KR102136478B1 - 다능성 줄기 세포의 계대 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시는, 대량 배양에 적합한 다능성 줄기 세포의 계대 방법을 제공한다. 다능성 줄기 세포의 계대 방법은, 다능성 줄기 세포를 배양하여 세포덩어리를 얻는 배양 공정과, 세포덩어리를 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하의 속도로, 각각의 개구 치수가 30μm 이상 80μm 이하인 복수의 관통 구멍을 갖는 메시 형상의 막에 통과시킴으로써, 세포덩어리를 분할하는 분할 공정을 포함한다.

Description

다능성 줄기 세포의 계대 방법

본 개시는, 다능성 줄기 세포의 계대 방법에 관한 것이다.

다능성 줄기 세포의 계대 방법에 관한 기술로서, 예를 들면 이하의 기술이 알려져 있다. 예를 들면, 국제 공개공보 제2013/077423호에는, 평균 직경이 약 200μm~약 300μm인 균일한 사이즈의 다능성 줄기 세포의 세포덩어리를 메시에 통과시켜 분할하는 계대 방법이 기재되어 있다. 또, 국제 공개공보 제2013/077423호에는, 메시의 구멍 직경을 50μm 정도로 하고, 분할 후의 세포덩어리의 직경을 약 80μm~약 120μm로 하는 것이 기재되어 있다.

또, 국제 공개공보 제2014/136581호에는, 계대용 필터부의 메시를 통과하는 다능성 줄기 세포를 포함하는 액체의 유속을 매분 90mL~300mL로 하는 것이 기재되어 있다.

예를 들면, 간질환이나 심질환 등을, 세포 이식에 의하여 치료하기 위해서는, 1×10⁹개 이상의 분화 세포의 이식이 한명의 환자에게 필요하다고 생각되고 있다. 이것을 실현하기 위해서는, 다능성 줄기 세포의 대량 배양 기술의 개발이 불가결해진다.

예를 들면, 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 세포를 배양함으로써 발생하는 세포덩어리(스피어)의 사이즈가 과대해지면, 세포덩어리끼리가 접착 융합하여, 세포가 분화를 개시하거나, 세포덩어리의 중심부의 세포가 괴사하거나 하는 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 세포덩어리의 사이즈가 과대해지는 것을 방지하기 위하여, 세포의 배양 기간 중의 적절한 시기에, 세포덩어리를 분할하는 분할 처리가 필수가 된다.

상기의 국제 공개공보 제2013/077423호 및 국제 공개공보 제2014/136581호에 기재된 바와 같이, 소정 사이즈로까지 성장한 세포덩어리를 메시에 통과시켜 분할하는 계대 방법에 의하면, 종래의 효소 처리에 의한 계대 방법과 비교하여, 계대 후에 있어서의 세포의 생존율의 향상을 도모할 수 있다. 그러나, 예를 들면 100리터 규모의 대량 배양을 실현하고자 한 경우, 국제 공개공보 제2014/136581호에 기재된 바와 같이, 메시를 통과하는 다능성 줄기 세포를 포함하는 액체의 유속을 매분 90mL~300mL로 한 경우, 처리에 방대한 시간을 필요로 하여, 세포의 균질성을 유지하는 것이 곤란해진다. 한편, 메시를 통과하는 다능성 줄기 세포를 포함하는 액체의 유속을 크게 한 경우 및 작게 한 경우의 쌍방에 대하여, 다능성 줄기 세포에게 주는 대미지를 고려할 필요가 있다.

본 개시는, 대량 배양에 적합한 다능성 줄기 세포의 계대 방법을 제공한다.

본 개시에 관한 제1 양태는, 다능성 줄기 세포의 계대 방법으로서, 다능성 줄기 세포를 배양하여 세포덩어리를 얻는 배양 공정과, 세포덩어리를 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하의 속도로, 각각의 개구 치수가 30μm 이상 80μm 이하인 복수의 관통 구멍을 갖는 메시 형상의 막에 통과시킴으로써, 세포덩어리를 분할하는 분할 공정을 포함한다.

배양 공정에 있어서, 다능성 줄기 세포를, 고분자 화합물을 함유하는 배양액 중에서 배양해도 된다. 분할 공정에 있어서, 분할 후의 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값을 30μm 이상 75μm 이하로 하는 것이 바람직하다. 다능성 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포여도 된다.

본 개시의 상기 양태에 의하면, 대량 배양에 적합한 다능성 줄기 세포의 계대 방법을 제공할 수 있다.

도 1a는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 분할 장치의 구성을 나타내는 단면도이다.
도 1b는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 메시의 구성을 나타내는 평면도이다.
도 2a는 분할 직후에 있어서의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2b는 분할 후 1시간 경과 후의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2c는 분할 후 2시간 경과 후의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2d는 분할 후 3시간 경과 후의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2e는 분할 후 4시간 경과 후의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2f는 분할 후 24시간 경과 후의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 4는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 배양 개시 처리를 실시하는 경우에 있어서의, 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 5는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 배지 교환 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 6은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 분할 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 7은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 동결 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 8은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 프로그램에 있어서의 처리의 흐름을 나타내는 플로차트이다.
도 9는 메시 (4)에 통과 속도 100cm/s로 통과시켜 계대한 후의 스피어상(像)이다.
도 10은 메시 (6)에 통과 속도 180cm/s로 통과시켜 계대한 후의 스피어상이다.
도 11은 메시 (1)에 통과 속도 15cm/s로 통과시켜 계대한 후의 스피어상이다.

이하, 본 개시의 예시적 실시형태를, 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 각 도면에 있어서 동일 또는 등가인 구성 요소 및 부분에는 동일한 참조 부호를 부여하고 있다.

본 개시의 예시적 실시형태에 관한 다능성 줄기 세포의 계대 방법은, 다능성 줄기 세포를 배양하여 세포덩어리를 얻는 배양 공정과, 세포덩어리를 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하의 속도로, 각각의 개구 치수가 30μm 이상 80μm 이하인 복수의 관통 구멍을 갖는 메시 형상의 막에 통과시킴으로써, 세포덩어리를 분할하는 분할 공정을 포함한다.

[다능성 줄기 세포]

본 예시적 실시형태에 적용 가능한 다능성 줄기 세포는, 미분화 상태를 유지한 채로 증식할 수 있는 "자기 복제능"과 삼배엽 계열 모두로 분화할 수 있는 "다분화능"을 갖는 미분화 세포이면 특별히 제한되지 않는다. 다능성 줄기 세포로서는, 예를 들면 배성 줄기 세포(embryonic stem cell; ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPS 세포), 배성 생식 세포(embryonic germ cell; EG 세포), 배성 암세포(embryonal carcinoma cell; EC 세포), 다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cell; MAP 세포), 성체 다능성 줄기 세포(adult pluripotent stem cell; APS 세포), Muse 세포(multi-lineage differentiating stress enduring cell) 등을 들 수 있다. 본 예시적 실시형태에 적용하는 다능성 줄기 세포로서는, ES 세포 및 iPS 세포가 바람직하다.

다능성 줄기 세포의 유래가 되는 동물은 특별히 제한되지 않는다. 포유 동물로서는, 예를 들면 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있다. 다능성 줄기 세포의 유래가 되는 동물(즉 도너)은, 그 다능성 줄기 세포 또는 그 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 세포가 이식되는 동물(즉 레시피언트)과 동종의 동물이 바람직하다. 다능성 줄기 세포의 수립은, 공지의 어느 방법으로 행해도 된다.

다능성 줄기 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지 여부는, 공지의 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들면, 미분화 마커의 발현을 플로 사이토메트리 또는 면역 염색에 의하여 확인하는 방법, 면역 부전 마우스의 피하에 인젝션하여 테라토마 형성을 확인하는 방법 등을 들 수 있다.

[다능성 줄기 세포의 배양]

이하에, 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 배양 공정에 대하여 설명한다. 본 예시적 실시형태에 있어서, 다능성 줄기 세포는, 부유 배양에 의하여 증식되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 배양 용기에, 다능성 줄기 세포를 배지와 함께 충전하여, 다능성 줄기 세포의 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값이 예를 들면, 200μm~300μm가 될 때까지 부유 배양한다. 또한, 원 상당 직경이란, 추출한 세포덩어리의 각각의 윤곽선에 의하여 획정(劃定)되는 영역을, 동일한 면적을 갖는 원으로 간주한 경우의 원의 직경을 말한다. 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값을 300μm 이하로 함으로써, 세포가 분비하는 사이토카인 등이 형성하는 미소 환경에 의한 분화 유도를 억제할 수 있다. 또, 세포덩어리의 중심부에서 일어나는 세포의 괴사를 억제하여, 생세포의 회수율의 저하를 억제할 수 있다. 한편, 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값을 200μm 이상으로 함으로써, 세포의 회수율을 일정 이상으로 할 수 있다. 또한, 배양 공정에 있어서 얻는 세포덩어리의 사이즈는, 분화 유도의 억제, 세포의 괴사, 세포의 회수율 등을 감안하여 적절히 변경하는 것이 가능하다.

본 예시적 실시형태에 적용하는 배지는, 특별히 제한되지 않고, 줄기 세포 배양에 이용되는 공지의 모든 배지를 들 수 있다. 구체적으로는, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM: F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), EMEM(Eagle's minimal essential medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, MCDB104, MCDB153, 199, L15, mTeSR1, TeSR2, E8(Nature Protocols 7: 2029-2040, 2012), 및 이들 배지에 세포 증식 인자를 첨가한 배지 등을 들 수 있다.

배지에는, 일반적으로 첨가되는 각종 성분, 예를 들면 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생 물질; 아스코브산, 레티노산 등의 비타민 또는 비타민 유도체; 글루코스 등의 당원; 아미노산; 아셀렌산 나트륨, 염화 나트륨 등의 무기염; 트랜스페린 등의 단백질; 인슐린 등의 호르몬; TGF-β(transforming growth factor-β), EGF(epidermal growth factor) 등의 사이토카인: 성장 인자; 분화 억제 인자; 2-머캅토에탄올, 다이싸이오트레이톨 등의 항산화제; 등을 첨가해도 된다. 상기 성분은, 배양 기간 전체에 걸쳐 농도를 소기의 범위로 유지하기 위하여, 다능성 줄기 세포의 배양 중에 배지에 보충해도 된다. 배지는, 항원성 물질이나 감염원 등이 다능성 줄기 세포에 혼입되는 것을 억제하는 관점에서, 혈청 및 혈청 대체물을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 배지의 pH는, 예를 들면 pH 7.0~8.0이며, 바람직하게는 pH 7.3~7.4이다.

본 예시적 실시형태에 있어서의 배양 공정에 있어서는, 적절히 배지 교환을 행하는 것이 바람직하다. 일련의 배양 공정에 이용하는 배지는, 동일 조성이 아니어도 된다. 다능성 줄기 세포를 미분화 상태로 유지할 수 있는 한, 다른 조성의 배지로 치환하면서 배양을 계속해도 된다.

부유 배양용 배지로서는, 세포덩어리의 이동과 세포덩어리끼리의 밀착을 방지하기 위하여, 배지가 적당한 점성을 갖는 것이 바람직하다. 여기에서, 적당한 점성이란, 배지 교환을 방해하지 않고 세포덩어리끼리의 접착이 일어나지 않을 정도의 점성을 의미한다.

배지에 점성을 부여하는 수단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 수용성 고분자를 적당한 농도로 배지에 첨가함으로써 실시될 수 있다. 수용성 고분자로서는, 배지에 적당한 점성을 부여할 수 있는 것이며, 점성을 부여할 수 있는 농도 범위에 있어서, 세포에 악영향을 미치지 않는(세포 독성이 없는) 것이면, 어떤 수용성 고분자도 사용할 수 있다. 예를 들면, 셀룰로스, 아가로스 등의 다당, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시에틸메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시에틸에틸셀룰로스, 하이드록시프로필에틸셀룰로스, 에틸하이드록시에틸셀룰로스, 다이하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시에틸하이드록시프로필셀룰로스 등의 다당의 에터, 폴리아크릴아마이드, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리바이닐피롤리돈, 에틸렌글라이콜/프로필렌글라이콜 공중합체, 폴리에틸렌이민, 폴리바이닐메틸에터, 폴리바이닐알코올, 폴리아크릴산, 말레산 공중합체 등의 합성 고분자, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 덱스트란, 알진산, 카라기난, 전분 등의 생체 고분자, 혹은 그들을 모방한 인공 고분자(예를 들면, 엘라스틴 유사 펩타이드 등)를 들 수 있다. 이들 수용성 고분자는 단독으로 이용해도 되고, 몇 종류의 수용성 고분자의 혼합물로서 이용할 수도 있다. 또, 이들 수용성 고분자의 공중합체를 이용해도 된다. 바람직하게는, 메틸셀룰로스, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리바이닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스, 또는 그들의 혼합물이고, 보다 바람직하게는 메틸셀룰로스이다.

예를 들면, 점성을 부여하기 위하여 메틸셀룰로스를 배지에 첨가하는 경우, 메틸셀룰로스의 농도로서는, 0.25w/v%보다 높고, 0.5w/v%보다 낮은 농도가 바람직하다. 바람직하게는, 메틸셀룰로스의 농도는, 0.26w/v%~0.3w/v%이며, 특히 바람직하게는, 0.28w/v%이다. 메틸셀룰로스의 농도를 상기의 범위로 함으로써, 분할 공정에 있어서, 세포덩어리의 분할에 이용되는 메시 형상의 막에 대한 투과성을 유지하면서 증점 작용을 얻고, 메시 형상의 막의 국소적인 폐색을 방지하여, 속도의 편차를 억제할 수 있다. 그 적당한 점성은 동점도로 대표된다. 예를 들면 25℃, 전단 속도가 100s^{- 1}에 있어서의 점도가 1.0mPa·s~15mPa·s, 더 바람직하게는 1.0mPa·s~7.5mPa·s이다. 다른 수용성 고분자를 이용하는 경우에도, 당업자는 상술한 적당한 점성을 얻기 위하여, 다른 수용성 고분자의 농도를 적절히 선택할 수 있다. 또한, 전단 속도 100s^{- 1}에 있어서의 점도의 평가는, 점도 측정 장치(안톤 펄사제의 MCR301, 25mm 콘 플레이트, 0.098mm 갭)를 이용하고, 평가 조건은 인터벌 설정 1로 행했다.

배지에 점성을 부여하는 대신에, 부유 배양의 배지 중에 부정형인 구조체를 균일하게 형성하여, 배지의 점도를 실질적으로 높이지 않고 세포의 침강을 억제하는 것도 바람직하다. 이와 같은 구조체를 형성할 수 있는 재료로서, 고분자 화합물을 들 수 있고, 바람직하게는 음이온성의 관능기를 갖는 고분자 화합물을 들 수 있다. 음이온성의 관능기로서는, 카복시기, 설포기, 인산기 및 그들 염을 들 수 있고, 카복시기 또는 그 염이 바람직하다. 고분자 화합물의 바람직한 구체예로서는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단당류(예를 들면, 트라이오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 등)가 10개 이상 중합한 다당류를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 음이온성의 관능기를 갖는 산성 다당류를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 히알루론산, 젤란검, 탈아실화 젤란검, 람잔검, 다이유탄검, 잔탄검, 카라기난, 헥스론산, 푸코이단, 펙틴, 펙트산, 펙틴산, 헤파란 황산, 헤파린, 헤파리틴 황산, 케라토 황산, 콘드로이틴 황산, 더마탄 황산, 람난 황산 및 그들 염으로 이루어지는 군으로부터 1종 또는 2종 이상으로 구성되는 것이 예시된다. 다당류는, 바람직하게는, 히알루론산, 젤란검, 탈아실화 젤란검, 다이유탄검, 잔탄검, 카라기난 또는 그들 염이며, 저농도의 사용으로 세포 및 세포덩어리를 부유시킬 수 있고, 또한 세포의 회수 용이성을 고려하면, 가장 바람직하게는, 탈아실화 젤란검이다.

탈아실화 젤란검은, 액체 배지와 혼합했을 때에, 액체 배지 중의 금속 이온(예를 들면, 칼슘 이온)을 도입하여, 금속 이온을 통한 부정형인 구조체를 형성하여, 세포를 부유시킨다. 탈아실화 젤란검을 포함하여 조제되는 배지 조성물의 점도는, 전단 속도 1000s^{- 1}에 있어서의 점도가 8mPa·s 이하이고, 바람직하게는 4mPa·s 이하이며, 세포의 회수 용이성을 고려하면, 보다 바람직하게는 1.0mPa·s 이상, 2mPa·s 이하이다. 또한, 전단 속도 1000s^{- 1}에 있어서의 점도의 평가는, 점도 측정 장치(안톤 펄사제의 MCR301, 25mm 콘 플레이트, 0.098mm 갭)를 이용하고, 평가 조건은 인터벌 설정 1로 행했다.

배양은, 부착 배양한 다능성 줄기 세포를 효소 처리에 의하여 해리하여, 배양 용기 중에, 예를 들면 약 1×10⁵~5×10⁶세포/ml, 바람직하게는, 약 2×10⁵~2×10⁶세포/ml의 세포 밀도가 되도록 파종하여, 약 1%~10%, 바람직하게는 약 2%~5% CO₂ 농도의 분위기하, 약 30℃~40℃, 바람직하게는 약 37℃에서, 1~7일간, 바람직하게는 3~6일간, 보다 바람직하게는 4~5일간 행해진다. 배양 기간 중에, 바람직하게는 1, 2일마다 배양 용기 중의 배지가 신선한 배지와 교환된다.

예를 들면, 인간 ES 세포를 배양하는 경우, 약 24시간에 1회 분열하므로, 부유 배양 개시 시의 다능성 줄기 세포의 세포덩어리의 원 상당 직경을 약 80μm로 하면, 4, 5일간의 배양에 의하여 세포덩어리는, 200μm~300μm로까지 성장한다고 생각된다.

[다능성 줄기 세포의 계대]

이하에, 다능성 줄기 세포의 계대를 행할 때에 실시되는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 분할 공정에 대하여 설명한다. 분할 공정에서는, 상기의 배양 공정에서 원 상당 직경의 평균값이 200μm~300μm가 될 때까지 성장한 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가, 보다 작은 사이즈의 세포덩어리로 분할된다.

도 1a는, 분할 공정에 있어서 사용되는 분할 장치(400)의 구성을 나타내는 단면도이다. 분할 장치(400)은, 메시(401) 및 케이스(402)를 포함하여 구성되어 있다.

케이스(402)는, 유입구(411) 및 유출구(412)를 갖는다. 메시(401)은, 케이스(402)의 내부의 유입구(411)과 유출구(412)의 사이에 마련되어 있다. 즉, 유입구(411)과 유출구(412)가 메시(401)에 의하여 이격되어 있다.

도 1b는, 메시(401)의 구성을 나타내는 평면도이다. 메시(401)은, 예를 들면 나일론이나 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 합성 수지 또는 스테인리스 등의 금속으로 구성되는 섬유 부재를 격자 형상으로 엮어 구성된다. 즉, 메시(401)은, 복수의 관통 구멍(420)을 갖는 메시 형상의 막이다. 도 1b에 나타내는 바와 같이, 메시(401)을 구성하는 경사와 위사를 동일한 간격으로 엮으면, 관통 구멍(420)의 형상은 정방형이 된다.

분할 공정에 있어서, 다능성 줄기 세포의 세포덩어리를, 배지와 함께 분할 장치(400)의 유입구(411)로부터 유입시키고, 유출구(412)로부터 유출시킨다. 유입구(411)로부터 유입된 다능성 줄기 세포의 세포덩어리는, 메시(401)을 통과할 때에, 보다 작은 사이즈의 세포덩어리로 분할된다. 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 메시(401)을 통과하는 속도는, 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하로 한다. 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 메시(401)을 통과하는 속도를 15cm/sec 이상으로 함으로써, 분할 공정에 있어서, 예를 들면 100리터 규모의 대량 배양에도 적용 가능한 처리 능력을 실현할 수 있다. 예를 들면, 분할 장치(400)의 유로의, 세포덩어리의 유통 방향과 직교하는 방향의 단면적을 10cm²로 한 경우, 1초당 분할 처리량을 150cm³ 이상으로 할 수 있다. 예를 들면, 100리터 규모의 대량 배양을 행한 경우에도, 분할 처리를 10분 정도로 완료시키는 것이 가능하고, 세포의 균질성을 유지하는 것이 가능해진다. 또, 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 메시(401)을 통과하는 속도를 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하로 함으로써, 분할에 의하여 세포에 주는 대미지를 억제하는 것이 가능하다. 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 메시(401)을 통과하는 속도는, 처리 능력 및 세포에 대한 대미지 완화의 관점에서, 보다 바람직하게는, 30cm/sec 이상 120cm/sec 이하이며, 더 바람직하게는, 50cm/sec 이상 100cm/sec 이하이다.

메시(401)의 관통 구멍(420)의 개구 치수는, 30μm 이상 80μm 이하로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 40μm 이상 70μm 이하이며, 전형적으로는 50μm이다. 개구 치수란, 관통 구멍(420)의 형상이 도 1b에 나타내는 바와 같이 정방형인 경우, 그 정방형의 한 변의 길이를 의미하고, 관통 구멍(420)의 형상이 원형인 경우에는, 그 원의 직경을 의미한다. 관통 구멍(420)의 개구 치수를 상기의 범위로 함으로써, 메시(401)의 통과 시에 세포덩어리에게 주는 대미지를 억제하면서 세포덩어리의 분할을 효과적으로 행할 수 있다. 또한, 분할 후에 있어서의 세포덩어리의 사이즈에 있어서, 후술하는 바람직한 분포를 얻을 수 있다.

분할 후에 있어서의 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값은, 30μm 이상 75μm 이하인 것이 바람직하다. 여기에서, 분할 후에 있어서의 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값은, 이하와 같이 하여 계측된다. 메시(401)을 통과함으로써 분할된 세포덩어리를 현미경 관찰로 예를 들면 무작위로 300개 추출하고, 추출한 세포덩어리의 각각의 원 상당 직경을 계측하여, 계측한 원 상당 직경의 평균값을 산출한다. 세포덩어리의 원 상당 직경의 계측은, 세포덩어리를 분할한 후, 1시간이 경과하기 전에 완료시키는 것이 바람직하다.

여기에서, 도 2a~도 2f는, 각각, 분할 직후, 분할 후 1시간 경과 후, 분할 후 2시간 경과 후, 분할 후 3시간 경과 후, 분할 후 4시간 경과 후, 분할 후 24시간 경과 후의 세포덩어리의 상태를 나타내는 현미경 사진이다. 도 2a 및 도 2b에 나타내는 바와 같이, 분할 후 1시간이 경과할 때까지의 기간에 있어서는, 세포덩어리의 상태는, 분할 직후의 상태를 유지한다. 한편, 도 2c~도 2f에 나타내는 바와 같이, 분할 후 2시간을 경과하면, 시간 경과와 함께, 세포덩어리의 표면으로부터 죽은 세포인 싱글 셀이 이탈하여, 싱글 셀의 수가 증대한다. 따라서, 분할 후 1시간이 경과하기 전에 세포덩어리의 사이즈의 계측을 완료시킴으로써, 분할 직후에 있어서의 세포덩어리의 통계 정보로서 적절한 정보를 얻을 수 있다.

본 예시적 실시형태에 관한 분할 공정에 있어서 분할된 세포덩어리 중 원 상당 직경이 30μm 이상 40μm 미만인 세포덩어리의 개수를 X로 한다. 또, 본 예시적 실시형태에 관한 분할 공정에 있어서 분할된 세포덩어리 중 원 상당 직경이 40μm 이상 300μm 미만인 세포덩어리의 개수를 Y로 한다. 이 경우에 있어서, 분할 후의 세포덩어리의 원 상당 직경의 분포가, 하기의 식 (1)을 충족시키는 것이 바람직하다.

1<X/Y<3…(1)

원 상당 직경이 30μm 이상 40μm 미만인 세포덩어리는, 분할에 의한 대미지가 비교적 크다고 생각되지만, 이와 같은 대미지가 비교적 큰 세포는, 대미지로부터의 회복에 기여하는 단백질의 분비를 활발히 행하는 것이라고 생각된다. 이 단백질은, 자기의 세포뿐만 아니라 다른 세포의 대미지 회복에도 기여한다고 생각된다. 한편, 원 상당 직경이 40μm 이상 300μm 미만인 세포덩어리는, 분할에 의한 대미지가 비교적 작다고 생각되며, 분할 후에 있어서의 생존율은 비교적 높다고 생각된다. 따라서, 분할 후의 세포덩어리의 원 상당 직경의 분포가, 상기의 (1) 식을 충족시킴으로써, 계대 후(즉 분할 후)에 있어서의 세포의 증식률을 최대화할 수 있다고 생각된다.

메시(401)의 관통 구멍(420)의 개구 치수를 30μm 이상 80μm 이하로 하고, 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 메시(401)을 통과하는 속도를 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하로 함으로써, 분할 후에 있어서의 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값을, 30μm 이상 75μm 이하로 하고 또한 분할 후의 세포덩어리의 원 상당 직경의 분포에 있어서 상기의 (1) 식을 충족시키도록 제어하는 것이 용이해진다. 따라서, 다능성 줄기 세포에 대한 대미지를 억제하면서 효율적으로 세포덩어리의 분할을 할 수 있어, 다능성 줄기 세포의 대량 배양에 적합하다.

이하에, 상기한 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 배양 공정 및 분할 공정에 있어서의 각 처리를 폐쇄계에 행할 수 있는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치에 대하여 설명한다.

도 3은, 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)의 구성을 나타내는 도이다. 세포 배양 장치(10)은, 세포 공급부(100), 배지 공급부(110), 희석액 공급부(120) 및 동결액 공급부(130)을 구비한다. 또, 세포 배양 장치(10)은, 배양 용기(20), 저장 용기(30), 분할 처리부(40), 폐액 회수 용기(16) 및 동결부(17)을 구비한다.

세포 배양 장치(10)은, 세포 공급부(100)으로부터 공급되는 세포를, 배지 공급부(110)으로부터 공급되는 배지(배양액)와 함께 배양 용기(20) 내에 수용하여, 배양 용기(20) 내에 있어서 세포를 배지 중에 부유시킨 상태로 배양한다.

<세포 공급부>

세포 공급부(100)은, 세포 배양 장치(10)에 의한 배양의 대상이 되는 세포를 동결시킨 상태로 수용하는 세포 수용부(101)과, 세포 수용부(101)에 수용된 세포를, 배관(c1)을 포함하여 구성되는 유로(F3)에 송출하는 펌프(P1)을 갖는다. 또, 세포 공급부(100)은, 세포 수용부(101)과 배관(c1)을 접속하는 배관의, 펌프(P1)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V1)을 갖는다. 세포 수용부(101)에 수용된 세포는, 펌프(P1)이 구동되어, 개폐 밸브(V1)이 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다.

<배지 공급부>

배지 공급부(110)은, 세포의 배양에 사용하는 배지(배양액)를 수용하는 배지 수용부(111 및 114)와, 배지 수용부(111 및 114)에 각각 수용된 배지를, 유로(F3)에 송출하는 펌프(P2 및 P3)과, 펌프(P2 및 P3)으로부터 각각 송출된 배지를 제균하기 위한 필터(113 및 116)을 갖는다. 또, 배지 공급부(110)은, 배지 수용부(111)과 배관(c1)을 접속하는 배관의, 필터(113)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V2)와, 배지 수용부(114)와 배관(c1)을 접속하는 배관의, 필터(116)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V3)을 갖는다. 이와 같이, 본 예시적 실시형태에 관한 배지 공급부(110)은, 배지 수용부(111), 펌프(P2), 필터(113) 및 개폐 밸브(V2)를 포함하는 제1 계통과, 배지 수용부(114), 펌프(P3), 필터(116) 및 개폐 밸브(V3)을 포함하는 제2 계통으로 이루어지는 2계통의 배지 공급 기능을 구비하고 있으며, 서로 다른 2종류의 배지가 공급 가능하다. 또한, 배지 공급부(110)에 있어서의 계통의 수는, 세포의 배양 프로토콜 등에 따라 적절히 증감시키는 것이 가능하다. 즉, 배지 공급부(110)을, 3종류 이상의 배지를 공급 가능하게 하는 구성으로 해도 되고, 1종류의 배지를 공급 가능하게 하는 구성으로 해도 된다. 배지 수용부(111)에 수용된 배지는, 펌프(P2)가 구동되어, 개폐 밸브(V2)가 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다. 배지 수용부(114)에 수용된 배지는, 펌프(P3)이 구동되어, 개폐 밸브(V3)이 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다.

<희석액 공급부>

희석액 공급부(120)은, 세포의 배양 과정에 있어서 적절히 실시되는 희석 처리에 이용되는 희석액을 수용하는 희석액 수용부(121)과, 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액을, 유로(F3)에 송출하는 펌프(P4)와, 펌프(P4)로부터 송출된 희석액을 제균하기 위한 필터(123)을 갖는다. 또, 희석액 공급부(120)은, 희석액 수용부(121)과 배관(c1)을 접속하는 배관의, 필터(123)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V4)를 갖는다. 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액은, 펌프(P4)가 구동되어, 개폐 밸브(V4)가 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다.

<동결액 공급부>

동결액 공급부(130)은, 배양된 세포를 동결부(17)에 있어서 동결 보존하는 경우에 이용되는 동결액을 수용하는 동결액 수용부(131)과, 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액을, 유로(F3)에 송출하는 펌프(P5)와, 펌프(P5)로부터 송출된 동결액을 제균하기 위한 필터(133)을 갖는다. 또, 동결액 공급부(130)은, 동결액 수용부(131), 펌프(P5) 및 필터(133)을 접속하는 배관의, 필터(133)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V5)를 포함한다. 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액은, 펌프(P5)가 구동되어, 개폐 밸브(V5)가 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다. 또한, 배양된 세포를 동결 보존할 필요가 없는 경우에는, 세포 배양 장치(10)에 있어서 동결액 공급부(130)을 생략하는 것이 가능하다.

<배양 용기>

배양 용기(20)은, 세포 공급부(100)으로부터 공급되는 세포를, 배지 공급부(110)으로부터 공급되는 배지와 함께 수용하여, 수용된 세포를 배양하기 위한 용기이다. 배양 용기(20)의 형태는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 유리제 또는 스테인리스제의 용기나 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다. 배양 용기(20)은, 세포 및 배지를 배양 용기(20) 내에 유입시키기 위한 유입구(21)과, 배양 용기(20)에 수용된 세포 및 배지를 배양 용기(20)의 외부에 유출시키기 위한 유출구(22)를 갖는다.

배양 용기(20)은, 예를 들면 온도 30℃~40℃(바람직하게는 37℃) 또한 CO₂ 농도 2%~10%(바람직하게는 5%)로 제어되고 또한 밀폐된 인큐베이터(24) 내에 수용된다. 인큐베이터(24)는, 배양 용기(20) 내에 배지와 함께 수용된 세포에 산소(O₂) 및 이산화탄소(CO₂)를 공급하기 위한 가스 공급 기구(25)를 구비한다. 또, 인큐베이터(24)는, 배양 용기(20) 내의 압력을 조정하는 압력 조정 기구(26)을 구비한다. 압력 조정 기구(26)은, 배양 용기(20) 내에 에어를 도입함으로써 배양 용기(20) 내의 분위기를 가압하거나, 또는 배양 용기(20) 내의 분위기를 외부로 배출함으로써 배양 용기(20) 내의 분위기를 대기로 해방한다. 압력 조정 기구(26)은, 배양 용기(20) 내의 압력을, 후술하는 순환 유로(F1) 내의 압력보다 높임으로써, 배양 용기(20) 내에 수용된 세포 및 배지를 순환 유로(F1) 내로 유출시킨다.

<순환 유로>

세포 배양 장치(10)은, 배양 용기(20)의 유출구(22)와 유입구(21)을 접속하는 배관(a1~a7)을 포함하여 구성되는 순환 유로(F1)을 갖는다. 배양 용기(20)에 수용된 세포 및 배지는, 배양 과정에 있어서, 순환 유로(F1) 내를 순환한다. 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포 및 배지는, 유입구(21)을 경유하여 배양 용기(20) 내로 유입되고, 배양 용기(20)의 내부에 수용된 세포 및 배지는, 유출구(22)를 경유하여 순환 유로(F1) 내로 유출된다.

배양 용기(20)의 유입구(21)에 접속된 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a7)에는 개폐 밸브(V11)이 마련되고, 배양 용기(20)의 유출구(22)에 접속된 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a1)에는 개폐 밸브(V12)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V11)은, 순환 유로(F1)로부터 배양 용기(20) 내에 세포 및 배지를 유입시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 개폐 밸브(V12)는, 배양 용기(20) 내로부터 순환 유로(F1) 내에 세포 및 배지를 유출시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.

세포 공급부(100), 배지 공급부(110), 희석액 공급부(120) 및 동결액 공급부(130)에 접속된 배관(c1)에 의하여 구성되는 유로(F3)은, 접속 부위(X3)에 있어서 순환 유로(F1)에 접속되어 있다. 즉, 세포 수용부(101)에 수용된 세포, 배지 수용부(111 및 114)에 각각 수용된 배지, 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액 및 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액은, 유로(F3) 및 접속 부위(X3)을 경유하여 순환 유로(F1) 내에 공급된다.

유로(F3)을 구성하는 배관(c1)에는, 접속 부위(X3)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V6)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V6)은, 세포 공급부(100), 배지 공급부(110), 희석액 공급부(120) 및 동결액 공급부(130)으로부터 각각, 세포, 배지, 희석액 및 동결액을 순환 유로(F1) 내에 공급하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태가 된다.

<저장 용기>

저장 용기(30)은, 순환 유로(F1) 내, 즉, 순환 유로(F1)의 도중에 마련되어 있다. 저장 용기(30)은, 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포, 배지, 희석액 및 동결액을 일시적으로 저장하기 위한 용기이며, 배양 기간 중에 실시되는 후술하는 배양 개시 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리에 있어서 사용된다. 저장 용기(30)의 형태는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 유리제 또는 스테인리스제의 용기, 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다.

저장 용기(30)은, 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포, 배지, 희석액 및 동결액을 저장 용기(30) 내에 유입시키기 위한 유입구(31)과, 저장 용기(30)에 수용된 세포, 배지, 희석액 및 동결액을 순환 유로(F1) 내로 유출시키기 위한 유출구(32)를 갖는다. 저장 용기(30)의 유입구(31)은, 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a1, a2 및 a3)에 의하여 배양 용기(20)의 유출구(22)에 접속되어 있다. 저장 용기(30)의 유출구(32)는, 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a4, a5, a6 및 a7)에 의하여 배양 용기(20)의 유입구(21)에 접속되어 있다. 또, 본 예시적 실시형태에 있어서는, 순환 유로(F1)과 유로(F3)이 접속되는 접속 부위(X3)이 저장 용기(30)의 유입구(31)의 근방에 배치되어 있는데, 순환 유로(F1)과 유로(F3)의 접속 위치는, 순환 유로(F1) 내에 있어서의 모든 위치에 배치하는 것이 가능하다.

순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a2)에는, 저장 용기(30)의 유입구(31)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V13)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V13)은, 순환 유로(F1)로부터 저장 용기(30) 내에 세포 및 배지 등을 유입시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 또, 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a5)에는, 저장 용기(30)의 유출구(32)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V14)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V14)는, 저장 용기(30) 내로부터 순환 유로(F1) 내에 세포 및 배지 등을 배양 용기(20), 분할 처리부(40) 및 동결부(17)에 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.

저장 용기(30)은, 저장 용기(30) 내의 압력을 조정하는 압력 조정 기구(33)을 구비한다. 압력 조정 기구(33)은, 저장 용기(30) 내에 에어를 도입함으로써 저장 용기(30) 내의 분위기를 가압하거나, 또는 저장 용기(30) 내의 분위기를 외부로 배출함으로써 저장 용기(30) 내의 분위기를 대기로 해방한다. 압력 조정 기구(33)은, 저장 용기(30) 내의 압력을 순환 유로(F1) 내의 압력보다 높임으로써, 저장 용기(30) 내에 저장된 세포, 배지, 희석액 및 동결액을, 유출구(32)로부터 순환 유로(F1) 내로 유출시킨다.

세포 배양 장치(10)은, 순환 유로(F1) 내에 있어서의, 저장 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이에 위치하는 접속 부위(X1)과, 순환 유로(F1) 내에 있어서의, 저장 용기(30)의 유입구(31)과 배양 용기(20)의 유출구(22)의 사이에 위치하는 접속 부위(X2)를 접속하는 배관(b1 및 b2)를 포함하여 구성되는 유로(F2)를 갖는다. 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포 및 배지 등은, 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F2) 내로 유입되는 것이 가능하다. 또, 유로(F2) 내를 흐르는 세포 및 배지 등은, 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내로 유입되는 것이 가능하다.

<분할 처리부>

분할 처리부(40)은, 유로(F2) 내, 즉, 유로(F2)의 도중에 마련되어 있다. 분할 처리부(40)은, 배양 용기(20) 내에 있어서, 도 1a에 나타내는 상기의 분할 장치(400)을 구비한다. 분할 처리부(40)은, 순환 유로(F1)로부터 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F2) 내로 유입되는 세포덩어리를 분할 장치(400)에 있어서 분할한다. 분할 처리가 실시된 세포는, 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내로 유출된다.

분할 처리부(40)은, 분할 장치(400)의 유입구(411)(도 1a 참조)에 접속된 송액부(450)을 구비한다. 송액부(450)은, 세포덩어리를 포함하는 배지를 분할 장치(400)에 송출하기 위한 송액 기구를 갖는다. 송액부(450)은, 통 형상 용기 내에 수용된 액체를 피스톤에 의하여 압출하는 이른바 시린지 펌프의 형태를 갖는 것이어도 된다. 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 분할 장치(400)의 메시(401)을 통과하는 속도는, 송액부(450)에 의하여 제어된다. 송액부(450)은, 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 분할 장치(400)의 메시(401)을 통과하는 속도가, 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하의 범위 내의 일정한 속도로 송액을 행한다.

유로(F2)를 구성하는, 분할 처리부(40)의 상류 측에 배치되는 배관(b1)에는, 접속 부위(X1)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V21)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V21)은, 저장 용기(30)으로부터 분할 처리부(40)에 세포 등을 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 한편, 유로(F2)를 구성하는, 분할 처리부(40)의 하류 측에 배치되는 배관(b2)에는, 접속 부위(X2)의 근방에 개폐 밸브(V22)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V22)는, 분할 처리부(40)에 의하여 분할 처리가 실시된 세포를 순환 유로(F1) 내로 유출시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.

순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a1)에는, 접속 부위(X2)의 근방이며 접속 부위(X2)의 상류 측에 개폐 밸브(V15)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V15)는, 배양 용기(20)으로부터 저장 용기(30)에 세포 및 배지 등을 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태가 된다.

<폐액 회수 용기>

세포 배양 장치(10)은, 순환 유로(F1) 내에 있어서의, 저장 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이이며, 접속 부위(X1)보다 상류 측(저장 용기(30)쪽)에 위치하는 접속 부위(X4)에 있어서, 순환 유로(F1)에 접속된 배관(d1)을 포함하여 구성되는 유로(F4)를 갖는다. 유로(F4)의 단부에는, 폐액 회수 용기(16)이 마련되어 있다. 폐액 회수 용기(16)은, 순환 유로(F1)로부터 접속 부위(X4)를 경유하여 유로(F4) 내로 유입되는 폐액을 회수하기 위한 용기이다. 폐액 회수 용기(16)에 회수되는 폐액에는, 사용 완료 배지, 사용 완료 희석액, 세포 공급부(100)으로부터 동결 상태로 공급되는 세포에 수반되는 동결액 등이 포함된다. 폐액 회수 용기(16)의 형태는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 유리제 또는 스테인리스제의 용기, 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다.

유로(F4)를 구성하는 배관(d1)에는, 접속 부위(X4)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V31)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V31)은, 저장 용기(30)으로부터 유출되는 폐액을 폐액 회수 용기(16) 내에 회수하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.

<동결부>

세포 배양 장치(10)은, 접속 부위(X1)에 있어서, 순환 유로(F1)에 접속된 배관(e1)을 포함하여 구성되는 유로(F5)를 갖는다. 유로(F5)의 단부에는, 동결부(17)이 마련되어 있다. 동결부(17)은, 순환 유로(F1)로부터 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F5) 내로 유입되는 세포를 동결액 공급부(130)으로부터 공급되는 동결액과 함께 수용하는 보존 용기(17a)를 갖는다. 보존 용기(17a)는, 예를 들면 바이알, 크라이오 튜브 또는 백의 형태를 갖는 것이어도 된다. 동결부(17)은, 보존 용기(17a)에 수용된 세포 및 동결액을 동결시키는 프리저를 포함하여 구성될 수 있다. 또, 동결부(17)은, 액체 질소를 충전한 탱크를 구비하고 있어도 되고, 탱크 내에 보존 용기(17a)를 수용할 수 있도록 구성되어 있어도 된다. 또, 동결부(17)은, 예를 들면 타이요 닛산사제의 크라이오 라이브러리(등록상표) 시스템을 포함하여 구성되어 있어도 된다. 유로(F5)를 구성하는 배관(e1)에는, 접속 부위(X1)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V41)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V41)은, 저장 용기(30)으로부터 동결부(17)에 세포 및 동결액을 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 또한, 유로(F5)와 순환 유로(F1)의 접속 위치는, 저장 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이이면, 어떠한 위치여도 된다. 또, 세포를 동결 보존할 필요가 없는 경우에는, 동결부(17)을 생략하는 것이 가능하다.

<제어부>

제어부(18)은, 펌프(P1~P5), 개폐 밸브(V1~V5, V11~V16, V21, V22, V31 및 V41), 가스 공급 기구(25), 압력 조정 기구(26, 33 및 43)의 동작을 통괄적으로 제어한다. 이로써, 소정 세포 배양 프로토콜을 따른 세포의 배양이, 사람의 손을 거치지 않고, 자동으로 실시된다. 또한, 도 3에 있어서, 제어부(18)과, 제어부(18)에 의하여 제어되는 상기의 각 구성 요소의 사이의 전기적인 접속 배선은, 도면의 번잡함을 회피하는 관점에서 도시를 생략하고 있다.

이하에, 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)에 있어서 실시될 수 있는 처리의 일례를 나타낸다. 세포 배양 장치(10)은, 예를 들면 이하에 예시하는 배양 개시 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리를 실시한다. 또한, 이하에 설명하는 배양 개시 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리는, 제어부(18)이, 개폐 밸브(V1~V5, V11~V16, V21, V22, V31 및 V41), 펌프(P1~P5), 압력 조정 기구(26, 33 및 43)의 동작을 제어함으로써 실현된다.

<배양 개시 처리>

세포 배양 장치(10)은, 세포 수용부(101)에 수용된 세포를, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 배지와 함께 배양 용기(20) 내에 수용하여 세포 배양을 개시하는 배양 개시 처리를 이하와 같이 하여 실시한다. 도 4는, 세포 배양 장치(10)이 배양 개시 처리를 실시하는 경우에 있어서의, 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 4에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과 이하에 나타내는 각 처리 스텝의 대응이 나타나 있다.

스텝 S1에 있어서, 개폐 밸브(V1, V4 및 V6)이 개방 상태가 되고, 펌프(P1 및 P4)가 구동된다. 이로써, 세포 수용부(101)에 있어서 동결 상태로 수용된 세포 및 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액이, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저장 용기(30) 내로 유입된다.

스텝 S2에 있어서, 저장 용기(30) 내에 저장된 세포, 세포에 수반되는 동결액 및 희석액을 포함하는 혼합물로부터 동결액 및 희석액을 제거하는 농축 처리가 실시된다. 상기의 농축 처리는, 예를 들면 저장 용기(30) 내에 희석액과 함께 수용된 세포를, 저장 용기(30) 내에 있어서 침강시키고(자연 침강), 희석액 및 동결액을 포함하는 상등액을 제거함으로써 행해진다. 구체적으로는, 세포를 저장 용기(30) 내에 있어서 침강시킨 후, 개폐 밸브(V14)를 단기간 개방 상태로 한다. 이로써, 저장 용기(30) 내에 상등액을 남기면서 세포를 저장 용기(30)으로부터 유출시켜, 배관(a5) 내에 체류시킨다. 그 후, 개폐 밸브(V14)를 폐쇄 상태로 하고, 개폐 밸브(V31)을 개방 상태로 한다. 이로써 저장 용기(30) 내에 잔존하는 희석액 및 동결액을 포함하는 폐액이 저장 용기(30)의 유출구(32)로부터 유출되고, 유로(F4)를 경유하여 폐액 회수 용기(16)에 회수된다. 또한, 저장 용기(30)으로부터 배관(a5)로의 세포의 이송 및 저장 용기(30)으로부터 폐액 회수 용기(16)으로의 희석액 및 동결액의 이송은, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기를 가압함으로써 행해진다.

스텝 S3에 있어서, 개폐 밸브(V2, V3 및 V6)이 개방 상태가 되고, 펌프(P2 및 P3)이 구동된다. 이로써, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 배지 A 및 배지 B가, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저장 용기(30) 내로 유입된다. 그 후, 개폐 밸브(V14)가 개방 상태가 되고, 배지 A 및 배지 B로 이루어지는 혼합 배지는, 저장 용기(30)으로부터 유출되어, 배관(a5) 내에 체류하고 있는 세포와 합류한다.

스텝 S4에 있어서, 개폐 밸브(V14, V16 및 V21)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 배관(a5) 내에 체류하는 세포 및 배지가 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F2) 내로 유입되고, 분할 처리부(40) 내로 유입된다. 분할 처리부(40) 내로 유입된 세포는, 분할 장치(400) 내에 있어서 분할 처리가 실시된다. 또한, 여기에서의 분할 처리는, 동결 상태가 된 세포를 파쇄할 목적으로 행해진다.

스텝 S5에 있어서, 개폐 밸브(V22 및 V13)이 개방 상태가 되고, 분할 처리가 실시된 세포가, 배지와 함께 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내로 유출되어, 저장 용기(30) 내에 이송된다.

스텝 S6에 있어서, 개폐 밸브(V14, V16 및 V11)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 저장 용기(30) 내에 저장된 세포 및 배지가, 순환 유로(F1)을 경유하여 배양 용기(20) 내로 유입된다. 이상의 스텝 S1~S6의 처리를 거침으로써, 배양 개시 처리가 완료된다. 또한, 상기의 예에서는, 농축 처리 및 새로운 배지의 공급을 분할 처리 전에 실시하고 있지만, 농축 처리 및 새로운 배지의 공급을 분할 처리 후에 실시해도 된다.

<배지 교환 처리>

세포 배양에 있어서는, 세포로부터 분비되는 대사물 등에 의하여 배지가 변질된다. 이로 인하여, 배양 기간 내에 있어서의 적절한 시기에, 배양 용기(20) 내에 있어서의 사용 완료 배지를, 새로운 배지로 교환하는 배지 교환 처리가 필요하게 된다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)은, 상기의 배지 교환 처리를, 이하와 같이 하여 실시한다. 도 5는, 세포 배양 장치(10)이 배지 교환 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 5에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝의 대응이 나타나 있다.

스텝 S11에 있어서, 개폐 밸브(V12, V15 및 V13)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(26)에 의하여 배양 용기(20) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 배양 용기(20) 내에 수용된 세포 및 사용 완료 배지가, 순환 유로(F1) 내로 유출되어, 저장 용기(30) 내에 이송된다.

스텝 S12에 있어서, 저장 용기(30) 내에 저장된 세포 및 사용 완료 배지를 포함하는 혼합물로부터 사용 완료 배지를 제거하는 농축 처리가 실시된다. 농축 처리는, 상기한 배양 개시 처리의 스텝 S2에 있어서의 처리와 동일한 순서로 행해진다. 농축 처리에 의하여, 사용 완료 배지는 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되고, 세포는, 배관(a5) 내에 체류한다. 또한, 세포의 침강을 촉진시키기 위하여, 희석액을 저장 용기(30) 내에 도입해도 된다.

스텝 S13에 있어서, 개폐 밸브(V2, V3 및 V6)이 개방 상태가 되고, 펌프(P2 및 P3)이 구동된다. 이로써, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지 A 및 새로운 배지 B가, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저장 용기(30) 내로 유입된다. 그 후, 개폐 밸브(V14)가 개방 상태가 되고, 배지 A 및 배지 B를 포함하는 새로운 배지는, 저장 용기(30)으로부터 유출되어, 배관(a5) 내에 체류하고 있는 세포와 합류한다.

스텝 S14에 있어서, 개폐 밸브(V14, V16 및 V11)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 배관(a5) 내에 체류하는 세포 및 새로운 배지가 배양 용기(20) 내로 유입된다. 배양 용기(20) 내에 수용된 세포는, 새로운 배지에 의하여 배양된다. 이상의 스텝 S11~S14의 처리를 거침으로써, 배지 교환 처리가 완료된다.

<분할 처리>

다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 세포를 배양함으로써 발생하는 세포덩어리(스피어)의 사이즈가 과대해지면, 세포덩어리끼리가 접착 융합하여, 세포가 분화를 개시하거나, 세포덩어리의 중심부의 세포가 괴사하거나 하는 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 세포덩어리의 사이즈가 과대해지는 것을 방지하기 위하여, 배양 기간 중의 적절한 시기에, 세포덩어리를 분할하는 분할 처리가 필요하게 되는 경우가 있다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)은, 상기의 분할 처리를, 이하와 같이 하여 실시한다. 도 6은, 세포 배양 장치(10)이 분할 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 6에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝의 대응이 나타나 있다.

스텝 S21에 있어서, 개폐 밸브(V12, V15 및 V13)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(26)에 의하여 배양 용기(20) 내의 분위기가 가압되고, 배양 용기(20) 내에 생긴 세포덩어리 및 사용 완료 배지가, 순환 유로(F1) 내로 유출되어, 저장 용기(30) 내에 이송된다.

스텝 S22에 있어서, 저장 용기(30) 내에 저장된 세포덩어리 및 사용 완료 배지를 포함하는 혼합물로부터 사용 완료 배지를 제거하는 농축 처리가 실시된다. 농축 처리는, 상기한 배양 개시 처리의 스텝 S2에 있어서의 처리와 동일한 순서로 행해진다. 농축 처리에 의하여, 사용 완료 배지는 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되며, 세포덩어리는, 배관(a5) 내에 체류한다. 또한, 세포의 침강을 촉진시키기 위하여, 희석액을 저장 용기(30) 내에 도입해도 된다.

스텝 S23에 있어서, 개폐 밸브(V2, V3 및 V6)이 개방 상태가 되고, 펌프(P2 및 P3)이 구동된다. 이로써, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지 A 및 새로운 배지 B가, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저장 용기(30) 내로 유입된다. 그 후, 개폐 밸브(V14)가 개방 상태가 되고, 배지 A 및 배지 B를 포함하는 새로운 배지는, 저장 용기(30)으로부터 유출되어, 배관(a5) 내에 체류하고 있는 세포덩어리와 합류한다.

스텝 S24에 있어서, 개폐 밸브(V14, V16 및 V21)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 배관(a5) 내에 체류하는 세포덩어리 및 배지가 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F2) 내로 유입되고, 분할 처리부(40) 내로 유입된다. 분할 처리부(40) 내로 유입된 세포는, 분할 장치(400)에 의하여 분할된다. 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 분할 장치(400)의 메시(401)을 통과하는 속도는, 송액부(450)에 의하여 제어된다. 송액부(450)은, 다능성 줄기 세포의 세포덩어리가 분할 장치(400)의 메시(401)을 통과하는 속도가 15cm/sec 이상 150cm/sec 이하의 범위 내에 있어서의 일정한 속도로 송액을 행한다.

스텝 S25에 있어서, 개폐 밸브(V22 및 V13)이 개방 상태가 되고, 분할 처리가 실시된 세포가, 배지와 함께 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내로 유출되어, 저장 용기(30) 내에 이송된다.

스텝 S26에 있어서, 개폐 밸브(V14, V16 및 V11)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 저장 용기(30) 내에 저장된 분할 비율 처리가 실시된 세포 및 새로운 배지가, 배양 용기(20) 내로 유입된다. 배양 용기(20) 내에 있어서, 분할 처리가 실시된 세포의 배양이 계속된다. 이상의 스텝 S21~S26의 처리를 거침으로써, 분할 처리가 완료된다. 즉, 세포의 계대가 완료된다.

또한, 상기의 예에서는, 농축 처리 및 새로운 배지의 공급을 분할 처리 전에 실시하고 있지만, 농축 처리 및 새로운 배지의 공급을 분할 처리 후에 실시해도 된다.

<동결 처리>

배양된 세포를 회수하여 보존하는 경우, 세포를 보존 용기 내에 회수하여 동결 보존하는 것이 일반적이다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)은, 배양된 세포를 회수하여 동결시키는 동결 처리를, 이하와 같이 하여 실시한다. 도 7은, 세포 배양 장치(10)이 동결 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 7에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝의 대응이 나타나 있다.

스텝 S41에 있어서, 개폐 밸브(V12, V15 및 V13)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(26)에 의하여 배양 용기(20) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 배양 용기(20) 내에 수용된 세포 및 사용 완료 배지가 순환 유로(F1) 내로 유출되어, 저장 용기(30) 내에 이송된다.

스텝 S42에 있어서, 저장 용기(30) 내에 저장된 세포 및 사용 완료 배지를 포함하는 혼합물로부터 사용 완료 배지를 제거하는 농축 처리가 실시된다. 농축 처리는, 상기한 배양 개시 처리의 스텝 S2에 있어서의 처리와 동일한 순서로 행해진다. 농축 처리에 의하여, 사용 완료 배지는 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되며, 세포는, 배관(a5) 내에 체류한다. 또한, 세포의 침강을 촉진시키기 위하여, 희석액을 저장 용기(30) 내에 도입해도 된다.

스텝 S43에 있어서, 개폐 밸브(V5 및 V6)이 개방 상태가 되고, 펌프(P5)가 구동된다. 이로써, 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액이, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저장 용기(30) 내로 유입된다. 그 후, 개폐 밸브(V14)가 개방 상태가 되고, 동결액은, 저장 용기(30)으로부터 유출되어, 배관(a5) 내에 체류하고 있는 세포와 합류한다.

스텝 S44에 있어서, 개폐 밸브(V14, V16 및 V41)이 개방 상태가 된다. 또, 압력 조정 기구(33)에 의하여 저장 용기(30) 내의 분위기가 가압된다. 이로써, 배관(a5) 내에 체류하는 세포 및 동결액이 유로(F5)를 경유하여 동결부(17)의 보존 용기(17a) 내에 수용된다. 동결부(17)은, 보존 용기(17a) 내에 수용된 세포를 동결액과 함께 동결시킨다. 이상의 스텝 S41~S44의 처리를 거침으로써, 동결 처리가 완료된다.

또한, 세포를 동결 보존하는 방법으로서, 예를 들면 일본 특허공보 제4705473호에 기재된 방법을 적용해도 된다. 이 방법에서는, 다이메틸설폭사이드(DMSO), 프로필렌글라이콜, 아세트아마이드 및 배지를 소정량 포함하는 매체 중에서, 세포를 급속 동결시키는 공정을 포함한다. 또, 일본 특허공보 제4223961호에 기재된 방법을 적용해도 된다. 이 방법은, 소정 농도의 다이메틸설폭사이드, 글리세린, 에틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜, 및 폴리바이닐피롤리돈으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 동결 보호제로서 함유하는 동결 보존액을 이용한 세포의 동결 보존 방법으로서, 세포를 동결 보존액에 현탁하는 공정과, 소정 냉각 속도로 동결 보존액을 -80℃ 이하까지 냉각하여 동결시키는 냉각 공정과, 동결 보존액을 -80℃ 이하로 보존하는 보존 공정을 포함한다.

또한, 상기의 배양 개시 처리, 배지 교환 처리 및 분할 처리에 있어서는 배지 공급부(110)으로부터 2종류의 배지 A 및 배지 B를 공급하는 경우를 예시하고 있지만, 사용하는 배지의 종류는, 세포의 배양 프로토콜에 따라 적절히 변경하는 것이 가능하다. 즉, 사용하는 배지는, 배양 프로토콜에 따라 1종류여도 되고, 3종류 이상이어도 된다.

<세포 배양 처리>

세포 배양 장치(10)은, 제어부(18)이 이하에 예시하는 세포 배양 처리 프로그램을 실행함으로써, 세포 배양을, 사람의 손을 거치지 않고 자동으로 행하는 것이 가능하다. 도 8은, 제어부(18)이 실행하는 세포 배양 프로그램에 있어서의 처리의 흐름을 나타내는 플로차트이다.

스텝 S101에 있어서, 제어부(18)은, 상기의 배양 개시 처리를 실행함으로써, 세포 공급부(100)으로부터 공급되는 세포 및 배지 공급부(110)으로부터 공급되는 배지를 배양 용기(20) 내에 수용하여, 세포 배양을 개시한다.

스텝 S102에 있어서, 제어부(18)은, 세포 배양을 개시한 다음 소정 기간 경과 후에, 상기의 배지 교환 처리(1회째)를 실시함으로써, 배양 용기(20) 내의 사용 완료 배지를, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지로 교환하여, 세포 배양을 계속한다.

스텝 S103에 있어서, 제어부(18)은, 1회째의 배지 교환 처리를 실시한 다음 소정 기간 경과 후에, 상기의 배지 교환 처리(2번째)를 실시함으로써, 배양 용기(20) 내의 사용 완료 배지를, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지로 교환하여, 세포 배양을 계속한다.

스텝 S104에 있어서, 제어부(18)은, 2번째의 배지 교환 처리를 실시한 다음 소정 기간 경과 후에, 상기의 분할 처리를 실시함으로써, 세포덩어리를 분할하여 세포 배양을 계속한다.

스텝 S105에 있어서, 제어부(18)은, 상기의 스텝 S102~S104에 있어서의 처리를 1사이클로 하는 배양 사이클의 사이클수가, 소정수에 달했는지 여부를 판정한다. 제어부(18)은, 배양 사이클의 사이클수가 소정수에 달하지 않았다고 판정한 경우에는, 처리를 스텝 S102로 되돌린다. 한편, 제어부(18)은, 배양 사이클의 사이클수가 소정 사이클수에 달했다고 판정한 경우에는, 처리를 스텝 S106으로 진행한다. 배양 사이클의 진행과 함께, 세포의 배양 스케일은 증대한다.

스텝 S106에 있어서, 제어부(18)은, 상기의 동결 처리를 실시함으로써 배양된 세포를 동결부(17)의 보존 용기(17a) 내에 수용하여 동결 보존한다.

또한, 상기의 예에서는, 배양 사이클의 1사이클 내에 있어서, 배지 교환 처리를 2회 실시하고 있지만, 배양 사이클의 1사이클 내에 있어서의 배지 교환 처리의 실시 횟수는, 적절히 변경하는 것이 가능하다.

이상과 같이, 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)은, 배양 용기(20)의 유입구(21)과 유출구(22)를 접속하는 순환 유로(F1)을 갖는다. 또, 세포 배양 장치(10)은, 순환 유로(F1) 내에 마련된 저장 용기(30)을 갖는다. 저장 용기(30)은, 배양 용기(20)의 유출구(22)에 접속된 유입구(31) 및 배양 용기(20)의 유입구(21)에 접속된 유출구(32)를 갖는다. 저장 용기(30)은, 상기의 배양 개시 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리에 있어서 실시되는 농축 처리 등의 용도로 제공된다. 또, 세포 배양 장치(10)은, 저장 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이에 위치하는 순환 유로(F1) 내의 접속 부위(X1)과, 저장 용기(30)의 유입구(31)과 배양 용기(20)의 유출구(22)의 사이에 위치하는 순환 유로(F1) 내의 접속 부위(X2)를 접속하는 유로(F2)를 갖는다. 세포 배양 장치(10)은, 유로(F2) 내에 마련되어, 접속 부위(X1)을 경유하여 순환 유로(F1)로부터 유입되는 세포덩어리를 분할하고, 분할한 세포덩어리를, 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내로 유출시키는 분할 처리부(40)을 갖는다. 또, 세포 배양 장치(10)은, 순환 유로(F1) 내에 배지를 공급하는 배지 공급부(110)을 갖는다.

세포 배양 장치(10)을 상기와 같이 구성함으로써, 배지 교환 처리나 분할 처리 등의 세포 배양에 있어서 필요로 하는 일련의 처리를 폐쇄계에 있어서 연속적으로 실시하는 것이 가능해진다. 이로써, 균질한 세포의 대량 생산이 가능해진다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)에 의하면, 배양 개시 처리부터 동결 처리까지의 세포 배양에 필요한 일련의 처리를 사람의 손을 거치지 않고 행하는 것이 가능하다.

또한, 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(10)은, 제어부(18)이, 개폐 밸브(V1~V5, V11~V16, V21, V22, V31 및 V41), 펌프(P1~P5), 압력 조정 기구(26, 33 및 43)의 동작을 제어함으로써, 배양 개시 처리부터 동결 처리까지를 자동화하는 경우를 예시했지만, 이 양태에 한정되는 것은 아니다. 개폐 밸브(V1~V5, V11~V16, V21, V22, V31 및 V41), 펌프(P1~P5), 압력 조정 기구(26, 33 및 43)을, 유저가 수동으로 조작해도 된다.

실시예

이하, 실시예에 의하여 발명의 예시적 실시형태를 상세하게 설명하지만, 발명의 예시적 실시형태는, 실시예에 한정되지 않는다.

하기에 있어서, 물질 농도에 관하여 "M"은 몰 농도를 나타내고, 1M=1mol/L이다.

하기에 있어서, "PBS"란, 인산 완충액(phosphate buffered saline)을 의미하고, "IMDM"이란, 이스코브 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 의미한다.

하기에 있어서, "스피어"란, 구상의 세포덩어리를 의미한다.

<재료>

[인간 인공 다능성 줄기 세포주(hiPS 세포주)]

·253G1. 가부시키 가이샤 iPS 포털(니혼 교토부 교토시 가미쿄구 가와라마치도오리 이마데가와사가루 가지이초 448번지 5)로부터 분양.

[기본 배지 및 배지 첨가제]

·TeSR-E8, STEMCELL Technologies사의 상품 번호 ST-05940.

·3% 메틸셀룰로스액(IMDM 중. 메틸셀룰로스 농도는 w/v%), R&D Systems사의 상품 번호 HSC001.

·10mM Y-27632액. Y-27632(ROCK 저해제, Sigma-Aldrich의 상품 번호 Y0503)를 둘베코 PBS(Ca, Mg 불포함)에 용해시킨 용액.

[배지]

·배지 1: TeSR-E8 450mL에 3% 메틸셀룰로스액 50mL를 첨가하여 잘 교반하고, 10mM Y-27632액을, Y-27632의 종농도가 10μM가 되는 양 첨가하여 조제했다.

·배지 2: TeSR-E8 450mL에 3% 메틸셀룰로스액 50mL를 첨가하여 잘 교반하여 조제했다.

[배양 디시 및 원심 튜브]

·Ultra-Low Attachment Plate, Corning사의 상품 번호 Costar3471. 6웰, 덮개 부착.

·15mL 원심 튜브, Thermo Scientific사의 상품 번호 339650.

·50mL 원심 튜브, Thermo Scientific사의 상품 번호 339652.

[계대용 메시]

·메시 (1): Sysmex사의 Partec CellTrics 상품 번호 06-04-004-2325.

·메시 (2): Sysmex사의 Partec CellTrics 상품 번호 06-04-004-2326.

·메시 (3): 벡톤·디킨슨사의 셀 스트레이너 상품 번호 352340.

·메시 (4): Sysmex사의 Partec CellTrics 상품 번호 06-04-004-2327.

·메시 (5): 벡톤·디킨슨사의 셀 스트레이너 상품 번호 352350.

·메시 (6): 벡톤·디킨슨사의 셀 스트레이너 상품 번호 352360.

메시 (1)~(6)을 위상차 현미경(올림푸스사의 IX73)에 의하여 배율 20배로 관찰하고, 메시의 개구 치수를 개구의 2변을 계측하여 그들의 평균에 의하여 구했다. 메시의 개구 치수는 하기와 같았다.

·메시 (1): 개구 치수 25.7μm

·메시 (2): 개구 치수 35.9μm

·메시 (3): 개구 치수 40.5μm

·메시 (4): 개구 치수 43.3μm

·메시 (5): 개구 치수 73.1μm

·메시 (6): 개구 치수 100.1μm

계대용 메시는 모두, 오토클레이브에 의한 멸균 처리를 하여 계대 조작에 제공했다.

<실시예: hiPS 세포의 배양과 계대>

[hiPS 세포의 배양]

hiPS 세포주 253G1을, 6웰 배양 디시와 배지 2를 이용하여, 인큐베이터 중, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서, 배지를 교환하면서 5일간 부유 배양하여, 스피어를 형성했다.

[hiPS 세포의 계대]

5일간의 부유 배양 후, 6웰 배양 디시를 인큐베이터로부터 꺼내고, 원을 그리듯이 웰을 움직여, 웰의 중앙에 스피어를 모아 15mL 원심 튜브에 배지째 옮겼다. 미리 37℃로 가온한 TeSR-E8 3mL를 웰에 넣고, 웰에 남은 스피어를 모아, 추가로 15mL 원심 튜브로 옮겼다.

15mL 원심 튜브를 원심 처리(50rpm, 2분간)하여 상등액을 제거한 후, 미리 37℃로 가온한 배지 1을 넣어, 스피어를 배지 1에 재현탁했다. 스피어 현탁액을, 배지 1(액체의 온도 37℃)을 넣은 다른 15mL 원심 튜브로 옮겨, 세포 농도 5×10⁵/mL의 스피어 부유액을 조제했다.

시린지(테루모사의 상품 번호 SS50-LZ)의 입구와 실리콘 튜브의 일단을 루어 로크 타입의 튜브 커넥터를 통하여 접속하고, 실리콘 튜브의 타단과 피펫용 팁(Greiner Bio-One사의 상품 번호 607160, 선단 내경 1.5mm)을 튜브 커넥터를 통하여 접속했다. 스피어 부유액을 시린지로 옮겨, 시린지를 시린지 펌프(Harvard사의 상품 번호 PHD-2000)에 장전했다.

15mL 원심 튜브 또는 50mL 원심 튜브의 입구에, 메시 (1)~(6)을 각각 장착했다. 스피어 부유액을 수용한 시린지에 연결되어 있는 피펫용 팁의 선단을 메시에 압압하고, 시린지 펌프를 작동시켜 스피어 부유액을 압출하며, 스피어 부유액을 메시에 통과시켜, 스피어를 분할했다. 스피어 부유액의 메시 통과 속도는, 시린지 펌프에 의하여 유량 제어를 행함으로써 변화시켰다.

[계대 후의 배양]

메시를 통과시킨 후의 스피어 부유액을, 6웰 배양 디시에 파종하여, 인큐베이터 중, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양했다.

계대 후의 배양 1일째(즉, 메시 통과로부터 24시간 후)에, 6웰 배양 디시를 인큐베이터로부터 꺼내고, 원을 그리듯이 웰을 움직여, 웰의 중앙에 스피어를 모아, 15mL 원심 튜브로 옮겼다. 미리 37℃로 가온한 TeSR-E8 3mL를 웰에 넣고, 웰에 남은 스피어를 모아, 추가로 15mL 원심 튜브로 옮겼다.

15mL 원심 튜브를 원심 처리(50rpm, 2분간)하여 상등액을 제거한 후, 미리 37℃로 가온한 배지 2를 교환 전의 배지와 등량 넣어 스피어를 재현탁하여, 배지 교환을 행했다. 스피어 현탁액을 웰로 되돌리고, 인큐베이터 중, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양을 계속했다.

상기와 동일한 조작을, 계대 후의 배양 3일째(즉, 메시 통과로부터 72시간 후)에도 실시하여, 배지 교환을 행했다.

<계대의 평가>

[계대 전의 스피어의 크기]

상술한 [hiPS 세포의 계대]에 있어서 계대를 위하여 조제한 스피어 현탁액의 일부를 웰로 되돌리고, 평면상에서 웰을 세로 및 가로로 움직여, 스피어를 웰 내에서 균일하게 분산시켰다. 웰 내의 스피어를 위상차 현미경(올림푸스사의 IX73)에 의하여 관찰하여, 배율 10배의 현미경 화상을 촬영했다. 무작위로 선택한 300개의 스피어상을 해석하여, 개개의 스피어상의 면적으로부터 원 상당 직경을 구하고 300개의 평균을 구했다. 원 상당 직경의 평균은 263.4μm였다.

[계대 후의 스피어의 크기 및 형상]

계대 1시간 후(즉, 메시 통과로부터 1시간 후)에, 6웰 배양 디시를 인큐베이터로부터 꺼내고, 평면상에서 웰을 세로 및 가로로 움직여, 스피어를 웰 내에서 균일하게 분산시켰다. 웰 내의 스피어를 위상차 현미경(올림푸스사의 IX73)에 의하여 관찰하여, 배율 10배의 현미경 화상을 촬영했다. 무작위로 선택한 300개의 스피어상을 해석하여, 개개의 스피어상의 면적으로부터 원 상당 직경을 구하고 300개의 평균을 구했다. 또, 하기와 같이 원 상당 직경에 의하여 스피어를 분류하여, X와 Y의 비 "X/Y"를 구했다.

X: 원 상당 직경이 30μm 이상 40μm 미만인 스피어의 개수.

Y: 원 상당 직경이 40μm 이상 300μm 미만인 스피어의 개수.

스피어의 현미경 화상으로부터, 스피어의 형상을 하기와 같이 분류했다.

분류 A: 스피어의 윤곽이 확실하고, 윤곽이 매끄러우며, 스피어가 구형이다.

분류 D: 스피어의 윤곽이 확실하지 않고, 윤곽에 요철이 있어, 스피어가 불규칙한 형상이다.

분류 E: 계대에 의하여 스피어가 과도하게 분할되어, 스피어의 크기가 부적당할 정도로 작아져 있다.

도 9는, 메시 (4)에 속도 100cm/s로 통과시켜 계대한 후의 스피어상이며, 스피어의 형상의 분류 A의 전형예이다.

도 10은, 메시 (6)에 속도 180cm/s로 통과시켜 계대한 후의 스피어상이며, 스피어의 형상의 분류 D의 전형예이다.

도 11은, 메시 (1)에 속도 15cm/s로 통과시켜 계대한 후의 스피어상이며, 스피어의 형상의 분류 E의 전형예이다.

[계대 시의 세포 회수율, 계대 5일 후의 세포 증식률]

계대 조작을 개시하기 직전과, 계대 1시간 후(즉, 메시 통과로부터 1시간 후)와 계대 후의 배양 5일째(즉, 메시 통과로부터 120시간 후)에, 6웰 배양 디시를 인큐베이터로부터 꺼내고, 평면상에서 웰을 세로 및 가로로 움직여, 스피어를 웰 내에서 균일하게 분산시켰다. 1mL 튜브에 스피어 분산액을 300μL 넣고, 700μL의 TeSR-E8을 첨가하고 원심 처리(4000rpm, 3분간)하여 상등액을 제거했다. 이어서, 300μL의 TrypLE Select(트립신 유사 효소, Gibco사의 상품 번호 12563)를 첨가하여, 보텍스 믹서로 교반하고, 37℃에서 3분간 정치 후에 다시 보텍스 믹서로 교반하여, 세포 현탁액을 얻었다. 세포 현탁액을 세포 계수 장치(ChemoMetec사의 NC-200)에 넣어 세포수를 측정하고, 하기의 식 (2)에 의하여 세포 회수율을 산출하여, 하기의 식 (3)에 의하여 계대 5일 후의 세포 증식률을 산출했다.

식 (2): 계대 시의 세포 회수율=계대 1시간 후의 세포수÷계대 전의 세포수

식 (3): 계대 5일 후의 세포 증식률=계대 5일 후의 세포수÷계대 1시간 후의 세포수

[종합 판정]

분류 G1: X/Y가 1 초과 3 미만이고, 스피어의 형상이 분류 A이며, 계대 시의 세포 회수율이 0.40 이상이고, 계대 5일 후의 세포 증식률이 3.0 이상이다.

분류 G2: X/Y가 3을 초과하는 것 이외에는, 분류 G1과 동일하다.

분류 NG: 분류 G1 및 분류 G2에 해당하지 않는다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

표 1~표 6에 나타내는 바와 같이, 다능성 줄기 세포의 스피어를 개구 치수가 30μm~80μm의 범위의 메시에 통과 속도 15cm/s~150cm/s의 범위에서 통과시킴으로써, 다능성 줄기 세포에 대한 대미지를 억제하면서 효율적으로 세포덩어리의 분할을 할 수 있었다. 즉, 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 다능성 줄기 세포의 계대 방법은, 대량 배양에 적합한 계대 방법이라고 할 수 있다.

일본 출원 2016-093300의 개시는, 그 전체가 참조에 의하여 본 명세서에 원용된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허출원, 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고 개개에 기록된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의하여 원용된다.

Claims (4)

1. 다능성 줄기 세포를 배양하여 세포덩어리를 얻는 배양 공정과,
   상기 세포덩어리를 50cm/sec 이상 100cm/sec 이하의 속도로, 각각의 개구 치수가 30μm 이상 80μm 이하인 복수의 관통 구멍을 갖는 메시 형상의 막에 통과시킴으로써, 상기 세포덩어리를 분할하는 분할 공정을 포함하는 다능성 줄기 세포의 계대 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 배양 공정에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포를, 고분자 화합물을 함유하는 배양액 중에서 배양하는 계대 방법.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   상기 분할 공정에 있어서, 분할 후의 세포덩어리의 원 상당 직경의 평균값을 30μm 이상 75μm 이하로 하는 계대 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 다능성 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포인 계대 방법.

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