JP7012128B2 - 膵内分泌腺前駆体細胞による糖尿病の治療 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年8月12日に出願された、米国特許仮出願第61/373,10
9号の利益を主張するものであり、当該出願を本明細書にその全容において、かつあらゆ
る目的について援用するものである。
本発明は、膵内分泌前駆細胞の集団を動物に移植することにより、動物の血糖値を低下
させる方法を提供する。
に適したインスリン産生細胞、すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。1
つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成す
ることがある。
つの胚葉(外胚葉、中胚葉、及び内胚葉)を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状
腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発現する。このプ
ロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、例えばHNF
3β、GATA4、MIXL1、CXCR4及びSOX17などの多くのマーカーを発現
する。
臓-十二指腸ホメオボックス遺伝子、PDX1を発現する。PDX1が存在しない場合、
膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発育しない。したがって、PDX1の発現は、
膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、
外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によ
って生じる。
例えば、Lumelskyら(Science 292:1389,2001)は、マウ
スの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Soria
ら(Diabetes 49:157,2000)は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウ
スにおいて、マウスの胚幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化する
ことを報告している。
スホイノシチド3-キナーゼ(LY294002)の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理す
ることにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
x4を構成的に発現しているマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告して
いる。
対する関与を調整することができることを報告している。レチノイン酸は、胚における原
腸形成の終了時に該当する期間中、胚性幹細胞分化の4日目に培養液に添加すると、PD
X1発現の誘導に最も効果的である(Diabetes 54:301,2005)。
。彼らの結果は、外因性のPDx1発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトス
タチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン3、p48、Pax6、及びHnf6遺伝子の
発現を明らかに増加させたことを示している(Diabetes 53:1030,20
04)。
細胞中で膵臓外分泌遺伝子(p48及びアミラーゼ)、並びに内分泌遺伝子(PDx1、
インスリン及びグルカゴン)の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、
1nMアクチビンAを使用して観察された。また、インスリン及びPDX1のmRNA発
現レベルはレチノイン酸に影響されないが、3nM FGF7処理により、PDx1の転
写物量が増加する結果となることが認められた(Biochem.J.379:749,
2004)。
の効果を研究した。Shirakiらは、TGF-β2によってPDX1陽性細胞がより
高い比率で再現性よく得られたことを観察している(Genes Cells.2005
Jun;10(6):503~16)。
が存在する条件下で、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形[陽性]/HNF-3β[陽性]
内胚葉細胞への誘導を示した(米国特許出願公開第2006/0003446(A1)号
)。
nt及びTGF-β/ノーダル/アクチビンシグナル伝達は、前側原始線条の生成のため
に同時に必要である」と述べている。
内の発育プログラムを正確に模倣しない恐れがある。
114、1998)。同時に、Gearhart及び共同研究者は、胎児腺組織から、ヒ
ト胚性生殖細胞(hEG)株を誘導した(Shamblottら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 95:13726,1998)。単に白血病抑制因子(LI
F)と共に培養することにより分化しないようにすることができるマウス胚幹細胞とは異
なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある(米国特許第6,20
0,806号、国際公開第99/20741号;国際公開第01/51616号)。
胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物の作製を述べている(Nature Biot
echnology 2005)。これらの細胞をマウスの腎臓皮膜下で移植することに
より、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が見られた。
ヒト胚幹細胞誘導による胚体内胚葉細胞は、FGF-10の添加後、PDX1陽性細胞に
更に分化することができる(米国特許出願公開第2005/0266554(A1)号)
。
401(2006))は、「ヒト胚性幹(hES)細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グ
ルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと
変換する分化プロセスを開発した」と述べている。このプロセスは、内分泌ホルモンを発
現する細胞経由で類胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体に類似する段
階に細胞を向わせることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。
米国特許出願公開第2006/0040387(A1)号)。この場合、分化経路を3つ
の段階に分割した。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンAの組み合わ
せを用いて内胚葉に分化した。次いで、細胞を、ノギンなどのTGF-βアンタゴニスト
とEGF又はベータセルリンとの組み合わせで培養して、PDX1陽性細胞を生成する。
最終分化をニコチンアミドにより誘発させた。
く見られる遺伝子の発現を増強させたことを結論し、インスリン発現の誘導には、インビ
ボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている(Benv
enistryら、Stem Cells 2006;24:1923~1930)。
リンを生産していない細胞を得る工程;及びb)高濃度のグルコースを含有し、細胞はイ
ンスリンを分泌する培地と共に細胞をインキュベートする工程を含む、インスリンを分泌
する細胞の製造方法を請求する。
化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するように拡張可能な、多
能性幹細胞株を確立するための条件を開発する著しい必要性がなお存在する。本発明者ら
は、膵臓内分泌細胞まで進むヒト胚幹細胞の分化の効率を改善する代替的な手法を採用し
た。
物の血糖値を低下させる方法を提供する。
しかるべき特徴、実施形態又は適用を説明又は例示する下記の小項目に分割する。
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製及び分化して、自己複製前駆細胞、非再生前駆
細胞、及び最終分化細胞を含む、後代細胞を生成する能力で定義される未分化細胞である
。幹細胞は、また、インビトロで複数の胚葉層(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な
細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、並びに移植後に複数の胚葉層の組織を生
じ、胚盤胞への注入後、全部ではないが殆どの組織に寄与する能力によって特徴付けられ
る。
能力を有することを意味する、分化全能性、(2)全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力
を有することを意味する、分化万能性、(3)特定の組織、臓器、又は生理学的な系内で
全ての細胞系統のサブセットを生ずる能力を有する、分化多能性(例えば、造血幹細胞(
HSC)は、HSC(自己再生性)、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成
分である全ての細胞種及び要素(例えば、血小板)を生じうる)、(4)多能性幹細胞よ
りも限定された細胞系統のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性
、及び(5)単一の細胞系統(例えば、精原幹細胞)を生ずる能力を有することを意味す
る、分化単一性に分類される。
い細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊された細胞の特徴を獲得するプロセス
である。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化された(「分化決
定した」)立場を選んだ細胞である。用語「分化決定した」は、分化プロセスに適用され
るとき、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける地点まで分化経
路において進行してしまっており、通常の環境下で異なる細胞型に分化することができな
いか、又は低分化細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内
でさほど特殊化されて(又は分化決定した)いない立場に戻るプロセスを指す。本明細書
で使用されるとき、細胞系統は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、
またどの細胞を生じ得るかを規定する。ある細胞系は、その細胞を発生及び分化の遺伝ス
キーム内に位置付ける。系統特異的マーカーは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的
に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価す
るために使用することができる。
又は「段階1細胞」、又は「段階1」は、以下のマーカー:SOX-17、GATA4、
HNF-3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix
様ホメオボックスタンパク質、FGF4 CD48、eomesodermin(EOM
ES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99又はO
TX2のうちの少なくとも1つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及
び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
、以下のマーカー:PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6、又はHB9のうち
の少なくとも1つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現
する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
以下のマーカー、すなわち、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、MAF
B、インスリン、グルカゴン又はソマトスタチンのうちの少なくとも1つを発現している
細胞を指す。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内分泌細
胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ-細胞系の細胞を含む
。
管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下
のマーカー:HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、go
osecoid、C-Kit、CD99、及びMIXL1を発現する。
はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベル
の増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検
出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いこ
とから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を
他の細胞から同定及び区別可能である。
ホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少
なくとも1つを発現することができる細胞を指す。
の細胞(限定するものではないが膵島ホルモン発現細胞が挙げられる)へと更に分化し得
る胚体内胚葉系の多能性細胞を指す。内分泌前駆細胞は、PDX1陽性膵臓内胚葉細胞な
どの低分化の胚体内胚葉系細胞と比較して、多くの異なる細胞、組織及び/又は器官型へ
と分化することはできない。
、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを産生す
ることができる細胞を指す。
グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも1つを分泌するこ
とが可能な細胞を指す。
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原(SSEA)3及び4、並びにTra-1-60及
びTra-1-81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現
する(Thomsonら、Science 282:1145,1998)。インビトロ
で多能性幹細胞を分化させると、SSEA-4、Tra-1-60、及びTra-1-8
1の発現が消失し(存在する場合)、SSEA-1の発現が増大する。未分化多能性幹細
胞は、典型的には、アルカリホスファターゼ活性を有し、製造業者(Vector La
boratories、Burlingame、Calif.)により説明されるように
、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてVector Redを使
用して展開することにより検出可能である。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、RT
-PCRによって検出されるOct-4及びTERTも発現する。
葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能性である。多能性幹細胞の多能性は、例
えば細胞を重症複合型免疫不全症(SCID)マウスに注入し、4%パラホルムアルデヒ
ドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、次いでそれらを3つの胚葉からの細胞型
の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。あるいは、多能性
は、胚様体を形成し、この胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価す
ることにより決定され得る。
されている核型と比較することで、核型決定され得る。細胞は「正常な核型」を有するこ
とが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃ってお
りかつ目立った変質のないことを意味する。
使用してもよい多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必須ではない
が、典型的には妊娠約10~12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば胚盤胞など
)、胚性組織、又は胎児組織を含む、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株
化細胞系が挙げられる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株H1、H7及びH9(
WiCell)などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の株化細胞系である。また、こ
うした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが
、その場合には、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される1次多能性細胞で
ある。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好
適である。例えば、BG01v(BresaGen,Athens,GA)などの変異型
ヒト胚幹細胞株も好適である。
号、Science 282:1145,1998、Curr.Top.Dev.Bio
l.38:133 ff.,1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S
.A.92:7844,1995)に記載されているように調製される。
一実施形態では、多能性幹細胞は、典型的には、多能性幹細胞を様々な方法で支持する
、フィーダー細胞の層上で培養される。あるいは、多能性幹細胞は、本質的にフィーダー
細胞を含まないが、それにも拘わらず、実質的な分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を
支持する培養系中で培養される。無フィーダー培養液中での多能性幹細胞の無分化での増
殖は、別の細胞型で以前に培養することによって馴化された培地を使用して支持される。
あるいは、無フィーダー培養液中での多能性幹細胞の無分化での増殖は、合成培地を使用
して支持される。
399~404(2000))及びThompsonら(Science 6 Nove
mber 1998:vol.282,no.5391,pp.1145~1147)は
、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からの多能性幹細胞株の
培養について開示している。
11種類の異なるヒト成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細
胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Richardsらは、「成人の皮膚線維
芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能
性を維持する」と述べている。
性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞株を開示している。使用される細胞株は、
胚組織から得た又は胚幹細胞から分化した間葉系細胞株、及び繊維芽細胞様細胞株である
。米国特許出願公開第20020072117号は、また、一次フィーダー細胞層として
の細胞株の使用も開示している。
)は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でのヒト多能性幹細胞の長期間増殖のた
めの方法を開示している。
314,2005)は、ヒト胚性幹細胞の自発的分化に由来するフィーダー細胞システム
を開示している。
004)は、ヒト胎盤から得たフィーダー細胞源を開示している。
ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
5)は、ヒト出生後包皮線維芽細胞からのフィーダー細胞層を開示している。
細胞の増殖を支持する培地、及びそのような培地の作製に有用な細胞を開示している。米
国特許第6642048号は、「本発明は、胚性組織から得られるか、あるいは胚性幹細
胞から分化した間葉系及び線維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を
誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び
図示する」と述べている。
増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開第2005014799号は、
「本発明に従って作製される培地は、マウス細胞、特にMMH(Metマウス肝細胞)と
呼ばれる分化かつ不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化され
る」と述べている。
トテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細
胞誘導体から得られた馴化培地を開示している。
ための合成培地を開示している。
た無血清培地を使用する。例えば、Cheonら(BioReprod DOI:10.
1095/biolreprod.105.046870、2005年10月19日)は
、無フィーダー、無血清培養システムを開示し、ここで胚幹細胞は、胚幹細胞の自己複製
を誘発することができる異なる増殖因子で補足された非血清代替(SR)培地中で維持さ
れる。
2006)は、繊維芽細胞又は馴化培地の不在下で、bFGFで補足された培地を使用し
て、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
ーダー細胞を含まない合成培地中でのヒト胚性幹細胞の培養方法であって、この方法が、
アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも1つのトランスフェリン又はト
ランスフェリン代用物質、少なくとも1つのインスリン又はインスリン代用物質を含有す
る培地中で幹細胞を培養する工程を含み、この培地が、哺乳動物胎児血清を本質的に含有
せず、線維芽細胞フィーダー層以外の供給源からも供給され、線維芽細胞増殖因子シグナ
ル伝達受容体を活性化することが可能な少なくとも約100ng/mLの線維芽細胞増殖
因子を含有し、この培地がフィーダー細胞又は馴化培地なしで未分化状態の幹細胞の増殖
を支持するものを開示している。
胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液中で培地は、培養されてい
る幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地
、並びに実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のbFGF、インス
リン、及びアスコルビン酸の各々を含有する。
の増殖を支持するうえで有効な低浸透圧、低内毒素の基本培地を含む、実質的に未分化状
態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地が提供される。この基本培地は
、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで有効な栄養血清、並びにフィーダー細
胞及びフィーダー細胞由来の細胞外マトリクス成分からなる群より選択される基質と組み
合わされる。培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩
からなる群から選択される第1の増殖因子を更に含む」と述べている。
長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。基本的に哺乳動物胎児血清を含まない(基
本的にいかなる動物血清も含まないことが好ましい)培養液中で、線維芽細胞フィーダー
層以外の供給源から供給された線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好まし
い形態では、充分な量の線維芽細胞増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維
持するために従来必要とされていた線維芽細胞フィーダー層の必要性がなくなる」と述べ
ている。
まない合成等張培地であって、この培地が、a.基本培地、b.実質的に未分化の哺乳類
幹細胞の増殖を支持するのに充分な量のbFGF、c.実質的に未分化の哺乳類幹細胞の
増殖を支持するのに充分な量のインスリン、d.実質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を
支持するのに充分な量のアスコルビン酸を含む合成等張培地を開示している。
法であって、この方法が、幹細胞をトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)族タ
ンパク質の構成員、線維芽細胞増殖因子(FGF)族タンパク質の構成員、又はニコチン
アミド(NIC)に、所望の結果を得るのに充分な時間細胞を未分化な状態に維持するの
に充分な量で、曝露することを含む、方法を開示している。
、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体-リガンド結合の一部を形成し
得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態で、好適な培養基材は、MATR
IGEL(登録商標)(Becton Dickenson)である。MATRIGEL
(登録商標)は、Engelbreth-Holm Swarm腫瘍細胞からの可溶性製
剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、
ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含んでもよい。
及び好適な分布で基質上に播いてもよい。この特徴の全部は、播種分布に細心の注意を払
うことによりメリットが得られるものであり、当業者ならば容易に決定することができる
。
bco # 11965-092;ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地(KO D
MEM)、Gibco # 10829-018;ハムF12/50%DMEM基本培地
;200mM L-グルタミン、Gibco # 15039-027;非必須アミノ酸
溶液、Gibco#11140-050;β-メルカプトエタノール、Sigma #
M7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、Gibco # 1
3256-029等から調製することもできる。
一実施形態では、本発明は、膵内分泌前駆細胞を産生する方法であって:
a.多能性幹細胞を培養する工程、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる
工程、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的な
マーカーを発現する細胞に分化させる工程、
d.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌前駆細胞へと分
化させる工程を含む方法を提供する。
IHコード:WA09)、ヒト胚性幹細胞株H1(NIHコード:WA01)、ヒト胚性
幹細胞株H7(NIHコード:WA07)、及びヒト胚性幹細胞株SA002(Cell
artis,Sweden)が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ-カー:AB
CG2、CRIPTO、CD9、FOXD3、コネキシン43、コネキシン45、OCT
4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SS
EA-4、Tra 1-60又はTra 1-81のうちの少なくとも1つを発現する細
胞も本発明での使用に適している。
CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix-様ホメオボックスタンパク質、F
GF4 CD48、エオメソダーミン(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA
6、CXCR4、C-Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。胚体
内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現している細胞は本発明での使
用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している
細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
ROX1からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少
なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、
膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内胚葉細胞である。
SL1、PDX1、PAX4、NKX2.2、又はARXからなる群から選択される。本
発明で使用するのに好適な細胞は、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを少なくとも1
つ発現している細胞である。
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法、又は本発明で提案される任意の方
法により、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
て胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる(D’A
mourら,Nature Biotechnology 23,1534~1541(
2005))。
651~1662(2004)に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的
なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
(2007)に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現
している細胞に分化され得る。
て胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる(D’A
mourら,Nature Biotechnology 24,1392~1401(
2006))。
地中で培養し、次いで細胞をアクチビンA及び血清と共に培養し、次いで細胞を異なる濃
度のアクチビンA及び血清と共に培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカ
ーを発現する細胞に分化され得る。この方法の例は、Nature Biotechno
logy 23,1534~1541(2005)に開示されている。
地中で培養し、次に細胞を、別の濃度の、血清を含むアクチビンAと共に培養することに
より、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。この方法の例
は、D’AmourらによるNature Biotechnology,2005に開
示されている。
ガンドを含有する培地中で培養し、次にWntリガンドを除去し、細胞を血清を含むアク
チビンAと共に培養することにより、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞
に分化され得る。この方法の例は、Nature Biotechnology 24,
1392~1401(2006)に開示されている。
1/736,908号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって
、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
1/779,311号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって
、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞へと分化させることができる。
従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞へと分化させることができる。
従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞へと分化させることができる。
従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞へと分化させることができる。
従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞へと分化させることができる。
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの
前後に、マーカーの存在に関して試験することにより判定することができる。多能性幹細
胞は、典型的には、そのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は
、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
ンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤(例えば、抗体等)に、処理した細胞集団を暴
露することにより測定され得る。
該技術分野における標準である。これらの方法としては、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ
連鎖反応(RT-PCR)、ノーザンブロット、インシチュハイブリダイゼーション(例
えば、Current Protocols in Molecular Biolog
y(Ausubelら編集,2001増刊号(supplement))参照)、並びにイムノアッ
セイ、例えば切片材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及び完全細胞
で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析(FACS)(例えば、Ha
rlow及びLane,Using Antibodies:A Laboratory
Manual,New York:Cold Spring Harbor Labo
ratory Press(1998)参照)が挙げられる。
定され続けている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの:ABCG2、
cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、
SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-
4、Tra 1-60、Tra 1-81の1つ以上の発現が挙げられる。
する細胞により発現される、例えばCXCR4等のタンパク質マーカーを特異的に認識す
る薬剤(例えば、抗体等)に処理した細胞集団を暴露することにより、分化した細胞を精
製することができる。
を発現する細胞の形成
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法
、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現し
ている細胞に分化され得る。
ature Biotechnology 24,1392~1401(2006)に開
示されている方法に従って、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化す
ることができる。
特徴的なマーカーを発現している細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル
伝達経路阻害剤KAAD-シクロパミンで処理した後、繊維芽細胞増殖因子及びKAAD
-シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、繊維芽細胞増殖因
子及びKAAD-シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系統
に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化される。この方法の例は、Nature
Biotechnology 24,1392~1401(2006)に開示されている
。
736,908号に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノ
イン酸及び少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカー
を発現する細胞に更に分化させる。
779,311号に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノ
イン酸及び少なくとも1種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカー
を発現する細胞に更に分化させる。
特許出願第60/990,529号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚
葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
している細胞を更に分化させる。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系統の特徴を
示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーを、本発明に従って
処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するた
めに使用することができる。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、HLX
B9、PTF-1α、PDX1、HNF6、HNF-1βなどの転写因子の1つ以上のも
のの発現が挙げられる。
たタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤(例えば、抗体等)に、処理した細胞集団
を暴露することにより測定することができる。
該技術分野における標準である。これらには、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(
RT-PCR)、ノーザンブロット、インシチュハイブリダイゼーション(例えば、Cu
rrent Protocols in Molecular Biology(Aus
ubelら編集,2001増刊号(supplement)参照)、並びにイムノアッセイ、例えば
切片材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及び完全細胞で利用できる
マーカーについてのフローサイトメトリー分析(FACS)(例えば、Harlow及び
Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manua
l,New York:Cold Spring Harbor Laboratory
Press(1998)参照)が挙げられる。
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、BMP
阻害能を持つ因子及びTGF-β受容体Iキナーゼ阻害剤を添加した培地で膵臓内胚葉系
に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することにより、膵内分泌前駆細胞に分化
される。
mL~約500μg/mLの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは1
00ng/mLの濃度で使用される。
biochem,Ca)である。ALK5阻害剤IIを約0.1μM~約10μMの濃度
で使用してもよい。一実施形態では、ALK5阻害剤IIは濃度1μMで使用される。
DMEMである。
ーを特異的に認識する剤(例えば抗体)に曝露することにより決定することができる。
該技術分野における標準である。これら方法としては、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連
鎖反応(RT-PCR)、ノーザンブロット、インシチュハイブリダイゼーション(例え
ば、Current Protocols in Molecular Biology
(Ausubelら編集、2001増刊号(supplement)参照))、並びにイムノアッセ
イ、例えば切片材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及び完全細胞で
利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析(FACS)(例えば、Har
low及びLane,Using Antibodies:A Laboratory
Manual,New York:Cold Spring Harbor Labor
atory Press(1998)参照)が挙げられる。
定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの:ABCG2、cr
ipto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SO
X2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、
Tra 1-60、Tra 1-81の1つ以上の発現が挙げられる。
なマーカーを発現する細胞により発現されるタンパク質マーカー(例えばCXCR4など
)を特異的に認識する薬剤(抗体など)に曝露することにより、分化した細胞を精製する
ことができる。
、HB9及びPROX1からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマー
カーのうちの少なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明
の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内胚葉細胞であ
る。
SL1、PDX1、PAX4、NKX2.2、PAX6又はARXからなる群から選択さ
れる。
一実施形態では、本発明の方法により産生した膵内分泌前駆細胞を、膵内分泌系に特徴
的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させてもよい。
より、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
有している培地で膵内分泌前駆細胞を培養し、次にエキセンディン4を含有している培地
を除去し、エキセンディン1、IGF-1及びHGFを含有している培地で培養すること
により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。この方
法の例は、D’Amourら、Nature Biotechnology,2006に
開示されている。
Aldrich,MO)及びエキセンディン4を含有している培地で膵内分泌前駆細胞を
培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化さ
せる。この方法の例は、D’AmourらのNature Biotechnology
,2006に開示されている。
している培地で膵内分泌前駆細胞を培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカー
を発現する細胞へと更に分化させる。この方法の例は、D’AmourらのNature
Biotechnology,2006に開示されている。
36,908号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、No
tchシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することにより、膵内分泌
系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
79,311号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、No
tchシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することにより、膵内分泌
系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
53,178号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、No
tchシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することにより、膵内分泌
系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
90,529号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、No
tchシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することにより、膵内分泌
系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
、PAX4、PAX6、NGN3及びNKX2.2からなる群から選択される。一実施形
態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、
及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することができる。本発明で使用す
るに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも1つ発現する細胞であ
る。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分
泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細
胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
ある。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、PDX1、並びに以下の転写
因子:NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、
MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現する。本発明の一態様
では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。
一態様では、本発明は、I型糖尿病に罹患しているかあるいはI型糖尿病を発症するリ
スクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多能性幹細胞
を培養すること、多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系に分化させること、及びβ細胞系
の細胞を患者に移植することを包含する。代替的な実施形態では、本方法は、多能性幹細
胞を培養すること、多能性幹細胞をインビトロで膵内分泌前駆細胞に分化させること、及
び膵内分泌前駆細胞を患者に移植することを包含する。
発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多
能性幹細胞を培養すること、多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系に分化させること、及
びβ細胞系の細胞を患者に移植することを包含する。代替的な実施形態では、本方法は、
多能性幹細胞を培養すること、多能性幹細胞をインビトロで膵内分泌前駆細胞に分化させ
ること、及び膵内分泌前駆細胞を患者に移植することを包含する。
性物質により更に治療してもよい。それらの薬剤は、例えば特に、インスリン、TGF-
β1、2、及び3を含むTGF-β族の構成員、骨形成タンパク質(BMP-2、-3、
-4、-5、-6、-7、-11、-12、及び-13)、繊維芽細胞増殖因子-1及び
-2、血小板由来増殖因子-AA及び-BB、多血小板血漿、インスリン増殖因子(IG
F-I、II)、増殖分化因子(GDF-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血
管内皮由来増殖因子(VEGF)、プレイオトロフィン、エンドセリンを含んでもよい。
他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド-I(GLP
-1)及びII、GLP-1及び2模倣体、エキセンディン-4、レチノイン酸、副甲状
腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第2004/0209901号及び同第2004/
0132729号に開示される化合物のようなMAPK阻害剤などが挙げられる。
。特別な実施形態では、多能性幹細胞を、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に
分化させる。あるいは多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに
移植してもよい。更なる分化をレシピエント内で行ってもよい。
胞として埋め込んでもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターとして形成しても
よい。あるいは、細胞を、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイ
ス内に提供してもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入してもよい。埋め込み
部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃
、又は皮下ポケットが挙げられる。
又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与し
てもよい。しかるべき実施形態で、増殖因子を、投与された細胞をインビボで分化させる
ように使用する。これらの因子を、内在性細胞により分泌し、投与された細胞にその場で
(in situ)で曝露してもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で既知の内因性の
及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。
ざまな要因に基き、当業者により決定され得る。
る患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をイ
ンビトロでβ細胞系に分化させ、この細胞を3次元支持体に埋め込むことを含む。細胞を
、患者に埋め込む前に、この支持体上にインビトロで維持してもよい。あるいは細胞を含
む支持体を、インビトロで更に培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は
、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも1つの医薬品を組
み込んでもよい。
、導管、バリア及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒ
ドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、インビトロ及
びインビボで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織
増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特
許第5,770,417号、同第6,022,743号、同第5,567,612号、同
第5,759,830号、同第6,626,950号、同第6,534,084号、同第
6,306,424号、同第6,365,149号、同第6,599,323号、同第6
,656,488号、米国特許出願公開第2004/0062753(A1)号、米国特
許第4,557,264号及び同第6,333,029号に開示されている材料を参照さ
れたい。
ポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好まし
くは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の
他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、
支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも1
種の医薬化合物(例えば米国特許第6,509,369号に開示される化合物)を支持体
に組み込む。
第6,793,945号に開示されている化合物と共に組み込んでもよい。
31,298号に開示されている化合物と共に組み込んでもよい。
国特許出願公開第2004/0220393号及び同第2004/0209901号に開
示されている化合物と共に組み込んでもよい。
公開第2004/0171623号に開示されている化合物と共に組み込んでもよい。
員、骨形成タンパク質(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12、
及び-13)、繊維芽細胞増殖因子-1及び-2、血小板由来増殖因子-AA及び-BB
、多血小板血漿、インスリン増殖因子(IGF-I、II)、増殖分化因子(GDF-5
、-6、-8、-10、-15)、血管内皮増殖因子(VEGF)、プレイオトロフィン
、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも1種の医薬化合物と共に組み込んでも
よい。他の医薬化合物としては、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子1-α、グルカ
ゴン様ペプチド-I(GLP-I)、GLP-1及びGLP-2疑似体、並びにII、エ
キセンディン4、ノーダル、ノギン、NGF、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイ
シン-C、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、
ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパ
ク質の細胞-及びヘパリン-結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開
第2004/0209901号及び同第2004/0132729号に開示されている化
合物などのMAPK阻害剤を挙げることができる。
に沈着させることにより達成できる。細胞は、単に拡散により骨格内に入ることができる
(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2):3~9(1988))。細胞
播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細
胞をポリグリコール酸骨格上に播種する際に、スピナーフラスコが使用された(Biot
echnol.Prog.14(2):193~202(1998))。細胞播種のため
の他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、か
つ播種効率を高める。例えば、Yangらは、遠心分離細胞固定法(CCI)と呼ばれる
細胞播種方法を開発した(J.Biomed.Mater.Res.55(3):379
~86(2001))。
れるものではない。
Karvonen,Mら、「Incidence of childhood typ
e 1 diabetes worldwide.」(Diabetes Mondia
le(DiaMond)Project Group.Diabetes Care 2
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ト上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させた:
a.2%のBSA(カタログ# 152401,MP Biomedical,Ohi
o)、100ng/mLのアクチビンA(R & D Systems,MN)、20n
g/mLのWNT-3a(カタログ# 1324-WN-002,R & D Syst
ems,MN)及び8ng/mLのbFGF(カタログ# 100-18B,Pepro
Tech,NJ)を添加したRPMI培地(カタログ#22400,Invitroge
n,Ca)で1日培養した後に、2%のBSA、100ng/mLのアクチビンA、8n
g/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間にわたって処理し(段階1)、
次いで
b.2%のBSA及び50ng/mLのFGF7を添加したDMEM/F12(カタロ
グ番号11330,Invitrogen,Ca)で3日間にわたって培養し(段階2)
、次いで
c.1%のB27(#17504-044,Invitrogen,CA)、50ng
/mLのFGF7、0.25μMのシクロパミン-KAAD(#239804,Calb
iochem,CA)、2μMのレチノイン酸(RA)(Sigma,MO)及び100
ng/mLのノギン(R & D Systems,MN)を添加した表1に記載の異な
る基本培地を使用して4日間にわたって培養し(段階3)、次いで
d.1%のB27(Invitrogen,CA)、100ng/mLのノギン及び1
μMのALK5阻害剤II(カタログ# 616452,Calbiochem,Ca)
を添加した、表1に記載の異なる基本培地を使用して3日間にわたって培養した(段階4
)。
ものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明し
たが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈さ
れる以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
Claims (7)
- 患者における血糖値を低下させるための薬剤の製造におけるカプセル化したヒト膵内分泌前駆細胞の集団の使用であって、
前記ヒト膵内分泌前駆細胞は、ノギン及びALK5阻害剤IIを添加した培地中で膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現しているヒト細胞からin vitroにおいて分化させたものであり、且つ、NGN3、NKX6.1、NeuroD、ISL1、PDX1、PAX4、NKX2.2、PAX6又はARXを発現しているものである、
前記使用。 - 前記カプセル化したヒト膵内分泌前駆細胞の集団は、患者に移植されるものである、請求項1に記載の使用。
- 前記ヒト膵内分泌前駆細胞は、肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットへの細胞に移植されるものである、請求項2に記載の使用。
- 前記培地が、4500mg/Lのグルコースと1%のB27を含有しているDMEMである、請求項1に記載の使用。
- 前記ヒト膵内分泌前駆細胞は前記培地中で4日間にわたって分化する、請求項1に記載の使用。
- さらに増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤の使用を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記患者が、I型糖尿病又はII型糖尿病に罹患しているか、あるいはそれを発症するリスクを有する患者である、請求項1に記載の使用。
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