JP2018064486A

JP2018064486A - 歯髄幹細胞の培養方法

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Publication number: JP2018064486A
Application number: JP2016204205A
Authority: JP
Inventors: 達哉山口; Tatsuya Yamaguchi
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2018-04-26

Abstract

【課題】動物の歯からの歯髄幹細胞の分離培養において、簡便かつ有効な方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、動物の歯髄幹細胞を培養する方法であって、ａ）採取した歯髄をプロテアーゼ溶液で消化して幹細胞を含む細胞懸濁液を得る工程、ｂ）前記細胞懸濁液を中空糸膜の中空部に充填して幹細胞を中空糸膜表面に接着させる工程、ｃ）中空糸膜の中空部に培養液を潅流して幹細胞を培養する工程を含むことを特徴とする歯髄幹細胞の培養方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、動物、特に犬または猫の歯髄幹細胞を効率よく培養する方法に関する。

骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、増殖能が高く、軟骨・筋肉・肝細胞・神経細胞・心筋細胞・血管内皮細胞等、種々の細胞に分化することが知られており、再生医療、特に細胞移植治療用の細胞源としての有用性が報告され、一部で既に実用化されている。

間葉系幹細胞は、骨髄液や脂肪組織から採取されることが多いが、これらの組織を得るには外科的侵襲を伴うことになる。そこで、臍帯、胎盤、歯など、従来は廃棄されていた組織を利用することが提唱されている。臍帯や胎盤組織が入手出来るのは、出産時に限られるのに対し、歯、特に脱落乳歯や抜歯された第三大臼歯（親知らず）は、その入手機会が非常に多いことから、歯髄細胞バンクが設立されるに至っており、再生医療用の細胞源として近年注目を集めている。

また、歯髄幹細胞は、上記のように簡便に採集可能であるだけでなく、その性質においても、骨髄由来間葉系幹細胞よりも増殖性が高く、分化能も同等以上であることがわかっており、今後ますます有効な利用手段が開発されることが期待できる。

ところで、再生医療への注目は人の医療に限ったことではなく、近年、獣医療の発展に伴い急速に高齢化が進んだ犬や猫に対しても積極的に再生医療が実施されつつあり、細胞源や安全性等の問題は人の再生医療とほぼ同じものである。このため、人の再生医療と同様になるべく簡便、低侵襲な方法で、良い性質の幹細胞を得ることが求められており、犬や猫の歯からも幹細胞を効率よく分離、培養する有効な手段が求められている。

乳歯は、特に良質の幹細胞源として期待される。しかし、幼犬や幼猫といった小さな動物の乳歯は人のそれと比べるとかなり小さく、得られる歯髄組織もごく僅かである。また、幼犬や幼猫は脱落した乳歯をそのまま飲み込むことも多いため、乳歯を得る機会は多くない。従って、このように貴重な乳歯から効率よく幹細胞を分離、培養する有効な方法が求められている。

国際公開２０１３／１４６９９２

動物、特に犬または猫の歯からの歯髄幹細胞の分離培養において、簡便かつ有効な方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）動物の歯髄幹細胞を培養する方法であって、
ａ）採取した歯髄をプロテアーゼ溶液で消化して幹細胞を含む細胞懸濁液を得る工程
ｂ）前記細胞懸濁液を中空糸膜の中空部に充填して幹細胞を中空糸膜表面に接着させる工程
ｃ）中空糸膜の中空部に培養液を潅流して幹細胞を培養する工程
を含むことを特徴とする歯髄幹細胞の培養方法。
（２）前記動物がイヌまたはネコであることを特徴とする（１）に記載の歯髄幹細胞の培養方法。
（３）前記プロテアーゼがコラゲナーゼおよび／またはディスパーゼであることを特徴とする（１）または（２）に記載の歯髄幹細胞の培養方法。
（４）前記中空糸膜が疎水性樹脂のみからなることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の歯髄幹細胞の培養方法。
（５）前記培養液が動物血清を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の歯髄幹細胞の培養方法。

本発明により、動物、特に犬または猫の歯から歯髄幹細胞を高効率に分離、培養することが可能となる。

細胞培養容器（中空糸膜モジュール）の一例を示す模式図である。細胞培養装置の一例を示す模式図である。犬の乳歯より採取された歯髄幹細胞を培養した後の顕微鏡観察像

本発明において、歯髄とは、歯の歯髄腔を満たす疎繊維性結合組織のことをいう。
歯髄を採取するための歯は、好ましくは抜歯（脱落）後２４時間以内、より好ましくは抜歯（脱落）後１２時間以内のものが好ましい。

（歯髄の採取）
自然に脱落した乳歯又は抜歯した乳歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液に浸して殺菌した後、培地中に回収する。続いて、生食注水下にて、歯科用バーを用いて乳歯を必要に応じて分割する。次に、歯科用ファイルを用いて歯髄を採取し、培地中に回収する。

（プロテアーゼ処理）
回収した歯髄に、プロテアーゼとしてコラゲナーゼおよび／またはディスパーゼを作用させる。例えば、培地中にコラゲナーゼ３ｍｇ／ｍｌとディスパーゼ４ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃で１時間放置する。このようにプロテアーゼ処理した後、ガーゼろ過またはセルストレーナ（１００μｍメッシュ）を通し、夾雑成分を除去する。

（幹細胞の培養）
得られた細胞は、洗浄せず、培養容器に播種する。培養容器をインキュベータ内に移し、培養する（３７℃、５％ＣＯ_２）。培養容器としては、培養皿やフラスコ、中空糸膜モジュールなどを用いることができるが、中空糸膜モジュールを用いるのが好ましい。従来、得られた細胞を培養皿等の培養容器に播種する際には、コラゲナーゼやディスパーゼ（プロテアーゼ）を予め除去しておく必要があった。しかし、本発明においては、細胞培養容器として中空糸膜モジュールを用いることにより、プロテアーゼを除去することなく細胞を培養することを可能とした。すなわち、犬や猫などの動物からの歯髄由来の幹細胞は、少量のため細胞のロスに繋がる操作は最小限に止めたい。本発明においては、細胞培養容器として特定の透過特性を有する中空糸膜を内蔵したモジュール（中空糸膜モジュール）を用いることにより、貴重な細胞の損失を抑えつつ、プロテアーゼを速やかに系外に排出できるため、幹細胞を高効率に培養、増殖させることができる。また、細胞培養容器として中空糸膜モジュールを用いることにより、膜表面に接着しない浮遊細胞等の目的外の細胞を培養液の流れとともに簡単に除去することができるメリットもある。また、中空糸膜モジュールを用いる他のメリットとして、細胞数が少ない初期段階においては小型のモジュールを用いて培養を行い、細胞数が増えるに従いモジュールを大型のものに交換していくなど、継代培養がやりやすいことが挙げられる。

（中空糸膜）
本発明において、中空糸膜の材料は、細胞を膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過できるものであれば特に限定されず、例えば、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロースなどのセルロース系樹脂、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンなどのポリスルホン系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、エチレンビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン等が挙げられる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、中空糸膜は、これらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されたものでもよい。親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をポリビニルピロリドンやヒドロキシアルキルセルロース、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。また、中空糸膜への細胞の接着向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着因子を表面にコーティングしたものでも良い。なお、ポリスルホン系樹脂等の疎水性樹脂からなる中空糸膜を用いると、血清中に含まれる細胞接着因子が速やかに膜表面に吸着されるため本発明において好ましく用いられる。

本発明において、中空糸膜の内径は、１００〜１０００μｍが好ましく、１５０〜５００μｍがより好ましい。膜厚は、中空糸膜が適度な強度を保ち、かつ物質の透過性に大きな支障がない範囲で設定すればよく、１０〜１５０μｍ程度が好ましい。中空糸膜の内側に細胞を播種し、培地を潅流する培養を行う場合は、中空糸膜の内径は、二次元的な効果として、細胞の播種、増殖する面積、細胞密度だけでなく、三次元的な効果であるコンパクト性のみならず、培地の流れ、線速度、せん断力などに影響する設計や操作条件と関わる事項となることから、培養容器として中空糸膜モジュールを用いた培養のメリットを活かす要件となる。

中空糸膜の孔径は、細胞は通過させないが、水、塩類、タンパク質などの培養液成分は通過させる孔径であればよく、培養という面を考慮すると物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が好ましい。具体的には、平均孔径が０．００１〜０．５μｍ程度であることが好ましく、０．０１〜０．１μｍ程度がより好ましい。また、分画分子量（篩係数が０．１未満となる分子量）は、1〜１００万程度であることが好ましく、２〜２０万程度であれば、より好ましい。なお、本発明において、中空糸膜の構造は、特に限定されるものではなく、均質構造でもよいし、不均質（非対称）構造でもよい。

本発明において、中空糸膜の透水性についても、特に制限はないが、好ましくは１０〜５０００ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇである。透水性が小さいと十分な物資移動を発現できない。また、透水性が大きすぎると、中空糸膜の内部や外部流路に培地などを流した場合に膜間圧力差が生じ、意図せずろ過が発生し流れが偏ってしまったり、中空糸膜の長さ方向で流れの淀み（分布）ができてしまうため好ましくない。

（中空糸膜モジュール）
本発明において、細胞培養容器として用いる中空糸膜モジュールは、例えば、筒状容器に数本〜数万本の中空糸膜を格納することにより作製することができる。このような中空糸膜モジュールは、単位容積あたりの培養面積を非常に大きくすることができ、また培養操作も簡便化することができるため、効率よく細胞培養を実施することが出来る。

前記中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用いるには、例えば、図１に示すような４つの開口部（端部導管および側部導管）を有するモジュールケース３に複数の中空糸膜４が内蔵された構成とするのが好ましい。複数の中空糸膜４は、両端において各中空糸膜の内腔と外腔を分離した状態で、かつ中空糸膜の中空部を閉塞しないようにシール材（例えば、ポリウレタン系ポッティング剤）によりモジュールケース端部に接着固定されている。すなわち、前記４つの開口部のうち、２つの端部導管１ａおよび１ｂは、中空糸膜の中空部（内腔）と連通しており、前記端部導管１ａまたは１ｂの一方から導入された培養液などが中空糸膜内腔を通ってもう一方の端部導管１ｂまたは１ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。一方、前記開口部のうち、残りの２つの側部導管２ａおよび２ｂは、前記モジュールケース３の内側であって、かつ前記中空糸膜の外腔である空間（以下、「外腔側」とも称する）と連通しており、前記側部導管２ａまたは２ｂの一方から導入された培養液などが外腔側を通ってもう一方の側部導管２ｂまたは２ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。

（細胞培養システム）
前記中空糸膜モジュールや培養液貯留容器、ペリスタポンプなどにより構成される培養システムをＣＯ_２インキュベーター内に設置し、本発明の実施の一つの態様例としたものを図２に示す。図２において、５および６はそれぞれ、培養液貯留容器である。培養液貯留容器５からは、中空糸膜モジュール７の端部導管１ａに、流路（回路）が接続され、培養液貯留容器５に入っている培養液（培地）が中空糸膜の中空部（内腔側）に送液できるようになっている。他方、培養液貯留容器６からは、中空糸膜モジュール７の側部導管２ａに、流路が接続され、培養液貯留容器６に入っている培地が中空糸膜の外腔側に送液できるようになっている。中空糸膜モジュール７の内腔側を通過した培養液は、端部導管１ｂから排出され、ペリスタポンプ８を経由して、回収容器１１まで流路が接続されている。一方、中空糸膜モジュール７の外腔側を通過した培養液は、側部導管２ｂから排出され、ペリスタポンプ９を経由して、廃液回収容器１０に回収される。

前記中空糸膜モジュールを用いる場合、細胞培養は、内腔側または外腔側のいずれにおいて行っても良いが、内腔側で培養を行うのがより好ましい。例えば、内腔側にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を端部導管より注入して播種し、播種終了後、細胞懸濁液を培地（培養液）に切り換えて潅流させ、内腔側にて一定期間培養を行う。この間、同時に外腔側へも培地を側部導管より注入し潅流させることが好ましい。

（培養液）
本発明において、培養液（培地）は、細胞を生育および増殖させるためのものであり、栄養素としてアミノ酸、ビタミン、無機塩および糖などが含まれている、いわゆる基礎培地を指す。このような培地としては、例えば、Minimum Essential Medium（MEM）、Basal Medium Eagle（BME）、Media199、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（D-MEM）、α−Minimum Essential Medium（α-MEM）、Ham's F-10 Nutrient Mixture（Ham’s F-10）、Ham's F-12 Nutrient Mixture（Ham’s F-12）、RPMI 1640、L-15、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）、ES medium、MCDB 131 Medium、CMRL 1066 Media、DM-160 Medium、Fisher’s Medium、StemSpan Medium、StemPro Medium、Hybridoma Serum Free Medium（Hybridoma SFM）、mTeSR1（modified Tenneille Serum Replacer 1）、Essential 8、Repro FF/FF2/XF、StemSure（登録商標）、CELRENA、S-Mediumと呼ばれる市販の細胞培養液およびこれらの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明において、歯髄由来の幹細胞を培養するために、前記基礎培地には血清を添加するのが好ましい。培地に添加する血清としては、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清などが挙げられる。添加量としては、基礎培地に対して１ｖｏｌ％以上が好ましい。添加量が少なすぎると、細胞が生育および増殖しないことがあるので、５ｖｏｌ％以上添加するのがより好ましく、１０ｖｏｌ％以上添加するのがさらに好ましい。添加量を必要以上に増やしても培養コストが上昇するだけであり、２０ｖｏｌ％程度を上限とするのが好ましい。前記血清は、内腔側に流す培養液に添加すればよいが、外腔側に流す培養液に添加してもよい。

以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（細胞回収数の測定）
細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔｇｒａｄｅｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ^２エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算方法：
Ｃ＝Ｎ×１０^４
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０^４：１ｍｍ^２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量

（細胞生存率の測定）
トリパンブルーで染色されない細胞を生細胞、染色される細胞を死細胞と判定し、以下の式により細胞の生存率を測定した。
細胞生存率（％）＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数）×１００

（透水性の測定）
中空糸膜モジュールに対し、純水を中空糸膜の内腔側への端部導管（図１の１ａ）から導入し、反対側（１ｂ）から流出させ、膜を十分に洗浄した。その後、中空糸膜の外腔側も同様に図１の２ａから２ｂに通水することにより洗浄実施した。出口部回路（圧力測定点よりも出口側）を鉗子で挟んで封止した。２５℃に保温した純水を加圧タンクに入れ、レギュレーターにより圧力を制御しながら、２５℃恒温槽で保温したモジュール流路側（中空糸の内部入口（１ａ））へ純水を送り、出口（１ｂ）および透過側出口（２ｂ）を閉じることにより、膜の透過側（中空糸外側２ｂ）から流出する濾液量を一定時間測定した。膜間圧力差は、モジュール入り口側への加圧圧力（タンクへの加圧と同一）とし、１００ｍｍＨｇで測定した。使用モジュールの膜透過部分（中空糸膜の内面）の面積を用いて、中空糸膜の透水性（ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇ）を算出した。
なお、透水性の測定および後述する篩い係数の測定には、中空糸膜内径基準の膜面積が１ｍ^２の中空糸膜モジュールを作製して用いた。

（篩い係数の測定）
中空糸膜が所定本数充填された、図１に示されるような中空糸膜モジュールを準備した。測定前に予め純水でプライミング処理を行い、モジュール内の空気を除去した後、３７℃で保温した。Ｆｅｅｄ液として、ｐＨ７．５±１に調整したリン酸緩衝液に１．０ｗｔ％の濃度となるようアルブミン（ナカライテスク社、ウシ由来（Ｆ−Ｖ））を溶解した溶液（Ｆｅｅｄ液）を準備し、３７℃に保温した。中空糸膜中空部に連通する入口より、Ｆｅｅｄ液を中空糸膜内径基準の膜面積１ｍ^２あたり２００ｍＬ／ｍｉｎで送液し、同膜面積１ｍ^２あたり３０ｍＬ／ｍｉｎの割合でろ過した。ろ液は、中空糸膜外側に連通する出入口より外部に流出させた。この時、２つある出入口の一方は閉止しておいた。ろ過されなかったＦｅｅｄ液はＦｅｅｄ液出口から外部に流出させた。ろ過開始より３０ｍｉｎ後に、Ｆｅｅｄ液入口濃度（Ｃｉ）、Ｆｅｅｄ液出口濃度（Ｃｏ）、濾液濃度（Ｃｆ）を測定し、以下の式により篩い係数（ＳＣ）を算出した。なお、アルブミンの濃度は、波長２８０ｎｍのＵＶ吸光度により測定した。
ＳＣ＝２×Ｃｆ／（Ｃｉ＋Ｃｏ）

（内径、膜厚の測定）
中空糸膜の内径、外径および膜厚は、中空糸膜をスライドグラスの中央に開けられたφ３ｍｍの孔に中空糸膜が抜け落ちない程度に適当本数通し、スライドグラスの上下面でカミソリによりカットし、中空糸膜断面サンプルを得た後、投影機Ｎｉｋｏｎ−Ｖ−１２Ａを用いて中空糸膜断面の短径、長径を測定した。中空糸膜断面１個につき２方向の短径、長径を測定し、それぞれの算術平均値を中空糸膜断面１個の内径および外径とし、膜厚は（外径−内径）／２で算出した。５断面について同様に測定を行い、平均値を内径、膜厚とした。

［実施例１］
（中空糸膜の作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０質量％、Ｎメチルピロリドン（三菱化学社製）３６質量％、トリエチレングリコール（三井化学社製）４４質量％を均一に溶解し、製膜原液を作製した。この原液を、７０℃に加温した円筒２重管ノズルから、中空形成剤としてＮメチルピロリドン１３．５質量％、トリエチレングリコール１６．５質量％、水７０質量％の水溶液とともに同時に吐出し、３００ｍｍの乾式部を通過させた後、７５℃の水中に浸漬し凝固させ、十分な水洗浄を実施した後に束に巻き取った。糸束は切断後、５０℃、５０％グリセリン水溶液に浸漬した後、過剰のグリセリン液を除き、６０℃にて通風乾燥させた。中空糸膜は、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量を調整した。
得られた中空糸膜を用いてモジュールを作製し、透水性および篩い係数を測定した結果、透水性は３８７ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇ、アルブミンの篩い係数は０．０１７であった。

（中空糸膜モジュールの作製）
試験用の中空糸膜モジュールを以下のように作製した。内径４ｍｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のアクリル製モジュールケース内に、前記作製したポリエーテルスルホン製中空糸膜を１０本挿入した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、図１に示すような形状の中空糸膜モジュールを作製した。

（細胞培養の準備）
得られた中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用い、図２に示すような細胞培養装置を構成した。まず、中空糸膜に付着しているグリセリンを除去するために、培養液貯留容器５、６に滅菌した注射用蒸留水を入れ、ポンプ８、９を起動し、中空糸膜モジュール内に充分量流して洗浄した。その後、培養液貯留容器５を、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地が入ったものに交換した。また、培養液貯留容器６を、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地が入ったものに交換した。この後、ポンプ８、９を起動してプライミング処理を行い、中空糸膜モジュール内の水を培養液に置換した。

（歯髄細胞の採取）
４ヶ月齢のイヌ（雑種、雌）の脱落乳歯より、以下の手順で歯髄を採取した。即ち、乳歯表面をイソジン溶液で消毒した後、滅菌した生理食塩液でイソジンを洗い流した。次いで、滅菌した歯科用カッターで乳歯を上下に二分割し、露出した歯髄を滅菌した先鋭鑷子（ピンセット）で採取し、培養皿に回収した。次に、歯髄が充分浸るように、１００μｌの０．３％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ溶液を添加した。コラゲナーゼによる消化が促進されるようピペットチップの先端などを使って組織を軽く潰した後、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、１５分間インキュベートし組織を消化した。消化後、１．９ｍｌの１５％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地を添加し、セルストレイナーを通し、幹細胞を含む細胞懸濁液を得た。

（細胞培養実験）
前記採取した幹細胞を含む細胞懸濁液を、中空糸膜の中空部側に充填して１晩放置し、中空糸膜内表面に細胞を接着させた。培養液貯留容器５を培養液のみの容器に交換した後、中空糸膜の中空部側の流速０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外側の流速３．４６ｍｍ／ｍｉｎで送液を開始した。この時、中空糸膜の中空部側に通液する培養液は、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地を用い、中空糸膜の外側に通液する培養液は、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた。なお、本細胞培養実験は、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、７日間行った。

（中空糸膜モジュールからの細胞回収）
７日間培養後、培養液の潅流を停止し、中空糸膜モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の潅流を停止した後、中空糸膜の中空部側および外側に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間潅流させ、培養液を十分ＰＢＳに置換した。次に、ＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を中空糸膜の中空部側と外側へ静かに充填し、室温で１５分間インキュベートした。
この後、培養液を図１の１ａより中空糸膜の中空部側へ流し入れ、１ｂより流し出した細胞を回収した（図３参照）。回収した細胞について、生細胞数および細胞生存率を計測した。この結果、８．１×１０^５個の生細胞が得られた（総細胞数：８．８×１０^５個、細胞生存率：９２．２％）。

（脂肪細胞への分化）
脂肪細胞への分化は、ＧｉｍｂｌｅＪＭ., ｅｔａｌ., ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ. ５８. ３９３−４０２（１９９５）に記載の方法を参考にして下記の方法で調べた。

歯髄由来細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に細胞密度（５，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ^２）で２４ウェル培養プレートに播種して１晩培養し、細胞をプレートに接着させた。細胞を２群に分け、一方の群の培地を、脂肪細胞誘導用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にインドメタシン（最終濃度６０μＭ）、ＩＢＭＸ（最終濃度０．５ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（最終濃度０．５μＭ）を添加した脂肪細胞分化誘導培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換をしながら５週間分化培養を行った。この群を脂肪細胞誘導群とした。もう一方の群については、培地を新しいＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら５週間培養を行った。この群をコントロール群とした。

脂肪細胞に分化した細胞は、細胞内に脂肪滴が観察される。そこで、培養後、両群の細胞を、オイルレッドＯ染色（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）によって染色して中性脂肪の有無を確認した。しかし、いずれの群においても中性脂肪の染色は認められなかった。更に、染色後、抽出液（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）を用いてオイルレッドＯ色素を抽出し、抽出液の５４０ｎｍにおける吸光度を両群で比較したが、両群間で有意な差は認められなかった。

次いで、脂肪細胞分化マーカーの１つであるＬｉｐｏＰｒｏｔｅｉｎＬｉｐａｓｅの発現量の変化を調べた。ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により各群の細胞から全ＲＮＡを抽出して全ＲＮＡ抽出液を調製し、次いでマルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて全ＲＮＡ抽出液に含まれるＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡ濃度測定後、ＴａｑＭａｎＴＭＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴＴＭ１−Ｓｔｅｐキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＰＣＲ反応液を調製し、各群の全ＲＮＡ２５ｎｇを鋳型とし、〔（４８℃／１５ｍｉｎ）×１サイクル、（９５℃／１０ｍｉｎ）×１サイクル、（９５℃／１５ｓｅｃ、６０℃／１ｍｉｎ）×４０サイクル〕のＰＣＲ条件下でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、ＬｉｐｏＰｒｏｔｅｉｎＬｉｐａｓｅ遺伝子とβアクチン遺伝子を増幅させた。ＰＣＲプライマーには、ＬｉｐｏＰｒｏｔｅｉｎＬｉｐａｓｅプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製／ＡｓｓａｙＩＤ：Ｈｓ００１７３４２５_ｍ１）及びβアクチンプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製／ＡｓｓａｙＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０３_ｍ１）をそれぞれ用いた。

その結果、ＬｉｐｏＰｒｏｔｅｉｎＬｉｐａｓｅのＣｔ値（Ｔｈｒｅａｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ）は、コントロール群では３９．３、脂肪分化誘導群では３６．０であり、脂肪分化誘導群ではコントロール群と比較してＬＰＬのＣｔ値が若干低いことが判明した。これらの結果は、脂肪分化誘導群において、細胞内に中性脂肪を蓄積した脂肪球の存在は確認できないものの、脂肪細胞分化マーカーの１つであるＬｉｐｏＰｒｏｔｅｉｎＬｉｐａｓｅの発現量が増加したことを示すものであり、歯髄由来細胞が、脂肪細胞への分化能を弱いながらも有することを示すものである。

（骨芽細胞への分化）
骨芽分化能は、ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭＦ., ｅｔａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２８４, １４３−７（１９９９），ＣｏｌｔｅｒＤＣ., ｅｔａｌ., ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ. ９８, ７８４１−５（２００１）に記載の方法を参考にして下記の方法で調べた。

上記軟骨分化能の測定で使用したのと同じ手法で調製した歯髄由来細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に細胞密度（５０００〜１００００細胞／ｃｍ^２）で４８ウェル培養プレートに播種して１晩培養した。細胞を２群に分け、一方の群の培地を、骨芽細胞分化用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にデキサメタゾン、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸塩、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＣＧＳ、β−グリセロフォスフェートを含む骨芽細胞分化用添加因子セット（Ｌｏｎｚａ社）を添加した骨芽細胞分化誘導培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら３週間分化培養を行った。この群を骨芽細胞誘導群とした。もう一方の群については、培地を新しいＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら３週間培養を行った。この群をコントロール群とした。培養後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、各ウェルに０．２ｍＬのＰＢＳと０．２ｍＬの２Ｍ塩酸を添加し３７℃で１時間静置して細胞内に蓄積したカルシウムを細胞から遊離させた。遊離したカルシウム濃度を、カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬）を用いて定量した。その結果、遊離カルシウム濃度は、コントロール群が１．５３ｍｇ／ｄＬであるのに対し、骨芽分化誘導群では２４．８８ｍｇ／ｄＬと高値を示した。

この結果は、歯髄由来細胞が、骨芽細胞分化誘導培地で培養することにより骨芽細胞へ分化して、細胞内にカルシウムが蓄積することを示すものであり、歯髄由来細胞が骨芽細胞への分化能を有することを示すものである。

本発明により、動物の歯髄組織から効率よく歯髄幹細胞を分離培養することが出来、動物の再生医療に有用な幹細胞を得ることが可能となる。

１ａ、１ｂ出入口（中空部側）
２ａ、２ｂ出入口（外腔側）
３モジュールケース
４中空糸膜
５、６培養液貯留容器
７細胞培養容器（中空糸膜モジュール）
８、９送液ポンプ
１０、１１廃液回収容器（細胞回収容器）

Claims

動物の歯髄幹細胞を培養する方法であって、
ａ）採取した歯髄をプロテアーゼ溶液で消化して幹細胞を含む細胞懸濁液を得る工程
ｂ）前記細胞懸濁液を中空糸膜の中空部に充填して幹細胞を中空糸膜表面に接着させる工程
ｃ）中空糸膜の中空部に培養液を潅流して幹細胞を培養する工程
を含むことを特徴とする歯髄幹細胞の培養方法。
前記動物がイヌまたはネコであることを特徴とする請求項１に記載の歯髄幹細胞の培養方法。
前記プロテアーゼがコラゲナーゼおよび／またはディスパーゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の歯髄幹細胞の培養方法。
前記中空糸膜が疎水性樹脂のみからなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の歯髄幹細胞の培養方法。
前記培養液が動物血清を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の歯髄幹細胞の培養方法。