TR201809759T4 - Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. - Google Patents

Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. Download PDF

Info

Publication number
TR201809759T4
TR201809759T4 TR2018/09759T TR201809759T TR201809759T4 TR 201809759 T4 TR201809759 T4 TR 201809759T4 TR 2018/09759 T TR2018/09759 T TR 2018/09759T TR 201809759 T TR201809759 T TR 201809759T TR 201809759 T4 TR201809759 T4 TR 201809759T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
cells
culture
cell
stem cells
stem
Prior art date
Application number
TR2018/09759T
Other languages
English (en)
Inventor
Sasai Yoshiki
Watanabe Kiichi
Original Assignee
Riken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38265386&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201809759(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Riken filed Critical Riken
Publication of TR201809759T4 publication Critical patent/TR201809759T4/tr

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0603Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0603Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70Enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999Small molecules not provided for elsewhere
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Mevcut buluş kök hücrelerin, örneğin embriyonik kök hücrelerin (ES hücreleri) kültürlenmesi için bir usule, bu tür kök hücrelerin kültürü için bir besiyerine ve bunların kullanımlarına ilişkindir.

Description

TARIFNAME KÖK HÜCRE KÜLTÜRÜ BESIYERI VE USULÜ Mevcut bulusta kök hücrelerin, örnegin embriyonik kök hücrelerin (ES hücreleri) kültürlenmesi için bir usul, bu tür kök hücrelerin kültürü için bir besiyeri ve bunlarin kullanimlari saglanmaktadir.
ES hücreleri merkezi sinir hastaligina, örnegin Parkinson hastaligina ve diyabete iliskin hücre transplantlarinda hücre kaynagi olarak kuvvetli bir aday saglar. ES hücrelerinin inceleninesinde günümüzde yaygin olarak fare ES hücresi kullanilmaktadir ancak klinik uygulamalar dikkate alindiginda arastirma ve gelistirmenin insan ES hücrelerini kullanmadan gerçeklestirilmesi gereklidir. Ancak hücre kültüründe insan ES hücreleri fare ES hücrelerine göre daha kolay hücre ölümüne maruz kalir. Örnegin, idame kültüründe insan ES hücrelerinin alt kültüründe, hücre agregatlari enzim islemi veya mekanik ayirma ile besleyici hücrelerden veya substratlardan ayrilir ayrilmaz süspanse olur, küçük hücre agregatlarina pipetleyerek ayrilir ve sonra yeni bir kültür plakasina ekilirler. Bununla birlikte, insan ES hücreleri yaygin hücre soylari ve fare ES hücreleri ile karsilastirildiginda zayif düzeyde ayrilmaya ve ayrismaya tabi olur ve hücrelerin çogu sagkalmaz. Insan ES hücrelerinin çok yavas bölünmesi ve kolaylikla farklilasmasi nedeniyle insan ES hücrelerinin farklilasmamis özellikleri koruyarak kültürlenmesi için çok fazla zaman ve isgücü gereklidir ve çogaltilabilir sonuçlar elde etmek için teknik egitim gereklidir. Ayrica, insan ES hücrelerini kullanarak arastirma ve gelistirme yapilmasinin engelleyen bir husus alt kültürde hücre ölümü nedeniyle toplama oraninin azalmasidir. Ayrica, insan ES hücrelerinin genetik mühendislik islemleriyle klonlanmasi istense de, insan ES hücreleri tekli hücrelere homojen olarak ayristiginda çok kolay bir sekilde hücre ölümü ve büyümenin durmasi ortaya çikar ve sonuç olarak insan ES hücrelerinde klonlama veriminin %1 veya daha az oldugu düsünülür.
Ayrica, insan ES hücrelerinin farklilastirilmasi için bu hücreler besleyici hücrelerden ayrilir, küçük hücre agregatlari veya tekli hücreler seklinde ayristirilir, daha sonra bir substrat veya özel besleyici hücreler üzerine yayilir ve farklilasmayi indükleyici besiyeri içinde kültürlenirler. Bu islemin verimliligi çok düsüktür. Ayrica, embriyoid bir kültür usulünde, Iliskin Serumsuz Yüzdürmeli Kültür) usulünde, hücrelerin bir kez tekli hücrelere ayrismasi ve hücre agregatlarinin olusmasi gereklidir ancak bu tür bir metodoloji insan ES hücrelerine uygulandiginda çok sayida hücre ölmektedir. Ayrica, insan ES hücreleri söz konusu oldugunda, tamamen tekli ayrismis olmasalar bile (küçük hücre agregatlarindan kültürleme durumunda) hücrelerin yüksek siklikta ölmeleri nedeniyle (F risch ve digerleri, Curr. Opin. kültürlenmesi için iyilestirilmis metodoloji gelistirilmesi istenmektedir.
Rho baglantili sarilmis sarmal kinaz (ROCK:GenBank erisim NO:NM_005406) Rho GTPaz°1n ana efektör moleküllerinden biridir ve damar tikanmasi ve sinir aksonu uzanimi gibi fizyolojik fenomenleri denetledigi bilinmektedir (Riento ve digerleri, Nat. Rev. Mol.
Hücre ölümünün ROCK inhibisyonu tarafindan denetlendigine iliskin çesitli bildiriler hizlandirdigina iliskin bildiriler de vardir (Rattan ve digerleri, J. Neurosci Res. 83, 243-255 düzenlenmesinde Rho/ROCKhin rolü henüz belirleninemistir (Riento ve digerleri, Nat. Rev.
CoClz'nin mezenkimal kök hücrelerin nöronlara farklilasmasini indükledigi ve ROCK inhibisyonunun bu etkiyi güçlendirdigi bilinmektedir. Bununla birlikte, kök hücrelerin, Örnegin ES hücrelerinin bir ROCK inhibitörü içeren besiyerinde kültürüne iliskin bildirim yoktur.
Fukushima ve digerleri, Hepatology, Cilt 38, sayfa 562, 2003 referansinda bir ROCK inhibitörü olan hidroksifasudilin siçan hepatik yildizsi hücrelerinde hücre büyümesini ve kollajen üretimini baskiladigi bildirilmektedir. Laplante ve digerleri, Journal of Neurobiology, hücrelerin nörodeterminasyonu sirasinda hücre-hücre temasini ve N-Cadezin protein seviyesini düzenledikleri bildirilmektedir. inhibe eden ve bir nükleik asit, polipeptit, peptit veya bunlarin karisimini içeren bir maddenin verilmesiyle apoptozun önlenmesine veya geciktirilmesine iliskin bir usul açiklanmaktadir. Özel olarak bu tür bir maddenin verilmesiyle kalp yetmezligi tedavisi öne sürülmektedir.
Mevcut bulusun bir amaci ES hücreleri gibi kök hücrelerin kültürlenmesi için etkili bir yeni metodoloji ve yeni besiyeri saglamaktir.
Mevcut bulusun sahipleri kapsamli çalismalar yapmis ve bunun sonucunda bir kök hücrenin, örnegin pluripotent bir kök hücrenin, bilhassa bir ES hücresinin sagkalim oraninin, proliferasyon gücünün ve/veya farklilasma etkinliginin kök hücrenin bir ROCK inhibitörü içeren bir kültür besiyerinde kültürlenmesiyle iyilestirilebilecegini bulmuslardir.
Dolayisiyla mevcut bulusta asagida siralananlar saglanmaktadir:- hücrelerin bir ROCK (Rho-kinaz) inhibitörü ile isleme tabi tutulmasini içerir. haline gelmis kök hücrelerdir (yani bir hücre kümesi olusturmus hücrelerdir). adherent (yüzeye tutunan) kültürde veya süspansiyon kültüründe kültürlenir. hücreden veya gelismis farklilasma etkinligine sahip bir kök hücreden bir farklilasmis hücrenin üretilmesi için bir usul, söz konusu usul bir pluripotent insan kök hücresinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içerir. inhibitörü Y-27632, Fasudil veya H-l 152,dir. preparasyonu. burada ROCK inhibitörü Y027632, Fasudil veya H-l 152°dir. klonlama veriminin veya pasajlama veriminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde, (ii) bir pluripotent insan kök hücresi kültüründe koloni olusumunun desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde ve/veya (iii) bir kültürde pluripotent insan kök hücrelerinin sagkaliminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi. 27632, Fasudil veya H-1152idir.
Dolayisiyla yukarida geçen düzenlemeler bir pluripotent insan kök hücresi kültürü usulünü içermekte olup, söz konusu usul kök hücrenin bir ROCK inhibitörü içeren bir kültür besiyerinde ve bir ROCK inhibitörü içeren bir pluripotent insan kök hücre kültürü besiyeri içinde tutulinasini içerir.
Baska yönleri itibariyla bulusta, pluripotent insan kök hücrelerinin klonlama verimini veya pasajlama verimini destekleyecek sekilde kültürlenmesine yönelik ve kök hücrelerin bir ROCK inhibitörü içeren bir kültür besiyerinde kültürlenmesini içeren bir usul; bir kök hücre kültüründe koloni olusuinunu destekleyen ve pluripotent insan kök hücrelerinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içeren bir usul; ve bir kök hücre kültüründe klonlama verimini veya pasajlama verimini iyilestirmek için pluripotent insan kök hücrelerinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içeren bir usul saglanmaktadir.
Bulusun tercih edilen düzenlemelerinde, kök hücreler besleyici hücreler, besleyici hücre ekstreleri ve/veya serumu olinadan kültürlenir. Kök hücreler alt klonlaina veya pasajlama öncesinde, örnegin alt klonlama veya pasajlamadan en az bir saat önce bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenebilir. Alternatif olarak veya ilaveten, kök hücreler alt klonlama veya pasajlama sonrasinda bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde tutulabilir. Tercih edilen düzenlemelerde, kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde en az yaklasik 12 saat, daha tercihen en az yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün tutulur. Baska düzenlemelerde, kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde en az bir ila bes pasaj tutulur.
Bulusun bazi düzenlemelerinde, daha sonra ROCK inhibitörü örnegin yaklasik 12 saat sonra veya yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün sonra kültür besiyerinden geri çekilir. Baska düzenlemelerde, ROCK inhibitörü en az bir ila bes pasaj sonra geri çekilir.
Bulusun bir baska yönü itibariyla pluripotent insan kök hücrelerinin bir kültür içinde sagkaliminin iyilestirilmesi için bir usul saglanmakta olup, söz konusu usul kök hücrelerin bir ROCK inhibitörü ile temas ettirilmesini veya kök hücrelerin bir ROCK inhibitörüne maruz birakilmasini içerir. Bulusun bu yönüne ait usuller, özellikle kültürün süspansiyon içinde ayrismis kök hücreleri veya kök hücre agregatlarini içermesi durumunda hücre sagkaliminin iyilestirilmesi bakimindan uygundur. Bu usuller özellikle kültür hücreleri burada açiklanan örnek hücre yogunluklari da dahil olmak üzere düsük yogunlukta içerdiginde veya kültür kök hücreleri klonal yogunlukta içerdiginde kullanislidir. Tercihen, kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde en az yaklasik 12 saat, daha tercihen en az yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün veya en az bir ila bes pasaj korunur. Istege bagli olarak, daha sonra ROCK inhibitörü, örnegin yaklasik 12 saat sonra, yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün sonra veya en az bir ila bes pasaj sonra kültür besiyerinden geri çekilir. Bulusa ait bir ilave usul kök hücrelerin aktarilmasina iliskin bir usul olup, söz konusu usul kök hücrelerin bir ROCK inhibitörü içeren bir besiyeri içine aktarilmasini içerir.
Takdir edilecegi üzere bulusa ait usuller burada açiklanan uygun herhangi bir ROCK inhibitörünü kullanarak gerçeklestirilebilecektir. Tercih edilen ROCK inhibitörleri Y-27632, Fasudil ve H-l 152,dir.
Usuller pluripotent insan kök hücrelerinin ayristirildigi veya düsük yogunluklarda kültürlendigi her durumda avantajli sekilde kullanilabilir. Bulusun kullaniminda, kök hücreler düsük hücre ölümüyle birlikte farklilasmamis bir halde korunur. Dolayisiyla, usuller dokulardan kök hücrelerin elde edilmesini iyilestirmekte kullanilabilir.
Usuller pluripotent insan kök hücrelerinin genetik modifikasyonu baglaminda da, özellikle belirtmek gerekirse genetik modifikasyon uygulanmis kök hücrelerin klonal popülasyonlarinin ayristirilmasinda da kullanislidir. Insan ES hücrelerinin transfekte olmus bir p0pülasy0nu asagidakileri içeren bir usulle elde edilebilir:- - ES hücrelerinin seçilebilir bir markörü kodlayan bir yapi ile transfekte edilmesi; - ES hücrelerinin kaplanmasi; - ES hücrelerinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesi; ve - seçilebilir markörü eksprese eden hücrelerin seçilmesi.
ROCK inhibitörü kültür besiyerinde seçilebilir markörü eksprese eden hücreleri seçme uygulamasi öncesinde ve/veya sonrasinda mevcut olabilir. Özellikle düsük kök hücre yogunluklarinin etkilerine karsi koyinak için seçilebilir inarkör besiyerinde mevcut belli seçim maddelerine direnç (örnegin antibiyotik direnci) katiyorsa ROCK inhibitörünün seçim sirasinda mevcut olmasi tercih edilir. Istege bagli olarak usul bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde seçilebilir markörü ekSprese eden ES hücrelerinin alt klonlanmasi, bu sekilde kök hücre büyümesinin ve/veya koloni olusumunun desteklenmesi ve/veya kök hücrelerin sagkaliminin iyilestirilmesi asamasini içerir .
Insan pluripotent kök hücreleri için bir kültür besiyeri imalatinda bir ROCK inhibitörü kullanilabilir . Kültür besiyeri burada açiklanan herhangi bir besiyeri olabilir veya burada açiklanan besiyeri bilesenlerinin bir kombinasyonunu veya birini veya daha fazlasini içerebilir. Besiyeri, insan ve fare kök hücreleri, Örnegin ES hücreleri dahil olmak üzere burada açiklanan herhangi bir kök hücre türünün kültür edilmesi için uygun olacak sekilde formüle edilebilir.
Serum ve serum özütü bulundurmayan ve bazal besiyeri; bir ROCK inhibitörü; ve istege bagli olarak insülin, insülin büyüme faktörü ve bir demir tasiyicidan birini veya daha fazlasini içeren bir hücre kültürü besiyeri de açiklanmaktadir. Burada açiklanan örnek besiyeri ve demir tasiyicilar dahil uygun bazal besiyeri ve demir tasiyicilar (örnegin transferrin) teknikte uzman olanlarca kolaylikla saglanir.
Mevcut bulusun ilave yönleri bir ROCK inhibitörünün pluripotent insan kök hücreleri üzerinde burada açiklanan etkileri elde etmek için kullanimina iliskindir. Özellikle, bulusun yönleri itibariyla, bir ROCK inhibitörünün bir kök hücre kültüründe klonlama veriminin veya pasajlama veriminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi; bir ROCK inhibitörünün bir kök hücre kültüründe koloni olusumunun desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi; ve bir ROCK inhibitörünün bir kültürde kök hücrelerin sagkaliminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi saglanmaktadir.
Bulusa ait usullerin avantajlarina iliskin burada sunulan açiklamanin ayni sekilde bulusa uygun ROCK inhibitörleri kullanimi ve bulusa uygun besiyerleri ve diger bilesimler için de geçerli oldugu takdir edilecektir.
Mevcut bulusa ait kültür usulleri pluripotent insan kök hücrelerinin sagkalim oranini, proliferasyon gücünü veya farklilasma etkinligini iyilestirebilir. Özellikle, mevcut bulusa ait kültür usulü avantajlarini, örnegin kök hücrelerin ayristirilmasini, ayrismis kök hücrelerin adherent veya süspansiyon kültürlerini veya benzerini içeren herhangi bir kültür usulünde sergileyebilir. Mevcut bulusa ait kültür usulü, tercihen kök hücre pasaj kültürü, kök hücrede farklilasma indükleme (örnegin, nöral veya sinir hücrelerine), kök hücre saflastirma veya klonlama, kök hücre genetik modiükasyonu ve benzeri için kullanilabilmesini saglayacak avantajlara sahiptir.
Mevcut bulusa ait kültür usulünde tercihen örnegin burada açiklanan hücre preparasyonu, kültür maddesi, kombinasyon (örnegin, bilesim ve kit), serumsuz besiyeri, kültür sistemi ve benzeri kullanilabilir.
Mevcut bulusa göre bir ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulacak pluripotent insan kök hücreleri ayrismis hücreler veya ayrismamis hücreler olabilir. Ayrismis hücreler hücre ayrismasini (örnegin, ileride açiklanan ayrisma) desteklemek üzere islem gören hücrelere karsilik gelir. Ayrismis hücreler tek bir hücreyi ve bir miktar (tipik olarak yaklasik 2 ila 50, 2 ila 20 veya 2 ila 10) hücreden küçük bir hücre kümesi (agregat) olusturan hücreleri içerir.
Ayrismis hücreler süspanse (yüzen) hücreler veya adherent hücreler olabilir. Örnegin, ES hücrelerinin, örnegin insan ES hücrelerinin ayrisma (ve/veya ayrisma sonrasi süspansiyon kültürü) gibi özel kosullara duyarli olduklari bilinmektedir. Kök hücre, simdiye dek hücre ölümünün olusacagi kosullara tabi oldugunda mevcut bulusa ait usuller özel kullanima sahiptir.
Mevcut bulusu uygulamak için bir inhibitör olarak Rho-kinaz (ROCK) islevini inhibe edebildikleri sürece genel olarak bir sinirlama olmaksizin ROCK inhibitörleri uygundur ve (örnegin bakiniz, Nakaj ima ve digerleri, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 ( ve bunlarin türevlerini ve ROCK için antisens nükleik asidi, bunlara ait RNA interferansini indükleyici nükleik asidi (örnegin, siRNA), rekabetçi peptitleri, antagonist peptitleri, inhibe edici antikorlari, antikor- ScF V fragmanlarini, dominant negatif varyantlari ve ekspresyon vektörlerini içerir. Ayrica, baska düsük moleküler bilesikler de ROCK inhibitörleri olarak bilinmektedir ve bu bilesikler inhibitörlerinin bir veya ikisinin veya daha fazlasinin bir kombinasyonu da kullanilabilir.
Mevcut bulusa göre, kök hücre bir besiyeri içinde ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulabilir.
Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usullerde kullanilan besiyeri zaten ROCK inhibitörü içerebilir veya alternatif olarak mevcut bulusa ait usuller besiyerine ROCK inhibitörü ilave etme asamasini içerebilir. Kök hücrelerin sagkalim oraninin iyilesmesi gibi Besiyerindeki ROCK inhibitörü konsantrasyonuna, istenen etkilerin, örnegin kök hücrelerde gelismis sagkalim oraninin elde edilebilmesini sagladigi sürece özel bir sinirlama getirilmeinektedir. Örnegin, uM, daha tercihen yaklasik 0.] ila yaklasik 100 MM, daha da tercihen yaklasik 1.0 ila yaklasik uM ve en fazla tercihen yaklasik 2.0 ila 20 uM konsantrasyonda kullanilabilir. ROCK inhibitörü olarak Fasudil/HA1077 kullanildiginda, yukarida bahsedilen Y-27632 konsantrasyonlarinin yaklasik iki kati kullanilabilir. ROCK inhibitörü olarak H-l 152 kullanildiginda, yukarida bahsedilen Y-27632 konsantrasyonlarinin yaklasik 1/50*si kullanilabilir.
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutuma süresine, istenen etkilerin, örnegin kök hücrelerde gelismis sagkalim oraninin elde edilebilmesini saglayan bir zaman süresi oldugu sürece özel bir sinirlama getirilmemektedir. Insan embriyonik kök hücre (bulusa ait degil) için isleme tabi tutma süresi ayrisma öncesinde tercihen yaklasik 30 dakika ila birkaç saattir (örnegin, yaklasik bir saat). Ayrisma sonrasinda, insan embriyonik kök hücresi istenilen etkileri elde etmek için örnegin yaklasik 12 saat veya daha fazla ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulabilir.
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulacak kök hücre(hücreler) yogunluguna istenilen etkilerin, örnegin kök hücrelerde gelismis sagkalim oraninin elde edilmesini saglayan bir yogunluk oldugu sürece özel bir sinirlama getirilmemektedir. Tercihen yaklasik 1.0 x 101 ila hücre/m1”dir.
Mevcut bulusa ait usuller ayrica kök hücrelerin ayristirilmasina iliskin bir asama içerebilir.
Kök hücre ayristirmasi bilinen herhangi bir usulü kullanarak gerçeklestirilebilir. Bu usuller selatlastirici bir madde (örnegin EDTA), bir enzim (örnegin tripsin, kollajenaz) veya benzeri ile yapilan isleinleri ve mekanik ayristirma (örnegin pipetleme) gibi yöntemleri içerir. Kök hücre(hücreler) ayristirma öncesinde ve/veya sonrasinda ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulabilir. Örnegin, kök hücre(hücreler) sadece ayristirma sonrasinda isleme tabi tutulabilir.
Kök hücrenin(hücrelerin) ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulmasi yukarida açiklanan sekilde yapilabilir.
Mevcut bulusa uygun kültür kosullari kullanilan besiyerine ve kök hücrelere göre uygun sekilde belirlenecektir. Mevcut bulusta, mevcut bulusa ait usullerde kullanilacak bir besiyeri de saglanmaktadir.
Mevcut bulusa uygun besiyeri bazal besiyeri olarak hayvan hücrelerinin kültürlenmesinde kullanilan bir besiyerini kullanarak hazirlanabilir. Bazal besiyeri olarak, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle MEM, OLMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 ve Fischer besiyerinden herhangi biri ve ayrica bunlarin kombinasyonlari kullanilabilir ancak besiyeri hayvan hücrelerinin kültürlenmesinde kullanilabildigi sürece bunlarla da sinirli tutulmamaktadir.
Mevcut bulusa uygun besiyeri serum içeren veya serumsuz bir besiyeri olabilir. Serumsuz besiyeri islenmemis veya saflastirilmamis seruinun olmadigi besiyerlerine karsilik gelir ve dolayisiyla saflastirilmis kandan elde edilen bilesenlerin veya hayvan dokusundan elde edilen bilesenlerin (örnegin büyüme faktörleri) oldugu besiyerlerini içerebilir. Heterojen hayvandan elde edilen bilesenlerle kontaminasyonu önleme yönü itibariyla, serum kök hücrenin(hücrelerin) elde edildigi hayvanla ayni hayvandan elde edilebilir.
Mevcut bulusa uygun besiyeri serum alternatiflerini içerebilir veya içermeyebilir. Serum alternatifleri uygun sekilde albümin (örnegin lipit açisindan zengin albümin, albümin ikaineleri, örnegin rekombinant albümin, bitki nisastasi, dekstranlar ve protein hidrolizatlari), transferrin (veya bir baska demir tasiyici), yag asitleri, insülin, kollajen prekürsörleri, eser elementler, 2-merkaptoetanol, 3'ti01gliser01 veya bunlarin esdegerlilerini bulunduran maddeleri içerebilir. Serum alternatifleri örnegin 98/30679 sayili Uluslararasi Yay1n7da açiklanan usulle hazirlanabilir. Alternatif olarak, daha kolay olmasi için ticari olarak piyasada mevcut herhangi bir malzeme kullanilabilir. Ticari olarak piyasada mevcut maddeler Nakavt Serum Degistirme (KSR), Kimyasal Tanimli Lipit Konsantresi (Gibco) ve Glutamaxli (Gibco) içerir.
Mevcut bulusa ait besiyeri yag asitlerini veya lipitleri, amino asitleri (örnegin esansiyel olmayan amino asitler), vitamin(vitaminler), büyüme faktörleri, sitokinler, antioksidan maddeler, 2-merkapt0etanol, piruvik asit, tamponlama maddeleri ve inorganik tuzlar da içerebilir. 2-merkaptoetanol konsantrasyonu, örnegin yaklasik 005 ila 1.0 mM ve tercihen yaklasik 0.1 ila kültürlenmesi için uygun oldugu sürece konsantrasyona özel bir sinirlama getirilmemektedir.
Kök hücrenin(hücrelerin) kültürlenmesinde kullanilan bir kültür kabi, içinde kök hücre kültürü yapilmasina imkan verdigi sürece ve özel olarak bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla cam sise, doku kültürü için cam sise, tabak, petri tabagi, doku kültürü için tabak, çoklu tabak, mikro-plaka, mikro-kuyucuklu plaka, çoklu plaka, çok kuyucuklu plaka, mikro lam, bölmeli lam, Schale (cam petri tabagi), tüp, tepsi, kültür torbasi ve silindir siseyi içerir.
Kültür kabi hücresel adhezif veya adhezif olmayan kültür kabi olabilir ve amaca göre seçilir.
Hücresel adhezif kültür kabi, kap yüzeyinin hücrelere adezyonunu gelistirmek için herhangi bir hücre adezyonu substratiyla, örnegin hücre disi matrisle (ECM) kaplanabilir. Hücre adezyonu substrati kök hücrelerin veya besleyici hücrelerin (eger kullanilmissa) baglanmasina yönelik herhangi bir malzeme olabilir. Hücre adezyonu substrati kollajen, jelatin, poli-L-lizin, poli-D-lizin, laminin ve fibronektin ve bunlarin karisimlarim, örnegin Matrigel ve lizizli hücre 1641).
Diger kültür kosullari da uygun sekilde belirlenebilir. Örnegin, kültür sicakligi yaklasik 30 ila 40 °C ve tercihen yaklasik 37 °C olabilir ancak özel olarak bunlarla sinirli tutulmamaktadir.
C02 konsantrasyonu yaklasik %1 ila %10 ve tercihen yaklasik %2 ila %5 olabilir. Oksijen gerilimi %1-10 olabilir.
Mevcut bulusa ait usuller, örnegin kök hücrelerin adezyon kültürü için kullanilabilir. Bu durumda, hücreler besleyici hücreler mevcudiyetinde kültürlenebilir. Mevcut bulusa ait usullerde besleyici hücrelerin kullanilmasi durumunda, besleyici hücreler olarak stromal hücreler, örnegin fetal fibroblastlar kullanilabilir (bakiniz örnegin; Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Ikinci Baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Martin, Mevcut bulusa ait usuller, kök hücrelere iliskin tasiyicilarda süspansiyon kültürü (Fernandes sayili Birlesik Devletler Patenti) dahil olmak üzere bir süspansiyon kültüründe de kullanilabilirler. Kök hücrelerin süspansiyon kültürü ifadesi kök hücrelerin bir besiyeri içinde kültür kabina veya besleyici hücrelere (eger kullanilirsa) göre adherent olmayan kosul altinda kültürlenmesi anlamina gelir. Kök hücrelerin süspansiyon kültürü bir kök hücreleri ayristirma kültürünü ve kök hücrelerde bir agregat süspansiyonu kültürünü içerir. Kök hücreleri ayristirma kültürü terimi süspansiyon halindeki kök hücrelerin kültürlenmesi anlamina gelir ve kök hücreleri ayristirma kültürü tekli kök hücrelere veya çok sayida kök hücreden (örnegin, yaklasik 2 ila 20 hücre) olusan küçük hücre agregatlarina iliskin olanlari içerir.
Yukarida bahsedilen ayristirma kültürü devam ederken, kültürlenmis, ayrismis hücreler kök hücrelerden daha büyük bir agregat olusturabilir ve bunun ardindan bir agregat süspansiyon kültürü gerçeklestirilebilir. Agregat süspansiyon kültürü bir embriyoid kültür usulünü Uluslararasi Yayin) içerir. Mevcut bulusa ait usuller bir süspansiyon kültüründe kök hücrelerin sagkalim oranini ve/veya farklilasma etkinligini anlamli ölçüde gelistirebilir.
Mevcut bulusa ait usuller kök hücre alt kültürü usulleri olarak kullanilabilir. Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usuller kök hücrelerin toplanmasi/yayilmasi asamasini içerebilir. Mevcut bulusa ait usullere göre, daha yüksek bir sagkalim orani ve gelismis proliferasyon gücü elde edilebilir.
Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usuller tekli hücrelerin (veya hücrelerden küçük bir agregasyonun) kültürde etkili sekilde birbirinden ayrismasini saglar; ayrica, bulusa ait usuller kök hücrelerin kullanildigi ilaç kesfetme ve güvenilirlik testlerinin (örnegin, yüksek is/ürün hacmi taramasi) verimliligini destekleyebilir. Ilaveten, mevcut bulusa ait usuller genetik modifikasyon yapilmis kök hücrelerin (tutulu ve/veya homolog olarak rekombine hücreler) kolay taranmasini/alt klonlanmasini ve tibbi uygulamalar için bir kök hücre hattinin daha güvenli ve daha homojen taranmasini saglar. Mevcut bulusa ait usuller, kök hücrelerin farklilasmamis Özelliklerinin sakli tutuldugu ve farklilasma güçlerinin azalmadigi kök hücreler ortaya çikartmalari bakimindan da avantajlidirlar.
Mevcut bulusa ait usuller kök hücre farklilasmasini indükleyerek kullanilabilirler.
Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usuller kök hücre farklilasmasinin indüklenmesine iliskin bir asamayi içerebilirler. Kök hücre farklilasmasinin indüklenmesi için bilinen herhangi bir usul kullanilabilir. Kök hücre farklilasmasi yoluyla üretilecek hücrelerin örnekleri endodermal hücreleri (, mezodermal hücreleri (Brachyury, Flkl , Mox markör pozitif hücreler, vb.) ve ektodeimal hücreleri içerir. Ektodemial hücrelerin örnekleri nöral hücreleri (NCAM, TuJl , tirozin hidroksilaz (TH), serotonin, nestin, MAP2, MAP2ab, NeuN, GABA, glutamat, ChAT veya Soxl markör pozitif hücreler, vb.), epidermal hücreleri (sitokeratin markör pozitif hücreler, vb.), duyusal hücreleri (RPE veya rodopsin markör pozitif hücreler, vb.), pigmentli hücreleri (TRP-l markör pozitif hücreler, vb.) ve nöral krest kökenli mezenkimal hücreleri (SMA markör pozitif hücreler, vb.) içerir. Tercihen ES hücrelerinden sinir sistemi hücrelerinin, örnegin nöral hücrelerin (örnegin serebral nöral hücreler) ve bunlarin prekürsörlerinin indüklenmesinde SFEB usulü (bakiniz, Nature durumda, faktörler asagidaki sekilde kullanilabilir; Nodal inhibitörler (Lefty-A, Lefty-B, Lefty-l, Lefty-2, çözünür Nodal reseptörler, Nodal antikorlar; Nodal reseptör inhibitörleri, vb.); Wnt inhibitörleri (Dkkl , Kerberus proteinleri, Wnt reseptörü inhibitörleri, çözünür Wnt reseptörleri, Wnt antikorlari, kazein kinaz inhibitörleri, dominant negatif Wnt proteinleri, vb.); ve BMP inhibitörleri (anti-BMP antikorlari, çözünür BMP reseptörleri, BMP reseptörü inhibitörleri, vb.). Mevcut bulusa ait usullere göre, kök hücreler etkili sekilde özellesmis hücrelere farklilasabilir. Mevcut bulusa ait usuller ayrica tercihen kök hücrelerin nöral hücrelere (ön beyin nöral hücreleri ve/veya serebral dorsal (kortikal bölge) hücreler ve serebral ventral (bazal gangliyon bölgesi) hücreleri) farklilasmasini saglayan baska usullerde (örnegin, bir SDIA usulü, AMED usulü, PA6 hücrelerinin kullanildigi bir usul) kullanilabilme avantajlarina sahiptirler.
Mevcut bulusta, mevcut bulusa ait usullerle ve/veya yukarida bahsedilen ayristirma islemleriyle elde edilen bir hücre preparasyonu saglanmaktadir. Mevcut bulusa ait hücre preparasyonu bir pluripotent insan kök hücresi ve bir ROCK inhibitörü içerir. Mevcut bulusa ait bir hücre preparasyonu çok sayida tekli hücreden olusan küçük hücre agregatlari gibi ayrismis hücreler içeren bir preparasyon olabilir. Bu tür bir hücre preparasyonu kök hücrelerin, tercihen insan nöral kök hücrelerinin sagkalim oranini veya farklilasma etkinligini iyilestirebilir. Mevcut bulusa ait hücre preparasyonu, örnegin kök hücrelerin saklanmasi (örnegin, dondurarak saklanmasi) ve/veya tasinmasi veya kök hücrelerin alt kültürü için kullanilabilir. Hücre preparasyonu kök hücrelerin dondurarak saklanmasi için kullanildiginda, mevcut bulusa ait hücre preparasyonu ayrica yukarida açiklanan serumu veya bunun ikamesini veya bir organik çözücü (örnegin, DMSO) içerebilir. Bu durumda, serum veya ikamesinin konsantrasyonu, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla yaklasik %1-50 (h/h), tercihen yaklasik %5-20 (h/h) olabilir. Organik çözücü konsantrasyonu, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla yaklasik %0-50 (h/h), tercihen yaklasik %5-20 (h/h) olabilir. Bulusun bu düzenlemelerine ait bilesimler serum içerebilir veya serumdan muaf olabilir ve ayri olarak Kök hücreler için bir kültür maddesi bir ROCK inhibitörü içerir. Genel olarak, kültür maddesi kök hücreler için bir kültür besiyeridir. Tercihen mevcut bulusa ait kültür usullerinde kültür maddesi kullanilir.
Bir ROCK inhibitörü ve baska bilesenler içeren bir kombinasyon örnegin kök hücrelerin kültürlenmesi için (örnegin, pasaj kültürü, farklilasma indüksiyonu kültürü) kullanilabilir. Örnegin, kombinasyon bir bilesim olabilir. Bilesim bir ROCK inhibitörünün ve diger bilesenlerin karisimi formunda saglanabilir. Bilesime dahil edilebilecek diger bilesenler, örnegin: kök hücrelerin farklilasinasini düzenleyici maddeleri, örnegin kök hücre farklilasma inhibitörlerini (örnegin, serum, FGF, LIF, BMP, Wnt, hücre disi matris, TGF-ß, besleyici hücre) ve kök hücre farklilasma indükleyicilerini (örnegin, BMP inhibitörü, Wnt inhibitörü, Nodal inhibitör, retinoik asit, serum, hücre disi matris, besleyici hücreler, örnegin mezenkimal hücreler); ayrica kültür katki maddelerini (örnegin, KSR, 2-merkaptoetanol, amino asitler, yag asitleri ve yukarida açiklanan diger faktörler) içerir.
Kombinasyon bir kit de olabilir. Kit ayri olarak (yani karistirilmamis bir sekilde) bir ROCK inhibitörü ve diger bilesenleri içerebilir. Örnegin, kit her bilesenin ayri olarak bir kapta paketlendigi formda saglanabilir. Kitte bulunabilecek diger bilesenler, örnegin: bilesime dahil edilebilecek yukarida bahsedilen diger bilesenleri; kök hücrelerin veya farklilasmis hücrelerin (örnegin, hücre markörüne yönelik bir antikor) tanimlanmasi veya ölçümü (tespit veya miktar tayini) için bir maddeyi; bir hücre kültürü besiyerini; kültür için hücre disi matrisle isleme tabi tutulmus bir kabi; genetik rekombinasyon için bir plazmidi ve bunun seçici bir maddesini Bir kültür sistemi bir besiyeri içinde kök hücreleri ve bir ROCK inhibitörünü içerir. Kültür sistemi mevcut bulusa ait besiyerinde kök hücreler içerebilir. Kültür sistemi ayrica bir besiyeri içinde mevcut bulusa ait usullerle baglantili olarak ayrintili sekilde açiklanmis bilesenlerden, örnegin besleyici hücreden, hücre destekleyici matristen, ROCK inhibitöründen farkli hücre kültürü faktörlerini içerebilir.
Ayrintili Örnekler asagida verilmektedir. Örnekler asagidaki çizimlerle gösterilmektedir: Sekil 1 - ROCK inhibitörü Y- klonlanma verimini pluripotentliklerini olumsuz etkilemeden bariz ölçüde artirir. (a-c) Yedi gün MEFide uM Y-27632 yoklugunda (a) ve mevcudiyetinde (b) ayrismis hES hücrelerinin düsük yogunluklu kültürü. Hemen hemen tüm koloniler ALP için pozitif oldu. Bar, 500 um. (c) ALP+ kolonilerin baslangiçta ekilen hES hücresi sayisina oranlari (**,10 kontrole göre P < 0.01 , n :3). (d-f) Y-27632 ile isleme tabi tutulmus hES hücresi kolonilerinin anti-E-kaderin (d), -Oct antikorlari ile immünolojik boyanmasi. Alt paneller çekirdek DAPl boyamasidir. Bar, 100 um. Y- 27632 islemi hES hücrelerinde aktin demeti olusumunda esasli degisikliklerin olmasina neden olmadi (gösterilmiyor). (g) F arklilasan hES hücrelerinde erken mezodermal markörler Brachyury ve Meoxl ”e iliskin RT-PCR analizi. RT(-),Ters transkripsiyonsuz G3PDH PCR. (h) Farklilasan ES hücrelerinde erken endoderinal markör Soxl Tye iliskin RT-PCR analizi. (i-k) Kollajen I ve IV ile kapli 8 kuyucuklu bölmeli lamda farklilasan hES hücrelerinde mezodermal ve endodermal markörler için immünolojik boyama. (i) Birkaç farklilasan hücrede mezodennal markör Brachyury (kirmizi) ekspresyonu. DAPI çekirdek boyamasi için kullanildi (mavi; c). Bar, 10 um. Ü) 12 gün OP9 hücrelerinde kültürlenmis hES hücresinden (Y-27632 ile isleme tabi tutulmus) elde edilen hücrelerde düz kas aktini immünolojik boyamasi (SMA; kirmizi). Çekirdekler DAPI ile boyandi (mavi). Bar, 5 um. (k) 6. günde hES hücresinden elde edilen bir epitelyal levhada HnBß ve E-kaderin immünolojik boyamasi. Bar, 5 um. (I-n) Y-27632 mevcudiyetinde düsük yogunlukta tutulmus hES hücrelerinden teratoma olusturma (%100, n=20) (30 pasaj). Bar, 1 cm. Hücreler SCID fare testlerine bilateral enjekte edildi (I). 9 hafta sonra teratomalar makroskopik kikirdaklari (beyaz oklar; m, n) ve pigment epitelini (siyah ok; 11) de içeren iyice farklilasmis dokulardan bir karisim içerdi.
Sekil 2 - Y- klonlanma verimini dogrudan artirir. (a, b) MEF ile hazirlanmis besiyerinde Matrigel kapli plakalarda hES hücrelerinin besleyici hücresiz kültürü. Bar, 500 um. Ayrisinis hES hücrelerinden koloni olusumu Y-27632 ile açik sekilde artmis (b; eklenti, tipik bir koloninin yüksek büyütmeli bir görüntüsü; bar, 100 um), yoklugunda ise birkaç koloni olusmustur (a; Y-27632 d) Yedi gün 10 uM Y-27632 mevcudiyetinde 96 kuyucuklu bir plakanin her kuyucugunda MEF içinde tek bir hES hücresinin kültürü. (c) (d) Her kuyucukta bir ALP+ koloni mevcudiyeti yüzdeleri (**, kontrole göre P < 0.01, 11 = 3 çalisma).
Kontrol, islem görmemis hücreler. Bar, 100 um. (e, f) Transfeksiyondan 12 gün sonra MEF'de düsük yogunluklu ayristirma kültüründe Y-27632 ile isleme tabi tutulmus hES hücrelerinden higromisin dirençli kolonilerin olusmasi. Bar, 100 um. (e) Faz kontrast görüntüsü. (f) Venüs-GFP ekspresyonu. (g) Farkli sürelerde Y-27632 islemi ile MEF”de kültürlenen hES hücrelerinin büyüme egrisi. Grup 1 (mavi), sadece ilk 12 saat sirasinda (bir saatlik ön islemle birlikte) Y-27632 islemi; Grup 2 (kirinizi), kültür islemi yok (mor). Her kosul için, 5x104 ayrismis hücre/kuyucuk (6 kuyucuklu plaka) MEF üzerine yayildi. **1 P < 0.01, Grup l'e karsi Grup 2 (n = 3 çalisma). (h) 3. ve 5. günlerde Grup 1 (mavi) ve 23de (kirmizi) Nanog+ hES hücrelerinde Ki67+ (mitotik) hücrelerin yüzdeleri (i-n) Hücre çevrimi fazina spesifik popülasyonlara iliskin akis sitometrisi analizi. (i, j, I, ni) Akis sitoinetrisi desenleri. X ekseni, 7-AAD baglanmasiyla gösterilen DNA içerigi; Y ekseni, bir saat maruziyet sonrasi BrdU alimi. (k, n) Grup 1 (mavi) ve 2”de (kirmizi) hES hücreleri arasinda faz Spesifik popülasyonlarin göreceli yüzdeleri (i-k) 3. gün (I-n) 5. gün. *, P < 0.05; **, P < 0.01, Grup l`e karsi Grup 2 (n = 3 çalisma). Hücre büyümesindeki artis derecesi çok büyük degildir ve klonlama verimindeki güçlü artisi (%27°ye karsi %1) açiklayamaz.
Sekil 3 - ROCK inhibitörü süspansiyon kültüründe ayrismis hES hücrelerinin (KhES- 1) apoptozunu önler ve sagkalimini destekler. (a-c) TUNEL analizi. Ayrismis hES hücreleri 10 uM Y-27632 yoklugunda (a) veya mevcudiyetinde (b) iki gün süspansiyonda kültürlendi. TUNEL+ hücreler FACS ile analiz edildi. (0) Apoptotik hücrelerin yüzdesi üzerinde Y- ve bir nörotrofin kokteylinin (BDNF + NT-3 ve -4) etkileri (**, P < 001; ***, P < 0.001, her çift arasinda; n = 3 çalisma). (d-I) Süspansiyon kültüründe hES hücresi hES hücresinin 35 mm plakalarda (n = 3) kültürden iki, dört ve alti gün sonra hücre sayilari. 6. günde Y-27632 ile isleme tabi tutulmus ES hücreleriyle etkili hücre agregati olusumu gözlemlendi (1), kontrol hücreleriyle ise gözlemlenmedi (e). Bar, 300 um. (g) SF EB-h kültürlü hES hücrelerinde Pax6 (yesil), Oct3/4 (kirmizi) ve E- kaderin (mavi) ekspresyonuna iliskin zaman analizi. (h) Kültür protokolü semasi. (i) SFEB-h kültüründe indüklenen hES hücresi türevi nöral hücrelerin immünolojik boyaninasi. Bfl (kirmizi), TuJ 1 (yesil), DAPI (mavi). Bar, 50 um. Bazi Bf1+ hücrelerin nöronal markör TuJ 1 için pozitif olduguna dikkat edilmelidir. (j-n) SFEB-h indüklü nöral hücrelere iliskin immünolojik boyama analizi. Bar, 25 um. (j) Pax6 ve Nkx2.1 için pozitif olan Bf1+ telensefalik hücrelerin yüzdeleri (**, kontrole göre P < 001; n = 3). Shh (30 nM) yoklugunda (k, 1) veya mevcudiyetinde (m, n) kültürlenmis SFEB-h indüklü nöral hücrelere iliskin immünositokimya. Bfl (yesil; k-n), Pax6 (kirmizi; k,m) ve Nkx2.] (kirmizi; l,n).
Sekil 4 - Düsük yogunlukta Y-27632 mevcudiyetinde kültürlenmis hES hücrelerinin analizi.(a-c) Y-27632 islemi ile düsük yogunlukta yapilan uzatilmis pasajlama (30 kere) sonrasinda Y-27632 ile isleme tabi tutulmus hES hücrelerinde (KhES-l) E- kaderin (a), Oct immünolojik boyamasi. Alt panellerde DAPI boyamasi gösterilmektedir (mavi). (d-g) Y-27632 ile uzatilmis pasajlamayi takiben hES hücrelerinin (KhES-l) SCID fare testlerine subkapsüler enjeksiyonundan sonra olusan teratoma dokularina iliskin histolojik analiz (hematoksilin-eozin boyamasi, 5 uM parafin bölümü). ((1) Kikirdak, (e) nöroepitelyum, (f) pigmentli epitel ve (g) silindir epitelli gut benzeri mukoza. (h,i) Y-27632 islemi ile düsük yogunluklu kültürü içeren uzatilmis pasajlama sonrasinda ayrismis hES hücrelerinden etkili koloni olusumu (%32.5 ± %1 .7; KhES-l) Y-2763,ye bagli kaldi (i) ve bu olmadan çok az koloni görüldü (11). (j) Koloni olusumunda (KhES-l) iki seçmeli ROCK inhibitörünün (Y-27632, F asudil; klonlama verimi 10 uM Fasudil yoklugunda ve mevcudiyetinde inhibitörünün (cAMP-Rp, LY294002) doz-yanit iliskisi. Y ekseni, koloni olusuinu destekleyici etkinliginin 10 uM Y-27632 ile olana oranlari. (k) hES hücrelerinin farkli yayma yogunluklarinda Y-27632 ile koloni olusumunun artmasi. ***, kontrole göre pasajlamasi sonrasinda normal bir karyotip (%100, 11 = 5) gösteren hES hücrelerinin (KhES-3) G bantlama analizi (300-500 bant seviyelerinde).
Sekil 5 - Y-27632 mevcudiyetinde ayrismayi/reagregasyonu içeren süspansiyon kültüründe hES hücrelerinin (KhES-l) nöral farklilasmasi. (a) Nodal (5 ug/ml Lefty, serit 2), Wnt ( inhibitörlerin Pax6+ nöral progenitörlere hES hücresi farklilasmasi üzerindeki etkileri.
Serit 5, üç faktörün kombinasyonu (*, P < 0.05; **, kontrole göre P < 0.01; n = 3 çalisma). (b,c) Y- kültürlenmis hES hücrelerinin SFEB agregatlarina iliskin immünolojik boyama (gün 24). (b) Pax6 (yesil) ve E-kaderin (kirmizi). (c) Nestin (yesil) ve Oct3/4 (kirmizi). ÖRNEKLER Referans Örnek 1: ROCK Inhibitörü Y-27632 Ile Insan Embriyonik Kök Hücrelerin Klonlanma Veriminin Iyilesmesi Burada açiklanan deneylerde kullanilan insan embriyonik kök hücreleri, Kyoto Üniversitesi, Frontier Tip Bilimleri Enstitüsü Norio Nakatsuji laboratuvarinda olusturulmus insan blastosistlerine ait embriyonik kök hücreler (KhES-l, KhES-2 ve KhES-3) olup, bunlar Japon devletinin insan embriyonik kök hücre yönergelerine göre dagitilmis ve kullanilmistir (çogunlukla KhES-l). Nakatsuji laboratuvari usulüne göre (Suemori ve digerleri, Biochem besleyici hücre tabakasi olarak ekilen fare embriyonik fibroblastlari (mitomisinle etkisiz kilinmis, MEF) ile plastik bir kültür tabaginda kültürlendi. Daha özellikle, D-MEM F12 (Sigma D, 1 X NEAA (esansiyel olmayan amino asitler, lnvitrogen/Gibco BRL), 2 mM L- glutaminik asit ve gerçeklestirildi. Pasajlama her üç veya dört günde bir gerçeklestirildi ve embriyonik kök hücreler ayristirmama sivisi (%025 tripsin, 1 mg/ml kollaj enaz IV çözeltisi, fosfat tamponlu tuzlu suda 1 mM CaC12 içerir; tamami Invitrogen/Gibco-BRUden temin edilir) kullanarak besleyici tabakadan ayrildi, ardindan pipetleme ile küçük hücre kümelerine (yaklasik 50-100 hücrelik) ayristirildi ve sonra bir gün önce MEF ekimiyle olusturulmus besleyici tabaka üzerine ekildi.
Tekli hücrelere ayrisma sonrasinda insan embriyonik kök hücre kültürüne iliskin ROCK inhibitörünün hücre ölümünü inhibe edici etkisi ve klonlanma verimi üzerindeki etkisi asagida belirtilen sekilde incelendi. Yukarida belirtilen sekilde kültürlenmis insan embriyonik kök hücreleri besleyici tabakadan küçük hücre kümeleri seklinde ayrildi ve ayrica kontainine edici besleyici hücreler bir saat 37 °C7de ikame kültürü besiyerinde inkübe edilerek atilmak üzere bir hücresel adhezif kültür plakasinin (%01 jelatin kapli) alt kismina yapisti, burada embriyonik kök hücre kümeleri plakaya kuvvetli sekilde yapismaz kontamine edici besleyici hücreler ise kuvvetli sekilde yapisir. Embriyonik kök hücre kümeleri tripsin sindirimiyle (% tekli hücrelere ayristi ve düsük yogunlukta (0.15 ml besiyerinde 500 hücre/0.32 cm2) 96 kuyucuklu kültür plakalarinda bir MEF besleyici tabakasina ekildi. Olusan kolonilerin sayisi idame kültürü besiyerinde kültürden alti gün sonra sayildi. Hücrelerin besleyici tabakadan ayrilmasindan bir saat önce 10 HM konsantrasyonda ROCK inhibitörü Y-27632 eklendi ve ayni miktar ayrilmadan sonra ayni miktarda kültüre eklendi.
Ayni sekilde, klonlanma tesvigine insan embriyonik kök hücresi otokrin faktörünün neden olup olmayacagini degerlendirmek için insan embriyonik kök hücreleri klonal yogunlugunda (kuyucuk basina bir hücre) 96 kuyucuklu kültür plakalarinda benzer bir deney gerçeklestirildi ve klonlanma verimi belirlendi.
Alti gün kültür sonrasinda klonlama verimlilikleri (olusan koloni sayilarinin ekilen insan embriyonik kök hücresi baslangiç sayilarina oranlari) ROCK inhibitörü yoklugunda ve mevcudiyetinde sirasiyla %1 ve %27 oldu. ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutularak olusan kolonilerdeki hücreler farklilasmamis embriyonik kök hücre markörleri olan alkalin fosfatazi ve Oct3/45ü eksprese etti. Klonlama verimi açisindan ROCK inhibitörünün üstün etkisi insan embriyonik kök hücrelerinden sadece KhES-l ,de degil, KhES-2 ve KhES-Tte de dogrulandi.
Ayni sekilde, 96 kuyucuklu plakalarda klonal yogunlukta (kuyucuk basina bir hücre) insan embriyonik kök hücresi kullanildiginda, klonlama verimlilikleri ROCK inhibitörü yoklugunda ve mevcudiyetinde sirasiyla %1 ve %25”in altinda oldu. Dolayisiyla, klonlama verimi açisindan ROCK inhibitörünün sagladigi üstün etkinin insan embriyonik kök hücresinin otokrin faktörüne bagli olmadigi düsünüldü.
Dolayisiyla, ROCK inhibitörü Y-27632,nin insan embriyonik kök hücrelerin sagkalim oranini anlamli ölçüde iyilestirdigi bulundu.
Referans Örnek 2: Ayrismis Insan Embriyonik Kök Hücrelerinde Rho Etkinlesmesi Insan embriyonik kök hücrelerin idame kültürü Örnek l”de açiklanan sekilde küçük hücre kümelerinin pasajlanmasiyla gerçeklestirildi. Örnek 1'de açiklanan sekilde, insan embriyonik kök hücreleri tripsin sindirimi ile tekli hücrelere ayristirildi, idame kültürü için kültür besiyerinde süspanse edildi ve 37 °C°de sonrasinda santrifüjleme ile toplandi ve ardindan imalatçi firmanin talimatlarini izleyerek The small GTPase Activation Kit (Cytoskeleton Sirketi, Denver, CO) ile isleme tabi tutuldu ve Çekme usulü ile analiz edildi. Rho etkinlesmesi Western blotla etkinlesmis Rho'nun (GTP baglantili Rho) toplam Rho,ya oranindaki artislari esas alarak degerlendirildi. 10 cm,lik bir kültür plakasindan (yaklasik 1 x 106 hücre) bir parti olarak hücrelerden bir numune hazirlandi.
Insan embriyonik kök hücrelerin ayrismasindan/inkübasyonundan 15-30 dakika sonra bariz Rho etkinlesmesi görüldü.
Rho etkinlesmesi 30 dakika içinde yavas yavas azaldi.
Dolayisiyla, sonuçlar Y-27632'nin insan embriyonik kök hücrelere üstün etkisinin, Y- 27632°nin ROCK inhibisyonu etkisinin neden oldugu Rho etkinlesmesi inhibisyonuna bagli oldugunu göstermektedir.
Referans Örnek 3: Farkli Kinaz Inhibitörleriyle Idame Kültüründe Insan Embriyonik Kök Hücrelerin Koloni Olusturma Verimliligi Diger ROCK inhibitörlerinin idame kültüründe insan embriyonik kök hücrelerin klonlanma verimi üzerindeki etkileri Örnek 1”de açiklanan usulleri kullanarak incelendi. ROCK kinazlara iliskin inhibitörler referans olarak kullanildi. Baska kinazlara iliskin kullanilan inhibitörler protein kinaz A inhibitörleri olan cAMP-Rp (1-100uM) ve KT5720 (; protein kinaz C inhibitörleri olan bisindolilmaleimit (0.01-5uM) ve staurosporin (1-50nM); 50uM); ve bir MLCK inhibitörü olan ML-79dir (0.3-30uM).
ROCK inhibitörleri (Fasudil/HA1077 ve H-l 152) söz konusu oldugunda, inhibitörlerin olmadigi durumla karsilastirildiginda anlamli ölçüde artmis klonlanma verimlilikleri gözlemlendi ancak baska kinazlara iliskin inhibitörler söz konusu oldugunda artis gözlemlenmedi.
Dolayisiyla, ROCK inhibitörünün insan embriyonik kök hücrelerin sagkalim oranini spesifik olarak iyilestirebildigi bulundu.
Referans Örnek 4: Ayrisma/Reagregasyon Gösteren Insan ES Hücrelerinin Süspansiyon Kültüründe ROCK inhibitörü Ile Apoptozun Bastirilmasi Idame kültürüne tabi tutulan insan ES hücreleri Örnek lsdeki ile ayni tarzda besleyici hücrelerden küçük hücre kümeleri (agregatlar) seklinde ayrildi ve geriye kalan besleyici hücrelerin atilmasindan sonra tripsin sindirimi ile tekli hücrelere ayristirildi. Santrifüjleme sonrasinda 2><105 hücre serumsuz kültür besiyerinde farklilasma sonrasi indüksiyon için 2-merkaptoetanol takviye edildi, KSR %20 bir konsantrasyonda eklendi). Tekli ayrismis insan ES hücrelerine (1.0>< 105 hücre/ml) hücresiz adhezif 35 mm bir kültür plakasinda süspansiyon kültürü yapilarak agregatlar olusturuldu ve 2-6 gün ayni kültür besiyerinde kültürlendi (SFEB usulü; bakiniz yukaridaki Watanabe ve digerleri referansi). 2 gün kültür sonrasinda apoptik hücrelerin yüzdesi TUNEL usulüyle ölçüldü (MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct, MBL).
ROCK inhibitörü Y-27632 ile islem Örnek l°deki ile ayni tarzda hücre ayrilmasindan 1 saat önce baslatildi ve inhibitör de ayrisma sonrasinda idame kültürü besiyerine eklendi.
Karsilastirma amaciyla deneylerin gerçeklestirilmesinde apoptozu bastirici etkisi bildirilmis kaspaz inhibitörü (ZVAD; 10 uM) ve BDNF/NT-3/NT-4 (her birinden 50 ng/mlilik karisim) kullanildi. ilaveten, her örnekte 6. günde sagkalan hücrelerin sayisi sayildi.
Takviye edilmemis kontrolde, 2 gün kültür sonrasinda TUNEL usulüyle hücrelerin %80°inde apoptoz gözlemlendi. ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulan hücrelerde, hücrelerin sadece 3/NT-4 (her biri 50 ng/ml) takviyesi sirasiyla %72 ve %69 TUNEL pozitif hücre ortaya çikartti. Bu sonuçlar ROCK inhibitörünün kuvvetli hücre ölümünü bastirici etkinlige sahip oldugunu göstermektedir. Dolayisiyla, 6. günde sagkalan hücrelerin sayisi bakimindan ayristirma kültürünün basinda takviyesiz grupta %8 sagkalmis, ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulan grupta ise %70 sagkalmistir; yani daha fazla hücre sagkalmistir. Gerek kaspaz inhibitörü, gerek BDNF/NT-S/NT-4 ile isleme tabi tutulup sagkalan hücreler yayilan hücrelerin %10,undan azina karsilik gelir.
Yukarida açiklandigi gibi, ROCK inhibitörünün insan ES hücrelerinin sagkalim oranini bariz ölçüde iyilestirdigi kanitlanmistir.
Referans Örnek 5: Tekli Ayrismis Insan ES Hücrelerini Kullanarak SFEB Usulüyle N öronal Prekürsör Hücrelere ve Beyin Prekürsör Hücrelerine F arklilasma Indüksiyonu Idame kültürüne tabi tutulan insan ES hücreleri Ömek 49teki ile ayni tarzda besleyici hücrelerden küçük hücre kümeleri seklinde ayrildi ve geriye kalan besleyici hücrelerin atilmasindan sonra tripsin sindirimi ile tekli hücrelere ayristirildi. Santrifüjleme sonrasinda hücreler 2><105 hücre/mLide farklilasma indüksiyonu için kültür besiyeri içinde ayristirildi ve hücresiz bir adhezif kültür plakasi kullanarak süspansiyon kültürü yapildi, bu sekilde süspanse agregatlarda serumsuz kültür (SFEB usulü) gerçeklestirildi. Ilaveten, farklilasma indüksiyonu kültürünün baslamasindan sonraki ilk 10 gün Nodal inhibitör LeftyA (1 tig/ml, R&D), Wnt inhibitörü Dkkl ( eklendi. 16-35 gün serumsuz süspansiyon kültürü sonrasinda hücre agregatlari sabitlendi ve Iloresans antikor usulüyle immünoloj ik boyama yapildi. ROCK inhibitörü Y-27632 ile islem Örnek l°deki ile ayni tarzda hücre ayrilmasindan 1 saat önce baslatildi ve inhibitör yine ayrisma sonrasinda ilk alti gün idame kültürü besiyerine eklendi.
Beyin prekürsör hücrelerine farklilasma için SFEB kültürünün 25. gününde üstte yüzen hücre agregatlari poli-D-lizin/laminin/fibronektin kapli bir kültür lamina aktarildi ve 10 gün daha adezyon durumunda kültürlendi. Adezyon kültüründe, kültür besiyeri olarak B27 (A vitamini olmadan) ve 2 mM L-glutamin (her ikisi de Gibco-BRL°den temin edilir) ile takviye edilmis Farklilasma kültürünün baslamasindan sonra 20. günde ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulmus neredeyse tüm hücre agregatlarinda, nöronal prekürsör hücre markörleri olan nestin ve Pax6 için pozif olan hücreler eksprese oldu. Farklilasma kültürünün 24. gününde, bu pozitif hücrelerin sayisi artti ve hücrelerin yaklasik %80'i Pax6 pozitif hücrelere döndü. Öte yandan, farklilasmamis durum ES hücresi markörü, Oct3/4 pozitif hücreler %107dan aza karsilik geldi. F arklilasma kültürünün 35. gününde hücre agregatlarinin yaklasik %6091nda birçok beyin prekürsör markörü, Bfl pozitif hücre oldu. Bu durum insan ES hücrelerinin serebral sinir dokularini olusturdugunu göstermektedir. ROCK inhibitörü islemi olmadiginda farklilasma kültürünün 7. gününde çok az sagkalan hücre olmustur.
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulmamis hücrelerden çok azi 7 gün veya daha uzun sagkaldi ve anlamli ölçüde üstte yüzen hücre agregati olusumu gözlemlenmedi.
Dolayisiyla, ROCK inhibitörünün insan ES hücrelerinin farklilasma gücünü zayiflatmadigi ve ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulan insan hücrelerinin çok verimli sekilde farklilasabilecegi bulundu.10 Referans Örnek 6: ROCK Inhibitörü Ile Takviye Edilmis Besleyicisiz Kültürle Tekli Ayrismis Insan ES Hücreleri Kültürü ROCK inhibitörü isleminin besleyici hücreleri, örnegin fare embriyonik fibroblastini (MEF) kullanmadan yine besleyicisiz kültürle insan ES hücrelerinde tekli ayrisma kültürünü mümkün kilip kilmadigini kanitlamak için insan ES hücreleri literatürde bilinen usule göre MEF ile hazirlanan hücre disi matriste kültürlendi (Xu C-H ve digerleri, Nature Biotechnol., konflüens görülene dek kültürlenen MEF hücrelerine sadece hücre disi matrisi birakmak üzere deoksikolat usulüyle bir kültür tabaginda liziz yapildi. Tekli ayrismis insan ES hücreleri (96 kuyucuklu plakada 500 hücre/kuyucuk) MEF hücrelerinde yapilan rutin kültürle ayni usulle (yukarida bahsedilen Örnek) Y-2763 islemi (10 ”M veya 0 uM) altinda bunlarin üzerine ekildi. Içinde insan ES hücresi idame besiyeri ve MEFinin baslangiç olarak bir gün kültürlendigi kosullandirilmis besiyeri bir kültür besiyeri olarak kullanildi. 5 gün sonra olusan insan ES hücresi kolonilerinin sayisi sayildi.
Y-27632 ile isleme tabi tutulmus grupta ekilen insan ES hücresi basina yüksek klonlama verimi (%102) gözlemlendi. Öte yandan, Y-27632 ile isleme tabi tutulmamis grupta klonlama verimi %0.2°den daha az oldu. Y-27632 ile isleme tabi tutulmus grupta olusan koloniler farklilasmamis durum markörü, alkalin fosfataz için kuvvetle pozitif oldu. Bu bulgular ROCK inhibitörünün koloni olusumunu desteklemekte besleyici hücreler üzerinde degil, dogrudan insan ES hücreleri üzerinde bir etkisinin oldugunu göstermektedir. ilaveten, besleyici hücrelerle ortak kültür kullanilmadiginda bile, ROCK inhibitörünün sivi faktörler (örnegin, kosullandirilmis besiyerinde bulunan faktörler) mevcudiyetinde dogru sekilde hazirlanmis hücre disi matriste kültürlendiklerinde insan ES hücrelerinin tekli ayrisma kültürünü mümkün kildigi kanitlanmistir.
Referans Örnek 7: Kisa Süreli ROCK Inhibitörü Islemi Ile Tekli Ayrismis Insan ES Hücrelerinin Idame Kültürü Tekli ayrismis insan ES hücrelerinin idame kültürü söz konusu oldugunda, Y-27632inin ayrisma kültürünün erken evresinde hücre sagkallmini destekleyip desteklemedigini incelemek için Y-27632 islemi süresi asagida belirtilen üç gruba bölünerek idame kültüründe hücre sagkalimini destekleyici etkiler karsilastirildi.
Grup 1: Y-27632 islemi (10 uM, asagidaki ile ayni) 1 saatlik ön islem olarak ve insan ES hücrelerinin ayrisma kültürü sürecinde ayrisma sonrasinda kültürün sadece ilk 12 saatinde gerçeklestirildi.
Grup 2: Y-27632 islemi 1 saatlik ön islem olarak ve insan ES hücrelerinin ayrisma kültürü sürecinde ayrisma sonrasinda kültür süresinin tamaminda gerçeklestirildi.
Grup 3: Y-27632 islemi gerçeklestirilmedi.
Bu gruplarda, MEF tabakasinda idame kültürü sisteminde ekili hücre basina (6 kuyucuklu bir plakanin bir kuyucugu basina 5><104 hücre) 3. günde sagkalan hücrelerin sayimi yapildi.
Y-27632 islemi yapilmamis Grup 3,te 3. günde ekilen hücre toplaminin en fazla %1 ,i sagkaldi. Ayrisma sonrasinda Y-27632 ile 12 saat isleme tabi tutulan Grup 1'de ekilen hücrelerin %270”i sayildi; Y-27632 ile kesintisiz isleme tabi tutulmus Grup 2°de ekilen hücrelerin %290& sayildi. Bu sonuçlar, adezyon kültürüyle insan ES hücrelerinin idame kültüründe ayrisma kültürünün baslamasindan sonraki ilk yarim gün içinde Y-27632 isleminin yeterince yüksek destekleyici etkiye sahip oldugunu göstermektedir.
Referans Örnek 8: Insan ES Hücrelerinin Idame Kültüründe ROCK Inhibitörü Islemi Ile Hücre Büyümesini Destekleyici Etkinlik Yukarida Örnek 7'de verilenle ayni deneyde, ayrisina kültürünün baslamasi sonrasinda 6 gün Y-27632,nin hücre büyümesi üzerindeki etkisi kültür süresini 6 güne uzatarak Grup 1 ve 2ide incelendi. 6. günde hücrelerin sayisi Grup 1 ve 2ide baslangiçta ekilen hücre sayisinin sirasiyla sirasinda hücre sayisina dayanan popülasyonun iki katina çikma süresi Grup 1 için 49.0 saat ve Grup 2 için 41.5 saat oldu; iki katina çikma süresi Grup 2,de yarisina kisaldi. Grup 1 ve 27nin her ikisinde de, 3. ve 5. günde apoptoz yüzdesi (etkin Kaspaz 3 pozitif hücre sayisi) hücre t0plaminin %1 ,inden daha az oldu. Bu sonuçlar, ayrisma kültürünün baslamasindan hemen sonra Y-276329nin hücre sagkalimini destekleyici etkinlige ilaveten bundan sonra sagkalan hücrelerde hücre büyümesini destekleyici etkinlige de sahip oldugunu göstermektedir.
Dolayisiyla, kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmektedir ve bulusta buna iliskin kültür usulleri ve besiyerleri saglanmaktadir.

Claims (10)

    ISTEMLER
  1. l. Pluripotent insan kök hücrelerinin kültürlenmesi için bir usul olup, kök hücrelerin bir ROCK (Rho-kinaz) inhibitörü ile isleme tabi tutulmasini içerir.
  2. 2. Istem lideki usul olup, burada kök hücreler ayrismistir.
  3. 3. Istem 27deki usul olup, burada kök hücreler tekli kök hücrelerdir veya agregat halinde kök hücrelerdir.
  4. 4. Önceki istemlerin herhangi birindeki usul olup, burada kök hücreler adherent kültürde veya süspansiyon kültüründe kültürlenir.
  5. 5. Gelismis bir sagkalim oranina ve/veya proliferasyon gücüne sahip bir kök hücreden veya gelismis bir farklilasma etkinligine sahip bir kök hücreden, farklilasmis bir hücrenin üretilmesi için bir usul olup, söz konusu usul bir pluripotent insan kök hücresinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içerir.
  6. 6. Istem 1 ila 53ten herhangi birindeki gibi bir usul olup, burada ROCK inhibitörü Y-27632, Fasudil veya H-11527dir.
  7. 7. Bir pluripotent insan kök hücresi ve bir ROCK inhibitörü içeren bir hücre preparasyonu.
  8. 8. Istem Tdeki gibi bir hücre preparasyonu olup, burada kök hücre ayrismistir.
  9. 9. Istem 7 veya 8,deki gibi bir hücre preparasyonu olup, burada ROCK inhibitörü Y-27632, Fasudil veya H-l 152idir.
  10. 10. Bir ROCK inhibitörünün (i) bir pluripotent insan kök hücresi kültüründe klonlama veriminin veya pasajlama veriminin desteklenmesinde ve/Veya iyilestirilmesinde, (ii) bir pluripotent insan kök hücresi kültüründe koloni olusumunun desteklenmesinde ve/Veya iyilestirilmesinde ve/Veya (iii) bir kültürde pluripotent insan kök hücrelerinin sagkaliminin desteklenmesinde ve/Veya iyilestirilmesinde kullanimi.
TR2018/09759T 2006-09-22 2007-09-24 Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. TR201809759T4 (tr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006257780 2006-09-22
JP2007118183A JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2007-04-27 幹細胞の培養方法
GBGB0710095.1A GB0710095D0 (en) 2006-09-22 2007-05-25 Culture method of stem cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809759T4 true TR201809759T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=38265386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09759T TR201809759T4 (tr) 2006-09-22 2007-09-24 Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü.

Country Status (12)

Country Link
US (3) US20100009442A1 (tr)
EP (1) EP2066786B1 (tr)
JP (3) JP2008099662A (tr)
AU (1) AU2007298734B2 (tr)
CA (1) CA2663978A1 (tr)
DK (1) DK2066786T3 (tr)
ES (1) ES2677319T3 (tr)
GB (2) GB0710095D0 (tr)
IL (1) IL197684A0 (tr)
RU (1) RU2009115186A (tr)
TR (1) TR201809759T4 (tr)
WO (1) WO2008035110A1 (tr)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
PL1888123T3 (pl) 2005-06-08 2013-06-28 Janssen Biotech Inc Terapia komórkowa chorób degeneracyjnych oka
US8129187B2 (en) 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
EP2208786B1 (en) 2005-12-13 2018-08-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008089351A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Improved culture of stem cells
US9213999B2 (en) 2007-06-15 2015-12-15 Kyoto University Providing iPSCs to a customer
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
EP2185693B1 (en) 2007-07-31 2019-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
ES2581990T3 (es) 2007-11-09 2016-09-08 Rnl Bio Co., Ltd. Método para el aislamiento y cultivo de células madre adultas derivadas del epitelio amniótico humano
EP2229434B1 (en) 2007-11-27 2011-09-07 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2959401C (en) * 2008-02-21 2021-12-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
CA2695522C (en) 2008-05-02 2019-01-15 Kyoto University Method of nuclear reprogramming
US10227563B2 (en) 2008-06-06 2019-03-12 Riken Method for culture of stem cell
EP2310492B1 (en) 2008-06-30 2015-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US9012218B2 (en) 2008-10-31 2015-04-21 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
US8895300B2 (en) * 2008-11-04 2014-11-25 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
AU2009316583B2 (en) * 2008-11-20 2016-04-21 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
RU2555538C2 (ru) * 2008-11-20 2015-07-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях
WO2010096496A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
EP2398897B1 (en) * 2009-02-20 2017-06-28 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for the differentiation of stem cells
CA2753679C (en) * 2009-02-27 2021-03-02 Cellular Dynamics International, Inc. Differentiation of pluripotent cells
US9150829B2 (en) 2009-03-20 2015-10-06 Agency For Science, Technoloy And Research Culture of pluripotent and multipotent cells on microcarriers
GB2485113B (en) 2009-07-20 2016-12-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage
CN102482640B (zh) 2009-07-20 2015-03-11 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
BR112012001480A2 (pt) 2009-07-20 2015-09-01 Janssen Biotech Inc Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas
EP2464723B1 (en) 2009-08-12 2016-06-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells
US11261425B2 (en) 2009-08-12 2022-03-01 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells
CA3091210C (en) * 2009-10-16 2023-04-04 The Scripps Research Institute Induction of pluripotent cells
AU2010315712B2 (en) 2009-10-19 2014-04-17 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Cardiomyocyte production
EP2496688B1 (en) 2009-11-05 2016-12-28 Riken A method for differentiation induction in cultured stem cells
WO2011063005A2 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Advanced Cell Technology, Inc. Methods of producing human rpe cells and pharmaceutical preparations of human rpe cells
JP5807862B2 (ja) 2009-12-01 2015-11-10 国立研究開発法人国立がん研究センター ラット胚性幹細胞を用いたキメララットの作製法
US9150833B2 (en) 2009-12-23 2015-10-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2664864C1 (ru) 2009-12-23 2018-08-23 Янссен Байотек, Инк. Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы
WO2011109279A2 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
AU2011250651B2 (en) * 2010-05-05 2015-10-08 Genea Ip Holdings Pty Limited Media and methods for cell culture
CN102884176B (zh) 2010-05-12 2017-09-05 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
US8932857B2 (en) * 2010-06-15 2015-01-13 Kyoto University Method for selecting reduced differentiation resistance human induced pluripotent stem cells
CN103052707A (zh) 2010-07-30 2013-04-17 剑桥实业有限公司 人类多能细胞的皮层生成
US9279107B2 (en) 2010-08-05 2016-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
RU2576000C2 (ru) * 2010-08-09 2016-02-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения клеток, продуцирующих панкреатические гормоны
PL2611910T3 (pl) 2010-08-31 2018-06-29 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
PL2611909T3 (pl) 2010-08-31 2018-05-30 Janssen Biotech, Inc Zróżnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
RU2673946C1 (ru) 2010-08-31 2018-12-03 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
US9181529B2 (en) 2010-10-19 2015-11-10 Cellular Dynamics International, Inc. Titration of differentiation medium components
AU2011328087A1 (en) 2010-11-09 2013-06-06 Lonza Cologne Gmbh Method for controlling binding of cells to a substrate
WO2012087965A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Fate Therapauetics, Inc. Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of ipscs
KR101293637B1 (ko) 2011-01-14 2013-08-13 서울대학교병원 줄기세포의 부유배양용 조성물
PT105484A (pt) 2011-01-14 2012-07-16 Univ Nova De Lisboa Um método de ambientómica funcional para engenharia de meio de cultura celular
WO2012135621A2 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Cellular Dynamics International. Inc Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
CN107142237B (zh) * 2011-05-17 2021-03-02 深圳涌泰生物科技有限公司 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法
AU2012326137B2 (en) 2011-10-17 2018-11-29 Minerva Biotechnologies Corporation Media for stem cell proliferation and induction
EP3530730B1 (en) 2011-10-31 2022-07-20 Riken Method for culturing stem cell
PT2773748T (pt) 2011-11-04 2020-03-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Neurónios dopaminérgicos (da) do mesencéfalo para enxerto
BR112014015417A8 (pt) 2011-12-22 2017-07-04 Janssen Biotech Inc diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas
AU2013230020B2 (en) 2012-03-07 2018-08-09 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
CN104334719B (zh) 2012-06-08 2018-02-13 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
US10487310B2 (en) 2012-06-08 2019-11-26 Riken Vessel for culturing human ES cells
EP2877586A4 (en) * 2012-07-24 2016-02-17 Minerva Biotechnologies Corp NME VARIANTS SPECIAL EXPRESSION AND SUPPRESSION
AU2013248265B2 (en) * 2012-11-08 2018-11-01 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
US10370644B2 (en) * 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
MX2015008619A (es) * 2012-12-31 2016-01-12 Janssen Biotech Inc Suspension y agrupamiento de celulas humanas pluripotentes para la diferenciacion a celulas endocrinas pancreaticas.
RU2018116647A (ru) 2012-12-31 2018-10-24 Янссен Байотек, Инк. Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
WO2014131033A1 (en) * 2013-02-25 2014-08-28 Genentech, Inc. Liquid culturing of epithelial stem cells
EP2970900A4 (en) * 2013-03-15 2017-01-04 The Broad Institute, Inc. Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof
WO2014176606A1 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Memorial Sloan-Kettering Center Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
JP6546089B2 (ja) 2013-08-06 2019-07-17 国立研究開発法人理化学研究所 前眼部組織の製造方法
CN106103702B (zh) 2013-11-22 2020-03-24 国立研究开发法人理化学研究所 制备端脑或其前体组织的方法
JP6366944B2 (ja) * 2014-01-24 2018-08-01 国立大学法人 東京大学 プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法並びにそのための組成物および組合せ
JP6422221B2 (ja) * 2014-03-04 2018-11-14 旭化成株式会社 多能性幹細胞からなる細胞塊製造方法
PT3114214T (pt) 2014-03-04 2024-01-03 Fate Therapeutics Inc Métodos de reprogramação melhorados e plataformas de cultura celular
RU2694311C2 (ru) 2014-05-16 2019-07-11 Янссен Байотек, Инк. Применение малых молекул для увеличения экспрессии mafa в панкреатических эндокринных клетках
EP3112454B1 (en) 2014-05-22 2018-02-14 Sumitomo Bakelite Co.,Ltd. Cell mass culture vessel
US10760047B2 (en) 2014-07-25 2020-09-01 Riken Method for producing adenohypophysis or precursor tissue thereof
CN107075472A (zh) * 2014-08-22 2017-08-18 剑桥企业有限公司 重置多能干细胞
KR102604999B1 (ko) 2014-09-08 2023-11-23 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 소뇌 선구체 조직의 제조 방법
JP6421374B2 (ja) * 2014-09-30 2018-11-14 株式会社ジェイテックコーポレーション 万能性幹細胞の培養方法
WO2016063986A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法
MY191740A (en) 2014-10-24 2022-07-13 Sumitomo Chemical Co Production method for nerve tissue
WO2016121737A1 (ja) * 2015-01-29 2016-08-04 株式会社カネカ 細胞凝集塊の作製方法
JP6962814B2 (ja) * 2015-02-27 2021-11-05 ロート製薬株式会社 間葉系幹細胞培養用培地、間葉系幹細胞の培養方法及び間葉系幹細胞
US10246679B2 (en) 2015-03-02 2019-04-02 The University Of Tokyo Method for producing pluripotent stem cell having improved chimera forming ability from primed pluripotent stem cell, and composition and combination therefor
US10384207B2 (en) 2015-07-21 2019-08-20 Neuro Probe Incorporated Assay apparatus and methods
US11441126B2 (en) 2015-10-16 2022-09-13 Fate Therapeutics, Inc. Platform for the induction and maintenance of ground state pluripotency
EP3418374A4 (en) * 2016-02-16 2020-01-01 Keio University CULTURE MEDIUM FOR USE IN THE DIFFERENTIATION OF A PLURIPOTENT STEM CELL FROM A NEURAL STEM CELL, AND ASSOCIATED USE
JP6754966B2 (ja) * 2016-02-25 2020-09-16 国立大学法人広島大学 始原生殖細胞の培養方法及び始原生殖細胞の培養用培地添加物
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
EP3447129B1 (en) 2016-04-22 2022-07-20 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method for producing retinal tissue
MX2020005668A (es) 2017-11-30 2020-11-24 Univ Kyoto Metodo de cultivo de celulas.
WO2019199881A1 (en) * 2018-04-09 2019-10-17 Cedars-Sinai Medical Center Methods for in vitro expansion of adult tissue stem cells
US20210348119A1 (en) * 2018-10-11 2021-11-11 The United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Compositions and methods for cell culture
CN114174497B (zh) * 2019-07-05 2024-03-01 诺和诺德股份有限公司 衍生自人类多能干细胞的神经干细胞系的生成
EP4092104A4 (en) 2020-01-14 2024-03-06 Ajinomoto Co., Inc. MEDIUM WITH REDUCED OSMOTIC PRESSURE
CN115003791A (zh) 2020-01-14 2022-09-02 味之素株式会社 细胞培养用培养基组合物
CA3167733A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Ajinomoto Co., Inc. High-density cell culture method
CN114981411A (zh) 2020-01-14 2022-08-30 味之素株式会社 细胞的培养方法
WO2021201175A1 (ja) 2020-03-31 2021-10-07 学校法人藤田学園 下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離法
EP4144830A4 (en) * 2020-04-30 2024-06-12 Oriental Yeast Co., Ltd. STEM CELL MEDIUM AND STEM CELL CULTIVATION METHODS
EP4357449A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Kyoto University Method for producing cerebral cortical cell preparation derived from human pluripotent stem cells
JPWO2023054325A1 (tr) 2021-09-28 2023-04-06
CA3238664A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Riken Production method for sheet-like retinal tissue
CN114480268B (zh) * 2022-01-21 2024-01-30 深圳市茵冠生物科技有限公司 人脐带间充质干细胞的制备方法
CN114736302B (zh) * 2022-05-12 2022-10-25 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种干细胞无血清培养基

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2272839C2 (ru) 1998-11-09 2006-03-27 Консорцио Пер Ла Джестионе Дель Чентро Ди Биотекнолоджие Аванцате Бессывороточная среда для культуры клеток, используемых для реконструкции костных и хрящевых сегментов (варианты)
US20030232430A1 (en) * 2001-11-26 2003-12-18 Advanced Cell Technology Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells
WO2006019366A1 (en) * 2003-03-28 2006-02-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Physiochemical culture conditions for embryonic stem cells
CA2556589A1 (en) * 2004-02-24 2005-09-01 Bioaxone Therapeutique Inc. 4-substituted piperidine derivatives
JP4576545B2 (ja) * 2004-05-27 2010-11-10 独立行政法人理化学研究所 羊膜由来因子による胚性幹細胞の培養方法
US8492147B2 (en) 2004-06-18 2013-07-23 Riken Method of inducing the differentiation of embryonic stem cells into nerve by serum-free suspension culture
EP1827458A4 (en) * 2004-11-09 2010-02-17 Baylor College Medicine SELECTIVE INHIBITION OF ROCK 1 IN CARDIAC THERAPY
CA2643478C (en) * 2006-02-23 2019-06-18 Novocell, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
KR20150142061A (ko) 2006-05-03 2015-12-21 오카타 세라퓨틱스, 인크. 배아 줄기 세포 및 배-유도 세포의 유도
JP2008099662A (ja) * 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008089351A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Improved culture of stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
JP5721111B2 (ja) 2015-05-20
JP2013099345A (ja) 2013-05-23
GB2446525A (en) 2008-08-13
EP2066786A1 (en) 2009-06-10
GB0710095D0 (en) 2007-07-04
GB2446525B (en) 2009-03-04
US20200239838A1 (en) 2020-07-30
WO2008035110A1 (en) 2008-03-27
JP2008099662A (ja) 2008-05-01
US11898161B2 (en) 2024-02-13
US20100009442A1 (en) 2010-01-14
RU2009115186A (ru) 2010-10-27
US10626366B2 (en) 2020-04-21
AU2007298734A1 (en) 2008-03-27
JP2010504090A (ja) 2010-02-12
US20170029771A1 (en) 2017-02-02
AU2007298734B2 (en) 2013-09-26
DK2066786T3 (en) 2018-07-23
EP2066786B1 (en) 2018-05-02
ES2677319T3 (es) 2018-08-01
IL197684A0 (en) 2011-08-01
GB0804056D0 (en) 2008-04-09
CA2663978A1 (en) 2008-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201809759T4 (tr) Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü.
US11560546B2 (en) Methods for neural conversion of human embryonic stem cells
AU2021225187B2 (en) Methods for differentiating pluripotent cells
EP3119881B1 (en) Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
DK2694644T3 (en) Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
EP2314671B1 (en) Method for culture of stem cell
JP5128946B2 (ja) 胚性幹細胞のフィーダー非依存性長期培養
US10087417B2 (en) Three-dimensional model of human cortex
JPWO2016013669A1 (ja) 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法