CN111909889A - 一种低成本小鼠肠类器官培养基及培养方法 - Google Patents
一种低成本小鼠肠类器官培养基及培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种低成本小鼠肠类器官培养基及培养方法，属于细胞生物技术领域。本发明的小鼠肠类器官的培养基，主要包括基础培养基、293T‑HA‑Rspo1‑Fc细胞上清及添加剂。小鼠肠类器官的培养方法包括以下步骤：小鼠肠预处理制备细胞团；用小鼠肠类器官培养基与基质胶混合液重悬细胞团；将细胞团接种到培养基中进行培养。本发明培养基中添加的细胞因子均为鼠源，更接近体内正常生长状态，有利于类器官的生长于形态结构维持。此外，使用了293T‑HA‑Rspo1‑Fc细胞上清代替昂贵的细胞因子R‑Spondin 1，成本低廉，便于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种低成本小鼠肠类器官培养基及培养方法。
背景技术
人类应用小鼠模型进行生物学医学研究已有超过一百多年的历史。小鼠体型小、繁殖周期短、产仔数量多、容易饲养、遗传资源丰富；小鼠的基因与人类相似度达95％，拥有人类相似的免疫系统及易于进行基因工程与细胞工程的改造，这些优点决定了小鼠模型在生物学医学研究中心得天独厚的优势。然而，即便小鼠动物模型有诸多的优势，却依然存在建模流程繁杂、建模时间长、操作难度大、硬件要求高和建模成本高昂等缺点。
类器官是衍生于干细胞的体外3D培养物。类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细胞培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。类器官作为一种新的研究模型，可操作性好、适宜高通量筛选、培养成本低，能够在段时间内实现大批量生产，极大的弥补了小鼠模型的短板。
小鼠肠类器官主要用于肠道疾病如肠癌、肠道感染和肠道消化吸收功能的研究。虽然多种人源组织的类器官培养方法已有一些报道，但是目前关于小鼠肠类器官的培养方法的研究及报道很少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有培养方法技术的不足，提供一种能够工业化生产、成本低廉的小鼠肠类器官培养基。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种小鼠肠类器官培养基，包含基础培养基和293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清。
优选的，所述基础培养基为DEME/F12培养基。
优选的，所述基础培养基与293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清的重量比为70～95：5～30。
DEME/F12含有较高浓度的营养成分以及多种微量元素，作为无血清配方的基础，适用于克隆密度的培养。
鼠源的293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清内含多种细胞因子。添加293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清使培养环境更接近体内正常生长状态，有利于类器官的生长于形态结构维持。此外，使用293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清代替传统细胞因子能够大幅度降低成本。
优选的，所述小鼠肠类器官培养基，还包含以下含量的成分：
无维生素A型B27 2％～10％；
N-acetylcysteine 0.2～5μmol/L；
Prostaglandin E2 0.1～1μmol/L；
Mouse EGF 10～100ng/mL；
A83-01 1～10μmol/L；
Y27632 5～50μmol/L；
Gastrin I 5～50ng/mL；
青霉素100～500U/mL；
链霉素100～500μg/mL；
两性霉素B 0.5～5μg/mL。
无维生素A型B-27是定制的B-27添加剂，不含维生素A。维生素A能被转化成视黄酸，可以诱导干细胞向神经细胞的分化。不含维生素A的配方是干细胞培养的理想选择。添加青霉素链霉素混合液和两性霉素B可以抑制微生物的生长繁殖，防治污染。
一种小鼠肠类细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜小鼠肠预处理，得到细胞数量为3～50个细胞的细胞团后，离心去除上清，得到细胞团沉淀；
(2)取适量小鼠肠类细胞培养基与基质胶混合，然后用混合液重悬步骤(1)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到培养皿中；
(3)将步骤(2)中的培养皿放入CO2培养箱中静置，轻晃培养皿，当胶滴无明显流动后倒置，待其充分凝固；
(4)在步骤(3)中的培养皿中加入小鼠肠类细胞培养基，恒温培养；
(5)每隔2～3天更换一次液体培养基，培养4～7天后得到小鼠肠类器官。
培养时倒置可以使细胞聚集并防止污染；CO2培养箱可通过控制CO2浓度、温度以及湿度模拟体内环境，使细胞培养环境更加接近体内，有利于细胞的生长。
优选的，所述预处理步骤包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解和过滤。
优选的，所述基质胶为Matrigel基质胶。
优选的，所述步骤(4)中恒温培养为在37℃、5％CO2条件下进行培养。
该培养方法不同于常规的细胞培养方法，采用三维立体培养，模拟体内空间结构及细胞微环境，有利于干细胞增殖及分化的正确调控，形成具有小鼠小肠隐窝、绒毛相似结构的小鼠小肠类器官。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明培养基含有小鼠肠类器官培养所需的最少组分，能够培养来源于小鼠肠正常组织的样本，培养的小鼠肠类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
(2)本发明培养基中细胞因子均为鼠源，且除小鼠表皮生长因子外细胞因子为鼠源细胞293T-HA-Rspo1-Fc细胞系分泌，更接近体内正常生长状态，有利于类器官的生长于形态结构维持。此外，使用293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清代替细胞因子具有大规模生产方便，成本更低的优点。
说明书附图
图1为采用实施例2方法培养的小鼠肠类器官光学显微镜观测图。
图2为采用实施例2方法培养的小鼠肠类器官与正常小鼠肠类器官HE染色图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的，技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
材料说明：
DMEM/F12培养基：动物细胞培养基，购自SIMGA公司。
无维生素A型B27：可维持小鼠来源的神经元，促进其分化，购自Gibco公司。
N-acetylcysteine：乙酰半胱氨酸酰胺，购自SIMGA公司。
Prostaglandin E2：前列腺素E2，购自SIMGA公司。
Mouse EGF：小鼠表皮生长因子，购自SIMGA公司。
A83-01：选择性小分子抑制剂，购自SIMGA公司。
Y27632：ROCK通路抑制剂Y27632，购自SIMGA公司。
Gastrin I：胃泌素I，购自生工生物工程(上海)公司。
青霉素：抗生素，购自生工生物工程(上海)公司。
链霉素：抗生素，购自生工生物工程(上海)公司。
两性霉素B：抗生素，购自生工生物工程(上海)公司。
实施例1
一种小鼠肠类器官培养基，包含以下成分：
DMEM/F12培养基：90％；
293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清：5％；
无维生素A型B27添加剂：2％；
乙酰半胱氨酸酰胺0.2μmol/L；
前列腺素E2 0.1μmol/L；
小鼠表皮生长因子10ng/mL；
选择性小分子抑制剂A83-01 1μmol/L；
ROCK抑制剂Y27632 5μmol/L；
胃泌素I 5ng/mL；
青霉素：100U/mL；
链霉素：100μg/mL；
两性霉素B 0.5μg/mL。
一种小鼠肠类器官的培养方法为：
(1)取新鲜小鼠肠预处理，得到细胞数量为3个细胞的细胞团后，离心去除上清，得到细胞团沉淀；
(2)取适量上述培养基与基质胶混合，然后用混合液重悬步骤(1)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到60mm培养皿中，每滴约50μl；
(3)将步骤(2)中的培养皿放入CO2培养箱中，静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，放置30min待其充分凝固；
(4)在步骤(3)中的培养皿中加入上述培养基，然后置于恒温培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养；
(5)每隔3天更换一次液体培养基，培养7天后得到小鼠肠类器官。
实施例2
一种小鼠肠类器官培养基，包含以下成分：
DMEM/F12培养基：70％；
293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清：25％；
无维生素A型B27添加剂：4％；
乙酰半胱氨酸酰胺2μmol/L；
前列腺素E2 0.5μmol/L；
小鼠表皮生长因子60ng/mL；
选择性小分子抑制剂A83-01 5μmol/L；
ROCK抑制剂Y27632 25μmol/L；
胃泌素I 25ng/mL；
青霉素：200U/mL；
链霉素：100μg/mL；
两性霉素B 2.5μg/mL。
一种小鼠肠类细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜小鼠肠预处理，得到细胞数量为30个细胞的细胞团后，离心去除上清，得到细胞团沉淀；
(2)取适量上述培养基与基质胶混合，然后用混合液重悬步骤(1)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到培养皿中；
(3)将步骤(2)中的培养皿放入CO2培养箱中静置，轻晃培养皿，当胶滴无明显流动后倒置，待其充分凝固；
(4)在步骤(3)中的培养皿中加入上述培养基，恒温培养；
(5)每隔3天更换一次液体培养基，培养6天后得到小鼠肠类器官。
实施例3
一种小鼠肠类器官培养基，包含以下成分：
DMEM/F12培养基：85％；
293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清：5％；
无维生素A型B27添加剂：10％；
乙酰半胱氨酸酰胺5μmol/L；
前列腺素E2 1μmol/L；
小鼠表皮生长因子100ng/mL；
选择性小分子抑制剂A83-01 10μmol/L；
ROCK抑制剂Y27632 50μmol/L；
胃泌素I 50ng/mL；
青霉素：500U/mL；
链霉素：500μg/mL；
两性霉素B 5μg/mL。
一种小鼠肠类细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜小鼠肠预处理，得到细胞数量为50个细胞的细胞团后，离心去除上清，得到细胞团沉淀；
(2)取适量小鼠肠类细胞培养基与基质胶混合，然后用混合液重悬步骤(1)得到的细胞团沉淀，再用移液器将混有细胞的凝胶滴到培养皿中；
(3)将步骤(2)中的培养皿放入CO2培养箱中静置，轻晃培养皿，当胶滴无明显流动后倒置，待其充分凝固；
(4)在步骤(3)中的培养皿中加入小鼠肠类细胞培养基，恒温培养；
(5)每隔2天更换一次液体培养基，培养4天后得到小鼠肠类器官。
效果例1
使用光学显微镜对采用实施例2的方法培养的小鼠肠类器官进行观察，结果如图1。从图中可以看出培养出的小鼠肠类器官结构完整，呈现出囊状出芽结构，出芽部位结构与正常小鼠肠组织的隐窝结构相似，这说明本发明培养的小鼠肠类器官维持了原发组织的结构形态。
效果例2
采用HE染色法对采用实施例2的方法培养的小鼠肠类器官和正常小鼠肠类器官进行染色，结果如图2。从图中可以看出，两者的隐窝结构具有高度相似性，这说明本发明培养的类器官维持了原发组织的形态结构特征。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种低成本小鼠肠类器官培养基，其特征在于，包含基础培养基和293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清。
2.根据权利要求1所述小鼠肠类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为DEME/F12培养基。
3.根据权利要求1所述小鼠肠类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基与293T-HA-Rspo1-Fc细胞上清的重量比为70～95:5～30。
4.根据权利要求1所述小鼠肠类器官培养基，其特征在于，还包含以下成分：
无维生素A型B27 2％～10％；
乙酰半胱氨酸酰胺0.2～5μmol/L；
前列腺素E2 0.1～1μmol/L；
小鼠表皮生长因子10～100ng/mL；
选择性小分子抑制剂A83-01 1～10mol/L；
ROCK抑制剂Y27632 5～50μmol/L；
胃泌素I 5～50ng/mL；
青霉素100～500U/mL；
链霉素100～500μg/mL；
两性霉素B 0.5～5μg/mL。
5.一种小鼠肠类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取小鼠肠预处理，离心去除上清，得到细胞团沉淀；
(2)取所述小鼠肠类器官培养基与基质胶制得混合液，然后用混合液重悬步骤(1)得到的细胞团沉淀，并转移到培养皿中；
(3)将步骤(2)中的培养皿放入CO2培养箱中培养；
(4)在步骤(3)中的培养皿中加入所述小鼠肠类器官培养基，恒温培养；
(5)定期更换培养基，最终得到小鼠肠类器官。
6.根据权利要求5所述小鼠肠类器官的培养方法，其特征在于，所述基质胶为Matrigel基质胶。
7.根据权利要求6所述小鼠肠类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中恒温培养为在37℃、5％CO2条件下进行培养。
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