TR201809759T4 - Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. - Google Patents
Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201809759T4 TR201809759T4 TR2018/09759T TR201809759T TR201809759T4 TR 201809759 T4 TR201809759 T4 TR 201809759T4 TR 2018/09759 T TR2018/09759 T TR 2018/09759T TR 201809759 T TR201809759 T TR 201809759T TR 201809759 T4 TR201809759 T4 TR 201809759T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- cells
- culture
- cell
- stem cells
- stem
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 288
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 114
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims description 95
- IYOZTVGMEWJPKR-IJLUTSLNSA-N Y-27632 Chemical group C1C[C@@H]([C@H](N)C)CC[C@@H]1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IYOZTVGMEWJPKR-IJLUTSLNSA-N 0.000 claims description 40
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 29
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 23
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 claims description 12
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 claims description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 9
- AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N (S)-2-methyl-1-(4-methylisoquinoline-5-sulfonyl)-1,4-diazepane Chemical compound C[C@H]1CNCCCN1S(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC(C)=C12 AWDORCFLUJZUQS-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 102100027609 Rho-related GTP-binding protein RhoD Human genes 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 10
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 9
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 8
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 7
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 7
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 7
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 3
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 101000844802 Lacticaseibacillus rhamnosus Teichoic acid D-alanyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- -1 combination (eg Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- DQYBRTASHMYDJG-UHFFFAOYSA-N Bisindolylmaleimide Chemical compound C1=CC=C2C(C=3C(=O)NC(C=3C=3C4=CC=CC=C4NC=3)=O)=CNC2=C1 DQYBRTASHMYDJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 description 2
- 229940123169 Caspase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 102000006757 Wnt Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010047118 Wnt Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000005403 Casein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010031425 Casein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101000731000 Homo sapiens Membrane-associated progesterone receptor component 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 102100032399 Membrane-associated progesterone receptor component 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 102100035044 Myosin light chain kinase, smooth muscle Human genes 0.000 description 1
- 101710198035 Myosin light chain kinase, smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 101150111110 NKX2-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 229940123924 Protein kinase C inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000019892 Stellar Nutrition 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- ZAVGJDAFCZAWSZ-UHFFFAOYSA-N hydroxyfasudil Chemical compound C1=CC=C2C(O)=NC=CC2=C1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 ZAVGJDAFCZAWSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000003881 protein kinase C inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 description 1
- 108060007624 small GTPase Proteins 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 1
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Mevcut buluş kök hücrelerin, örneğin embriyonik kök hücrelerin (ES hücreleri) kültürlenmesi için bir usule, bu tür kök hücrelerin kültürü için bir besiyerine ve bunların kullanımlarına ilişkindir.
Description
TARIFNAME
KÖK HÜCRE KÜLTÜRÜ BESIYERI VE USULÜ
Mevcut bulusta kök hücrelerin, örnegin embriyonik kök hücrelerin (ES hücreleri)
kültürlenmesi için bir usul, bu tür kök hücrelerin kültürü için bir besiyeri ve bunlarin
kullanimlari saglanmaktadir.
ES hücreleri merkezi sinir hastaligina, örnegin Parkinson hastaligina ve diyabete iliskin hücre
transplantlarinda hücre kaynagi olarak kuvvetli bir aday saglar. ES hücrelerinin
inceleninesinde günümüzde yaygin olarak fare ES hücresi kullanilmaktadir ancak klinik
uygulamalar dikkate alindiginda arastirma ve gelistirmenin insan ES hücrelerini kullanmadan
gerçeklestirilmesi gereklidir. Ancak hücre kültüründe insan ES hücreleri fare ES hücrelerine
göre daha kolay hücre ölümüne maruz kalir.
Örnegin, idame kültüründe insan ES hücrelerinin alt kültüründe, hücre agregatlari enzim
islemi veya mekanik ayirma ile besleyici hücrelerden veya substratlardan ayrilir ayrilmaz
süspanse olur, küçük hücre agregatlarina pipetleyerek ayrilir ve sonra yeni bir kültür plakasina
ekilirler. Bununla birlikte, insan ES hücreleri yaygin hücre soylari ve fare ES hücreleri ile
karsilastirildiginda zayif düzeyde ayrilmaya ve ayrismaya tabi olur ve hücrelerin çogu
sagkalmaz. Insan ES hücrelerinin çok yavas bölünmesi ve kolaylikla farklilasmasi nedeniyle
insan ES hücrelerinin farklilasmamis özellikleri koruyarak kültürlenmesi için çok fazla zaman
ve isgücü gereklidir ve çogaltilabilir sonuçlar elde etmek için teknik egitim gereklidir. Ayrica,
insan ES hücrelerini kullanarak arastirma ve gelistirme yapilmasinin engelleyen bir husus alt
kültürde hücre ölümü nedeniyle toplama oraninin azalmasidir. Ayrica, insan ES hücrelerinin
genetik mühendislik islemleriyle klonlanmasi istense de, insan ES hücreleri tekli hücrelere
homojen olarak ayristiginda çok kolay bir sekilde hücre ölümü ve büyümenin durmasi ortaya
çikar ve sonuç olarak insan ES hücrelerinde klonlama veriminin %1 veya daha az oldugu
düsünülür.
Ayrica, insan ES hücrelerinin farklilastirilmasi için bu hücreler besleyici hücrelerden ayrilir,
küçük hücre agregatlari veya tekli hücreler seklinde ayristirilir, daha sonra bir substrat veya
özel besleyici hücreler üzerine yayilir ve farklilasmayi indükleyici besiyeri içinde
kültürlenirler. Bu islemin verimliligi çok düsüktür. Ayrica, embriyoid bir kültür usulünde,
Iliskin Serumsuz Yüzdürmeli Kültür) usulünde, hücrelerin bir kez tekli hücrelere ayrismasi ve
hücre agregatlarinin olusmasi gereklidir ancak bu tür bir metodoloji insan ES hücrelerine
uygulandiginda çok sayida hücre ölmektedir. Ayrica, insan ES hücreleri söz konusu
oldugunda, tamamen tekli ayrismis olmasalar bile (küçük hücre agregatlarindan kültürleme
durumunda) hücrelerin yüksek siklikta ölmeleri nedeniyle (F risch ve digerleri, Curr. Opin.
kültürlenmesi için iyilestirilmis metodoloji gelistirilmesi istenmektedir.
Rho baglantili sarilmis sarmal kinaz (ROCK:GenBank erisim NO:NM_005406) Rho
GTPaz°1n ana efektör moleküllerinden biridir ve damar tikanmasi ve sinir aksonu uzanimi
gibi fizyolojik fenomenleri denetledigi bilinmektedir (Riento ve digerleri, Nat. Rev. Mol.
Hücre ölümünün ROCK inhibisyonu tarafindan denetlendigine iliskin çesitli bildiriler
hizlandirdigina iliskin bildiriler de vardir (Rattan ve digerleri, J. Neurosci Res. 83, 243-255
düzenlenmesinde Rho/ROCKhin rolü henüz belirleninemistir (Riento ve digerleri, Nat. Rev.
CoClz'nin mezenkimal kök hücrelerin nöronlara farklilasmasini indükledigi ve ROCK
inhibisyonunun bu etkiyi güçlendirdigi bilinmektedir. Bununla birlikte, kök hücrelerin,
Örnegin ES hücrelerinin bir ROCK inhibitörü içeren besiyerinde kültürüne iliskin bildirim
yoktur.
Fukushima ve digerleri, Hepatology, Cilt 38, sayfa 562, 2003 referansinda bir ROCK
inhibitörü olan hidroksifasudilin siçan hepatik yildizsi hücrelerinde hücre büyümesini ve
kollajen üretimini baskiladigi bildirilmektedir. Laplante ve digerleri, Journal of Neurobiology,
hücrelerin nörodeterminasyonu sirasinda hücre-hücre temasini ve N-Cadezin protein
seviyesini düzenledikleri bildirilmektedir.
inhibe eden ve bir nükleik asit, polipeptit, peptit veya bunlarin karisimini içeren bir maddenin
verilmesiyle apoptozun önlenmesine veya geciktirilmesine iliskin bir usul açiklanmaktadir.
Özel olarak bu tür bir maddenin verilmesiyle kalp yetmezligi tedavisi öne sürülmektedir.
Mevcut bulusun bir amaci ES hücreleri gibi kök hücrelerin kültürlenmesi için etkili bir yeni
metodoloji ve yeni besiyeri saglamaktir.
Mevcut bulusun sahipleri kapsamli çalismalar yapmis ve bunun sonucunda bir kök hücrenin,
örnegin pluripotent bir kök hücrenin, bilhassa bir ES hücresinin sagkalim oraninin,
proliferasyon gücünün ve/veya farklilasma etkinliginin kök hücrenin bir ROCK inhibitörü
içeren bir kültür besiyerinde kültürlenmesiyle iyilestirilebilecegini bulmuslardir.
Dolayisiyla mevcut bulusta asagida siralananlar saglanmaktadir:-
hücrelerin bir ROCK (Rho-kinaz) inhibitörü ile isleme tabi tutulmasini içerir.
haline gelmis kök hücrelerdir (yani bir hücre kümesi olusturmus hücrelerdir).
adherent (yüzeye tutunan) kültürde veya süspansiyon kültüründe kültürlenir.
hücreden veya gelismis farklilasma etkinligine sahip bir kök hücreden bir farklilasmis
hücrenin üretilmesi için bir usul, söz konusu usul bir pluripotent insan kök hücresinin
bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içerir.
inhibitörü Y-27632, Fasudil veya H-l 152,dir.
preparasyonu.
burada ROCK inhibitörü Y027632, Fasudil veya H-l 152°dir.
klonlama veriminin veya pasajlama veriminin desteklenmesinde ve/veya
iyilestirilmesinde, (ii) bir pluripotent insan kök hücresi kültüründe koloni olusumunun
desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde ve/veya (iii) bir kültürde pluripotent insan
kök hücrelerinin sagkaliminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi.
27632, Fasudil veya H-1152idir.
Dolayisiyla yukarida geçen düzenlemeler bir pluripotent insan kök hücresi kültürü usulünü
içermekte olup, söz konusu usul kök hücrenin bir ROCK inhibitörü içeren bir kültür
besiyerinde ve bir ROCK inhibitörü içeren bir pluripotent insan kök hücre kültürü besiyeri
içinde tutulinasini içerir.
Baska yönleri itibariyla bulusta, pluripotent insan kök hücrelerinin klonlama verimini veya
pasajlama verimini destekleyecek sekilde kültürlenmesine yönelik ve kök hücrelerin bir
ROCK inhibitörü içeren bir kültür besiyerinde kültürlenmesini içeren bir usul; bir kök hücre
kültüründe koloni olusuinunu destekleyen ve pluripotent insan kök hücrelerinin bir ROCK
inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içeren bir usul; ve bir kök hücre kültüründe
klonlama verimini veya pasajlama verimini iyilestirmek için pluripotent insan kök
hücrelerinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içeren bir usul
saglanmaktadir.
Bulusun tercih edilen düzenlemelerinde, kök hücreler besleyici hücreler, besleyici hücre
ekstreleri ve/veya serumu olinadan kültürlenir. Kök hücreler alt klonlaina veya pasajlama
öncesinde, örnegin alt klonlama veya pasajlamadan en az bir saat önce bir ROCK inhibitörü
mevcudiyetinde kültürlenebilir. Alternatif olarak veya ilaveten, kök hücreler alt klonlama
veya pasajlama sonrasinda bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde tutulabilir. Tercih edilen
düzenlemelerde, kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde en az yaklasik 12 saat,
daha tercihen en az yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün tutulur. Baska düzenlemelerde,
kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde en az bir ila bes pasaj tutulur.
Bulusun bazi düzenlemelerinde, daha sonra ROCK inhibitörü örnegin yaklasik 12 saat sonra
veya yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün sonra kültür besiyerinden geri çekilir. Baska
düzenlemelerde, ROCK inhibitörü en az bir ila bes pasaj sonra geri çekilir.
Bulusun bir baska yönü itibariyla pluripotent insan kök hücrelerinin bir kültür içinde
sagkaliminin iyilestirilmesi için bir usul saglanmakta olup, söz konusu usul kök hücrelerin bir
ROCK inhibitörü ile temas ettirilmesini veya kök hücrelerin bir ROCK inhibitörüne maruz
birakilmasini içerir. Bulusun bu yönüne ait usuller, özellikle kültürün süspansiyon içinde
ayrismis kök hücreleri veya kök hücre agregatlarini içermesi durumunda hücre sagkaliminin
iyilestirilmesi bakimindan uygundur. Bu usuller özellikle kültür hücreleri burada açiklanan
örnek hücre yogunluklari da dahil olmak üzere düsük yogunlukta içerdiginde veya kültür kök
hücreleri klonal yogunlukta içerdiginde kullanislidir. Tercihen, kök hücreler bir ROCK
inhibitörü mevcudiyetinde en az yaklasik 12 saat, daha tercihen en az yaklasik 2, yaklasik 4
veya yaklasik 6 gün veya en az bir ila bes pasaj korunur. Istege bagli olarak, daha sonra
ROCK inhibitörü, örnegin yaklasik 12 saat sonra, yaklasik 2, yaklasik 4 veya yaklasik 6 gün
sonra veya en az bir ila bes pasaj sonra kültür besiyerinden geri çekilir. Bulusa ait bir ilave
usul kök hücrelerin aktarilmasina iliskin bir usul olup, söz konusu usul kök hücrelerin bir
ROCK inhibitörü içeren bir besiyeri içine aktarilmasini içerir.
Takdir edilecegi üzere bulusa ait usuller burada açiklanan uygun herhangi bir ROCK
inhibitörünü kullanarak gerçeklestirilebilecektir. Tercih edilen ROCK inhibitörleri Y-27632,
Fasudil ve H-l 152,dir.
Usuller pluripotent insan kök hücrelerinin ayristirildigi veya düsük yogunluklarda
kültürlendigi her durumda avantajli sekilde kullanilabilir. Bulusun kullaniminda, kök hücreler
düsük hücre ölümüyle birlikte farklilasmamis bir halde korunur. Dolayisiyla, usuller
dokulardan kök hücrelerin elde edilmesini iyilestirmekte kullanilabilir.
Usuller pluripotent insan kök hücrelerinin genetik modifikasyonu baglaminda da, özellikle
belirtmek gerekirse genetik modifikasyon uygulanmis kök hücrelerin klonal
popülasyonlarinin ayristirilmasinda da kullanislidir. Insan ES hücrelerinin transfekte olmus
bir p0pülasy0nu asagidakileri içeren bir usulle elde edilebilir:-
- ES hücrelerinin seçilebilir bir markörü kodlayan bir yapi ile transfekte edilmesi;
- ES hücrelerinin kaplanmasi;
- ES hücrelerinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesi; ve
- seçilebilir markörü eksprese eden hücrelerin seçilmesi.
ROCK inhibitörü kültür besiyerinde seçilebilir markörü eksprese eden hücreleri seçme
uygulamasi öncesinde ve/veya sonrasinda mevcut olabilir. Özellikle düsük kök hücre
yogunluklarinin etkilerine karsi koyinak için seçilebilir inarkör besiyerinde mevcut belli
seçim maddelerine direnç (örnegin antibiyotik direnci) katiyorsa ROCK inhibitörünün seçim
sirasinda mevcut olmasi tercih edilir. Istege bagli olarak usul bir ROCK inhibitörü
mevcudiyetinde seçilebilir markörü ekSprese eden ES hücrelerinin alt klonlanmasi, bu sekilde
kök hücre büyümesinin ve/veya koloni olusumunun desteklenmesi ve/veya kök hücrelerin
sagkaliminin iyilestirilmesi asamasini içerir .
Insan pluripotent kök hücreleri için bir kültür besiyeri imalatinda bir ROCK inhibitörü
kullanilabilir . Kültür besiyeri burada açiklanan herhangi bir besiyeri olabilir veya burada
açiklanan besiyeri bilesenlerinin bir kombinasyonunu veya birini veya daha fazlasini
içerebilir. Besiyeri, insan ve fare kök hücreleri, Örnegin ES hücreleri dahil olmak üzere burada
açiklanan herhangi bir kök hücre türünün kültür edilmesi için uygun olacak sekilde formüle
edilebilir.
Serum ve serum özütü bulundurmayan ve bazal besiyeri; bir ROCK inhibitörü; ve istege bagli
olarak insülin, insülin büyüme faktörü ve bir demir tasiyicidan birini veya daha fazlasini
içeren bir hücre kültürü besiyeri de açiklanmaktadir. Burada açiklanan örnek besiyeri ve
demir tasiyicilar dahil uygun bazal besiyeri ve demir tasiyicilar (örnegin transferrin) teknikte
uzman olanlarca kolaylikla saglanir.
Mevcut bulusun ilave yönleri bir ROCK inhibitörünün pluripotent insan kök hücreleri
üzerinde burada açiklanan etkileri elde etmek için kullanimina iliskindir. Özellikle, bulusun
yönleri itibariyla, bir ROCK inhibitörünün bir kök hücre kültüründe klonlama veriminin veya
pasajlama veriminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi; bir ROCK
inhibitörünün bir kök hücre kültüründe koloni olusumunun desteklenmesinde ve/veya
iyilestirilmesinde kullanimi; ve bir ROCK inhibitörünün bir kültürde kök hücrelerin
sagkaliminin desteklenmesinde ve/veya iyilestirilmesinde kullanimi saglanmaktadir.
Bulusa ait usullerin avantajlarina iliskin burada sunulan açiklamanin ayni sekilde bulusa
uygun ROCK inhibitörleri kullanimi ve bulusa uygun besiyerleri ve diger bilesimler için de
geçerli oldugu takdir edilecektir.
Mevcut bulusa ait kültür usulleri pluripotent insan kök hücrelerinin sagkalim oranini,
proliferasyon gücünü veya farklilasma etkinligini iyilestirebilir. Özellikle, mevcut bulusa ait
kültür usulü avantajlarini, örnegin kök hücrelerin ayristirilmasini, ayrismis kök hücrelerin
adherent veya süspansiyon kültürlerini veya benzerini içeren herhangi bir kültür usulünde
sergileyebilir. Mevcut bulusa ait kültür usulü, tercihen kök hücre pasaj kültürü, kök hücrede
farklilasma indükleme (örnegin, nöral veya sinir hücrelerine), kök hücre saflastirma veya
klonlama, kök hücre genetik modiükasyonu ve benzeri için kullanilabilmesini saglayacak
avantajlara sahiptir.
Mevcut bulusa ait kültür usulünde tercihen örnegin burada açiklanan hücre preparasyonu,
kültür maddesi, kombinasyon (örnegin, bilesim ve kit), serumsuz besiyeri, kültür sistemi ve
benzeri kullanilabilir.
Mevcut bulusa göre bir ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulacak pluripotent insan kök
hücreleri ayrismis hücreler veya ayrismamis hücreler olabilir. Ayrismis hücreler hücre
ayrismasini (örnegin, ileride açiklanan ayrisma) desteklemek üzere islem gören hücrelere
karsilik gelir. Ayrismis hücreler tek bir hücreyi ve bir miktar (tipik olarak yaklasik 2 ila 50, 2
ila 20 veya 2 ila 10) hücreden küçük bir hücre kümesi (agregat) olusturan hücreleri içerir.
Ayrismis hücreler süspanse (yüzen) hücreler veya adherent hücreler olabilir. Örnegin, ES
hücrelerinin, örnegin insan ES hücrelerinin ayrisma (ve/veya ayrisma sonrasi süspansiyon
kültürü) gibi özel kosullara duyarli olduklari bilinmektedir. Kök hücre, simdiye dek hücre
ölümünün olusacagi kosullara tabi oldugunda mevcut bulusa ait usuller özel kullanima
sahiptir.
Mevcut bulusu uygulamak için bir inhibitör olarak Rho-kinaz (ROCK) islevini inhibe
edebildikleri sürece genel olarak bir sinirlama olmaksizin ROCK inhibitörleri uygundur ve
(örnegin bakiniz, Nakaj ima ve digerleri, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324
( ve bunlarin türevlerini ve
ROCK için antisens nükleik asidi, bunlara ait RNA interferansini indükleyici nükleik asidi
(örnegin, siRNA), rekabetçi peptitleri, antagonist peptitleri, inhibe edici antikorlari, antikor-
ScF V fragmanlarini, dominant negatif varyantlari ve ekspresyon vektörlerini içerir. Ayrica,
baska düsük moleküler bilesikler de ROCK inhibitörleri olarak bilinmektedir ve bu bilesikler
inhibitörlerinin bir veya ikisinin veya daha fazlasinin bir kombinasyonu da kullanilabilir.
Mevcut bulusa göre, kök hücre bir besiyeri içinde ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulabilir.
Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usullerde kullanilan besiyeri zaten ROCK inhibitörü içerebilir
veya alternatif olarak mevcut bulusa ait usuller besiyerine ROCK inhibitörü ilave etme
asamasini içerebilir. Kök hücrelerin sagkalim oraninin iyilesmesi gibi Besiyerindeki ROCK
inhibitörü konsantrasyonuna, istenen etkilerin, örnegin kök hücrelerde gelismis sagkalim
oraninin elde edilebilmesini sagladigi sürece özel bir sinirlama getirilmeinektedir. Örnegin,
uM, daha tercihen yaklasik 0.] ila yaklasik 100 MM, daha da tercihen yaklasik 1.0 ila yaklasik
uM ve en fazla tercihen yaklasik 2.0 ila 20 uM konsantrasyonda kullanilabilir. ROCK
inhibitörü olarak Fasudil/HA1077 kullanildiginda, yukarida bahsedilen Y-27632
konsantrasyonlarinin yaklasik iki kati kullanilabilir. ROCK inhibitörü olarak H-l 152
kullanildiginda, yukarida bahsedilen Y-27632 konsantrasyonlarinin yaklasik 1/50*si
kullanilabilir.
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutuma süresine, istenen etkilerin, örnegin kök hücrelerde
gelismis sagkalim oraninin elde edilebilmesini saglayan bir zaman süresi oldugu sürece özel
bir sinirlama getirilmemektedir. Insan embriyonik kök hücre (bulusa ait degil) için isleme tabi
tutma süresi ayrisma öncesinde tercihen yaklasik 30 dakika ila birkaç saattir (örnegin,
yaklasik bir saat). Ayrisma sonrasinda, insan embriyonik kök hücresi istenilen etkileri elde
etmek için örnegin yaklasik 12 saat veya daha fazla ROCK inhibitörü ile isleme tabi
tutulabilir.
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulacak kök hücre(hücreler) yogunluguna istenilen
etkilerin, örnegin kök hücrelerde gelismis sagkalim oraninin elde edilmesini saglayan bir
yogunluk oldugu sürece özel bir sinirlama getirilmemektedir. Tercihen yaklasik 1.0 x 101 ila
hücre/m1”dir.
Mevcut bulusa ait usuller ayrica kök hücrelerin ayristirilmasina iliskin bir asama içerebilir.
Kök hücre ayristirmasi bilinen herhangi bir usulü kullanarak gerçeklestirilebilir. Bu usuller
selatlastirici bir madde (örnegin EDTA), bir enzim (örnegin tripsin, kollajenaz) veya benzeri
ile yapilan isleinleri ve mekanik ayristirma (örnegin pipetleme) gibi yöntemleri içerir. Kök
hücre(hücreler) ayristirma öncesinde ve/veya sonrasinda ROCK inhibitörü ile isleme tabi
tutulabilir. Örnegin, kök hücre(hücreler) sadece ayristirma sonrasinda isleme tabi tutulabilir.
Kök hücrenin(hücrelerin) ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulmasi yukarida açiklanan
sekilde yapilabilir.
Mevcut bulusa uygun kültür kosullari kullanilan besiyerine ve kök hücrelere göre uygun
sekilde belirlenecektir. Mevcut bulusta, mevcut bulusa ait usullerde kullanilacak bir besiyeri
de saglanmaktadir.
Mevcut bulusa uygun besiyeri bazal besiyeri olarak hayvan hücrelerinin kültürlenmesinde
kullanilan bir besiyerini kullanarak hazirlanabilir. Bazal besiyeri olarak, BME, BGJb, CMRL
1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle MEM,
OLMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 ve Fischer besiyerinden herhangi biri ve ayrica bunlarin
kombinasyonlari kullanilabilir ancak besiyeri hayvan hücrelerinin kültürlenmesinde
kullanilabildigi sürece bunlarla da sinirli tutulmamaktadir.
Mevcut bulusa uygun besiyeri serum içeren veya serumsuz bir besiyeri olabilir. Serumsuz
besiyeri islenmemis veya saflastirilmamis seruinun olmadigi besiyerlerine karsilik gelir ve
dolayisiyla saflastirilmis kandan elde edilen bilesenlerin veya hayvan dokusundan elde edilen
bilesenlerin (örnegin büyüme faktörleri) oldugu besiyerlerini içerebilir. Heterojen hayvandan
elde edilen bilesenlerle kontaminasyonu önleme yönü itibariyla, serum kök
hücrenin(hücrelerin) elde edildigi hayvanla ayni hayvandan elde edilebilir.
Mevcut bulusa uygun besiyeri serum alternatiflerini içerebilir veya içermeyebilir. Serum
alternatifleri uygun sekilde albümin (örnegin lipit açisindan zengin albümin, albümin
ikaineleri, örnegin rekombinant albümin, bitki nisastasi, dekstranlar ve protein hidrolizatlari),
transferrin (veya bir baska demir tasiyici), yag asitleri, insülin, kollajen prekürsörleri, eser
elementler, 2-merkaptoetanol, 3'ti01gliser01 veya bunlarin esdegerlilerini bulunduran
maddeleri içerebilir. Serum alternatifleri örnegin 98/30679 sayili Uluslararasi Yay1n7da
açiklanan usulle hazirlanabilir. Alternatif olarak, daha kolay olmasi için ticari olarak piyasada
mevcut herhangi bir malzeme kullanilabilir. Ticari olarak piyasada mevcut maddeler Nakavt
Serum Degistirme (KSR), Kimyasal Tanimli Lipit Konsantresi (Gibco) ve Glutamaxli
(Gibco) içerir.
Mevcut bulusa ait besiyeri yag asitlerini veya lipitleri, amino asitleri (örnegin esansiyel
olmayan amino asitler), vitamin(vitaminler), büyüme faktörleri, sitokinler, antioksidan
maddeler, 2-merkapt0etanol, piruvik asit, tamponlama maddeleri ve inorganik tuzlar da
içerebilir. 2-merkaptoetanol konsantrasyonu, örnegin yaklasik 005 ila 1.0 mM ve tercihen
yaklasik 0.1 ila kültürlenmesi için uygun
oldugu sürece konsantrasyona özel bir sinirlama getirilmemektedir.
Kök hücrenin(hücrelerin) kültürlenmesinde kullanilan bir kültür kabi, içinde kök hücre
kültürü yapilmasina imkan verdigi sürece ve özel olarak bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla
cam sise, doku kültürü için cam sise, tabak, petri tabagi, doku kültürü için tabak, çoklu tabak,
mikro-plaka, mikro-kuyucuklu plaka, çoklu plaka, çok kuyucuklu plaka, mikro lam, bölmeli
lam, Schale (cam petri tabagi), tüp, tepsi, kültür torbasi ve silindir siseyi içerir.
Kültür kabi hücresel adhezif veya adhezif olmayan kültür kabi olabilir ve amaca göre seçilir.
Hücresel adhezif kültür kabi, kap yüzeyinin hücrelere adezyonunu gelistirmek için herhangi
bir hücre adezyonu substratiyla, örnegin hücre disi matrisle (ECM) kaplanabilir. Hücre
adezyonu substrati kök hücrelerin veya besleyici hücrelerin (eger kullanilmissa) baglanmasina
yönelik herhangi bir malzeme olabilir. Hücre adezyonu substrati kollajen, jelatin, poli-L-lizin,
poli-D-lizin, laminin ve fibronektin ve bunlarin karisimlarim, örnegin Matrigel ve lizizli hücre
1641).
Diger kültür kosullari da uygun sekilde belirlenebilir. Örnegin, kültür sicakligi yaklasik 30 ila
40 °C ve tercihen yaklasik 37 °C olabilir ancak özel olarak bunlarla sinirli tutulmamaktadir.
C02 konsantrasyonu yaklasik %1 ila %10 ve tercihen yaklasik %2 ila %5 olabilir. Oksijen
gerilimi %1-10 olabilir.
Mevcut bulusa ait usuller, örnegin kök hücrelerin adezyon kültürü için kullanilabilir. Bu
durumda, hücreler besleyici hücreler mevcudiyetinde kültürlenebilir. Mevcut bulusa ait
usullerde besleyici hücrelerin kullanilmasi durumunda, besleyici hücreler olarak stromal
hücreler, örnegin fetal fibroblastlar kullanilabilir (bakiniz örnegin; Manipulating the Mouse
Embryo A Laboratory Manual, Ikinci Baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994);
Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Martin,
Mevcut bulusa ait usuller, kök hücrelere iliskin tasiyicilarda süspansiyon kültürü (Fernandes
sayili Birlesik Devletler Patenti) dahil olmak üzere bir süspansiyon kültüründe de
kullanilabilirler. Kök hücrelerin süspansiyon kültürü ifadesi kök hücrelerin bir besiyeri içinde
kültür kabina veya besleyici hücrelere (eger kullanilirsa) göre adherent olmayan kosul altinda
kültürlenmesi anlamina gelir. Kök hücrelerin süspansiyon kültürü bir kök hücreleri ayristirma
kültürünü ve kök hücrelerde bir agregat süspansiyonu kültürünü içerir. Kök hücreleri
ayristirma kültürü terimi süspansiyon halindeki kök hücrelerin kültürlenmesi anlamina gelir
ve kök hücreleri ayristirma kültürü tekli kök hücrelere veya çok sayida kök hücreden
(örnegin, yaklasik 2 ila 20 hücre) olusan küçük hücre agregatlarina iliskin olanlari içerir.
Yukarida bahsedilen ayristirma kültürü devam ederken, kültürlenmis, ayrismis hücreler kök
hücrelerden daha büyük bir agregat olusturabilir ve bunun ardindan bir agregat süspansiyon
kültürü gerçeklestirilebilir. Agregat süspansiyon kültürü bir embriyoid kültür usulünü
Uluslararasi Yayin) içerir. Mevcut bulusa ait usuller bir süspansiyon kültüründe kök
hücrelerin sagkalim oranini ve/veya farklilasma etkinligini anlamli ölçüde gelistirebilir.
Mevcut bulusa ait usuller kök hücre alt kültürü usulleri olarak kullanilabilir. Dolayisiyla,
mevcut bulusa ait usuller kök hücrelerin toplanmasi/yayilmasi asamasini içerebilir. Mevcut
bulusa ait usullere göre, daha yüksek bir sagkalim orani ve gelismis proliferasyon gücü elde
edilebilir.
Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usuller tekli hücrelerin (veya hücrelerden küçük bir
agregasyonun) kültürde etkili sekilde birbirinden ayrismasini saglar; ayrica, bulusa ait usuller
kök hücrelerin kullanildigi ilaç kesfetme ve güvenilirlik testlerinin (örnegin, yüksek is/ürün
hacmi taramasi) verimliligini destekleyebilir. Ilaveten, mevcut bulusa ait usuller genetik
modifikasyon yapilmis kök hücrelerin (tutulu ve/veya homolog olarak rekombine hücreler)
kolay taranmasini/alt klonlanmasini ve tibbi uygulamalar için bir kök hücre hattinin daha
güvenli ve daha homojen taranmasini saglar. Mevcut bulusa ait usuller, kök hücrelerin
farklilasmamis Özelliklerinin sakli tutuldugu ve farklilasma güçlerinin azalmadigi kök
hücreler ortaya çikartmalari bakimindan da avantajlidirlar.
Mevcut bulusa ait usuller kök hücre farklilasmasini indükleyerek kullanilabilirler.
Dolayisiyla, mevcut bulusa ait usuller kök hücre farklilasmasinin indüklenmesine iliskin bir
asamayi içerebilirler. Kök hücre farklilasmasinin indüklenmesi için bilinen herhangi bir usul
kullanilabilir. Kök hücre farklilasmasi yoluyla üretilecek hücrelerin örnekleri endodermal
hücreleri (, mezodermal hücreleri (Brachyury,
Flkl , Mox markör pozitif hücreler, vb.) ve ektodeimal hücreleri içerir. Ektodemial hücrelerin
örnekleri nöral hücreleri (NCAM, TuJl , tirozin hidroksilaz (TH), serotonin, nestin, MAP2,
MAP2ab, NeuN, GABA, glutamat, ChAT veya Soxl markör pozitif hücreler, vb.), epidermal
hücreleri (sitokeratin markör pozitif hücreler, vb.), duyusal hücreleri (RPE veya rodopsin
markör pozitif hücreler, vb.), pigmentli hücreleri (TRP-l markör pozitif hücreler, vb.) ve
nöral krest kökenli mezenkimal hücreleri (SMA markör pozitif hücreler, vb.) içerir. Tercihen
ES hücrelerinden sinir sistemi hücrelerinin, örnegin nöral hücrelerin (örnegin serebral nöral
hücreler) ve bunlarin prekürsörlerinin indüklenmesinde SFEB usulü (bakiniz, Nature
durumda, faktörler asagidaki sekilde kullanilabilir; Nodal inhibitörler (Lefty-A, Lefty-B,
Lefty-l, Lefty-2, çözünür Nodal reseptörler, Nodal antikorlar; Nodal reseptör inhibitörleri,
vb.); Wnt inhibitörleri (Dkkl , Kerberus proteinleri, Wnt reseptörü inhibitörleri, çözünür Wnt
reseptörleri, Wnt antikorlari, kazein kinaz inhibitörleri, dominant negatif Wnt proteinleri, vb.);
ve BMP inhibitörleri (anti-BMP antikorlari, çözünür BMP reseptörleri, BMP reseptörü
inhibitörleri, vb.). Mevcut bulusa ait usullere göre, kök hücreler etkili sekilde özellesmis
hücrelere farklilasabilir. Mevcut bulusa ait usuller ayrica tercihen kök hücrelerin nöral
hücrelere (ön beyin nöral hücreleri ve/veya serebral dorsal (kortikal bölge) hücreler ve
serebral ventral (bazal gangliyon bölgesi) hücreleri) farklilasmasini saglayan baska usullerde
(örnegin, bir SDIA usulü, AMED usulü, PA6 hücrelerinin kullanildigi bir usul) kullanilabilme
avantajlarina sahiptirler.
Mevcut bulusta, mevcut bulusa ait usullerle ve/veya yukarida bahsedilen ayristirma
islemleriyle elde edilen bir hücre preparasyonu saglanmaktadir. Mevcut bulusa ait hücre
preparasyonu bir pluripotent insan kök hücresi ve bir ROCK inhibitörü içerir. Mevcut bulusa
ait bir hücre preparasyonu çok sayida tekli hücreden olusan küçük hücre agregatlari gibi
ayrismis hücreler içeren bir preparasyon olabilir. Bu tür bir hücre preparasyonu kök
hücrelerin, tercihen insan nöral kök hücrelerinin sagkalim oranini veya farklilasma etkinligini
iyilestirebilir. Mevcut bulusa ait hücre preparasyonu, örnegin kök hücrelerin saklanmasi
(örnegin, dondurarak saklanmasi) ve/veya tasinmasi veya kök hücrelerin alt kültürü için
kullanilabilir. Hücre preparasyonu kök hücrelerin dondurarak saklanmasi için kullanildiginda,
mevcut bulusa ait hücre preparasyonu ayrica yukarida açiklanan serumu veya bunun
ikamesini veya bir organik çözücü (örnegin, DMSO) içerebilir. Bu durumda, serum veya
ikamesinin konsantrasyonu, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla yaklasik %1-50 (h/h), tercihen
yaklasik %5-20 (h/h) olabilir. Organik çözücü konsantrasyonu, bunlarla sinirli kalmamak
kaydiyla yaklasik %0-50 (h/h), tercihen yaklasik %5-20 (h/h) olabilir. Bulusun bu
düzenlemelerine ait bilesimler serum içerebilir veya serumdan muaf olabilir ve ayri olarak
Kök hücreler için bir kültür maddesi bir ROCK inhibitörü içerir. Genel olarak, kültür maddesi
kök hücreler için bir kültür besiyeridir. Tercihen mevcut bulusa ait kültür usullerinde kültür
maddesi kullanilir.
Bir ROCK inhibitörü ve baska bilesenler içeren bir kombinasyon örnegin kök hücrelerin
kültürlenmesi için (örnegin, pasaj kültürü, farklilasma indüksiyonu kültürü) kullanilabilir.
Örnegin, kombinasyon bir bilesim olabilir. Bilesim bir ROCK inhibitörünün ve diger
bilesenlerin karisimi formunda saglanabilir. Bilesime dahil edilebilecek diger bilesenler,
örnegin: kök hücrelerin farklilasinasini düzenleyici maddeleri, örnegin kök hücre farklilasma
inhibitörlerini (örnegin, serum, FGF, LIF, BMP, Wnt, hücre disi matris, TGF-ß, besleyici
hücre) ve kök hücre farklilasma indükleyicilerini (örnegin, BMP inhibitörü, Wnt inhibitörü,
Nodal inhibitör, retinoik asit, serum, hücre disi matris, besleyici hücreler, örnegin mezenkimal
hücreler); ayrica kültür katki maddelerini (örnegin, KSR, 2-merkaptoetanol, amino asitler, yag
asitleri ve yukarida açiklanan diger faktörler) içerir.
Kombinasyon bir kit de olabilir. Kit ayri olarak (yani karistirilmamis bir sekilde) bir ROCK
inhibitörü ve diger bilesenleri içerebilir. Örnegin, kit her bilesenin ayri olarak bir kapta
paketlendigi formda saglanabilir. Kitte bulunabilecek diger bilesenler, örnegin: bilesime dahil
edilebilecek yukarida bahsedilen diger bilesenleri; kök hücrelerin veya farklilasmis hücrelerin
(örnegin, hücre markörüne yönelik bir antikor) tanimlanmasi veya ölçümü (tespit veya miktar
tayini) için bir maddeyi; bir hücre kültürü besiyerini; kültür için hücre disi matrisle isleme tabi
tutulmus bir kabi; genetik rekombinasyon için bir plazmidi ve bunun seçici bir maddesini
Bir kültür sistemi bir besiyeri içinde kök hücreleri ve bir ROCK inhibitörünü içerir. Kültür
sistemi mevcut bulusa ait besiyerinde kök hücreler içerebilir. Kültür sistemi ayrica bir besiyeri
içinde mevcut bulusa ait usullerle baglantili olarak ayrintili sekilde açiklanmis bilesenlerden,
örnegin besleyici hücreden, hücre destekleyici matristen, ROCK inhibitöründen farkli hücre
kültürü faktörlerini içerebilir.
Ayrintili Örnekler asagida verilmektedir. Örnekler asagidaki çizimlerle gösterilmektedir:
Sekil 1 - ROCK inhibitörü Y- klonlanma verimini
pluripotentliklerini olumsuz etkilemeden bariz ölçüde artirir. (a-c) Yedi gün MEFide
uM Y-27632 yoklugunda (a) ve mevcudiyetinde (b) ayrismis hES hücrelerinin
düsük yogunluklu kültürü. Hemen hemen tüm koloniler ALP için pozitif oldu. Bar,
500 um. (c) ALP+ kolonilerin baslangiçta ekilen hES hücresi sayisina oranlari (**,10
kontrole göre P < 0.01 , n :3). (d-f) Y-27632 ile isleme tabi tutulmus hES hücresi
kolonilerinin anti-E-kaderin (d), -Oct antikorlari ile
immünolojik boyanmasi. Alt paneller çekirdek DAPl boyamasidir. Bar, 100 um. Y-
27632 islemi hES hücrelerinde aktin demeti olusumunda esasli degisikliklerin
olmasina neden olmadi (gösterilmiyor). (g) F arklilasan hES hücrelerinde erken
mezodermal markörler Brachyury ve Meoxl ”e iliskin RT-PCR analizi. RT(-),Ters
transkripsiyonsuz G3PDH PCR. (h) Farklilasan ES hücrelerinde erken endoderinal
markör Soxl Tye iliskin RT-PCR analizi. (i-k) Kollajen I ve IV ile kapli 8 kuyucuklu
bölmeli lamda farklilasan hES hücrelerinde mezodermal ve endodermal markörler için
immünolojik boyama. (i) Birkaç farklilasan hücrede mezodennal markör Brachyury
(kirmizi) ekspresyonu. DAPI çekirdek boyamasi için kullanildi (mavi; c). Bar, 10 um.
Ü) 12 gün OP9 hücrelerinde kültürlenmis hES hücresinden (Y-27632 ile isleme tabi
tutulmus) elde edilen hücrelerde düz kas aktini immünolojik boyamasi (SMA;
kirmizi). Çekirdekler DAPI ile boyandi (mavi). Bar, 5 um. (k) 6. günde hES
hücresinden elde edilen bir epitelyal levhada HnBß ve E-kaderin immünolojik
boyamasi. Bar, 5 um. (I-n) Y-27632 mevcudiyetinde düsük yogunlukta tutulmus hES
hücrelerinden teratoma olusturma (%100, n=20) (30 pasaj). Bar, 1 cm. Hücreler SCID
fare testlerine bilateral enjekte edildi (I). 9 hafta sonra teratomalar makroskopik
kikirdaklari (beyaz oklar; m, n) ve pigment epitelini (siyah ok; 11) de içeren iyice
farklilasmis dokulardan bir karisim içerdi.
Sekil 2 - Y- klonlanma verimini dogrudan artirir. (a,
b) MEF ile hazirlanmis besiyerinde Matrigel kapli plakalarda hES hücrelerinin
besleyici hücresiz kültürü. Bar, 500 um. Ayrisinis hES hücrelerinden koloni olusumu
Y-27632 ile açik sekilde artmis (b; eklenti, tipik bir koloninin yüksek büyütmeli bir
görüntüsü; bar, 100 um), yoklugunda ise birkaç koloni olusmustur (a; Y-27632
d) Yedi gün 10 uM Y-27632 mevcudiyetinde 96 kuyucuklu bir plakanin her
kuyucugunda MEF içinde tek bir hES hücresinin kültürü. (c) (d) Her kuyucukta bir
ALP+ koloni mevcudiyeti yüzdeleri (**, kontrole göre P < 0.01, 11 = 3 çalisma).
Kontrol, islem görmemis hücreler. Bar, 100 um. (e, f) Transfeksiyondan 12 gün sonra
MEF'de düsük yogunluklu ayristirma kültüründe Y-27632 ile isleme tabi tutulmus
hES hücrelerinden higromisin dirençli kolonilerin olusmasi. Bar, 100 um. (e) Faz
kontrast görüntüsü. (f) Venüs-GFP ekspresyonu. (g) Farkli sürelerde Y-27632 islemi
ile MEF”de kültürlenen hES hücrelerinin büyüme egrisi. Grup 1 (mavi), sadece ilk 12
saat sirasinda (bir saatlik ön islemle birlikte) Y-27632 islemi; Grup 2 (kirinizi), kültür
islemi yok (mor). Her kosul için, 5x104 ayrismis hücre/kuyucuk (6 kuyucuklu plaka)
MEF üzerine yayildi. **1 P < 0.01, Grup l'e karsi Grup 2 (n = 3 çalisma). (h) 3. ve 5.
günlerde Grup 1 (mavi) ve 23de (kirmizi) Nanog+ hES hücrelerinde Ki67+ (mitotik)
hücrelerin yüzdeleri (i-n) Hücre çevrimi fazina spesifik popülasyonlara iliskin akis
sitometrisi analizi. (i, j, I, ni) Akis sitoinetrisi desenleri. X ekseni, 7-AAD
baglanmasiyla gösterilen DNA içerigi; Y ekseni, bir saat maruziyet sonrasi BrdU
alimi. (k, n) Grup 1 (mavi) ve 2”de (kirmizi) hES hücreleri arasinda faz Spesifik
popülasyonlarin göreceli yüzdeleri (i-k) 3. gün (I-n) 5. gün. *, P < 0.05; **, P < 0.01,
Grup l`e karsi Grup 2 (n = 3 çalisma). Hücre büyümesindeki artis derecesi çok büyük
degildir ve klonlama verimindeki güçlü artisi (%27°ye karsi %1) açiklayamaz.
Sekil 3 - ROCK inhibitörü süspansiyon kültüründe ayrismis hES hücrelerinin (KhES-
1) apoptozunu önler ve sagkalimini destekler. (a-c) TUNEL analizi. Ayrismis hES
hücreleri 10 uM Y-27632 yoklugunda (a) veya mevcudiyetinde (b) iki gün
süspansiyonda kültürlendi. TUNEL+ hücreler FACS ile analiz edildi. (0) Apoptotik
hücrelerin yüzdesi üzerinde Y- ve bir
nörotrofin kokteylinin (BDNF + NT-3 ve -4) etkileri (**, P < 001; ***, P < 0.001, her
çift arasinda; n = 3 çalisma). (d-I) Süspansiyon kültüründe hES hücresi
hES hücresinin 35 mm plakalarda (n = 3) kültürden iki, dört ve alti gün sonra hücre
sayilari. 6. günde Y-27632 ile isleme tabi tutulmus ES hücreleriyle etkili hücre
agregati olusumu gözlemlendi (1), kontrol hücreleriyle ise gözlemlenmedi (e). Bar,
300 um. (g) SF EB-h kültürlü hES hücrelerinde Pax6 (yesil), Oct3/4 (kirmizi) ve E-
kaderin (mavi) ekspresyonuna iliskin zaman analizi. (h) Kültür protokolü semasi. (i)
SFEB-h kültüründe indüklenen hES hücresi türevi nöral hücrelerin immünolojik
boyaninasi. Bfl (kirmizi), TuJ 1 (yesil), DAPI (mavi). Bar, 50 um. Bazi Bf1+
hücrelerin nöronal markör TuJ 1 için pozitif olduguna dikkat edilmelidir. (j-n) SFEB-h
indüklü nöral hücrelere iliskin immünolojik boyama analizi. Bar, 25 um. (j) Pax6 ve
Nkx2.1 için pozitif olan Bf1+ telensefalik hücrelerin yüzdeleri (**, kontrole göre P <
001; n = 3). Shh (30 nM) yoklugunda (k, 1) veya mevcudiyetinde (m, n) kültürlenmis
SFEB-h indüklü nöral hücrelere iliskin immünositokimya. Bfl (yesil; k-n), Pax6
(kirmizi; k,m) ve Nkx2.] (kirmizi; l,n).
Sekil 4 - Düsük yogunlukta Y-27632 mevcudiyetinde kültürlenmis hES hücrelerinin
analizi.(a-c) Y-27632 islemi ile düsük yogunlukta yapilan uzatilmis pasajlama (30
kere) sonrasinda Y-27632 ile isleme tabi tutulmus hES hücrelerinde (KhES-l) E-
kaderin (a), Oct immünolojik boyamasi. Alt panellerde DAPI
boyamasi gösterilmektedir (mavi). (d-g) Y-27632 ile uzatilmis pasajlamayi takiben
hES hücrelerinin (KhES-l) SCID fare testlerine subkapsüler enjeksiyonundan sonra
olusan teratoma dokularina iliskin histolojik analiz (hematoksilin-eozin boyamasi, 5
uM parafin bölümü). ((1) Kikirdak, (e) nöroepitelyum, (f) pigmentli epitel ve (g)
silindir epitelli gut benzeri mukoza. (h,i) Y-27632 islemi ile düsük yogunluklu kültürü
içeren uzatilmis pasajlama sonrasinda ayrismis hES hücrelerinden etkili koloni
olusumu (%32.5 ± %1 .7; KhES-l) Y-2763,ye bagli kaldi (i) ve bu olmadan çok az
koloni görüldü (11). (j) Koloni olusumunda (KhES-l) iki seçmeli ROCK inhibitörünün
(Y-27632, F asudil; klonlama verimi 10 uM Fasudil yoklugunda ve mevcudiyetinde
inhibitörünün (cAMP-Rp, LY294002) doz-yanit iliskisi. Y ekseni, koloni olusuinu
destekleyici etkinliginin 10 uM Y-27632 ile olana oranlari. (k) hES hücrelerinin farkli
yayma yogunluklarinda Y-27632 ile koloni olusumunun artmasi. ***, kontrole göre
pasajlamasi sonrasinda normal bir karyotip (%100, 11 = 5) gösteren hES hücrelerinin
(KhES-3) G bantlama analizi (300-500 bant seviyelerinde).
Sekil 5 - Y-27632 mevcudiyetinde ayrismayi/reagregasyonu içeren süspansiyon
kültüründe hES hücrelerinin (KhES-l) nöral farklilasmasi. (a) Nodal (5 ug/ml Lefty,
serit 2), Wnt (
inhibitörlerin Pax6+ nöral progenitörlere hES hücresi farklilasmasi üzerindeki etkileri.
Serit 5, üç faktörün kombinasyonu (*, P < 0.05; **, kontrole göre P < 0.01; n = 3
çalisma). (b,c) Y- kültürlenmis
hES hücrelerinin SFEB agregatlarina iliskin immünolojik boyama (gün 24). (b) Pax6
(yesil) ve E-kaderin (kirmizi). (c) Nestin (yesil) ve Oct3/4 (kirmizi).
ÖRNEKLER
Referans Örnek 1: ROCK Inhibitörü Y-27632 Ile Insan Embriyonik Kök Hücrelerin
Klonlanma Veriminin Iyilesmesi
Burada açiklanan deneylerde kullanilan insan embriyonik kök hücreleri, Kyoto Üniversitesi,
Frontier Tip Bilimleri Enstitüsü Norio Nakatsuji laboratuvarinda olusturulmus insan
blastosistlerine ait embriyonik kök hücreler (KhES-l, KhES-2 ve KhES-3) olup, bunlar Japon
devletinin insan embriyonik kök hücre yönergelerine göre dagitilmis ve kullanilmistir
(çogunlukla KhES-l). Nakatsuji laboratuvari usulüne göre (Suemori ve digerleri, Biochem
besleyici hücre tabakasi olarak ekilen fare embriyonik fibroblastlari (mitomisinle etkisiz
kilinmis, MEF) ile plastik bir kültür tabaginda kültürlendi. Daha özellikle, D-MEM F12
(Sigma D, 1 X
NEAA (esansiyel olmayan amino asitler, lnvitrogen/Gibco BRL), 2 mM L- glutaminik asit ve
gerçeklestirildi. Pasajlama her üç veya dört günde bir gerçeklestirildi ve embriyonik kök
hücreler ayristirmama sivisi (%025 tripsin, 1 mg/ml kollaj enaz IV çözeltisi, fosfat tamponlu
tuzlu suda 1 mM CaC12 içerir; tamami Invitrogen/Gibco-BRUden temin edilir) kullanarak
besleyici tabakadan ayrildi, ardindan pipetleme ile küçük hücre kümelerine (yaklasik 50-100
hücrelik) ayristirildi ve sonra bir gün önce MEF ekimiyle olusturulmus besleyici tabaka
üzerine ekildi.
Tekli hücrelere ayrisma sonrasinda insan embriyonik kök hücre kültürüne iliskin ROCK
inhibitörünün hücre ölümünü inhibe edici etkisi ve klonlanma verimi üzerindeki etkisi asagida
belirtilen sekilde incelendi. Yukarida belirtilen sekilde kültürlenmis insan embriyonik kök
hücreleri besleyici tabakadan küçük hücre kümeleri seklinde ayrildi ve ayrica kontainine edici
besleyici hücreler bir saat 37 °C7de ikame kültürü besiyerinde inkübe edilerek atilmak üzere
bir hücresel adhezif kültür plakasinin (%01 jelatin kapli) alt kismina yapisti, burada
embriyonik kök hücre kümeleri plakaya kuvvetli sekilde yapismaz kontamine edici besleyici
hücreler ise kuvvetli sekilde yapisir. Embriyonik kök hücre kümeleri tripsin sindirimiyle
(% tekli hücrelere ayristi ve düsük yogunlukta (0.15
ml besiyerinde 500 hücre/0.32 cm2) 96 kuyucuklu kültür plakalarinda bir MEF besleyici
tabakasina ekildi. Olusan kolonilerin sayisi idame kültürü besiyerinde kültürden alti gün sonra
sayildi. Hücrelerin besleyici tabakadan ayrilmasindan bir saat önce 10 HM konsantrasyonda
ROCK inhibitörü Y-27632 eklendi ve ayni miktar ayrilmadan sonra ayni miktarda kültüre
eklendi.
Ayni sekilde, klonlanma tesvigine insan embriyonik kök hücresi otokrin faktörünün neden
olup olmayacagini degerlendirmek için insan embriyonik kök hücreleri klonal yogunlugunda
(kuyucuk basina bir hücre) 96 kuyucuklu kültür plakalarinda benzer bir deney gerçeklestirildi
ve klonlanma verimi belirlendi.
Alti gün kültür sonrasinda klonlama verimlilikleri (olusan koloni sayilarinin ekilen insan
embriyonik kök hücresi baslangiç sayilarina oranlari) ROCK inhibitörü yoklugunda ve
mevcudiyetinde sirasiyla %1 ve %27 oldu. ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutularak olusan
kolonilerdeki hücreler farklilasmamis embriyonik kök hücre markörleri olan alkalin fosfatazi
ve Oct3/45ü eksprese etti. Klonlama verimi açisindan ROCK inhibitörünün üstün etkisi insan
embriyonik kök hücrelerinden sadece KhES-l ,de degil, KhES-2 ve KhES-Tte de dogrulandi.
Ayni sekilde, 96 kuyucuklu plakalarda klonal yogunlukta (kuyucuk basina bir hücre) insan
embriyonik kök hücresi kullanildiginda, klonlama verimlilikleri ROCK inhibitörü yoklugunda
ve mevcudiyetinde sirasiyla %1 ve %25”in altinda oldu. Dolayisiyla, klonlama verimi
açisindan ROCK inhibitörünün sagladigi üstün etkinin insan embriyonik kök hücresinin
otokrin faktörüne bagli olmadigi düsünüldü.
Dolayisiyla, ROCK inhibitörü Y-27632,nin insan embriyonik kök hücrelerin sagkalim oranini
anlamli ölçüde iyilestirdigi bulundu.
Referans Örnek 2: Ayrismis Insan Embriyonik Kök Hücrelerinde Rho Etkinlesmesi
Insan embriyonik kök hücrelerin idame kültürü Örnek l”de açiklanan sekilde küçük hücre
kümelerinin pasajlanmasiyla gerçeklestirildi.
Örnek 1'de açiklanan sekilde, insan embriyonik kök hücreleri tripsin sindirimi ile tekli
hücrelere ayristirildi, idame kültürü için kültür besiyerinde süspanse edildi ve 37 °C°de
sonrasinda santrifüjleme ile toplandi ve ardindan imalatçi firmanin talimatlarini izleyerek The
small GTPase Activation Kit (Cytoskeleton Sirketi, Denver, CO) ile isleme tabi tutuldu ve
Çekme usulü ile analiz edildi. Rho etkinlesmesi Western blotla etkinlesmis Rho'nun (GTP
baglantili Rho) toplam Rho,ya oranindaki artislari esas alarak degerlendirildi. 10 cm,lik bir
kültür plakasindan (yaklasik 1 x 106 hücre) bir parti olarak hücrelerden bir numune hazirlandi.
Insan embriyonik kök hücrelerin ayrismasindan/inkübasyonundan 15-30 dakika sonra bariz
Rho etkinlesmesi görüldü.
Rho etkinlesmesi 30 dakika içinde yavas yavas azaldi.
Dolayisiyla, sonuçlar Y-27632'nin insan embriyonik kök hücrelere üstün etkisinin, Y-
27632°nin ROCK inhibisyonu etkisinin neden oldugu Rho etkinlesmesi inhibisyonuna bagli
oldugunu göstermektedir.
Referans Örnek 3: Farkli Kinaz Inhibitörleriyle Idame Kültüründe Insan Embriyonik
Kök Hücrelerin Koloni Olusturma Verimliligi
Diger ROCK inhibitörlerinin idame kültüründe insan embriyonik kök hücrelerin klonlanma
verimi üzerindeki etkileri Örnek 1”de açiklanan usulleri kullanarak incelendi. ROCK
kinazlara iliskin inhibitörler referans olarak kullanildi. Baska kinazlara iliskin kullanilan
inhibitörler protein kinaz A inhibitörleri olan cAMP-Rp (1-100uM) ve KT5720 (;
protein kinaz C inhibitörleri olan bisindolilmaleimit (0.01-5uM) ve staurosporin (1-50nM);
50uM); ve bir MLCK inhibitörü olan ML-79dir (0.3-30uM).
ROCK inhibitörleri (Fasudil/HA1077 ve H-l 152) söz konusu oldugunda, inhibitörlerin
olmadigi durumla karsilastirildiginda anlamli ölçüde artmis klonlanma verimlilikleri
gözlemlendi ancak baska kinazlara iliskin inhibitörler söz konusu oldugunda artis
gözlemlenmedi.
Dolayisiyla, ROCK inhibitörünün insan embriyonik kök hücrelerin sagkalim oranini spesifik
olarak iyilestirebildigi bulundu.
Referans Örnek 4: Ayrisma/Reagregasyon Gösteren Insan ES Hücrelerinin Süspansiyon
Kültüründe ROCK inhibitörü Ile Apoptozun Bastirilmasi
Idame kültürüne tabi tutulan insan ES hücreleri Örnek lsdeki ile ayni tarzda besleyici
hücrelerden küçük hücre kümeleri (agregatlar) seklinde ayrildi ve geriye kalan besleyici
hücrelerin atilmasindan sonra tripsin sindirimi ile tekli hücrelere ayristirildi. Santrifüjleme
sonrasinda 2><105 hücre serumsuz kültür besiyerinde farklilasma sonrasi indüksiyon için
2-merkaptoetanol takviye edildi, KSR %20 bir konsantrasyonda eklendi). Tekli ayrismis insan
ES hücrelerine (1.0>< 105 hücre/ml) hücresiz adhezif 35 mm bir kültür plakasinda süspansiyon
kültürü yapilarak agregatlar olusturuldu ve 2-6 gün ayni kültür besiyerinde kültürlendi (SFEB
usulü; bakiniz yukaridaki Watanabe ve digerleri referansi). 2 gün kültür sonrasinda apoptik
hücrelerin yüzdesi TUNEL usulüyle ölçüldü (MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct, MBL).
ROCK inhibitörü Y-27632 ile islem Örnek l°deki ile ayni tarzda hücre ayrilmasindan 1 saat
önce baslatildi ve inhibitör de ayrisma sonrasinda idame kültürü besiyerine eklendi.
Karsilastirma amaciyla deneylerin gerçeklestirilmesinde apoptozu bastirici etkisi bildirilmis
kaspaz inhibitörü (ZVAD; 10 uM) ve BDNF/NT-3/NT-4 (her birinden 50 ng/mlilik karisim)
kullanildi. ilaveten, her örnekte 6. günde sagkalan hücrelerin sayisi sayildi.
Takviye edilmemis kontrolde, 2 gün kültür sonrasinda TUNEL usulüyle hücrelerin %80°inde
apoptoz gözlemlendi. ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulan hücrelerde, hücrelerin sadece
3/NT-4 (her biri 50 ng/ml) takviyesi sirasiyla %72 ve %69 TUNEL pozitif hücre ortaya
çikartti. Bu sonuçlar ROCK inhibitörünün kuvvetli hücre ölümünü bastirici etkinlige sahip
oldugunu göstermektedir. Dolayisiyla, 6. günde sagkalan hücrelerin sayisi bakimindan
ayristirma kültürünün basinda takviyesiz grupta %8 sagkalmis, ROCK inhibitörü ile isleme
tabi tutulan grupta ise %70 sagkalmistir; yani daha fazla hücre sagkalmistir. Gerek kaspaz
inhibitörü, gerek BDNF/NT-S/NT-4 ile isleme tabi tutulup sagkalan hücreler yayilan
hücrelerin %10,undan azina karsilik gelir.
Yukarida açiklandigi gibi, ROCK inhibitörünün insan ES hücrelerinin sagkalim oranini bariz
ölçüde iyilestirdigi kanitlanmistir.
Referans Örnek 5: Tekli Ayrismis Insan ES Hücrelerini Kullanarak SFEB Usulüyle
N öronal Prekürsör Hücrelere ve Beyin Prekürsör Hücrelerine F arklilasma Indüksiyonu
Idame kültürüne tabi tutulan insan ES hücreleri Ömek 49teki ile ayni tarzda besleyici
hücrelerden küçük hücre kümeleri seklinde ayrildi ve geriye kalan besleyici hücrelerin
atilmasindan sonra tripsin sindirimi ile tekli hücrelere ayristirildi. Santrifüjleme sonrasinda
hücreler 2><105 hücre/mLide farklilasma indüksiyonu için kültür besiyeri içinde ayristirildi ve
hücresiz bir adhezif kültür plakasi kullanarak süspansiyon kültürü yapildi, bu sekilde süspanse
agregatlarda serumsuz kültür (SFEB usulü) gerçeklestirildi. Ilaveten, farklilasma indüksiyonu
kültürünün baslamasindan sonraki ilk 10 gün Nodal inhibitör LeftyA (1 tig/ml, R&D), Wnt
inhibitörü Dkkl (
eklendi. 16-35 gün serumsuz süspansiyon kültürü sonrasinda hücre agregatlari sabitlendi ve
Iloresans antikor usulüyle immünoloj ik boyama yapildi. ROCK inhibitörü Y-27632 ile islem
Örnek l°deki ile ayni tarzda hücre ayrilmasindan 1 saat önce baslatildi ve inhibitör yine
ayrisma sonrasinda ilk alti gün idame kültürü besiyerine eklendi.
Beyin prekürsör hücrelerine farklilasma için SFEB kültürünün 25. gününde üstte yüzen hücre
agregatlari poli-D-lizin/laminin/fibronektin kapli bir kültür lamina aktarildi ve 10 gün daha
adezyon durumunda kültürlendi. Adezyon kültüründe, kültür besiyeri olarak B27 (A vitamini
olmadan) ve 2 mM L-glutamin (her ikisi de Gibco-BRL°den temin edilir) ile takviye edilmis
Farklilasma kültürünün baslamasindan sonra 20. günde ROCK inhibitörü ile isleme tabi
tutulmus neredeyse tüm hücre agregatlarinda, nöronal prekürsör hücre markörleri olan nestin
ve Pax6 için pozif olan hücreler eksprese oldu. Farklilasma kültürünün 24. gününde, bu
pozitif hücrelerin sayisi artti ve hücrelerin yaklasik %80'i Pax6 pozitif hücrelere döndü. Öte
yandan, farklilasmamis durum ES hücresi markörü, Oct3/4 pozitif hücreler %107dan aza
karsilik geldi. F arklilasma kültürünün 35. gününde hücre agregatlarinin yaklasik %6091nda
birçok beyin prekürsör markörü, Bfl pozitif hücre oldu. Bu durum insan ES hücrelerinin
serebral sinir dokularini olusturdugunu göstermektedir. ROCK inhibitörü islemi olmadiginda
farklilasma kültürünün 7. gününde çok az sagkalan hücre olmustur.
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulmamis hücrelerden çok azi 7 gün veya daha uzun
sagkaldi ve anlamli ölçüde üstte yüzen hücre agregati olusumu gözlemlenmedi.
Dolayisiyla, ROCK inhibitörünün insan ES hücrelerinin farklilasma gücünü zayiflatmadigi ve
ROCK inhibitörü ile isleme tabi tutulan insan hücrelerinin çok verimli sekilde
farklilasabilecegi bulundu.10
Referans Örnek 6: ROCK Inhibitörü Ile Takviye Edilmis Besleyicisiz Kültürle Tekli
Ayrismis Insan ES Hücreleri Kültürü
ROCK inhibitörü isleminin besleyici hücreleri, örnegin fare embriyonik fibroblastini (MEF)
kullanmadan yine besleyicisiz kültürle insan ES hücrelerinde tekli ayrisma kültürünü
mümkün kilip kilmadigini kanitlamak için insan ES hücreleri literatürde bilinen usule göre
MEF ile hazirlanan hücre disi matriste kültürlendi (Xu C-H ve digerleri, Nature Biotechnol.,
konflüens görülene dek kültürlenen MEF hücrelerine sadece hücre disi matrisi birakmak üzere
deoksikolat usulüyle bir kültür tabaginda liziz yapildi. Tekli ayrismis insan ES hücreleri (96
kuyucuklu plakada 500 hücre/kuyucuk) MEF hücrelerinde yapilan rutin kültürle ayni usulle
(yukarida bahsedilen Örnek) Y-2763 islemi (10 ”M veya 0 uM) altinda bunlarin üzerine
ekildi. Içinde insan ES hücresi idame besiyeri ve MEFinin baslangiç olarak bir gün
kültürlendigi kosullandirilmis besiyeri bir kültür besiyeri olarak kullanildi. 5 gün sonra olusan
insan ES hücresi kolonilerinin sayisi sayildi.
Y-27632 ile isleme tabi tutulmus grupta ekilen insan ES hücresi basina yüksek klonlama
verimi (%102) gözlemlendi. Öte yandan, Y-27632 ile isleme tabi tutulmamis grupta
klonlama verimi %0.2°den daha az oldu. Y-27632 ile isleme tabi tutulmus grupta olusan
koloniler farklilasmamis durum markörü, alkalin fosfataz için kuvvetle pozitif oldu. Bu
bulgular ROCK inhibitörünün koloni olusumunu desteklemekte besleyici hücreler üzerinde
degil, dogrudan insan ES hücreleri üzerinde bir etkisinin oldugunu göstermektedir. ilaveten,
besleyici hücrelerle ortak kültür kullanilmadiginda bile, ROCK inhibitörünün sivi faktörler
(örnegin, kosullandirilmis besiyerinde bulunan faktörler) mevcudiyetinde dogru sekilde
hazirlanmis hücre disi matriste kültürlendiklerinde insan ES hücrelerinin tekli ayrisma
kültürünü mümkün kildigi kanitlanmistir.
Referans Örnek 7: Kisa Süreli ROCK Inhibitörü Islemi Ile Tekli Ayrismis Insan ES
Hücrelerinin Idame Kültürü
Tekli ayrismis insan ES hücrelerinin idame kültürü söz konusu oldugunda, Y-27632inin
ayrisma kültürünün erken evresinde hücre sagkallmini destekleyip desteklemedigini
incelemek için Y-27632 islemi süresi asagida belirtilen üç gruba bölünerek idame kültüründe
hücre sagkalimini destekleyici etkiler karsilastirildi.
Grup 1: Y-27632 islemi (10 uM, asagidaki ile ayni) 1 saatlik ön islem olarak ve insan
ES hücrelerinin ayrisma kültürü sürecinde ayrisma sonrasinda kültürün sadece ilk 12
saatinde gerçeklestirildi.
Grup 2: Y-27632 islemi 1 saatlik ön islem olarak ve insan ES hücrelerinin ayrisma
kültürü sürecinde ayrisma sonrasinda kültür süresinin tamaminda gerçeklestirildi.
Grup 3: Y-27632 islemi gerçeklestirilmedi.
Bu gruplarda, MEF tabakasinda idame kültürü sisteminde ekili hücre basina (6 kuyucuklu bir
plakanin bir kuyucugu basina 5><104 hücre) 3. günde sagkalan hücrelerin sayimi yapildi.
Y-27632 islemi yapilmamis Grup 3,te 3. günde ekilen hücre toplaminin en fazla %1 ,i
sagkaldi. Ayrisma sonrasinda Y-27632 ile 12 saat isleme tabi tutulan Grup 1'de ekilen
hücrelerin %270”i sayildi; Y-27632 ile kesintisiz isleme tabi tutulmus Grup 2°de ekilen
hücrelerin %290& sayildi. Bu sonuçlar, adezyon kültürüyle insan ES hücrelerinin idame
kültüründe ayrisma kültürünün baslamasindan sonraki ilk yarim gün içinde Y-27632
isleminin yeterince yüksek destekleyici etkiye sahip oldugunu göstermektedir.
Referans Örnek 8: Insan ES Hücrelerinin Idame Kültüründe ROCK Inhibitörü Islemi
Ile Hücre Büyümesini Destekleyici Etkinlik
Yukarida Örnek 7'de verilenle ayni deneyde, ayrisina kültürünün baslamasi sonrasinda 6 gün
Y-27632,nin hücre büyümesi üzerindeki etkisi kültür süresini 6 güne uzatarak Grup 1 ve 2ide
incelendi.
6. günde hücrelerin sayisi Grup 1 ve 2ide baslangiçta ekilen hücre sayisinin sirasiyla
sirasinda hücre sayisina dayanan popülasyonun iki katina çikma süresi Grup 1 için 49.0 saat
ve Grup 2 için 41.5 saat oldu; iki katina çikma süresi Grup 2,de yarisina kisaldi. Grup 1 ve
27nin her ikisinde de, 3. ve 5. günde apoptoz yüzdesi (etkin Kaspaz 3 pozitif hücre sayisi)
hücre t0plaminin %1 ,inden daha az oldu. Bu sonuçlar, ayrisma kültürünün baslamasindan
hemen sonra Y-276329nin hücre sagkalimini destekleyici etkinlige ilaveten bundan sonra
sagkalan hücrelerde hücre büyümesini destekleyici etkinlige de sahip oldugunu
göstermektedir.
Dolayisiyla, kök hücreler bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmektedir ve bulusta
buna iliskin kültür usulleri ve besiyerleri saglanmaktadir.
Claims (10)
- l. Pluripotent insan kök hücrelerinin kültürlenmesi için bir usul olup, kök hücrelerin bir ROCK (Rho-kinaz) inhibitörü ile isleme tabi tutulmasini içerir.
- 2. Istem lideki usul olup, burada kök hücreler ayrismistir.
- 3. Istem 27deki usul olup, burada kök hücreler tekli kök hücrelerdir veya agregat halinde kök hücrelerdir.
- 4. Önceki istemlerin herhangi birindeki usul olup, burada kök hücreler adherent kültürde veya süspansiyon kültüründe kültürlenir.
- 5. Gelismis bir sagkalim oranina ve/veya proliferasyon gücüne sahip bir kök hücreden veya gelismis bir farklilasma etkinligine sahip bir kök hücreden, farklilasmis bir hücrenin üretilmesi için bir usul olup, söz konusu usul bir pluripotent insan kök hücresinin bir ROCK inhibitörü mevcudiyetinde kültürlenmesini içerir.
- 6. Istem 1 ila 53ten herhangi birindeki gibi bir usul olup, burada ROCK inhibitörü Y-27632, Fasudil veya H-11527dir.
- 7. Bir pluripotent insan kök hücresi ve bir ROCK inhibitörü içeren bir hücre preparasyonu.
- 8. Istem Tdeki gibi bir hücre preparasyonu olup, burada kök hücre ayrismistir.
- 9. Istem 7 veya 8,deki gibi bir hücre preparasyonu olup, burada ROCK inhibitörü Y-27632, Fasudil veya H-l 152idir.
- 10. Bir ROCK inhibitörünün (i) bir pluripotent insan kök hücresi kültüründe klonlama veriminin veya pasajlama veriminin desteklenmesinde ve/Veya iyilestirilmesinde, (ii) bir pluripotent insan kök hücresi kültüründe koloni olusumunun desteklenmesinde ve/Veya iyilestirilmesinde ve/Veya (iii) bir kültürde pluripotent insan kök hücrelerinin sagkaliminin desteklenmesinde ve/Veya iyilestirilmesinde kullanimi.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006257780 | 2006-09-22 | ||
| JP2007118183A JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2007-04-27 | 幹細胞の培養方法 |
| GBGB0710095.1A GB0710095D0 (en) | 2006-09-22 | 2007-05-25 | Culture method of stem cell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201809759T4 true TR201809759T4 (tr) | 2018-07-23 |
Family
ID=38265386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/09759T TR201809759T4 (tr) | 2006-09-22 | 2007-09-24 | Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20100009442A1 (tr) |
| EP (1) | EP2066786B1 (tr) |
| JP (3) | JP2008099662A (tr) |
| AU (1) | AU2007298734B2 (tr) |
| CA (1) | CA2663978A1 (tr) |
| DK (1) | DK2066786T3 (tr) |
| ES (1) | ES2677319T3 (tr) |
| GB (2) | GB0710095D0 (tr) |
| IL (1) | IL197684A0 (tr) |
| RU (1) | RU2009115186A (tr) |
| TR (1) | TR201809759T4 (tr) |
| WO (1) | WO2008035110A1 (tr) |
Families Citing this family (110)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
| PT1888123E (pt) | 2005-06-08 | 2013-03-13 | Janssen Biotech Inc | Uma terapêutica celular para a degeneração ocular |
| US8129187B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-03-06 | Kyoto University | Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2 |
| CN101356270B (zh) | 2005-12-13 | 2014-02-12 | 国立大学法人京都大学 | 核重新编程因子 |
| US8278104B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
| US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
| JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
| JP5419279B2 (ja) * | 2007-01-17 | 2014-02-19 | ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 改良された幹細胞の培養 |
| US9213999B2 (en) | 2007-06-15 | 2015-12-15 | Kyoto University | Providing iPSCs to a customer |
| JP2008307007A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Bayer Schering Pharma Ag | 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞 |
| US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
| BRPI0814894A2 (pt) | 2007-07-31 | 2014-10-21 | Lifescan Inc | Diferenciação de células-tronco embrionárias de ser humano. |
| CN101765657A (zh) | 2007-11-09 | 2010-06-30 | Rnl生物技术株式会社 | 分离和培养来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法 |
| CA2954431C (en) | 2007-11-27 | 2021-08-24 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
| CN105886459A (zh) * | 2008-02-21 | 2016-08-24 | 詹森生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
| US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
| CN101855350B (zh) | 2008-05-02 | 2014-12-31 | 国立大学法人京都大学 | 核重编程序方法 |
| EP2314671B1 (en) * | 2008-06-06 | 2022-08-03 | Riken | Method for culture of stem cell |
| ES2552240T3 (es) | 2008-06-30 | 2015-11-26 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de las células madre pluripotentes |
| AU2009308967C1 (en) | 2008-10-31 | 2017-04-20 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
| EP2350265B1 (en) | 2008-10-31 | 2019-04-17 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
| US8895300B2 (en) * | 2008-11-04 | 2014-11-25 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
| MX356756B (es) * | 2008-11-20 | 2018-06-11 | Centocor Ortho Biotech Inc | Células madre pluripotentes en microportadores. |
| RU2547925C2 (ru) * | 2008-11-20 | 2015-04-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Способы и композиции для закрепления и культивирования клеток на плоских носителях |
| US8642334B2 (en) | 2009-02-17 | 2014-02-04 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Methods of neural conversion of human embryonic stem cells |
| WO2010096746A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for the differentiation of stem cells |
| EP2401364B1 (en) * | 2009-02-27 | 2015-04-22 | Cellular Dynamics International, Inc. | Differentiation of pluripotent cells |
| WO2010107392A1 (en) | 2009-03-20 | 2010-09-23 | Agency For Science, Technology And Research | Culture of pluripotent and multipotent cells on microcarriers |
| ES2693088T3 (es) | 2009-07-20 | 2018-12-07 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de células madre embriónicas humanas |
| KR101786735B1 (ko) | 2009-07-20 | 2017-10-18 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
| RU2579278C2 (ru) | 2009-07-20 | 2016-04-10 | Янссен Байотек, Инк. | Популяция панкреатических эндокринных клеток-предшественников для снижения концентрации глюкозы в крови и способ дифференцировки панкреатических эндодермальных клеток |
| CN102597218B (zh) * | 2009-08-12 | 2017-10-27 | 国立大学法人京都大学 | 用于诱导多能干细胞分化成神经前体细胞的方法 |
| US11261425B2 (en) | 2009-08-12 | 2022-03-01 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells |
| CN113621576A (zh) | 2009-10-16 | 2021-11-09 | 斯克里普斯研究所 | 多能细胞的诱导 |
| EP3255142A1 (en) | 2009-10-19 | 2017-12-13 | Cellular Dynamics International, Inc. | Cardiomyocyte production |
| JP5787370B2 (ja) | 2009-11-05 | 2015-09-30 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 幹細胞の分化誘導方法 |
| KR102073730B1 (ko) | 2009-11-17 | 2020-02-05 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 인간 ｒｐｅ 세포의 생산 방법 및 인간 ｒｐｅ 세포의 제약 제제 |
| EP2508595B1 (en) * | 2009-12-01 | 2016-11-23 | National Cancer Center | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
| BR112012017761A2 (pt) | 2009-12-23 | 2015-09-15 | Centocor Ortho Biotech Inc | diferenciação das células-tronco embrionárias humanas |
| KR101764404B1 (ko) | 2009-12-23 | 2017-08-03 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
| CA2791476C (en) | 2010-03-01 | 2020-06-30 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
| US20130071927A1 (en) * | 2010-05-05 | 2013-03-21 | Sydney Ivf Limited | Media and methods for cell culture |
| MX351515B (es) | 2010-05-12 | 2017-10-17 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
| WO2011158960A1 (en) * | 2010-06-15 | 2011-12-22 | Kyoto University | Method for selecting human induced pluripotent stem cells |
| EP2598635B1 (en) | 2010-07-30 | 2014-10-22 | Cambridge Enterprise Limited | Corticogenesis of human pluripotent cells |
| US9279107B2 (en) * | 2010-08-05 | 2016-03-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Simplified basic media for human pluripotent cell culture |
| NZ607608A (en) | 2010-08-09 | 2014-03-28 | Takeda Pharmaceuticals Co | Method of producing pancreatic hormone-producing cells |
| KR101836855B1 (ko) | 2010-08-31 | 2018-04-19 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 만능 줄기 세포의 분화 |
| PL2611910T3 (pl) | 2010-08-31 | 2018-06-29 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych |
| US9506036B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| US9181529B2 (en) | 2010-10-19 | 2015-11-10 | Cellular Dynamics International, Inc. | Titration of differentiation medium components |
| AU2011328087A1 (en) | 2010-11-09 | 2013-06-06 | Lonza Cologne Gmbh | Method for controlling binding of cells to a substrate |
| KR102160721B1 (ko) * | 2010-12-22 | 2020-09-29 | 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 | 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼 |
| PT105484A (pt) | 2011-01-14 | 2012-07-16 | Univ Nova De Lisboa | Um método de ambientómica funcional para engenharia de meio de cultura celular |
| KR101293637B1 (ko) | 2011-01-14 | 2013-08-13 | 서울대학교병원 | 줄기세포의 부유배양용 조성물 |
| WO2012135621A2 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Cellular Dynamics International. Inc | Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation |
| CN102787094B (zh) * | 2011-05-17 | 2015-09-23 | 李晖 | 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法 |
| AU2012326137B2 (en) | 2011-10-17 | 2018-11-29 | Minerva Biotechnologies Corporation | Media for stem cell proliferation and induction |
| US10808224B2 (en) | 2011-10-31 | 2020-10-20 | Riken | Method for culturing stem cell |
| WO2013067362A1 (en) | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment |
| MX2014007744A (es) | 2011-12-22 | 2015-01-12 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionicas humanas en celulas individuales positivas de insulina hormonal. |
| EP2823037A4 (en) | 2012-03-07 | 2015-09-16 | Janssen Biotech Inc | DEFINED MEDIA FOR THE EXPANSION AND CARE OF PLURIPOTENTAL STEM CELLS |
| MX358590B (es) | 2012-06-08 | 2018-08-24 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas. |
| EP2860239B1 (en) | 2012-06-08 | 2019-11-13 | Riken | Vessel for culturing human es cells |
| CA2880010A1 (en) * | 2012-07-24 | 2014-01-30 | Minerva Biotechnologies Corporation | Nme variant species expression and suppression |
| AU2013248265B2 (en) * | 2012-11-08 | 2018-11-01 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
| RU2658488C2 (ru) | 2012-12-31 | 2018-06-21 | Янссен Байотек, Инк. | Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток |
| US10370644B2 (en) * | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
| KR101942769B1 (ko) | 2012-12-31 | 2019-01-28 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
| CA2896750A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells |
| RU2015140912A (ru) * | 2013-02-25 | 2017-03-30 | Дженентек, Инк. | Культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких питательных средах |
| US10081609B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-25 | The Broad Institute, Inc. | Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof |
| EP2989198A4 (en) | 2013-04-26 | 2016-10-26 | Sloan Kettering Inst Cancer | CORTICAL INTERNEURONES AND OTHER NEURONAL CELLS PRODUCED BY DIRECTED DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT AND MULTIPOTENT CELLS |
| AU2014303443B2 (en) | 2013-08-06 | 2020-11-12 | Riken | Method for producing anterior eye segment tissue |
| CA2931278A1 (en) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | Riken | Method for manufacturing telencephalon or progenitor tissue thereof |
| JP6366944B2 (ja) * | 2014-01-24 | 2018-08-01 | 国立大学法人 東京大学 | プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法並びにそのための組成物および組合せ |
| JP6422221B2 (ja) * | 2014-03-04 | 2018-11-14 | 旭化成株式会社 | 多能性幹細胞からなる細胞塊製造方法 |
| KR102670874B1 (ko) | 2014-03-04 | 2024-05-31 | 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 | 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼 |
| MX2016015004A (es) | 2014-05-16 | 2017-06-27 | Janssen Biotech Inc | Uso de moleculas pequeñas para mejorar la expresion de mafa en celulas endocrinas pancreaticas. |
| JP5950055B2 (ja) | 2014-05-22 | 2016-07-13 | 住友ベークライト株式会社 | 細胞塊用培養容器 |
| JP6789814B2 (ja) | 2014-07-25 | 2020-11-25 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法 |
| CN107075472A (zh) * | 2014-08-22 | 2017-08-18 | 剑桥企业有限公司 | 重置多能干细胞 |
| ES2972541T3 (es) | 2014-09-08 | 2024-06-13 | Riken | Método para producir tejido progenitor cerebeloso |
| JP6421374B2 (ja) * | 2014-09-30 | 2018-11-14 | 株式会社ジェイテックコーポレーション | 万能性幹細胞の培養方法 |
| MY183058A (en) * | 2014-10-24 | 2021-02-09 | Riken | Production method for retinal tissue |
| CA2965248A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. | Production method for nerve tissue |
| WO2016121737A1 (ja) * | 2015-01-29 | 2016-08-04 | 株式会社カネカ | 細胞凝集塊の作製方法 |
| EP3263697B1 (en) * | 2015-02-27 | 2021-03-31 | Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. | Culture medium for culturing mesenchymal stem cell, method for culturing mesenchymal stem cell, and mesenchymal stem cell |
| US10246679B2 (en) | 2015-03-02 | 2019-04-02 | The University Of Tokyo | Method for producing pluripotent stem cell having improved chimera forming ability from primed pluripotent stem cell, and composition and combination therefor |
| US10384207B2 (en) | 2015-07-21 | 2019-08-20 | Neuro Probe Incorporated | Assay apparatus and methods |
| CN108291237B (zh) | 2015-10-16 | 2023-11-21 | 菲特治疗公司 | 用于诱导和维护基态多能性的平台 |
| EP3418374A4 (en) * | 2016-02-16 | 2020-01-01 | Keio University | CULTURE MEDIUM FOR USE IN THE DIFFERENTIATION OF A PLURIPOTENT STEM CELL FROM A NEURAL STEM CELL, AND ASSOCIATED USE |
| JP6754966B2 (ja) * | 2016-02-25 | 2020-09-16 | 国立大学法人広島大学 | 始原生殖細胞の培養方法及び始原生殖細胞の培養用培地添加物 |
| MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
| WO2017183732A1 (ja) | 2016-04-22 | 2017-10-26 | 大日本住友製薬株式会社 | 網膜組織の製造法 |
| CA3083253A1 (en) | 2017-11-30 | 2019-06-06 | Kyoto University | Method for culture of cells |
| WO2019199881A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods for in vitro expansion of adult tissue stem cells |
| WO2020077266A1 (en) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for cell culture |
| WO2021004864A1 (en) * | 2019-07-05 | 2021-01-14 | Novo Nordisk A/S | Generation of neural stem cell lines derived from human pluripotent stem cells |
| EP4092101A4 (en) | 2020-01-14 | 2024-03-06 | Ajinomoto Co., Inc. | CELL CULTURE METHOD |
| KR20220128645A (ko) | 2020-01-14 | 2022-09-21 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 세포의 고밀도 배양 방법 |
| CA3167871A1 (en) | 2020-01-14 | 2021-07-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Medium having reduced osmotic pressure |
| WO2021145319A1 (ja) | 2020-01-14 | 2021-07-22 | 味の素株式会社 | 細胞培養用培地組成物 |
| CA3178695A1 (en) | 2020-03-31 | 2021-10-07 | Fujita Academy | Method for separating pituitary hormone-producing cells and progenitor cells thereof |
| AU2021263179A1 (en) * | 2020-04-30 | 2022-11-17 | Oriental Yeast Co.,Ltd. | Stem cell medium and stem cell culturing method |
| IL309344A (en) | 2021-06-17 | 2024-02-01 | Univ Kyoto | A method for producing the preparation of cortical cells derived from human pluripotent stem cells |
| CN118043448A (zh) | 2021-09-28 | 2024-05-14 | 学校法人藤田学园 | 使用细胞表面标记物的垂体细胞和下丘脑细胞的分离方法 |
| CA3238664A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Riken | Production method for sheet-like retinal tissue |
| CN114480268B (zh) * | 2022-01-21 | 2024-01-30 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞的制备方法 |
| CN114736302B (zh) * | 2022-05-12 | 2022-10-25 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 一种干细胞无血清培养基 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1131407B1 (en) | 1998-11-09 | 2006-10-11 | Consorzio per la Gestione del Centro di Biotecnologie Avanzate | Serum free medium for chondrocyte-like cells |
| US20030232430A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-12-18 | Advanced Cell Technology | Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells |
| US20040224401A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-11-11 | Ludwig Tenneille E. | Physiochemical culture conditions for embryonic stem cells |
| WO2005080394A1 (en) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Bioaxone Therapeutique Inc. | 4-substituted piperidine derivatives |
| JP4576545B2 (ja) * | 2004-05-27 | 2010-11-10 | 独立行政法人理化学研究所 | 羊膜由来因子による胚性幹細胞の培養方法 |
| JP5141016B2 (ja) | 2004-06-18 | 2013-02-13 | 独立行政法人理化学研究所 | 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法 |
| US20060142193A1 (en) | 2004-11-09 | 2006-06-29 | Baylor College Of Medicine | Selective inhibition of rock1 in cardiac therapy |
| DK2420565T3 (en) * | 2006-02-23 | 2017-12-04 | Viacyte Inc | APPLICABLE COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTIVATING DIFFERENTIBLE CELLS |
| WO2007130664A2 (en) | 2006-05-03 | 2007-11-15 | Advanced Cell Technology, Inc. | Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells |
| JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
| JP5419279B2 (ja) * | 2007-01-17 | 2014-02-19 | ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 改良された幹細胞の培養 |
-
2007
- 2007-04-27 JP JP2007118183A patent/JP2008099662A/ja active Pending
- 2007-05-25 GB GBGB0710095.1A patent/GB0710095D0/en not_active Ceased
- 2007-09-24 EP EP07804383.3A patent/EP2066786B1/en active Active
- 2007-09-24 TR TR2018/09759T patent/TR201809759T4/tr unknown
- 2007-09-24 JP JP2009528790A patent/JP2010504090A/ja active Pending
- 2007-09-24 ES ES07804383.3T patent/ES2677319T3/es active Active
- 2007-09-24 US US12/442,245 patent/US20100009442A1/en not_active Abandoned
- 2007-09-24 AU AU2007298734A patent/AU2007298734B2/en active Active
- 2007-09-24 WO PCT/GB2007/003636 patent/WO2008035110A1/en active Application Filing
- 2007-09-24 CA CA002663978A patent/CA2663978A1/en not_active Abandoned
- 2007-09-24 RU RU2009115186/10A patent/RU2009115186A/ru not_active Application Discontinuation
- 2007-09-24 DK DK07804383.3T patent/DK2066786T3/en active
-
2008
- 2008-03-05 GB GB0804056A patent/GB2446525B/en active Active
-
2009
- 2009-03-19 IL IL197684A patent/IL197684A0/en unknown
-
2013
- 2013-01-11 JP JP2013004088A patent/JP5721111B2/ja active Active
-
2016
- 2016-08-29 US US15/250,848 patent/US10626366B2/en active Active
-
2020
- 2020-04-17 US US16/852,361 patent/US11898161B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2007298734A1 (en) | 2008-03-27 |
| IL197684A0 (en) | 2011-08-01 |
| GB0804056D0 (en) | 2008-04-09 |
| GB2446525B (en) | 2009-03-04 |
| AU2007298734B2 (en) | 2013-09-26 |
| EP2066786A1 (en) | 2009-06-10 |
| JP5721111B2 (ja) | 2015-05-20 |
| CA2663978A1 (en) | 2008-03-27 |
| JP2013099345A (ja) | 2013-05-23 |
| WO2008035110A1 (en) | 2008-03-27 |
| US20100009442A1 (en) | 2010-01-14 |
| EP2066786B1 (en) | 2018-05-02 |
| US20200239838A1 (en) | 2020-07-30 |
| US11898161B2 (en) | 2024-02-13 |
| US10626366B2 (en) | 2020-04-21 |
| ES2677319T3 (es) | 2018-08-01 |
| DK2066786T3 (en) | 2018-07-23 |
| JP2008099662A (ja) | 2008-05-01 |
| GB0710095D0 (en) | 2007-07-04 |
| JP2010504090A (ja) | 2010-02-12 |
| US20170029771A1 (en) | 2017-02-02 |
| GB2446525A (en) | 2008-08-13 |
| RU2009115186A (ru) | 2010-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201809759T4 (tr) | Kök hücre kültürü besiyeri ve usulü. | |
| AU2021225187B2 (en) | Methods for differentiating pluripotent cells | |
| US11560546B2 (en) | Methods for neural conversion of human embryonic stem cells | |
| EP3119881B1 (en) | Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof | |
| DK2694644T3 (en) | Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation | |
| EP2314671B1 (en) | Method for culture of stem cell | |
| JP5128946B2 (ja) | 胚性幹細胞のフィーダー非依存性長期培養 | |
| US10087417B2 (en) | Three-dimensional model of human cortex | |
| JPWO2016013669A1 (ja) | 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法 |