JP2024036649A - 細胞送達装置におけるｐｄｘ１膵臓内胚葉細胞及びその方法 - Google Patents

Abstract

【課題】膵臓内胚葉細胞等の細胞を宿主に移植する装置及び方法を開示する。【解決手段】装置は、細胞除外膜の外側の不織布を含み、不織布及び／又は細胞除外膜を穿孔することができる。免疫抑制試薬による宿主の治療は、細胞送達装置の穿孔による同種移植片拒絶を抑制するために必要とされ、移植した膵臓内胚葉細胞の成熟又は機能を損なわない。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、膵臓内胚葉細胞等の細胞を送達する装置の分野及びその使用に関する。

支援の記載
本発明は、カリフォルニア再生医療研究所による資金援助を部分的に受けた。

装置の生細胞又は組織を移植するいくつかの方法が試されてきた。例えば、以前に有孔細胞送達装置が報告された。米国特許出願第１２／６１８，６５９号及び国際公開第１９９３００２６３５号を参照のこと、その全体が参照により本明細書に援用される。これらの開示において、細胞送達装置の各層が穿孔され、すなわち、穿孔が装置のそれぞれの壁又は装置全体（全層）を横断する。装置の各層が穿孔していると、細胞が装置から逃げてしまうだろう。

Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ等の米国特許出願第４，８７７，０２９号は、その全体が参照により本明細書に援用される、半透性の神経誘導チャンネル又は細胞不透過性の滑らかな内膜面と小柱構造を形成する１～２０ミクロンのサイズの孔を有する外表面から構成される管を記載している。この小柱構造は、管の厚みを横断する穴（孔）を含まず、従ってこの構造は内部区画に血管成長することができない。

細胞送達装置の内部に不織布が使用されている。不織布は、細胞を装置内部に接着し、分配するための構造を提供する送達装置内に不活性スキャフォールドを提供する。米国特許出願第５，８５３，７１７号を参照のこと（その全体が参照により援用される）。

不織布はグルコース監視装置を取り囲むためにも使用される。米国特許出願第８，５２７，０２６号は、その全体が参照により本明細書に援用される、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）の血管新生層によって取り囲まれたセンサーを記載し、ｅＰＴＦＥの上にはＮＷＦが積層され得る。この‘０２６特許では、患者の血中グルコースレベルをこのセンサーで測定している。

細胞をカプセルに包み、ｉｎ ｖｉｖｏの生存率を促進するための多くの戦略が開発されてきたが、色々なものが混ざった結果だけが報告された。したがって、移植細胞の成熟又は機能を促進する細胞を移植するための装置及び方法が必要とされている。

細胞を送達する医療装置、移植細胞の細胞生存率、分化及び成熟を促進する方法を提供する。特に、本明細書に記載の実施形態は、不織布（ＮＷＦ）、例えば、ポリエステル不織布（ＮＷＰＦ）を細胞除外膜の外側に提供することによって、宿主の組織と送達装置のインターフェースを改善して、移植片の血管新生を改善する。本明細書に記載の実施形態は、ＮＷＦ及び細胞除外膜の穿孔を含んで、移植片の血管新生を改善する。本明細書に記載の実施形態は、細胞生存率を改善する宿主免疫反応を制御する。

いくつかの実施形態において、（ａ）不織布層を含む細胞送達装置と（Ｂ）ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む組合せ製品を開示する。

他の実施形態において、哺乳類動物でインスリンを産生する方法を開示する。この方法は、ａ）哺乳類動物宿主に免疫抑制薬を投与し、ｂ）膵臓内胚葉細胞を含む有孔装置を哺
乳類動物宿主に移植し、及びｃ）哺乳類動物宿主の有孔装置の膵臓内胚葉細胞集団を成熟させ、前駆細胞集団がインスリン分泌細胞を産生することを含む。

図１Ａ～図１Ｄは本開示に沿った送達装置を示す。 同上 同上 同上 図２Ａ～図２Ｄはそれぞれ、有孔細胞送達装置の一実施形態である。 同上 同上 同上 図３はＣペプチドタンパク質の合計含有量と膵島等価物（ＩＥＱ）として示されるベータ細胞の質量の相関を示すグラフである。このグラフを使用して、膵島等価物（ＩＥＱ）として示される有孔細胞カプセル化装置に膵臓細胞を移植した後に産生されたベータ細胞の質量を確認することができる。 図４は追加された不織布層を有する細胞送達装置の断面図である。 図５は針で穿孔した送達装置（対照、ＣＯＮ）及びレーザーで穿孔した装置で送達された膵臓前駆体を移植されたラットの血清中ヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。分泌Ｃペプチドレベルを移植後１２週目の空腹時と、グルコースの腹腔内投与後６０分に分析した。平均Ｃペプチド濃度（＋／－ＳＥＭ）。「Ｍ」は、針を使用した手動の孔の形成を指し、約２ｍｍの間隔である。 図６は（手動の）針で穿孔した送達装置（対照、ＣＯＮ）及びレーザーで穿孔した装置で送達された膵臓前駆体を移植されたラットの血清中ヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。分泌されたＣペプチドレベルを移植後３４週目の空腹時と、グルコースの腹腔内投与後１５分及び３０分に分析した。「Ｍ」は、針を使用した手動の孔の形成を指し、約２ｍｍの間隔である。 図７は移植後１０、１６、３６及び３９週目に有孔装置で送達された膵臓前駆体を以前に移植したラットから外植された移植片のＣペプチドタンパク質の合計含有量を示すグラフである。１０週と１６週のデータを生成するために使用された有孔装置は、図１Ｄと類似しているが、ＮＷＦが細胞除外膜に積層せず、２ｍｍの間隔の孔を有する。使用したＮＷＰＦは、基本重量が１．００ｏｚ／ｙｄ^２、公称厚みが２２８μｍ、繊維径が２６μｍを有する。３６週のデータを生成するために使用された有孔装置は、ＮＷＦを有しないことを除いて１６週の装置と同じである。３９週のデータを生成するために使用された有孔装置は、使用したＮＷＦの基本重量が０．７５ｏｚ／ｙｄ^２であり、孔の間隔が２ｍｍであることを除いて、１６週の装置と同じである。 図８は約９か月間、有孔装置の膵臓内胚葉細胞をラットに移植することによって個々の移植片で達成されたベータ細胞の質量は、同様の期間にマウスに移植されたインタクトな装置と比較して、約５倍増加したことを示すグラフである。 図９はＣペプチドが定常になった後のインタクトな細胞送達装置と有孔細胞送達装置の断面の写真である。有孔装置は、インタクトな装置より拡大し、より多くのインスリン産生細胞（ベータ細胞）を含む。 有孔送達装置で送達された膵臓内胚葉を移植された通常の食事を与えられたヌードラット（対照）、又は２５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ－２５０）を含有する食事を与えられたラットにおける血清中ラット若しくはヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。図１０Ａは、１２週目にシクロスポリンＡを投与された内在性ラットベータ細胞の機能が完全に欠如していることを示す。図１０Ｂは、ＣｓＡの処置を受けたラットのヒトＣペプチドレベルが、内在性ベータ細胞のＣｓＡ毒性によって、わずかに増加したことを示す。 同上 図１１はそれぞれ有孔送達装置の膵臓内胚葉を移植された、通常の食事を与えられたヌードラット（対照）、２５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ－２５０）を含有する食事を与えられたラット、２５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡと５００ｍｇ／ｋｇのミコフェノール酸モフェチル（ＣｓＡ－２５０＋ＭＭＦ５００）を含有する食事を与えられたラット、１５０ｍｇ／ｋｇのタクロリムスと５００ｍｇ／ｋｇのミコフェノール酸モフェチル（ＴＡＣ－１５０＋ＭＭＦ５００）を含む食事を与えられたラットにおける血清中ヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。ＣｓＡの処置を受けたラットの血中グルコースレベルが、内在性ベータ細胞のＩＳＤ毒性によって、わずかに増加した。 図１２は１１週（◆）、１４週（■）及び１８週（●）に、有孔又は無孔（インタクトな）送達装置の何れかで送達された膵臓内胚葉を移植された、通常の食事を与えられたヌードラット（対照）又はＣｓＡ－ＭＭＦを含有する食事を与えられたラットにおける血清中ヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。

本開示の実施形態を詳細に参照し、添付の図面に例を示す。可能な限り、同じ又は同様の部分を指すために、同じ参照番号を図面全体に使用する。

用語の説明
他に断りがない限り、通常の使用に従って技術用語を使用する。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ出版、１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ等（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．出版、１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．出版、１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見つけることができる。

治療薬：いくつかの実施形態において、細胞送達装置は治療薬を含む。「治療薬」という用語は、所与の疾患に対して治療的又は予防的結果を提供する薬又は微生物等の病原薬を指す。好ましくは、治療薬は、カプセルに包まれた細胞、細胞凝集体、オルガノイド、クラスター、塊、組織、癌細胞に対して向けられた毒素、例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシン、メクロレタミン等である。治療薬は、抗体又はその断片、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であってもよい。さらに治療薬は、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、又は細胞疾患若しくは障害の治療又は予防をさらに容易にするその他の薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、治療薬は、以下に示すように移植される細胞である。

移植細胞：一実施形態において、移植部位又は送達装置には、「移植細胞」（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、「外因性細胞」、「移植に適した細胞」、「移植細胞」（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、「移植細胞」（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、「治療用細胞」、「移植カプセル化細胞」、「カプセル化細胞」、「治療用同種細胞」又は「治療用自家細胞」とも呼ばれる「細胞」が添加される。多様な細胞を本開示の方法に使用することができる。移植細胞は、同種若しくは異種細胞集団、又は目的の生物学的活性物質を１つ以上産生する細胞であり得る。移植細胞、例えば、膵臓前駆体又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉は、最初に移植したときは、治療的に活性でなくてもよいが、一度移植されると、さらに発生し、成熟し、治療効果を有する。本明細書で使用する場合、「
移植される細胞」は、充分に生存可能及び／若しくは機能的な細胞若しくは細胞集団を指し、又は代謝障害のｉｎ ｖｉｖｏ治療に機能性になる。

「誘導多能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」又は「ｉＰＳ」は、特定の遺伝子又は遺伝子産物を挿入することによって、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞等の非多能性細胞、一般的には成人体細胞又は高分化細胞から人工的に調製された一種の多能性幹細胞を指し、リプログラミング細胞とも呼ばれる。Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｃｅｌｌ
１３１：８６１－８７２（２００７）；Ｗｅｒｎｉｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３１８－３２４（２００７）；Ｐａｒｋ等、Ｎａｔｕｒｅ ４５１：１４１－１４６（２００８）を参照のこと、またＰＣＴ出願国際公開第２０１００４８５６７号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９３５号、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６３９０６号及び米国特許出願第第２０１１／００３９３３８ＵＳ号、第２０１１／００３９３３８号も参照のこと、その全体が参照により本明細書に援用される。ｉＰＳＣを作製する上述の方法及びその他の方法は知られており、ｉＰＳＣが派生する又は生成される様式は、本開示の方法を限定しない。ヒトｉＰＳＣは、胚を伴う使用のない多能性幹細胞の源を提供する。

移植細胞はリプログラム細胞を含む。本明細書で使用する場合、「リプログラミング」、「リプログラムされた」という用語又はその等価物は、培地又はｉｎ ｖｉｖｏの何れかに少なくとも１つの新しい細胞種の子孫を形成する測定可能に増加した能力を細胞に与えるプロセスを指し、その能力はリプログラミングすることなく同条件下で有する。

移植細胞は分化、脱分化及び分化転換細胞を含む。したがって、本明細書で使用する場合、「分化」というフレーズは、特殊化していない細胞がより特殊化した細胞種になるプロセスを指す。反対に、「脱分化」というフレーズは、部分的に又は高分化した細胞が、多能性又は多分化能を有する細胞等の発達段階初期に逆戻りする細胞プロセスを指す。さらに対照的に、「分化転換」というフレーズは、１つの分化した細胞種を別の分化した細胞種に形質転換するプロセスを指す。

移植細胞は、単独のホルモン細胞又はポリホルモン（ｐｏｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）細胞を含む。本明細書で使用する場合、「単独のホルモン」細胞又はその等価物は、たった１つのホルモンを発現する細胞（例えば、未成熟ベータ細胞及びベータ細胞は、インスリンタンパク質のみを発現し、グルカゴン又はソマトスタチンタンパク質を発現しない）を指す。本明細書で使用する場合、「ポリホルモン」細胞は、１つ以上又は複数のホルモンを発現する（例えば、内分泌前駆体又は前駆細胞は、同細胞に２、３又は４個以上のホルモンを発現する細胞の亜集団を有する）。

移植細胞は、中内胚葉細胞を含む。「中内胚葉細胞」という用語又はその等価物は、ＳＯＸ１７ ｌｏｗ、ＣＸＣＲ４ ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ ｌｏｗ、ＳＯＸ７ ｌｏｗ及びＳＯＸ１ ｌｏｗに比べて、比較的高発現レベルのブラキュリ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１ ＭＩＸＬ１及び／又はＷＮＴ３マーカー遺伝子を有する多能性細胞を指す。

移植細胞は、胚体内胚葉細胞を含む。「胚体内胚葉」、「ＤＥ」、「胚体内胚葉系」という用語又はその等価物は、腸管又は腸管から派生した臓器の細胞に分化することができる多能性内胚葉系細胞を指す。

移植細胞は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む。「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「前腸内胚葉細胞」又はその等価物は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）、ＨＮＦ４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）及びＦＯＸＡ１マーカーを発現する細胞であるが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７又はＳＯＸ１を実質的に発現しない。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団
及びその生成方法は、２００６年１０月２７日出願された米国特許出願第１１／５８８，６９３号、明細書名「ＰＤＸ１－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｏｒｓａｌ ａｎｄ ｖｅｎｔｒａｌ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ」に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。

移植細胞は、ＰＤＸ１陽性、背側性偏向、前腸内胚葉細胞を含む。「ＰＤＸ１陽性、背側性偏向、前腸内胚葉細胞」という用語（背側性ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）は、２０１３年２月６日に出願された米国特許出願第１３／７６１，０７８号及び米国特許出願第９，１０９，２４５号の表１から選択される１つ以上のマーカーを発現する細胞であり、上述の特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。

移植細胞は、膵臓内胚葉細胞を含む。「膵臓内胚葉」、「膵臓上皮性」、「膵臓上皮」（「ＰＥ」と短縮され得る）、「膵臓内前駆体」、「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉」又は「ＰＥＣ細胞産物」という用語又はその等価物、例えば「膵臓内胚葉細胞」（ＰＥＣ）は、全ての前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）又は前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）膵臓細胞である。ＰＥＣは、本明細書に記載するとき、ステージ４分化後（約１２～１４日目）の前駆細胞集団であり、少なくとも２つの主要な固有の集団：ｉ）ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡ（若しくはＣＨＧＡ陰性、ＣＨＧＡ－）を発現しない膵臓前駆細胞、「非内分泌性多能性前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）」、「非内分泌性（ＣＨＧＡ－）亜集団」、「非内分泌性（ＣＨＧＡ－）細胞」又はその等価物、並びにｉｉ）ＣＨＧＡ（ＣＨＧＡ陽性ＣＨＧＡ＋）、「内分泌性多能性前駆体亜集団（ＣＨＧＡ＋）」又は「内分泌性（ＣＨＧＡ＋）亜集団」、「内分泌性（ＣＨＧＡ＋）細胞」又はその等価物を含む。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡを発現しないＰＥＣ膵臓内前駆体亜集団は、「非内分泌性多能性膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）」、「非内分泌性前駆体亜集団」、「非内分泌性（ＣＨＧＡ－）亜集団」、「非内分泌性（ＣＨＧＡ－）亜集団」、又は「多能性前駆体亜集団」等とも呼ばれる。ＣＨＧＡを発現するＰＥＣ多ホルモン性内分泌性細胞亜集団は、「内分泌系に関与する細胞（ＣＨＧＡ＋）」、又は「ＣＨＧＡ＋細胞」等とも呼ばれる。理論に縛られることはないが、ＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡを発現しない細胞集団は、ＰＥＣのより活性又は治療的成分であると仮説され、ＣＨＧＡ陽性多ホルモン性内分泌性細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにグルカゴン発現膵島細胞にさらに分化し、成熟すると仮説されている。Ｋｅｌｌｙ等（２０１１）Ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０－７５６、２０１１年７月３１日にオンライン出版及びＳｃｈｕｌｚ等（２０１２）、Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＰＬｏｓＯｎｅ ７（５）：１－１７、ｅ３７００４を参照のこと、参照によりその全体が本明細書に援用される。

時には、膵臓内胚葉は前述のＰＥＣを参照することなく使用されるが、概して少なくともステージ３及び４型細胞を参照するために使用される。その使用及び意味は文脈から明らかになる。膵臓内胚葉は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸ及びＮＫＸ２．２マーカーから選択されるマーカーの高レベルの発現を有するが、例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＭＡＦＡ、ＰＣＳＫ１及びＧＬＵＴ１の膵臓内分泌細胞の特徴である遺伝子を実質的に発現しない。さらに、ＮＧＮ３を発現するいくつかの「内分泌前駆細胞」は、その他の非膵臓構造（例えば十二指腸）に分化することができる。膵臓内胚葉又は内分泌前駆細胞集団及びその方法は、２００７年７月５日に出願された米国特許出願第１１／７７３，９４４号、明細書名「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｈｏｒｍｏ
ｎｅｓ」、及び２００８年４月２１日に出願された米国特許出願第１２／１０７，０２０号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＯＲＭ
ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ」にも記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。

移植細胞は内分泌前駆細胞を含む。「内分泌前駆細胞」又はその等価物は、本明細書で使用する場合、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ｂ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ６、ＭＹＴ１、ＩＳＬＥＴ１、ＮＥＵＲＯＤ、ＳＮＡＩＬ２、ＭＮＸ１、ＩＡ１、ＲＦＸ６、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＫＸ２．２及びＭＡＦＢから成るリストから少なくとも１つのマーカーを発現し、限定されないが膵島ホルモン発現細胞を含む内分泌系の細胞にさらに分化することができる胚体内胚葉系の多能性細胞を指す。内分泌前駆細胞は、少なくとも２０１２年３月６日に出願された米国特許出願第８，１２９，１８２号、明細書名「ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ， ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ－ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ」及び２０１４年１０月１４日に出願された米国特許出願第８，８５９，２８６号、明細書名「ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＯ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ（ＰＥＣ） ＡＮＤ ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＣＥＬＬＳ」に詳細に記載され、参照によりその全体が本明細書に援用される。

移植細胞は、内分泌細胞を含む。「内分泌細胞」又は「膵島ホルモン発現細胞」、「膵臓内分泌細胞」、「膵島細胞」、「膵島」、「幹細胞由来ベータ細胞」、「ベータ細胞」（「β細胞」）、「ＳＣ－ベータ細胞」又はその等価物は、インスリンを発現することができるが、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン及び膵臓ポリペプチドを発現しない膵臓内分泌細胞である。β細胞に特徴的なマーカーを発現する膵臓内分泌細胞は、インスリン及び以下の転写因子：ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＨＢ９、ＭＡＦＡ、及びＰＡＸ６の少なくとも１つの発現を特徴とし得る。

移植細胞は、適切に内分泌細胞を特定する。本明細書で使用する場合、フレーズ「適切に特定された内分泌細胞」又は「ステージ７培養物」、「未成熟ベータ細胞」を含む「未成熟内分泌細胞」又はその等価物は、血中グルコースに反応してインスリンを分泌するように移植された場合、例えば未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで機能化することができるｉｎ ｖｉｔｒｏに作製された内分泌細胞集団を指す。適切に特定された内分泌細胞又はステージ７培養物は、以下を含む追加の特徴を有し得る。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、移植されると、機能的膵島細胞に発現及び成熟する。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞集団は、内分泌細胞を富化し（又は非分泌細胞を枯渇させる）。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞集団の約５０％超の細胞は、ＣＨＧＡ＋である。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞集団の細胞の約６０％、約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％超がＣＨＧＡ＋である。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞集団の細胞の約５０％未満がＣＨＧＡ－である。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞集団の細胞の約１５％未満がＣＨＧＡ－である。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞集団の細胞の約１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％又は０％未満がＣＨＧＡ－である。さらに、特定のマーカーの発現がステージ３の最中にＮＧＮ３発現等の適切に特定された内分泌細胞であってもよい。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、ステージ５でＮＧＮ３の発現を増加させた。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、単独のホルモン（例えば、ＩＮＳのみ、ＧＣＧのみ又はＳＳＴのみ）である。一実
施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１を含むその他の未成熟の内分泌細胞マーカーを共発現する。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、単独のホルモンとＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１を含む共発現するその他の未成熟の内分泌細胞マーカーの両方であってもよい。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、合計のＩＮＳ集団の割合として単独のホルモンを発現するＩＮＳ細胞をより多く有し得る。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、合計のＩＮＳ集団の割合として単独のホルモンを発現するＩＮＳ細胞を少なくとも５０％有する。一実施形態において、適切に特定された内分泌細胞は、ＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。一実施形態において、細胞集団の細胞の約２５％超がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。一実施形態において、細胞集団の細胞の約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％超がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。

移植細胞は、未成熟の内分泌細胞を含む。「未成熟の内分泌細胞」という用語、特に「未成熟のベータ細胞」又はその等価物は、内分泌前駆細胞、膵臓内胚葉細胞（ＰＥ）、膵臓前腸細胞、胚体内胚葉細胞、中内胚葉細胞、又は後述する初期由来細胞を含むその他の内分泌細胞に由来する細胞を指し、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＮＥＵＲＯＤ、ＭＮＸ１、ＮＫＸ２．２、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＳＮＡＩＬ２、ＦＯＸＡ１又はＦＯＸＡ２から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。好ましくは、本明細書に記載の未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１を発現し、より好ましくは、ＩＮＳ及びＮＫＸ６．１を共発現する。「未成熟内分泌細胞」、「未成熟膵臓ホルモン発現細胞」、「未成熟膵島」という用語又はその等価物は、例えば、米国特許出願第８，８５９，２８６号の図４５に記載の少なくとも１つの単能性未成熟ベータ細胞又は前ベータ細胞を指し、参照によりその全体が本明細書に援用され、その他の未成熟細胞を含まず、例えば、この用語は、未成熟アルファ（グルカゴン）細胞、未成熟デルタ（ソマトスタチン）細胞、未成熟イプシロン（グレリン）細胞、又は未成熟膵臓ポリペプチド（ＰＰ）を含まない。多能性細胞を膵臓内分泌前駆細胞及び膵臓内分泌細胞に分化する方法は、さらに米国特許出願第９，０１２，２１８号、第９，１８１，５２８号、第９，２３４，１７８号、第９，１５０，８３３号、第９，０９６，８３２号、第９，０６２，２９０号にさらに記載され、参照によりその全体が本明細書に援用される。

移植細胞は機能的ベータ細胞を含む。「機能的ベータ細胞」、「成熟ベータ細胞」という用語又はその等価物は、確立されたプロセスを示す膵臓内分泌細胞であり、確実に迅速で制御されたグルコース促進インスリン分泌（「ＧＳＩＳ」）を行い、特に、ミトコンドリア呼吸／活性、次にインスリン分泌の第１フェーズ及び第２フェーズ（「二相性ＧＳＩＳ」）が増加する。詳細には、機能的ベータ細胞は、以下の二相性ＧＳＩＳの特徴の少なくとも１つを示し、（ｉ）インスリン分泌によるミトコンドリア呼吸／活性のカップリング、（ｉｉ）高い要求（本明細書では、高グルコース濃度）に応答する迅速なインスリン分泌、（ｉｉｉ）要求が静まった後に迅速にインスリン分泌をやめる能力、（ｉｖ）複数回のインスリン分泌の「オン－オフ」スイッチング能力、（ｖ）要求通りの適正量のインスリンを分泌する能力、及び（ｖｉ）複数のインスリン分泌促進物質（例えば、エキセンディン－４又はアミノ酸－Ｌ－グルタミン及びＬ－アルギニン）に応答する能力の少なくとも１つを示す。機能的ベータ細胞は、インスリンと以下の転写因子：ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＨＢ９、ＰＡＸ６、ＭＡＦＡ、ＳＬＣ２Ａ１、ＵＣＮ３及びＧＬＰ１Ｒの少なくとも１つの発現を特徴とし得る。

本明細書で使用する場合、「多能性細胞から発生」、「多能性細胞から分化」、「多能性細胞から成熟」又は「多能性細胞から産生」、「多能性細胞から派生」、「多能性細胞から分化した」という用語及びその等価物は、多能性細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ
ｖｉｖｏに分化された細胞種の産生を指す。

移植細胞は、細胞凝集体を含む。細胞凝集体は前述に示した細胞種の凝集体であり得る。凝集体は、実質的に１つの細胞種であっても、混合細胞集団であってもよい。本明細書で使用する場合、「クラスター」、「塊」、「凝集体」という用語又はその等価物は、同義に使用することができ、概して、単一の細胞に分離され、凝集されてクラスターを形成する、又は密接な細胞間接触を有する細胞群を指す。「再凝集された」という用語は、本明細書で使用する場合、クラスター、塊及び／又は凝集体がより小さいクラスター、塊及び／又は凝集体又は単一の細胞に分離され、クラスター、塊及び／又は凝集体に再凝集されることによって、新しい細胞間接触が形成される。この分離は、一般的には本質的には（パスツールピペットを使用して）手動であるが、他の分離方法も考慮される。凝集体懸濁多能性細胞培養物は、実質的に、国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５号、明細書名「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬＳ」及び第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６号、明細書名「ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ
ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＥＯＦ」に記載されている。

移植細胞は単一細胞懸濁液を含む。「単一細胞懸濁液」という用語又はその等価物は、多能性又は高分化した単一細胞懸濁液、又は機械的若しくは化学的手段によって、多能性細胞から生じた単一細胞懸濁液を指す。２０１１年６月２１日に出願された米国特許出願第７，９６４，４０２号、明細書名「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」に詳細に記載されている。

「細胞」は、個別の細胞、細胞株又はこの細胞に由来する培養物を指す。「培養物」は、同じ又は異なる種類の単離された細胞を含む組成物を指す。「培養物」、「集団」又は「細胞集団」は、本明細書で使用する場合、同義に使用することができ、その意味は文脈に応じて明らかになる。例えば、「集団」という用語は、同じ識別特徴を有する１つ以上の細胞の細胞培養物であり得、又は異なる識別特徴を有する１つ以上の細胞種の培養物であり得る。「亜集団」という用語は、細胞培養物又は細胞集団内で特定の細胞種を記述するために使用するとき、細胞培養物又は集団のサブセットを指す。

「細胞系」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞種が最も初期の前駆細胞から完全に成熟した細胞（特定化された細胞）に生育するステージの全てを指す。例えば、「胚体内胚葉系細胞」、「ＰＤＸ１陰性内胚葉系細胞」、「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉系細胞」、「内分泌前駆体系細胞」、「内分泌系細胞」又は「未成熟ベータ系細胞」等は、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞等から派生又は分化した細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、その前駆体の１つである中内胚葉細胞の系である。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、その前駆体の１つである胚体内胚葉細胞の系である。ＰＤＸ１陽性膵臓細胞、胚体内胚葉細胞及び中内胚葉細胞の系の内分泌前駆体は全てその前駆体である。内分泌前駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓細胞、胚体内胚葉細胞、及び中内胚葉細胞の系の未成熟ベータ細胞は全てその前駆体である。ベータ細胞は、例えば、未成熟ベータ細胞の唯一の系である。本明細書に記載の全ての内胚葉系細胞は、ｈＥＳ系細胞である。

「治療」、「改善」又は「治癒」という用語又はその等価物は、徴候又は症状を改善する治療介入を指す。「改善」は、徴候又は症状の数又は重症度の軽減を指す。

「患者」、「宿主」、「哺乳類動物宿主」、「対象」という用語又はその等価物は、ヒト及び非ヒト哺乳類動物の両方を含むカテゴリーの１つである生きている多細胞脊椎動物を指す。いくつかの実施形態において、対象はヒト対象である。好ましい治療対象の患者はヒト対象である。有孔組合せ製品を移植した患者は、「高リスクのインスリンを必要としている患者」であり、集団の例として、低血糖症に気がつかない、不安定（脆性）Ｔ１Ｄ及び移植患者が挙げられる。標的の患者集団は、有孔組合せ製品それ自体から独立して、臨床使用／経験が経時的に変化し得るが、むしろ免疫抑制レジメンの性質に関係する。例えば、有孔組合せ製品は、運用許容範囲を達成するＩＳＤレジメンを使用して、「全てのＴ１Ｄ集団」に使用され得る。

「有効量」、「治療有効量」という用語又はその等価物は、治療する対象又は細胞に望ましい効果を達成するのに充分な薬の量を指す。例えば、血中グルコースレベルを抑制し、又は測定可能に低下する、及び最終的に恒常的に血糖を制御するのに必要な細胞の量であってもよい。また、細胞又は対象の機能又は構造を変化させる薬の有効量を意味し得る。薬の有効量は単回量又は数回量で投与され得る。しかしながら、有効量は、投与する特定の薬、治療対象、苦痛の重症度及び種類、並びに投与形式に依存する。

「生物付着」、「汚損装置」という用語又はその等価物は、本明細書で使用する場合、生物環境（例えば、限定されないが、皮下環境等を含む宿主環境）を有する埋め込み型成体装置のインターフェースにおけるプロセスを指し、タンパク質が非特異的に装置の物質に吸収されて、次に、マクロファージ及び線維芽細胞等の宿主細胞の装置表面への付着が促されることによって部分的に生じる。このプロセスは、一般的に異物反応として呼ばれる。したがって、本明細書に記載の実施形態は、生物付着耐性表面を含むカプセル化装置である。このような表面は、表面親水性及び電荷、生体分子機能化及び薬物溶出に基づいて作製され、又は使用することができる。装置の生物付着が減少することによって、概して、異物反応を減少させ、細胞生存率、発生、成熟及び機能を回復し、又は維持する。本明細書に記載の実施形態は、装置の表面の生物付着を抑制し、又は減少し、血管新生を促進し、その結果、装置と装置内の細胞を統合するために、不織布の使用を検討する。

本明細書で使用する場合、「低血糖症の減少」は、ＨｂＡ１ｃの０．２％以下の増加によって規定される、血糖コントロールを悪化することなく、低血糖エピソードの数が減少することを指す。

本明細書で使用する場合、「インスリン依存性の減少」は、ＨｂＡ１ｃの０．２％以下の増加によって規定される、血糖コントロールを悪化することなく、外因性インスリン注入の投与回数及び／又は投与量が減少することを指す。

本明細書で使用する場合、「維持」は、有孔組合せ製品の内部で維持されるＰＥＣ細胞の量を意味する。有孔装置は、製剤中の細胞産物、貯蔵寿命、外科移植、成熟及び機能を維持する。

本明細書で使用する場合、「組織カプセル」は、移植片の周囲に形成される異物カプセルを意味する。有孔装置及びその細胞含有量の大部分は、移植期間中にカプセルの内部に維持されることを意図する。装置は、カプセル形成の前に、最初の移植の最中に、管腔の内部に細胞産物を維持する。

「移植」は、前駆体又は未成熟の細胞集団が成熟した細胞種に分化することを指す。例えば、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞集団の移植によって、膵臓内分泌細胞集団に成熟する。

「移植片」は、本明細書に記載の装置にカプセル化され、又は送達される分化した細胞集団を指す。例えば、成熟した膵臓内分泌細胞移植片が挙げられる。

「本質的に」又は「実質的に」という用語は、細胞集団又は培養物に存在するほぼ僅少又は少量の成分又は細胞を意味し、例えば、未成熟のベータ細胞は、「本質的に又は実質的にＩＮＳ、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１を発現する未成熟のベータ細胞であり、本質的又は実質的にＮＧＮ３を発現しない」。他の例として、限定されないが、「本質的又は実質的にｈＥＳ細胞」、「本質的又は実質的に胚体内胚葉細胞」、「本質的又は実質的に前腸内胚葉細胞」、「本質的又は実質的にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「本質的又は実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」、「本質的又は実質的に膵臓内分泌前駆細胞」、「本質的又は実質的に膵臓内分泌細胞」等が挙げられる。

細胞培養物又は細胞集団における細胞について、「実質的に含まない」という用語は、細胞培養物又は細胞集団を含まない特定の細胞種が、細胞培養物又は細胞集団に存在する細胞の総数の少なくとも約１０％未満、少なくとも約９％未満、少なくとも約８％未満、少なくとも約７％未満、少なくとも約６％未満、少なくとも約５％未満、少なくとも約４％未満、少なくとも約３％未満、少なくとも約２％未満、又は少なくとも約１％未満の量で存在する。

「不織布」という用語又はその等価物として、限定されないが、織り又は編み以外のプロセスによって製造された結合した布、形成された布、又は加工された布が挙げられる。

他に断りがない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術の当業者によって多く理解される意味と同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明確に断りがない限り複数も含む。同様に、「又は」という用語は、他に明確に断りがない限り「及び」を含むことを意図する。核酸又はポリペプチドの塩基のサイズ又はアミノ酸のサイズ、及び全分子量又は分子質量値は適切であり、記述のために提供されることがさらに理解される。本明細書に記載の方法及び材料と類似し、又は等価な方法及び材料は、本開示を実行し、又は試験を行うときに使用することができ、適切な方法及び材料を以下に記述する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。齟齬がある場合、用語の説明を含んで本明細書が優先される。さらに、材料、方法及び例は説明のためだけにあり、限定を意図していない。

以下の請求項及び本開示で使用する場合、「本質的に成る」というフレーズは、このフレーズの後に列挙する要素を含むことを意味し、列挙した要素の開示において、特定される作用又は活動を妨害しない又はそれに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的に成る」というフレーズは、列挙した要素が必要であり又は必須であるが、その他の要素は、任意であり、それが列挙した要素の作用又は活動に影響するかどうかによって、存在しても存在しなくてもよい。

細胞送達装置
細胞カプセル化装置、細胞維持装置、細胞封じ込め装置又は生体人工器官とも呼ばれる細胞送達装置は、限定されないが、宿主免疫系を含む宿主の細胞を全体的又は部分的にカプセルに包む筐体を提供する装置である。

細胞は目的の細胞であってもよい。細胞は、同種若しくは異種細胞集団、又は目的の生物学的活性物質を１つ以上生成する細胞であり得る。移植細胞、例えば、膵臓前駆体又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉は、最初に移植したときは、治療的に活性でなくてもよいが、一
度移植されると、さらに発生し、成熟し、治療効果を有する。移植細胞は、懸濁液又は細胞凝集体の個別の細胞であり得る。

例えば、糖尿病又はその１つ以上の症状は、糖尿病をり患している対象への移植に適した細胞を移植した後に、一定期間改善し、又は減少し得る。一実施形態において、細胞送達装置には、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が添加される。一実施形態において、細胞送達装置には、膵臓前駆細胞が添加される。一実施形態において、細胞送達装置には、膵臓内分泌前駆細胞が添加される。一実施形態において、細胞送達装置には、膵臓内分泌細胞が添加される。一実施形態において、細胞送達装置には、成熟したベータ細胞が添加される。

一実施形態において、移植細胞は、全能性細胞を含む。一実施形態において、移植細胞は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を含む。一実施形態において、移植細胞は、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を含む。多能性細胞として、内分泌前駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、又は中内胚葉細胞を含み、膵臓アルファ、ベータ、デルタ及びガンマ膵島細胞のそれぞれが生じ得る。一実施形態において、移植細胞は、単能性細胞を含む。単能性細胞は、例えば、インスリンベータ細胞のみに分化する能力を有し、グルカゴン（アルファ）細胞、ソマトスタチン（デルタ）細胞及び膵臓ポリペプチド（ガンマ）細胞には分化しない未成熟ベータ細胞を含む。一実施形態において、移植細胞は、高分化した細胞を含む。

一実施形態において、移植細胞は、周知の一般に利用可能な不死化細胞株である。本明細書に記載の発明は、ＷｉＣｅｌｌのウェブサイト、ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅｓ／ｏｒｄｅｒ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅｓ／ｏｂｔａｉｎ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅｓ．ｃｍｓｘで市販されている全てのｈＥＳ細胞株、及び少なくともｈＥＳＣ及びｉＰＳＣ、例えば、ＣｙＴ２５、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２１２、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３と有用である。本発明の実施に適した細胞は周知の又は後に作製された多能性細胞である。ＷｉＣｅｌｌは数百ものその他の市販のｈＥＳ幹細胞株を列挙している。当業者は、文献及び一般公開されているデータベース、例えば、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、及びｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）のｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙから、本発明で使用する市販の幹細胞を確認し、購入する方法を知っている。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり、登録されるたびに定期的に更新される。ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙには少なくとも２５４個の市販のｉＰＳＣ株及び１２１１個の市販のｈＥＳＣ株が列挙されている。一実施形態において、多能性移植細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞、誘導性多能性幹細胞（すなわち、「ｉＰＳ細胞」又は「ｉＰＳＣ細胞」）、単為生殖生物細胞、体細胞各輸送等によって生じた胚である。一実施形態において、移植細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞、誘導性多能性幹細胞（すなわち、「ｉＰＳ細胞」又は「ｉＰＳＣ細胞」）、単為生殖生物細胞、体細胞各輸送等によって生じた胚等の多能性細胞に由来する分化細胞である。多能性は、表面マーカー、転写マーカー、核型、及び３つの胚葉の細胞に分化する能力について、細胞を特徴付けることによって、決定することもできる。これらの特徴は当業者に周知である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、多能性の分化及び維持を導く遺伝子の確実に抑制するコア調節複合体を形成するいくつかの転写因子、転写因子Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ－２を含む細胞表面タンパク質、糖脂質ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ケラタン硫酸抗原、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１及びアルカリホスファターゼ等の細胞表
面抗原の存在によって規定又は特徴付けることができる。

当業者は、ヒト胚を使用する必要性がなく、早い時点で行われたヒト胚の破壊的使用を前提とせず、本開示の方法を実施し、本開示の装置を使用することができる。確かに、単為生殖で活性化された卵母細胞からｈＥＳ細胞株を誘導することは、（例えば、国際公開第０３／０４６１４１号に記載、参照により本明細書にその全体が援用される）本発明を実施する方法の１つである。胚を破壊せずに哺乳類動物のＥＳ細胞等の多能性幹細胞を誘導するその他の方法が存在する。端的には、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）は、胚を無傷の状態で、したがって破壊することなく、１つの卵割球からマウス及びヒトＥＳ細胞を誘導する３つの科学ジャーナル記事を公開した。２００５年の終わりに、Ｃｈｕｎｇ等は、１つの卵割球からマウスＥＳ細胞を作製する方法を最初に記載した。Ｃｈｕｎｇ等（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９：２１６－２１９、２００５年１０月１６日にオンライン出版を参照のこと。Ｃｈｕｎｇ等（２００６）は、移植前遺伝子診断（ＰＧＤ）、２１７頁を参照のこと、のために使用した技術と同様の顕微操作を使用して、胚から組織診を取り出したことを記載した。その当時、Ｃｈｕｎｇ等（２００６）は、卵割球細胞株をその他の胚性幹細胞と共培養した。Ｃｈｕｎｇ等（２００８）Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｍｂｒｙｏ
Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１１３－１１７を参照のこと。しかし、２００８年の終わりに、前述のＣｈｕｎｇ等による研究では、ラミニンを有する培地で単離された卵割球を培養するとｈＥＳＣが生じる能力が高まったため、ｈＥＳＣ細胞株はＥＳ細胞との共培養を全く必要としないことを証明した。Ｃｈｕｎｇ等（２００８）， Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２）：１１３－１１７、ｐ．１１６、２００８年１月１０日にオンライン出版を参照のこと。さらに、この方法で得られたｈＥＳが、６か月以上、未分化状態を維持することができるｈＥＳ細胞を含むその他のヒト多能性幹細胞と同じ特徴を有することを証明し、正常な核型並びにＯｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ及びアルカリホスファターゼを含む多能性のマーカーの発現を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで３つの胚性胚葉の誘導体を分化し、形成し、さらにｉｎ ｖｉｖｏのテラトーマを形成することができる。

移植細胞は分化、脱分化及び分化転換細胞を含み得る。追加の実施形態において、移植細胞は、１つのホルモン又はポリホルモン細胞を含み得る。さらなる実施形態において、移植細胞はリプログラム細胞を含む。いくつかの実施形態において、移植細胞は中胚葉細胞を含む。

他の実施形態において、移植細胞は、胚体内胚葉細胞を含む。特定の実施形態において、胚体内胚葉細胞は哺乳類動物細胞であり、好ましい実施形態において、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から選択される１つ以上のマーカーは、胚体内胚葉細胞に発現する。他の実施形態において、ＯＣＴ４、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７及びＨＮＦ４αから選択される１つ以上のマーカーは発現しない、又は胚体内胚葉細胞にかなり発現する。胚体内胚葉細胞集団及びその生成方法は、２００４年１２月２３日に出願された米国特許出願第１１／０２１，６１８号、明細書名「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」にも記載されており、参照によりその全体が援用される。

いくつかの実施形態において、移植細胞は内分泌前駆細胞を含む。他の実施形態におい
て、移植細胞は機能的ベータ細胞を含む。さらなる実施形態において、移植細胞は、限定されないが、ランゲルハンスのヒト膵島、ブタ膵島及びラット膵島を含む。移植細胞は、高分化したアルファ（α）、ベータ（β）、デルタ（δ）及び／又は膵臓ペプチド（ＰＰ）細胞を含む。一態様において、本開示と一致した実施形態は、ランゲルハンス細胞の膵島の移植に使用される。いくつかの実施形態において、移植細胞は、幹細胞、脾臓、膵臓、胆嚢、腎臓及び外分泌機能を有するその他の組織等のその他の細胞種を含む。いくつかの実施形態において、移植細胞は、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、細胞増殖制御因子、又は代謝機能を有するその他の細胞を分泌する神経内分泌細胞、増殖細胞及び細胞株を含む。当業者に明らかなように、これらの細胞及び組織は、哺乳類動物の組織、初代培養細胞、生物産物を産生する培養された細胞株、及び遺伝子操作された培養細胞株から得ることができる。移植細胞は、遺伝子操作して、タンパク質、ペプチド、核酸又はその他の生物活性剤等の望ましい分子を産生することもできる。例として、レシピエントを失っている又は欠損している酵素、又は癌細胞に対する毒素等の治療薬を発現する酵素を発現するように操作された細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態において、移植細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）、ＨＮＦ４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）及びＦＯＸＡ１マーカーを発現する細胞であるが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７又はＳＯＸ１を実質的に発現しないＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む。他の実施形態において、移植細胞は、ＰＤＸ１陽性、背側性偏向、前腸内胚葉細胞を含む。

実施形態において、移植細胞は、動物由来の産物を含まない培地に存在する。別の実施形態において、移植細胞は、異物を含まない培地に存在する。移植細胞は、増殖因子を補充した培地に存在することができる。「補助増殖因子」という用語は、最も広義の意味で使用され、多能性細胞の成長を促し、細胞生存を維持し、細胞分化を刺激し、及び／又は細胞分化の逆転を刺激するのに効果的な物質を指す。このような物質として、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、小分子、中和抗体及びタンパク質が挙げられる。増殖因子として、細胞の発生と維持、並びに組織の形態と機能を制御する細胞内シグナル伝達ポリペプチドも挙げられる。好ましい実施形態において、補助増殖因子は、ｓｔｅｅｌ細胞因子（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、可溶性インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）と組み合わせたインターロイキン－６（ＩＬ－６）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される。

一実施形態において、移植細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ等、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ
Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」（２００６年１１月１日）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２－１４０１、参照によりその全体が本明細書に援用される、に記載の細胞と実質的に同様である。Ｄ′Ａｍｏｕｒ等は、５つのステップの分化プロトコル：ステージ１（多くは胚体内胚葉を産生）、ステージ２（多くはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を産生）、ステージ３（多くはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を再生）、ステージ４（多くは多能性膵臓前駆細胞又は膵臓内分泌前駆細胞とも呼ばれる膵臓内胚葉を産生）、及びステージ５（多くは、ホルモン発現内分泌細胞を産生）を記載している。

一実施形態において、移植細胞は、Ｓｃｈｕｌｚ等、Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：５ １－１７（２０１２）、参照によりその全体
が本明細書に援用される、に記載の細胞と実質的に同様である。Ｓｃｈｕｌｚ等は、ｈＥＳＣの増殖、バンク方法及び懸濁液ベースの分化システムを記載している。特に、未分化の多能性細胞を動的回転懸濁液培養物のクラスターに凝集し、次に４ステージのプロトコルで、２週間、まとめて分化した。端的には、ｈＥＳＣ単層をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でｈＥＳ細胞凝集体懸濁液から分離し、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｌｕｔａｍａｘ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ補助剤、ＢＳＡ、及び１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを組み合わせた；ＦＧＦ－２及び２－メルカプトエタノールを除いた）に、１×１０^６細胞／ｍＬで回収し、再懸濁する。１つの細胞懸濁液を非ＴＣ処理６ウェルプレート（５．５ｍＬ／ウェル）に分注し、Ｉｎｎｏｖａ ２０００ローテータ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で９５ｒｐｍで回転し、５００ｍＬのＮａｌｇｅｎｅフィルターレシーバー貯蔵容器（１５０ｍＬ／容器）に分注し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｅｒｔｏｍａｔ ＲＭ－５０ローテータ（５ｃｍの回転軸で構成）で６５ｒｐｍで回転した。細胞を３７℃／８％ＣＯ２インキュベーターで一晩回転し、約１００～２００μｍの凝集体を形成した。１００～２００μｍの凝集体の直径について、６ウェルの皿の回転速度は６０～１４０ｒｐｍ、５００ｍＬの容器の回転速度は５～２０ｒｐｍにして使用することができる。懸濁液凝集体の分化は、Ｄ’Ａｍｏｕｒからいくつか修正した。ステージ２の最中にＴＧＦ－βＲＩキナーゼ阻害剤ＩＶを含み、ステージ３の最中に、レチノイン酸をより安定したレチノイド類似体、ＴＴＮＰＢ（３ｎＭ）に交換した。増殖因子ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）をステージ４に加えて、細胞質量を保持した。ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）もステージ４で加えた。

一実施形態において、移植細胞は、Ａｇｕｌｎｉｃｋ等、Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１－９（２０１５）、参照によりその全体が本明細書に援用される、に記載の細胞と実質的に同様である。Ａｇｕｌｎｉｃｋ等は、膵臓前駆細胞を作製し、細胞集団の７３％～８０％がＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）及びＮＫＸ６．１＋膵臓前駆体から構成されるように、修正したプロトコルを記載している。膵臓前駆細胞は、７３％～８９％の内分泌細胞を再現性よく含み、その約４０％～５０％がインスリンを発現する膵島様細胞（ＩＣ）にさらに分化した。これらのインスリン陽性細胞の大きい画分は、１つのホルモン陽性であり、転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現した。我々は、膵臓前駆細胞を作製し、細胞集団の７３％～８０％がＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）及びＮＫＸ６．１＋ＰＰから構成されるように、プロトコルを修正した。ＰＰは、７３％～８９％の内分泌細胞を再現性よく含み、その約４０％～５０％がインスリンを発現する膵島様細胞（ＩＣ）にさらに分化した。これらのインスリン陽性細胞の大きい画分は、１つのホルモン陽性であり、転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現した。Ａｇｕｌｎｉｃｋ等は、追加的に、ステージ３（５～７日）でアクチビンＡ、Ｗｎｔ３Ａ及びヘレグリンβ１で処理し、ステージ４（７～１３日）でアクチビンＡとヘレグリンβ１で処理することによってＳｃｈｕｌｚ等、２０１２のプロトコルを修正したプロトコルを記載している。

多能性幹細胞に由来する様々な細胞組成物が本明細書に記載され、以下の米国特許出願に見つけることができる。米国特許出願第第１０／４８６，４０８号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＨＥＳＣ ＯＮ ＦＥＥＤＥＲ ＣＥＬＬＳ」、２００２年８月６日出願；第１１／０２１，６１８号、明細書名「ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２００４年１２月２３日出願；第１１／１１５，８６８号、明細書名「ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２００５年４月２６
日出願；第１１／１６５，３０５号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２００５年６月２３日出願；第１１／５７３，６６２号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＷＩＴＨ ＰＩ－３ ＫＩＮＡＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ」、２００５年８月１５日出願；第１２／７２９， ０８４号、明細書名「ＰＤＸ１－ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＲＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」２００５年１０月２７日出願；第１２／０９３，５９０号、明細書名「ＭＡＲＫＥＲＳ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２００５年１１月１４日出願；第１１／９９３，３９９号、明細書名「ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」２００６年６月２０日出願；第１１／５８８，６９３号、明細書名「ＰＤＸ１－ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＲＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ」２００６年１０月２７日出願；第１１／６８１，６８７号、明細書名「ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ， ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ－ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ」２００７年３月２日出願；第１１／８０７，２２３号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＳＩＮＧＬＥ ＣＥＬＬ ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＨＥＳＣ」２００７年５月２４日出願；第１１／７７３，９４４号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」２００７年７月５日出願；第１１／８６０，４９４号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ」２００７年９月２４日出願；第１２／０９９，７５９号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」２００８年４月８日出願；第１２／１０７，０２０号、明細書名「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＯＲＭ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願；第１２／６１８，６５９号、明細書名「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＬＩＮＥＡＧＥ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ」２００９年１１月１３日出願；第１２／７６５，７１４号及び第１３／７６１，０７８号、両出願とも明細書名「ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＲＯＭ ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ ＣＥＬＬＳ」２０１０年４月２２日出願、及び２０１３年２月６日出願；第１１／８３８，０５４号、明細書名「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＵＳＥＦＵＬ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ ＣＥＬＬＳ」、２００７年８月１３日出願；第１２／２６４，７６０号、明細書名「ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＥＯＦ」２００８年１１月４日出願；第１３／２５９，１５号、明細書名「ＳＭＡＬＬ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＳＵＰＰＯＲＴＩＮＧ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＣＥＬＬ ＧＲＯＷＴＨ」、２０１０年４月２７日出願；ＰＣＴ／ＵＳ１１／２５６２８号、明細書名「ＬＯＡＤＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ
ＦＯＲ ＡＮ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥ」、２０１１年２月２１日出願；第１３／９９２，９３１号、明細書名「ＡＧＥＮＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ、２０１０年１２月２８日出願；米国意匠特許出願第２９／４０８，３６６号、２０１１年１２月１２日出願；第２９／４０８，３６８号、２０１１年１２月１２日出願；第２９／４２３，３６５号、２０１２年５月３１日出願；及び第２９／４４７，９４４号、２０１３年
３月１３日出願；米国特許出願第１４／２０１，６３０号、明細書名「３－ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ ＬＡＲＧＥ ＣＡＰＡＣＩＴＹ ＣＥＬＬ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥ ＡＳＳＥＭＢＬＹ」２０１４年３月７日出願；及び米国特許出願第１４／１０６，３３０号、明細書名「ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＯ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ（ＰＥＣ） ＡＮＤ ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＣＥＬＬＳ」２０１３年１２月１３日出願、参照によりその全体が本明細書に援用される。

多能性幹細胞に由来する様々な細胞組成物が本明細書に記載され、排他的権利を有する以下の特許出願に見つけることができる。米国特許出願第２００９／０２６９８４５号、明細書名「Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ」、２００８年４月２４日出願；米国特許出願第２０１１／００１４７０３号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」２０１０年７月２０日出願；米国特許出願第２０１１／００１４７０２号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」２０１０年７月１９日出願；米国特許出願第２０１１／０１５１５６１号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」２０１０年１２月１６日出願；米国特許出願第２０１０／０１１２６９２号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」、２００９年１０月２２日出願；米国特許出願第２０１２／００５２５７６号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２０１１年８月１７日出願；米国特許出願第２０１０／０１１２６９３号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」２００９年１０月２３日出願；米国特許出願第２０１１／０１５１５６０号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、２０１０年１２月１６日出願；米国特許出願第２０１０／００１５１００号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、２００８年７月３１日出願；米国特許出願第２００９／０１７０１９８号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、２００８年１１月２５日出願；米国特許出願第２０１５／０３２９８２８号、明細書名「Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｍａｆａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ」、２０１５年５月７日出願；米国特許出願第２０１３／０３３０８２３号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ」、２０１３年６月６日出願；国際特許出願第ＷＯ ２０１３／１９２００５号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ」２０１３年６月１３日出願；米国特許出願第２０１４／０２４２６９３号、明細書名「Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ」、２０１３年１２月３０日出願；米国特許出願第米国特許出願第２０１４／０２９５５５２号、明細書名「Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ」、２０１４年６月１７日出願；国際特許出願第ＷＯ ２０１５／０６５５２４号、明細書名「Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｅ ｃｅｌｌｓ」、２０１４年５月２１日出願；米国特許出願第２０１３／０３３０８２３号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ」２０１３年６月６日出願；米国特許出願第２０１４／０１８６９５３号、明細書名「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｏ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＢ９ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ」２０１３年１２月１８日出願；米国特許出願第１４／９６３７３０号、２０１５年１２月９日出願；米国特許出願第１４／８９８，０１５号、２０１５年１２月１１日出願、参照によりその全体が本明細書に援用される。

一実施形態において、移植細胞は、生体適合性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してカプセル化される。ＰＥＧベースのカプセル化については以下の特許出願に記載されている。米国特許出願第７，４２７，４１５号、明細書名「ＩＭＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＤＩＳＥＡＳＥＳ」；米国特許出願第６，９１１，２２７号、明細書名「ＧＥＬＳ ＦＯＲ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ」；米国特許出願第６，９１１，２２７号、第５，５２９，９１４号、第５，８０１，０３３号、第６，２５８，８７０号、明細書名「ＧＥＬＳ ＦＯＲ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ」、参照によりその全体が本明細書に援用される。

別の実施形態において、送達装置はＴｈｅｒａＣｙｔｅ（以前はＢａｘｔｅｒ）ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆ．）である。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ細胞送達装置は、米国特許出願第６，７７３，４５８号；第６，１５６，３０５号；第６，０６０，６４０号；第５，９６４，８０４号；第５，９６４，２６１号；第５，８８２，３５４号；第５，８０７，４０６号；第５，８００，５２９号；第５，７８２，９１２号；第５，７４１，３３０号；第５，７３３，３３６号；第５，７１３，８８８号；第５，６５３，７５６号；第５，５９３，４４０号；第５，５６９，４６２号；第５，５４９，６７５号；第５，５４５，２２３；号第５，４５３，２７８号；第５，４２１，９２３号；第５，３４４，４５４号；第５，３１４，４７１号；第５，３２４，５１８号；第５，２１９，３６１号；第５，１００，３９２号；及び第５，０１１，４９４号、参照によりその全体が本明細書に援用される。

別の実施形態において、送達装置は、米国特許出願第８，２７８，１０６号、米国特許出願第１４／２０１，６３０号、２０１４年３月７日出願、米国意匠特許出願第 ２９／４４７，９４４号、第２９／５０９，１０２号、第２９／４８４，３６３号、第２９／４８４，３６０号、第２９／４８４，３５９号、第２９／４８４，３５７号、第２９／４８４，３５６号、第２９／４８４，３５５号、第２９／４８４，３６２号、第２９／４８４，３５８号、第２９／４０８，３６６号、第２９／５１７，３１９号、第２９／４０８，３６８号、第２９／５１８，５１３号、第２９／５１８，５１６号、第２９／４０８，３７０号、第２９／５１７，１４４号、第２９／４２３，３６５号、第２９／５３０，３２５号に実質的に記載され、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書に記載の細胞送達装置の実施形態は、移植細胞が血中グルコースに応答してインスリンを生成することができる限り、特定のサイズ、形状、デザイン、容積容量及び／又は細胞送達装置を作製するために使用される材料に限定されることを意図していない。

細胞送達装置のコア（細胞チャンバー又は管腔とも呼ばれる）の移植片又は細胞は、ハイドロゲル又は細胞外マトリックス成分等の固定マトリックスに固定され得る。さらに、
細胞送達装置のコアは、挿入部を含んで、コアの中心に「無細胞」領域を作製することができ、装置の中心で細胞の壊死性コアが発生する可能性がさらに減少する。

細胞送達装置は、生物学的活性を維持し、産物又は機能を送達するためのアクセスを提供するのに適した構造を有し、例えば、円柱状、長方形、ディスク形状、パッチ形状、卵形、星状、又は球状を含む。さらに細胞送達装置は、メッシュ様又は入れ子構造に巻きつき、管状、又は包むことができる。細胞送達装置が、移植後にいつか回収される場合、（球状の装置は、レシーバーの血管を移動するには小さすぎるというように）細胞送達装置が移植部位から移動することを招く傾向にある構造は避けるべきである。本発明の実施形態は、高い構造統合性を提供し、宿主から容易に回収される形状を含む。このような形状として、長方形パッチ、ディスク、円柱、及び平坦なシートが挙げられる。

その他の実施形態において、細胞送達装置又は大容量の組立体は、細胞送達装置の管腔をさらに分ける１つ又は２つ以上のシール、すなわち、パーティションシールから構成される。例えば、米国意匠特許出願第２９／４０８３６６号、２９／４０８３６８号、２９／４０８３７０号及び２９／４２３，３６５号を参照のこと。

細胞送達装置は、皮下に移植され得るが、腹腔内又は腹腔壁、筋肉内部位、腹部脂肪パッド、又は別の適切な場所等のその他の位置に移植され得る。あるいは、開示の細胞送達装置は、網又はその他の適切な部位を含む宿主の身体の管腔に部分的に移植され、皮下環境に延在し得る。一実施形態において、細胞は、装置の残りが腹腔内環境にありながら、皮下環境に延在する装置の部分に添加され得る。別の実施形態において、細胞送達装置は、脳、脊髄領域又は移植細胞から治療効果を引き出すのに必要とされるその他の臓器に移植されてもよい。多くの例では、宿主はヒトであるが、別の哺乳類動物又は非哺乳類動物であってもよい。

拡張装置：一実施形態において、細胞送達装置又は拡張可能な大容量の組立体を提供する。

詰め替え用装置：移植された細胞送達装置の内部で細胞を交換することは、細胞送達装置から細胞を取り除き、次に治療薬又は細胞をリザーバー、チャンバー、管腔、容器又は移植された細胞送達装置のコンパートメントに、例えば、皮下に直接注入することによって達成することができる。細胞／治療薬の注入は、ポートに挿入されたシリンジを使用して達成することができる。

あるいは、別の実施形態において、本明細書で提供する装置又は組立体は、入口又は出口のポートを含まず、装置は、いわゆるポートレスであり、細胞は、移植部位に移植される前に、送達装置に添加される。

マルチチャンバーモジュラー装置
一実施形態において、移植細胞は、大容量組立体又は大容量装置とも呼ばれるマクロ細胞カプセル化装置／送達装置に送達される。本明細書で使用する場合、「大容量組立体」又は「大容量装置」は、多数又は複数の細胞チャンバーから構成される細胞カプセル封入装置を指す。一実施形態において、大容量組立体は、少なくとも１、２、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の細胞チャンバーから構成される。別の実施形態において、大容量組立体は、大容量組立体がいくつかの細胞チャンバー（又はモジュラーユニット）から構成されるように作製される。例えば、モジュラーユニットは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の細胞チャンバーから構成され得、米国特許出願第８，２７８，１０６号、参照によりその全体が本明細書に援用される、に記載の疾患の治療に必要とされる細胞の数又は用量に依存し得る。送達装置のチャンバーの数は、移植される細胞の
容量及び／又は数に基づいて決定される。

３次元大容量装置：一実施形態において、無細胞領域によって相互接続される複数又は多数の細胞チャンバーを含む細胞送達装置又は大容量組立体が提供され、例えば、２０１４年３月７日に出願された米国特許出願第１４／２０１，６３０号に記載のように折りたたまれ、曲げられる。一実施形態において、大容量組立体は、少なくとも２つの細胞チャンバー並びに折りたたまれた、折りたたまれていない少なくとも２つの構成を含み、折りたたまれた構成は、折りたたまれていない構成より小さいフットプリントを有する。したがって、本明細書で使用する場合、「細胞カプセル化装置」又は「細胞送達装置」という用語は、１つの細胞チャンバーから成る１つの装置、又は米国特許出願第８，２７８，１０６号及び２０１４年３月７日に出願された米国特許出願第１４／２０１，６３０号、参照によりその全体が本明細書に援用される、に記載の３次元装置又は装置組立体における大容量装置又は複数の細胞チャンバーのように、複数の細胞チャンバーから成る１つの装置を意味することができる。したがって、細胞送達装置、大容量組立体及び３次元装置は同義に使用することができる。

様々な細胞送達装置の構成
細胞送達装置は、それぞれが１つ又は複数の機能を提供する様々な層を含む。いくつかの実施形態において、細胞送達装置は、細胞除外膜と不織布の両方を含む。

細胞除外膜：この層は、Ｔ細胞等の免疫系の細胞成分が装置に入ってくるのを抑制する。この層は、治療細胞が装置から出ていくのを防ぐ役割もある。この層は、目的のカプセルに包まれた生物活性物質（インスリン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド等）が通過するのを可能にし、細胞送達装置の外側及び患者の体内で活性物質を標的細胞に対して使用可能にする。この層は、理想的に宿主に自然に存在する栄養が膜を通過して、必須栄養素がカプセルに包まれた細胞に提供される。細胞除外膜は、米国特許出願第６，７７３，４５８号；６，５２０，９９７号；６，１５６，３０５号；６，０６０，６４０号；５，９６４，８０４号；５，９６４，２６１号；５，８８２，３５４号；５，８０７，４０６号；５，８００，５２９号；５，７８２，９１２号；５，７４１，３３０号；５，７３３，３３６号；５，７１３，８８８号；５，６５３，７５６号；５，５９３，４４０号；５，５６９，４６２号；５，５４９，６７５号；５，５４５，２２３号；５，４５３，２７８号；５，４２１，９２３号；５，３４４，４５４号；５，３１４，４７１号；５，３２４，５１８号；５，２１９，３６１号；５，１００，３９２号；及び５，０１１，４９４号、参照によりその全体が本明細書に援用される、を含むＢａｘｔｅｒによって前述した特許を含む技術に記載されている。いくつかの実施形態において、この層は穿孔している。

膜：いくつかの実施形態において、細胞送達装置は、膜層、膜リング又は膜溶接部を含む。膜は、少なくとも２つ以上の層を一緒に接着し、又は結合することを助ける溶接部にのみ存在する結合又は接着層である。いくつかの実施形態において、膜は、不織布（以下参照）の内面（チャンバー面）にのみ存在して、固定するのを抑制する外面（宿主面）にある場合はその膜が形成する平滑面を取り除く。いくつかの実施形態において、膜は、細胞除外膜の内面（チャンバー面）に存在する。膜はチャンバーの一部ではなく、溶接部に置かれる。

メッシュ：織りメッシュは、それぞれの装置に構造的剛性を提供し、保護性外骨格として提供することによって、細胞除外膜を保護する。いくつかの実施形態において、不織メッシュは、装置の構成に含まれない。装置の設計から織りメッシュを含まないことから生じる剛性の欠如に対処するために、装置の外側に不織布及び／又は不織布のリングの二重層を使用することができる。

不織布：移植後に宿主にうまく統合される細胞カプセル化装置を提供する。このために、装置－宿主インターフェースにおいて、生物付着を減少させる（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）こと、抑制すること、減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）ことは装置の統合に欠かせない。一実施形態において、不織布を使用して、構造的統合性を提供するとともに、血管新生を増加させ、生物付着を減少又は抑制することができるかどうかを調査する。一実施形態において、不織布は、細胞除外膜が織りメッシュに直接接触することを防ぎ、宿主に固定する装置又は装置の統合のために追加の材料を提供する。織りの堅固さ及びシートの厚みを変えた多くの種類の不織布がある。一実施形態において、フィラメント断面は三葉である。不織布は、結合した布、形成された布、又は加工された布であり得、織り又は編み以外の工程によって製造される。いくつかの実施形態において、織布、シート又はバットに作製されたステープル繊維等の繊維から主に又は全体的に構成された通常は平坦なシート形状の多孔性テキスタイル様材料である。不織布の構造は、例えば、一般的に多かれ少なかれランダムに配置されたステープル繊維の配列に基づいている。

不織布は、テキスタイル業界で周知の様々な技術によって作製することができる。様々な方法によって、カード処理、湿式、メルトブローン、スパンボンド又はエアレイド不織布が作製され得る。例示的な方法及び基質は、米国特許出願第２０１０／０１５１５７５号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。一実施形態において、不織布はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）である。一実施形態において、不織布は、スパンボンドポリエステルである。

不織布の密度は、加工条件に応じて変化し得る。一実施形態において、不織布は、基本重量が約０．４０～約１．００（ｏｚ／ｙｄ^２）、公称厚みが約１２７～約２２８μｍ、繊維径が約０．５～約２６μｍであるスパンボンドポリエステルである。一実施形態において、フィラメント断面は三葉である。いくつかの実施形態において、不織布は生体適合性及び／又は生体吸収性である。

歴史的に、細胞送達装置は、治療用細胞の封じ込めのための細胞除外膜、溶接のための膜、及び／又は織りメッシュ（ＥＮ－Ａ構成）を含む単純な構成を有する。

図１Ａ～Ｄは、細胞送達装置の特定の実施形態の分解図である。図にはＥＮ２０が図示され、無孔形態で、成熟時に移植細胞の約２０μｌを支持する能力を有する薬物送達装置の省略表現である。図１Ａ～Ｄに示すように、装置は、追加の様々な層のメッシュ、膜（ｆｉｌｍ）、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）及び不織布を有することができる。それぞれの構造が材料の堆積として作製され、密封された「サンドイッチ」のように製造されている。

以下の表１は細胞送達装置の構成を記載している。装置のそれぞれの壁は、層によって必要とされ、付与される機能に応じて、同一の数の層及び材料の種類、又は異なる数及び種類の層から構成され得る。装置のチャンバー又は筐体は、周辺を溶接し、又は結合することで作製され、チャンバーの追加は、ポートチュービングによって達成される。表１の第１列及び下列は、移植時に宿主に曝される又は接触すると思われる層である。

例えば、図１Ａ：装置（ＥＮ２０Ｂ１）は、不織布リング５１、膜リング５２、不織布の２つの層が細胞除外膜（５３）に対して熱積層のように積層する膜層を有し、不織布層は、宿主に対して外側を向いており、細胞除外膜層は、周辺又は溶接部において、チャンバー又は移植細胞、及び膜リング（５４）に対して内側を向いている。このパターンはその他の装置壁について繰り返される。装置の反対側は、不織布リング５８、膜リング５７、不織布の２つの層は、細胞除外膜（５６）に対して熱積層のように積層する膜層を有し、不織布層は、宿主に対して外側を向いており、細胞除外膜層は、チャンバー又は移植細胞に対して内側を向いている。前述のように、周辺又は溶接部に膜リング（５５）がある。すなわち、チャンバーの２つの側又は壁は、互いに鏡像イメージであり、間に細胞を添加するためのポート（８５）が、治療薬が存在する管腔（８６）を形成する。図１Ａを参照のこと。この実施形態において、メッシュ層は含まれない。いくつかの実施形態において、不織布リングより、（図１Ａ、１Ｂ、５１及び５９と比較すると）送達装置の全表面が不織布に覆われている。

図１Ｂは、不織布層（５９）、膜リング（６０）、メッシュ層（６１）、不織布層が、周辺及び溶接部で、膜（６２）及び膜リング（６３）に対して熱積層のように積層される細胞除外膜層を有する送達装置（ＥＮ２０Ｂ２）を示す一実施形態である。チャンバーの２つの側面又は壁は、互いに鏡像イメージであり、間に細胞を添加するためのポート（８５）が、治療薬が存在する管腔（８６）を形成する。したがって、装置の反対側は、不織布層（６８）、膜リング（６７）、メッシュ層（６６）、不織布層が、周辺及び溶接部で、膜（６５）及び膜リング（６４）に対して熱積層のように積層される細胞除外膜層を含む。図１Ａと同様に、チャンバーの２つの側は互いに鏡像イメージである。

図１Ｃは、メッシュ層（６９）、膜リング（７０）、不織布層が、周辺及び溶接部で、膜（７１）及び膜リング（７２）に対して熱積層のように積層される細胞除外膜層を有する送達装置（ＥＮ２０Ｂ３）を示す一実施形態である。したがって、別のメッシュ層（７６）、膜リング（７５）、不織布が膜（７４）及び膜リング（７３）に対して熱積層のように積層される細胞除外膜層が示される。チャンバーの２つの側面又は壁は、互いに鏡像イメージであり、間に細胞を添加するためのポート（８５）が、治療薬が存在する管腔（
８６）を形成する。図１Ａ～Ｂと同様に、チャンバーの２つの側は互いに鏡像イメージである。

図１Ｄは、ＥＮ２０Ｂ３と同じ構造を有する送達装置（ＥＮ２０Ｂ４）を示す一実施形態であるが、不織布層（７９及び８２）は、ＥＮ２０Ｂ３の不織布層の密度と異なる密度を有する。メッシュ層（７１及び８４）、膜リング（７８、８０、８１及び８３）は、図１Ｃに示されるそれぞれの要素と類似している。

一実施形態において、不織布及び細胞除外膜は、熱積層又は熱プレス（例えば、Ｐｌａｓｔｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＡＲＢ Ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）を使用して、積層することができる。プレスは、約３０５～３２０°Ｆまで加熱される。０～６ＰＳＩの圧力が、３フィート／分又は１０フィート／分の速度で不織布及び膜に加えられる。しかしながら、不織布及び細胞除外膜は積層する必要はない。

一実施形態において、不織布層は、宿主に対して外側を向いており、細胞除外膜層は、チャンバー又は移植細胞に対して内側を向いているが、当業者は、例えば、不織布層がチャンバー又は移植細胞に対して内側を向いており、細胞除外膜層が宿主に対して外側を向いているといった本開示を使用して、異なる構造を想像することができる。いくつかの実施形態において、ポリエステル不織布は、細胞除外膜の外側にあり、膜に積層されている。

いくつかの実施形態において、細胞除外膜及び／又は不織布は、一緒に積層され、穿孔される。いくつかの実施形態において、細胞除外膜は、最初に穿孔され、不織布に積層される。いくつかの実施形態において、不織布が穿孔され、細胞除外膜に積層される。細胞除外膜が穿孔される場合、哺乳類動物宿主は、免疫無防備状態であるか、免疫抑制薬で治療される。

図１Ａ～Ｄに示す細胞送達装置に使用される不織布は、実質的に平坦であるが、さらに操作されて厚みを提供し得る。例えば、不織布は、プリーツされ、輪郭付けられ、又は打ち出されてもよい。さらに、パイルを有する布、メリヤス、カーペットの製造のようにタフティングを使用して、パイル及びその他の３次元構造を有する布を作製してもよい。例えば、米国特許第７，７５４，９３７号を参照のこと、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書で考えられている装置は、多くの異なる構成、及び治療薬を保持する異なる容量を有し得る。ＥＮＣＡＰＴＲＡ ＥＮ２０又はＥＮ２０装置又は小さい送達装置は、約２０μｌの機能容積を有する装置を指し、マウスの１ｋｇあたり約２，５００～３，５００ＩＥＱ又は８０，０００ＩＥＱ超のベータ細胞の質量を含み得る。ＥＮＣＡＰＴＲＡ ＥＮ２５０、ＥＮ２５０若しくはＥＮ２５０装置又は大きい送達装置は、約２５０μＬの機能容積を有し、ＥＮ２０装置より約１２．５倍（１２．５Ｘ）大きく、マウスの１ｋｇあたり最大約３０，０００～４５，０００ＩＥＱを含み得る。ＥＮＣＡＰＴＲＡ ＥＮ１００、ＥＮ１００又はＥＮ１００装置は、約１００μＬの機能容積を有し、ＥＮ２０装置より約６．５倍（６．５Ｘ）大きく、マウスの１ｋｇあたり最大約１６，２５０～２２，７５０ＩＥＱを含み得る。ＥＮ大容量又はＥＮ－ＬＣ装置は、ＥＮ２０より約４８．４倍（４８．４Ｘ）大きい。４つの細胞チャンバーを含むＥＮ－ＬＣ装置は、最大約１２１，０００～１６９，４００ＩＥＱを含み得る。したがって、患者に治療有効量を送達するために、充分なＰＥＣ量を送達するのに、少なくとも約４、約５、約６、約７、約８機のＥＮ２５０装置又は約２機のＥＮ－ＬＣ装置が必要である。

投与能力を高めるために装置のサイズを大きくする他に、装置を穿孔することも投与能
力を高める。有孔ＥＮ２０装置は、無孔ＥＮ２０装置より（成熟時に達成されるベータ細胞の質量を意味する）約５倍の投与能力を有する。記載の有孔装置の別の投与方法は、インタクトな装置の約５分の１である。

有孔細胞送達装置
移植後に短期間に血管新生を促進するために、宿主の脈管構造とカプセルに包まれた細胞の直接的な細胞間接触を提供する有孔細胞送達装置に細胞を移植する。いくつかの実施形態において、装置の層が全て穿孔されているわけではない。例えば、有孔細胞送達装置は、１つの層、例えば細胞除外膜、又は細胞除外膜及び不織布層に穿孔を提供する。これは、移植細胞／組織を保持し、同時に脈管構造及びマクロファージ等の進入といった宿主との交換を可能にする。

穿孔をレーザー穴あけ加工することによって、穿孔のサイズ、数及び位置を選択することができる。宿主の維管束組織（毛細血管等）及び膵臓細胞種を支持する間質細胞が装置の管腔に入ることができる充分な大きさである。一実施形態において、穿孔の大きさは、宿主マクロファージ及びその他の貪食細胞が装置に入り、有孔装置の管腔から壊死性残屑を取り除くこともできるように定められる。一実施形態において、有孔の大きさは、移植片によって産生されるインスリン等の治療薬が、細胞送達装置から出ることができるようにも定められる。血管構造が装置の管腔で成長することができる穿孔は、装置を宿主に固定し、装置の移動を抑制することを助ける。一実施形態において、有孔の大きさは細胞保持を最大にする細胞凝集体の直径に基づいても定められる。

いくつかの実施形態において、装置は、宿主に移植し、宿主に免疫学的に適合性又は非適合性であり得る治療薬を実質的に含むように適合した生体適合性材料から作製される細胞筐体を含み、チャンバーは、細胞除外膜及び任意にメッシュ層及び膜溶接部を有し、壁は、細胞除外膜を通過する孔を有し、孔は宿主の毛細血管が壁の厚みを通過することができる充分な大きさの最も狭い点に内径を有し、孔の数は、宿主の毛細血管がそこに含まれ得る治療薬の生存能を支持するのに充分である。

一実施形態において、送達装置の１つ以上の層が穿孔している有孔送達装置を提供する。一実施形態において、送達装置の１つ以上の層が穿孔していない有孔送達装置を提供する。一実施形態において、細胞除外膜だけが穿孔される。一実施形態において、装置のそれぞれの壁を通過しない孔を含む細胞送達装置を提供する。一実施形態において、細胞送達装置の穿孔は、装置のそれぞれの壁を通過しないが、細胞送達装置の管腔内面に宿主の脈管構造がまだ成長する孔から構成される。一実施形態において、不織布を含まない細胞送達装置を開示する。一実施形態において、不織布を含まないが、細胞除外膜が穿孔される細胞送達装置を開示する。このような実施形態において、細胞除外膜の孔の直径は、細胞を維持するために使用され、すなわち装置の孔は、そこに含まれる細胞凝集体より小さい。

一実施形態において、有孔送達装置の細胞は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１ ｃｏ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ膵臓前駆細胞から構成される。一実施形態において、有孔送達装置の細胞は、インスリン（ＩＮＳ）及びＮＫＸ６．１を発現する未成熟のベータ細胞又はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１及びＭＡＦＢを発現する未成熟のベータ細胞から構成される。一実施形態において、有孔送達装置の細胞は、ＩＮＳとＭＡＦＡ、又はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１とＭＡＦＡを発現する成熟したベータ細胞から構成される。一実施形態において、有孔送達装置の細胞は、膵臓内分泌細胞から構成される。一実施形態において、有孔送達装置の細胞は、膵臓インスリン分泌細胞から構成される。一実施形態において、有孔送達装置の細胞は、血中グルコースレベルに応答して、インスリンを分泌することができる膵臓ベータ又はインスリン細胞から構成される。

不織布によって囲まれた有孔装置
これらの実施形態において、不織布は、細胞送達装置の外側にある。移植細胞に影響するというよりも、不織布は、細胞筐体を取り囲む宿主血管新生を高める。

一実施形態において、不織布を含む細胞送達装置を開示する。一実施形態において、ポリエステル不織布（ＮＷＰＦ）を含む細胞送達装置を開示する。ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタン、ポリアミドは、使用することができるポリエステル不織布のいくつかの例である。一実施形態において、細胞除外膜は、不織布で取り囲まれ（又は被覆されている）、すなわち、不織布は細胞除外膜に対して外側である。別の方法として、不織布は、移植細胞ではなく宿主に面している。一実施形態において、不織布は、細胞除外膜の周りにジャケットを形成する。一実施形態において、細胞除外膜だけが穿孔され、不織布を含む装置の外層は穿孔されていない。一実施形態において、細胞除外膜及び不織布は穿孔されており、装置のその他の層は穿孔されていない。

一実施形態において、孔は装置に含まれるｈＰＳＣ由来凝集体等の細胞凝集体、例えば、そこに含まれる胚体内胚葉系細胞凝集体より小さい。一実施形態において、孔は、そこに含まれるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞凝集体より小さい。一実施形態において、孔は、そこに含まれる膵臓前駆細胞凝集体より小さい。一実施形態において、孔は、そこに含まれる内分泌細胞凝集体より小さい。一実施形態において、孔は、そこに含まれる成熟したベータ細胞凝集体より小さい。

一実施形態において、孔の直径は、細胞を保持するのに充分小さいが、治療効果が確実に達成されるほど充分に大きい。例えば、糖尿病患者の場合、孔の直径は、移植細胞が血中グルコースレベルに応答してインスリンを成熟させ、及び／又は産生する能力によって決定される。

一実施形態において、有孔細胞送達装置は、ラット又はヒトに移植される。一実施形態において、ラット又はヒトに移植される有孔細胞送達装置は、細胞除外膜及びポリエステル不織布に孔を含み（装置のその他の層は穿孔されていない）、孔は、（孔の中心から中心を測定して）約２ｍｍ以上の離れており、孔の直径は、１００ミクロン未満である。一実施形態において、ラット又はヒトに移植される有孔細胞送達装置は、細胞除外膜及びポリエステル不織布に孔を含み（装置のその他の層は穿孔されていない）、孔は、約２ｍｍ以上離れている。一実施形態において、ラット又はヒトに移植される有孔細胞送達装置は、細胞除外膜及びポリエステル不織布に孔を含み（装置のその他の層は穿孔されていない）、孔の直径は、約１００ミクロン未満である。

一実施形態において、ラット又はヒトに移植される有孔細胞送達装置は、細胞除外膜に孔を含み（装置のその他の層は穿孔されていない）、孔は、約２ｍｍ以上の離れており、孔の直径は、約１００ミクロン未満である。

一実施形態において、細胞送達装置は、有孔の細胞除外膜及びＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含み、ヒト患者に移植することができ、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞はｉｎ ｖｉｖｏでインスリン産生細胞に成熟する。一実施形態において、細胞送達装置は、有孔の細胞除外膜、有孔のＮＷＦ層及びＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含み、細胞送達装置は、ヒト患者に移植することができ、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞はｉｎ ｖｉｖｏでインスリン産生細胞に成熟する。

積層された装置
一実施形態において、細胞除外膜は不織布に積層される。一実施形態において、細胞除
外膜はＮＷＦに積層される。細胞除外膜が不織布に積層される場合、細胞除外膜は平坦なままである。積層しない場合、細胞除外膜は、不均一な細胞分布になり得るダムを作製する平面から変形する可能性がある。不均一な細胞分布は、壊死領域を誘導し、細胞死等が有効性を低下し得る。細胞送達装置のチャンバー又は管腔の内部の細胞分布を制御することは、細胞送達装置内の細胞の空間的位置としても示される。一実施形態において、細胞送達装置内の細胞分布（細胞の位置）を制御する方法は、細胞除外膜を不織布に積層することを含む。一実施形態において、細胞送達装置内の細胞分布（細胞の位置）を制御する方法は、細胞除外膜をＮＷＦに積層することを含む。

細胞を細胞送達装置の管腔の内部に均一に分布することを達成することによって、移植する必要のある細胞が少なくなる。少ない数の細胞を使用することで、細胞の残骸が少なくなる。細胞が均一に分布され、膜により近く接触するため、栄養物を細胞に拡散増大するという別の利益がある。栄養物の細胞への拡散増大は、細胞生存率の改善につながる。

装置に積層した膜が組み込まれるにつれて、管腔を完全に満たすことができ、移植細胞の治療有効性が最大になる。積層した膜を組み込んでいる装置でより長く大きい管腔を満たすことができる。

有孔積層装置
穿孔は、穴、孔、開口（ｏｐｅｎｉｎｇ）、穿刺、開口部（ａｐｅｒｔｕｒｅ）又はチャンネルとも呼ばれる。

前述の装置は非限定的な開示であり、本明細書に記載の実施形態を踏まえたその他の装置は、本開示により体現される。本開示は、前述の装置の組み合わせを考慮している。例えば、一実施形態において、細胞除外膜及び不織布は、一緒に積層され、穿孔される。一実施形態において、有孔細胞除外膜及び無孔ＮＷＦ不織布は一緒に積層される。

治療用細胞を添加した有孔装置の潜在的な治療価値は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の集団に大きな価値を有し、慢性免疫抑制薬の副作用は、許容され、又は免疫抑制薬は、すでに以前の臓器移植（例えば腎移植）によって必要とされている。重要なこととして、多能性幹細胞に由来する治療用細胞は、死亡した臓器ドナーの使用に関係する限界を克服し、その限界とは主に、（１）要望に適した死体からの膵島の供給が非常に限定され、（２）提供された臓器に関する患者のリスク（例えば、移植前に提供された組織を検査する能力が限定されたドナー由来の病原）である。さらに、送達装置及び投与の皮下移植経路は、現在の臨床の膵島移植を上回るいくつかの利点を提供し、利点として、移植部位の非侵襲的モニタリング及び撮像能力、移植片及び外植片／生検の手術の容易性、及び門脈血栓症事象の排除が挙げられる。確かに、膵島移植領域は、門脈内移植部位の代わりを長い間求めてきた。Ｃａｎｔａｒｅｌｌｉ等、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｇｒａｆｔｓ Ｃｕｒｒ Ｄｉａｂ Ｒｅｐ．２０１１ Ｏｃｔ；１１（５）：３６４－７４を参照のこと。

望ましい装置の穿孔幾何形状を決定するために、孔の直径、量及び分布を特徴化した。図２Ａ～Ｄはそれぞれ、特定の孔の密度を有する装置を記述する実施形態である。図に示される孔の形状及びサイズは均一であるが、ｉ）孔のサイズ又は形状は均一である必要はない、ｉｉ）装置の両側の孔は、装置を組み立てたときに整列している（規則正しい列にある）必要はない、ｉｉｉ）各装置の孔の数又は密度は、僅少であってもよく、直接的な宿主と移植片の細胞間接触及び血管新生を促進する、ｉｖ）孔の直径はそこにカプセルに包まれた細胞又は組織、例えば、細胞クラスター又は凝集体のサイズに依存するが、カプセルに包まれた細胞は穿孔を通じて装置から漏れるとは限らず、むしろ装置の外側の移植細胞に比べて、装置の内側により多くの宿主由来細胞が存在する、並びにｖ）細胞除外膜
及び不織布の孔は、装置を組み立てたときに整列している必要はなく、装置のチャンバーの外側から内側まで不規則な経路を形成していてもよい。さらに装置が卵形のように示されるが、装置の形状は、円形、長方形、正方形、三角形の何れの形状であってもよい。

一実施形態において、穿孔は、円形又は卵形又は楕円形である。穿孔は、長方形、６角形、多角形又はスリット等のその他の形状を有してもよいことに留意するべきである。一実施形態において、穿孔は、均一な形状を有する。一実施形態において、穿孔は、均一な形状を有しない。一実施形態において、穿孔は、細胞除外膜に均一に分布される。一実施形態において、穿孔は、細胞除外膜の上で様々な間隔で存在し、例えば、装置の中央又は装置の端でクラスター形成され得る。一実施形態において、複数の穿孔は、一連の行と列で離れており、グリッド配列、同心円、その他の幾何学的構成又は構成の組み合わせを形成する。一実施形態において、複数の穿孔はランダムに分布される。一実施形態において、穿孔は、それぞれの細胞除外膜に存在するのでなく、装置の一方の側だけに存在する。

一実施形態において、細胞送達装置は、細胞除外膜だけが穿孔される層を含む。一実施形態において、細胞送達装置は、膜リング、メッシュ及び細胞除外膜を含み、細胞除外膜だけが穿孔される。一実施形態において、細胞送達装置は、膜リング、メッシュ、不織布及び細胞除外膜を含み、細胞除外膜及び不織布層だけが穿孔される。一実施形態において、細胞送達装置は、不織布及び細胞除外層を含み、細胞除外膜と不織布層のみが穿孔される。一実施形態において、細胞送達装置は、細胞除外膜の外側に不織布を含み、細胞除外膜及び不織布層だけが穿孔される。一実施形態において、細胞送達装置は、互いに積層された不織布及び細胞除外層を含み、細胞除外膜と不織布層のみが穿孔される。一実施形態において、細胞送達装置は、細胞除外層の外側に不織布を含み、細胞除外膜に積層され、細胞除外膜及び不織布層のみが穿孔される。

一実施形態において、細胞送達装置は、細胞除外膜及び不織布層のみが穿孔される層を含み、孔はレーザーで作製される。

穿孔の直径
有孔細胞送達装置の使用は、細胞が逃げる、細胞がより少なくなる、腫瘍形成能等の特定の欠点を有する。穿孔の開口部は、したがって、細胞除外膜がカプセルに包まれた要素を保持することができ、同時に、有孔装置の管腔及び膵臓細胞種を支持する間質細胞から壊死性残屑を除去することができる脈管構造、マクロファージ及びその他の貪食細胞の進入といった宿主との交換を可能にする。一実施形態において、穿孔は、毛細血管の内殖を可能にする直径約１００μＭ未満である。出願人は、以前に、四分位の直径１００～２００μｍで平均直径約１８０μｍの膵臓前駆細胞凝集体について（Ｓｃｈｕｌｚ等（２０１２）前述）、孔直径が約１００μｍ以下であると細胞産物を実質的に保持し、前述のその他の利益を達成し、したがって、細胞の送達と回収、並びに毛細血管の内殖の両方を容易にすることを開示した。細胞は宿主組織、例えば宿主血管に暴露されるが、サイズがより大きいと、細胞が逃げるリスクが僅かになる。一実施形態において、孔は、宿主の毛細血管が内殖し、放出することができ、治療薬から生成されるホルモンが装置の管腔／チャンバーから出ていくことができる程度の大きさの内径を有する。

孔サイズ（直径）は、細胞機能に応じて変化し得る。例えば、完全な細胞の封じ込めが必要でない場合、孔の直径と密度に対する制限は緩い。特定の装置の孔は、同じ直径を有してもよく、その装置の異なる部品の異なる直径を有してもよい。例えば、カプセルに包まれた細胞、細胞凝集体、オルガノイド、クラスター、塊、及び組織の多くが装置の中心に大方配置される傾向にある場合、少なく及び／又は小さい孔を有し得る装置の近位端及び遠位端に比べて、より多くの孔が装置の領域における細胞生存に必要となり得る。このように、宿主－移植片の細胞間血管新生が、移植後に短期間で確立される限り、穿孔のサ
イズ、密度及び分布には多くの柔軟性がある。再度、図２Ａ及び２Ｂは、有孔装置の実施形態を示す。図２Ｂは、細胞プーリングの領域を少なくする二重管腔及び二重ポートを示す。

他の実施形態において、膵臓前駆細胞凝集体は、装置の孔の平均直径より大きい。一実施形態において、細胞送達装置は、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１５０ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約６０ミクロン未満、又は約５０ミクロン未満の直径の孔で穿孔される。一実施形態において、細胞送達装置は、約３００～５０ミクロン、約２００～５０ミクロン、約２００～７５ミクロン又は約７０～８０μｍの直径の孔で穿孔される。一実施形態において、孔径は約２００ミクロンより大きい。一実施形態において、孔径は約２００～４００ミクロンである。

一実施形態において、穿孔は、約４０～１５０μｍの直径を有する。一実施形態において、穿孔は、均一な形状を有する。一実施形態において、穿孔は、均一な形状を有しない。

穿孔の密度
一実施形態において、装置の表面領域の０．４％未満が穿孔され、孔は、（孔の中心間を測定して）約２ｍｍ間隔で離れているが、２ｍｍ未満であっても２ｍｍより大きく離れていてもよく、宿主－移植片細胞間血管新生を促進する。いくつかの実施形態において、装置の表面領域の約５．０％未満、約４．０％未満、約３．０％未満、約２．０％未満、約１．０％未満、約０．８％未満、約０．３％未満、約０．２％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満が穿孔される。いくつかの実施形態において、装置の表面領域の約５．０～０．５％、約５．０～３．５％、約４．０～２．０％が穿孔される。

一実施形態において、細胞除外膜を高い透過性の膜に置き換えることで穿孔を避ける。例えば、膜に８０～１２０ミクロンの孔から成る膜では、このような孔は本明細書に記載の孔と類似した密度で作製される。

実施例１は、穿孔が比較的に少なく、細胞生存率を向上しながら、直接的な宿主の血管新生の望ましい利益を提供することを示す。移植後１２及び３４週のグルコース促進インシュリン（ＧＳＩＳ）試験（実施例１に記載）では、直径約１００μｍ、（孔の中心間を測定して）互いに約１、１．５又は２ｍｍ離れている孔が胸腺欠損のヌードマウスにおいて機能的移植片を生成することを示す。確かに、２ｍｍ離れた最も低密度の孔であっても、直接的な血管新生及び堅調なＣペプチドレベルを示した。臨床的安全性の観点から、孔が少ないほどリスクが減少し、細胞送達装置から逃げる細胞があったとしても、有孔装置の最も低密度の孔（２ｍｍ間隔）が好ましい。

一実施形態において、細胞送達装置は、（孔の中心間を測定して）約０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ以上離れた孔を有する有孔細胞除外膜を含む。一実施形態において、細胞送達装置は、約０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ以上離れた孔を有する有孔細胞除外膜及び有孔ＮＷＦ層を含む。一実施形態において、細胞送達装置は、約０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ以上離れた孔を有する有孔ＮＷＦ層に積層された有孔細胞除外膜及び有孔ＮＷＦ層を含む。一実施形態において、約０．５ｍｍ～４ｍｍ、約０．５ｍｍ～２ｍｍ、又は約１．０ｍｍ～２ｍｍ離れた孔又は穿孔から成る細胞送達装置を提供する。

孔の数／密度は、装置につき、５～２００個又は２０～１００個であってもよく、装置のサイズ（管腔表面領域）に部分的に依存する。確かに、孔の数／密度は、装置の管腔につき、２０～５０～１００個であってもよい。確かに、孔の数／密度は、装置の管腔につ
き、５～２００個、２０～１００個であってもよい。当業者は、望ましい効果を達成する孔の数／密度を決定することができる。糖尿病患者の場合、孔の数／密度は、移植細胞が血中グルコースレベルに応答してインスリンを成熟させ、及び／又は産生する能力によって決定される。

一実施形態において、孔が約０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ以上離れている孔又は穿孔を含む細胞送達装置が提供され、孔径は約２００ミクロン未満、約１５０ミクロン未満、約１００ミクロン未満、又は約７５ミクロン未満である。一実施形態において、孔が約２ｍｍ以上離れており、孔径が約２００ミクロン未満である穿孔を含む細胞送達装置を提供する。一実施形態において、孔が約２ｍｍ以上離れており、孔径が（孔の中心間を測定して）約１００ミクロン未満である孔又は穿孔を含む細胞送達装置を提供する。

有孔細胞送達装置の製造者
技術分野で周知の製造方法を使用して、本開示の有孔装置を製造することができる。歴史的には、装置を組み立て、細胞を添加し、その後、針を使用してインタクトな装置に手動で穿孔を加えた。このように、装置の全ての層が穿孔していた。米国特許出願第１２／６１８，６５９号及びＰＣＴ出願第ＷＯ／１９９３／００２６３５号を参照のこと。さらに、穿孔を作製したときに細胞は装置の内側にあるために、カプセルに包まれた細胞のいくらかは穿孔するときに針の通路に存在し、針がカプセルに包まれた細胞のいくらかを傷つける可能性があった。この方法は、針が挿入されて、孔を作り、その後取り除かれるため、偶発的な汚染（装置から離れる細胞）が生じる可能性もある。

本明細書の実施形態は、レーザーを使用して、孔のサイズ及び分布を制御し、装置の各層を穿孔せず、細胞が添加された後に装置を穿孔しない。このように、穿孔を形成することによって、細胞を傷つける、又は破壊することがなく、潜在的な汚染が減少し、細胞除外膜（又は細胞除外膜及び不織布層）が穿孔され、その他の層が移植時に送達装置のカプセルに包まれた細胞を保持することを助けることができる。

有孔細胞送達装置は、前臨床齧歯動物モデル（通常２０μＬの容量）及び臨床試験のためのより大きな装置（ＥＮ２５０）といった多くのサイズ構成で構築することができる。有孔及び無孔細胞送達装置は同一の材料、製造技術及び厚みを使用する。

針の代わりにレーザーを使用することによって、細胞除外膜のみが穿孔される有孔細胞送達装置の製造を開示する。いくつかの実施形態において、不織布が細胞除外膜に積層し、この２つの層のみが穿孔される。一実施形態において、装置層の孔の製造は自動化されている。

一実施形態において、穿孔は、円形又は卵形又は楕円形である。穿孔は、長方形、６角形、多角形又はスリット等のその他の形状を有してもよいことに留意するべきである。一実施形態において、穿孔は、均一な形状を有する。一実施形態において、穿孔は、均一な形状を有しない。一実施形態において、穿孔は、細胞除外膜に均一に分布される。一実施形態において、穿孔は、細胞除外膜の上で様々な間隔で存在し、例えば、装置の中央又は装置の端にクラスター形成され得る。一実施形態において、複数の穿孔は、一連の行と列で離れており、グリッド配列、同心円、その他の幾何学的構成又は構成の組み合わせを形成する。一実施形態において、複数の穿孔はランダムに分布される。一実施形態において、穿孔は、それぞれの細胞除外膜に存在するのでなく、装置の一方の側だけに存在する。

一実施形態において、装置には複数の異なる細胞集団がある。一実施形態において、装置には複数のチャンバーがあり、チャンバーのそれぞれが、無細胞領域又は島によって分
かれており、チャンバーのそれぞれが穿孔される。一実施形態において、装置にはチャンバーには複数のチャンバーがあり、チャンバーのそれぞれが無細胞領域によって分かれており、全てのチャンバーが穿孔されているわけではない。一実施形態において、膵臓前駆体が１つのチャンバーにカプセル化され、異なる治療薬が別のチャンバーにカプセル化される。この例では、膵臓前駆体を含むチャンバーのみが穿孔されている。

改善された投与プロファイル
膵臓内胚葉系細胞を送達するための有孔装置を使用する１つの利点は、細胞の増殖能力が増加することである。孔によって、生存率を改善する宿主脈管構造と細胞間接触が可能になる。孔によって、装置チャンバーを拡張することができ、有孔装置の内部により多くの細胞が入る余地ができる。細胞増殖能力の増加によって、細胞質量が増加し、細胞質量の増加が細胞容量の増加に相関する。出願人は、適切な細胞容量が同じサイズの装置（例えば、ＥＮ２０、ＥＮ１００、ＥＮ２５０等）に添加されると、有孔装置の最終細胞容量（移植後約１２～１６週で細胞は成熟する）がインタクト又は無孔装置よりかなり多いことを示した。実際には、最終（成熟した）細胞容量は、無孔又はインタクトな装置に比べて、有孔装置において約５～６倍多い。これは、それ以外の同サイズの細胞送達装置の投与能力を改善する。

膵島移植術において、膵島の数又は容量は、膵島等価物又はＩＥＱとして示されることが多い。１ＩＥＱは、１５０μｍの直径の膵島と同等であると考えられる。健康なヒトは約１００万ＩＥＱを有し、Ｔ１Ｄと診断された患者は、約８０％の膵島細胞を失っていた。治療薬で、完全に膵島の質量／機能を回復させる必要はない。膵島の質量／機能の約２０％、すなわち約２００，０００ＩＥＱを回復することは、Ｔ１Ｄ患者の機能的治癒になる。Ｇｉｌｌａｒｄ等、Ｍｉｎｉｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ β－ｃｅｌｌ ｍａｓｓ ｉｎ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｔｈａｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｇｌｙｃｅｍｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ２０１３（１１）３４８３－８は、機能性β細胞移植片を有するレシピエントが、正常なコントロール対象の１８％（四分位範囲１０～３３％）に対応する平均の機能性β細胞質量を示すことを示す。

出願人は、Ｋｒｏｏｎ等（２００８）、前述に以前記載された移植された成熟したＰＥＣ移植片によって放出されるＣペプチドに基づいてＩＥＱを計算しようとした。出願人は、装置に生成されるＣペプチドが相対ＩＥＱ数に相関するリニアスケールがあることを示した。図３を参照のこと。このグラフを生成するために、出願人は、特定の一定分量の死体の膵島を購入した。６つの異なる膵島調製物をすりつぶし、各試料からＣペプチドの合計を測定した。各膵島試料のＣペプチドの測定値をグラフにし、Ｃペプチドレベル対ヒト膵島等価物の量に直線関係があることを示した。図３を参照のこと。以下の式は、Ｃペプチドレベル（ピコモル）とヒト膵島数（ＩＥＱ）の直線関係を規定する。
Ｃペプチド＝０．３８８９ｘ＋２４５．５３
この式は、０．９８５２の定量Ｒ^２の補正を有する。定量のＲ^２係数は、回帰直線がどの程度実データポイントに近似するかを示す統計的測定値である。Ｒ^２が１であることは、回帰直線がデータに完全に一致することを示す。したがって、式に示されるＣペプチドとＩＥＱの相関は、強力な又は高い信頼水準を有する。

一実施形態において、ＩＥＱの数は、膵島ＩＥＱに対するＣペプチドレベルの直線関係によって外挿され、又は推定することができ、ＩＥＱの数は、治療用細胞を含む有孔又は無孔装置のいずれか１つで達成される細胞量の相対的測定値である。したがって、例えば、２０００ピコモルのＣペプチドは、約４５００ＩＥＱであり、又は以下のヒト膵島である。
２０００＝０．３８８９ｘ＋２４５．５３→（２０００－２４５．５３）／０．３８８９
＝ｘ→ｘ＝４５１１．３６ＩＥＱ

一実施形態において、有孔細胞送達装置は、完全（無孔）細胞送達装置に比べて少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍以上の投与能力を改善する。例えば、有孔ＥＮ２０装置又は小さい送達装置は、約２０μｌの名目上の充填容量を有し、ラットの１ｋｇあたり約７，０００～４７，０００ＩＥＱ（約２３，０００の平均）又は２５０，０００ＩＥＱ超のベータ細胞の質量を有する。名目上の充填容量３００μｌを有するより大きい送達装置は、最大７００，０００ＩＥＱのベータ細胞質量を含み得る。したがって、患者に治療有効量を送達するために、充分なＰＥＣ量を送達するのに、１又は２機の大きい有孔装置が必要であると推定される。

一実施形態において、有孔細胞送達装置による移植後の哺乳類動物のＣペプチド産生は、約１５週、約１６週、約１７週、約１８週、約１９週、約２０週、約２１週、約２２週、約２３週、約２４週、約２５週、約２６週、約２７週、約２８週、約２９週、約３０週、約３１週、約３２週、約３３週、約３４週、約３５週までは定常ではない。

一実施形態において、有孔細胞送達装置による移植後の哺乳類動物のＣペプチド産生は、移植後約３０週、移植後約３１週、移植後約３２週、移植後約３３週、移植後約３４週、移植後約３５週、移植後約３６週、移植後約３７週、移植後約３８週、移植後約３９週、移植後約４０週に定常になる。一実施形態において、有孔細胞送達装置による移植後の哺乳類動物のＣペプチド産生は、移植後約３０～４０週で定常になる。一実施形態において、有孔細胞送達装置による移植後の哺乳類動物のＣペプチド産生は、移植後約３５～４５週、移植後約３０～４５週で定常になる。

有孔細胞送達装置は、装置の管腔に一種の保護ニッチを提供して、移植後すぐに厳しい皮下の宿主環境となるものから移植細胞を遮蔽し得ると仮定される。確かに、出願人が有孔装置と細胞カプセル化が全く存在しないもの（すなわち精巣上体脂肪パッド下で移植された装置なし／「裸細胞」）を比較したときに、裸細胞より有孔装置のほうが、細胞機能が改善した（データ示さず）。したがって、細胞のより直接的な宿主－移植片細胞間接触（直接的血管新生）だけがｉｎ ｖｉｖｏの細胞機能の改善に対する解決策ではなく、裸細胞が有孔装置の細胞を上回る改善された機能を有することが予想される。出願人の米国特許第１２／６１８，６５９号、前述を参照のこと。

送達装置は、病態の是正において、組織又は細胞置換に使用することができる。現在、最も実施されていることが、病態を是正するために、門脈循環に注入することによる細胞小器官又は遊離細胞の同種移植であり、細胞を肝臓に留まらせることができる。本発明は、容易に接近することができる代わりの移植部位の使用を可能にし、その内容物を有する送達装置は必要であれば除去することができる。送達装置によって、宿主が移植組織に充分な栄養補助を提供して、病態を是正することができる。したがって、送達装置は、ヒト組織の同種移植に使用することができる。

送達装置は、また、遺伝子改変された患者自身の細胞を移植して、治療用産物を生成するために使用することができる。細胞が形質転換して、遺伝子を発現し、治療用産物を分泌すると、その細胞にとって取り外し可能な容器が望ましい。本発明の送達装置は、ハイブリッドバイオ人工臓器を構築するためにも使用することができる。送達装置は、詳細な脈管構造を有するバイオ人工臓器を供給して、栄養が臓器に送達され、代謝老廃物を除去し、臓器によって作製された治療用産物を宿主に送達することができる。

生物学的免疫保護戦略の追加の開発業務は、将来的に、慢性免疫抑制の必要性を無くすことができる。Ｒｏｎｇ、Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｅ
ｖｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１４ １４（１）：１２１－１３０を参照のこと、参照によりその全体が本明細書に援用される。

他に断りがない限り、無孔装置又はインタクトな装置は、穿孔（孔）を有しない装置を意味する。

組合せ製品
本明細書に記載の実施形態は、組合せ製品を開示し、細胞又は治療薬を添加した装置を示し、それぞれ単独で候補となる医療装置又は細胞産物になり得るが、一緒に組合せ製品を作製する。一実施形態において、組合せ製品は細胞が添加される有孔装置を指す。これは「有孔組合せ製品」と呼ばれる。装置（有孔又は無孔）は、限定されないが、ＥＮ２０、ＥＮ１００、ＥＮ２５０又はＥＮ大容量を含む本明細書に記載のマクロ細胞送達装置であり得る。組合せ製品は、装置のサイズを特定し得、例えば、ＶＣ－０１－２０は細胞が添加されたＥＮ２０を意味する。（有孔又は無孔）装置に添加される細胞は、限定されないが、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、膵臓内胚葉、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する膵臓内胚葉細胞、内分泌前駆体、ＮＫＸ６．１及びＩＮＳを発現する内分泌前駆体、未成熟ベータ細胞、ＮＫＸ６．１、ＩＮＳ及びＭＡＦＢを発現する未成熟ベータ細胞、成熟内分泌細胞、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ及びＰＰを発現する成熟内分泌細胞、成熟ベータ細胞、並びにＩＮＳ及びＭＡＦＡを発現する成熟ベータ細胞であってもよい。

ｉｎ ｖｉｖｏで移植されると、成熟する膵臓内胚葉細胞（「有孔組合せ製品」）を添加した有孔送達装置は、インスリン依存性を減少させ、及び／又は低血糖症に気がつかない、不安定（脆性）であり、又は臓器移植を受けたことがあり、免疫抑制治療に耐性がある可能性がある、又はすでに治療中のハイリスクＩ型糖尿病患者の低血糖症を減少させることを意図する。活動の主要方法は、ヒト膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）又は膵臓前駆細胞を介し、宿主の直接的な血管新生を容易にする透過性、耐久性のある埋め込み型医療装置に含まれる。ＰＥＣ細胞は、移植後、治療用グルコース応答性インスリン放出細胞に分化し、成熟する。このように、有孔組合せ製品はヒトインスリンの分泌を補助する。有孔組合せ製品は、ｉｎ ｖｉｖｏのＰＥＣ細胞の分布（放出）を制限する。有孔組合せ製品は、装置内の治療用細胞の集団を維持し、インスリン及びその他の膵臓産物の血流への分布を容易にする充分な血管移植を可能にする場所に移植される。有孔組合せ製品は、通常の手術器具で移植又は外植し、２年間以上治療的用量を提供することを意図する。装置は、製剤中の充分な用量のＰＥＣ細胞産物、貯蔵寿命、臨床的効果を達成する操作及び手術移植を維持し、細胞産物は、安全要件を満たすように、確実に組織カプセルの内部に配置される。

有孔組合せ製品は、ＰＥＣの用量を含む有孔装置（ＰＤ）、ヒト膵臓前駆細胞治療産物から構成される。患者に移植後、有孔組合せ製品は、装置の統合及び移植された細胞産物の直接的な血管新生によって、インスリンを必要とする患者の治療のために、ＰＥＣ細胞をグルコース応答性、インスリン産生細胞の分化及び成熟を可能にするように設計される。

有孔装置（ＰＤ）は、共に結合される堆積した材料層から構成されて、細胞含有管腔を形成する耐久性、生体適合性、取り外しが容易な移植装置として規定される。装置は、長期間の移植を意図した生体適合性及び生体安定材料から構成される。半透性膜は、移植後直ぐに栄養物の管腔への拡散を可能にし、同時に、膜の穿孔によって、装置の管腔及び直接的には移植細胞に対する宿主の血管の成長を可能にし、インスリンを含む移植した細胞産物の血流への灌流及び放出を改善する。

ＰＤは、宿主血管の侵入又は内殖を可能にする大きさの穿孔を含み、その他の宿主細胞は、免疫細胞を含み、免疫抑制薬の使用を必要とする装置の細胞を含む管腔に移動する。

有孔組合せ製品は、５年間、移植されることが予想されるが、少なくとも２年間の用途を満たす必要がある。ＰＤの設計意図は、カプセル形成の期間に移植細胞の初期生存及び分化／成熟の所定の保護された空間を提供し、移植期間全体にわたって大部分の細胞を保持することである。装置の部品は生体適合性でなければならない。治療的投与を潜在的に達成する充分な用量を有する装置、及び中間時点（センチネル）で組織診断を介して移植及び宿主組織応答を評価するために、容易な移植及び外植に適したより小さいユニットの２つの装置構成が臨床試験のために開発されている。充分な細胞量を維持して、有効性を提供する有孔装置の能力を損なうことなく、充分な量の宿主血管が移植細胞に直接的に内殖されることを可能にするような装置の穿孔のサイズ及び数が選択されるべきである。さらに、有孔装置は、確実に、産物を外植する間に周囲の宿主組織のカプセルを含む充分な量の移植細胞が身体から取り除かれ、安全要件を満たすようにする。

ＰＤ及び有孔組合せ製品の設計は、インタクトな（孔のない）細胞送達装置の類似性に関係する追加の利益を有する。その利益として、以下が挙げられる。

ＰＤは同じ材料、類似の製造工程、米国特許出願第８２７８１０６号、及び米国特許出願第１４／２０１，６３０に以前に開示されたインタクトな細胞カプセル化装置のために確立された包括的な生体適合性試験を支援する。

インタクトな装置と有孔装置は、同様の形状寸法及び操作特徴を提供するため、移植と外植の両方の手術方法が両者で同じになることを意図する。要約すると、有孔組合せ製品は、細胞産物の送達について、インタクトな細胞カプセル化装置と共に、既存の製造工程及び臨床経験を支援するように設計される。

以下のパラグラフでは、他の実施形態を記載する。

不織布を含む細胞送達装置。

細胞除外膜をさらに含み、不織布は細胞除外膜の外側にあるパラグラフ２４に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜及び細胞除外膜の外側にある不織布を含み、細胞除外膜のみが穿孔される細胞送達装置。

宿主の血管が細胞送達装置の管腔に直接的に接触するパラグラフ２６に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜及び細胞除外膜の外側にある不織布を含み、不織布のみが穿孔される細胞送達装置。

宿主の血管が細胞送達装置の外表面に直接的に接触するパラグラフ２８に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜、細胞除外膜の外側にある不織布、及びメッシュ層、膜溶接部のいずれか若しくはその両方を含み、不織布及び細胞除外膜が穿孔される細胞送達装置。

宿主の血管が細胞送達装置の管腔に直接的に接触するパラグラフ３０に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜及び細胞除外膜の外側にある不織布を含み、不織布及び細胞除外膜のみが穿孔される細胞送達装置。

宿主の血管が細胞送達装置の外表面に直接的に接触するパラグラフ３２に記載の細胞送達装置。

宿主の血管が細胞送達装置全体に形成し、細胞送達装置に添加される治療薬と直接的に接触するパラグラフ３２に記載の細胞送達装置。

不織布が細胞除外膜に積層されるパラグラフ３２に記載の細胞送達装置。

細胞送達装置が少なくとも１つの免疫抑制薬で治療を受ける哺乳類動物宿主に移植されるパラグラフ３２に記載の細胞送達装置。

免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害剤、代謝拮抗薬免疫抑制薬及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ３６に記載の細胞送達装置。

免疫抑制薬が、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、タクロリムス（ＴＡＣ）及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ３７に記載の細胞送達装置。

免疫抑制薬で治療を受ける宿主に移植される有孔不織布を含む細胞送達装置。

免疫抑制薬で治療を受ける宿主に移植される細胞除外膜の外側に不織布を含む細胞送達装置。

不織布が穿孔されるパラグラフ３９又は４０に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜が穿孔されるパラグラフ４１に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜及び不織布が穿孔されるパラグラフ４２に記載の細胞送達装置。

免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害剤、代謝拮抗薬免疫抑制薬及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ３９又は４０に記載の細胞送達装置。

免疫抑制薬が、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、タクロリムス（ＴＡＣ）及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ４４に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、不織布が細胞除外膜に積層されるパラグラフ３９又は４０に記載の細胞送達装置。

哺乳類動物にｉｎ ｖｉｖｏに移植される細胞の生存率を促進する方法であって、ａ）細胞を有孔細胞送達装置に添加し、ｂ）細胞を含む有孔装置を哺乳類動物宿主に移植し、それによって移植細胞の細胞生存率を促進することを含む方法。

細胞が膵臓内胚葉細胞であるパラグラフ４７に記載の方法。

哺乳類動物はマウスではないパラグラフ４７に記載の方法。

哺乳類動物はヒト又はラットであるパラグラフ４７に記載の方法。

哺乳類動物の血中グルコースを低下させる方法であって、１）細胞を細胞送達装置に添加し、装置は、有孔細胞除外膜及び細胞除外膜に対して外側にある有孔不織布を含み、その他の穿孔された層を含まず、ｂ）細胞送達装置を哺乳類動物宿主に移植し、ｃ）移植細胞を成熟させ、それによって哺乳類動物の血中グルコースを低下させる方法。

細胞除外膜及び細胞除外膜の外側にある不織布を含み、不織布が細胞除外膜に積層される細胞送達装置。

不織布及び細胞除外膜が穿孔されるパラグラフ５２に記載の細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、細胞除外膜だけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受ける哺乳類動物に移植されず、細胞除外膜だけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療ラット又はヒトに移植され、細胞除外膜だけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受けない哺乳類動物に移植され、細胞除外膜だけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受けないラット又はヒトに移植され、細胞除外膜だけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜及びＮＷＦを含み、細胞除外膜とＮＷＦだけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜及びＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受ける哺乳類動物に移植され、細胞除外膜及びＮＷＦだけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜及びＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受けるラット又はヒトに移植され、細胞除外膜及びＮＷＦだけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜及びＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受けない哺乳類動物に移植され、細胞除外膜とＮＷＦだけが穿孔される細胞送達装置。

細胞除外膜及びＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受けないラット又はヒトに移植され、細胞除外膜とＮＷＦだけが穿孔される細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まない細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受ける哺乳類動物に移植される細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受けるラット又はヒトに移植される細胞送達装置。

細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受けない哺乳類動物に移植される細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜を含み、ＮＷＦを含まず、ＩＳＤで治療を受けないラット又はヒトに移植される細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜及びインタクトなＮＷＦを含む細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜及びインタクトなＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受ける哺乳類動物に移植される細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜及びインタクトなＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受けるラット又はヒトに移植される細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜及びインタクトなＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受けない哺乳類動物に移植される細胞送達装置。

インタクトな細胞除外膜及びインタクトなＮＷＦを含み、ＩＳＤで治療を受けないラット又はヒトに移植される細胞送達装置。

免疫抑制
免疫抑制化合物で宿主を治療しながら、成熟した膵島を移植することは以前から開示されている。米国特許出願第９，０６２，２９０号を参照のこと、参照によりその全体が本明細書に援用される。しかし、カルシニューリン阻害剤は、（１）糖尿病誘発性であり（糖尿病を発症する）（Ｃｒｕｔｃｈｌｏｗ ＭＦ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ：ａ ｎｅｗ ｌｏｏｋ ａｔ ａｎ ｏｌｄ ｐｒｏｂｌｅｍ Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２（２）：３４３－５５（２００７））でレビューされた）、（２）マウスの内在性膵臓細胞の再生に負に影響する（Ｈｅｉｔ Ｊ、Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ＮＦＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｎａｔｕｒｅ ２１；４４３（７１０９）：３４５－９（２００６）ａｎｄ Ｎｉｒ Ｔ， Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ
ｂｙ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ
１１７（９）：２５５３－６１（２００７）を参照のこと）ことが報告された。このように、未成熟な膵臓前駆体がカルシニューリン阻害剤の存在下でｉｎ ｖｉｖｏに成熟するかどうかについて、仮に成熟する場合、宿主が免疫抑制薬で治療を受けている場合、成熟した移植片が生存し、機能することができるかどうかについては知られておらず、予測することができなかった。

膵島移植片による１型糖尿病の治療であっても、長期間にわたって、多くの患者を外因性インスリン注射から解放するのに効果的ではなかった。１つの問題として、同種移植片拒絶を抑制するのに必要とされる免疫抑制試薬が移植した膵島細胞の機能を著しく損なう可能性があることであった。Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ Ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ（１９９７）、ＮＩＨ
Ｇｕｉｄｅ ２６（３８）を参照のこと。

本明細書に記載の実施形態は、細胞を含む移植された有孔装置に関し、宿主は免疫抑制薬による治療を受ける。一実施形態において、有孔装置は、ＮＷＦ等の宿主に面している不織布の少なくとも１つの層を含み、宿主は免疫抑制薬による治療を受ける。一実施形態
において、有孔装置は、細胞外膜に積層され、宿主に面しているＮＷＦの少なくとも１つの層を含み、宿主は免疫抑制薬による治療を受ける。一実施形態において、免疫抑制薬は、カルシニューリン阻害剤、代謝拮抗薬免疫抑制薬及びその組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、免疫抑制薬は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、タクロリムス（ＴＡＣ）及びその組み合わせから成る群から選択される。一実施形態において、免疫抑制薬は、無孔装置を移植された宿主に投与される。

一実施形態において、免疫抑制薬による治療を受ける宿主に、有孔細胞送達装置の治療有効量の治療薬を投与する方法を開示する。

以下のパラグラフでは、他の実施形態を記載する。

方法は、ａ）哺乳類動物宿主に免疫抑制薬を投与し、ｂ）膵臓内胚葉細胞を含む有孔装置を哺乳類動物宿主に移植し、及びｃ）ｉｎ ｖｉｖｏの有孔装置に膵臓内胚葉細胞集団を成熟させ、前駆細胞集団がインスリン分泌細胞に成熟し、それにより哺乳類動物にｉｎ
ｖｉｖｏでインスリンを産生することを含む。

免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害剤、代謝拮抗薬免疫抑制薬及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ６２に記載の方法。

免疫抑制薬が、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、タクロリムス（ＴＡＣ）及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ６３に記載の方法。

有孔装置が細胞除外膜及び細胞除外膜の外側にある不織布の少なくとも１つの層を含むパラグラフ６２に記載の方法。

不織布が細胞除外膜に積層されるパラグラフ６６５に記載の方法。

免疫抑制薬で治療を受ける宿主に移植される膵臓内胚葉細胞を含む有孔細胞送達装置。

免疫抑制薬が、カルシニューリン阻害剤、代謝拮抗薬免疫抑制薬及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ６７に記載の有孔細胞送達装置。

免疫抑制薬が、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、タクロリムス（ＴＡＣ）及びその組み合わせから成る群から選択されるパラグラフ６８に記載の有孔細胞送達装置。

有孔装置が不織布の少なくとも１つの層を含むパラグラフ６７に記載の有孔細胞送達装置。

有孔装置が細胞除外膜を含み、不織布が細胞除外膜に積層されるパラグラフ７０に記載の有孔細胞送達装置。

哺乳類動物の対象の治療用細胞の生存率を改善する方法であって、有孔細胞送達装置の有効量の治療用細胞及び有効量の免疫抑制薬を対象に投与することを含み、有効量の免疫抑制薬は、治療用細胞がｉｎ ｖｉｖｏで生存し、成熟する能力を損なわない方法。

哺乳類動物でインスリンを産生する方法であって、膵臓内胚葉を宿主に移植し、有効量
の免疫抑制薬を宿主に投与し、膵臓内胚葉が哺乳類動物でインスリン産生細胞に成熟することを可能にし、それにより哺乳類動物においてインスリンを産生する方法。

宿主の移植された異種又は同種細胞に対する免疫又は炎症反応を抑制し、又は調節する方法であって、有孔細胞送達装置の細胞を送達し、宿主に有効量の抗炎症因子又は免疫抑制薬を投与し、細胞は膵臓内胚葉である方法。

対象の糖尿病を治療する方法であって、（ａ）糖尿病対象に免疫抑制薬を投与し、（ｂ）有孔細胞送達装置で対象に膵臓内胚葉細胞を投与し、膵臓内胚葉細胞は、インスリン産生細胞に成熟し、それにより対象の糖尿病を治療する方法。

本明細書に記載の実施形態の追加の特徴及び利点は詳細な記述、図及び例から明らかになるだろう。実施形態の例は以下の通りである。
（１）
不織布層及びＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞送達装置を含む組合せ製品。
（２）
前記細胞組合せ製品が細胞除外膜をさらに含み、前記不織布層が前記細胞送達装置の前記細胞除外膜に対して外側にある（１）に記載の組合せ製品。
（３）
前記不織布層及び前記細胞除外膜が共に積層される（１）又は（２）に記載の組合せ製品。
（４）
前記不織布層及び前記細胞除外膜が穿孔を含む（２）又は（３）に記載の組合せ製品。（５）
前記不織布層が穿孔されず、前記細胞除外膜が穿孔される（２）又は（３）に記載の組合せ製品。
（６）
前記組合せ製品が免疫抑制薬で治療を受けたラットに移植される（１）から（５）の何れかに記載の組合せ製品。
（７）
前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞である（１）から（６）の何れかに記載の組合せ製品。
（８）
前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が膵臓内分泌細胞である（１）から（６）の何れかに記載の組合せ製品。
（９）
前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が膵臓ベータ細胞である（１）から（６）の何れかに記載の組合せ製品。
（１０）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が１５０ミクロン以下の直径を有する（４）又は（６）から（９）の何れかに記載の組合せ製品。
（１１）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が１００ミクロン以下の直径を有する（４）又は（６）から（９）の何れかに記載の組合せ製品。
（１２）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が７５ミクロン以下の直径を有する（４）又は（６）から（９）の何れかに記載の組合せ製品。
（１３）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が５０ミクロン以下の直径を有する（４）又は（６）から（９）の何れかに記載の組合せ製品。
（１４）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が約１．０ｍｍ離れている（４）又は（６）から（１３）の何れかに記載の組合せ製品。
（１５）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が約１．５ｍｍ離れている（４）又は（６）から（１３）の何れかに記載の組合せ製品。
（１６）
前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が約２ｍｍ離れている（４）又は（６）から（１３）の何れかに記載の組合せ製品。
（１７）
前記不織布層及び前記細胞除外膜がそれぞれ、装置につき約４０個未満の穿孔を含む（４）又は（６）から（１６）の何れかに記載の組合せ製品。
（１８）
前記不織布層及び前記細胞除外膜がそれぞれ、装置につき約２０個未満の穿孔を含む（４）又は（６）から（１６）の何れかに記載の組合せ製品。
（１９）
ａ）哺乳類動物宿主に免疫抑制薬を投与し、
ｂ）膵臓内胚葉細胞を含む有孔装置を前記哺乳類動物宿主に移植し、及び
ｃ）前記哺乳類動物宿主の前記有孔装置において前記膵臓内胚葉細胞集団を成熟させ、前記前駆細胞集団がインスリン分泌細胞を産生し、それによって哺乳類動物でインスリンが産生することを含む哺乳類動物でインスリンを産生する方法。
（２０）
前記哺乳類動物宿主がヒト又はラットである（１９）に記載の方法。

通常のヒト患者に有孔装置を使用するには、慢性免疫抑制薬（ＩＳＤ）療法が必要である。ＩＳＤによって生じる有害事象のために、出願人専売のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞又は膵臓前駆体（「ＰＥＣ」とも呼ばれる）がＩＳＤを投与された宿主に移植した場合に、（１）成熟することができるのか、（２）以前の研究では、特定のカルシニューリン阻害剤が糖尿病誘発性であること（糖尿病を発症する）（Ｃｒｕｔｃｈｌｏｗ等（２００７）前述を参照のこと）、マウスの内在性膵臓細胞の再生に負に影響する（Ｈｅｉｔ（２００６）前述）ことが示されたため、成熟した細胞が生存し、生物学的に活性であり続け、血中グルコースレベルに反応してインスリンを産生するかどうかは分からなかった。出願人は、シクロスポリンＡによる治療を受けた動物のヒトＣペプチドの血清レベルが未治療の対照ラットで測定したレベルに類似するという事実によって証明されたように、有孔装置で移植されたＰＥＣが、ＩＳＤを投与したヌードラットにおいて分化し、機能し続けるという驚くべき発見をした。さらに、ＣｓＡ治療ラットに観察された初期高血糖が逆転したことを観察した。この事実は、移植後少なくとも３０週間続き、シクロスポリンＡによるカルシニューリン阻害の前述の治療レベルに対する移植片感受性が無くなったことを示している。次の研究では、有孔装置の膵臓内胚葉にさらに試験を行い、ＣｓＡ又はミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を有するタクロリムス（ＴＡＣ）の併用を投与された宿主に移植した。この試験は、試験対象のＩＳＤレジメン全てに対して膵臓内胚葉と移植片耐性を確立した。要約すると、膵臓内胚葉及び移植片の機能は、以前の参考文献の報告からの予想に反して、高血糖及びカルシニューリン阻害の複合された存在によって、負の影響を受けているように見えなかった。このように、当業者は、膵臓内胚葉と移植片の機能が免疫抑制を維持するための最も多く使用される薬によって負の影響を受けることはないと予想する。

一実施形態において、装置は腹膜前に移植される。

関連文献
ヒト多能性幹細胞由来の膵臓細胞のカプセル化については、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ等、米国特許出願第８２７８１０６号、２０１２年１０月２日出願に記載されている。移植可能なカプセル化装置と使用されるツール及び器具は、米国特許第１４／２５４，８４４号、２０１４年４月１６日出願、及び米国意匠特許出願第２９／４８８，２０９号、第２９／４８８，２１７号、第２９／４８８，１９１号、第２９／４８８，２０４号に記載されている。移植可能な装置に細胞を添加する器具及び方法については、２０１４年１０月１３に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６０３０６号に記載されている。「ＬＯＡＤＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＡＮ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥＳ」は、米国特許出願第１４／０００，８６４号、２０１３年８月２１日出願に記載されている。「３－ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ ＬＡＲＧＥ ＣＡＰＡＣＩＴＹ ＣＥＬＬ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥ ＡＳＳＥＭＢＬＩＥＳ」は、米国特許出願第１４／２０１，６３０号、２０１４年３月７日出願、米国意匠特許出願第２９／４４７，９４４号、第２９／５０９，１０２号、第２９／４８４，３６３号、第２９／４８４，３６０号、第２９／４８４，３５９号、第２９／４８４，３５７号、第２９／４８４，３５６号、第２９／４８４，３５５号、第２９／４８４，３６２号、第２９／４８４，３５８号に記載されている。「ＣＥＬＬ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥＳ」は、米国意匠特許出願第２９／４０８，３６６、第２９／５１７，３１９号、第２９／４０８，３６８号、第２９／５１８，５１３号、第２９／５１８，５１６号、第２９／４０８，３７０号、第２９／５１７，１４４号、第２９／４２３，３６５号、第２９／５３０，３２５号に記載されている。「ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＯＦ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＩＮＴＯ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＣＥＬＬＳ」は第 １３／９９８，８８４号及び第６２／３５２，９６８号に記載されている。「ＦＯＲＡＭＩＮＯＵＳ ＩＭＰＬＡＮＴ」は、国際公開第ＷＯ１９９３／０２６３５号に記載されている。前述の参考の特許／出願はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書に記載の刊行物及び特許は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

当然のことながら、前述したことは説明した実施形態に関連し、本発明の範囲から逸脱することなく多数の変更がなされ得る。本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、その範囲を限定するのものとして理解してはならない。対照的に、様々なその他の実施形態、修正及びその等価物があることが明確に理解され、それらが本明細書の記述を読んだ後に、説明した実施形態の趣旨及び／又は添付の請求項の範囲から逸脱することなく、当業者に示唆され得る。

実施例１：様々な密度の不織布を有する細胞送達装置
ＥＮ２０装置は、一般的に３つの層：１）内部の細胞除外膜、２）中央の膜リング、及び３）織りメッシュの外層から構成される。製造プロセスの間、３つの部品が一緒に超音波接合（又は密封）される場合、細胞除外膜は、特に溶接部と管腔の間の移行領域の近くで、目の詰まったメッシュによって圧縮され得る。装置の極端な屈曲も、膜の領域を圧縮し得る。これらの圧縮領域は、潜在的に、膜に割れ目ができ、装置の統合性を損なう（例えば、装置からの細胞漏れ）可能性がある。装置の構造的統合性を改善し、同時にその機能性（細胞除外、血管形成、生体適合性等）維持するために、追加の材料及び／又は層の試験を行った。不織布は、潜在的な介在性のバッファ層として認識された。

新規の装置は、不織布を使用して作製した。前述のように、装置の部品（不織布、膜メッシュ及び膜）は、様々なパターンで配列され得る。ここでは、様々な繊維密度：０．４０、０．７５及び１．００ｏｚ／ｙｄ＾２を使用して、不織布を外側織りメッシュ層と細胞除外膜の外面の間に加えた。追加された不織布を有する送達装置の断面図を示す図４を
参照のこと。

不織布を細胞除外膜に積層しない、又はカスタムのポリエチレン、乾燥接着性織布（例えば、Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ Ｓｐｕｎｆａｂ ＰＯ４６０５、ＳｐｕｎＦａｂ，Ｉｎｃ．）を細胞除外膜に熱積層した。表５を参照のこと。低基本重量（０．１４５ｏｚ／ｙｄ＾２）の接着剤を選択して、積層プロセスの最中に、細胞除外膜の孔の閉塞を阻害する。

この試験をＳＣＩＤ－Ｂｇマウスの２つの群で実施した。凍結保存した膵臓内胚葉細胞（「ＰＥＣ」と呼ぶ）を解凍し、ＤＭＥＭ／ＨＩグルコース（２７ｍｍ）及びＢ２７を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ培地に培養し、各コホートについてＥＮ２０サイズの装置に別々に添加した。

様々な構成の機能性を決定するために、グルコース促進インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイをＫｒｏｏｎ等、２００９、前述及びＡｇｕｌｎｉｃｋ等、２０１５、前述に記載のように、移植後約８、１３、１６及び２２週で実施した。特にＧＳＩＳアッセイの前に、マウスを約１５～１８時間絶食にした。約３０％のブドウ糖（Ｈｏｓｐｉｒａ）溶液の管腔内注入によって約３．０ｇ／ｋｇ体重のグルコースを投与し、（絶食）前、グルコース投与後３０及び／又は６０分に血液を回収した。約５０μＬの血液試料をイソフルラン麻酔下で後眼窩静脈叢を穿刺することによって回収し、血液／血清分離ゲルを含むマイクロタイターチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃３６５９５６）に写した。これらのチューブを４０００～６０００ｘｇで１０分間回転させた後、血清を回収した。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ
ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＩＳＡ、ｃａｔ＃１０－１１４１－０１）を使用して、血液試料の血清のヒトＣペプチドを分析した。

表８は、グルコース促進後の血清中のヒトＣペプチドによって測定したときに、ＮＷＦを組み込んだ装置が、対照装置（ＮＷＦ未使用）に比べて改善した機能を与えたことを示す。

例えば、ＥＮ２０－ＮＷＦ（２）（０．７５ｏｚ／ｙｄ＾２、細胞除外膜に積層されない）を移植したマウスから最大Ｃペプチドが達成された。Ｃペプチド値は、移植後、１３週（１９４５ｐＭ対８４１ｐＭ）と１６週（３６９７ｐＭ対１３２６ｐＭ）の両方でＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ－１装置より約２．５倍高かった。ＥＮ２０－ＮＷＦ（２）－ＳＢ（不織布のＰＥＴ材料をポリエチレン接着性織布で細胞除外膜に積層した）を移植したマウスは、移植後１３週（１３１４ｐＭ対８４１ｐＭ）と１６週（１６９６ｐＭ対１３２６ｐＭ）の両方でヒトＣペプチド血清値が約１．５倍高かった。

同様に、その他の密度の不織布ＰＥＴ材料を使用したとき（（ＮＷＦ（３）は０．４０ｏｚ／ｙｄ＾２であり、ＮＷＦ（１）は１．００ｏｚ／ｙｄ＾２であり、細胞除外膜に積層されない）、Ｃペプチド値は、移植後１３週（ＮＷＦ（３）あり装置の１６０３ｐＭ対ＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ－２装置の６４４ｐＭ、ＮＷＦ（１）あり装置の１４８２ｐＭ対ＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ－２装置の６４４ｐＭ）と１６週（ＮＷＦ（３）あり装置の２１８６ｐＭ対ＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ－２の８２６ｐＭ、ＮＷＦ（１）あり装置の２２８５ｐＭ対ＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ－２の８２６ｐＭ）でＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ－２装置を移植されたマウスより約２．５倍高かった。（表８を参照のこと）

外植された移植片の組織学的分析は、ＮＷＦを有しない対照装置に比べて、細胞除外膜とメッシュ層との間にＮＷＦを含む装置の周辺の血管新生が増加したことを示し、これは、グルコース促進後、対照に比べてヒトＣペプチド血清レベルが著しく高いことで示されるように、ＮＷＦが装置の機能的性能の改善に寄与することを示唆している。

細胞除外膜と外側メッシュの間のＮＷＦが、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＮ２０装置の機能的性能を改善したが、様々な異なる密度（基本重量）のＮＷＦ（１）、（２）又は（３）は、（表８のコホート２のＥＮ２０－ＮＷＦ（３）とＥＮ２０－ＮＷＦ（１）を比べて）機能的性能にあまり著しい影響を与えないようであった。意外なことに、ＮＷＦが細胞膜層に積層されなかった装置（コホート１のＥＮ２０－ＮＷＦ（２）、コホート２のＥＮ２０－
ＮＷＦ（３）、ＥＮ２０－ＮＷＦ（１））は、不織布ＰＥＴ層がポリエチレン接着性織布で細胞除外膜に積層された装置（コホート１のＥＮ２０－ＮＷＦ（２）－ＳＢ）に比べて、機能的性能が改善した（２．５倍及び１．５倍高いヒトＣペプチド）。このことから、ＮＷＦの存在（積層された又は積層されない）が送達細胞の機能性に最も大きな効果を有すると結論付けられる。

実施例２：細胞送達装置の細胞除外膜に対する不織布の積層
細胞除外膜層に対するＮＷＦ層の積層の効果をさらに調べた。小さいサイズの２０μＬの細胞送達装置の少なくとも３つの構成を構築した（「ＥＮ２０」）。対照の装置は、最内層の細胞除外膜と最外層のメッシュから構成された（「ＥＮ２０ Ｃｏｎｔｒｏｌ」）。実験用装置は、最内層の細胞除外膜、中央のＮＷＦ及び最外層のメッシュから構成された。一構成において、ＮＷＦを細胞除外膜に積層しなかった（「ＥＮ２０－ＮＷＦ（２）」）。別の構成において、熱と圧力を使用してＮＷＦを細胞除外膜に積層した（「ＥＮ２０－ＮＷＦ（２）－ＨＬ」）。細胞除外膜及びＮＷＦの熱積層（すなわち、熱スタッキング）を標準的な熱プレス機械（例えばＡＲＢ Ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｓｔｉｃ
Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。プレスを３０５～３２０^ｏＦに加熱し、０～６ＰＳＩの圧力を３フィート／分又は１０フィート／分の速度で加えた。

完成した装置は全て殺菌処理し、ヒト多能性幹細胞に由来する研究グレードの膵臓前駆細胞を無菌で添加し、少なくともＫｒｏｏｎ等２００８前述及びＡｇｕｌｎｉｃｋ等 ２０１５前述に記載のように、ＳＣＩＤ－Ｂｇマウスに移植した。様々な構成の機能性を特定するために、グルコース促進インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを実施例１に記載のように、移植後約１２週と１６週に行った。

ＥＮ２０－ＮＷＦ（２）（熱積層していない）装置を移植したマウスから得た最大Ｃペプチド値は、移植後１２週では約２．４倍、１６週では約１．９倍高く（２４１％対１００％及び１８５％対１００％を比較されたい）、ＥＮ２０－ＮＷＦ（２）－ＨＬ（熱積層した）を移植したマウスは、対象に比べて、移植後１２週では約２．８倍、１６週では約２．３０倍高かった（２７８％対１００％及び２２９％対１００％を比較されたい）。

これは、細胞除外膜に対する不織布の積層が装置の細胞の機能性に改善された効果を有することを実証している（１２週では２４１％対２７８％、１６週では１８５％対２２９％を比較されたい）。しかしながら、前述のように、細胞の機能性に最も大きな効果を有するのは不織布（積層された又は積層されていない）の存在であった。すなわち、不織布を有する装置は、不織布を有しない対照の装置より少なくとも１．９倍高いＣペプチド値を有した。

不織布は、装置の宿主の血管新生を改善することによって、装置の移植を改善し、それにより細胞生存率、増殖、発生、成熟及び装置内部の機能が改善するように思われる。

実施例３：有孔装置の孔密度の最適化
出願人は、マクロ細胞送達装置の穿孔の最適な数（密度）を特徴付けようとする。以下の表２は、穿孔された不織布ありの有孔細胞送達装置と不織布なしの有孔細胞送達装置を記載し、密度（装置の約１００ミクロンにつき穿孔の数）を変える。概して、ＮＷＦ層は、その不織布構造により不同の孔又はギャップを有することに留意されたい。そのため、１００ミクロン未満の孔又はギャップがあり得、１００ミクロンより大きい孔又はギャップもあり得る。ＮＷＦ層は、基本重量が約０．４～０．７５ｏｚ／ｙｄ＾２であり、公称厚みが約１２７～約２２８μｍ、繊維径が２６μｍを有し得る。装置に孔を開ける方法は様々あるが、例えば、全層を互いの上部で最初に積層し、その後、装置の両側又は壁の各層を穿孔する。あるいは、細胞除外層を穿孔し、その後、ＮＷＦ層を含むその他の無孔層の装置と合わせる。レーザーでの穿孔は、孔サイズ（直径）及び穿孔の数（密度）をかなり制御する。以下の表２の群１～３では、細胞除外膜をレーザーで穿孔して、約５０～１２０μｍで平均直径が約８７μｍであり、互いに約１ｍｍ、１．５ｍｍ又は２ｍｍ間隔の孔を形成した。小ゲージの皮下針を使用して、対照群（群４及び群５）の各層に互いに約２ｍｍの孔を手動で作製した。

全ての動物（胸腺欠損のヌードラット）に、それぞれ約２０μＬの固定の膵臓前駆細胞凝集体を含む試験又は対照ＥＮ２０装置の２つの皮下移植片を移植した。

全ての装置構成で（約１ｍｍ、１．５ｍｍ又は２ｍｍ間隔のレーザーで生成した孔及び約２ｍｍ間隔の針で生成した孔）、図５に示されるヒトＣペプチドレベルによって示される胸腺欠損のヌードラットの機能的膵臓内分泌細胞内で、膵臓前駆体が生存、増殖、発生及び成熟することができた。ＧＳＩＳアッセイ（Ｋｒｏｏｎ等（２００８）前述；Ａｇｕｌｎｉｃｋ等（２０１５）前述）を孔密度から独立して、全ての有孔装置で移植後３４週間実施し、対照装置においてもグルコース誘発後１５分及び３０分間実施した。図６を参照のこと。

当業者は、移植細胞と宿主細胞の、特に宿主の脈管構造の細胞間接触が増加すると、細胞生存率、増殖及び成熟が増加し、装置の孔が多いほどよいと仮定するだろう。そのため、孔密度の低い装置の細胞も孔密度の高い装置と同様に機能することを発見したことは驚くべきことであった。例えば、２ｍｍ間隔の孔の装置（孔同士の間隔の開いていると、より少ない孔と低密度を意味する）は、２ｍｍ未満間隔の孔（孔同士の間隔の狭いと、より多くの孔と高密度を意味する）と同様に機能した。このように、出願人は、穿孔の孔密度が低い又は数が少なくても（小さいサイズのＥＮ２０の壁につき約２０個の穿孔があり、装置の表面積の約０．４％未満が穿孔されている）、宿主の血管新生及び細胞生存率に望ましい利益を提供することを発見した。当業者は孔が多いほど（密度がより高いほど）宿主の血管新生が増加及び／又は速くなり、移植細胞に酸素及びその他の栄養物を送達するのを補助し、それにより細胞生存率及び分化が増加すると予想しているため、このことは驚くべきことだった。

孔が少ないほど装置から逃げる細胞が減少し、又は逃げることを抑制することによって、安全性が改善するため、低密度の装置のほうが好まれ得る。さらに、万一移植片全体を取り除くとしても、移植片全体を回収することができる装置の内部に細胞を保持することが望ましい。

実施例４：無孔装置と比較した改善された投与プロファイルを有する有孔装置
前述の実施例３、表２に記載の有孔送達装置を移植されたラットでは、マウスのインタクトな装置に比べて、経時的にＣペプチド含有量が増加することを示した（例えば、インタクトな装置について図７の点線を参照のこと）。図７は、様々な穿孔の構成によって生成されたＣペプチドを示し、ＮＷＦ層を有する有孔装置では、（インスリン含有量を示す）Ｃペプチドが最大約３０、３５又は４０週まで増加することを示す。約１５週で、有孔装置の細胞は、無孔装置に移植された細胞よりも約５０％も多くのＣペプチドを生成する。１６週で、有孔装置の細胞によって生成された平均のＣペプチドは２，６９６ピコモルであり（図７、ＳＰ－２０１６－１４９）、図３に記載のようにＩＥＱに対するＣペプチドのレベルの直線関係に基づいており、装置につき約６，３００ＩＥＱであり、すなわち細胞量は約６３００ＩＥＱである。約３９週までに、有孔装置の細胞は、９，２４４ピコモルの平均Ｃペプチド値を有し（図７、ＳＰ－２０１５－１２８）、再び図３に基づいており、装置につき約２３，１００ＩＥＱの用量である。

細胞を保持した有孔装置を移植されたラットで生成されるＣペプチドは、インタクトな細胞を含む装置より多く、有孔装置においてＣペプチドが定常になるまで長期間かかる（約３５週）（図７、ＳＰ－２０１５－１２８）。すなわち、有孔及び無孔（インタクトな）細胞装置は、約１６週まで同様のレベルのヒトＣペプチドを有し、その後、Ｃペプチドは、インタクトな装置では定常になり、有孔装置では増加し続ける。

有孔装置で達成されるより高いＣペプチド濃度は、約１６週までは到達しない。図７、ＳＰ－２０１６－１４９～ＳＰ－２０１５－１２８を参照のこと。対照的に、インタクトな装置を移植されたマウスのＣペプチドレベルは、約１６週で２，０００ピコモル未満の定常になる。図７（点線の水平線）を参照のこと。

３６又は３９週間ラットに移植された有孔装置の細胞量又はＩＥＱを同じ期間マウスに移植されたインタクトな装置と比較した。マウスのインタクトな装置に比べて、ラットの有孔装置の細胞量は約５倍増加した。図８を参照のこと。図８は、マウスのインタクトな装置が約５，０００未満のＩＥＱを有し、ラットの有孔装置は約２３，１００ピコモルのＩＥＱを有し、５倍の差があることを示す。このことは、有孔装置の細胞は増殖することができ、したがって、より多くのインスリン産生細胞を保持し、及び／又は細胞は、細胞につき、より多くのインスリンを産生しているためであり得る。同じサイズであり、各装置に添加される最初の細胞量が同じであるインタクト（上部）及び有孔（下部）送達装置の細胞の組織学的断面図の顕微鏡写真を示す図９を参照のこと。成熟後、有孔装置の細胞は、インタクトな装置の細胞より増殖性である。すなわち、細胞質量がより多く、又は好ましくはベータ細胞質量がより多い。前述及び図７に記載のＣペプチドデータは、有孔装置の成熟した細胞が、インタクトな装置の細胞より多くのＣペプチドを生成することを示す。図７に示すように、Ｃペプチドレベルが高いほど、膵島の数又はＩＥＱが多くなり、ＩＥＱが多いほど、細胞量が多くなることを示す。

有孔装置の細胞はインタクト又は無孔装置の細胞よりもＩＥＱ値が５～６倍多いため、インタクトな装置の細胞に比べて、より少ない有孔装置又は小さい有孔装置で治療的細胞量を達成することができる。したがって、一実施形態において、有孔装置の細胞は、インタクト又は無孔装置と同じサイズ容量につき、投与能力を改善する。

実施例５：膵臓内胚葉は、カルシニューリン阻害剤で治療を受けたヌードラットで成熟することができる
膵島置換療法について、有孔装置の治療用細胞を移植することは、慢性免疫抑制療法を必要とする。死体からの膵島移植細胞の維持免疫抑制ではタクロリムス（ＴＡＣ）等のカルシニューリン阻害剤を使用するが、シクロスポリン（ＣｓＡ）、抗増殖剤及びミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を使用する頻度は少ない。カルシニューリン阻害剤は、（１）糖尿病誘発性であり（糖尿病を発症する、Ｃｒｕｔｃｈｌｏｗ等（２００７）、前述）、（２）マウスの内在性膵臓の再生に負に影響する（Ｈｅｉｔ（２００６）、前述及びＮｉｒ（２００７）、前述）。このように、免疫抑制薬の投与から生じる有害事象は、増殖はｉｎ ｖｉｖｏのカプセルに包まれた膵臓内胚葉の成熟の重要な要素であるため、膵臓内胚葉の成熟について予想され得、膵臓内胚葉細胞移植片から生じる成熟したベータ細胞についても予想され得る。

ＩＳＤの影響を試験するため、５匹のヌードラットに通常の食事を与え、５匹のヌードラットに２５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを調合した食事を１８週間与えた。この方法は、腹腔内注射及び／又は胃管栄養による日々の投与によるストレスを回避するという利点を有する。１２時間の血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ_{０－１２ｈｒ}）として示された結果として生じる薬物暴露レベルは、約１６μｇ・ｈｒ／ｍＬと推定された。この暴露は、腎臓及び肝臓移植レシピエントのシクロスポリンＡ臨床ターゲットＡＵＣ_{０－１２ｈｒ}が６－９μｇ・ｈｒ／ｍＬであるのに対し高い。

カルシニューリン阻害剤に応答して、治療群のラットは糖尿病になった。特に、２５０ｍｇ／ｋｇの食事でシクロスポリンＡを投与されたラットは、約１０週間後に高血糖になり、すなわち、このラットは内在性Ｃペプチドを生成しなかった。グルコース誘発後の３０分と６０分のラットの血清中Ｃペプチドレベルは、５００ｐＭ以下であった。図１０Ａ
を参照のこと。この影響は、外因性インスリン（Ｌｉｎｂｉｔ ｐｅｌｌｅｔ及びＬａｎｔｕｓ）の投与によって一時的に管理された。その他の点では、シクロスポリンＡの食事は、ラットに良好な耐容性を示した。確かに、体重と食事の消費率は、対照食事を与えられたラットより正常であった。

前述のように小さいサイズのＥＮ２０装置に膵臓前駆体（又はＰＥＣ）を含む有孔装置をラットに移植した。装置は、ＮＷＦ層を含まなかった。移植後１８週で、シクロスポリンＡ治療群のラットの血清中ヒトＣペプチドレベルは、未治療対照群のラットと実質的な差はなかった（図１０Ｂ）。ＣｓＡ治療群のラットは、３０分では１０６９～４０９８ｐＭの血清中ヒトＣペプチド、６０分では１９９５～４１４４ｐＭの血清中ヒトＣペプチドであることを観察したように、堅調なインスリンレベルを示した。重要な点として、ラットは高血糖ではなく、又は外因性インスリンを必要としなかったことである。例えば、１５週で、平均血中グルコースは２８３ｍｇ／ｄＬ（高血糖）であり、２０週で１２８ｍｇ／ｄＬ（正常血糖）であった。このことは、有孔装置の移植片が正常血中グルコースを調節していたことを示した。このデータは、有孔装置のＰＥＣが、ＣｓＡを投与されたラットにおいて分化と機能を継続したことを実証する。この事実は、移植後少なくとも３６週間続き（データ図示せず）、ＰＥＣとシクロスポリンＡによるカルシニューリン阻害の前述の治療レベルに対する移植片感受性の欠如を示している。

前述のことは、カルシニューリン阻害の治療を受けた糖尿病（高血糖）のラットであっても、有孔装置に移植された膵臓内胚葉は、成熟することができ、インスリン産生細胞を生成し、糖尿病の病態を逆転することができることを実証する。

実施例６：膵臓内胚葉は、カルシニューリン阻害剤及び代謝拮抗薬免疫抑制薬で治療を受けたヌードラットで成熟することができる
カルシニューリン阻害剤代謝拮抗薬免疫抑制薬に暴露されたときの有孔装置にカプセル化された膵臓内胚葉がインスリン産生細胞に成熟する能力を評価した。表１２は研究プロトコルの概要を示す。通常の食事（対照）、２５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ－２５０）を含む食事、２５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡと５００ｍｇ／ｋｇのミコフェノール酸モフェチル（ＣｓＡ－２５０＋ＭＭＦ５００）を含む食事、又は１５０ｍｇ／ｋｇのタクロリムスと５００ｍｇ／ｋｇのミコフェノール酸モフェチル（ＴＡＣ－１５０＋ＭＭＦ５００）を含む食事をヌードラットにそれぞれ与えた。食事に順化して２週間後、ラットに実施例１～４に記載の有孔装置で送達されるＰＥＣを移植した。

望ましいＩＳＤ含有量を有する食事の再調合をＢｉｏ－Ｓｅｒｖ（Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）で実施した。穀物をベースとしたＰｉｃｏＬａｂ ５０５３食事、１／２”ペレットが食事の基本であり、対照の食事と同一であり、ラットに適宜与えた。

推定されるＩＳＤ投与量は、典型的なラットの食物消費率の体重１ｋｇあたり約７０ｇに基づく。実際の食物消費率及びＩＳＤ投与量を測定した。

^＊針を用いて手動で穿孔した装置で送達された約７×１０^６の膵臓内胚葉細胞の移植片（マウスにつき１つ、ヌードラットにつき２つ）を全ての動物に皮下投与した。送達装置にはＮＷＦ層を含まないことに留意されたい。

移植後９週で、ＩＳＤ（ＣｓＡ－ＭＭＦ又はＴＡＣ－ＭＭＦのいずれか）で治療を受けたラットは、対照（ＩＳＤなし）よりヒトＣペプチドレベルが高かった。図１１を参照のこと。一過性にヒトＣペプチドレベルが高くなることは、部分的に、これらの動物がＩＳＤ治療薬の結果として糖尿病になり、内在性インスリン分泌の欠如により、対照動物より血中グルコースレベルが高かったことが原因である。すなわち、ＩＳＤによる治療を受けたラットは、対照よりラットＣペプチドのレベルが低いことが予想される。

実施例７：有孔細胞送達装置のポリエステル不織布層は、膵臓前駆体の発生と機能を改善する
実施例１～４は、ＮＷＦを組み入れると、ＮＷＦが細胞除外膜層に対する積層の有無から独立して、及び装置の孔密度（孔の数）から独立して、カプセルに包まれた細胞と送達装置の構造及び機能が増加することを示した。実施例５は、ヒト多能性幹細胞に由来する膵臓前駆体が、宿主がカルシニューリン阻害剤（例えばＣｓＡ）の免疫抑制レジメンで治療を受けると、実際は、生存し、発生し、機能性膵臓内分泌細胞に成熟し得ることを示し、このことはこれまで記載されたことがなく、出願人が開示するまで知られていなかった。実施例６は、膵臓前駆体がカルシニューリン阻害剤の免疫抑制レジメンだけでなく、代謝拮抗薬免疫抑制薬の免疫抑制レジメンにおいて生存することができることをさらに示した。

この研究では、実施例１～６の教示を組み合わせて、カルシニューリン阻害剤と代謝拮抗薬免疫抑制レジメンの併用で治療した、（装置の壁又は側につき）少なくとも１つのＮＷＦ層を組み入れた有孔送達装置及び無孔送達装置の膵臓前駆体の機能を特定した。

概して、有孔ＮＷＦ送達装置を移植した対照ラットは、無孔ＮＷＦカプセル化装置の細胞を移植したラットよりヒトＣペプチドレベルが高かった。図１２（対照、インタクトな送達装置、無孔装置、ＣｓＡ－ＭＭＦによる治療なしを比較）を参照のこと。これは、有孔装置の穿孔（孔）によって移植細胞を有する宿主血管の直接的な血管新生によるものであり、細胞生存率を改善する。さらに、ＩＳＤで治療を受けたラットにおいて、有孔ＮＷＦ送達装置を移植したラットは、無孔ＮＷＦ装置を移植したラットよりヒトＣペプチドレ
ベルが高かった。図１２（インタクトな送達装置及び無孔装置、ＣｓＡ－ＭＭＦによる治療なしを比較）を参照のこと。興味深いことに、ＣｓＡ－ＭＭＦを投与され、有孔ＮＷＦ送達装置を移植した動物のヒトＣペプチドレベルは、同種の有孔ＮＷＦ送達装置を移植したが、ＣｓＡ－ＭＭＦ免疫抑制薬を投与されていない動物より約２倍（１．６倍）高かった。図１２を参照のこと。このヒトＣペプチドの増加は、ＮＷＦ送達装置とＣｓＡ－ＭＭＦ免疫抑制レジメンの組み合わせの相乗効果の結果であり得る。この改善されたヒトＣペプチドレベルは、ＮＷＦ単独及び／又はＩＳＤとの併用によって軽減された改善された宿主の血管新生の結果であり得る。

Claims (20)

1. 不織布層及びＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞送達装置を含む組合せ製品。
2. 前記細胞組合せ製品が細胞除外膜をさらに含み、前記不織布層が前記細胞送達装置の前記細胞除外膜に対して外側にある請求項１に記載の組合せ製品。
3. 前記不織布層及び前記細胞除外膜が共に積層される請求項１又は請求項２に記載の組合せ製品。
4. 前記不織布層及び前記細胞除外膜が穿孔を含む請求項２又は請求項３に記載の組合せ製品。
5. 前記不織布層が穿孔されず、前記細胞除外膜が穿孔される請求項２又は請求項３に記載の組合せ製品。
6. 前記組合せ製品が免疫抑制薬で治療を受けたラットに移植される請求項１から５の何れか１項に記載の組合せ製品。
7. 前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞である請求項１から６の何れか１項に記載の組合せ製品。
8. 前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が膵臓内分泌細胞である請求項１から６の何れか１項に記載の組合せ製品。
9. 前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞が膵臓ベータ細胞である請求項１から６の何れか１項に記載の組合せ製品。
10. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が１５０ミクロン以下の直径を有する請求項４又は請求項６から９の何れか１項に記載の組合せ製品。
11. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が１００ミクロン以下の直径を有する請求項４又は請求項６から９の何れか１項に記載の組合せ製品。
12. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が７５ミクロン以下の直径を有する請求項４又は請求項６から９の何れか１項に記載の組合せ製品。
13. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が５０ミクロン以下の直径を有する請求項４又は請求項６から９の何れか１項に記載の組合せ製品。
14. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が約１．０ｍｍ離れている請求項４又は請求項６から１３の何れか１項に記載の組合せ製品。
15. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が約１．５ｍｍ離れている請求項４又は請求項６から１３の何れか１項に記載の組合せ製品。
16. 前記不織布層及び前記細胞除外膜の前記穿孔が約２ｍｍ離れている請求項４又は請求項６から１３の何れか１項に記載の組合せ製品。
17. 前記不織布層及び前記細胞除外膜がそれぞれ、装置につき約４０個未満の穿孔を含む請
    求項４又は請求項６から１６の何れか１項に記載の組合せ製品。
18. 前記不織布層及び前記細胞除外膜がそれぞれ、装置につき約２０個未満の穿孔を含む請求項４又は請求項６から１６の何れか１項に記載の組合せ製品。
19. ａ）哺乳類動物宿主に免疫抑制薬を投与し、
    ｂ）膵臓内胚葉細胞を含む有孔装置を前記哺乳類動物宿主に移植し、及び
    ｃ）前記哺乳類動物宿主の前記有孔装置において前記膵臓内胚葉細胞集団を成熟させ、前記前駆細胞集団がインスリン分泌細胞を産生し、それによって哺乳類動物でインスリンが産生することを含む哺乳類動物でインスリンを産生する方法。
20. 前記哺乳類動物宿主がヒト又はラットである請求項１９に記載の方法。