度直到约16周后才达到。参见图7，SP-2016-149至SP-2015-128。相比较而言，植入了完整装置的小鼠中的c-肽水平在约16周时达到稳定时期，少于2,000皮摩尔。图7(虚线水平线)。

将来自在大鼠中植入了36或39周的穿孔装置的细胞剂量或IEQ与在小鼠中植入了相同时间段的完整的装置进行了比较。与小鼠中完整的装置相比，大鼠中的穿孔装置中的细胞剂量或IEQ有约5倍的增加。参见图8。图8显示了小鼠中的完整的装置具有少于约5,000的IEQ，而大鼠中的穿孔装置具有约23,100pmol(5倍的差异)的IEQ。这可能是因为穿孔装置中的细胞能够扩增，并因此保留了更多的产胰岛素细胞，和/或细胞产生更多的胰岛素/细胞。参见图9，其显示了相同大小和装载至每个装置中相同初始细胞剂量的完整的(上图)和穿孔的(下图)递送装置中的细胞的组织学横截面的显微照片。很明显在成熟后，穿孔装置中的细胞比完整装置中的细胞更具增殖性。即，有更多的细胞质量，或优选地更多的β细胞质量。如上文和图7中所述的人c-肽数据证明了穿孔装置中的成熟细胞比完整装置中的细胞产生更多量的c-肽。并且如图7中所示的更高的c-肽水平与更大的胰岛数目或IEQ相关联，并且更大的IEQ指示更大的细胞剂量。

因为于完整的或非穿孔装置中的细胞相比，穿孔装置中的细胞的IEQ值具有5-6倍的增加，因此于完整装置中的细胞相比，可以用更少的穿孔装置或更小的穿孔装置实现治疗性细胞剂量。因此，在一个实施方案中，穿孔装置中的细胞提供了按照与完整的或非穿孔装置相同的大小容量装置的改善的剂量容量。

实施例5：胰腺内胚层能够在用钙调神经磷酸酶抑制剂治疗的裸大鼠中成熟

关于胰岛置换治疗，在穿孔装置中移植治疗性细胞需要长期免疫抑制治疗。用于尸体胰岛细胞移植的维持性免疫抑制使用钙调神经磷酸酶抑制剂(如他克莫司(TAC)和较少用的环孢霉素(CsA))以及抗增殖剂霉酚酸酯(MMF)。已报道钙调神经磷酸酶抑制剂：(1)为致糖尿病的(产生糖尿病，Crutchlow等人(2007)，同上)和(2)对小鼠中的内源性胰脏腺再生有负面影响(Heit(2006)，同上，和Nir(2007)，同上)。由此，对于胰腺内胚层的成熟，可以预期免疫抑制给药导致的不利影响，因为对于封装的胰腺内胚层体内成熟和来源于胰腺内胚层细胞移植体的成熟β细胞，增殖是重要的组分部分。

为了测试ISD的效应，给5只裸大鼠喂食正常食物，并给5只裸大鼠喂食用250mg/kg环孢霉素A配制的食物18周。这具有优势，避免了有压力的每日通过IP注射和/或口服填喂的给药。产生的表示为血液浓度曲线下的12小时面积(AUC0-12hr)的药物暴露水平被预估为大约16μg·hr/mL。与肾脏和肝脏移植受体中6-9μg·hr/mL的环孢霉素A临床靶标AUC0-12hr相比，该暴露是高水平的。

响应钙调神经磷酸酶抑制剂，治疗的大鼠变得患糖尿病。具体地，在大约10周后，施用250mg/kg食物的环孢霉素A的大鼠成为高血糖的，也就是说大鼠未产生内源性c-肽。葡萄糖挑战后30和60分钟的血清大鼠c-肽水平远低于500pM。参见图10A。该效应通过施用外源性胰岛素(Linbit丸剂和Lantus)而被暂时控制。否则，环孢霉素A饮食能较好地被大鼠所耐受。确实，当与喂食对照饮食的动物相比时，重量和食物消耗速率是正常的。

然后如前所述，在小EN20装置中向大鼠植入含有胰腺祖细胞(或PEC)的穿孔装置。该装置不含有任何NWF层。在植入后18周，在环孢霉素A治疗的动物中的人c-肽的血清水平与未治疗的对照大鼠中的人c-肽的血清水平没有实质不同(图10B)。所有CsA治疗的动物均产生了较强的胰岛素水平，如通过30分钟时1069至4098pM人血清c-肽，和60分钟时1995至4144pM人血清c-肽所观察到。重要的是，动物不再是高血糖的或需要外源性胰岛素。例如，在15周时，平均血糖为283mg/dL(高血糖的)，在20周时它为128mg/dL(正常血糖的)。这表明来自穿孔装置的移植体现在正在调控正常血糖。该数据证明了穿孔装置中的PEC在施用了CsA的大鼠中继续分化和发挥功能。在植入后至少36周仍然保持如此(数据未显示)，表明缺少PEC和移植体对超过治疗水平的通过环孢霉素A的钙调神经磷酸酶抑制的敏感性。

上文证明了即使在用钙调神经磷酸酶抑制治疗的糖尿病(高血糖的)大鼠中，在穿孔装置中移植的胰腺内胚层仍然能够成熟并产生产胰岛素细胞和逆转糖尿病病况。

实施例6：胰腺内胚层能够在用钙调神经磷酸酶抑制剂和抗代谢物免疫抑制剂治疗的裸大鼠中成熟

评估了当暴露于钙调神经磷酸酶抑制剂和抗代谢物免疫抑制剂时，穿孔装置中封装的胰腺内胚层成熟为产胰岛素细胞的能力。表12概括了研究方案。给裸大鼠喂食以下中的每种：正常食物(对照)、含有250mg/kg环孢霉素A的食物(CsA-250)、含有250mg/kg环孢霉素A和500mg/kg霉酚酸酯的食物(CsA-250+MMF500)，或含有150mg/kg他克莫司和500mg/kg霉酚酸酯的食物(TAC-150+MMF500)。在两周的饮食驯化后，为动物植入在如上述实施例1-4中所述的穿孔装置中递送的PEC。

在Bio-Serv(Flemington,NJ)进行具有所期望的ISD含量的食物的重新配制。与对照饮食相同，基于谷物的PicoLab 5053膳食(1/2”小球)为食物基础，并随意提供给大鼠。

表11：各种食物配方

预估的ISD剂量给药是基于大约70g食物/kg体重的典型大鼠每日食物消耗速率。测量了实际的食物消耗速率和ISD剂量给药。

表12：用免疫抑制药CsA、MMF和TAC治疗的裸大鼠中的穿孔装置中封装的胰腺内胚层

*所有动物均接受了在用针手动穿孔的装置中递送的大约7x10⁶个胰腺内胚层细胞的皮下移植体(1个/小鼠或2个/裸大鼠)。注意递送装置不含有NWF层。

植入后9周，用ISD(CsA-MMF或TAC-MMF)治疗的大鼠具有比对照(无ISD)更高的人c-肽水平。参见图11。该瞬时的较高人c-肽水平部分是由于这些动物因为ISD治疗而导致成为糖尿病型，使得它们由于缺少内源性胰岛素分泌而造成血糖水平高于对照动物。以另外一种方式表示，与对照相比，用ISD治疗的大鼠预期具有更低水平的大鼠c-肽。

实施例7：穿孔细胞递送装置中的非纺织聚酯层改善胰腺祖细胞的发育和功能

实施例1-4证明了NWF的并入为细胞封装和递送装置提供增加的结构和功能，而不依赖于NWF是否被层压至排斥细胞的膜层，并且不依赖于每个装置的孔洞密度(孔洞的数目)。实施例5证明了当用钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，CsA)的免疫抑制方案治疗宿主时，来源于人多能干细胞的胰腺祖细胞事实上能够存活、发育和成熟为发挥功能的胰腺内分泌细胞，这先前未被描述且直到申请人公开前是未知的。实施例6进一步证明了胰腺祖细胞不仅能够在钙调神经磷酸酶抑制剂的免疫抑制方案中存活，而且在抗代谢物免疫抑制剂亦如此。

在本研究中，将实施例1-6的教导组合，以确定并入至少一层NWF层(装置的每个壁或每侧)的穿孔递送装置和非穿孔递送装置中的，并且用钙调神经磷酸酶抑制剂和抗代谢物免疫抑制方案的组合治疗的胰腺祖细胞的功能。

通常，植入了穿孔NWF递送装置的对照大鼠具有比植入了在非穿孔NWF封装装置中的细胞的大鼠更高的人c-肽水平。参见图12(对照，相比完整的和穿孔的，未用CsA-MMF治疗)。这是由于通过穿孔装置中的穿孔(孔洞)宿主血管与植入的细胞的直接的血管生成，这提高了细胞存活。此外，在用ISD治疗的大鼠中，植入了穿孔NWF递送装置的动物也具有比植入了非穿孔NWF装置的动物更高的人C-肽水平。参见图12(比较完整的和穿孔的，用CsA-MMF治疗)。有趣地是，接受了CsA-MMF和穿孔的NWF递送装置的这些动物的人c-肽水平为接受相同类型穿孔的NWF递送装置但无CsA-MMF免疫抑制的那些动物的约2倍(1.6倍)高。参见图12。人c-肽的这一增加可能是NWF递送装置和CsA-MMF免疫抑制方案的组合的协同效应的结果。这一提高的人c-肽水平可能是通过仅NWF和/或与ISD的组合减轻的改善的宿主血管生成的结果。

Claims (13)

1.细胞封装装置，其包含：至少一个室，以及包含在所述至少一个室内的PDX1阳性的胰腺内胚层谱系细胞，其中所述至少一个室包含排斥细胞的膜，其中所述排斥细胞的膜包含与所述细胞接触的内表面和与非纺织织物层接触的外表面。

2.如权利要求1所述的细胞封装装置，其中在所述细胞封装装置中，所述非纺织织物层位于所述排斥细胞的膜外部。

3.如权利要求1所述的细胞封装装置，其中所述非纺织织物层和所述排斥细胞的膜被层压在一起。

4.如权利要求1所述的细胞封装装置，其中所述非纺织织物层和所述排斥细胞的膜未被层压在一起。

5.如权利要求1所述的细胞封装装置，其中所述非纺织织物层和排斥细胞的膜包含穿孔。

6.如权利要求5所述的细胞封装装置，其中所述非纺织织物层和所述排斥细胞的膜包含少于40个穿孔/装置、少于20个穿孔/装置、5个穿孔/装置至200个穿孔/装置、或20个穿孔/装置至100个穿孔/装置。

7.如权利要求5所述的细胞封装装置，其中所述非纺织织物层和所述排斥细胞的膜中的每个穿孔的直径为不大于150微米、不大于100微米、不大于75微米、不大于50微米、50微米至300微米、50微米至200微米、75微米至200微米、200微米至400微米或70微米至80微米。

8.如权利要求5所述的细胞封装装置，其中如从一个穿孔的中心到另一个穿孔的中心所测量的，所述非纺织织物层和所述排斥细胞的膜中的每个穿孔间隔约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约4mm或约8mm。

9.如权利要求1所述的细胞封装装置，其中所述排斥细胞的膜是穿孔的。

10.如权利要求9所述的细胞封装装置，其中所述排斥细胞的膜包含少于40个穿孔/装置、少于20个穿孔/装置、5个穿孔/装置至200个穿孔/装置、或20个穿孔/装置至100个穿孔/装置。

11.如权利要求9所述的细胞封装装置，其中所述排斥细胞的膜中的每个穿孔的直径为不大于150微米、不大于100微米、不大于75微米、不大于50微米、50微米至300微米、50微米至200微米、75微米至200微米、200微米至400微米或70微米至80微米。

12.如权利要求9所述的细胞封装装置，其中如从一个穿孔的中心到另一个穿孔的中心所测量的，所述排斥细胞的膜中的每个穿孔间隔约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm、约2mm、约4mm或约8mm。

13.如权利要求1所述的细胞封装装置，其中所述PDX1阳性的胰腺内胚层谱系细胞为胰腺祖细胞、胰腺内分泌细胞、内分泌前体细胞或胰腺β细胞。

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