TW202020135A - 細胞培養系統及使用該系統之細胞團的製造方法 - Google Patents

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Abstract

一種用於將細胞團分割並繼代培養之細胞培養系統，其係連接第1容器10與分割器20而構成。其中，分割器的出口連接於第1容器。於分割器20的分割用管路中配置有用於分割細胞團之網狀構造22，藉由使細胞團通過該網狀構造而分割。經分割的細胞團係以在不與外部氣體接觸下被送往第1容器10，並在第1容器10進行進一步的培養為較佳態樣。藉此，可在維持封閉系統之狀態下進行細胞團的分割與懸浮培養。藉由將培養後的細胞團送往細胞培養系統本身的分割器或另外準備之細胞培養系統的分割器，可重複進行細胞團的分割與懸浮培養。

Description

細胞培養系統及使用該系統之細胞團的製造方法
本發明係關於能夠在封閉系統內重複進行將細胞懸浮培養而成長之細胞團的分割與進一步的懸浮培養之細胞培養系統，以及使用了該細胞培養系統之細胞團的製造方法。
近年來，正開發使多潛能幹細胞等各種細胞懸浮於液體培養基中，同時三維地成長為細胞團之細胞培養方法(亦稱為懸浮培養法)(例如專利文獻1等)。此外，亦開發用於較佳地實施懸浮培養法之液體培養基和該液體培養基的製造方法(例如專利文獻2等)。
於懸浮培養法中，隨著細胞團成長為更大，多潛能幹細胞的未分化性係有可能降低。例如，於非專利文獻1中指出150μm以上的大細胞團之未分化性有可能降低。
另一方面，於專利文獻1所記載之多潛能幹細胞的培養方法中，係將多潛能幹細胞懸浮培養至成為平均直徑約200至約300μm的大細胞團為止，並將所得到之該大細胞團分割為平均直徑約80至約 120μm的更小的細胞團，然後持續進行進一步的懸浮培養，以維持擴增該多潛能幹細胞。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2013/077423號
專利文獻2：國際公開第2016/163444號
[非專利文獻]
非專利文獻1：Andreas Elanzew et al., “A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension”, Biotechnology Journal, 2015, 10, 1589-1599.
然而，本發明者們在對專利文獻1所記載之多潛能幹細胞的培養方法進行詳細探討後，得知該方法包含以下應予改善之問題。
亦即，於前述培養方法中，係使用互為分開之不同的容器與分割器具來進行細胞團的分割步驟與進一步培養經分割之細胞團之步驟。因此，細胞團與含有該細胞團之液體培養基在送入於分割步驟時會與外部氣體接觸，此外，於分割步驟中被分割之細胞團與含有該細胞團之液體培養基，在為了進一步培養而移往下一段的培養容器時會與外部氣體接觸。因此， 在重複進行細胞團的分割步驟與進一步培養經分割之細胞團之步驟之情形下，細胞團與液體培養基會數度與外部氣體接觸，而可能被污染。
本發明之目的在於提供一種細胞培養系統，並且提供一種使用該細胞培養系統之細胞團的製造方法；該細胞培養系統能夠解決上述問題，可在封閉系統內進行細胞團的分割與經分割之細胞團的進一步培養。
本發明之主要構成係如下列所述。
[1]一種細胞培養系統，係用於將細胞團分割並進行繼代培養之細胞培養系統，其中至少具有：
用於將從供給源連同液體培養基所供給之應予分割的細胞團分割為更小的細胞團之分割器，以及
用於將藉由前述分割器所分割之細胞團進行懸浮培養之第1容器；
前述分割器係具有入口與內部的分割用管路與出口，前述入口係構成為將前述應予分割的細胞團與液體培養基從前述供給源接收至前述分割用管路內之方式構成，於前述分割用管路中配置有用於分割應予分割的細胞團之網狀構造，並藉由使該應予分割的細胞團連同液體培養基通過該網狀構造而分割，前述出口係以將前述經分割的細胞團送出至前述第1容器之方式連接於該第1容器；
前述第1容器係具有接收經分割的細胞團與液體培養基，並且送出在該第1容器內懸浮培養後的細胞團之構成。
[2]如上述[1]所述之細胞培養系統，其中，第1容器為柔軟的細胞培養袋。
[3]如上述[1]或[2]所述之細胞培養系統，其中，前述網狀構造為以線材所編織之篩網。
[4]如上述[1]或[2]所述之細胞培養系統，其中，前述網狀構造為在膜之主面的既定區域配置有複數個貫通孔之多孔膜，該網狀構造具有：在膜的厚度方向上貫通前述既定區域之複數個貫通孔、以及作為該貫通孔彼此之間的間隔壁之樑部；
前述貫通孔具有可讓前述更小的細胞團通過之大小的開口形狀，
前述樑部為從前述既定區域的前述本體部分扣除前述貫通孔後之剩餘部分，係將應予分割的細胞團進行切斷之部分，且係以形成為網狀之方式一體地連結。
[5]如上述[4]所述之細胞培養系統，其中，前述網狀構造之垂直於樑部的長邊方向之剖面的形狀為矩形，或為該矩形之入口側的2個角部帶有弧度之形狀。
[6]如上述[4]或[5]所述之細胞培養系統，其中，前述複數個貫通孔的開口形狀係互為全等的四角形，且前述樑部以正交方格狀相互連結；或是
前述複數個貫通孔的開口形狀係互為全等的六角形，且前述樑部以蜂巢狀相互連結。
[7]如上述[1]至[6]中任一項所述之細胞培養系統，其中更具有用於回收既定大小的細胞團之回收器，
該回收器係以接收在前述第1容器內懸浮培養後的細胞團與液體培養基之方式連接於該第1容器，
該回收器具有分離室，該分離室由分離用網狀構造區隔為第1室與第2室，並以使進入於該回收器內之液體培養基從第1室通過分離用網狀構造往第2室移動，且移出至該回收器外之方式來構成內部流路，
前述分離用網狀構造係具有不會讓所欲回收之大小的細胞團通過之預定大小的網目，藉此，在連同液體培養基進入於該回收器內之細胞團中，所欲回收之大小的細胞團不會通過該分離用網狀構造而滯留於第1室。
[8]如上述[7]所述之細胞培養系統，其中，前述分離用網狀構造之整體的形狀為薄片狀或袋狀。
[9]如上述[7]或[8]所述之細胞培養系統，其中，以使在液體培養基通過前述回收器之分離用網狀構造的網目時之該液體培養基的行進方向具有垂直朝上的方向分量之方式，於前述回收器的分離室中配置有該分離用網狀構造。
[10]如上述[7]至[9]中任一項所述之細胞培養系統，其中，前述回收器之分離室的第1室係具有：
用於將在前述第1容器內懸浮培養後的細胞團與液體培養基接收至於第1室之第1流入埠，
用於使稀釋具有試劑及/或細胞團與液體培養基而成之懸浮液用之液體從外部流入於第1室之第2流入埠，以及
用於使一部分的細胞團從第1室流出至外部之流出埠。
[11]如上述[1]至[10]中任一項所述之細胞培養系統，其中更具有用於使液體培養基與細胞團移動之送液裝置，該送液裝置係選自由將第1容器 壓縮變形以將容納於內部之液體培養基與細胞團送出之裝置、注射泵以及蠕動泵所組成之群組的1種以上。
[12]如上述[1]至[11]中任一項所述之細胞培養系統，其中更具有：以在與前述應予分割的細胞團連同液體培養基通過前述網狀構造之方向為相反的方向上，使既定液體通過該網狀構造之方式，使該既定液體移動用之逆向送液功能或逆向送液裝置。
[13]如上述[1]至[12]中任一項所述之細胞培養系統，其中，前述細胞團是由多潛能幹細胞所構成之細胞團。
[14]如上述[1]至[13]中任一項所述之細胞培養系統，其中，於前述液體培養基中包含用於使細胞或細胞團懸浮於該液體培養基中之細微的構造體，該細微的構造體係分散並懸浮於該液體培養基中。
[15]一種細胞團的製造方法，該製造方法係具有：
使用如上述[1]至[14]中任一項所述之細胞培養系統，
使應予分割的細胞團與液體培養基通過前述細胞培養系統的分割器，來分割該細胞團之步驟；以及
將藉由前述分割器所分割之細胞團連同液體培養基送往第1容器內，並於該第1容器內進行懸浮培養之步驟。
[16]如上述[15]所述之細胞團的製造方法，其中，使細胞團連同液體培養基通過前述分割器時之該液體培養基的流速為10mm/秒至500mm/秒。
[17]如上述[15]或[16]所述之細胞團的製造方法，其中更具有逆流洗淨步驟，該逆流洗淨步驟為在前述分割細胞團之步驟中分割出既定量的細 胞團後，在與用於分割該細胞團而通過分割器的網狀構造之方向為相反的方向上，使既定液體通過該網狀構造，藉此洗淨該網狀構造之步驟。
[18]如上述[15]至[17]中任一項所述之細胞團的製造方法，其中，前述細胞培養系統為上述[7]至[10]中任一項所述之細胞培養系統，且更具有：將在第1容器內懸浮培養後的細胞團連同液體培養基送往前述細胞培養系統的回收器，並將滯留於該回收器的第1室之細胞團送往回收容器而進行回收之步驟。
[19]如上述[17]所述之細胞團的製造方法，其中，在前述回收器中用以將細胞團與液體培養基進行分離之通過該回收器之該液體培養基的流速為0.01mm/秒至25mm/秒。
藉由本發明之細胞培養系統及製造方法，細胞團能夠連同液體培養基於封閉系統內移動，在此封閉系統內的移動中，亦能夠進行細胞團的分割與分割後之細胞團的成長。埠能夠以可適當地注入新的液體培養基並適當地抽取舊的液體培養基之方式而設置。藉此，能夠抑制來自外界的污染，同時使目的之細胞團自動地大量增殖。
此外，如前述般，較佳的態樣係於封閉系統內所培養之細胞團為連同液體培養基被移往回收器(較佳係在不與外部氣體接觸下被移往回收器)，可安全地回收細胞團。所回收之細胞團的一部分或全部可被再次送回該細胞培養系統，也可移往另外準備之僅為必需數量的其它之該細胞培養系統，亦可在其中重複進行僅為必需次數之細胞團的分割與培養。僅準備必需數量的其它之該細胞培養系統，可以是以使細胞團從1個系統 被分配至複數個系統之方式並聯地配置，也可以是以使細胞團依序從1個系統供給至下1個系統之方式串聯地配置。
10‧‧‧第1容器
20‧‧‧分割器
20a‧‧‧聯結入口
20b‧‧‧聯結出口
21‧‧‧分割用管路
22‧‧‧網狀構造
40‧‧‧回收器
41‧‧‧分離室
41a‧‧‧第1室
41b‧‧‧第2室
42‧‧‧分離用網狀構造
43‧‧‧流入埠
44‧‧‧排出埠
50‧‧‧廢液用容器
51‧‧‧液體供給容器
52‧‧‧回收容器
100‧‧‧網目
101、102‧‧‧線材(經線)
111、112‧‧‧線材(緯線)
200‧‧‧膜狀的本體部分
200a‧‧‧中央區域
200b‧‧‧外周區域
210‧‧‧多孔膜的網狀構造
220‧‧‧貫通孔
230‧‧‧樑部
231‧‧‧單點鏈線圈起之部分
240‧‧‧支撐器
241‧‧‧支撐器本體部
241c、242c‧‧‧連接用的管部
241p‧‧‧第1貫通孔
241s‧‧‧配置面
241t‧‧‧外螺紋
242‧‧‧蓋體部
242p‧‧‧第2貫通孔
242s‧‧‧壓抵面
242t‧‧‧內螺紋
243、244‧‧‧墊片(薄片狀的密封構件)
431‧‧‧第1流入埠
432‧‧‧第2流入埠
433‧‧‧流出埠
C11、C12、C13、C14、C21、C22、C23、C24、C31、C32、C33、C34、C41、C42、C43、C44、C51、C52、C53、C54‧‧‧頂點
E1‧‧‧細胞團
f‧‧‧行進方向
fh‧‧‧水平方向分量
fv‧‧‧垂直朝上的方向分量
F1‧‧‧送液裝置
h1‧‧‧中心軸線的高度
H1‧‧‧室內總高度
P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8‧‧‧管路
Q1‧‧‧液體培養基(懸浮液)
Q2‧‧‧液體培養基
S1‧‧‧供給源
t1‧‧‧厚度
V1、V2‧‧‧切換閥
W1、W11‧‧‧距離
W2、W21‧‧‧樑部的寬度
第1圖為概略性顯示本發明之細胞培養系統之構成的一例之圖。在圖中，係為了說明而將培養容器描繪地較小，且將管路描繪地較粗，惟實際上之培養容器為一般培養袋的大小，管路為可撓性配管管體。分割器的網狀構造係以粗虛線描繪。
第2圖為顯示細胞團的分割所使用之篩網的構造之圖。第2圖(a)為顯示篩網之薄片面的既定區域之部分擴大圖，第2圖(b)為第2圖(a)的X1-X1剖面圖。於第2圖(b)中，係於線材的剖面施以影線。
第3圖為顯示提出作為較佳之分割器的網狀構造之多孔膜之態樣的一例之圖。第3圖(a)為顯示膜狀的本體部分之膜面的既定區域之部分擴大圖，第3圖(b)為第3圖(a)的X2-X2剖面圖。第3圖(c)至(e)為例示第3圖(b)所示之樑部之剖面的其它態樣之圖。於第3圖(b)至(e)中，係於樑部的剖面施以影線。
第4圖為例示在本發明中所提出之多孔膜中，於膜面設置有網狀構造之區域之圖。於該圖中，係省略了貫通孔之開口的圖示，並以影線顯示設置有網狀構造之區域。
第5圖為顯示本發明中所提出之多孔膜的其它例子之圖，且為顯示本體部分之膜面的既定區域之部分擴大圖。
第6圖為顯示支撐器之構造的一例之剖面圖，該支撐器係以可將網狀構造較佳地使用作為分割器之方式所構成者。
第7圖為概略性顯示加入有回收器之本發明之細胞培養系統的構成例之圖。回收器內的分離用網狀構造係以粗虛線來描繪。在圖中，係與第1圖相同，是為了說明而將培養容器描繪地較小，且將管路描繪地較粗。此外，係以粗箭號顯示細胞培養的流程，並以細虛線的箭號顯示與使用回收器之回收相關的流程。
第8圖為顯示回收器之較佳態樣的一例之圖。第8圖(a)是為了觀看回收器的內部而去除側壁部之圖，第8圖(b)為第8圖(a)的X3-X3剖面圖。
第9圖為顯示回收器之較佳態樣的其它例之圖。第9圖(a)是為了觀看回收器的內部而去除側壁部之圖，第9圖(b)為第9圖(a)的X4-X4剖面圖。
第10圖為顯示回收器之較佳態樣的其它例之剖面圖。圖中，係以粗虛線表示分離用網狀構造的剖面。該虛線上之點彼此的間隔與實際之網目的大小並無關係。細胞團係使用白色圓形的符號來顯示。第11圖、第15圖亦同。
第11圖為顯示回收器之較佳態樣的其它例之剖面圖。
第12圖為概略性顯示回收器之較佳態樣的其它例之剖面圖。
第13圖為顯示回收器之較佳態樣的其它例之剖面圖。第13圖(a)是為了觀看回收器的內部而去除側壁部之圖，第13圖(b)為第13圖(a)的X5-X5剖面圖。
第14圖為顯示回收器之較佳態樣的其它例之圖。第14圖(a)是為了觀看回收器的內部而去除側壁部之圖。第14圖(b)為示意性顯示第14圖(a) 之回收器之構成的一例之立體圖。第14圖(c)為示意性顯示第14圖(a)之回收器之構成的其它例之立體圖。
第15圖為顯示回收器之較佳態樣的其它例之剖面圖。
第16圖為顯示使用了本發明之分割細胞團的方法之細胞培養方法的一例之流程圖。
第17圖為顯示調查在本發明中對分割器之逆流洗淨的效果之試驗結果之圖表。第17圖(a)、第17圖(b)為顯示在不進行逆流洗淨而持續進行細胞團的分割之情形下，經分割之細胞團所含有之細胞的生存率之圖表，第17圖(c)、第17圖(d)為顯示每當分割既定量，而於進行逆流洗淨同時持續進行細胞團的分割之情形下，經分割之細胞團所含有之細胞的生存率之圖表。
第18圖為顯示調查在本發明中網狀構造之樑部的剖面形狀與分割性能之關係的試驗結果之圖表。
第19圖為顯示本發明的實施例中所使用之細胞培養系統的構成之方塊圖。
以下，係列舉實施例來詳細說明本發明之細胞培養系統(亦稱為該細胞培養系統)的構成。
該細胞培養系統之較佳態樣下，係以整體為封閉系統(排除氣體分子的穿透而從外部氣體阻隔之系統)之方式構成，並在與外界隔離之管路內分割細胞團，並進一步培養(繼代培養)分割後的細胞團。然後，所培養之細胞 團係被迴饋至同樣的該細胞培養系統內，亦可被送往其它的該細胞培養系統，而重複進行進一步的分割與培養。該細胞培養系統是以可重複進行於如此封閉系統下之細胞團的分割與培養之方式，而如第1圖之較佳態樣的一例所示般地至少具有：用於將從供給源S1連同液體培養基所供給之應予分割的細胞團分割為更小的細胞團之分割器20，以及用於將藉由該分割器20所分割之細胞團進行懸浮培養之第1容器10；且此等係氣密地連接。於第1圖的例子中，分割器20與第1容器10是經由配管P2來連接，或亦可為兩者直接連接。F1為用於沿著管路來傳送液體培養基與細胞團之送液裝置(泵)。送液裝置F1的位置並無限定。送液裝置F1係詳述於後。
(供給源)
第1圖所示之供給源S1係用於將應予分割的細胞團與液體培養基(亦即，液體培養基與存在於該液體培養基中之細胞團)供給至該細胞培養系統者。供給源S1可為容納有細胞團與液體培養基之外部的培養容器，亦可為被賦予至該細胞培養系統之回收器所附帶之回收容器。於第1圖的例子中，在外部的細胞培養裝置中，將藉由附著培養而成長之群落從培養支架(scaffold)剝離後之細胞團(或是藉由懸浮培養而形成之細胞團)係連同液體培養基被容納於注射器等容器中，較佳態樣係不與外部氣體接觸而通過管路P1被送入分割器20。此時，可從合流管路等來添加分割後的培養所需之量的液體培養基，亦可在供給源S1中容納分割後的培養所需之量的液體培養基與細胞團。也可以適當地加入用於交換培養所需之液體培養基、應予廢棄之液體培養基的配管。
在被賦予至該細胞培養系統之回收器為供給源之情形下，該回收器可設置在管路P3上，亦可是在封閉迴路內循環地重複進行細胞團的分割與培養。亦可以在封閉迴路內較佳循環地重複進行細胞團的分割與培養之方式，適當地設置開閉閥、切換閥、容器、送液裝置等。
此外，亦可使用複數個該細胞培養系統，將第1段之該細胞培養系統的回收容器設為供給源S1，並以從該處所供給之細胞團與液體培養基被依序供給至第2段以後的該細胞培養系統之方式，設為各細胞培養系統會成為下一段之細胞培養系統的供給源之構成。
(分割器)
如第1圖所示，分割器20係具有入口20a及出口20b，該出口20b氣密地(亦即，較佳態樣為外部氣體無法進入之方式)連接於第1容器10。於第1圖的例子中，分割器20的出口與第1容器10的入口係經由管路P2(軟質樹脂管等配管構件)來連接，但兩者亦可直接連接。此外，於管路P2的中途，亦可視需要而連接切換閥、注入埠等。
分割器20具有聯結入口20a及出口20b之分割用管路21。於分割用管路21中，係配置有用於分割(碎解)細胞團之網狀構造22，從第1容器10連同液體培養基被送出至分割用管路21中之細胞團，較佳態樣係以不與外部氣體接觸而通過該網狀構造22之方式構成。在此所謂的「通過網狀構造」，意指從一側往另一側通過網狀構造的網目者。
網狀構造的較佳態樣以及較佳地保持該網狀構造之構造，係詳細於後。
(第1容器)
第1容器10係具有能夠以較佳態樣而不與外部氣體接觸地容納液體培養基與分割後的細胞團之構成，並且，具有能夠以較佳態樣而在不與外部氣體接觸下送出所容納之液體培養基與細胞團(分散於液體培養基之細胞團)之構成。
於本發明之較佳態樣中，所謂(液體培養基與細胞團不與外部氣體接觸)，意指液體培養基及/或細胞團不會直接接觸或暴露於外部氣體。例如，在外部氣體(氧氣等)通過氣體穿透性培養袋而穿透至容器內之情形下，並不屬於接觸。此外，在為了細胞培養而將特定氣體積極地注入至容器內之情形下，該種意欲助於培養而注入之氣體並非外部氣體，因此不屬於接觸外部氣體。
如前述之第1容器10可列舉出柔軟的細胞培養袋和燒瓶等，較佳者可列舉出容積可改變之容器。尤其，於壁部採用柔軟的聚合物膜之細胞培養袋，因為低價且容積大，且可因應液體培養基與細胞團的進出而收縮或膨脹(不須因應液體培養基與細胞團的出/入而使外部氣體填補性地出/入)，所以是液體培養基與細胞團不與外部氣體接觸之較佳容器。該細胞培養袋可利用氣體穿透性者等以往所知者，此外，燒瓶亦可利用以往所知者，此等係可選擇因應需要之容積。
(分割器的網狀構造)
分割器如上述般，係具有分割用管路，於該分割用管路中，配置有用於分割細胞團之網狀構造。細胞團於通過此網狀構造時，會被分割為對應於網目的大小之大小。較網狀構造的網目更大之細胞團會被網狀構造分割而通過該網狀構造，或是無法通過網狀構造而殘留於網狀構造的薄片面， 是否能夠通過主要是由通過該網狀構造之液體培養基的流速、與構成網狀構造之線材和樑部(後述)的粗度來決定。
網狀構造可為以線材所編織之篩網，亦可為在膜之主面的既定區域配置有複數個貫通孔之多孔膜。藉由以線材所編織之篩網來分割細胞團一事，係記載於上述專利文獻1。因此，篩網係可利用使用在該種切斷之周知者。於本發明中，係提出用於將篩網和多孔膜組入封閉系統的管路中之後述支撐器，即使是篩網，亦可在封閉系統中使用。
於專利文獻1所記載之多潛能幹細胞的培養方法中，係使用編入尼龍製和金屬製的線材而成之篩網，並使較大細胞團通過該篩網，藉此分割成大小為對應於該篩網的網目(正方形的通過孔)之較小細胞團。
然而，本發明者們在對使用前述篩網之細胞團的分割進行詳細探討後，得知會有由於篩網特有的構造而導致未較佳地分割通過該篩網之細胞團之情形。亦即，篩網為一種薄片狀物，在巨觀地正視該薄片面之情形下，係如第2圖(a)所示般，可觀看到經線及緯線係直線地交叉，且可觀看到網目亦為平面的正方形。但是，在微觀地觀察各個網目時，由於經線及緯線係以相互交錯之方式被三維地編織，所以構成包圍1個正方形的網目100之4邊的4條線材(2條經線(101、102)及2條緯線(111、112))如第2圖(b)所示般，係分別在篩網的厚度方向上呈較大波形。
在細胞團通過如此的由呈波形之4條線材所包圍之網目的情況下，由於各線材的剖面形狀為圓形，線材的線體表面為曲面，所以會有細胞團未被適當地或銳利地分割之情形。若是為了改善此篩網的缺點而使用更細的線材，則篩網的強度會降低。若是為了改善此種情形而進一步 提高線材的強度，則篩網會變得更昂貴。此外，在藉由以線材所形成之篩網來分割細胞團之情形下，若液體培養基的流速低則無法切斷細胞團，而只是被篩網的網所捕集，故無法適當地分割，而使得細胞團的回收率降低。因此，流速必須高至某程度。另一方面，若是提高液體培養基的流速，則經分割的細胞團會承受高速流動所造成之剪力而導致變得更小。多潛能幹細胞的細胞團在被分割至外徑為40μm時，會引起細胞凋亡(apoptosis)等而對細胞造成較大損害，故不佳。
如以上所述，在使用以往的篩網之細胞團的分割中，液體培養基的流速較低時則細胞的回收率降低，液體培養基的流速較高時則對細胞團造成的損害較大，導致擴大培養效率的降低。
於是，在本發明中，係提出使用在膜之主面的既定區域配置有複數個貫通孔之多孔膜作為網狀構造。以下，係列舉實施例來詳細說明較佳之多孔膜的態樣。
多孔膜係具有膜狀的本體部分。於該本體部分的外周緣部等處，可更設置用於提升處理性之剛性高的框體或耳片等，在以下列舉作為說明之態樣中，多孔膜整體為膜狀的本體部分，因此係整體為1片膜。多孔膜的本體部分之膜面上的既定區域如第3圖(a)所示般，係成為在該膜面配置有複數個貫通孔220之網狀構造210。膜面的既定區域可為膜面的一部分或全部區域。例如，在第4圖(a)的例子中，膜狀的本體部分200的外周區域200b係成為無貫通孔之平坦的膜，而於中央區域200a上配置有貫通孔。在決定網狀構造的外周之外形線(例如中央區域200a之外周的邊界線)橫切貫通孔的開口之情形下，該貫通孔的開口成為僅於外形線的內側之 較小開口。在此情形下，可直接設置較小開口的貫通孔，或不設置較小開口的貫通孔，或者可以原先形狀的開口係於外側超過外形線之方式設置貫通孔。
(網狀構造)
多孔膜的網狀構造210係如第3圖(a)所示，是由：在膜的厚度方向上貫通前述既定區域之複數個貫通孔220、以及作為該貫通孔彼此之間的間隔壁之樑部230所構成。貫通孔220具有能夠讓分割後的細胞團通過之大小的開口形狀。另一方面，樑部230為從前述既定區域的本體部分扣除前述貫通孔後之剩餘部分。該樑部作為將應予分割的細胞團切斷之部分發揮功能，且係以形成為網狀之方式一體地連結。藉由此構成，可抑制前述之篩網的問題，並較佳地分割成長為較大之細胞團。
於可利用在本發明之多孔膜中，如前述般於，係於膜面上配置有複數個貫通孔，且該膜面的既定區域(一部分或全部區域)係成為網狀構造。此網狀構造是一種多孔膜，其係作為網目發揮功能之貫通孔以及作為相鄰之貫通孔彼此間的間隔壁發揮功能之樑部所構成者。如第3圖(a)所示，在此網狀構造的區域中，樑部230係作為從膜中排除貫通孔後之剩餘部分且以二維狀連結成網，所以不具有如篩網的線材般之波形。因此，碰撞於如此之不具有波形之樑部的細胞團，能夠較碰撞於上述形呈波形之篩網的線材者被更佳地分割。再者，該樑部230的剖面形狀係如第3圖(b)或第3圖(c)所示般，並非圓形，而是接近於四角形和矩形(以厚度方向為長邊之長方形，或以厚度方向為短邊之長方形、正方形)。因此，該細胞團能夠 藉由各貫通孔的開口部之樑部230的邊緣而更無阻力地被銳利地分割，所以於切斷時該細胞團所受到之損害有變得更小之情形。
因此，在使用多孔膜之細胞團的分割中，即使將通過網狀的區域之液體(分散有應予分割的細胞團之液體培養基等)的流速提高為較使用以往的篩網之分割時的流速更高，仍可抑制細胞團被碎解為過細的細胞團之情形。
樑部的剖面形狀(垂直於樑部的長邊方向之剖面的形狀)係能夠藉由該樑部的寬度W2與多孔膜的厚度t1之關係，而如第3圖(b)或第3圖(c)所示般成為矩形(直角四邊形)。
前述矩形之入口側的2個角部為如第3圖(b)或第3圖(c)所示般帶有弧度之形狀者，亦有經分割之細胞團的生存率會進一步提高，而為較佳之情形。咸認係因為此種情形與入口側的2個角部為尖銳直角的邊緣之情形相比，係細胞所受到之損害減少，且各個細胞本身被切斷的可能性變得更低，而且更可能在細胞彼此相互接著之邊界面將該細胞彼此分離之所造成的結果。
於第3圖(d)的態樣中，係僅在矩形之入口側的2個角部處局部地帶有弧度之形狀，因此於樑部之入口側的面係殘留有平面。另一方面，於第3圖(e)的態樣中，矩形之入口側的2個角部較第3圖(d)的態樣更帶有弧度，剖面形狀整體為半圓形(更嚴格來說，為具有圓弧與弦之形狀)。因此，樑部之入口側的面係有如圓柱的柱體表面而整體呈曲面。如前述般，從減少細胞所受到之損害之觀點來看，角部之弧度的半徑係以愈大者為愈佳，與第3圖(d)的態樣相比，係以第3圖(e)的態樣為更佳。該弧度的半徑亦會因為 樑部的寬度W2和多孔膜的厚度t1而有所不同，惟能夠例示為1μm至100μm左右。此外，該弧度的半徑係可如圓弧般地一致，亦可因場所而異。
就能夠利用在本發明之多孔膜的較佳態樣而言，係將貫通孔的開口形狀設為更接近圓形之形狀(例如正方形或正六角形)，並設成相同開口形狀的貫通孔形以矩陣狀或細密狀地配置之構成，並且使樑部的寬度均勻，藉此可進一步減少該細胞團於切斷時所受到之損害，並且可以得到較佳大小之球體(sphere)狀的細胞團。
此外，於可利用在本發明之多孔膜中，就進一步窄化樑部的寬度而言，在加工上係相對容易，且若開口形狀為正六角形，則網狀構造整體的強度高，故可進一步窄化樑部的寬度。藉此，可更無阻力地切斷細胞團，且可增大開口率(於網狀構造區域的單位面積中開口面積的總和所佔之比率)，故能解決如前所述之篩網的問題。
(多孔膜之貫通孔的開口形狀之尺寸限定)
貫通孔之開口形狀的等效圓直徑係因構成應予分割的細胞團之細胞的種類而有所不同，例如當細胞為多潛能幹細胞或胚胎幹細胞等時，則可列舉出40至90μm左右，更佳為50至80μm，又更佳為60至70μm。以下係例示對於細胞為多潛能幹細胞或胚胎幹細胞等情形時之各部分的較佳尺寸等，惟對於此等以外的其它細胞，亦可為分別適當地因應而變更之尺寸。
若是僅規定前述等效圓直徑，則亦包括如狹縫般之細長的開口形狀或如迷宮般錯綜複雜的開口形狀。因此，於本發明中除了限定前述等效圓直徑之外，還加上該開口形狀為可容納直徑35μm至85μm的圓(以下稱為容納圓)之形狀者來作為限制條件。在此，所謂開口形狀為可將容納 圓容納，係包括容納圓內接於開口形狀之情形還有容納圓與開口形狀為一致之情形。
在將具有相同的等效圓直徑之形狀進行比較之情形下，正六角形之容納圓的直徑係較正方形之容納圓的直徑大。在為對應於等效圓直徑的較佳下限值之40μm的正方形之情形下，該正方形的一邊長度係約35.449μm，此時之容納圓的直徑係約35.449μm以下。因此於本發明中，係將35μm設為容納圓直徑的較佳下限。此外，在為對應於等效圓直徑的較佳上限值之90μm的正六角形之情形下，如此之正六角形的互為相對之兩邊的距離為約85.708μm，此時之容納圓的直徑為約85.708μm以下。因此，於本發明中係將85μm設為容納圓直徑的較佳上限。
前述容納圓的直徑更佳為44μm至76μm，又更佳為53μm至67μm。在開口形狀為圓形之情形下，容納圓的直徑=等效圓直徑，除此之外，係容納圓的直徑<等效圓直徑。
(多孔膜之貫通孔的開口形狀)
設置在網狀構造之複數個貫通孔的開口形狀並無特別限定，可為圓形、橢圓形、三角形、四角形、六角形、其它多角形或不規則形等，當為三角形等具有銳角的內角之形狀的情形下，由於從膜的強度之觀點來看係無法提高開口率，所以可能會產生回收率降低等問題。此外，開口形狀為圓形時，由於樑部的寬度並非固定，而且樑部相互連結之部分的面積較大，所以由樑部所致之細胞的切斷性為不佳。相對於此，若為正六角形，則內角為鈍角，而且樑部相互連結之部分的面積小，故可抑制如前述之問題，而為較佳。
此外，就切斷後得到均勻的細胞團之點而言，較佳係所有的開口形狀相互為全等。
此外，就樑部的寬度(相互鄰接之貫通孔彼此的間距距離)為均勻者而言，因為依該樑部的長度之切斷性為均勻，故較佳。
從此等之點來看，貫通孔的開口形狀較佳為四角形或六角形，更佳為開口周圍之邊(樑部)的長度係互為相等之正方形或正六角形。以更接近圓形之點來看，較佳為正六角形。
(多孔膜之開口的配置圖案)
在所有的開口形狀為全等的正六角形之情形下，往膜面之開口的配置圖案係以細密狀為較佳，在此情形下，樑部係成為如第3圖(a)所示般之以蜂巢狀相互連結之網狀體。在此態樣中，排除3個樑部的端部彼此所結合之部分，較佳係所有樑部的寬度W2為均勻。
此外，在所有的開口形狀為全等的正方形之情形下，往膜面之開口的配置圖案較佳為正方形矩陣狀，在此情形下，樑部係成為如第5圖(a)所示般之以正交方格狀相互連結之網狀體。在此態樣中，因為除了4個樑部的端部彼此結合之部分之外，所有樑部的寬度W21係成為均勻，故亦為較佳。再者，亦可如第5圖(b)所示般，為正方形的開口部以每一行往橫向偏移之配置圖案等，惟如單點鏈線圈起之部分231般，由於橫向的樑部被分為2個，所以切斷性係與第5圖(a)所示之正交方格不同。
如第3圖(a)所示，在正六角形的開口被配置為細密狀之情形下，該正六角形的6邊當中，互為相對之平行的兩個邊之間的距離W1可為前述容納圓的直徑，較佳為38μm至85μm，更佳為48μm至76μm， 又更佳為57μm至67μm。在此情形下，樑部的寬度W2較佳為10μm至60μm，更佳為20μm至40μm。
此外，如第5圖(a)所示，在正方形的開口被配置為正方形矩陣狀之情形下，該正方形的4邊當中，互為相對之平行的兩個邊之間的距離W11可為前述容納圓的直徑，較佳為35μm至80μm，更佳為44μm至71μm，又更佳為53μm至62μm。在此情形下，樑部的寬度W21較佳為10μm至60μm，更佳為20μm至40μm。
(本體部分的厚度)
膜狀的本體部分的厚度並無特別限定，從將樑部形成為細線狀之點來看，較佳為10μm至60μm，更佳為20μm至40μm。
(本體部分的材料)
膜狀本體部分的材料並無特別限定，可列舉出：金、銀、銅、鐵、鋅、鉑、鎳、鉻、鈀等金屬材料或由此等任意材料的組合所構成之合金，較佳的合金可例示出不鏽鋼或黃銅等。
(多孔膜的製造方法)
多孔膜的製造方法並無特別限定，能夠因應材料而適當地選擇樹脂成型、衝孔、LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung：光刻電鑄模造)等適當的方法，從開口形狀及樑部之寬度係微小之點來看，可例示出採用了LIGA之製造方法。使用LIGA之製造方法中，係例如：藉由光蝕刻(lithography)來製作電鑄用模具，並在電鑄槽內利用電化學反應而在該模具的表面形成成為多孔膜之金屬鍍覆層，將該金屬鍍覆層從該模具剝離而使用作為多孔膜。
即使是如第3圖(d)、(e)所示般，為樑部的剖面形狀之入口側的2個角部帶有弧度之形狀，例如亦可藉由將前述模具之凹部的形狀作成為隅角部帶有弧度之形狀而得到。
網狀構造可視需要串聯地配置2個以上而使用。例如，可將2個以上的網狀構造重疊配置在以下所說明之支撐器內，亦可串聯連接2個以上之容納有1個網狀構造之支撐器。使用2個以上時，網狀構造的規格可互為不同或相同。
(用於較佳地使用網狀構造之支撐器)
於本發明中，係提出一種支撐器，該支撐器係用以較佳地使用網狀構造(篩網或多孔膜)之支撐器。藉由將該網狀構造設置在該支撐器，可構成較佳的分割器。該支撐器不僅可使應予分割的細胞團連同液體較佳地通過網狀構造，並且可在封閉系統中連續地進行細胞培養、細胞團的分割、分割後之細胞團的繼代培養。
第6圖為顯示前述支撐器之構造的一例之剖面圖。如該圖所示，支撐器240係具有支撐器本體部241與蓋體部242而構成者；前述支撐器本體部241具備用於配置網狀構造22之配置面241s，前述蓋體部42係覆蓋被配置在該配置面241s之網狀構造22，且可裝卸地被固定在該支撐器本體部。於第6圖的例子中，網狀構造(多孔膜)22被夾持於2片墊片(薄片狀的密封構件)243與244之間，藉此而以液體培養基不會洩漏至支撐器外之方式來密封。蓋體部242的內側面係成為用以將網狀構造22往支撐器本體部241壓抵之壓抵面242s。
支撐器本體部241具有於配置面241s上開口之第1貫通孔241p，蓋體部242具有於壓抵面242s上開口之第2貫通孔242p。此等第1貫通孔及第2貫通孔係作為分割用管路而發揮功能。如第6圖所示，於蓋體部242被固定在支撐器本體部241之狀態下，第1貫通孔241p之開口的中心與第2貫通孔242p之開口的中心係互為一致。由於多孔膜22與以往的篩網不同，其表面與內面為平坦，所以能夠以使液體培養基不在橫向上洩漏之方式而容易且較佳地氣密夾起。
墊片243、244的外形係以外形大於網狀構造為較佳。該墊片243、244的材料若是例如為矽等不會對活體造成影響且具有較佳的密封性者即可。
於第6圖的例子中，係於2片墊片的各自之中央處，設置有與第1貫通孔241p、第2貫通孔242p為相同的剖面形狀之圓形的貫通孔。此等貫通孔包含於分割用管路。於圖的例子中，此等貫通孔的內徑係約1.6mm，並對位於一直線上。藉此，液體培養基的流動係在此等貫通孔的剖面形狀處通過網狀構造。若在通過網狀構造時流動產生變化，則經分割的細胞團還會承受由流動所造成之剪切力，而可能會變得更小。因此，第1貫通孔241p、第2貫通孔242p、2片墊片之各貫通孔的內徑係以相同為較佳，惟若是在不會產生造成不良影響的亂流之範圍內，則此等貫通孔的內徑亦可互為不同。
於第6圖的例子中，第1貫通孔241p、第2貫通孔242p之管路的內徑為一定，而該管路的內徑(D1)與用以決定通過網狀構造之流動的有效徑之墊片之貫通孔的內徑(d1)之比(D1/d1)，係較佳為約0.33至3左 右，更佳為0.5至2，又更佳係接近於1。於較佳態樣中，D1/d1=1。對於各貫通孔的內徑、墊片的外徑、配置面241s的直徑等，亦可考量到使與流路的中心軸線一致等而賦予適當的容許尺寸。
於第6圖的例子中，於支撐器本體部241的主體外周設置有外螺紋241t，於蓋體部242的蓋體內側面設置有內螺紋242t，藉由此等螺紋而將支撐器本體部241旋入固定於蓋體部242的內部，並以不會洩漏之方式夾起並壓抵網狀構造22。於支撐器本體部241及蓋體部242的各自之主體外周，亦可設置用以使轉動此等之力(或保持此等之力)作用之滾花或六角螺栓的頭部等。
支撐器本體部與蓋體部之裝卸構造並不僅限於前述的旋入構造，亦可為單觸聯結(one-touch coupling)的構造，或是使用螺栓與內螺紋將蓋體部鎖固於支撐器本體部之構造等。
支撐器的材料並無特別限定，可列舉出：聚苯乙烯和聚丙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、丙烯酸、矽、聚二氟亞乙烯等有機高分子材料；和不鏽鋼等金屬材料。從可便宜地成形且相對於高壓釜或γ射線之耐性的觀點來看，較佳材料可例示：出聚丙烯和聚碳酸酯、丙烯酸。
支撐器本體部241及蓋體部242之各自的管路241p、242p(剖面形狀為圓形)的內徑並無特別限定，可因應該細胞培養系統的規模和流量來適當地決定，0.5mm至15mm左右係具泛用性且為有用。於第6圖的例子中，管路的內徑為1.6mm。
此外，為了連接此等管路與外部的配管，連接用的管部241c、242c係分別從支撐器本體部及蓋體部突出。此等管部的管體外面係例如可成為撓 性管接頭(hose nipple，亦稱為「筍節式接頭」)的形狀，而且，亦可製成能夠壓入製軟質管體等內(或是壓入軟質管體等)而連接者。此外，亦可為與周知之單觸接頭(快速聯結)的母側和公側等與周知的連接器具有連接性之構造體、樹脂管用的插入式接頭或鎖入式接頭等。
支撐器的外形並無特別限定。於第6圖的例子中，支撐器之整體的外形(排除管部)為圓柱狀，直徑為20mm。此外，全長為20至25mm左右。此等數值僅為一例，可因應管路的內徑和連接器的構造等來適當地決定。
若使用如上述支撐器，則無殘存於(被捕集於)網狀構造之細胞的損耗，在細胞團連同液體通過網狀構造時不易產生亂流，細胞團能夠藉由順著層流之移動而更無阻力地被切斷，減少對細胞團所帶來的損害，而能夠改善分割後之細胞團的生存率。
網狀構造可視需要串聯地配置2個以上而使用。例如，可將2個以上的網狀構造重疊配置在1個支撐器內，亦可串聯連接2個以上的支撐器而使用。使用2個以上時，網狀構造可互為不同或相同。
(細胞團)
構成藉由該細胞培養系統所培養之細胞團(亦即，藉由本發明之製造方法所製造之細胞團)之細胞的種類，若為藉由懸浮培養來形成細胞團(亦稱為「球狀體(spheroid)」)之細胞者即無特別限定，可為任意的細胞。構成該細胞團之細胞能夠為來自動物或植物之細胞，特佳為來自動物之細胞。就該細胞來源之動物物種而言，係以來自大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉鼠、日本田鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨、犬、貓、山羊、牛、馬、綿羊、豬、 象、狨、松鼠猴、恆河獼猴、黑猩猩及人類等哺乳動物之細胞為更佳。此外，構成細胞團之細胞亦可為作為培養細胞而經確立細胞株者和從生物組織所得到之初代細胞。再者，構成細胞團之細胞可為多潛能幹細胞，於此之中係包括：胚胎幹細胞(ES細胞)、誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)、間葉系幹細胞、神經幹細胞等。此外，構成細胞團之細胞可為分化細胞，例如可為：肝細胞、胰島細胞、腎細胞、神經細胞、角膜內皮細胞、軟骨細胞、心肌細胞等。再者，構成細胞團之細胞可為由臍帶血、骨髓、脂肪、血液之組織性幹細胞所分化誘導之細胞，或是經癌化之細胞、藉由基因工程技術而經轉化之細胞和經病毒載體感染之細胞。於本發明之一態樣中，構成細胞團之細胞較佳為來自人類之多潛能幹細胞，特佳為人類iPS細胞。又，於本說明書中所謂之「懸浮培養」，意指在將細胞或細胞團(亦即具有集合了複數個細胞所形成之三維構造(球狀或葡萄串狀等)之細胞的塊體)在不附著於培養器之條件下進行培養。
於一態樣中，就本發明之細胞培養系統的第1容器中之細胞或細胞團於懸浮培養時的細胞接種密度而言，只要能夠得到所期望的效果即無特別限定，惟通常能夠為1×103至1×107cells/mL，較佳為1×104至1×106cells/mL，更佳為5×104至1×106cells/mL，又更佳為1×105至1×106cells/mL，又再更佳為1×105至8×105cells/mL，特佳為1.0×105至3.0×105cells/mL。
(應予分割之細胞團的大小)
應予分割之細胞團的外徑並無特別限定，若細胞為多潛能幹細胞、胚胎幹細胞等，則較佳為50μm至300μm，更佳為100μm至200μm，又更佳為120μm至180μm。
細胞團的外徑係測定藉由顯微鏡(包括電子顯微鏡、光學顯微鏡)所得到之細胞團影像的面積，並採用具有與該面積為相同的面積之圓的直徑(等效圓直徑)。
前述外徑的細胞團係藉由分割器來分割而成為40μm至120μm左右，更佳為50μm至90μm左右的外徑。
經分割之細胞團的外徑(等效圓直徑)並不一定與分割器的網狀構造之貫通孔的開口形狀之等效圓直徑一致，而有較開口形狀的等效圓直徑更大或更小之情形。例如，藉由通過貫通孔被切分成形為長柱狀之細胞團，因為觀察角度的不同，而會有具有較開口形狀的等效圓直徑更大之等效圓直徑之情形。此外，就細胞團未完全填充貫通孔內，並在與貫通孔的內壁(樑部的壁面)之間產生間隙同時通過之較小的細胞團而言，因為觀察角度的不同，而會有具有較開口形狀的等效圓直徑更小之等效圓直徑之情形。
(液體培養基)
能夠使用在前述細胞培養之液體培養基並無特別限定，可為適合於所培養的細胞之培養基，並且包括該細胞在懸浮之狀態下被培養的結果為能夠形成細胞團之培養基。如此之培養基較佳係於該液體培養基中包含用於使細胞或細胞團懸浮於該液體培養基中之細微的構造體，而該細微的構造體係分散而懸浮於該液體培養基中者，例如可列舉出：可進行球體培養(sphere culture)之培養基或是含有特定的多醣類之培養基。從細胞培養的 效率性等之點來看，更佳為含有特定的多醣類之培養基(詳細內容參照WO2014/017513)。該培養基所含有之多醣類例如可列舉出：脫醯化結蘭膠、迪坦膠(音譯，diutan gum)、角叉菜膠(carrageenan)及三仙膠(xanthan gum)或此等之鹽等，較佳為脫醯化結蘭膠。藉由將該多醣類添加於周知的培養基，可容易地調製出能夠利用在前述細胞培養之液體培養基，又，可使用之周知的培養基，係例如在細胞為來自動物的細胞之情形下，可列舉例如：Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)、Ham氏F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、McCoy氏5A培養基(McCoy’s 5A medium)、Eagle氏MEM培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培養基(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、Iscove氏改良的Dulbecco培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、William培養基E、IPL41培養基、費雪氏培養基(Fischer's Medium)、StemPro34培養基(Invitrogen公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(StemCell Technologies公司製)、StemSpan SFEM(StemCell Technologies公司製)、Stemlinell(Sigma Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製)、Essential8(註冊商標)培養基(Gibco公司製)、Essential8(註冊商標)Flex培養基(Thermo Fisher公司製)、StemFlex培養基(Thermo Fisher公司製)、mTeSR(註冊商標)1或2或Plus培養基(StemCell Technologies 公司製)、ReproFF或ReproFF2(Reprocell公司製)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Bioscience公司製)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製)、MesenPro RS培養基(Gibco公司製)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份有限公司製)、Sf-900II(Invitrogen公司製)、Opti-Pro(Invitrogen公司製)、StemFit(註冊商標)AK02N或Basic02或AK03N或Basic03或Basic04培養基(Ajinomoto Healthy Supply股份有限公司製)、STEMUP培養基(日產化學股份有限公司製)等。因為FCeM培養基(日產化學股份有限公司製)含有可將細胞凝結塊均勻地分散之多醣類，故可較佳地使用。
當於液體培養基中分散並懸浮有用於使細胞團懸浮之構造體(上述脫醯化結蘭膠等)之情形下，若如此之構造體連同細胞團通過分割器，則該構造體的一部分會崩壞，而使得將細胞團維持在懸浮狀態之性能降低。
(送液裝置與配管)
該細胞培養系統係能夠與用於傳送分散有細胞團之液體培養基之送液裝置F1一同使用。送液裝置F1可以是該細胞培養系統之構成要素，也可以是雖不屬於該細胞培養系統，但為在使該細胞培養系統運作時所使用之外部的裝置。送液裝置F1的位置並無特別限定，例如在第1圖的構成中，可以在管路P1上，亦可在管路P2上。
可利用在該細胞培養系統之送液裝置並無特別限定，較佳者可列舉出以管式泵(亦稱為滾子泵(roller pump))為代表之蠕動泵和注射泵， 尤其從容易構成封閉系統的配管之點來看，較佳為蠕動泵。此外，各容器本身亦可具有如注射器般之可送出內部的液體之構造。
蠕動泵係使壓擠具有彈性及柔軟性之泵浦管(pumping tube)的位置往傳送方向移動，藉此使所設置之泵浦管內的液體移動之泵。即使使用蠕動泵，亦可不壓碎複數個細胞團而連同液體培養基而進行較佳的運送。關於蠕動泵之傳送構造的詳細內容，係可參照先前技術。在使用蠕動泵之情形下，管路所能使用之配管用的管體較佳為能夠於該蠕動泵裝設作為泵浦管，並且具有能夠作為泵浦管發揮功能及運作之形狀、柔軟性、具彈性之部分。
配管用的連接器(connector)或聯結器(coupling)並無特別限定，較佳可使用無菌連接器等能夠無菌地連接之連接器。
(用於洗淨分割器之構成)
本發明者們已得知：在為了分割細胞團而持續使用分割器之情形下，細胞團的碎片、培養基所含之細微的構造體等固形成分等會堆積於該分割器內之網狀構造中的樑部(或線材)，分割器的有效面積(液體能夠通過之開口的面積總和)伴隨著該堆積而逐漸降低，其結果係使細胞團成受高速的流動所致之剪切，並因此成為受到損害者或被分割為較小的細胞團，而有導致生存率的降低之情形。
因此，該細胞培養系統中的分割器或網狀構造較佳係定期地交換為無堆積細胞團的碎片等者。
相對於此，本發明者們發現到：在每次只使既定量的含有細胞團之液體通過網狀構造後，藉由使既定的液體(後述之含有細胞團的液體培養基、 洗淨專用的液體等)逆流，能夠去除纏附於網狀構造的樑部之細胞團的碎片等，且能抑制網狀構造之有效面積的降低。亦即，可知藉由使既定液體以與分割時為相反之方向通過網狀構造，能夠抑制網狀構造之有效面積的降低，其結果係可抑制被分割之細胞團所含有之細胞的生存率降低。以下，係將如此之用於抑制網狀構造之有效面積的降低之既定液體的逆流程序稱為「網狀構造的逆流洗淨」。
藉由定期地進行網狀構造的逆流洗淨，可減少分割器或網狀構造的交換次數，藉此可維持封閉系統，同時抑制網狀構造之切斷性的降低。
於該細胞培養系統之較佳態樣中，係能夠以可進行網狀構造的逆流洗淨之方式(亦即，在與含有應予分割的細胞團之懸浮液通過前述網狀構造之方向為相反的方向上，懸浮液或洗淨用的液體會通過前述網狀構造之方式)，進一步設置用於使該懸浮液或洗淨用的液體移動之逆向送液功能或逆向送液裝置。
前述逆向送液功能可為利用該細胞培養系統所設置之上述送液裝置的逆流功能，此外亦可為於該送液裝置中進一步添加逆流功能者。該送液裝置的逆流功能例如可為：蠕動泵的反轉、注射泵的反向動作(相對於擠出之抽吸)、柔軟容器的壓抵等。
此外，用於實施網狀構造的逆流洗淨之逆向送液裝置與其配管構成並無特別限定。例如在第7圖之回收器之構成中，係以使新的液體培養基從液體供給容器51依序流通於管路P7、管路P6、回收器40、管路P5、管路P8並到達回收容器52內之方式來操作切換閥V1、V2。藉此操作，使 新的液體培養基以相反方向通過回收器40。亦可將此逆流的構成應用在網狀構造的逆流洗淨，並可適當地追加切換閥和流體供給容器等，而適當地建構用於實施網狀構造的逆流洗淨之使液體逆流之構成。
藉由前述構成及其運作，含有細胞團之懸浮液和新的液體培養基會以相反方向通過網狀構造，並從該樑部去除纏附於該網狀構造的樑部之細胞團等。
(於網狀構造的逆流洗淨中應予逆流之既定液體)
就於網狀構造的逆流洗淨中應使其逆流之「既定液體」而言，並無特別限定，可列舉除能夠持續利用網狀構造之液體，例如可列舉出：通過網狀構造不久後之液體(亦即，含有經分割的細胞團之液體培養基(懸浮液))、與細胞團的分割時所使用之液體培養基為相同的液體培養基(不含細胞團)、從細胞團的分割時所使用之液體培養基中去除了用於使細胞團及細胞懸浮之細微的構造體後之液體；等。
(網狀構造之逆流洗淨的態樣例)
網狀構造之逆流洗淨的態樣並無特別限定，可例示下列者。
(i)於含有應予分割的細胞團之液體培養基通過網狀構造之後，使流動進行逆流，並藉此使含有經分割的細胞團之液體培養基以相反方向通過網狀構造之態樣。
(ii)於含有應予分割的細胞團之液體培養基通過網狀構造之後，切換流路，而將不含細胞團等之液體(液體培養基等)供給至網狀構造的下游側(出口側)，並且使流動進行逆流，藉此使不含細胞團等之液體培養基以相反方向通過網狀構造之態樣。
(iii)於含有應予分割的細胞團之液體培養基通過網狀構造不久後，繼而使不含細胞團等之液體培養基往同方向流動，並在該液體培養基通過網狀構造後使流動進行逆流，藉此使不含細胞團等之液體培養基以相反方向通過網狀構造之態樣。
網狀構造之逆流洗淨的頻率並無特別限定，可為每隔1次的分割，亦可為每隔2次以上的分割，係可因應通過網狀構造的單位面積之細胞團的總數，而且綜合地考量(抑制經分割的細胞團所含有之細胞之生存率的降低所帶來之益處，與網狀構造的逆流洗淨所費之功夫和系統增設所帶來之利益損失)來適當地決定。可藉由事前實驗來決定：網狀構造的單位面積要通過多少數量的細胞團，會將網狀構造的切斷性降低至何種程度。
在進行網狀構造的逆流洗淨之情形下，前述既定液體的流速和洗淨時間係可因應該液體的種類、該逆流洗淨的效果來適當地決定。流速並無特別限定，惟例如可例示出10mm/秒至500mm/秒左右，其中，較佳範圍可列舉50mm/秒至300mm/秒左右。該流速可採用液體(懸浮液)流入分割器之流速(或從分割器流出之流速)。該流速可根據使用注射器等送液泵並於既定時間內以一定速度擠出或抽吸既定量的溶液之操作來得到。此外，液體通過網狀構造的網目時之流速，係可藉由將前述送液泵的流量除以網目之開口面積的總和來算出。此外，洗淨時間(逆流的時間)亦無特別限定，惟在該液體的流速係位於前述範圍之情形下，可例示出0.1秒至5秒左右，當中可列舉出約0.3秒至2秒作為較佳範圍。
(回收器)
於該細胞培養系統之較佳態樣中，能夠進一步設置回收器，該回收器係用於回收藉由分割與培養而成長為既定大小之細胞團之回收器。第7圖為顯示於第1圖所示之構成中加入回收器的一例之圖。於第7圖的例子中，回收器40係將第1容器10內所懸浮培養之細胞團與液體培養基以不會接觸外部氣體而接收之方式，經由管路P4而連接於該第1容器10。於第1容器10與管路P4之連接部分處，較佳係設置有開閉閥。
如第7圖所示，回收器40係具有分離室41，該分離室是藉由用於分離液體培養基與細胞團之分離用網狀構造42而區隔為第1室41a與第2室41b，且是以使進入於該回收器40內之液體培養基從第1室41a通過分離用網狀構造42而往第2室41b移動，並往回收器40的外部送出之方式來構成內部流路。為了保持封閉系統，較佳係於回收器40的後段與用於接收液體培養基之廢液用容器50連接。回收後的細胞團可藉由磷酸緩衝液(PBS)和所期望的培養基來進行洗淨。
(分離用網狀構造)
分離用網狀構造42係具有網目，該網目係不會讓所欲回收之大小的細胞團通過(亦即被捕集)之預定大小的網目。藉此，在連同液體培養基進入於回收器內之細胞團當中的所欲回收之大小的細胞團不會通過該分離用網狀構造42，而係滯留於第1室41a。藉此，可回收滯留於第1室41a之細胞團。
分離用網狀構造係可與分割器的網狀構造同樣地為篩網，亦可為多孔膜，惟篩網於市面上有以低價販售之具有各種線徑之線材及具有各種開口率之材料，而且，若為由圓線(剖面形狀為圓形之線材)製成之篩 網，則有較高的可能不切斷細胞團而擋下細胞團，故為較佳。以下，係說明篩網，但亦可藉由多孔膜來達成相同的構成。
分離用網狀構造的貫通孔(網目)之開口形狀的等效圓直徑係因構成應予回收的細胞團之細胞的種類而有所不同，例如當細胞為多潛能幹細胞或胚胎幹細胞等時，則可列舉出5μm至150μm左右，更佳為10μm至100μm，又更佳為20μm至80μm。以下係例示對於細胞為多潛能幹細胞或胚胎幹細胞等情形時之各部分的較佳尺寸等，惟對於此等以外的其它細胞，亦可分別適當地變更為所分別因應之尺寸。
線材的直徑可列舉出10μm至100μm左右，更佳為30μm至80μm。
若是僅規定前述等效圓直徑，則亦包括如狹縫般之細長的開口形狀或如迷宮般錯綜複雜的開口形狀，導致連較小的細胞團也會被捕集。因此，於本發明中除了限定前述等效圓直徑之外，還加上該開口形狀為可容納直徑5μm至150μm的圓(以下稱為容納圓)之形狀者來作為限制條件。在此，所謂開口形狀為可將容納圓予以容納，係包括容納圓內接於開口形狀之情形還有容納圓與開口形狀為一致之情形。
容納圓的直徑更佳為5μm至150μm，又更佳為10μm至100μm。在開口形狀為圓形之情形下，容納圓的直徑=等效圓直徑，除此之外，容納圓的直徑<等效圓直徑。
(網目的開口形狀)
分離用網狀構造之網目的開口形狀並無特別限定，可為三角形、四角形、六角形、其它多角形和不規則形等，就一般之低價且高品質之篩網的形狀而言，可列舉出正方形。在此情形下，縱橫的線材係如第4圖(a)所示 之分割器的網狀構造的例子般，呈正交方格狀。於該正方形之開口的4邊當中，互為相對之平行的兩個邊之間的距離係可為前述容納圓的直徑，較佳為5μm至150μm，更佳為10μm至100μm。
回收器的分離用網狀構造雖與分割器的網狀構造為同樣的構造，但能夠藉由粗化線材(樑構件)來抑制細胞團的切斷。此外，線材(樑構件)的粗度係可與分割器的網狀構造相同，亦可為將通過分離用網狀構造之液體培養基的流速設為較通過分割器的網狀構造之液體培養基的流速更慢，藉此能夠抑制細胞團的切斷。
藉由將分離用網狀構造所配置之分離室的容積進一步增大，將流動的剖面積設為較其它管路的剖面積更大，並將分離用網狀構造之網目的開口面積的總和設為較其它管路的剖面積更大，可使通過分離用網狀構造之液體培養基的流速變慢，細胞團不會被分離用網狀構造所分割。藉此，細胞團被分離用網狀構造捕集，而滯留在第1室41a。分離用網狀構造之網目的開口面積的總和較佳為其它管路的剖面積之0.01倍至1000倍左右，更佳為0.1倍至500倍左右。例如在其它管路(配管軟質管體)的剖面積為1mm2至50mm2左右之情形下，分離用網狀構造之網目的開口面積的總和較佳為0.01mm2至50000mm2左右。
第8圖為顯示回收器之較佳構造的一例之圖。於第8圖的例子中，分離用網狀構造42之整體的形狀為袋狀(以網形成之袋體的形態)，袋狀分離用網狀構造42的內部側為第1室41a。於回收器的分離室41係設有流入埠43與排出埠44，分離用網狀構造42係覆蓋流入埠43的內部開口。亦即，流入埠43係開口於分離用網狀構造42的內部之第1室41a。 另一方面，排出埠44係開口於分離用網狀構造42的外部之第2室41b。雖然亦可與第8圖的例子相反地以液體培養基從分離用網狀構造42的外部往內部流動之方式來使用，但在該分離用網狀構造為容易變形且柔軟者之情形下，該分離用網狀構造會受到從外部往內部之流動的壓力而癟掉，而有會阻礙液體培養基的流動之情形。因此，在使用袋狀之容易變形的分離用網狀構造之情形下，較佳係如第8圖所示般，液體培養基從袋狀分離用網狀構造的內部往外部流動之態樣。即使是袋狀分離用網狀構造，若為不易因流動的壓力而變形者、經賦予補強構件者，則流動的方向並無限定。此外，就液體培養基在袋狀分離用網狀構造流動之方向(從內部往外部或從外部往內部)而言，較佳係考量細胞團的數目和流速、培養基的黏度等而決定最合適者。
第9圖為顯示回收器之較佳構造的其它例之圖。於第9圖的例子中，回收器的分離室41係整體呈圓板狀(圓柱狀)，分離用網狀構造42的整體形狀為平坦的薄片狀。與第8圖的例子相同，於回收器的分離室41係設置有流入埠43與排出埠44。分離用網狀構造42係藉由斜向地橫切於回收器的分離室41內，而將該分離室41區隔為第1室41a與第2室41b。若為此種構成，則液體培養基的流動並非以直角相對於分離用網狀構造42，而是斜向地相對，所以可期待能夠防止阻塞之效果。
第10圖為顯示回收器之較佳構造的其它例之圖。於第10圖所示的例子中，分離用網狀構造42的整體形狀為平坦的薄片狀。回收器之分離室41的形狀並無特別限定。與第8圖的例子相同，於回收器的分離室41中，係設置有流入埠43與排出埠44，該流入埠43係用於使含有細胞 團之液體培養基(以下亦稱為懸浮液)Q1進入，該排出埠44係用於使去除細胞團後之液體培養基Q2流出。分離用網狀構造42係斜向地橫切於回收器的分離室41內，藉此將該分離室41區隔為第1室41a與第2室41b。在此之重要特徵在於：分離用網狀構造42係以液體培養基通過分離用網狀構造42的網目時之該液體培養基的行進方向f具有垂直朝上的方向分量fv之方式，而配置於分離室41中。於第10圖的例子中，液體培養基的行進方向f亦具有水平方向分量fh。於第10圖的例子中，分離用網狀構造42為平坦的薄片狀篩網。該分離用網狀構造係以使第2室41b側的面成為傾斜面之方式而斜向地傾斜配置，藉此，該分離用網狀構造之第1室41a側的面成為懸突(overhang)面。分離用網狀構造之第1室41a側的面亦可非整面地成為懸突面，也可以藉由使該分離用網狀構造彎曲或折曲而局部性地含有非懸突面之面。此外，流入埠43亦並非必須要設在分離室的最下部，而排出埠44亦並非必須要設在分離室的最上部。於第10圖的構成中，於流入埠43設置在第1室41a的上部且排出埠44設置在第2室41b的下部之情形下，即使流入埠43設置在較排出埠44更高之位置，液體培養基通過分離用網狀構造42的網目時之該液體培養基的行進方向f亦具有垂直朝上的方向分量fv。
藉由以上的構成，被捕集於分離用網狀構造42之第1室41a側的面之細胞團E1係從該分離用網狀構造中剝落而沉降。藉此，可抑制該分離用網狀構造的網目被細胞團E1所阻塞，液體培養基可有效率地通過分離用網狀構造。
(分離用網狀構造的配置態勢)
於第10圖的例子中，分離用網狀構造係網狀的部分為薄片狀(亦即，薄平板狀)之篩網，該分離用網狀構造之第1室41a側的面(下側面)為懸突面，且相對於水平面僅以仰角θ傾斜。若為此種構成，則雖會由於分離室的形狀而有所不同，但因為分離用網狀構造係斜向地橫切分離室，所以該分離用網狀構造的面積(網目所存在之面的面積)多會變得更寬廣，即使流量多亦可降低線性流速，故為較佳。
另一方面，於第11圖的例子中，雖然分離用網狀構造以與第10圖的例子同樣地網狀部分為薄片狀之篩網，但是該分離用網狀構造之第1室41a側的面(下側面)為水平面(仰角θ為0度)，為朝向正下方之方向(換言之，液體培養基通過分離用網狀構造42的網目時之該液體培養基的行進方向f僅具有垂直朝上的方向分量fv)。就於此種態樣而言，由於作用於被網目所捕集之細胞團之重力均係作為往分離用網狀構造的下側面垂直地剝離之力而作用於該細胞團，所以能夠最有效地消除阻塞，故為較佳。
分離用網狀構造的下側面與水平面之間的角度(第10圖的仰角θ)若為0度以上且未達90度即可，惟在如第10圖的態樣般為斜向地配置分離用網狀構造並使液體培養基從下方流入於第1室之情形下，就期待藉由藉由該液體培養基的流動而變得容易剝離附著於分離用網狀構造之細胞團之作用，並抑制由細胞團造成的阻塞之觀點來看，仰角θ的較佳範圍係45度≦θ<90度。如上述般，由於使分離用網狀構造的下側面成為水平面之態樣(仰角θ=0度)、與使分離用網狀構造的下側面成為斜向的懸突面之態樣係各自有其優點，所以可因應用途、分離室的內部形狀來選擇較佳態樣。
(分離用網狀構造的形狀)
於第12圖(a)所例示之態樣中，係以袋的開口朝向下方之方式來配置分離用網狀構造42，該袋的內部為第1室41a的一部分或全部，該袋的外部為第2室41b。於第12圖(a)的例子中，該袋的內部為第1室41a的全部，惟在該袋的位置係於分離室內往上方移動時，該袋的內部成為第1室41a的一部分。該袋的壁部之互相相對的內面並非互為平行，而是該內面彼此間的距離隨著從前述開口朝袋內深入而變窄。藉此，使該袋的內面成為全部斜向的懸突面或朝向正下方之面。
於第12圖(b)所例示之態樣中，係以袋的開口朝向上方之方式來配置分離用網狀構造42，該袋的外部為第1室41a，該袋的內部為第2室41b的一部分或全部。於第12圖(b)的例子中，該袋的內部為第2室41b的全部，惟在該袋的位置係於分離室內往下方移動時，該袋的內部成為第2室41b的一部分。該袋的壁部之互相相對的內面並非相互平行，而是該內面彼此間的距離隨著從前述開口朝袋內深入而變窄。藉此，使該袋的外面成為全部斜向的懸突面或朝向正下方之面。
(用於將分離用網狀構造配置在分離室內之構成)
用於將分離用網狀構造配置在分離室內之構成並無特別限定，例如可列舉出：準備第1室與第2室作為各別不同的零件，並藉由此等來夾起分離用網狀構造而固定之構成；或是將具有接著榫卯之分離用網狀構造插入於1個分離室內，並利用接著榫卯將分離用網狀構造接著固定在該分離室的內壁，而將該分離室分為第1室與第2室之構成等。接著可為使用接著劑之接著，亦可為零件本身彼此的熔著等。
(第1室具有複數個進出埠之態樣)
於該回收器中，可因應目的而分別於第1室、第2室設置複數個埠。
於第13圖所示之態樣例中，於第1室設置有3個埠(第1流入埠431、第2流入埠432及流出埠433)，於第2室僅設置有流出埠44。於第13圖所示之態樣例中，分離室的外形為圓板狀(圓柱狀)，各埠431、432、433、44係位於在分離室的外周側面之間隔角度90度之位置。
於第14圖所示之態樣例中，亦同樣於第1室設置有3個埠(第1流入埠431、第2流入埠432及流出埠433)，而於第2室僅設置有流出埠44。於第14圖所示之態樣例中，分離室的外形為長方體狀(薄板狀)，各埠431、432、433、44係於分離室之外周側面的4面中之互為相對的2面上分別設置2個。
於第14圖(b)所示之態樣中，分離室為具有8個頂點(C11、C12、C13、C14、C31、C32、C33、C34)之長方體狀(使薄四角形的板水平地橫置之形狀)。該分離室係藉由水平地配置之方形的薄片狀分離用網狀構造42而區隔為下側的第1室41a與上側的第2室41b。該分離用網狀構造42的4個頂點為C21、C22、C23、C24。第1室中的第1流入埠431及第2流入埠432係位於側面(C22、C23、C33、C32)內，第1室中的流出埠433係位於側面(C21、C24、C34、C31)內，此外，第2室的流出埠44係位於側面(C11、C14、C24、C21)內。
於第14圖(c)所示之態樣中，分離室為具有8個頂點(C41、C42、C43、C44、C51、C52、C53、C54)之長方體狀(使薄四角形的板垂直地豎立之形狀)。該分離室係藉由斜向地配置之方形的薄片狀分離用網狀構造42而區 隔為下側的第1室41a與該斜向上側的第2室41b。方形之薄片狀分離用網狀構造42的4個頂點為C41、C52、C53、C44。第1室中的第1流入埠431及第2流入埠432係位於側面(C41、C51、C52)內，第1室中的流出埠433係位於側面(C44、C54、C53)內，此外，第2室的流出埠44係位於側面(C44、C53、C43)內。
於第13圖、第14圖的任一態樣中，第1流入埠431為用於使懸浮液從外部流入於第1室之埠。此外，第2流入埠432為用於讓稀釋試劑及/或懸浮液用之液體從外部流入於第1室之埠。此外，設置在第1室之流出埠433為用以使一部分的細胞團從第1室往外部流出之埠。此等試劑和液體若為可使液體培養基的懸浮力降低而容易進行細胞團的分離及/或回收者，即無特別限定。就該試劑而言，例如在液體培養基中含有由所謂脫醯化結蘭膠之特定的多醣體所構成之構造體之情形下，可列舉出從該構造體中奪取2價離子並藉此發揮使該構造體分解的作用之螯合劑(例如EDTA等)，但並不限定於此。此外，用於稀釋該懸浮液之液體例如可列舉出：不含用於使細胞團等懸浮之細微的構造體(例如脫醯化結蘭膠等)之液體培養基及緩衝液等，但並不限定於此等。
藉由此等埠，可於回收器中進行使液體培養基的懸浮力降低並使細胞團沉降之處理。
(第1室之流入埠的位置)
於第15圖所示之態樣例中，第2室41b位於第1室41a的上方，且薄片狀分離用網狀構造42係水平地配置。因此，通過分離用網狀構造42的網目時之液體的行進方向f為垂直朝上的方向。
於第15圖所示之態樣例中，第1室至少具有用於使懸浮液Q1從外部流入之流入埠43，該流入埠43係設置在第1室41a的側壁。藉此，分離室的底面呈平坦，而可穩定地將回收器配置在基礎面上。
此外，較佳態樣下，流入埠43之中心軸線的高度h1係位於第1室41a的室內總高度H1之40%以上的高度處，較佳為位於60%以上的高度處。藉此，於第1室內，於流入埠之中心軸線的高度h1的較下方係存在有空間。藉由此空間的存在、與從設置在側面之流入埠43所流入之懸浮液Q1的流動，於第1室41a內細胞團可較佳地循環，且該細胞團可從分離用網狀構造中剝落，同時留置於前述空間。留置於該空間之細胞團不會成為新流入之懸浮液的阻礙。此外，由於流入埠未設置在第1室的底面，所以新流入之懸浮液亦不會使留置於該空間的底部之分離對象物往上方揚起。因此，液體培養基可較佳地通過分離用網狀構造。流入埠43之中心軸線之高度h1的上限為該流入埠43的開口上端接觸於分離用網狀構造的下側面之位置。亦即，在將開口的口徑設為d時，流入埠43之中心軸線之高度h1的上限係位於從分離用網狀構造的下側面算起為僅低d/2之位置。
設置在第2室之流出埠的位置並無特別限定，而可如第15圖所示之態樣例般設置在第2室的側面。於第15圖所示之態樣例中，設置在第1室之流入埠與設置在第2室之流出埠係設置於分離室的側面當中互為相反側的面上，但亦可設置在互為相同側的面上。流入埠與流出埠之位置較佳係考量配管作業或管體所佔之配管空間來適當地決定。
(回收器的連接例)
如上述般，細胞團係滯留於回收器的第1室內並從液體培養基中被分離，僅液體培養基會通過回收器。第7圖為顯示維持封閉系統同時使滯留於第1室內之細胞團移往回收容器52之較佳的配管連接例。於該圖的例子中，從第1容器10使細胞團通過回收器時，係以液體培養基依序流通於管路P4、管路P5、管路P6、管路P7並到達廢液用容器50內之方式來操作切換閥V1、V2。藉由此操作，細胞團會滯留於回收器40的第1室41a。接著，為了將滯留於第1室41a之細胞團取出至外部，係以使新的液體培養基從液體供給容器51依序流通於管路P7、管路P6、回收器40、管路P5、管路P8並到達回收容器52內之方式來操作切換閥V1、V2。藉此操作，新的液體培養基以相反方向通過回收器40(從第2室41b往第1室41a)，藉此使滯留於第1室41a之細胞團往回收容器52內移動，且較佳態樣係不暴露於外部氣體而回收。液體供給容器51可為注射器。送液裝置係可適當地設置。如以上所例示之配管例般，藉由液體培養基來使滯留於第1室41a之細胞團移動並回收細胞團之配管可為各種構成。
於該細胞培養系統的管路中，可為了調查細胞團的狀態而適當地設置用於採集細胞團和液體培養基之埠。此外，用於監視液體培養基的狀態之感測器(例如用於測定乳酸濃度、葡萄糖濃度、pH、氧濃度、二氧化碳濃度等之感測器)可設置為暴露於管路中的液體培養基中，也可以設置光學、電性測定裝置。
(細胞團的製造方法)
本發明之細胞團的製造方法係使用上述本發明之細胞培養系統來進行。因此，於該製造方法係如第1圖所示般，較佳態樣係在不與外部氣體 接觸而進行下述步驟：使應予分割的細胞團與液體培養基從供給源通過該細胞培養系統的分割器20，以分割該細胞團之步驟；將藉由前述分割器20所分割之細胞團連同液體培養基，以較佳態樣係不與外部氣體接觸肢是送往第1容器10內，並於該第1容器內進行懸浮培養之步驟。從供給源S1所供給之細胞團較佳為已成長至應予分割的大小之細胞團。
(細胞團的培養條件)
就使用本發明之細胞培養系統將細胞團進行三維地培養所用之條件而言，若可使細胞團成長者即無特別限定，可適當地使用適合於所培養的細胞之本屬周知的培養條件。例如，在以使用hiPS細胞之情形為例示時，可設成溫度條件為30℃至39℃(例如37℃)、CO2濃度為1%至10%(例如5%)。此外，從第1之細胞團的分割算起至第2之細胞團的分割為止之培養時間，係可設為1日至7日(例如：2日、3日、4日、5日、6日)。於一態樣中，在經過第1次分割所得到之更小的細胞團之培養開始後，可藉由追加培養基而更有效率地培養細胞團。培養基的追加時機是於細胞團的培養開始之第1日至第3日，較佳為第1日至第2日，特佳為第1日，藉由相對於培養細胞團之培養液的容量為追加1倍量至5倍量，較佳為追加2倍量至4倍量，特佳為追加2倍量至3倍量的培養基，能夠有效率地培養細胞團。此外，於其它態樣中，從第1之細胞團的分割開始至第2之細胞團的分割為止之培養時間中，亦可追加2次以上的培養基。追加2次培養基之態樣的一例係可為：在培養開始第1日之時間點，添加相對於培養細胞團之培養液的容量為1倍量至5倍量(例如2倍量至3倍量)來作為第1次的追加培養基；並在培養開始第4日之時間點，添加相對於培養細胞團 之培養液的容量為0.1倍量至2倍量(例如0.4倍量至0.7倍量)來作為第2次的追加培養基。再者，亦可藉由測定用於培養細胞團之培養基中的乳酸濃度並使乳酸濃度位於特定範圍，而有效率地培養細胞團。該乳酸濃度通常可設為0mM至20mM，較佳為0mM至18mM，特佳為0mM至16mM。又，培養基中的乳酸濃度係如上述般，若為使用本發明之細胞培養系統所具備之感測器等來測定即可。
(用於分割之流速)
在細胞團連同液體培養基而通過分割器的網狀構造時，較佳的用於分割之流速雖會因為細胞的種類、細胞團的大小、液體培養基的黏性等而有所不同，但大致上為10mm/秒至500mm/秒，較佳為50mm/秒至150mm/秒。
前述流速可採用液體(懸浮液)流入分割器之流速(或從分割器流出之流速)。該流速可根據使用注射器等送液泵並於既定時間內以一定速度擠出或抽吸既定量的溶液之操作來得到。此外，液體通過網狀構造的網目時之流速，係可藉由將前述送液泵的流量除以網目之開口面積的總和來算出。
(用於洗淨分割器之逆流洗淨步驟)
於該製造方法之較佳態樣中，能夠進一步加上用於實施上述網狀構造的逆流洗淨之逆流洗淨步驟。該逆流洗淨步驟為：在分割細胞團之步驟中分割了既定量的細胞團之後，在與用於分割該細胞團而通過分割器的網狀構造之方向為相反的方向上，使上述既定液體(含有細胞團之懸浮液或洗淨用的液體等)通過該網狀構造，藉此洗淨該網狀構造之步驟。
實施逆流洗淨步驟之頻率、用於使該懸浮液的逆流或使該洗淨用的液體流通之構成、逆流洗淨步驟所使用之洗淨用的既定液體、洗淨時的流速、洗淨時間，係如本發明之細胞培養系統的說明所述。
(細胞團的回收)
該製造方法如第7圖所示，係藉由回收器40來回收在該細胞培養系統中被分割且經懸浮培養並增殖之細胞團。於回收器中，係藉由分離用網狀構造來分離細胞團與液體培養基。
第16圖為顯示使用了本發明之細胞培養系統之細胞培養與分割與回收之程序的一較佳例之流程圖。各步驟間之液體培養基(包含細胞團)的移動皆係藉由封閉系統的配管而不接觸外部氣體地進行。如第1圖所示，例如在供給源S1中，係使藉由附著培養而成長之群落從培養支架剝離後之細胞團(或是藉由懸浮培養而形成之細胞團)通過分割器20而進行分割。接著，使用經分割的細胞團，在第1容器10內於新的液體培養基進行接種，並於該處進行懸浮培養，以使細胞團成長。然後，回收成長後的細胞團並交換培養基，送回原先的分割步驟或送往下一段細胞培養系統的分割步驟，使通過此等分割器來進行分割。此時，亦可不將所有的細胞團送往分割步驟，而是取出既定比率的細胞團作為收穫部分。
(用於回收之流速)
為了於前述回收器將細胞團與液體培養基進行分離，通過該回收器之該液體培養基的流速雖會因為細胞的種類、網狀構造的規格、該液體培養基的量、該液體培養基的黏性等而有所不同，但較佳為0.01至25mm/秒，更佳為0.1至15mm/秒，特佳為1至10mm/秒。在以相同細胞種類來進行 比較之情形下，較佳為相較於通過分割器之網狀構造的各個網目之液體培養基的速度，係以使通過回收器之分離用網狀構造的各個網目之液體培養基的速度為較慢之方式來設定流路的剖面積或送液裝置的傳送量。藉此，即使是相同的網狀構造，亦可使用在分割與回收。
前述流速可採用液體(懸浮液)流入回收器之流速(或從回收器流出之流速)。該流速可根據使用注射器等送液泵而於既定時間內以一定速度擠出或抽吸既定量的溶液之操作來得到。此外，液體通過回收器之分離用網狀構造的網目時之流速，可藉由將前述送液泵所致之流量除以網目之開口面積的總和來算出。
實施例
[試驗例1]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)之細胞團的分割
懸浮培養hiPS細胞來形成細胞團，使用多孔膜及以往的篩網來分割該細胞團，並觀察各別分割後之細胞團的生存率，藉此進行確認由多孔膜所致之分割性能之試驗。
(分割前之hiPS細胞的三維培養)
培養基1：
依循專利文獻2所記載之混合方法，使用FCeM系列製備套組(FCeM-series Preparation Kit)(日產化學股份有限公司製)將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三榮源FFI公司製)注入於含有10μM Y-27632(Fujifilm Wako Pure Chemical公司製)之mTeSR-1培養基(StemCell Technologies公司製)而調製成之液狀的培養基組成物。
培養基2：
依循專利文獻2所記載之混合方法，使用FCeM-series Preparation Kit將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠注入於mTeSR-1培養基而調製之液狀的培養基組成物。
使用15mL試管、培養基1及培養基2，將hiPS細胞株253G1(由理化學研究所分讓)於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行培養(分割前培養)。
於分割前培養的第0日將hiPS細胞株253G1接種於培養基1，每隔1至2日添加培養基2，並持續此操作5至6日而形成細胞團。於最終日進行離心(100×G、3分鐘)以使細胞團沉降，去除上清液後，懸浮於培養基1中，然後使培養基與細胞團通過多孔膜，並將經分割的細胞團接種於培養基1(分割後培養的第0日)。
(多孔膜的規格)
以下的事例中所使用之器具皆係使用經殺菌者。
製作第1圖所示之型式的多孔膜，作為多孔膜的實施例品。
膜本體的材料為鎳。
如下述第1表所示，膜本體的厚度為20μm或40μm。
各貫通孔的開口形狀係互為全等的正六角形，於膜本體之膜面的整體配置有該貫通孔。如下述第1表所示，各貫通孔的孔徑(於開口形狀之正六角形的6邊當中，互為相對之平行的兩個邊之間的距離)為60μm或70μm。
線徑(樑部的寬度)為20μm或40μm。
膜本體的外周形狀為圓形，圓的尺寸(直徑)為13mm。
(保持多孔膜之支撐器)
如第6圖所示般，製作用於設置多孔膜之支撐器。用於流通分散有細胞團之液狀的培養基組成物之管路(剖面呈圓形)的內徑為1.6mm，通過多孔膜之液狀的培養基組成物之流動的有效徑亦為1.6mm。
(使用篩網之分割)
分割器之網狀構造的其它探討例係使用以往的篩網。
準備具有與上述多孔膜相同的外形之尼龍篩網(由尼龍製的線材所構成之篩網)與不鏽鋼篩網(由不鏽鋼製的線材所構成之篩網)，並取代上述多孔膜而裝設於上述支撐器，進行細胞團的分割。
尼龍篩網之貫通孔的開口形狀大致呈正方形，1邊的長度為70μm。線材的直徑係經線及緯線皆為50μm。
不鏽鋼篩網之貫通孔的開口形狀大致呈正方形，1邊的長度為70μm。線材的直徑係經線及緯線皆為40μm。
(hiPS細胞之細胞團的分割)
在經過5至6日的分割前懸浮培養後，進行離心(100×G、3分鐘)以使細胞團沉降，去除上清液後，於培養基1中係以成為2.0×105cells/mL之方式懸浮。將懸浮液4mL移往5mL注射器(Terumo公司製)，並以既定的通過速度使懸浮液通過多孔膜及篩網。
(分割後的培養)
將通過多孔膜及篩網後之懸浮液接種於15mL試管，並於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行培養(分割後培養)。又，15mL試管的蓋體係設成半開狀態。於分割後培養的第2日，每次添加2.5mL之已預先加 溫至37℃的培養基2。於分割後培養的第4日，每次添加3.5mL之已預先加溫至37℃的培養基2。
(細胞生存率)
於分割的2小時後，從培養器取出培養試管，並使細胞團充分分散後，採集培養液0.25mL，添加ATP試劑0.25mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管(pipetman)進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將100μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。
將以分割前之懸浮液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時之相對值設為細胞生存率。
(細胞增殖率)
於分割後培養的第5日，從培養器取出培養試管，並使細胞團充分分散後，採集培養液0.5mL，添加ATP試劑0.5mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將100μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。考量到培養體積比，係將與分割2小時後之培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)之相對值設為細胞增殖率。
(分割後之細胞團的大小及個數)
於分割2小時後，從培養器取出培養試管，並使細胞團充分分散後，將培養液1mL移往6孔盤，並藉由Cell3iMager(SCREEN Holdings公司製)來計測細胞團的大小、個數。又，計測所使用之培養液並不回到試管。從計測結果算出細胞團的等效圓直徑、個數、等效圓直徑為120μm以上之細胞團的比率。
以上的試驗結果係顯示於以下第1表。
[第1表]
Figure 108127919-A0202-12-0053-1
從上述第1表可知，在15cm/秒以下的處理速度區域中，相較於篩網，多孔膜係可分割為更小的細胞團，且分割後之細胞團的個數較多。
此外，可知相較於與篩網，多孔膜係可降低120μm以上之細胞團的比率，而可分割為大小更均勻的細胞團。
[試驗例2]入類多潛能幹細胞(hiPS細胞)的培養
(附著維持培養)
hiPS細胞株253G1(由理化學研究所分讓)係在塗覆有玻連蛋白VTN-N(Thermo Fisher Scientific公司製、#A14700)之6cm培養皿上接種5.0×104cells至5.0×105cells的細胞，並使用mTeSR1(註冊商標)培養基(StemCell Technologies公司製、#ST-05850)來進行培養。於接種後24小時，係在含有10μM Y-27632(Fujifilm Wako Pure Chemical公司製、#030-24021)之mTeSR1培養基進行培養，然後，每日進行培養基交換為不含10μMY-27632之mTeSR1培養基。於接種3至4日後，使用含有0.5mM EDTA之PBS溶液將細胞剝離，以維持繼代。
(懸浮維持培養)
‧培養基1：
依循專利文獻1(WO2016/163444)之方法，使用FCeM-series Preparation Kit(日產化學公司製)而將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三榮源FFI公司製)注入於含有10μM Y-27632之mTeSR1培養基中所調製之組成物
‧培養基2：
依循專利文獻1之方法，使用FCeM-series Preparation Kit而將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠添加於mTeSR1培養基中所調製之組成物
為了進行三維培養，係使用人類ES/iPS細胞用解離液(Dissociation Solution for human ES/iPS Cells)(ReproCELL公司製、#RCHETP002)將接種所使用之hiPS細胞株253G1剝離為群落狀態。以培養基1使所剝離的細胞懸浮後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)60μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度5cm/秒)來進行分割，藉此製作細胞團，並以1.0×105cells/mL至2.0×106cells/mL的細胞濃度進行接種，而在CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。於培養的第0日接種於培養基1，每隔1至2日添加培養基2，並持續此操作5至7日以進行培養。使用30μm的篩網(Miltenyi Biotec公司製、#130-110-915)來回收所形成之細胞團，懸浮於培養基1中之後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)60μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度5cm/秒)來分割細胞團，以維持繼代。
[試驗例3]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)之三維培養條件的探討
將以試驗例2的方法所製作並且經三維培養而培養1次繼代以上之第5日之hiPS細胞株253G1的細胞團進行計數，將細胞濃度調整為0.3×106cells/mL或0.6×106cells/mL或1.2×106cells/mL後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)60μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度5cm/秒)來進行分割，並接種於15mL試管(Falcon公司製、型號352095)，在蓋體未密閉之狀態下於CO2培養器(37℃、5% CO2) 內，以靜置狀態進行三維培養。於培養的第0日接種於培養基1，第1日以後以各種條件來添加培養基2，而培養4至6日。此外，將「在未培養細胞之條件下實施同樣的操作」的條件設為臨床對照組。
條件1：未添加培養基
條件2：於第1日添加相對於細胞培養液為等量之新鮮的培養基2
條件3：於第2日添加相對於細胞培養液為等量之新鮮的培養基2
條件4：於第1日及第3日添加相對於細胞培養液為等量之新鮮的培養基2
條件5：於第1日添加相對於細胞培養液為2倍量之新鮮的培養基2
條件6：於第1日添加相對於細胞培養液為3倍量之新鮮的培養基2
(細胞團之大小的變遷)
從培養器取出培養試管並使細胞團充分分散後，將培養液的一部分移往12孔盤，並以DMEM/Ham’s F-12(Fujifilm Wako Pure Chemical公司製、#048-29785)稀釋後，以Cell3iMagerduos(SCREEN Holdings公司製)來計測直徑50μm以上之細胞團的大小，並算出平均直徑。
於細胞團之大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將等效圓直徑的平均值設為平均直徑。以細胞團的平均直徑未達100μm者為△，100μm以上且未達120μm者為○，120μm以上者為◎。此外，將未實施試驗之條件記載為-。
[第2表]
Figure 108127919-A0202-12-0057-2
(培養基環境測定)
從培養器中取出培養試管，並使細胞團充分分散後，採集培養液0.1mL並使用Vi-CELL MetaFLEX(Beckman Coulter公司製)來測定培養基中的 乳酸濃度(mM)。乳酸為細胞代謝的副產物，對細胞而言有時是有毒的。因此，能夠藉由監測培養液中之乳酸的濃度而決定最合適的培養基添加量、繼代時期。此外，係將未實施試驗之條件記載為-。
[第3表]
Figure 108127919-A0202-12-0059-3
本試驗之結果係：在「於接種後未添加培養基」之條件以及「於第2日添加與培養液為等量之培養基」之條件下，細胞團於4日之間並未成長至120μm以上。另一方面，在「於培養的第1日以及於培養的第1日、第3日添加與培養液為等量之培養基」之條件下，只有細胞濃度為0.3×106cells/mL的條件之細胞團於4日之間成長至120μm以上。再者，在「於培養的第1日添加相對於培養液為3倍量的培養基」之條件下，無論於何種細胞濃度條件中，細胞團皆可於4日之間成長至120μm以上。從以上的結果可明瞭，藉由在培養的第1日添加相對於培養液為3倍量的培養基，無論於何種細胞濃度下，皆能夠有效率地培養細胞團。此外，依培養基環境測定結果，在乳酸濃度為0至15.7mM下係能夠進行培養，而以0至14.0mM則可有效率地培養。
[試驗例4]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)塊之回收條件的探討
使用藉由試驗例2的方法而以三維培養進行1次繼代以上的培養之第7日的hiPS細胞株253G1的細胞培養液。將線材徑50μm、孔徑(正方形之1邊的長度)15μm、36μm、50μm、70μm的尼龍篩網作為分離用網狀構造而安裝於過濾器支撐器(Merck公司製、#SX0001300、有效面積0.7cm2)，並以各種流速使細胞培養液流通，藉此使細胞團被捕集於篩網上。
在此，所謂之有效面積為有助於細胞團的分離之篩網的面積，亦即，實際上能夠使培養液通過且可捕集細胞團之區域的面積(開口的面積與線材所佔的面積之總和)。
(細胞團個數及平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將試驗所使用之培養液的一部分移往12孔盤，並使用Cell3iMagerduos來計測培養液中之直徑50μm以上之細胞團的個數及大小。於細胞團大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑並將其平均值設為平均直徑。其結果為：細胞團在700個/mL的濃度下之平均直徑為145.8μm。
(通過篩網之細胞的算出)
採集培養液、過濾液0.5mL，分別添加ATP試劑0.5mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將200μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定通過篩網的過濾液中之活細胞的數目。將以培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)為100%時之過濾液的相對值設為通過篩網的細胞。試驗結果如第4表所示。
[第4表]
Figure 108127919-A0202-12-0061-4
如第4表所示，在以0.1cm/秒的通過速度來實施細胞團的回收之情形下，已知相較於孔徑(正方形之1邊的長度)36μm及50μm的篩 網，以孔徑70μm的篩網係往過濾液流出8倍以上的細胞。另一方面，在使用孔徑15μm的篩網之情形下，已知相較於孔徑36μm及50μm的篩網係往過濾液流出1.7至1.9倍左右的細胞。由以上的結果，顯示出在以0.1cm/秒的通過速度來回收細胞團之情形下，係可藉由使用孔徑36μm及50μm的篩網而有效率地回收細胞。
此外，使用線材徑50μm、孔徑(正方形之1邊的長度)50μm的篩網並變更通過速度，而調查通過篩網之細胞團的比率。試驗結果如係第5表所示。
[第5表]
Figure 108127919-A0202-12-0062-5
如第5表所示，在使用孔徑50μm的篩網來實施細胞團的回收之情形下，可以通過速度0.1cm/秒而有效率地回收細胞團。
此外，使用線材徑50μm、孔徑(正方形之1邊的長度)50μm的篩網，且將通過速度設為0.1cm/秒，並改變每單位面積之細胞團((總細胞數)/(過濾器有效面積))的數目，而調查通過篩網之細胞團的比率。試驗結果係如第6表所示。
[第6表]
Figure 108127919-A0202-12-0063-6
如第6表所示，可知在使用孔徑50μm的篩網並以通過速度0.1cm/秒來實施細胞團的回收之情形下，係回收每單位面積12000個的細胞團，且往過濾液流出約4成的細胞。另一方面，顯示若每單位面積為6000個以下，則可有效率地回收細胞團。
[試驗例5]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)之細胞團的回收
藉由試驗例2的方法，使藉由三維培養進行1次繼代以上的培養之第5至6日之hiPS細胞株253G1的細胞培養液以1mL/秒的速度通過篩網孔徑、有效面積及形狀為不同之各種條件的回收篩網容器，並使細胞團被捕集於篩網。然後，使試驗例2所記載之新鮮的培養基2逆流，藉此回收細胞團。
(回收器的規格)
在條件7至9中，係使用內部配置有第8圖所示之袋形的篩網之回收器。在條件7中，係使用篩網孔徑21μm、有效面積約1.5cm2者。
所謂之回收器的有效面積，為有助於細胞團的回收之篩網的面積，亦即，為實際上可使培養液通過且可捕集細胞團之區域的面積(開口的面積與線材所佔的面積之總和)。
在條件8中，係使用篩網孔徑40μm、有效面積約1.5cm2者。在條件9中，係使用篩網孔徑30μm、有效面積約16cm2者。藉由將回收時的流動方向設為相對於捕集時的流動方向為相反的方向，使被捕集之細胞團往回收容器移動。
在條件10中，係使用內部配置有第9圖所示之圓板形的篩網之回收器。篩網的孔徑為70μm，有效面積為約12cm2。藉由將回收時的流動方向設為相對於捕集時的流動方向為相反的方向，使被捕集之細胞團往回收容器移動。
(細胞團的個數及平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將試驗所使用之培養液的一部分移往12孔盤，使用Cell3iMagerduos來計測培養液中之直徑50μm以上之細胞團的個數及大小。於細胞團的大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將其平均值設為平均直徑。
(回收率的算出)
採集培養液及回收液0.5mL，分別添加ATP試劑0.5mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並以微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將200μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)， 扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。將以培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時之回收液的相對值設為回收率。
回收率的結果如第7表所示。
[第7表]
Figure 108127919-A0202-12-0065-7
如第7表所示，已知在使用具有第8圖的形狀之回收器來實施細胞團的回收之情形下，若是如條件7及條件8所示之相同的有效面積，則篩網孔徑較小者可有效率地回收細胞團。另一方面，已知在使用具有第9圖的形狀之回收器來實施細胞團的回收之情形下，條件10即使相較於條件9為篩網孔徑較大，仍然可以有效率地回收細胞團。由以上的結果，顯 示為了有效率地回收細胞，除了篩網孔徑的大小之外，還需在回收器的形狀方面下功夫。
[試驗例6]網狀構造之逆流洗淨效果的確認
於本試驗例中，係藉由重複進行下列(i)至(iii)的操作來調查對於網狀構造之逆流洗淨的效果。
(i)使用含有既定密度的細胞團之試樣液，並在既定流速下藉由分割器的網狀構造來進行細胞團的分割。
(ii)每當通過既定量的細胞團時，測定所通過之細胞團的生存率。
(iii)於前述(ii)之每當通過既定量的細胞團時，係對網狀構造進行逆流洗淨。
試驗所使用之細胞團是由人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)所構成之細胞團。
(分割前之hiPS細胞的三維培養)
培養基1：
依循專利文獻2所記載之混合方法，使用FCeM-series Preparation Kit(日產化學股份有限公司製)將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三榮源FFI公司製)注入於含有10μM Y-27632(Fujifilm Wako Pure Chemical公司製)之mTeSR-1培養基(StemCell Technologies公司製)而調製成之液狀的培養基組成物。
培養基2：
依循專利文獻2所記載之混合方法，使用FCeM-series Preparation Kit將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠注入於mTeSR1培養基而調製之液狀的培養基組成物。
使用可變更容量的200mL培養袋(Nipro公司製)、培養基1及培養基2，將hiPS細胞株253G1(由理化學研究所分讓)於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行維持培養。
於培養的第0日接種於培養基1，每隔1至3日添加培養基2，並持續此操作6至8日而形成細胞團。
於最終日使用MACS(註冊商標)SmartStrainers(70μm、MACS公司製)來回收細胞團，並懸浮於培養基1中，然後使其通過依據本發明之裝置，並將經分割的細胞團予以接種(第0日)。
重複進行此操作，以進行細胞的維持培養。
(分割器的規格)
本試驗中所使用之各部的器具皆係使用經電子射線殺菌者。
製作第3圖所示之型式的多孔膜，以作為網狀構造的實施例品。
該多孔膜的材料為鎳，多孔膜的厚度為20μm，樑部的寬度為20μm。各貫通孔的孔徑(於開口形狀之正六角形的6邊當中，互為相對之平行的兩個邊之間的距離)為70μm。除了特別記載之事項以外，係與試驗例1中所使用之多孔膜相同。
多孔膜的外周形狀為圓形，圓的直徑為6mm。
(保持網狀構造之支撐器)
製作如第6圖所示之用於設置網狀構造之支撐器。藉由將網狀構造設置在該支撐器而成為分割器。用於流通分散有細胞團之液狀的培養基組成物之管路(剖面呈圓形)的內徑為2.6mm，通過裝置之液狀的培養基組成物之流動的有效徑亦為2.6mm。
(hiPS細胞之細胞團的分割)
在經過7日的懸浮培養後，使用MACS(註冊商標)SmartStrainers(70μm、MACS公司製)來回收細胞團，並混合懸浮於培養基1，而製作濃度不同的2種懸浮液(3.0×105cells/mL及6.0×105cells/mL)。
(i)不進行網狀構造的逆流洗淨而持續進行分割之試驗例
將前述2種懸浮液各50mL移往2個50mL注射器(Nipro公司製)，並以10cm/秒的速度使各懸浮液通過前述分割器，每使10mL的懸浮液通過分割器便分配至15mL試管，而得到5根容納有濃度3.0×105cells/mL之懸浮液的分割後試樣之試管以及5根容納有6.0×105cells/mL之懸浮液的分割後試樣之試管。
(ii)定期進行網狀構造的逆流洗淨，同時持續進行分割之試驗例
將前述2種懸浮液各50mL移往2個50mL注射器(Nipro公司製)，並以10cm/秒的速度使各懸浮液通過前述分割器，每使10mL的懸浮液通過分割器便分配至15mL試管，並且在分配至試管後操作注射器，使僅1mL之該懸浮液1mL以100mm/秒的流速逆流而進行網狀構造的逆流洗淨，然後再次使10mL的懸浮液流通以進行分割，且分配至另外的15mL試管，並重複進行此操作。藉此，與前述(i)同樣地，得到5根容納有濃度 3.0×105cells/mL之懸浮液的分割後試樣之試管、以及5根容納有6.0×105cells/mL之懸浮液的分割後試樣之試管。
將分配後的15mL試管(4種、共20根)於培養器(37℃、5% CO2)中靜置2小時。
(細胞生存率的測定)
於靜置2小時後，從培養器取出前述15mL試管，並藉由倒置混和而使細胞團充分分散後，採集培養液0.75mL，添加ATP試劑0.75mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管充分攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將100μL分注於白色96孔盤，並以Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。
將以分割前之懸浮液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時之相對值設為細胞生存率。該細胞生存率示於第17圖的圖表。
(網狀構造之逆流洗淨效果的評估)
第17圖(a)、(b)的圖表係顯示上述(i)之不進行網狀構造的逆流洗淨而持續進行分割之試驗例的結果。第17圖(a)係的圖表顯示關於細胞濃度3.0×105cells/mL的懸浮液之結果，第17圖(b)的圖表係顯示關於細胞濃度6.0×105cells/mL的懸浮液之結果。
第17圖(c)、(d)的圖表係顯示上述(ii)定期進行網狀構造的逆流洗淨同時持續進行分割之試驗例的結果。第17圖(c)的圖表係顯示關於細胞濃度 3.0×105cells/mL的懸浮液之結果，第17圖(d)的圖表係顯示關於細胞濃度6.0×105cells/mL的懸浮液之結果。
如第17圖(a)、(b)的圖表所示般，在不進行網狀構造的逆流洗淨之情形下，不論於何種細胞濃度下，細胞生存率皆會隨著分割處理量的增多而降低。相對於此，如第17圖(c)、(d)的圖表所示般，在進行了網狀構造的逆流洗淨之情形下，於3×105cells/mL的細胞密度係可充分地抑制細胞生存率的降低，此外，就6×105cells/mL的細胞密度而言，相較於第17圖(b)的圖表所示之結果，亦為可抑制細胞生存率的降低。
由以上可明瞭，在使用網狀構造之細胞團的分割中，若進行該網狀構造的定期性逆流洗淨，則對於抑制經分割的細胞團之生存率的降低是極為有效的。此外，在細胞密度較高之情形下，由於會有較更多的細胞團通過網狀構造，因此，咸認可藉由進一步提高網狀構造之逆流洗淨的頻率(亦即，在既定數量的細胞團通過網狀構造的單位面積之時間點進行逆流洗淨)來抑制細胞生存率的降低。
[試驗例7]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)之細胞團的分割
將hiPS細胞進行懸浮培養來形成細胞團，使用上述網狀構造來分割該細胞團，並觀察每單位容量之各別分割後之細胞團的生存率，藉此進行確認由該網狀構造所致之分割性能及分割程序之試驗。
(分割前之hiPS細胞的三維培養)
培養基1：
依循專利文獻2所記載之混合方法，使用FCeM-series Preparation Kit(日產化學股份有限公司製)將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠 (KELCOGEL CG-LA、三榮源FFI公司製)注入於含有10μM Y-27632(Fujifilm Wako Pure Chemical公司製)之mTeSR1培養基(StemCell Technologies公司製)而調製成之液狀的培養基組成物。
培養基2：
依循專利文獻2所記載之混合方法，使用FCeM-series Preparation Kit將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠注入於mTeSR1培養基而調製之液狀的培養基組成物。
使用可變更容量的200mL培養袋(Nipro公司製)、培養基1及培養基2，將hiPS細胞株253G1(由理化學研究所分讓)於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行維持培養。
於培養的第0日接種於培養基1，每隔1至3日添加培養基2，並持續此操作6至8日而形成細胞團。於最終日使用MACS(註冊商標)SmartStrainers(70μm、MACS公司製)來回收細胞團，於培養基1中懸浮後通過依據本發明之裝置者，並將經分割的細胞團予以接種(第0日)。重複進行此操作，進行細胞的維持培養。
(網狀構造的規格)
以下的事例中所使用之器具係使用經消毒用乙醇殺菌者。
製作具有以下所示之形狀的多孔膜來作為網狀構造的實施例品。
(a)開口的形狀為第3圖(a)所示之正六角形，樑部的剖面形狀為第3圖(c)所示之長方形。
(b)開口的形狀為第5圖(a)所示之正方形，樑部的剖面形狀為第3圖(c)所示之長方形。
(c)開口的形狀為第3圖(a)所示之正六角形，樑部的剖面形狀為第3圖(e)所示之入口側的角部帶有弧度之形狀(具有圓弧與弦之形狀)。
(d)開口的形狀為第5圖(a)所示之正方形，樑部的剖面形狀為第3圖(e)所示之入口側的角部帶有弧度之形狀(具有圓弧與弦之形狀)。
膜本體的材料為鎳，膜本體的厚度(第3圖(c)、(e)的厚度t1)為20μm，線徑(樑部的寬度)為50μm。各貫通孔的孔徑(於開口形狀之正六角形的6邊當中，互為相對之平行的兩個邊之間的距離，或是於開口形狀之正方形的兩個邊之間的距離)為60μm。
膜本體的外周形狀為圓形，圓的尺寸(直徑)為6mm。
(保持本發明之裝置之支撐器)
如第6圖所示般，製作用於設置網狀構造之支撐器。用於流通分散有細胞團之液狀的培養基組成物之管路(剖面呈圓形)的內徑為3.0mm，通過網狀構造之液狀的培養基組成物之流動的有效徑亦為3.0mm。
(hiPS細胞之細胞團的分割)
在經過7日的懸浮培養後，使用MACS(註冊商標)SmartStrainers(70μm、MACS公司製)來回收細胞團，於培養基1中以成為3.0×105cells/mL的細胞密度之方式懸浮。將各懸浮液45mL移往50mL注射器(Nipro公司製)，並以10cm/秒的處理速度使懸浮液通過本發明之裝置的實施例品，並以每次15mL而分注於15mL試管。
此外，亦藉由每10mL便將注射器抽回1mL來進行包含逆洗步驟之分割。
分注後之15mL試管係靜置於培養器(37℃、5% CO2)。
(細胞生存率)
於分割的2小時後，從培養器取出經分注之15mL試管，並藉由倒置混和而使細胞團充分分散後，採集培養液0.75mL，添加ATP試劑0.75mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)並藉由微量吸管充分攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將100μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。
將以分割前之懸浮液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時之相對值而設為細胞生存率。
以上的試驗結果係顯示於第18圖的圖表。
從第18圖的圖表所示之結果可知，在所有條件下之細胞生存率係容量相依性地降低。再者，可知相較於開口的形狀為正六角形者，係以正方形者之細胞生存率高，並且相較於樑部的剖面形狀為矩形者，係以入口側的角部帶有弧度之形狀者之細胞生存率高。
本試驗中關於開口的形狀之結果，不僅單純是開口形狀的影響，還由於正六角形的開口面積為3118μm2，正方形的開口面積為3600μm2，所以亦可考察到具有更大的開口面積之正方形之細胞生存率會變高。
依以上所述，可知在擴大規模時之分割中，樑部的剖面形狀係設成矩形且於入口側的角部帶有弧度之形狀者乃極為有效。
[試驗例8]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)的培養
(附著維持培養)
hiPS細胞株253G1(由理化學研究所分讓)係在塗覆有玻連蛋白VTN-N(Thermo Fisher Scientific公司製、#A14700)之6cm培養皿上接種5.0×104cells至5.0×105cells的細胞，並使用mTeSR(註冊商標)1培養基(StemCell Technologies公司製、#ST-05850)來進行培養。於接種後24小時，係在含有10μM Y-27632(Fujifilm Wako Pure Chemical公司製、#030-24021)之mTeSR1培養基進行培養，然後，每日進行培養基交換為不含10μMY-27632之mTeSR1培養基。於接種3至4日後，使用含有0.5mM EDTA之PBS溶液將細胞剝離，以維持繼代。
(懸浮維持培養)
‧培養基1：
依循專利文獻1(WO2016/163444)之方法，使用FCeM-series Preparation Kit(日產化學公司製)而將0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三榮源FFI公司製)注入於含有10μM Y-27632之mTeSR1培養基中所調製之組成物
‧培養基2：
依循專利文獻1之方法，使用FCeM-series Preparation Kit於mTeSR1培養基中調製0.016%(w/v)的脫醯化結蘭膠之組成物
為了進行三維培養，係使用人類ES/iPS細胞用解離液(Dissociation Solution for human ES/iPS Cells)(ReproCELL公司製、#RCHETP002)將接種所使用之hiPS細胞株253G1剝離為群落狀態。
以培養基1使所剝離的細胞懸浮後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來進行分割而製作細胞團。
提取一部分分割後的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來測量活細胞數。
以活細胞成為2.0×105cells/mL之方式調整細胞濃度後，接種於氣體穿透性培養袋(Nipro公司製、#87-352)，並於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。
於培養的第0日接種於培養基1，並在培養的第1日及第4日添加相對於接種量為2倍量之培養基2而進行培養7日。使用70μm的篩網(Miltenyi Biotec公司製、#130-098-462)來回收所形成之細胞團，懸浮於培養基1中之後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來分割細胞團，以維持繼代。
[試驗例9]懸浮培養時之最合適的細胞接種密度
使用以試驗例8所記載之方法而維持繼代之細胞，來驗證懸浮培養時之最合適的細胞接種密度。
使用人類ES/iPS細胞用解離液(Dissociation Solution for human ES/iPS Cells)(ReproCELL公司製、#RCHETP002)將經附著培養後之hiPS細胞株253G1剝離為群落狀態。以培養基1使所剝離的細胞懸浮後，使用 多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來進行分割而製作細胞團。
提取一部分之分割後的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。
以活細胞成為1×105cells/mL或2×105cells/mL或4×105cells/mL或6×105cells/mL或8×105cells/mL之方式調整細胞濃度後，接種於15mL試管(Falcon公司製、型號352095)，在未將蓋體密閉之狀態下，於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。
於培養的第0日接種於培養基1，並在培養的第1日及第4日添加相對於接種量為2倍量之培養基2，進行培養7日。
(增殖率的算出)
於培養的第0、1、2、3、4、7日採集一部分之各條件的培養液，分別添加與培養液為等量之ATP試劑(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將150μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。以培養的第0日之培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%，並將各測定日之相對值設為增殖率。試驗結果如第8表所示。
[第8表]
Figure 108127919-A0202-12-0077-8
如第8表所示，可得知在細胞接種密度為2.0×105cells/mL之條件下，第7日的增殖率為最高。為了有效率地使細胞增殖，必須以適當的濃度來接種細胞。
[試驗例10]懸浮培養時之最合適的培養基添加方法
使用經試驗例8所記載之懸浮維持培養來維持繼代之細胞，來驗證懸浮培養時之最合適的培養基添加方法。
將藉由三維培養進行1次繼代以上的培養之第7至8日的hiPS細胞株253G1細胞進行回收，並以培養基1使細胞懸浮後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來進行分割，而製作細胞團。
提取一部分分割後的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。
以活細胞成為2×105cells/mL之方式調整細胞濃度後，接種於氣體穿透性培養袋(Nipro公司製、#87-352)，並於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。於培養的第1日將培養袋內的細胞培養液1mL接種於15mL試管(Falcon公司製、型號352095)，並且如第9表所記載般，於培養的第1至6日添加培養基2。接種細胞後之15mL試管係在未將蓋體密閉之狀態下，於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。
(增殖率的算出)
於培養的第7日採集各條件的培養液1mL，分別添加ATP試劑1mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)並藉由微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將150μL分注於白色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。將以培養的第1日之培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為1時之第7日之相對值設為增殖率。試驗結果如第9表所示。
(細胞團平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將試驗中所使用之各條件之培養液的一部分移往12孔盤，使用Cell3iMagerduos來測量培養液中之直徑50μm以上之細胞團的大小。於細胞團大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將其平均值設為平均直徑。
[第9表]
Figure 108127919-A0202-12-0079-9
如第9表所示，可知所添加之培養基的量愈多則增殖率愈高，且球體平均直徑亦有增大之傾向。為了有效率地使細胞增殖，必須在適當的時機添加培養基，並添加適當的量。
[試驗例11]使用氣體穿透性培養袋之培養
使用經試驗例8所記載之懸浮維持培養而維持繼代之細胞，來驗證使用氣體穿透性培養袋之培養。
將藉由三維培養進行1次繼代以上的培養之第7日的hiPS細胞株253G1細胞回收，並於培養基1使細胞懸浮後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來進行分割而製作細胞團。
提取一部分之分割後的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。
以活細胞成為2×105cells/mL之方式調整細胞濃度後，接種於200mL培養用氣體穿透性培養袋(Nipro公司製、#87-352)或1L培養用氣體穿透性培養袋(Nipro公司製、#87-302)，並於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。
於培養的第0日接種於培養基1，並在培養的第1日及第4日添加相對於接種量為2倍量之培養基2，進行培養7日。於培養後，使用篩網來回收細胞，懸浮於培養基1之後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來分割細胞團，以維持繼代。
(增殖率的算出)
提取一部分之培養第7日的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝 置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。將培養第7日的細胞數除以在培養的第0日所接種之細胞數，藉此算出增殖率。
(細胞團個數及平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將試驗中所使用之培養液的一部分移往12孔盤，並使用Cell3iMagerduos來計測培養液中之直徑50μm以上之細胞團的個數及大小。於細胞團大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將其平均值設為平均直徑。
[第10表]
Figure 108127919-A0202-12-0081-10
如第10表所示，使用200mL培養袋之情形時的增殖率約為10倍，而使用1L培養袋之情形時的增殖率約為9倍。從以上結果可知，在200mL規模與1L規模中皆能以幾乎相同程度的效率來培養。
[試驗例12]使用各種容器之培養
使用經試驗例8所記載之懸浮維持培養而維持繼代之細胞，來驗證使用各種容器之培養。
將藉由三維培養而進行1次繼代以上的培養之第7至8日的hiPS細胞株253G1細胞回收，於培養基1使細胞懸浮後，使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來進行分割，藉此製作細胞團。
提取一部分之分割後的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來測量活細胞數。
以活細胞成為2×105cells/mL之方式調整細胞濃度後，接種於50mL試管(WATOSON公司製、#1345-050S)、低吸附10cm皿(Corning公司製、#3262)、細胞培養燒瓶(Corning公司製、#430168)，並於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。
此時，50mL試管及細胞培養燒瓶是在未將蓋體密閉之狀態下培養。於培養的第0日接種於培養基1，並在培養的第1日及第4日添加相對於接種量為2倍量之培養基2，進行培養7日。培養條件及結果顯示於第11表。於條件2中，除了培養基添加日以外，亦實施使培養液懸浮之操作。
(增殖率的算出)
提取一部分之培養第7日的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。將培養第7日的細胞數除以在培養的第0日所接種之細胞數，藉此算出增殖率。
(細胞團個數及平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將試驗中所使用之培養液的一部分移往12孔盤，使用Cell3iMagerduos來計測培養液中之直徑50μm以上之細胞團的個數及大小。於細胞團大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將其平均值設為平均直徑。
[第11表]
Figure 108127919-A0202-12-0083-11
如第11表所示，可知藉由使用低吸附10cm皿作為培養容器，而能夠得到與第10表所記載之氣體穿透性培養袋為同等程度之增殖率。此外，測定培養的第7日之各容器的培養液與空氣接觸之面積(記載為空氣接觸面積)與培養液的高度(記載為液面高度)。咸認與其它容器相比，於低吸附10cm皿為增殖率提升之原因是因為培養液與空氣接觸之面積較大且培養液的高度較低之故。由以上結果顯示出：為了有效率地使細胞增殖，必須進行氣體交換，該氣體係用於使細胞在培養基中增加所需之氣體。
[試驗例13]人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)之細胞團的回收
使用經試驗例8所記載之懸浮維持培養而維持繼代之細胞，來驗證細胞團的回收條件。使經三維培養進行1次繼代以上的培養之第7日之hiPS細胞株253G1的細胞培養液以1mL/秒的速度通過有效面積及形狀不同之各種條件的篩網容器，以將細胞團捕集於篩網。然後，使試驗例8所記載之新鮮的培養基2逆流，藉此回收細胞團。
(回收器的規格)
在條件1及2中，係使用如第9圖所示之以將回收容器內的空間以篩網區隔為2個之方式所配置之回收器。
於第9圖(a)所示之例子中，回收容器之內部空間的外周形狀為圓形，但在條件1下，係使用回收容器之內部空間的外周形狀為長方形(長邊位於從入口朝向出口之方向)，且篩網孔徑65μm、有效面積約13cm2者。此外，在條件2下，使用回收容器之內部空間的外周形狀(基本形狀)為菱形(在互為相對之2個頂點部分設置入口及出口)，篩網孔徑65μm、有效面積約 34cm2者。藉由將回收時的流動方向設為相對於捕集時的流動方向為相反，使被捕集之細胞團往回收容器移動。
(細胞團個數及平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將試驗中所使用之培養液的一部分移往12孔盤，使用Cell3iMagerduos來計測培養液中之直徑50μm以上之細胞團的個數及大小。於細胞團大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將其平均值設為平均直徑。
(回收率的算出)
採集培養液及回收液1mL，分別添加ATP試劑1mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將150μL分注於白色96孔盤，並以Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值而藉此測定活細胞的數目。將以培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時之回收液的相對值設為回收率。
回收率的結果如第12表所示。
[第12表]
Figure 108127919-A0202-12-0086-12
如第12表所示，在條件1及2中可得到80%前後的回收率。與試驗例5的條件9及10相比，於第12表的條件1及2之回收率為提升。從此等結果來看，可知藉由使回收器的形狀與篩網的孔徑達到最合適化，可提升回收效率，並有效率地回收細胞團。
[試驗例14]封閉系統培養
使用經試驗例8所記載之懸浮維持培養而維持繼代後之細胞，來驗證第7圖所示之封閉系統培養。
將以三維培養而進行1次繼代以上的培養之第7日的hiPS細胞株253G1細胞回收，並使細胞懸浮於培養基1之後，使用多孔膜(開口形狀為 正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)來進行分割，藉此製作細胞團。
提取一部分之分割後的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。
以活細胞成為2×105cells/mL之方式調整細胞濃度後，接種於氣體穿透性培養袋(Nipro公司製、#87-352)，並於CO2培養器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態進行三維培養。於培養的第0日接種於培養基1，並在培養的第1日及第4日添加相對於接種量為2倍量之培養基2，進行培養7日。
於培養的第7日，藉由連接於第7圖所記載之具有回收器及分割器及新的培養袋之封閉系統流路而回收細胞團，分割較大的細胞團，並接種至新的培養袋，藉此進行維持培養。此時，以活細胞成為2×105cells/mL之方式調整濃度。
回收器係使用分離篩網孔徑65μm、線徑48μm、有效面積約34cm2者，分割器係使用多孔膜(開口形狀為正六角形、孔徑(平行的兩個邊之間的距離)70μm、線徑(樑寬度)20μm、通過速度10cm/秒)。
本試驗例中，實際使用之細胞培養系統的構成係如第19圖的方塊圖所示。圖中之較小的正方形為以懸浮液或液體培養基會沿著圖中虛線的箭號流動之方式來切換流路之切換閥。又，於圖示中係省略以調節細胞團的濃度等為目的而用於從外部適當地追加培養基之要素、配管，和用於細胞團的檢查而抽取懸浮液之要素或配管等附加性構成。
如第19圖所示，藉由第1送液注射器的運作，第1培養袋中的懸浮液(含有細胞團之液體培養基)係沿著箭號1而進入第1送液注射器，接著，沿著箭號2進入回收器。其中，僅殘留有細胞團之培養所使用之培養基係通過回收器而進入廢液袋。在此，回收器係位於較分割器更靠前之位置，係用於在分割前置換液體培養基。接著，沿著箭號3而從第2送液注射器送出新鮮的培養基，並與回收器中的細胞團一同成為新的懸浮液，而進入第3送液注射器。然後，該新的懸浮液係沿著箭號4被送入分割器，細胞團在此分割器被分割，並沿著箭號5進入第2培養袋。
於第19圖的例子中，第1培養袋為第1圖所謂之供給源，第2培養袋為第1圖所謂之第1容器。第2培養袋可藉由管路的切換等而封閉性地與第1培養袋進行交換，第2培養袋中的細胞團能夠藉由沿著前述箭號1至5之移動而被再次分割，並進入於第3培養袋(圖中未顯示)。
(增殖率的算出)
提取一部分之培養第0日及第7日的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，使用細胞計數裝置(ChemoMetec公司製、#NC-200)來計測活細胞數。將培養第7日的細胞數除以在培養的第0日所接種之細胞數，藉此算出增殖率。測定結果如第13表所示。
(回收率的算出)
採集培養液、過濾液、回收液1mL，分別添加ATP試劑1mL(CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega公司製)，並藉由微量吸管進行攪拌，於室溫下靜置10分鐘後，分別將150μL分注於白 色96孔盤，並藉由Enspire(Perkins Elmer公司製)來測定發光強度(RLU值)，扣除單為培養基之發光值，藉此測定活細胞的數目。將以培養液的RLU值(ATP測定、發光強度)作為100%時之過濾液的相對值設為濾液流出細胞，並將回收液的相對值設為回收率。測定結果如第13表所示。
(細胞團個數及平均直徑的測定)
使細胞團充分分散後，將培養液的一部分移往12孔盤，並使用Cell3iMagerduos來測量培養液中之直徑50μm以上之細胞團的大小。於細胞團大小的測定中，係計測細胞團的等效圓直徑，並將其平均值設為平均直徑。測定結果如第13表所示。
(未分化性的評估)
提取一部分之培養第7日的細胞，並藉由TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製、#12563011)處理而單細胞化後，懸浮於4%PFA溶液並靜置15分鐘，藉此將細胞固定化。
經固定化的細胞係懸浮於抗TRA-1-60抗體(BD、#560193)及抗SSEA-4抗體(BD、#560796)溶液並靜置30分鐘，藉此進行染色後，使用含有2%FBS之PBS溶液來洗淨細胞，然後使用Fortessa X-20(BD)來測定作為iPS細胞的未分化性指標之TRA-1-60及SSEA-4的表現。測定結果如第14表所示。
[第13表]
Figure 108127919-A0202-12-0090-13
[第14表]
Figure 108127919-A0202-12-0090-14
如第13表、第14表所示，可知於該細胞培養系統(亦即，使用了封閉系統流路之細胞培養系統)中，可以維持良好的增殖率並進行未分化培養。
[產業上之可利用性]
藉由本發明，能夠在封閉系統內進行細胞團的分割、與經分割之細胞團的進一步培養，再者，能夠在維持封閉系統之狀態下重複進行細胞團的分割與培養，而較佳地進行細胞團的增殖。此外，可在維持封閉系統之狀態下回收增殖後之細胞團。
本申請案係以在日本提出申請之日本特願2018-148042(申請日：2018年8月6日)及日本特願2018-170103(申請日：2018年9月11日)為基礎，於本說明書係涵蓋其全部內容。
10‧‧‧第1容器
20‧‧‧分割器
20a‧‧‧聯結入口
20b‧‧‧聯結出口
21‧‧‧分割用管路
22‧‧‧網狀構造
F1‧‧‧送液裝置
P1、P2、P3‧‧‧管路
S1‧‧‧供給源

Claims (19)

  1. 一種細胞培養系統，係用於將細胞團分割並繼代培養之細胞培養系統，其中至少具有：
    將從供給源連同液體培養基所供給之應予分割的細胞團分割為更小的細胞團之分割器，以及
    用於將藉由前述分割器所分割之細胞團進行懸浮培養之第1容器；
    前述分割器係具有入口、與內部的分割用管路、與出口，前述入口係以將前述應予分割的細胞團與液體培養基從前述供給源接收至前述分割用管路內之方式構成，於前述分割用管路中，配置有用於分割應予分割的細胞團之網狀構造，並藉由使該應予分割的細胞團連同液體培養基通過該網狀構造而進行分割，前述出口係以將前述經分割的細胞團送出至前述第1容器之方式連接於該第1容器；
    前述第1容器係具有容納經分割的細胞團與液體培養基，並且將在該第1容器內經浮游培養後的細胞團予以送出之構成。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之細胞培養系統，其中，第1容器為柔軟的細胞培養袋。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之細胞培養系統，其中，前述網狀構造為以線材所編織之篩網。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之細胞培養系統，其中，前述網狀構造為在膜之主面的既定區域配置有複數個貫通孔之多孔膜，該網狀構造具有：在膜的厚度方向上貫通前述既定區域之複數個貫通孔、以及作為該貫通孔彼此之間的間隔壁之樑部；
    前述貫通孔具有可讓前述更小的細胞團通過之大小的開口形狀；
    前述樑部為從前述既定區域的前述本體部分扣除前述貫通孔後之剩餘部分，係將應予分割的細胞團進行切斷之部分，且係以形成為網狀之方式一體地連結。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之細胞培養系統，其中，前述網狀構造之垂直於樑部的長邊方向之剖面的形狀為矩形，或為該矩形之入口側的2個角部帶有弧度之形狀。
  6. 如申請專利範圍第4或5項所述之細胞培養系統，其中，前述複數個貫通孔的開口形狀係互為全等的四角形，且前述樑部以正交方格狀相互連結；或是
    前述複數個貫通孔的開口形狀係互為全等的六角形，且前述樑部以蜂巢狀相互連結。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之細胞培養系統，其中更具有用於回收既定大小的細胞團之回收器，
    該回收器係以接收在前述第1容器內經浮游培養後的細胞團與液體培養基之方式而連接於該第1容器，
    該回收器係具有分離室，該分離室由分離用網狀構造區隔為第1室與第2室，並以使進入於該回收器內之液體培養基會從第1室通過分離用網狀構造並往第2室移動，且移出至該回收器外之方式來構成內部流路；
    前述分離用網狀構造係具有不會讓所欲回收之大小的細胞團通過之預定大小的網目，藉此，在連同液體培養基進入於該回收器內之細胞團中，所欲回收之大小的細胞團不會通過該分離用網狀構造而滯留於第1室。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之細胞培養系統，其中，前述分離用網狀構造之整體的形狀為薄片狀或袋狀。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述之細胞培養系統，其中，以使在液體培養基通過前述回收器之分離用網狀構造的網目時之該液體培養基的行進方向具有垂直朝上的方向分量之方式，於前述回收器的分離室中配置有該分離用網狀構造。
  10. 如申請專利範圍第7至9項中任一項所述之細胞培養系統，其中，前述回收器之分離室的第1室係具有：
    用於將在前述第1容器內懸浮培養後的細胞團與液體培養基接收至第1室之第1流入埠，
    用於使稀釋具有試劑及/或細胞團與液體培養基而成之懸浮液用之液體從外部流入於第1室之第2流入埠，以及
    用於使一部分的細胞團從第1室流出至外部之流出埠。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之細胞培養系統，其中更具有用於使液體培養基與細胞團移動之送液裝置，該送液裝置係選自由將第1容器壓縮變形以將容納於內部之液體培養基與細胞團送出之裝置、注射泵以及蠕動泵所組成之群組的1種以上。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之細胞培養系統，其中更具有：以在與前述應予分割的細胞團連同液體培養基通過前述網狀構造之方向為相反的方向上，使既定液體通過該網狀構造之方式，使該既定液體移動用之逆向送液功能或逆向送液裝置。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之細胞培養系統，其中，前述細胞團是由多潛能幹細胞所構成之細胞團。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之細胞培養系統，其中，於前述液體培養基中包含用於使細胞或細胞團懸浮於該液體培養基中之細微的構造體，該細微的構造體係分散並懸浮於該液體培養基中。
  15. 一種細胞團的製造方法，該製造方法係具有：
    使用如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之細胞培養系統，並
    使應予分割的細胞團與液體培養基通過前述細胞培養系統的分割器，以分割該細胞團之步驟；以及
    將藉由前述分割器所分割之細胞團連同液體培養基送往第1容器內，並於該第1容器內進行懸浮培養之步驟。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之細胞團的製造方法，其中，使細胞團連同液體培養基通過前述分割器時之該液體培養基的流速為10mm/秒至500mm/秒。
  17. 如申請專利範圍第15或16項所述之細胞團的製造方法，其中更具有逆流洗淨步驟，該逆流洗淨步驟為：在前述分割細胞團之步驟中分割出既定量的細胞團後，在與用於分割該細胞團而通過分割器的網狀構造之方向為相反的方向上，使既定液體通過該網狀構造，藉此洗淨該網狀構造之步驟。
  18. 如申請專利範圍第15至17項中任一項所述之細胞團的製造方法，其中，前述細胞培養系統為申請專利範圍第7至10項中任一項所述之細胞培養系統，且更具有：
    將在第1容器內經浮游培養的細胞團連同液體培養基送往前述細胞培養系統的回收器，並將滯留於該回收器的第1室之細胞團送往回收容器而進行回收之步驟。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之細胞團的製造方法，其中，在前述回收器中用以將細胞團與液體培養基進行分離之通過該回收器之該液體培養基的流速為0.01mm/秒至25mm/秒。
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