CN103052393B - 用胰腺内分泌前体细胞治疗糖尿病 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过将胰腺内分泌前体细胞群移植到动物体内来降低动物血糖水平的方法。

Description

用胰腺内分泌前体细胞治疗糖尿病
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2010年8月12日提交的序列号为61/373,109的美国临时专利申请的权益，在此其全部内容通过引用方式并入本文以用于任何目的。
技术领域
本发明提供通过将胰腺内分泌前体细胞群移植到动物体内来降低动物血糖水平的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞生成功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道了衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。
在一个实例中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了与β细胞相似的细胞。
在另一个实例中，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞生成胰岛素生成细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末端的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导PDX1表达最有效的(Diabetes 54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明，外源Pdx1表达明显增强所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制素、葡萄糖激酶、神经元素3、p48、Pax6和Hnf6基因的表达(Diabetes53：1030，2004)。
Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超级族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到了最大效应。他们也观察到胰岛素和Pdx1mRNA表达水平并未受到视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1转录物的水平增加(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了特征性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的效果。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells，2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号传导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导鼠短尾突变体表型[阳性]/HNF3β[阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006)声称“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号传导同时为生成前原条所必需的”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
D’Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾小囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们研究出了一种分化方法，其可将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰激素：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和胃饥饿素的内分泌细胞。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。
在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在这种情况下，分化通道分成三个阶段。使用丁酸钠和激活素A混合物将人类胚胎干细胞首先分化为内胚层细胞。随后将该细胞用TGF-β拮抗剂例如头蛋白与EGF或乙胞素的混合物培养以生成PDX1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个实例中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论：PDX1的过量表达增强了胰腺富集基因的表达，诱导胰岛素表达可能需要仅在体内存在的附加信号”(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。
在另一个例子中，US2008/0241107A1要求保护用于生产分泌胰岛素的细胞的方法，包括：a)获取一种不产生胰岛素的细胞；和b)在含有高浓度葡萄糖的培养基中培养所述细胞，其中所述细胞分泌胰岛素。
因此，仍明显需要开发用于建立能扩增以满足目前临床需要的多能干细胞系，同时又保持分化成胰内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力的条件。我们已采用替代方法，以提高使人胚胎干细胞朝胰内分泌细胞分化的效率。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了通过将胰腺内分泌前体细胞群移植到动物体内来降低动物血糖水平的方法。
附图说明
图1示出了SCID小鼠中的血糖水平，所述小鼠通过五次注射链脲佐菌素呈现糖尿病，然后用分化的人ES细胞(第4阶段)在第0天移植至肾小囊下。以下几个月的血糖跟踪显示高血糖对糖尿病前期的水平逐渐下降。随后的肾移除导致糖尿病快速复发。
图2显示了移植后指定周的血浆样本中人类C-肽测量值显示逐步增加，同时血糖水平下降。
图3示出了肾小囊下移植的细胞受体或皮下移植的TheraCyte装置内得到的可比较的C-肽水平。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生后代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织的能力。
干细胞根据其发育潜能分类为：(1)全能的，意指能够产生全部胚胎细胞和胚外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意指能够产生全部胚胎细胞类型；(3)多能的(multipotent)，意指能够产生细胞谱系的子类，但是均处于特定组织、器官或生理学系统内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生子代，所述子代包括HSC(自我更新)、血液细胞限制性寡能祖细胞和作为血液正常组分的全部细胞类型和要素(例如，血小板))；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系的子类；和(5)单能的，意指能够产生单一细胞谱系(例如，精子发生干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常情况下，它会继续分化成特定细胞类型或细胞类型的子集，且在正常情况下不能分化成不同的细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞谱系中特化(或定向)不足的位置的过程。本文所用的“细胞谱系”限定细胞的遗传，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的显型具体相关的特征，并且可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第1阶段细胞”或“第1阶段”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：SOX-17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、鼠短尾突变体表型、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达下列标志物中的至少一种的细胞：PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6、或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞”是指表达下列标记物中的至少一种的细胞：NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、MAFB、胰岛素、胰高血糖素、或生长抑素。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰内分泌细胞、胰腺激素表达细胞、胰腺激素分泌细胞和b细胞谱系的细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标记物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽在所关注细胞中的可检测水平充分地高于或低于在其他细胞中的那些，使得可使用本领域已知的多种方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，“胰内分泌细胞”或“表达胰激素的细胞”是指能够表达下列激素中至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺内分泌前体细胞”是指定形内胚层谱系中表达NGN3并可进一步分化为内分泌系统细胞(包括但不限于胰岛激素表达细胞)的多能细胞。与较少特异性分化的定形内胚层谱系细胞(如PDX1阳性胰腺内胚层细胞)相比，内分泌前体细胞无法分化成与其一样多的不同细胞、组织和/或器官类型。
如本文所用，“胰腺激素生成细胞”指能够生成下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“分泌胰激素的细胞”是指能够分泌下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，其可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red显影作为底物来检测，如生产商(Vector Laboratories，Burlingame Calif)所描述。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一期望显型是有潜能分化成所有三个胚层的细胞：内胚层、中胚层和外胚层组织。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以证明来自三个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)评价了一组11种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养物的能力。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养细胞上培养的人胚胎干细胞系保持人胚胎干细胞形态并仍为多能的”。
US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
在另一个实例中，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于在源自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期培育人多能干细胞的方法。
在另一个实例中，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了一种源自人胚胎干细胞自发分化的饲养细胞系统。
在又一个实例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了源自人包皮的饲养细胞层。
在另一个实例中，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条件培养基。WO2005014799声称：“根据本发明产生的培养基被鼠细胞的、尤其是那些名为MMH(Met鼠肝细胞)的分化和永生化转基因肝细胞的细胞分泌活性条件化”。
在另一个实例中，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的条件培养基，所述人胚胎干细胞衍生物已被遗传修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种替代的培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
在另一个实例中，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或条件培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
在另一个实例中，US20050148070公开了一种在无血清和无成纤维饲养细胞的确定成分培养基中培养人胚胎干细胞的方法，所述方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代物、至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞，该培养基基本上不含哺乳动物胎血清，并且含有至少约100ng/ml能够激活成纤维细胞生长因子信号受体的成纤维细胞生长因子，其中提供该生长因子的来源不只是成纤维细胞饲养层，此培养基支持干细胞在无饲养细胞或条件培养基的情况下以未分化状态增殖。
在另一个实例中，US20050244962声称：“在一个方面，本发明提供培养灵长类胚胎干细胞的方法”。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子的情况下培养干细胞。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变为非必需的”。
在又一个实例中，WO2005065354公开了一种基本上不含饲养细胞和血清的确定成分的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.一定量的bFGF，其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；c.一定量的胰岛素，其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；和d.一定量的抗坏血酸，其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是细胞外基质成分，例如衍生自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是(Becton Dickenson)。是得自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等、单独的或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可由下列组分制成，例如细胞培养基(DMEM)，Gibco货号11965-092；Knockout细胞培养基(KO DMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco货号15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma货号M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco货号13256-029。
胰腺内分泌前体细胞的形成
在一个实施例中，本发明提供产生胰腺内分泌前体细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)以及人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，Sweden)。表达下列多能细胞特征性标志物中的至少一种的细胞也适用于本发明：ABCG2、CRIPTO、CD9、FOXD3、Connexin43、Connexin45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra 1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、鼠短尾突变体表型、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达定形内胚层谱系特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF1β、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达胰腺内胚层谱系特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌前体细胞特征性标志物选自NGN3、NKX6.1、NeuroD、ISL1、PDX1、PAX4、NKX2.2或ARX。适用于本发明的是表达胰腺内分泌前体细胞特征性标志物中的至少一种的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子公开于Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子公开于D’Amour等人，NatureBiotechnology，2005中。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A和Wnt配体的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活素A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子公开于NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/736,908中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/779,311中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请序列号60/990,529中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请序列号61/076,889中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据美国专利申请序列号61/076,900中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请序列号61/076,908中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
例如，可根据美国专利申请序列号61/076,915中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的表征
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑，2001增刊))以及免疫测定(例如切片材料的免疫组织化学分析)、Western印迹和在完整细胞中可接近的标志物的流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，使用抗体：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的附加特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括例如一种或多种下列标志物的表达：ABCG2、CRIPTO、FOXD3、Connexin43、Connexin45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra 1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。
从表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成表达胰腺内胚层谱系特征性标 志物的细胞
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和刺猬信号通道抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子公开于Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据美国专利申请序列号60/990,529中公开的方法，通过处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的表征
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物继续被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系特异性标志物包括一种或多种转录因子的表达，这些因子例如有HLXB9、PTF1α、PDX1、HNF6、HNF1β。
可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑，2001增刊))以及免疫测定(例如切片材料的免疫组织化学分析)、Western印迹和在完整细胞中可接近的标志物的流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成胰腺内分泌前体细胞
在本发明的一个方面，通过在补充有能够抑制BMP的因子和TGF-β受体I激酶抑制剂的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞。
在一个实施例中，能够抑制BMP的因子为头蛋白。头蛋白可以约100pg/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，头蛋白以100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，TGF-β受体I激酶抑制剂为ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)。ALK5抑制剂II可以按约0.1μM至约10μM的浓度使用。在一个实施例中，ALK5抑制剂II按1μM的浓度使用。
在一个实施例中，培养基为含有4500mg/L葡萄糖和1％B27的DMEM。
在一个实施例中，将细胞在培养基中培养约4天。
可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由胰腺内分泌前体细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑，2001增刊))以及免疫测定(例如切片材料的免疫组织化学分析)、Western印迹和在完整细胞中可接近的标志物的流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的附加特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括例如一种或多种下列标志物的表达：ABCG2、CRIPTO、FOXD3、Connexin43、Connexin45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra 1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群暴露于特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(如CXCR4)的试剂(例如抗体)来纯化分化的细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达胰腺内胚层谱系特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌前体细胞特征性标志物选自NGN3、NKX6.1、NEUROD、ISL1、PDX1、PAX4、NKX2.2、PAX6或ARX。
从胰腺内分泌前体细胞形成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞
在一个实施例中，可使通过本发明的方法制备的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
可通过本领域的任何方法或者本发明提出的任何方法，使胰腺内分泌前体细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养胰腺内分泌前体细胞，然后移除含有毒蜥外泌肽4的培养基，随后在含有毒蜥外泌肽1、IGF1和HGF的培养基中培养该细胞，来使根据本发明方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子公开于D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中。
例如，可通过在含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基中培养胰腺内分泌前体细胞，来使根据本发明方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子公开于D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中。
例如，可通过在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养胰腺内分泌前体细胞来使根据本发明方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子公开于D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/736,908中所公开的方法，通过利用抑制Notch信号通道的因子处理胰腺内分泌前体细胞来将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/779,311中所公开的方法，通过利用抑制Notch信号通道的因子处理胰腺内分泌前体细胞来将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号60/953,178中所公开的方法，通过利用抑制Notch信号通道的因子处理胰腺内分泌前体细胞来将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号60/990,529中所公开的方法，通过利用抑制Notch信号通道的因子处理胰腺内分泌前体细胞来将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、PAX6、NGN3和NKX2.2。在一个实施例中，胰内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达胰腺内分泌谱系特征性标志物中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内分泌系特征性标志物的细胞为胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达PDX1以及下列转录因子中的至少一种：NGN-3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞植入到患者体内。在一个替代实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成胰腺内分泌前体细胞，以及将该胰腺内分泌前体细胞植入到患者体内。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞植入到患者体内。在一个替代实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成胰腺内分泌前体细胞，以及将该胰腺内分泌前体细胞植入到患者体内。
如果合适，可用有利于该移植细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步治疗。这些试剂可包括例如胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和成纤维细胞生长因子-2、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括例如烟酰胺、高血糖素样肽-I(GLP-1)和高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进受体前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定的实施例中，在移植进受体之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进受体中。可在该受体中进行进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞被植入，或可使这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞植入到受体中的适当位置内。植入位点包括例如肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，生长因子用于体内分化施用的细胞。这些因子可以由内源细胞分泌并就地暴露于施用的细胞。可通过本领域已知的内源施用的生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使该培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该细胞掺入三维的支持物中。在移植进患者前，可将该细胞体外保持在该支持物上。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接植入到患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、障碍物和储液器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成掺有药剂的支持物，可在形成支持物前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂添加至支持物中以改变药剂的释放速率。在一个替代实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物(例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物(例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物(例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物)掺入支持物中。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和成纤维细胞生长因子-2、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括例如烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体以及高血糖素样肽-II、毒蜥外泌肽-4、nodal、头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、抗菌肽、防御素、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合域和肝素结合域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1Pt 2)：3-9(1988))。已经开发了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种的另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人开发了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称作离心细胞固定法(CCI)。
本发明通过但不限于以下实例进一步进行说明。
参考文献
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实例
在MATRIGEL涂布的平板上(按1∶30稀释)培养人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.在补充有2％BSA(目录号：152401，MP Biomedical，Ohio)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(目录号：1324-WN-002，R&D Systems，MN)加8ng/ml的bFGF(目录号：100-18B，PeproTech，NJ)的RPMI培养基(目录号22400，Invitrogen，Ca)中培养一天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A加8ng/ml的bFGF的RPMI培养基再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12(目录号11330，Invitrogen，Ca)+2％BSA+50ng/ml FGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.用表1中所示的补充有1％B27(号17504-044，Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7+0.25μM环巴胺-KAAD(号239804，Calbiochem，CA)+2μM视黄酸(RA)(Sigma，MO)+100ng/ml头蛋白(R&D Systems，MN)的不同基础培养基培养四天(Stage 3)，然后
d.用表1中所示的补充有1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml头蛋白+1μM ALK5抑制剂II(目录号616452，Calbiochem，Ca)的不同基础培养基培养三天(第4阶段)。
在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。

Claims (1)

1.表达包括NKX6.1、PDX1和NKX2.2的标志物的封装的胰腺内分泌前体细胞群在制备用于在动物中降低血糖水平的药物中的用途，其中在补充有能够抑制BMP的因子和TGF-β受体I激酶抑制剂的培养基中，在体外将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞。
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