CN114981411A - 细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供细胞的培养方法，其包括以下的工序：调制长径400μm以下的细胞块的集团的第1工序、及对在第1工序中得到的细胞块的集团进行悬浮培养的第2工序。

Description

细胞的培养方法
【技术领域】
本发明涉及细胞的培养方法，具体而言，涉及包括控制细胞块的尺寸的工序的细胞的培养方法。
【背景技术】
使用细胞的再生医疗技术作为可治疗至今难以治疗的各种各样的疾病或损伤的手段之一，近年，非常地关注。由于再生医疗需要大量的细胞，意欲推进有效培养细胞的方法的开发。例如，在专利文献1中报告了包括在培养基中将干细胞用ROCK抑制剂处理的干细胞的培养方法。
为了稳定培养细胞，增殖，定期的的培养基更换或传代等的作业是必须的。由于涉及的作业有重复进行烦琐的过程的必要，作业者的负担大，或还有因作业者的技术的巧拙而对细胞增殖效率等有影响这样的问题。因此，近年，监测培养基的pH或气体浓度这样的培养环境，根据需要进行自动优化这些细胞培养装置(在本说明书中，有时称为“生物反应器”等)的开发或活用。作为涉及的生物反应器的一例，可举出例如，Sartorius公司的“ambr(注册商标)”细胞培养装置。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特开2008-099662号公报
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
由生物反应器的使用，大幅地改善细胞培养中的作业者的负担或起因于作业者的问题。但是一方面，在使用生物反应器时，对于当采用何种条件时可优化细胞增殖的效率，在现时点难说有充分的探讨。
从而，本发明以在使用生物反应器的细胞培养中，由简便并且廉价的手段提高细胞增殖的效率的方法的提供作为目的。
【用于解决课题的手段】
本发明人针对上述课题进行锐意探讨的结果发现，当通过控制要培养的细胞的细胞块尺寸来调制大量比较小的细胞块时，可实现非常地优选的高密度培养，通过基于涉及的见解推进进一步研究，从而完成本发明。即，本发明如下。
[1]包括以下的工序的细胞的培养方法：
调制长径400μm以下的细胞块的集团的第1工序、及
对在第1工序中得到的细胞块的集团进行悬浮培养的第2工序。
[2][1]所述的方法，其中第1工序中的细胞块的长径的平均值是110μm以下。
[3][1]或[2]所述的方法，其中第1工序中的细胞块的长径的中位值是90μm以下。
[4][1]～[3]之任一项所述的方法，其特征在于，第1工序和第2工序连续进行。
[5][1]～[4]之任一项所述的方法，其中第1工序的细胞块的集团的调制使用旋转瓶进行。
[6][1]～[5]之任一项所述的方法，其中在第2工序中使用的培养基中的钙离子的浓度是0.07～0.25mM。
[7][1]～[3]之任一项所述的方法，其特征在于，第1工序的细胞块的集团的调制由钙离子的浓度的调制进行，上述钙离子的浓度是0.07～0.25mM。
[8][6]或[7]所述的方法，其特征在于，还将镁离子的浓度设为0.5～0.65mM。
[9][1]～[8]之任一项所述的方法，其中第2工序中的悬浮培养使用生物反应器进行。
[10][1]～[9]之任一项所述的方法，其中细胞是干细胞。
[11][10]所述的方法，其中干细胞是iPS细胞。
[12]细胞的培养方法，其包括在具有0.07～0.25mM的钙离子浓度的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。
[13][12]所述的方法，其中细胞是干细胞。
[14][13]所述的方法，其中干细胞是iPS细胞。
【发明的效果】
由本发明，可用非常地廉价并且简便的方法实现优选的高密度培养。
【附图的简单的说明】
【图1】图1是显示在本申请实施例中，iPS细胞数的经时变化的图。
【图2】图2是显示在本申请实施例中，使用旋转瓶调制的细胞块的集团的尺寸分布(第3天的时间点，供于生物反应器中的悬浮培养之前、n＝4)的图。
【图3】图3是显示进行细胞块尺寸的控制时和不进行细胞块尺寸的控制时的细胞数的经时变化的图。
【图4】图4是显示进行细胞块尺寸的控制时和不进行细胞块尺寸的控制时的细胞块的尺寸分布(第3天的时间点)的图。
【图5】图5是显示使用条件1～3对iPS细胞进行培养之时的，细胞数的变化的图。
【图6】图6是显示使用条件1～3对iPS细胞进行培养之时的，细胞块的尺寸分布的图。
【图7】图7是显示Ca2+及Mg2+的培养基中的浓度对iPS细胞的增殖的影响的图。
【图8】图8是显示培养基中的Ca2+浓度对iPS细胞的细胞块的尺寸的影响的图。
【图9】图9是显示培养基中的Ca2+浓度对iPS细胞的活细胞密度(VCD)的影响的图。
【图10】图10是显示培养基中的Ca2+浓度对iPS细胞的细胞块数的影响的图。
【图11】图11是显示培养基中的Ca2+浓度对iPS细胞的细胞块的尺寸的影响的图。
【图12】图12是显示培养基中的Ca2+浓度对iPS细胞的活细胞密度(VCD)的影响的图。
【图13】图13是显示培养基中的Ca2+浓度对iPS细胞的细胞块数的影响的图。
【具体实施方式】
以下，对本发明详细地进行说明。
【定义】
在本说明书中，“悬浮培养”是指在细胞不接附于培养容器的状态下进行的细胞培养方法。在本发明中，悬浮培养可伴随对于液体培养基的自外部的压力或振动、或者，所述液体培养基中的振荡或旋转操作，也可不伴随。
在本说明书中，“细胞块”是指将细胞供于悬浮培养之时，细胞彼此接附而形成的细胞的凝集体。细胞块有时也称为球(或者球形)。
在本说明书中，细胞块的尺寸设为通过对其长径进行测定来确定的。细胞块的尺寸的测定可使用公知的方法。细胞块的尺寸的测定可使用例如，BZ-X710(Keyence公司)等的市售的装置简便地进行。
【细胞的培养方法1】
本发明提供包括以下的工序的细胞的培养方法(以下，有时称为“本发明的方法1”)：
调制长径400μm以下的细胞块的集团的第1工序、及
对在第1工序中得到的细胞块的集团进行悬浮培养的第2工序。
在本发明的方法1中的第1工序以调制比较小的尺寸的细胞块的集团作为目的。
在本发明的方法1中，由第1工序调制的细胞块的尺寸(即，细胞块的长径)的上限是400μm。具有这以上的长径的细胞块供于进一步的的悬浮培养时位于细胞块的中心部分的细胞无法从培养基摄取必要的成分而容易引发凋亡，从细胞增殖的观点来看，不优选。另外，在细胞是干细胞时，不仅中心部分的细胞变得容易引发凋亡，无法维持未分化的状态，作为结果，发生品质不均一的干细胞集团的悬念也升高。
在本发明的方法1的一实施方式中，由第1工序调制的细胞块的长径的上限可通常为400μm、优选为390μm、380μm、370μm、360μm、350μm、340μm、330μm、320μm、310μm、300μm、290μm、280μm、270μm、260μm、250μm、240μm、230μm、220μm、210μm、或者200μm。
另外，在本发明的方法1的一实施方式中，细胞块的长径的平均值可为400μm以下，优选为300μm以下，250μm以下，200μm以下，190μm以下，180μm以下，170μm以下，160μm以下，150μm以下，140μm以下，130μm以下，120μm以下，110μm以下，100μm以下，95μm以下，90μm以下，85μm以下，或者80μm以下。在一实施方式中，细胞块的长径的平均值也可为80～400μm、80～300μm、80～250μm、80～200μm、80～190μm、80～180μm、80～170μm、80～160μm、80～150μm、80～140μm、80～130μm、80～120μm、80～110μm、80～100μm、80～95μm、80～90μm、或者80～85μm。
另外，在本发明的方法1的别的一实施方式中，细胞块的长径的中位值可为400μm以下，优选为300μm以下，250μm以下，200μm以下，190μm以下，180μm以下，170μm以下，160μm以下，150μm以下，140μm以下，130μm以下，120μm以下，110μm以下，100μm以下，95μm以下，90μm以下，85μm以下，80μm以下，75μm以下，或者70μm以下。在一实施方式中，细胞块的长径的中位值也可为70～400μm、70～300μm、70～250μm、70～200μm、70～190μm、70～180μm、70～170μm、70～160μm、70～150μm、70～140μm、70～130μm、70～120μm、70～110μm、70～100μm、70～95μm、70～90μm、70～85μm、70～80μm、或者70～75μm。
本发明的方法1的第1工序只要是可调制上述的细胞块的尺寸，就也可使用公知的任何方法。例如，本发明的方法1的第1工序可通过使用旋转瓶对细胞进行悬浮培养来达成。简言之，已知将一常数的细胞用旋转瓶悬浮培养时，叶轮的转数越少，一定期间后形成的细胞块的尺寸变大，转数越多，一定期间后形成的细胞块的尺寸变小。从而，只要是本领域技术人员，就可通过适宜确定旋转瓶的叶轮的转数，容易地调制期望的尺寸的细胞块。
作为旋转瓶，只要是可调制具有目的尺寸的细胞块，就不特别限定，使用市售的即可。在作为细胞，使用iPS细胞时，适宜地使用例如，iPS细胞用30mL一次性生物反应器(ABLE公司制、型号BWV-S03A)等。
或者，也可通过调制比较大的尺寸的细胞块的集团之后，通过具备适合的孔径的网等而分割细胞块，调制具有上述的优选的尺寸的细胞块的集团。
再者，在别的一实施方式中，也可由使用低接附板的悬浮培养调制具有目的尺寸的细胞块。作为在涉及的方法中使用的低接附板，可举出例如“Corning(注册商标)Elplasia(注册商标)板”等，但不限于此。
作为网，只要是能灭菌，就不特别限定，可举出例如，尼龙网或不锈钢等的金属制网等。网的孔径是，在例如尼龙网时，开口部为约20～100μm、优选为约30～70μm、更优选为约40～60μm，但不限于这些。网的形状等也不特别限定，优选具有尽可能不给细胞损伤的粗度和形状。例如，由于不锈钢等的金属网容易使网的粗度变细，优选分割时给细胞的损伤比较少。
另外，在别的一实施方式中，具有期望的尺寸的细胞块的调制也可通过调节钙离子(Ca2+)的培养基中的浓度来进行。另外，在别的一实施方式中，具有期望的尺寸的细胞块的调制也可通过调节钙离子(Ca2+)及镁离子(Mg2+)的培养基中的浓度来进行。
在调制比较小的尺寸的细胞块的工序(即，第1工序)中使用的培养基的钙离子的浓度只要是可调制期望的尺寸的细胞块，就不特别限定，可设为例如，以下的浓度范围：
(1)Ca2+＝0.07～0.25mM
(2)Ca2+＝0.10～0.25mM
(3)Ca2+＝0.13～0.25mM
(4)Ca2+＝0.18～0.25mM
(5)Ca2+＝0.20～0.25mM。
另外，在调整钙离子和镁离子的浓度时，钙离子及镁离子的浓度范围只要是可调制期望的尺寸的细胞块，就不特别限定，可设为例如，以下的浓度范围：
(6)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.25mM/0.5～0.65mM
(7)Ca2+/Mg2+＝0.10～0.25mM/0.5～0.65mM
(8)Ca2+/Mg2+＝0.13～0.25mM/0.5～0.65mM
(9)Ca2+/Mg2+＝0.18～0.25mM/0.5～0.65mM
(10)Ca2+/Mg2+＝0.20～0.25mM/0.5～0.65mM。
第1工序的实施方式不限定于上述的2个形态，还可使用代替网而使用酶分割细胞块的方法等。
在本发明的方法1的一实施方式中，第1工序的细胞块的集团的调制使用旋转瓶进行。旋转瓶的使用是廉价并且简便，另外，在可最小限度地抑制给细胞块的物理/化学损伤的点优选。
在本发明的方法1的第2工序中，以通过将第1工序中得到的细胞块的集团供于悬浮培养，使细胞进一步增殖作为目的。
在第2工序中的悬浮培养只要是构成细胞块的细胞可增殖，就无特别限定，只要使用公知的悬浮培养方法即可。在一实施方式中，可使用市售的生物反应器等，由公知的条件悬浮培养。
在一实施方式中，优选调节本发明的方法1的第2工序中使用的培养基的钙离子的浓度。在第2工序中使用的培养基的钙离子的浓度范围可设为例如，以下的浓度范围：
(1)Ca2+＝0.07～0.25mM
(2)Ca2+＝0.10～0.25mM
(3)Ca2+＝0.13～0.25mM
(4)Ca2+＝0.18～0.25mM
(5)Ca2+＝0.20～0.25mM。
另外，在别的一实施方式中，在本发明的方法1的第2工序中使用的培养基的钙离子的浓度范围可设为例如，以下的浓度范围：
(6)Ca2+＝0.07～0.25mM
(7)Ca2+＝0.07～0.22mM
(8)Ca2+＝0.07～0.20mM
(9)Ca2+＝0.07～0.18mM
(10)Ca2+＝0.07～0.15mM。
另外，也可与第1工序同样，调节第2工序中使用的培养基的钙离子和镁离子的浓度。第2工序中的优选的钙离子及镁离子的浓度范围只要是得到了本发明的期望的效果，就不特别限定可设为例如，以下的浓度范围：
(1)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.25mM/0.5～0.65mM
(2)Ca2+/Mg2+＝0.10～0.25mM/0.5～0.65mM
(3)Ca2+/Mg2+＝0.13～0.25mM/0.5～0.65mM
(4)Ca2+/Mg2+＝0.18～0.25mM/0.5～0.65mM
(5)Ca2+/Mg2+＝0.20～0.25mM/0.5～0.65mM。
在本发明的方法1的一实施方式中，也优选不使第1工序中使用的培养基的钙离子和/或镁离子的浓度降低到上述的范围，而设为一般使用的培养基的钙浓度和/或镁离子浓度(例、钙离子：0.8～1.2mM、镁离子：0.8～1.2mM)，仅将第2工序中使用的培养基的钙离子和/或镁离子的浓度设为上述的浓度范围。
在本发明的方法1的别的一实施方式中，也可连续实施第1工序和第2工序。更具体而言，可通过在某培养系中调制大量比较小的尺寸的细胞块之后，不变更所述培养系，持续直接培养来达成期望的高密度培养时，无设定明确的第2工序的必要，也可将继续实施第1工序置换为第2工序的实施。
可适用本发明的方法1的细胞种只要是通过供于悬浮培养形成球的细胞，就不特别限定。作为涉及的细胞种，含例如，精子或卵子等的生殖细胞、构成生物体的体细胞、干细胞(多能性干细胞等)、前体细胞、从生物体分离的癌细胞、从生物体分离而获得永生化能而在体外稳定维持的细胞(细胞株)、从生物体分离而人为形成基因改变的细胞、从生物体分离而人为更换核的细胞等。作为构成生物体的体细胞的例，包括但不限于：成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、周皮细胞、树突细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、微神经胶质、星状胶细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑色素细胞、造血前体细胞(例如，来源于脐带血的CD34阳性细胞)、及单核细胞等。所述体细胞含从例如皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(含脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等的任意的组织采集的细胞。
干细胞是指兼备复制自身的能力和分化为其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例，包括但不限于：胚胎干细胞(ES细胞)、胚性肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、人工多能性干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛包干细胞等。
细胞株是指由生物体外的人为的操作获得无限的增殖能的细胞，作为其例，包括但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎儿肾细胞)、HeLa(人子宫癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。
在本发明的方法1的优选的一实施方式中，细胞是干细胞，更优选为iPS细胞。
在本发明的方法1中的第1工序及第2工序中使用的培养基只要是可达成细胞增殖，就不特别限定。使用的培养基可在第1工序及第2工序中相同，也可不同。使用的培养基，根据培养的细胞，可由公知的方法调制，另外也可为市售品。
作为可使用的培养基，可举出例如，Dulbecco改变Eagle培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium)(DMEM)、HamF12培养基(Ham's Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy5A培养基(McCoy's 5A Medium)、最小必须培养基(Minimum EssentialMedium)(MEM)、Eagle最小必须培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)、α改变型Eagle最小必须培养基(αModified Eagle's Minimum Essential Medium)(αMEM)、Roswell Park记念研究所(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)1640培养基、Iscove改变Dulbecco培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E(William's Medium E)、Fisher培养基(Fischer's Medium)等。
另外，特别是，作为在干细胞的培养中使用的培养基，可举出STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(Life Technologies公司)、mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies公司)、TeSR2培养基(STEMCELL Technologies公司)、TeSR-E8培养基(STEMCELLTechnologies公司)、Essential 8培养基(Life Technologies公司)、HEScGRO(商标)Serum-Free Medium for hES cells(Millipore公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPSMedium(EMD Millipore公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek公司)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(Stemgent公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(Biological IndustriesIsrael Beit-Haemek公司)、S-medium(DSPharmaBiomedical株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF-FX培养基、CDM培养基、DEF-CS 500Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium(Cellartis公司)、StemFlex培养基(ThermoFisher Scientific公司)等。
在本发明的方法1的一实施方式中，也可向第1工序和/或第2工序中使用的培养基进一步添加对于细胞增殖优选的成分。作为涉及的成分，可举出例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等的糖；天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等的氨基酸；白蛋白、转铁蛋白等的蛋白质；甘氨酰甘氨酰甘氨酸、大豆肽等的肽；血清；胆碱、维生素A、维生素B组(硫胺素、核黄素、吡哆素、氰基钴胺、生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等)、维生素C、维生素E等的维生素；油酸、花生四烯酸、亚油酸等的脂肪酸；胆甾醇等的脂质；氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠等的无机盐；锌、铜、硒等的微量元素；N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES))、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid(HEPES))、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine))等的缓冲剂；两性霉素B、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素等的抗生物质；I型胶原、II型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸等的细胞接附因子及细胞外基质成分；白细胞介素、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)-α、转化生长因子(TGF)-β、血管内皮生长因子(VEGF)、激活素A等的细胞因子及生长因子；地塞米松、氢化可的松、雌二醇、黄体酮、胰高血糖素、胰岛素等的激素等，可对应于培养的细胞的种类选择使用适合的成分。
在本发明的方法1的优选的一实施方式中，也可向第1工序和/或第2工序中使用的培养基追加添加D-葡萄糖及5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(或者胱氨酸)、甲硫氨酸、精氨酸)。
葡萄糖(或者其盐)可以换算为葡萄糖的浓度而成为通常0.1g/L/天～900g/L/天、优选为1g/L/天～200g/L/天、更优选为1g/L/天～20g/L/天的方式添加到培养基中。
另外，5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(胱氨酸)、甲硫氨酸及精氨酸)可以色氨酸的浓度(换算为游离体的色氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～11000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、丝氨酸的浓度(换算为游离体的丝氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～425000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、半胱氨酸或胱氨酸的浓度(换算为游离体的半胱氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～280000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、甲硫氨酸的浓度(换算为游离体的甲硫氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～55000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、精氨酸的浓度(换算为游离体的精氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～150000mg/L/天、优选为1mg/L/天～2000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～200mg/L/天的方式添加到培养基中。
在将本发明的方法1适用于干细胞时，在优选的一实施方式中，也可向第1工序和/或第2工序中使用的培养基每一定期间追加添加bFGF。
在本发明的方法1中，细胞的培养条件只要是对应于细胞种选择公知的方法即可。例如，培养温度可通常为25℃～39℃、优选为33℃～39℃。作为二氧化碳浓度，可通常为4体积％～10体积％、优选为4体积％～6体积％。作为氧浓度，可通常为1体积％～25体积％、优选为4体积％～20体积％。作为培养基更换的频度，可为每2～3天1次、1天1次、或者1天多次(例、2次)。另外，培养基更换可在更换时更换全量，也可更换一部分(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或者90％等)。对于培养基更换时的更换的培养基量，只要是对应于细胞种等适宜确定即可。
【细胞的培养方法2】
本发明另外提供包括在具有0.07～0.25mM的钙离子浓度的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序的细胞的培养方法(以下，有时称为“本发明的方法2”)。
可适用本发明的方法2的细胞种只要是通过供于悬浮培养形成球的细胞，就不特别限定。作为涉及的细胞种，含例如，精子或卵子等的生殖细胞、构成生物体的体细胞、干细胞(多能性干细胞等)、前体细胞、从生物体分离的癌细胞、从生物体分离而获得永生化能而在体外稳定维持的细胞(细胞株)、从生物体分离而人为形成基因改变的细胞、从生物体分离而人为更换核的细胞等。作为构成生物体的体细胞的例，包括但不限于：成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、周皮细胞、树突细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、微神经胶质、星状胶细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑色素细胞、造血前体细胞(例如，来源于脐带血的CD34阳性细胞)、及单核细胞等。所述体细胞含从例如皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(含脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等的任意的组织采集的细胞。
干细胞是指兼备复制自身的能力和分化为其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例，包括但不限于：胚胎干细胞(ES细胞)、胚性肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、人工多能性干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛包干细胞等。
细胞株是指由生物体外的人为的操作获得无限的增殖能的细胞。细胞株是指由生物体外的人为的操作获得无限的增殖能的细胞，作为其例，包括但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎儿肾细胞)、HeLa(人子宫癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。
在本发明的方法2的优选的一实施方式中细胞是干细胞，更优选为iPS细胞。
作为可在本发明的方法2中使用的培养基，可举出例如，Dulbecco改变Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)、HamF12培养基(Ham's NutrientMixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy5A培养基(McCoy's 5A medium)、最小必须培养基(Minimum Essential Medium)(MEM)、Eagle最小必须培养基(Eagle's Minimum EssentialMedium)(EMEM)、α改变型Eagle最小必须培养基(αModified Eagle's Minimum EssentialMedium)(αMEM)、Roswell Park记念研究所(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)1640培养基、Iscove改变Dulbecco培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E(William's Medium E)、Fisher培养基(Fischer's Medium)等。
另外，特别是，作为在干细胞的培养中使用的培养基，可举出STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(Life Technologies公司)、mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies公司)、TeSR2培养基(STEMCELL Technologies公司)、TeSR-E8培养基(STEMCELLTechnologies公司)、Essential 8培养基(Life Technologies公司)、HEScGRO(商标)Serum-Free Medium for hES cells(Millipore公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPSMedium(EMD Millipore公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek公司)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(Stemgent公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(Biological IndustriesIsrael Beit-Haemek公司)、S-medium(DSPharmaBiomedical株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF-FX培养基、CDM培养基、DEF-CS500Xeno-Free 3D Spheroid Culture Medium(Cellartis公司)、StemFlex培养基(ThermoFisher Scientific公司)等。
在本发明的方法2的一实施方式中，也可向使用的培养基进一步添加对于细胞增殖优选的成分。作为涉及的成分，可举出例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等的糖；天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等的氨基酸；白蛋白、转铁蛋白等的蛋白质；甘氨酰甘氨酰甘氨酸、大豆肽等的肽；血清；胆碱、维生素A、维生素B组(硫胺素、核黄素、吡哆素、氰基钴胺、生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等)、维生素C、维生素E等的维生素；油酸、花生四烯酸、亚油酸等的脂肪酸；胆甾醇等的脂质；氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠等的无机盐；锌、铜、硒等的微量元素；N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES))、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid(HEPES))、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine))等的缓冲剂；两性霉素B、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素等的抗生物质；I型胶原、II型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸等的细胞接附因子及细胞外基质成分；白细胞介素、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)-α、转化生长因子(TGF)-β、血管内皮生长因子(VEGF)、激活素A等的细胞因子及生长因子；地塞米松、氢化可的松、雌二醇、黄体酮、胰高血糖素、胰岛素等的激素等，可对应于培养的细胞的种类选择使用适合的成分。
本发明的方法2的特征在于，适合地调整培养基中所含的钙离子浓度。使用的培养基中所含的钙离子浓度范围通常为0.07～0.25mM、优选为0.10～0.25mM、更优选为0.13～0.25mM、再优选为0.18～0.25mM、特别优选为0.20～0.25mM，但不限于这些。
另外，在别的一实施方式中，在本发明的方法2中，培养基中所含的钙离子浓度的范围通常为0.07～0.25mM、优选为0.07～0.22mM、更优选为0.07～0.20mM、再优选为0.07～0.18mM、特别优选为0.07～0.15mM，但不限于这些。
在一实施方式中，也可调整钙离子浓度及镁离子浓度。培养基中所含的钙离子及镁离子的浓度的范围只要是得到了期望的效果，就不特别限定，可设为以下：
(1)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.25mM/0.5～0.65mM
(2)Ca2+/Mg2+＝0.10～0.25mM/0.5～0.65mM
(3)Ca2+/Mg2+＝0.13～0.25mM/0.5～0.65mM
(4)Ca2+/Mg2+＝0.18～0.25mM/0.5～0.65mM
(5)Ca2+/Mg2+＝0.20～0.25mM/0.5～0.65mM。
另外，在别的一实施方式中，培养基中所含的钙离子及镁离子浓度的范围只要是得到了期望的效果，就不特别限定，可设为以下：
(6)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.25mM/0.5～0.65mM
(7)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.22mM/0.5～0.65mM
(8)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.20mM/0.5～0.65mM
(9)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.18mM/0.5～0.65mM
(10)Ca2+/Mg2+＝0.07～0.15mM/0.5～0.65mM。
在本发明的方法2的优选的一实施方式中，也可向使用的培养基追加添加D-葡萄糖及5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(或者胱氨酸)、甲硫氨酸、精氨酸)。
葡萄糖(或者其盐)可以换算为葡萄糖的浓度而成为通常0.1g/L/天～900g/L/天、优选为1g/L/天～200g/L/天、更优选为1g/L/天～20g/L/天的方式添加到培养基中。
另外，5种氨基酸(色氨酸、丝氨酸、半胱氨酸(胱氨酸)、甲硫氨酸及精氨酸)可以色氨酸的浓度(换算为游离体的色氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～11000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、丝氨酸的浓度(换算为游离体的丝氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～425000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、半胱氨酸或胱氨酸的浓度(换算为游离体的半胱氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～280000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、甲硫氨酸的浓度(换算为游离体的甲硫氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～55000mg/L/天、优选为1mg/L/天～1000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～100mg/L/天、精氨酸的浓度(换算为游离体的精氨酸的浓度)成为通常0.1mg/L/天～150000mg/L/天、优选为1mg/L/天～2000mg/L/天、更优选为1mg/L/天～200mg/L/天的方式添加到培养基中。
在将本发明的方法2适用于干细胞时，在优选的一实施方式中，也可向使用的培养基每一定期间追加添加bFGF。
在本发明的方法2中，细胞的培养条件只要是对应于细胞种选择公知的方法即可。例如，培养温度可通常为25℃～39℃、优选为33℃～39℃。作为二氧化碳浓度，可通常为4体积％～10体积％、优选为4体积％～6体积％。作为氧浓度，可通常为1体积％～25体积％、优选为4体积％～20体积％。作为培养基更换的频度，可为每2～3天1次、1天1次、或者1天多次(例、2次)。另外，培养基更换可在更换时更换全量，也可更换一部分(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或者90％等)。对于培养基更换时的更换的培养基量，只要是对应于细胞种等适宜确定即可。
在本发明的方法2中，作为培养开始时的细胞的接种浓度，可通常为1×104个细胞/mL～1×107个细胞/mL、优选为5×104个细胞/mL～5×106个细胞/mL、更优选为5×104个细胞/mL～1×106个细胞/mL、特别优选为1×105个细胞/mL～1×106个细胞/mL，但不限于这些。
在以下的实施例中，对本发明更具体地进行说明，但本发明不受这些例的任何限定。再者，本说明书及实施例中的粒径基准是“个数基准”。
【实施例】
【实施例1：使用旋转瓶的iPS细胞的球形成和细胞增殖】
使用iPS细胞用30mL一次性生物反应器(ABLE公司、型号BWV-S03A)，将iPS细胞1231A3株以6×105个细胞/mL的细胞密度接种到StemFit(注册商标)AK03N+10μM Y-27632(Wako公司、034-24024)中，在CO2温育器内在37℃、CO2浓度＝5％、搅拌速度＝120rpm的条件下搅拌培养。在接种第2天，将7成的培养基用StemFit AK03N更换。在接种第3天，将细胞悬浮液10mL再悬浮于新鲜的StemFit AK03N+200ng/mL bFGF(Peprotech)，移到生物反应器的ambr15(sartorius公司、型号001-0881)，持续在37℃、pH＝7.2、溶解氧浓度＝4％、搅拌速度＝300rpm的条件下搅拌培养。另外，使用BZ-X710(Keyence)定量细胞块的长径(仅以细胞块作为对象，对长径进行测定的目的而截止值设定为50μm)。将7成的培养基用StemFitAK03N+200ng/mL bFGF1天2次更换，再者向培养基添加40mg/L/天Trp(味之素公司)、40mg/L/天Ser(味之素公司)、40mg/L/天Cys盐酸盐(日本蛋白公司)、40mg/L/天Met(味之素公司)、160mg/L/天Arg(味之素公司)、4g/L/天D-葡萄糖(NACALAI TESQUE公司、型号16806-25)。在培养第5天往后，使用生死细胞自动分析仪的Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定活细胞数。
以1次重复验证iPS细胞的增殖结果的结果示于图1。另外，在第3天，以4次重复验证移到生物反应器时的细胞块的长径的分布的结果示于图2及以下表1。表明，通过控制细胞块长径至400μm以下的尺寸，可实现超1.0×107个细胞/mL的高密度培养。
【表1】
瓶1 瓶2 瓶3 瓶4
最大值(μm) 267 388 323 257
平均值(μm) 92 98 100 93
中位值(μm) 83 89 89 87
标准偏差(μm) 36 45 44 31
【实施例2：球尺寸控制的有无对增殖的影响】
为了确认球尺寸的控制对于细胞增殖重要，不控制球尺寸地在微生物反应器内进行培养。即，将iPS细胞1210B2株以6×105个细胞/mL的细胞密度接种到微生物反应器的ambr15中，使用StemFit AK03N+10μM Y-27632，在CO2温育器内在37℃、CO2浓度＝5％、搅拌速度＝300rpm的条件下搅拌培养。在接种第2天，将7成的培养基用StemFit AK03N更换。在接种第3天，将细胞悬浮液10mL再悬浮于新鲜的StemFit AK03N，其后将7成的培养基用StemFit AK03N进行1天2次更换，进一步添加40mg/L/天Trp、40mg/L/天Ser、40mg/L/天Cys、40mg/L/天Met、160mg/L/天Arg、4g/L/天D-葡萄糖。一方面，控制球尺寸的组使用StemFitAK03N进行与实施例1同样的操作。在培养第3天，使用BZ-X710定量球的长径。另外，在培养第7天往后，使用生死细胞自动分析仪的Vi-CELL(商标)XR测定活细胞数。
以1次重复验证iPS细胞的增殖结果的结果示于图3。另外，在第3天，以1次重复验证移到微生物反应器时的球的长径分布的结果示于图4。表明，即使是同样的培养条件，如果不控制球尺寸，就达不到1.0×107个细胞/mL。
【实施例3：球尺寸的控制方法的探讨】
在以下的实验例中，对于由悬浮培养增殖人工多能性干细胞(iPS细胞)时可维持小球尺寸的成分进行探讨。作为iPS细胞，使用自iPSAcademia日本公司购入的1231A3株。另外，作为iPS细胞用培养基，使用市售的StemFit AK03N(味之素公司)。
使用iPS细胞用30mL一次性生物反应器(ABLE：BWV-S03A)调整氯化钙、硫酸镁、氯化镁的浓度，将iPS细胞1231A3株以2×105个细胞/mL的细胞密度接种到调整到表2中所示的3条件的StemFit AK03N+10μM Y-27632(Wako：034-24024)中，在CO2温育器内在37℃、CO2浓度＝5％、搅拌速度＝55rpm的条件下搅拌培养。接种第2天往后、每日、将7成的培养基用各条件的StemFit AK03N更换。在培养第7天，使用生死细胞自动分析仪的Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定活细胞数。另外，使用BZ-X710(Keyence)定量细胞块的长径。
【表2】
Ca<sup>2+</sup>(mM) Mg<sup>2+</sup>(mM)
条件1 0.844 1.003
条件2 0.214 0.579
条件3 0.144 0.532
以1次重复验证iPS细胞的增殖结果的结果示于图5。另外，以1次重复验证第7天的球的长径的分布的结果示于图6及表3。表明，通过调节Ca2+及Mg2+的浓度，能维持小的球长径。
【表3】
条件1 条件2 条件3
最大值 425 374 323
第三四分位 271.75 210 222.25
中位值 212 153 150
第一四分位 151.75 107 112
最小值 52 54 55
平均 208 161 162
【实施例4：镁离子及钙离子浓度对细胞增殖的影响的探讨】
使用iPS细胞用30mL一次性生物反应器(ABLE：BWV-S03A)，将iPS细胞1210B2株以6×105个细胞/mL的细胞密度接种到StemFit AK03N+10μM Y-27632(Wako：034-24024)中，在CO2温育器内在37℃、CO2浓度＝5％、搅拌速度＝120rpm的条件下搅拌培养。在接种第2天，将7成的培养基用StemFit AK03N更换。在接种第3天，使细胞悬浮液10mL再悬浮于调整氯化钙、硫酸镁、氯化镁的浓度、调整到表4中所示的2条件的新鲜的StemFit AK03N，移到微生物反应器的ambr15(sartorius：001-0881)，持续在37℃、pH＝7.2、溶解氧浓度＝20％、搅拌速度＝300rpm的条件下搅拌培养。将7成的培养基用各条件的StemFit AK03N进行1天2次更换，再者向两组添加40mg/L/天Trp(味之素公司)、40mg/L/天Ser(味之素公司)、40mg/L/天Cys盐酸盐(日本蛋白公司)、40mg/L/天Met(味之素公司)、160mg/L/天Arg(味之素公司)、4g/L/天D-葡萄糖(NACALAI TESQUE公司：16806-25)。在培养第7天，使用生死细胞自动分析仪的Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定活细胞数。
【表4】
Figure BDA0003743532270000111
Figure BDA0003743532270000121
以2次重复验证Ca2+及Mg2+对iPS细胞的增殖的影响的结果示于图7。如图7所示表明，Ca2+及Mg2+以一定的浓度给细胞增殖大的影响。
【实施例5：球尺寸的控制方法的探讨2】
表明，在上述的实施例3中，Ca2+及Mg2+的浓度对于球长径的控制重要，在本实施例中，对于Ca2+和Mg2+的浓度中的哪个更给球长径的控制大的影响进行探讨。
使用iPS细胞用30mL一次性生物反应器(ABLE：BWV-S03A)，将iPS细胞1210B2株以6×105个细胞/mL的细胞密度接种到StemFit AK03N+10μM Y-27632(Wako：034-24024)中，在CO2温育器内在37℃、CO2浓度＝5％、搅拌速度＝120rpm的条件下搅拌培养。在接种第2天，将7成的培养基用StemFit AK03N更换。至此时点使用的培养基的钙离子浓度不调整。从而，该培养基的钙离子浓度是与一般的细胞培养基的钙离子浓度同程度(约0.8mM～1.2mM)。在接种第3天，使细胞悬浮液10mL再悬浮于调整氯化钙的浓度、调整到表5中所示的2条件的新鲜的StemFit AK03N，移到微生物反应器的ambr15(sartorius：001-0881)，持续在37℃、pH＝7.2、溶解氧浓度＝20％、搅拌速度＝300rpm的条件下搅拌培养。再者，在条件1及条件2中，Mg2+的浓度相同(1.003mM)。将7成的培养基用各条件的StemFit AK03N进行1天2次更换，再者向两组添加40mg/L/天Trp(味之素公司)、40mg/L/天Ser(味之素公司)、40mg/L/天Cys盐酸盐(日本蛋白公司)、40mg/L/天Met(味之素公司)、160mg/L/天Arg(味之素公司)、18.6mg/L/天His(味之素公司)、43.7mg/L/天Ile(味之素公司)、47.3mg/L/天Leu(味之素公司)、73.1mg/L/天Lys盐酸盐(味之素公司)、28.4mg/L/天Phe(味之素公司)、42.3mg/L/天Val(味之素公司)、4g/L/天D-葡萄糖(NACALAI TESQUE公司：16806-25)。在培养第3天及第6天，使用BZ-X710(Keyence)定量球的长径。另外，在培养第3天及培养第6天，使用生死细胞自动分析仪的Vi-CELL(商标)XR(Beckman Coulter公司)测定活细胞数。
【表5】
条件1 条件2
Ca<sup>2+</sup>(mM) 0.844 0.144
以1次重复验证Ca2+浓度对iPS细胞的球尺寸的影响的结果示于图8及表6。另外，VCD示于图9，细胞块数示于图10。
如从这些图及表可知表明，可通过调整Ca2+浓度，维持小的球长径，维持大量球数。
【表6】
Figure BDA0003743532270000122
【实施例6：使用悬浮培养系对iPS细胞的细胞增殖的影响】
将iPS细胞1210B2株以1.72×105个细胞/mL的细胞密度接种到微生物反应器的ambr15(sartorius：001-0881)中，调整氯化钙的浓度，使用调整到表7中所示的2条件的新鲜的StemFit AK03N+10μM Y-27632，在37℃、pH＝7.2、溶解氧浓度＝20％、搅拌速度＝300rpm的条件下搅拌培养。培养第2天往后、将7成的培养基用各条件的StemFit AK03N进行1天2次更换，再者向两组添加40mg/L/天Trp(味之素公司)、40mg/L/天Ser(味之素公司)、40mg/L/天Cys盐酸盐(日本蛋白公司)、40mg/L/天Met(味之素公司)、160mg/L/天Arg(味之素公司)、18.6mg/L/天His(味之素公司)、43.7mg/L/天Ile(味之素公司)、47.3mg/L/天Leu(味之素公司)、73.1mg/L/天Lys盐酸盐(味之素公司)、28.4mg/L/天Phe(味之素公司)、42.3mg/L/天Val(味之素公司)、4g/L/天D-葡萄糖(NACALAI TESQUE公司：16806-25)。在第6天，使用BZ-X710(Keyence)定量球的长径。另外，在培养第6天，使用生死细胞自动分析仪的Vi-CELL(商标)XR(Beckman Coulter公司)测定活细胞数。
【表7】
条件1 条件2
Ca<sup>2+</sup>(mM) 0.844 0.074
以1次重复验证Ca2+浓度对iPS细胞的球尺寸的影响的结果示于图11及表8。另外，VCD示于图12，细胞块数示于图13。以上表明，可通过调整Ca2+浓度，维持小的球长径，还维持大量球数。
【表8】
条件1 条件2
最大值(μm) 657 641
中位值(μm) 331 308
最小值(μm) 120 107
平均值(μm) 367 318
【产业上的利用可能性】
由本发明，可用非常地廉价并且简便的方法实现与从前进行的实施方式比较更优选的高密度培养。
本申请以在日本申请的特愿2020-003961(申请日：2020年1月14日)及特愿2020-096485(申请日：2020年6月2日)作为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (14)

1.细胞的培养方法，其包括以下工序：
调制长径400μm以下的细胞块的集团的第1工序、及
对在第1工序中得到的细胞块的集团进行悬浮培养的第2工序。
2.权利要求1所述的方法，其中第1工序中的细胞块的长径的平均值是110μm以下。
3.权利要求1或2所述的方法，其中第1工序中的细胞块的长径的中位值是90μm以下。
4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，第1工序和第2工序连续进行。
5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中第1工序的细胞块的集团的调制使用旋转瓶进行。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在第2工序中使用的培养基中的钙离子的浓度是0.07～0.25mM。
7.权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，
第1工序的细胞块的集团的调制通过调节钙离子的浓度来进行，
所述钙离子的浓度是0.07～0.25mM。
8.权利要求6或7所述的方法，其特征在于，进一步将镁离子的浓度设为0.5～0.65mM。
9.权利要求1～8之任一项所述的方法，其中第2工序中的悬浮培养使用生物反应器进行。
10.权利要求1～9之任一项所述的方法，其中细胞是干细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中干细胞是iPS细胞。
12.细胞的培养方法，其包括：在具有0.07～0.25mM的钙离子浓度的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。
13.权利要求12所述的方法，其中细胞是干细胞。
14.权利要求13所述的方法，其中干细胞是iPS细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH084495B2 (ja) * 1988-08-19 1996-01-24 帝人株式会社 接着性動物細胞の培養方法
JPH01296986A (ja) * 1988-05-25 1989-11-30 Teijin Ltd 接着性動物細胞の培養方法
CA2551026A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Schering Corporation Methods for producing a549 cell lines stable in serum-free medium suspension culture
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
EP3255142A1 (en) * 2009-10-19 2017-12-13 Cellular Dynamics International, Inc. Cardiomyocyte production
CA2810488A1 (en) * 2010-09-07 2012-03-15 Technion Research & Development Foundation Limited Novel methods and culture media for culturing pluripotent stem cells
EP2784153B1 (en) * 2011-11-25 2018-01-03 Kyoto University Method for culturing pluripotent stem cell
JP6653753B2 (ja) * 2016-05-06 2020-02-26 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の継代方法
JP2019134682A (ja) * 2016-06-01 2019-08-15 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 肝幹細胞様細胞の調製方法
JP7217096B2 (ja) 2018-06-26 2023-02-02 株式会社Lifull 広告オプション割当装置、広告オプション割当プログラム、広告オプション割当方法、及び情報提供システム
JP7331356B2 (ja) 2018-12-14 2023-08-23 Tdk株式会社 永久磁石および回転電機

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