KR20130100122A - 췌장 내분비 전구 세포를 이용한 당뇨병의 치료 - Google Patents
췌장 내분비 전구 세포를 이용한 당뇨병의 치료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식함으로써 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 가특허 출원 제61/373,109호(출원일: 2010년 8월 12일)의 이익을 주장한다.
본 발명은 췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식함으로써 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법을 제공한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생성 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 예를 들어 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고한다. 소리아(Soria) 등 (문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-분비 세포가 스트렙토조토신-유도 당뇨 생쥐에서 혈당증을 정상화시킴을 보고한다.
일 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나제의 억제제(LY294002)로 처리하여, β 세포와 유사한 세포가 생성되었음을 개시하였다.
다른 예에서, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생성 세포를 생성하는 것을 보고한다.
미칼레프(Micallef) 등은 레티논산이 PDX1 양성 췌장 내배엽을 형성하는 배아 줄기 세포의 의무를 조절할 수 있음을 보고한다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 PDX1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나제, 뉴로제닌3, p48, Pax6, 및 Hnf6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다(문헌[Diabetes 53: 1030, 2004).
스코우디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGF-β 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 사용하여 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지않지만; 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다(문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.]).
고든(Gordon) 등은 Wnt 시그널링 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/노달/액티빈 시그널링은 동시적으로 전방부 원시선의 발생에 필요하였다"고 언급한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, Gearhart와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(인간 배아 생식, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 방법을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.
또다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌장 도세포를 생성하는 시스템을 보고한다(US2006/0040387A1). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 부티르산나트륨 및 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화시켰다. 그 다음, 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 TGF-β 길항제, 예컨대 노긴(Noggin)과 함께 배양하여, PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 PDX1의 과발현이 췌장 풍부해진 유전자의 발현을 향상시켰고, 인슐린 발현의 유도는 단지 생체 내에서 존재하는 추가의 신호를 필요로 할 수 있는 것으로 결론짓는다"고 언급한다(문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제2008/0241107A1호에는 인슐린을 분비하는 세포의 생성 방법을 청구하며, 이는 a) 인슐린을 생성하지 않는 세포를 얻는 단계; 및 b) 상기 세포를 고 글루코스를 함유하는 배지를 이용하여 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 세포는 인슐린을 분비한다.
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로의 분화능을 보유하면서, 현재의 임상적 필요성에 대처하게 증가될 수 있는 다능성 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명자들은 인간 배아 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 효율을 향상시키기 위해 대안적인 접근법을 취하였다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식함으로써 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법을 제공한다.
<도 1>
도 1은 스트렙토조토신의 5회의 주사에 의해 당뇨병이 있도록 하고 그 후 분화된 인간 ES 세포(4기)를 0일에 신장 피막 하에 이식한 SCID 생쥐에서의 혈당 수준을 나타낸다. 그 후의 수개월간의 혈당 추적에 의하면 고혈당증에서 당뇨병 전증 수준으로 점진적으로 감소함이 나타났다. 후속적인 신장 제거에 의해 당뇨병이 급속하게 재발되었다.
<도 2>
도 2는 이식 후 지시된 주수에서의 혈장 샘플에서의 인간 C-펩티드 측정치가 혈당 수준의 저하에 비례하여 점진적 증가를 나타냄을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 테라사이트(TheraCyte) 장치 내에서 신장 피막 하에 또는 피하에 이식된 세포의 수령체에서 비견되는 C-펩티드 수준이 얻어짐을 나타낸다.
도 1은 스트렙토조토신의 5회의 주사에 의해 당뇨병이 있도록 하고 그 후 분화된 인간 ES 세포(4기)를 0일에 신장 피막 하에 이식한 SCID 생쥐에서의 혈당 수준을 나타낸다. 그 후의 수개월간의 혈당 추적에 의하면 고혈당증에서 당뇨병 전증 수준으로 점진적으로 감소함이 나타났다. 후속적인 신장 제거에 의해 당뇨병이 급속하게 재발되었다.
<도 2>
도 2는 이식 후 지시된 주수에서의 혈장 샘플에서의 인간 C-펩티드 측정치가 혈당 수준의 저하에 비례하여 점진적 증가를 나타냄을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 테라사이트(TheraCyte) 장치 내에서 신장 피막 하에 또는 피하에 이식된 세포의 수령체에서 비견되는 C-펩티드 수준이 얻어짐을 나타낸다.
개시 내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특색, 실시 형태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 전구세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "1기 세포" 또는 "1기"는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, HNF-1 베타, PTF1 알파, HNF6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(primitive gut tube) 세포, 및 후방 전장(posterior foregut) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, MAFB, 인슐린, 글루카곤 또는 소마토스타틴. 췌장 내분비 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 전구 세포"는 NGN3을 발현하며 췌도 호르몬-발현 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 내분비계 세포로 추가로 분화될 수 있는 완성 내배엽 계통의 다능성 세포를 말한다. 내분비 전구 세포는 덜 특정하게 분화된 완성 내배엽 계통 세포, 예를 들어 PDX1 양성 췌장 내배엽 세포에 비교되는 만큼의 많은 상이한 세포, 조직 및/또는 기관 유형으로 분화될 수는 없다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 생성 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 생성할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
만능 줄기 세포의 단리, 팽창 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈)가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 다능성 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출된 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐 내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨등에 의해 개시된 바와 같이 제조된다. (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]).
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양 세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양 세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 레우비노프(Reubinoff) 등 (문헌[Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]) 및 톰슨 등 (문헌[Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147])은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.
리차즈(Richards) 등 (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양 세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양 세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.
다른 예에서, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.
추가의 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻어진 영양 세포의 공급원을 개시한다.
아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.
다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 생후 포피 섬유아세포로부터의 영양 세포층을 개시한다.
미국 특허 제6642048호는 영양 세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는 "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다."라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포; 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 명명된 분화된 그리고 불사화된 트랜스제닉 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다."라고 진술한다.
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양 세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/mL의 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다. "고 진술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호에는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양 세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양 세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호에는 미분화 줄기 세포의 유지 방법이 개시되어 있는데, 상기 방법은 줄기 세포를 원하는 결과를 성취하기에 충분한 양의 시간 동안 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (transforming growth factor-beta, TGF-β) 패밀리의 단백질류의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리의 단백질류의 구성원 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 하나의 실시 형태에서, 적합한 배양 기질은 마트리겔(MATRIGEL)® (벡튼 디켄슨(Becton Dickenson))이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 집코 (Gibco) 번호 11965-092; 낙아웃 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 집코 번호 10829-018; 햄 (Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 집코 번호 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 집코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마 (Sigma) 번호 M7522; 인간 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 집코 번호 13256- 029로부터 제조할 수 있다.
췌장 내분비 전구 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 췌장 내분비 전구 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 단계.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, 커넥신(Connexin)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-키트, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, HNF1 베타, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커는 NGN3, NKX6.1, NeuroD, ISL1, PDX1, PAX4, NKX2.2, 또는 ARX로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004 )]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이러한 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시되어 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.(LifeScan, Inc.)에 허여된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 특성화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석 (FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
다능성 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로부터의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 신호화 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시되어 있다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔, 인크.에 허여된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 추가로, 미국 특허 출원 제60/990,529호에서 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 특성화
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통의 특정 마커는 예를 들어 HLXB9, PTF1 알파, PDX1, HNF6, HNF-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화의 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds . 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로부터의 췌장 내분비 전구 세포의 형성
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, BMP 및 TGF-β 수용체 I 키나아제 억제제를 억제할 수 있는 인자로 보충된 배지에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써 췌장 내분비 전구 세포로 분화된다.
일 실시 형태에서, BMP를 억제할 수 있는 인자는 노긴이다. 노긴은 약 100 pg/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 노긴은 100 ng/㎖의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, TGF-β 수용체 I 키나아제 억제제는 ALK5 억제제 II (칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주)이다. ALK5 억제제 II는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, ALK5 억제제 II는 1 μM의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, 배지는 4500 mg/l의 글루코스 및 1%의 B27을 함유하는 DMEM이다.
일 실시 형태에서, 세포는 약 4일 동안 배양 배지에서 배양된다.
분화의 효율은 췌장 내분비 전구 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
본 발명의 방법으로 만능 줄기 세포를 처리한 후, 분화된 세포는, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, HNF-1 베타, PTF1 알파, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커는 NGN3, NKX6.1, NEUROD, ISL1, PDX1, PAX4, NKX2.2, PAX6 또는 ARX로 이루어진 군으로부터 선택된다.
췌장 내분비 전구 세포로부터의 췌장 내분비 계통의 특징적인
마커를
발현하는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 췌장 내분비 전구 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 전구 세포는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 또는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내분비 전구 세포는, 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내분비 전구 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내분비 전구 세포는, DAPT (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내분비 전구 세포를 배양함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내분비 전구 세포는, 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내분비 전구 세포를 배양함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔, 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔, 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔, 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔, 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, PAX6, NGN3 및 NKX2.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 
및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
치료법
일 태양에서, 본 발명은 제I형 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 단계, 및 췌장 내분비 전구 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓고 있거나, 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 단계, 및 췌장 내분비 전구 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.
적절하다면, 환자는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 약학 제제 또는 생물활성제로 추가로 처리될 수 있다. 이러한 제제는 다른 것들 중에서, 예를 들어, 인슐린, TGF-β 패밀리의 구성원(TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II) 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀(pleiotrophin), 엔도텔린(endothelin)을 포함할 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1) 및 II, GLP-1 및 2 미메티바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 인슐린-생성 세포로 분화될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 수여자에게 이식되기 전에, β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미분화 또는 부분 분화 상태로 수령체 내로 이식될 수 있다. 추가 분화는 수령체 내에서 일어날 수 있다.
완성 내배엽 세포 또는, 대안적으로, 췌장 내배엽 세포, 또는, 대안적으로, β 세포는 분산된 세포로서 이식되거나, 또는 간문맥으로 융합될 수 있는 클러스터로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성 분해성 중합체성 지지체, 다공성 비분해성 장치로 제공되거나 또는 캡슐화되어 숙주 면역 반응으로부터 보호될 수 있다. 세포는 수령체에서 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는 예를 들어, 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.
추가 분화, 이식된 세포의 생존 또는 활성을 향상시키기 위하여, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가 인자를 세포의 투여 전에, 세포의 투여와 동시에, 또는 세포의 투여 후에 투여할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 성장 인자는 투여된 세포를 생체 내에서 분화시키는데 이용된다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되고, 투여된 세포에 원위치에서 노출될 수 있다. 이식된 세포는 내부 및 외부 투여된 당업계에 알려진 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.
이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 치료법에 대한 반응을 비롯한 다양한 많은 인자에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 태양에서 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하고, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키고, 세포를 3차원 지지체 내로 혼입하는 것을 수반한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관 내 배양 없이 환자에서 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약학 제제가 선택적으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 복구에 유용한 조직 주형, 도관, 장벽, 및 저장부를 포함한다. 구체적으로, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생시키기 위해서뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 주화성 제제를 전달하기 위해 시험관 내 및 생체 내에서 사용된 폼, 스펀지, 젤, 하이드로젤, 직물, 및 부직 구조체 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법의 실시에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호에 개시된 물질을 참고한다.
약학 제제가 혼입된 지지체를 형성하기 위하여, 약학 제제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약학 제제는 바람직하게는 약학적 담체의 존재 하에서, 제작된 지지체 상에 코팅될 수 있다. 약학 제제는 액체, 미분 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 부형제는 약학 제제의 방출 속도를 변경하기 위하여 지지체에 첨가될 수 있다. 대안의 실시 형태에서, 지지체에는 항-염증성 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물, 예를 들어 미국 특허 제6,509,369호에 개시된 화합물이 혼입된다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 개시된 화합물과 같은 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 개시된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 적어도 하나의 약학적 화합물이 또한 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0220393호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호에 개시된 화합물과 같은 혈관신생을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171623호에 개시된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한, 성장 인자, 예컨대, 다른 것들 중에서도, 예를 들어, TGF-β 패밀리의 구성원(TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질(BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II) 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입된다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-알파, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-1), GLP-1 및 GLP-2 미메티바디, 및 II, 엑센딘-4, 노달, 노긴, NGF, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C, 트로포엘라스틴, 트롬빈-유래 펩티드, 카텔리시딘, 데펜신, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포- 및 헤파린-결합 도메인을 함유한 생물학적 펩티드, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
스캐폴드(scaffold) 내로 본 발명의 세포를 혼입시키는 것은 스캐폴드 상에 세포를 간단히 침적시키는 것에 의해 성취될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드 내로 들어갈 수 있다 (문헌[J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)]). 세포 접종의 효율을 향상시키기 위하여 몇몇 다른 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flasks)가 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 연골세포를 접종하는 데 사용되었다 (문헌[Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)]). 세포를 접종하기 위한 다른 접근법은 원심분리를 사용하는 것이며, 이것은 접종된 세포에 대해 최소의 스트레스를 생성하며 접종 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 양(Yang)등은 세포 접종 방법을 개발하였으며(문헌[J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)]), 이는 원심분리적 세포 고정법(Centrifugational Cell Immobilization; CCI)으로 칭해졌다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
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실시예
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리젤-코팅된 플레이트 상에서 배양하고 (1:30의 희석), 하기 프로토콜을 이용하여 췌장 내분비 전구 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼, 미국 오하이오주) 및 100 ng/㎖ 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/㎖ WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지(카탈로그 번호 22400, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주), 이어서 2% BSA 및 100 ng/㎖ 액티빈-A에 더하여 8 ng/㎖의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서
b. 3일 동안 DMEM/F12 (카탈로그 번호 11330, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주)+ 2% BSA + 50 ng/㎖ FGF7 (제2기), 이어서
c. 1% B27 (#17504-044, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/㎖ FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD (#239804, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 2 μM 레틴산(RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/㎖의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)으로 보충된, 표 1에 나타낸 상이한 기본 배지를 4일간 사용함 (제3기), 이어서
d. 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/㎖의 노긴 + 1 μM의 ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)로 보충된, 표 1에 나타낸 상이한 기본 배지를 3일간 사용함 (제4기).
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기에 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허법의 원리 하에 적절하게 파악되는 하기의 특허청구범위에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.
Claims (1)
- 캡슐화된 췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식하는 단계에 의해 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법.
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