WO2008019783A1 - Verfahren zur identifizierung von stickstoffmonoxid modulatoren - Google Patents

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the invention relates to methods for the identification of substances which modulate the release of nitric oxide (NO) from NO-producing cells and can be identified by means of a NO-sensitized reporter gene cell line in co-culture with a NO-producing cell.
  • NO-releasing cells are, for example, cells expressing the endothelial nitric oxide synthase eNOS (e.g., endothelial cells) that are inducible
  • Nitric oxide synthase iNOS e.g., macrophages
  • the new methods are characterized by high sensitivity and low susceptibility to interference and can be easily automated and miniaturized.
  • the methods can be used particularly advantageously in the field of medical diagnostics and biomedical research, including pharmaceutical drug discovery.
  • Nitric oxide is a metabolite of the enzymatic reaction of L-arginine with nitric oxide synthase (NOS, EC 1.14.13.39), whereby besides L-nitric oxide, L-gcrulline is also formed by difunctional membranes it may pass from the synthesizing cell into directly adjacent cells.
  • NOS nitric oxide synthase
  • nitric oxide can only have a locally limited effect, since it is converted into nitrates or nitrites in the extracellular space immediately via oxygen and water and therefore has an extremely short half-life of 5-10 s.
  • nitric oxide synthase The activity of a nitric oxide synthase is controlled by many biological regulatory mechanisms; For example, endothelial nitric oxide synthase is modulated, among other receptor-induced via calcium ions, which involves a translocation and activation step.
  • the regulation of nitric oxide synthases involves a large number of other enzymes and biological signal steps which are the subject of biomedical research and can serve as starting points for a therapeutic intervention for the treatment of nitric oxide-mediated diseases.
  • the aim of the drug development is therefore to find selective inducers of the respective NOS.
  • nitric oxide gas or nitric oxide releasing organic compounds such as glyceron nitrate.
  • therapy with NO-delivering substances plays a major role in the treatment of heart disease.
  • Nitroglycerin and other organic nitrates that release nitric oxide in the body are indispensable long-term therapeutics for the treatment of angina pectoris and heart failure, as well as life support for immediate onset acute infarction.
  • Nitric oxide acts as a peripheral neurotransmitter, eg in the improvement of cognitive abilities in neurodegenerative diseases. Toxic effects of NO, due to pathological activation of NO synthases, find their expression in infections and inflammations (septic shock, rheumatoid arthritis, etc.).
  • the aim of the drug development is therefore also to find selective inhibitors of inducible NOS.
  • Therapeutic interventions are currently possible mainly by NOS-unspecific substrate inhibitors, eg ⁇ ⁇ -methyl-L-arginine or L-6-thiocitrulline derivatives.
  • Therapeutic approaches that selectively modulate the pathologically altered endogenous NO production would allow a more targeted therapy.
  • nitric oxide The physiological functions of nitric oxide range from the regulation of blood pressure, the inhibition of platelet aggregation, wound healing, neuronal signal transmission (brain and peripheral autonomic nerves) to the inactivation of bacteria, parasites and tumor cells.
  • Pathologically altered concentrations of nitric oxide are co-responsible for a number of diseases, e.g. endothelial dysfunction, septic shock, stroke, arthritis, migraine, neurodegenerative diseases (e.g., Alzheimer's disease, multiple sclerosis) or chronic inflammation.
  • Methods for the detection and quantification of nitric oxide can therefore be used in various fields, of particular interest is the use in the field of medical diagnostics and biomedical diagnostics, in particular drug discovery and drug research.
  • Known stimulators of nitric oxide formation in endothelial cells are, for example, the peptide bradykinin or the messenger histamine. By activating a cell surface receptor, these substances subsequently cause the rapid activation of an intracellular signaling cascade, which ultimately leads to the activation of eNOS and thus to nitric oxide formation [R. Govers and TJ. Rabe link; At J Physiol Renal Physiol. 2001; 280 (2): F193-206]. These processes are fast.
  • Known stimulators of nitric oxide formation in immune cells are, for example, the lipopolysaccharide LPS. By activating a cell-surface receptor, these substances subsequently induce the transcriptional activation of iNOS and thus nitric oxide formation [Kleinert et al .; Biol Chem. 2003; 384 (10-l 1): 1343].
  • a known inhibitor of nitric oxide formation in immune cells is, for example, interleukinol. By activating a cell-surface receptor, this substance subsequently inhibits iNOS activity and thus reduces nitric oxide formation in immune cells [Dugas N et al., Cytokines. 1998; 10 (9): 680].
  • Methods for measuring NO release from cells in high throughput pharmaceutical screening should be readily automated and miniaturized to limit the cost of reagents and test substances.
  • the lowest possible susceptibility to the detection of even low amounts of NO as high sensitivity and to achieve a high data quality is desirable.
  • the prior art discloses various methods for detecting nitric oxide or N ⁇ S activity.
  • the resulting radioactive L-citrulline is a measure of nitric oxide and is separated from unreacted radioactive L-arginine via an ion exchanger and quantified.
  • the methods involve several complex steps and are therefore difficult to automate.
  • the high reagent costs are disadvantageous.
  • Nims, RW, et al. 1996. Methods Enzymol. 268, 93 and Amano F, 1995. FEBS Letters 368 (3), 425 describe coupled chemical detection methods for nitric oxide. The methods are based on the Griess-Hosvay reaction for the determination of nitrites. In processes based on the fact that the short-lived nitrogen monoxide of the test sample to be examined is oxidized by oxygen to nitrates and nitrites. For the quantitative determination of nitrogen monoxide, the resulting nitrate must also be reduced to nitrite by means of nitrate reductase.
  • nitrites The detection of nitrites is carried out by a reaction with sulphanilic acid and 1-naphthylamine which leads to an azo dye which can be determined colorimetrically.
  • the problem is the low sensitivity and susceptibility of these detection methods, in particular by nitrites and - A -
  • Nitrates for example, which does not allow this method to be used in combination with conventional tissue culture media.
  • US 6,306,609 (Bl) and US 5,358,703 (A) describe methods for detecting nitric oxide based on paramagnetic resonance spectroscopy. These are typically not suitable for high throughput screening. Disadvantages of these processes are the high reagent costs or the expenditure on equipment, which considerably limits their use in the area of pharmaceutical drug discovery, including pharmaceutical high-throughput screening.
  • US 5,248,616 (A, X6) describes methods for detecting nitric oxide based on a permeable membrane and a gas analyzer. Substantial limitations on the use of these methods in the field of pharmaceutical drug discovery, including pharmaceutical high-throughput screening, arise from the high equipment costs and problems in miniaturization.
  • Nitric oxide detections by means of fluorescent dyes are also known in the prior art; In these processes, nitric oxide reacts with a fluorogenic dye, which changes its spectral properties after the reaction.
  • the quantification of the fluorescence serves as a measure of the nitrogen monoxide concentration [described, for example, in US Pat. No. 6,201,134 (Bl, X6), US Pat. No. 6,469,051 (B2, X6), US Pat. No. 6,756,231 (Bl), US 2004/0147035 (A1), US 2001/0001800 (Al) and EP 1000941 (B1)].
  • Such a method is described, for example, by Berkels, R., et al. 2000. Cell Calcium 27, 281.
  • DAF-2 DA 4,5-diaminofluorescein diacetate
  • cGMP cyclic 3 '-5' -Guanosinmonophosphat
  • the guanylyl cyclase (E.C: 4.6.1.2) is used, which catalyzes the conversion of guanosine triphosphate to cGMP and pyrrophosphate. Since nitric oxide is an activator of soluble guanylyl cyclase, the amount of cGMP produced can be used as a measure of the short-lived nitric oxide [US 2005/0112717 (Al) and WO 2005/052185 (Al)].
  • guanylyl cyclase-based method a cell culture of guanylyl cyclase overexpressing RFL-6 cells is used [Ishii et al, Am J Physiol. 1991; 261 H598-603].
  • a test sample to be examined for nitrogen monoxide must be transferred as quickly as possible to a sample vessel in which a culture with RFL-6 cells was used.
  • the amount of cGMP formed is used.
  • Various immunoassays using cGMP-specific antibodies are known for the determination of cGMP.
  • the detection of the cGMP formed is carried out indirectly via the displacement and quantification of a bound to the antibody probe, such as iodine isotope radiolabelled cGMP (Competitive Immunoassay).
  • a bound to the antibody probe such as iodine isotope radiolabelled cGMP (Competitive Immunoassay).
  • Disadvantages of this process are the high reagent costs or the preparative expenditures for providing the required antibodies.
  • the methods comprise complicated work steps, in particular time-critical transfer steps and complicated washing procedures, which make efficient automation considerably more difficult; this severely restricts the use of these methods in high-throughput experiments such as high throughput pharmaceutical screening.
  • the invention is based on the object to overcome the disadvantages and limitations of the prior art and to provide a method for the identification of substances that modulate the release of nitric oxide from NO-producing cells, which is characterized by high sensitivity and low susceptibility can be easily automated and miniaturized and are particularly suitable for high-throughput screening (HTS).
  • the object is achieved by means of a method for the identification of substances which modulate the release of nitric oxide from NO-producing cells by means of a cellular reporter gene assay.
  • the invention relates to methods for the identification of substances which modulate the release of nitric oxide from NO-producing cells, comprising the following steps:
  • Substances which modulate the release of nitric oxide from NO-producing cells are inhibitors, activators or substances which act synergistically with activators or inhibitors on NO release.
  • composition used in step (a) of the method of the invention in a preferred embodiment, is the use of non-recombinant and recombinant cells characterized by producing and releasing nitric oxide, for example, selected but not limited by endothelial cells , Glial cells, macrophages, neutrophils or immortalized cells derived therefrom.
  • nitric oxide-producing cells are eukaryotic or prokaryotic cells stably or transiently transfected with a eukaryotic NOS, for example with eNOS, iNOS or nNOS.
  • endothelial cells are selected from, but not limited to, HUVEC, BAEC, HMVEC-dLyAd (Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells, Adult), HMVEC-dLyNeo (Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells, Neonatal), HMVEC-LB1 (Lung Blood Microvascular Endothelial Cells), HMVEC-LLY (Lung Lymphatic Microvascular Endothelial Cells), bAEC (Bovine Aortic Endothelial Cells), bAEC (Bovine Aortic Endothelial cells, pooled), bovine coronary artery endothelial cells (bCAEC), bovine pulmonary endothelial cells (bPE), aortic endothelial cells (HAEC), coronary artery endothelial cells (HCAEC), illiac artery endothelial cells (HIAEC), HMVEC-Bd ( Human Micro
  • composition used in step (b) of the method according to the invention is, in a preferred embodiment, the use of a recombinant cell characterized by being capable of detecting nitric oxide, for example, but not limited to, introducing a mutant variant of guanylyl cyclase, which synthesizes cyclic adenosine monophosphate (cAMP) from adenosine triphosphate (ATP) in place of nitric oxide instead of cGMP [Sunahara et al., J. Biol. Chem., 1998, 237, 16332].
  • cAMP cyclic adenosine monophosphate
  • ATP adenosine triphosphate
  • the amino acid arginine 592 of the alpha subunit can be replaced by glutamine, the beta subunit glutamate 473 amino acids by lysine, and the beta subunit cysteine 541 by aspartate to convert the reaction product of cGMP to cAMP to change.
  • the cAMP formed is determined using a cAMP-sensitive reporter gene construct consisting of a reporter gene which is functionally linked to a cAMP-responsive promoter element and is sensitive to intracellular cAMP.
  • the cAMP-responsive promoter element is a CRE (cAMP responsive element, Fink, JS et al., Proc Natl Acad Sci.
  • inducible promoter which contains one or more CRE Contains elements.
  • CRE elements Preferably, a combination of one or more CRE elements and one or more MREs (Multiple Response Element, Ray A, et al., Mol Cell Biol. 1989; 9 (12): 5537) may also be used as the cAMP-responsive promoter element.
  • the reporter construct may additionally contain other transcriptional control elements, such as fragments from viral promoters, as well as selectable markers to generate stable cell lines.
  • the introduction of the mutant guanylyl cyclase required for the detection of nitric oxide and the reporter gene construct into a cell to be used can be carried out with commercially available transfection agents.
  • the detector cell can transiently express these components or a detector cell can be made to preferentially stably express both components.
  • a stably transfected cell can be generated with commercially available selection markers.
  • Reporter genes the erf ⁇ ndungshiel
  • Firefly luciferase from Photinus pyralis, beta galactosidase, green fluorescent protein (GFP), beta-lactamase, aequurin from Aequorea victoria, CAT (chloramphenicol transferase), and Renilla luciferase, and others are selected from, but not limited to Genes and their gene products that can catalyze luminescent or fluorescent reactions.
  • Such a cell is described, for example, in Corazza et al., Assay Drug Dev Technol. 2006; 4 (2): 165 or described in WO 2006/007937.
  • a host cell for example, a CHO, HELA, MDCK or HEK293 cell can be used; for example, they are available from the American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA.).
  • step (c) of the inventive method in a preferred embodiment, the joint application and cultivation of the NO-producing cell and the detector cell in a sample vessel in a mixing ratio of 10-fold excess up to 10-fold deficiency of the detector cell to NO-producing cell, with the range of 5-fold excess up to 5-fold deficiency being more preferred and the range of 2-fold excess up to 2-fold deficiency of the detector cell being most preferred.
  • To bring into contact means that the cells can be cultured together (co-culture), whereby first the one and then the second cell are applied in the same test vessel, or that the cells are mixed before application, or that the cells are semipermeable Membrane be brought into contact.
  • composition used in step (c) of the process according to the invention may contain additional components, for example reducing agents, especially those which scavenge superoxide anions and hyperoxide anions, proteins, in particular those which trap superoxide anions and hyperoxide anions, or other substances, which can amplify the signal of the reporter gene, especially those which can stabilize cAMP.
  • reducing agents especially those which scavenge superoxide anions and hyperoxide anions
  • proteins in particular those which trap superoxide anions and hyperoxide anions, or other substances, which can amplify the signal of the reporter gene, especially those which can stabilize cAMP.
  • reducing agents are ascorbate or chemical superoxide dismutase mimetics such as manganese (IH) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride (MnTBAP chloride).
  • IH manganese
  • MnTBAP chloride manganese tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride
  • proteins are Cu / Zn-dependent superoxide dismutase or Mn-dependent superoxide dismutase.
  • phosphodiesterase inhibitors such as 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX).
  • the substance to be tested in step (d) may be, for example, a chemical substance, which is preferably a low molecular weight substance, particularly preferably having a molecular weight of 100 Da to 600 Da, be a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid, such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product.
  • a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, particularly preferably having a molecular weight of 100 Da to 600 Da
  • a protein an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid, such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product.
  • the resulting nitric oxide forms rapidly, typically within seconds or minutes.
  • the nitric oxide formed usually has a very short half-life, typically a half-life of several seconds.
  • the erf ⁇ ndungssiee method allows by cocultivation of nitrogen monoxide-releasing cell and detector cell a particularly efficient and lossless detection of nitrogen monoxide and thus a low susceptibility ..
  • the subsequent induction of the reporter gene claimed a longer period of time, typically several hours.
  • step (e) has several advantages, on the one hand facilitates the temporal separation of the substance addition in step (d) or the generation of nitrogen monoxide and the detection of the reporter gene in step (e), the automation of the process and reduces the complexity of the apparatus to be used.
  • the use of a reporter gene causes integration over the entire released nitric oxide and amplification of the signal, thus increasing the sensitivity of the process.
  • a NO release-inhibiting substance may directly inhibit NOS or act by inhibiting an NOS-activating step.
  • a substance which only indirectly stimulates NO release may act by inhibiting a negative feedback mechanism of an NOS.
  • a substance that only indirectly stimulates NO release can also act by inducing the transcription and / or translation of an NOS.
  • the substance to be tested in step (b) may be, for example, a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid , such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product.
  • a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid , such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product.
  • the second substance to be tested in step (e) may be, for example, a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of from 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a Nucleic acid, such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product and is typically a known modulator of an NOS.
  • a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of from 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a Nucleic acid, such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product and is typically a known modulator of an NOS.
  • step (e) of the invention another known NO release activating substance may be added subsequently in step (e).
  • a substance which only indirectly stimulates NO release may act by inhibiting a negative feedback mechanism of an NOS.
  • stimulatory substance may also act by inducing transcription and / or translation of an NOS.
  • a NO release-inhibiting substance may directly inhibit NOS or act by inhibiting an NOS-activating step.
  • a further subject of the invention are methods for the identification of substances which modulate the release of nitric oxide from NO-producing cells, comprising the following stages:
  • the substance to be tested in step (d) may be, for example, a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of from 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid , such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product.
  • a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of from 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid , such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product.
  • the second substance to be tested in step (e) may be, for example, a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product and is typically a known modulator of an NOS.
  • a chemical substance which is preferably a low molecular weight substance, more preferably having a molecular weight of 100 Da to 600 Da, a protein, an antibody, a peptide, an enzyme, a nucleic acid such as a cDNA, an RNA, an RNAi molecule or an antisense nucleotide, an aptamer or a natural product and is typically a known modulator of an NOS.
  • a substance which only indirectly stimulates NO release may act by inhibiting a negative feedback mechanism of an NOS.
  • a substance that only indirectly stimulates NO release can also act by inducing the transcription and / or translation of an NOS.
  • a NO release-inhibiting substance may directly inhibit NOS or act by inhibiting an NOS-activating step.
  • the process according to the invention is carried out in a homogeneous phase.
  • the method according to the invention can be particularly easily automated and miniaturized.
  • the substance to be tested is added to the cells in aqueous solution, to increase the solubility of the substances solubilizing agents such as DMSO can be added.
  • solubilizing agents such as DMSO can be added.
  • transfection agents can be used for transfection with nucleic acids.
  • the combination of the cells and the combination of the cells with the substances to be tested can be carried out with commercially available liquid handling systems.
  • suitable devices are pipetting devices, including micropipettors and parallel pipettors, dispensing devices, including piezo effect based systems, bubble jet systems, and valve control dispensers and transfer devices, including pin-tool based systems.
  • the processes according to the invention can be carried out in commercially available reaction vessels, preferably microtiter plates with 96, 384 or 1536 wells.
  • the measurement of the detection signal in step (e) of the inventive method can be carried out with commercially available measuring devices.
  • luminogenic reporter genes are the luciferases from Photinus pyralis or from Renilla. Depending on the choice of the luminogenic substrate, it may be necessary to lyse the cells before starting the measurement in order to ensure substrate saturation of the reporter gene product.
  • fluoresent reporter genes is GFP.
  • the measurement data can be graphically interpolated or approximated by a mathematical algorithm and electronic processing. From the derived correlation, the detection signal measured for a test sample can be directly a
  • the erf ⁇ ndungswashen methods can be used advantageously in various areas; Of particular interest is the use in the field of biomedical research, in particular drug discovery and drug discovery.
  • the processes according to the invention can be carried out in a homogeneous phase and in a few simple processing stages; This makes them ideal for automation and miniaturization.
  • the automated use of the methods according to the invention may be of importance in the field of biomedical research, in particular pharmaceutical drug discovery;
  • large substance libraries with sometimes more than one million substances are regularly screened using automated procedures (high-throughput screening, high throughput screening);
  • the miniaturization, the high sensitivity and the low susceptibility to interference are particularly advantageous in this application.
  • the miniaturization of the test formats and the high sensitivity reduce the expenses for the production or procurement of reagents as well as the consumption of test substances. Low susceptibility usually leads to high data quality and good reproducibility of the test results.
  • the screening is typically directed to the identification of modulators of biological activity that could be the target of medical therapy.
  • Biological activities using nitric oxide as a messenger include, for example, endothelium-mediated vascular relaxation, macrophage-induced killing of invading microorganisms, neuronal signal transduction in the brain and peripheral autonomic nerves, platelet aggregation, tumor progression and metastasis, or wound healing.
  • the methods of the present invention are eminently suitable for use in high throughput pharmaceutical screening, especially for finding modulators of enzymes and receptors that regulate nitric oxide formation; For example, modulators of the enzyme activity of NOS or their direct or indirect regulators are of particular interest.
  • nitric oxide formation of a cell to be tested is determined by one of the inventive method described above in the presence of one or more suitable concentrations of a test substance, compared with the nitric oxide formation in the absence of the test substance and derived therefrom, the modulating properties of the test substance in a known manner.
  • derived properties of a test substance are the activating or inhibiting effect on the activity studied.
  • the methods of the invention can also be used for further characterization of the signaling pathway that leads to nitric oxide formation, for example, finding a new modulator by siRNA or cDNA technology or combining these methods with chemical substances.
  • Fig. 1 Principle of the co-culture assay
  • Assay principle consisting of a NO-producing cell and a detector cell. Released NO diffuses into detector cell and regulates the expression of a reporter gene.
  • sGCmut is a modified soluble guanylyl cyclase that can catalyze the reaction of ATP in cAMP.
  • CRE Luci is a reporter gene construct that controls cAMP-dependent expression of luciferase.
  • FIG. 2 NO release of a HUVEC measured via a reporter gene detector cell.
  • FIG. 3 NO release of a HUVEC cell measured via a reporter gene detector cell.
  • Signal of various substances induced NO release measured by luminescence of a reporter gene, control (ctrl) contained only buffer. Used substances were used at the concentrations indicated. Cells were incubated with (hatched bars) and without (open bars) the sGC inhibitor ODQ. RLU (Relative Light Units).
  • Fig. 4 NO release of a BPAEC cell measured via a reporter gene detector cell
  • DRC Dose-response relationship
  • Fig. 5 NO release of a HUVEC cell modulated by a synergistic stimulator measured via a reporter gene detector cell
  • the CHOsGCmut detector cell was mixed with primary human umbilical endothelial cells (HUVEC) in a 2: 1 ratio and 15,000 cells per well
  • the culture medium was replaced with 50 ⁇ l Tyrode.
  • the Tyrode contained, as illustrated in Figs. 2 and 3, either no additives or
  • the example shows that the NO-releasing substances ATP, histamine and A23187 cause a significant signal increase of the reporter gene with respect to the control sample in which only Tyrode with 0.25% DMSO was added. Furthermore, the examples in Figures 2 and 3 show that preincubation of the cell mixture with L-NAME or ODQ does not result in a significant increase in the reporter gene signal. L-NAME inhibits eNOS and ODQ inhibits sGC. The results show that the assay format selectively detects released NO. As a further control forskolin or BAY 41-2272 was used. The examples also show that inhibitors and activators of NO release can be identified with this method. Example 2
  • the detector cell CHOsGCmut was mixed with primary bovine pulmonary artery endothelial cells (BPAEC) in the ratio 2: 1 and 7500 cells per well in a 96-well MTP in 100 ⁇ l
  • BPAEC primary bovine pulmonary artery endothelial cells
  • Tyrode as illustrated in Figure 4, contained increasing concentrations of the NO-releasing substance
  • the example shows that the NO-releasing substances ATP and bradykinin bring about a significant and stable signal increase of the reporter gene and that the assay can be used for identification and characterization.
  • the detector cell CHOsGCmut was mixed with HUVEC cells in the ratio 2: 1 and seeded 15,000 cells per well in a 96-well MTP in 100 ⁇ l culture medium (EGM-2 with 2% FBS).
  • Sepiapterin (Sigma, Cat. No. S 154) was added at a final concentration of 10 ⁇ M ( Figure 5 gray bars). After a further 24 h under standard culture conditions, the culture medium was replaced by 50 ⁇ l Tyrode. The Tyrode either contained no additives as illustrated in Figure 5 or was spiked with the eNOS inhibitor L-NAME at a final concentration of 10 ⁇ M ( Figure 5 hatched bars). After incubation for 30 minutes, 50 ⁇ l of a test substance dissolved in Tyrode was added, as illustrated in FIG. 5, the NO-releasing substance A23187 was used. To improve the solution, a final concentration of 0.25% DMSO v / v was used.
  • the assay can be used to identify and characterize direct and synergistic substances.
  • the detector cell CHOsGCmut was mixed with HUVEC cells in the ratio 2: 1 and seeded 15,000 cells per well in a 96-well MTP in 100 ⁇ l culture medium (EGM-2 with 2% FBS). After 48 h under standard culture conditions, the culture medium was replaced by 50 ⁇ l Tyrode.
  • the Tyrode as illustrated in Figure 6, either contained no additives or was supplemented with superoxide dismutase (SOD) (Sigma, Order No. S5395) at a final concentration of 10 U / ml ( Figure 6 hatched bars). After incubation for 30 minutes, 50 ⁇ l of a test substance dissolved in Tyrode were added, as illustrated in FIG.
  • the NO-releasing substances ATP, histamine and A23187 were used.
  • a final concentration of 0.25% DMSO v / v was used.
  • 50 ⁇ l of a luciferin / Triton solution were pipetted in to detect the luciferase signal and the resulting luminescence was measured with a CCD camera (30 sec. At high sensitivity).
  • the example shows that the NO-releasing substances can cause significant and stable signal enhancement of the reporter gene and the NO release by SOD can be increased.
  • the assay can be used to identify and characterize direct and synergistic substances.
  • CHOsGCmut was cultured in DMEM / F12 (Invitrogen, Order No. 21331-020), 2% Glutamax (Invitrogen, Order No. 35050-087), 10% FBS (Invitrogen, Order No. 10082-147), 1% PenVStrep (Invitrogen, p / n 15070-063), 2% HEPES (Invitrogen, p / n 15630-122), sodium pyruvate (Invitrogen, p / n 11360-039) and 2% sodium bicarbonate (Invitrogen, Order No. 25080-102) cultured (all data in v / v). The cells were harvested and used for the experiments when they reached 70-80% confluency.
  • HUVEC cells (Cambrex, order No. CC-2519) were cultured in EGM-2 (Cambrex, order number CC-3162) according to the manufacturer's instructions.
  • BPAEC cells (Cambrex, Betsell No. BW-6004) were cultured in EGM-MV (Cambrex, order No. CC-3125) according to the manufacturer's instructions.
  • Substances used and buffer ODQ (Sigma, Order No. 03636), Bay41-2272 (Alexis, Order No. ALX-420-030), histamine (Fuka, Order No. 53290), ATP (Sigma, Order No. A6419),
  • KCl 5 mM NaHCO 3 and 20 mM HEPES, pH 7.4), luciferin / Triton solution (530 ⁇ M ATP, 470 ⁇ M luciferin, 270 ⁇ M coenzyme A, 20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO 4 , 33.3 mM DTT, 0.1mM EDTA, 15% Triton, 10% glycerol, 25mM Na 2 HPO 4 , 25mM TRIS-HCl, pH 7.8) Luciferin (Sigma,

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) aus NO-produzierenden Zellen modulieren, und mittels einer NO-sensitisierten Reportergen-Zelllinie in Kokultur mit einer NO-produzierenden Zelle identifiziert werden können. Besonders vorteilhaft können die Verfahren im Bereich der biomedizinischen Forschung, einschließlich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, eingesetzt werden.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Stickstoffmonoxid Modulatoren
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) aus NO-produzierenden Zellen modulieren, und mittels einer NO- sensitisierten Reportergen-Zelllinie in Kokultur mit einer NO-produzierenden Zelle identifiziert werden können. NO-freisetzende Zellen sind beispielsweise Zellen, welche die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase eNOS (z.B.Endothelzellen), die induzierbare
Stickstoffmonoxidsynthase iNOS (z.B. Macrophagen) oder welche die neuronale Stickstoffmonoxidsynthase nNOS exprimieren. Die neuen Verfahren zeichnen sich durch hohe Sensitivität und geringe Störanfälligkeit aus und lassen sich leicht automatisieren und miniaturisieren. Besonders vorteilhaft können die Verfahren im Bereich der medizinischen Diagnostik und der biomedizinischen Forschung, einschließlich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, eingesetzt werden.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein Metabolit der enzymatischen Reaktion von L-Arginin mit Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS; EC 1.14.13.39), wobei außer Stickstoffmonoxid auch L- Gkrullin- gebildet-wird— Da-Stkkstoffmonctxid-dureh^kJθgisGhe-Membranen-difftmdieren-kann— gelangt es aus der synthetisierenden Zelle in direkt benachbarte Zellen. Stickstoffmonoxid kann allerdings nur lokal begrenzt wirken, da es im extrazellulären Raum sofort über Sauerstoff und Wasser in Nitrate bzw. Nitrite umgewandelt wird und daher eine äußerst kurze Halbwertzeit von 5-10 s aufweist. Die Aktivität einer Stickstoffmonoxid-Synthase wird durch viele biologische Regelmechanismen kontrolliert; zum Beispiel wird die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter anderem Rezeptor-induziert über Kalzium-Ionen moduliert, welche eine Translokations- und Aktivierungsschritt beinhaltet. An der Regulation der Stickstoffmonoxid-Synthasen sind eine Vielzahl weiterer Enzyme und biologischer Signalschritte involviert, die Gegenstand der biomedizinischen Forschung sind und als Ansatzpunkte einer therapeutischen Intervention zur Behandlung Stickstoffmonoxid-vermittelter Erkrankungen dienen können. Ziel der Arzneimittelentwicklung ist es deshalb auch, selektive Induktoren der jeweiligen NOS zu finden.
Gängige Therapieansätze verwenden zurzeit Stickstoffmonoxid-Gas oder Stickstoffmonoxidfreisetzende organische Verbindungen wie Glyceronitrat. Zum Beispiel spielt die Therapie mit NO-liefernden Substanzen eine tragende Rolle in der Behandlung von Herzkrankheiten. Nitroglycerin und andere organische Nitrate, die im Körper Stickstoffmonoxid freisetzen, sind unentbehrliche Langzeit-Therapeutika bei der Behandlung von Angina pectoris und Herzinsuffienz, aber auch zur lebenserhaltenden Soforttherapie bei akutem Infarkt. Stickstoffmonoxid agiert als peripherer Neurotransmitter, z.B. bei der Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten bei neurodegenerativen Erkrankungen. Toxische Effekte von NO, infolge von pathologischen Aktivierung von NO-Synthasen, finden ihren Ausdruck in Infektionen und Entzündungen (septischer Schock, rheumatoide Arthritis usw.). Ziel der Arzneimittelentwicklung ist es deshalb auch, selektive Inhibitoren der induzierbaren NOS zu finden. Therapeutische Interventionen sind derzeit hauptsächlich durch NOS-unspezifsiche Substratinhibitoren möglich, z.B. Λ^-Methyl-L-arginin oder L-6-Thiocitrullin-Derivate. Therapeutische Ansatzpunkte, die die selektiv die pathologisch veränderte endogene NO- Produktion modulieren, würden eine gezieltere Therapie ermöglichen.
Die physiologische Funktionen des Stickstoffmonoxid reichen von der Regulation des Blutdrucks, der Hemmung der Blutplättchenaggregation, der Wundheilung, der neuronalen Signalübertragung (Gehirn u. periphere autonome Nerven) bis hin zur Inaktivierung von Bakterien, Parasiten und Tumorzellen. Pathologisch veränderte Konzentrationen von Stickstoffmonoxid werden für eine Reihe von Krankheiten mitverantwortlich gemacht, z.B. endotheliale Dysfunktion, septischer Schock, Schlaganfall, Arthritis, Migräne, neurodegenerative Erkrankungen (z.B .Alzheimer, Multiple Sklerose) oder chronische Entzündungen. Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Stickstoffmonoxid können daher in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden, von besonderem Interesse ist die Verwendung im Bereich der medizinischen Diagnostik und der biomedizinischen Diagnostik, insbesondere der Wirkstoffforschung und der Arzneimittelforschung. Im Bereich der biomedizinischen Forschung, insbesondere der pharmazeutischen Wirkstoffforschung werden zur Auffindung neuer Wirkstoffe regelmäßig große Substanzbibliotheken mit teilweise mehr als einer Million Substanzen mit Hilfe automatisierter Verfahren durchgemustert (Hochdurchsatz Screening, High Throughput Screening). Dabei richtet sich das Screening typischerweise auf die Identifizierung von Modulatoren einer biologischen Aktivität, beispielsweise einer Enzym- oder Rezeptoraktivität, welche das Ziel einer medizinischen Therapie sein könnte. Biologische Aktivitäten, welche Stickstoffmonoxid als Botenstoff verwenden, sind zum Beispiel Endothel-vermittelte Gefäßrelaxation, Makrophagen-induziertes abtöten eingedrungener Mikroorganismen, neuronale Signalübertragung im Gehirn und peripheren autonomen Nerven, Blutplättchenaggregation, Tumorprogression und Metastasierung oder der Wundheilung.
Bekannte Stimulatoren der Stickstoffmonoxidbildung in endothelialen Zellen sind zum Beispiel das Peptid Bradykinin oder der Botenstoff Histamin. Diese Stoffe bewirken durch die Aktivierung eines Zelloberflächenrezeptors nachfolgend die schnelle Aktivierung einer intrazellulären Signalkaskade, welche letztendlich zur Aktivierung der eNOS und somit zur Stickstoffmonoxidbildung führt [R. Govers und TJ. Rabelink; Am J Physiol Renal Physiol. 2001;280(2):F193-206]. Diese Prozesse sind schnell. Bekannte Stimulatoren der Stickstoffinonoxidbildung in Immunzellen sind zum Beispiel das Lipopolysaccharid LPS. Diese Stoffe bewirken durch die Aktivierung eines Zeiloberflächenrezeptors nachfolgend die transkriptionelle Aktivierung der iNOS und somit die Stickstoffinonoxidbildung [Kleinert et al.; Biol Chem. 2003;384(10-l 1):1343].
Ein bekannter Inhibitor der Stickstoffinonoxidbildung in Immunzellen ist zum Beispiel InterleukinlO. Dieser Stoff bewirkt durch die Aktivierung eines Zeiloberflächenrezeptors nachfolgend die Ihibition der iNOS Aktivität und somit eine Reduktion der Stickstoffinonoxidbildung in Immunzellen [Dugas N et al., Cytokine. 1998;10(9):680].
Verfahren zur Messung der NO-Freisetzung aus Zellen im pharmazeutischen Hochdurchsatz Screening sollen sich leicht automatisieren und zur Begrenzung der Kosten für Reagenzien und Testsubstanzen auch miniaturisieren lassen. Darüber hinaus ist zum Nachweis auch geringer NO- Mengen eine möglichst hohe Sensitivität und zur Erreichung einer hohen Datenqualität eine möglichst geringe Störanfälligkeit wünschenswert.
Ln Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von Stickstoffmonoxid oder der NΘS-Aktivitä^bekannt-
Bredt, D.S., and Snyder, S.H. 1994. Annu. Rev. Biochem. 63, 175. Bredt, D.S., and Snyder, S.H. 1990. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 689. Bredt, D.S., and Snyder, S.H. 1989. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 9030 beschreiben indirekte Nachweisverfahren für Stickstoffmonoxid mittels Quantifizierung der NO-Synthase Aktivität. Bei den beschriebenen Verfahren wird die NO- Synthase katalysierte Konversion von radioaktiv markiertem L-Arginin zu L-Citrullin bestimmt. Das entstehende radioaktive L-Citrullin ist ein Maß für Stickstoffmonoxid und wird von nicht umgesetztem radioaktivem L-Arginin über einen Ionenaustauscher abgetrennt und quantifiziert. Die Verfahren umfassen mehrere aufwendige Arbeitsschritte und lassen sich daher nur schwer automatisieren. Darüber hinaus sind die hohen Reagenzienkosten von Nachteil.
Nims, R.W., et al. 1996. Methods Enzymol. 268, 93 und Amano F, 1995. FEBS Letters 368(3),425 beschreiben gekoppelte chemische Nachweisverfahren für Stickstoffmonoxid. Die Verfahren beruhen auf der Griess-Hosvay-Reaktion zur Bestimmung von Nitriten. Bei Verfahren beruhen darauf, dass das kurzlebige Stickstoffmonoxid der zu untersuchenden Testprobe durch Sauerstoff zu Nitraten und Nitriten oxidiert wird. Zur quantitativen Bestimmung von Stickstoffmonoxid muss das auch entstandene Nitrat mittels Nitratredukatse zu Nitrit reduziert werden. Der Nachweis für Nitrite erfolgt durch eine Reaktion mit Sulfanilsäure und 1-Naphthylamin welche zu einem Azofarbstoff führt, welcher colorimetrisch bestimmt werden kann. Problematisch sind die geringe Sensitivität und die Störanfälligkeit dieser Nachweisverfahren, insbesondere durch Nitrite und - A -
Nitrate, welche es zum Beispiel nicht erlaubt, dieses Verfahren in Kombination mit gebräuchlichen Gewebekultur-Medien zu verwenden.
US 6,306,609 (Bl) und US 5,358,703(A) beschreiben Verfahren zur Detektion von Stickstoffmonoxid basierend auf paramagnetischer Resonanzspektroskopie. Diese sind typischerweise nicht für das Hochdurchsatz Screening geeignet. Nachteilig bei diesen Verfahren sind die hohen Reagenzienkosten oder die apparativen Aufwendungen, was die Verwendung im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, einschließlich des pharmazeutischen Hochdurchsatz Screenings, erheblich einschränkt.
US 5,248,616(A, X6) beschreibt Verfahren zur Detektion von Stickstoffmonoxid basierend einer permeablen Membran und einem Gasanalysator. Erheblich Einschränkungen der Verwendung dieser Verfahren im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, einschließlich des pharmazeutischen Hochdurchsatz Screenings, entstehen durch die hohen apparativen Aufwendungen und Probleme bei der Miniaturisierung.
US 6,636,652(Bl), US 6,900,891(B2), US 6,002,817(A) und US 2004/0190813(Al) beschreiben Verfahren — zur — Detektion — von — Stickstoffmonoxid — basierend — auf- — Metalücoiloiden — und- mikroskopischen Techniken. Diese sind typischerweise nicht für das Hochdurchsatz Screening geeignet.
Im Stand der Technik sind außerdem Stickstoffmonoxid Nachweise mittels Fluoreszenzfarbstoffen bekannt; bei diesen Verfahren reagiert Stickstoffmonoxid mit einem fluorogenen Farbstoff, welcher nach erfolgter Reaktion seine spektralen Eigenschaften ändert. Die Quantifizierung der Fluoreszenz dient als Maß der Stickstoffmonoxid-Konzentration [beschrieben zum Beispiel in US 6,201,134(Bl, X6), US 6,469,051(B2, X6), US 6,756,231(Bl), US 2004/0147035(Al), US 2001/0001800(Al) und EP 1000941 (Bl)]. Ein solches Verfahren wird zum Beispiel von Berkels, R., et al. 2000. Cell Calcium 27, 281. Kojima, H., et al. 1998. Anal. Chem. 70, 2446. Kojima, H., et al. 1998. Chem. Pharm. Bull. 46, 373. Nakatsubo, N., et al. 1998. FEBS Lett. All, 263 beschrieben; dabei wird 4,5-Diaminofluorescein (DAF-2) als Stickstoffmonoxid-sensitiver Farbstoff verwendet. Der Farbstoff wird dabei in bildgebenden mikroskopischen Verfahren verwendet, welche eine zeitliche und räumliche Auflösung der Stickstoffmonoxid-Freisetzung ermöglicht. Ahnliche Verfahren verwenden modifizierte Farbstoffe, wie zum Beispiel 3-Amino, A- aminomethyl-2',7'-Difluorofluorescein (DAF-FM) nach Kojima, H., et al. 2001. J. Neurochem. 76, 1404. Park. J.M., et al. 2001. Br. J. Pharmacol. 132, 1876. Itoh, Y., et al. 2000. Anal. Biochem. 287, 203. Kojima, H., et al. 1999. Angew. Chem. Int. Ed. 38, 3209 oder membrangängige Farbstoffe wie 4,5-Diaminofluorescein Diacetat (DAF-2 DA) nach Berkels, R., et al. 2000 Cell Calcium 27, 281, Kojima, H., et al. 1998. Anal. Chem. 70, 2446, Kojima, H., et al. 1998. Chem. Pharm. Bull. 46, 373, und Nakatsubo, N., et al. 1998. FEBS Lett. 427, 263.
Diese Verfahren sind mit dem Nachteil behaftet, dass die erforderlichen Farbstoffe teuer sind und die Fluoreszenz störanfällig unter anderem gegenüber pH-Änderungen ist. Des Weiteren ist die Störanfälligkeit dieser Verfahren gegenüber fluoreszierender Testsubstanzen von Nachteil, was die Verwendung im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, einschließlich des pharmazeutischen Hochdurchsatz Screenings, erheblich einschränkt.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, die eine indirekte Detektion von Stickstoffmonoxid mittels zyklischem 3 '-5 '-Guanosinmonophosphat (cGMP) erlauben. Dazu wird die Guanylylzyklase (E.C: 4.6.1.2) verwendet, die die Umsetzung von Guanosintriphosphat zu cGMP und Pyrrophosphat katalysiert. Da Stickstoffmonoxid ein Aktivator der löslichen Guanylylzyklase ist, kann die Menge an gebildetem cGMP als Maß für das kurzlebige Stickstoffmonoxid verwendet werden [US 2005/0112717(Al) und WO 2005/052185(Al)]. In einem weiteren auf Guanylylzyklase basierendem Verfahren wird eine Zellkultur aus Guanylylzyklase-überexprimierender RFL-6 Zellen verwendet [Ishii et al, Am J Physiol. 1991; 261 H598-603]. Dazu muss eine auf Stickstoffmonoxid zu untersuchende Testprobe schnellstmöglich in ein Probengefäß überführt werden, in dem eine Kultur mit RFL-6 Zellen herangezogen wurde. Als Maß für Stickstoffmonoxid wird die Menge an gebildetem cGMP verwendet. Zur Bestimmung von cGMP sind verschiedene Immunoassays unter Verwendung von cGMP spezifischen Antikörpern bekannt. Der Nachweis des gebildetem cGMP erfolgt indirekt über die Verdrängung und Quantifizierung einer an den Antikörper gebundenen Sonde, wie zum Beispiel mit Iod Isotopen radioaktiv markiertes cGMP (Kompetitiver Immunoassay). Nachteilig bei diesem Verfahren sind die hohen Reagenzienkosten oder die präparativen Aufwendungen zur Bereitstellung der erforderlichen Antikörper. Weiterhin umfassen die Verfahren aufwendige Arbeitsschritte, insbesondere zeitkritische Transferschritte und aufwendige Waschprozeduren, welche eine effiziente Automatisierung erheblich erschweren; dies schränkt die Verwendung dieser Verfahren in Hochdurchsatzexperimenten, wie beispielsweise dem pharmazeutischen Hochdurchsatz Screening erheblich ein.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zu Grunde, die aufgeführten Nachteile und Einschränkungen des Standes der Technik zu überwinden und ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, bereitzustellen, welches sich durch hohe Sensitivität und geringe Störanfälligkeit auszeichnen und sich zudem leicht automatisieren und miniaturisieren lassen und sich insbesondere für das Hochdurchsatz- Screening (HTS) eignen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, mittels eines zellulären Reportergen-Assays gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welche folgende Stufen umfassen:
(a) Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle, und
(b) Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
(c) in Kontakt bringen der Zellen aus (a) und (b), und
(d) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zu testenden Substanz, und
(e) Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, ^md-^dentifizierung-einer-Substanz, die die Ffeisetzung-von-Stiekgtoffmonoxid aus NO- produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (e) gemessenen Detektionsignals.
Substanzen, welche die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, sind Inhibitoren, Aktivatoren oder Substanzen, die synergistisch mit Aktivatoren oder Inhibitoren, auf die NO-Freisetzung einwirken.
Die in Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Zusammensetzung ist in einer bevorzugten Ausgestaltung die Verwendung von nicht-rekombinanten und rekombinanten Zellen, die sich dadurch auszeichnen, dass sie Stickstoffmonoxid produzieren und freisetzen, zum Beispiel ausgewählt, aber nicht eingeschränkt durch, aus endothelialen Zellen, Gliazellen, Macrophagen, Neutrophilen oder daraus abgeleiteten immortalisierten Zellen.
Weitere Beispiele für Stickstoffmonoxid produzierende Zellen sind eukaryontische oder prokaryontische Zellen, die mit einer eukaryontischen NOS, zum Beispiel mit eNOS, iNOS oder nNOS, stabil oder transient transfiziert wurden.
Endotheliale Zellen sind zum Beispiel ausgewählt aus, aber nicht eingeschränkt durch, HUVEC, BAEC, HMVEC-dLyAd (Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells, Adult), HMVEC-dLyNeo (Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells, Neonatal), HMVEC-LBl (Lung Blood Microvascular Endothelial Cells), HMVEC-LLY (Lung Lymphatic Microvascular Endothelial Cells), bAEC (Bovine Aortic Endothelial Cells), bAEC (Bovine Aortic Endothelial Cells, pooled), bCAEC (Bovine Coronary Artery Endothelial Cells), bPAEC (Bovine Pulmonary Endothelial Cells), HAEC (Aortic Endothelial Cells), HCAEC (Coronary Artery Endothelial Cells), HIAEC (Illiac Artery Endothelial Cells), HMVEC-Bd (Human Microvascular Endothelial Cells - Bladder), HMVEC-C (Human Microvascular Endothelial Cells - Cardiac), HMVEC-d (Dermal Microvascular Endothelial Cells, Adult), HMVEC-d (Dermal Microvascular Endothelial Cells, Neonatal), HMVEC-d (Dermal Microvascular Endothelial Cells, Neonatal, pooled), HMVEC-L (Lung Microvascular Endothelial Cells), HPAEC (Pulmonary Artery Endothelial Cells), HUAEC (Umbilical Artery Endothelial Cells), HUVEC (Umbilical Vein Endothelial Cells), (HUVEC (Umbilical Vein Endothelial Cells, Pooled), UtMVEC (Uterine Microvascular Endothelial Cells) und Endothelzellen isoliert aus Nagern, Schweinen und Hunden.
Die in Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Zusammensetzung ist in einer bevorzugten Ausgestaltung die Verwendung einer rekombinanten Zelle, die sich dadurch auszeichnet, dass sie Stickstoffmonoxid detektieren kann, zum Beispiel ausgewählt, aber nicht eingeschränkt, durch das Einführen einer mutierten Variante der Guanylylzyklase, welche in Abhängigkeit von Stickstoffmonoxid an Stelle von cGMP cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) aus Adenosintriphosphat (ATP) synthetisiert [Sunahara et al, J Biol. Chem., 1998, 237, 16332]. Zum Beispiel kann bei Verwendung der löslichen Guanylylzyklase aus Ratte die Aminosäure Arginin 592 der alpha-Untereinheit durch Glutamin, die Aminosäuren Glutamat 473 der beta-Untereinheit durch Lysin und Cystein 541 der beta-Untereinheit durch Aspartat ausgetauscht werden, um das Reaktionsprodukt von cGMP auf cAMP zu ändern. Das gebildete cAMP wird mit Hilfe eines cAMP-sensitiven Reportergenkonstruktes bestimmt, bestehend aus einem Reportergen, welches funktionell mit einem cAMP-responsiblen Promoterelement verknüpft ist und sensitiv für intrazelluläres cAMP ist. Li einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das cAMP-responsible Promoterelement ein CRE (cAMP Responsive Element, Fink, J.S. et al., Proc Natl Acad Sei U S A. 1988; 85(18):6662) induzierbarer Promoter, welcher ein oder mehrere CRE Elemente enthält. Bevorzugterweise kann auch eine Kombination aus ein oder mehreren CRE Elementen und einem oder mehreren MREs (Multiple Respone Element, Ray A, et al. Mol Cell Biol. 1989; 9(12):5537) als cAMP-responsibles Promoterelement verwendet werden. Das Reporterkonstrukt kann zusätzlich weitere Transkriptionskontrollelemente, wie zum Beispiel Fragmente aus viralen Promotoren, und auch selektierbare Marker zur Erzeugung stabiler Zelllinien. Das Einführen der zur Detektion von Stickstoffmonoxid benötigten mutierten Guanylylzyklase und des Reportergenkonstruktes in eine zu verwendende Zelle kann mit handelsüblichen Transfektionagenzien durchgeführt werden. Die Detektorzelle kann diese Komponenten transient exprimieren oder eine Detektorzelle kann so hergestellt werden, daß sie beide Komponenten bevorzugterweise stabil exprimiert. Eine stabil transfizierte Zelle kann mit handiesüblichen Selektionsmarkern generieret werden. Reportergene, die erfϊndungsgemäß verwendet werden können, sind zum Beispiel ausgewählt aus, aber nicht eingeschränkt durch, Firefly Luciferase aus Photinus pyralis, beta-Galactosidase, Green Fluorescent Protein (GFP), beta-Lactamase, Aequrin aus Aequorea victoria, CAT (Chloramphenicoltransferase) und Renilla Luciferase und weitere Gene und deren Genprodukte, die lumineszente oder fluoreszente Reaktionen katalysieren können. Eine solche Zelle ist zum Beispiel in Corazza et al., Assay Drug Dev Technol. 2006;4(2):165 oder in WO 2006/007937 beschrieben. Als Wirtszelle kann zum Beispiel eine CHO, HELA, MDCK oder HEK293 Zelle verwendet werden; sie sind zum Beispiel bei der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA) erhältlich.
Das in Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Kontakt bringen ist in einer bevorzugten Ausgestaltung die gemeinsame Ausbringung und Kultivierung der NO-produzierenden Zelle und der Detektorzelle in einem Probengefäß in einem Mischungsverhältnis von 10-fachem Überschuss bis zu 10-fachem Unterschuss der Detektorzelle zur NO-produzierenden Zelle, wobei der Bereich von 5-fachem Überschuss bis zu 5-fachem Unterschuss mehr bevorzugt und der Bereich von 2- fächern Überschuss bis zu 2-fachem Unterschuss der Detektorzelle am meisten bevorzugt ist. In Kontakt bringen bedeutet, dass die Zellen zusammen kultiviert werden können (Co-Kultur), wobei erst die eine und anschließend die zweite Zelle im selben Testgefäß ausgebracht werden, oder dass vor dem Ausbringen die Zellen gemischt werden, oder dass die Zellen über eine semipermeable Membran in Kontakt gebracht werden.
Das in Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Zusammensetzung kann zusätzliche Komponenten enthalten beispielsweise Reduktionsmittel, insbesondere solche, die Superoxid-Anionen und Hyperoxid-Anionen abfangen, Proteine, insbesondere solche, die Superoxid-Anionen und Hyperoxid-Anionen abfangen, oder weitere Substanzen, die das Signal des Reportergens verstärken können, insbesondere solche, die cAMP stabilisieren können.
Beispiele für Reduktionsmittel sind Ascorbat oder chemische Superoxid-Dismutase Mimetika wie zum Beispiel Mangan(IH) tetrakis (4-benzoic acid)porphyrin chlorid (MnTBAP Chlorid).
Beispiele für Proteine sind Cu/Zn-abhängige Superoxid-Dismutase oder Mn-abhängige Superoxid-Dismutase.
Beispiele für Substanzen, die cAMP stabilisieren können, sind Phosphodiesteraseinhibitoren, wie zum Beispiel 3-Isobutyl-l-methylxanthine (IBMX).
Die zu testende Substanz in Stufe (d) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein.
Nachdem die zu testende Substanz in Stufe (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Zellen in Konatkt gebracht wurde, bildet sich das resultierende Stickstoffmonoxid schnell, typischerweise in innerhalb von Sekunden oder Minuten. Das gebildete Stickstoffmonoxid hat gewöhnlich eine sehr kurze Halbwertszeit, typischerweise eine Halbwertszeit von mehreren Sekunden. Das erfϊndungsgemäße Verfahren ermöglicht durch die Kokultivierung von Stickstoffmonoxidfreisetzender Zelle und Detektor-Zelle eine besonders effiziente und verlustfreie Detektion des Stickstoffmonoxids und somit auch eine geringe Störanfälligkeit.. Die nachfolgende Induktion des Reportergens beansprucht einen längeren Zeitraum, typischerweise mehrere Stunden. Die Verwendung einer funktionellen Kopplung des Stickstoffmonoxids an ein Reportergen- Detektionssystem
hat mehrfache Vorteile, zum einen erleichtert die zeitliche Trennung der Substanzzugabe in Stufe (d) bzw. die Generierung des Stickstoffmonoxids und der Detektion des Reportergens in Stufe (e) die Automatisierung des Verfahrens und vermindert die Komplexität der zu verwendeten Apparate. Zum anderen bewirkt die Verwendung eines Reportergens eine Integration über das gesamte freigesetzte Stickstoffmonoxid und Amplifizierung des Signals, erhöht somit die Sensitivität des Verfahrens.
Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung inhibieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (d) hinzugegeben werden. Eine die NO-Freisetzung inhibierende Substanz kann zum Beispiel eine NOS direkt inhibieren oder durch Inhibierung eines eine NOS aktivierenden Schrittes wirken.
Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung nur indirekt stimulieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (d) hinzugegeben werden. Eine nur indirekt die NO- Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel durch die Inhibierung eines negativen Rückkopplungsmechanismus einer NOS wirken. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel auch durch die Induktion der Transkription und oder Translation einer NOS wirken. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welche folgende Stufen umfassen:
a) Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle
b) in Kontakt bringen der Zelle aus (a) mit einer zu testenden Substanz, und ' • ■
c) Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
d) in Kontakt bringen der Zellen aus (b) und (c), und
e) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zweiten zu testenden Substanz, und
f) Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und
g) Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO- produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (f) gemessenen Detektionsignals.
Die zu testende Substanz in Stufe (b) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein.
Die zu testende zweite Substanz in Stufe (e) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein und ist typischerweise ein bekannter Modulator einer NOS.
Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung nur indirekt stimulieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine nur indirekt die NO- Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel durch die Inhibierung eines negativen Rückkopplungsmechanismus einer NOS wirken. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel auch durch die Induktion der Transkription und oder Translation einer NOS wirken.
Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung inhibieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine die NO-Freisetzung inhibierende Substanz kann zum Beispiel eine NOS direkt inhibieren oder durch Inhibierung eines eine NOS aktivierenden Schrittes wirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welche folgende Stufen umfassen:
(a) Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle, und
(b) Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
(c) in Kontakt bringen der Zellen aus (a) und (b), und
(d) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zu testenden Substanz, und
(e) in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (d) mit einer zweiten zu testenden Substanz, und
(f) Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und
(g) Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO- produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (f) gemessenen Detektionsignals.
Die zu testende Substanz in Stufe (d) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein.
Die zu testende zweite Substanz in Stufe (e) kann zum Beispiel eine chemische Substanz sein, welche bevorzugt eine niedermolekulare Substanz, besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von 100 Da bis 600 Da ist, ein Protein, ein Antikörper, ein Peptid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine cDNA, eine RNA, ein RNAi Molekül oder ein Antisense Nukleotid, ein Aptamer oder ein Naturstoff sein und ist typischerweise ein bekannter Modulator einer NOS.
Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung nur indirekt stimulieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine nur indirekt die NO- Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel durch die Inhibierung eines negativen Rückkopplungsmechanismus einer NOS wirken. Eine nur indirekt die NO-Freisetzung stimulierende Substanz kann zum Beispiel auch durch die Induktion der Transkription und oder Translation einer NOS wirken.
Zur Identifizierung von Substanzen, die die Stickstoffmonoxid Freisetzung einer Zelle nach Stufe (a) der Erfindung inhibieren, kann eine weitere bekannte NO-Freisetzung aktivierende Substanz nachfolgend in Stufe (e) hinzugegeben werden. Eine die NO-Freisetzung inhibierende Substanz kann zum Beispiel eine NOS direkt inhibieren oder durch Inhibierung eines eine NOS aktivierenden Schrittes wirken.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das erfindungsgemäße Verfahren in homogener Phase durchgeführt. In dieser Ausgestaltung lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders leicht automatisieren und miniaturisieren. Dafür wird die zu testende Substanz in wässriger Lösung zu den Zellen gegeben, zur Erhöhung der Löslichkeit der Substanzen können Löslichkeitsvermittler wie DMSO zugesetzt werden. Zur Transfektion mit Nukleinsäuren können handelsübliche Transfektionsagenzien verwendet werden.
Die Kombination der Zellen und die Kombination der Zellen mit den zu testenden Substanzen kann mit handelsüblichen Vorrichtung zur Handhabung von Flüssigkeiten (Liquid Handling Systems) durchgeführt werden. Beispiele für geeignete Vorrichtungen sind Pipettiervorrichtungen, einschließlich Mikropipettierer und Parallelpipettierer, Dispensvorrichtungen, einschließlich Piezo-Effekt basierender Systeme, Bubble-Jet Systeme sowie Dispensiergeräte mit Ventilsteuerung und Übertragungsvorrichtungen, einschließlich Pin-Tool basierender Systeme.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können in handelsüblichen Reaktionsgefäßen, vorzugsweise Mikrotiterplatten mit 96, 384 oder 1536 Vertiefungen, ausgeführt werden.
Die Messung des Detektionssignals in Stufe (e) des erfϊndungsgemäßen Verfahrens kann mit handelsüblichen Messgeräten durchgeführt werden. Beispiele für luminogene Reportergene sind die Luciferasen aus Photinus pyralis bzw. aus Renilla. Je nach der Wahl des luminogenen Substrates kann es notwendig sein, die Zellen vor Beginn der Messung zu lysieren, um eine Substratsättigung des Reportergenproduktes zu gewährleisten. Beispiele für fluoresente Reportergene ist GFP. Es besteht aber auch die Möglichkeit handelsübliche fluorogene Substrate für Reportergene zu verwenden. Wird ein auf Lumineszenz basierendes Reportergen verwendet, kann das Verfahren mit handelsüblichen Lumineszenzmessgeräten durchgeführt werden. Wird ein auf Fluoreszenz basierendes Reportergen verwendet, kann das Verfahren mit handelsüblichen Fluoreszenzmessgeräten durchgeführt werden.
Für eine quantitative Bestimmung der freigesetzten Stickstoffmonoxidkonzentrationen in einer Testprobe werden zusätzlich Referenzproben mit bekannter NO-Konzentration in gleicher Weise behandelt und vermessen wie die Testproben. Aus dieser zusätzlichen Untersuchung wird eine
Korrelation von Detektionsignal und NO-Konzentration unter den gegebenen experimentellen
Bedingungen abgeleitet, wobei die Messdaten zum Beispiel graphisch interpoliert oder durch einen mathematischen Algorithmus und elektronische Prozessierung angenähert werden können. Aus der abgeleiteten Korrelation lässt sich dem für eine Testprobe gemessenen Detektionsignal direkt eine
NO-Konzentration zuordnen.
Die erfϊndungsgemäßen Verfahren können in verschiedenen Bereichen vorteilhaft eingesetzt werden; von besonderem Interesse ist der Einsatz im Bereich der biomedizinischen Forschung, insbesondere der Wirkstoffforschung und der Arzneimittelforschung. Die erfϊndungsgemäßen Verfahren können, wie oben bereits erläutert, in homogener Phase und in wenigen einfachen Prozessierungsstufen durchgeführt werden; dadurch eignen sie sich ausgezeichnet zur Automatisierung und Miniaturisierung.
Der automatisierte Einsatz der erfϊndungsgemäßen Verfahren kann im Bereich der biomedizinischen Forschung, insbesondere der pharmazeutischen Wirkstoffforschung, von Bedeutung sein; dort werden zur Auffindung neuer Wirkstoffkandidaten regelmäßig große Substanzbibliotheken mit teilweise mehr als einer Million Substanzen mit Hilfe automatisierter Verfahren durchgemustert (Hochdurchsatz Screening; High Throughput Screening); neben der leichten Automatisierbarkeit der Verfahren ist bei dieser Anwendung vor allem die Miniaturisierbarkeit, die hohe Sensitivität und die geringe Störanfälligkeit von Vorteil. Die Miniaturisierung der Testformate und die hohe Sensitivität reduzieren die Aufwendungen für die Herstellung oder Beschaffung von Reagenzien sowie den Verbrauch von Testsubstanzen. Geringe Störanfälligkeit führt üblicherweise zu hoher Datenqualität und guter Reproduzierbarkeit der Testergebnisse. Dabei richtet sich das Screening typischerweise auf die Identifizierung von Modulatoren einer biologischen Aktivität, welche das Ziel einer medizinischen Therapie sein könnte. Biologische Aktivitäten, welche Stickstoffmonoxid als Botenstoff verwenden, sind zum Beispiel Endothel- vermittelte Gefäßrelaxation, Makrophagen-induziertes abtöten eingedrungener Mikroorganismen, neuronale Signalübertragung im Gehirn und peripheren autonomen Nerven, Blutplättchenaggregation, Tumorprogression und Metastasierung oder der Wundheilung. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich ausgezeichnet für einen solchen Einsatz im pharmazeutischen Hochdurchsatz Screening, speziell zur Auffindung von Modulatoren von Enzymen und Rezeptoren , die die Stickstoffmonoxidbildung regulieren; von besonderem Interesse sind dabei zum Beispiel Modulatoren der Enzymaktivität von NOS oder deren direkte oder indirekten Regulatoren. Dafür wird die Stickstoffmonoxidbildung einer zu testenden Zelle nach einem der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in Gegenwart einer oder mehrerer geeigneter Konzentrationen einer Testsubstanz bestimmt, mit der Stickstoffmonoxidbildung in Abwesenheit der Testsubstanz verglichen und daraus die modulierenden Eigenschaften der Testsubstanz in bekannter Weise abgeleitet. Üblicherweise abgeleitete Eigenschaften einer Testsubstanz sind die aktivierende oder inhibierende Wirkung auf die untersuchte Aktivität.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verfahren auch zur weiteren Charakterisierung des Signalweges, der zur Stickstoffmonoxidbildung führt, verwendet werden, beispielsweise zur Auffindung eines neuen Modulators mittels der siRNA oder cDNA Technologie oder der Kombination dieser Methoden mit chemischen Substanzen.
Figuren:
Fig. 1 : Prinzip des Kokultur-Assays
Assaysprinzip, bestehend aus einer NO-produzierenden Zelle und einer Detektorzelle. Freigesetztes NO diffundiert in Detektorzelle und reguliert die Expression eines Reportergens. sGCmut ist eine modifizierte lösliche Guanylylzyklase, welche die Reaktion von ATP in cAMP katalysieren kann. CRE Luci ist Reportergenkonstrukt, welches cAMP-abhängig die Expression der Luciferase steuert.
Fig. 2: NO-Freisetzung einer HUVEC gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
Signal der durch verschiedene Substanzen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Verwendete Substanzen wurden mit den angegebenen Konzentrationen verwendet. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) den NOS-Inhibitor L-NAME inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
Fig. 3: NO-Freisetzung einer HUVEC Zelle gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
Signal der durch verschiedene Substanzen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Verwendete Substanzen wurden mit den angegebenen Konzentrationen verwendet. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) den sGC-Inhibitor ODQ inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
Fig. 4: NO-Freisetzung einer BPAEC Zelle gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
Dosis-Wirkungsbeziehung (DRC) der NO-Freisetzung einer BPAEC Zelle durch den Stimulator ATP beziehungsweise Bradykinin mittels einer Detektorzelle mit sGCmut und CRE-Luciferase. RLU (Relative Lichteinheiten).
Fig. 5: NO-Freisetzung einer HUVEC Zelle moduliert durch einen synergistischen Stimulator gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
Signal der durch A23187 in den angegebenen Konzentrationen induzierte NO-Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) den NOS Inhibitor L-NAME (10 μM) kombiniert mit der Inkubation ohne (weisse Balken) bzw. mit 10 μM Sepiapterin (graue Balken) inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten). Fig. 6: NO-Freisetzung einer HUVEC Zelle moduliert durch einen synergistischen Stimulator gemessen über eine Reportergen-Detektorzelle
Signal der durch verschiedene Substanzen in den angegebenen Konzentrationen induzierte NO- Freisetzung, gemessen über Lumineszenz eines Reportergens, die Kontrolle (ctrl) enthielt nur Puffer. Zellen wurden mit (schraffierte Balken) und ohne (offene Balken) Superoxid-Dismutase (10 U/ml) inkubiert. RLU (Relative Lichteinheiten).
Beispiele
Beispiel 1
Charakterisierung des zellbasierten Kokulturassays zur Detektion von Stickstoffmonoxid
Das Prinzip des Kokultur-basierten Zellassays mittels einer Reportergen-Detektorzelle zur Detektion von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid modulieren ist in Fig. 1 beschrieben.
Zur Herstellung der Reportergen-Detektorzelle CHOsGCmut wurde analog nach WO 2006/007937(Al) bzw. Corazza et al., Assay Drug Dev Technol. 2006;4(2):165 vorgegangen.
Zur Charakterisierung des Assaysystems wurde die Detektorzelle CHOsGCmut mit primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) im Verhältnis 2: 1 gemischt und 15000 Zellen pro
Well in einer 96-well MTP in lOOμl Kulturmedium (EGM-2 mit 2% FBS) ausgesät. Nach 48
Stunden unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 50 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in Fig. 2 und 3 illustriert entweder keine Zusätze oder
"wurde mit dem eNOS-Inhibitor L-NAME mit emer Endkonzentration von 10 μM (Fig. 2) bzw. dem sGC Inhibitor ODQ mit einer Endkonzentration von 10 μM (Fig. 3) versetzt. Nach 30 Minuten Inkubation wurden 50 μl einer Testsubstanz gelöst in Tyrode zugegeben, wie in Fig. 2 und 3 illustriert wurden die NO-freisetzenden Substanzen ATP, Histamin und A23187 verwendet. Zur Lösungsverbesserung wurde eine Endkonzentration von 0,25% DMSO v/v verwendet. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase-Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzenden Substanzen ATP, Histamin und A23187 eine signifikante Signalerhöhung des Reportergens bezüglich der Kontrollprobe, bei der nur Tyrode mit 0,25% DMSO zugegeben wurde, bewirken. Des weiteren zeigen die Beispiele in Fig. 2 und 3, dass bei Vorinkubation der Zellmischung mit L-NAME oder ODQ keine signifikante Erhöhung des Reportergensignals resultiert. L-NAME inhibiert eNOS und ODQ inhibiert die sGC. Die Ergebnisse zeigen, dass das Assyayformat selektiv freigesetztes NO detektiert. Als weitere Kontrolle wurde Forskolin bzw. BAY 41-2272 verwendet. Die Beispiele zeigen darüber hinaus, dass mit diesem Verfahren Inhibitoren und AKtivatoren der NO-Freisetzung identifiziert werden können. Beispiel 2
Nachweis der Dosisabhängigkeit der NO-Freisetzung durch Stimulation primärer boviner pulmonararterieller Endothelzellen mit ATP oder Bradykinin
Die Detektorzelle CHOsGCmut wurde mit primären bovinen pulmonararteriellen-Endothelzellen (BPAEC) im Verhältnis 2:1 gemischt und 7500 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in lOOμl
Kulturmedium (EGM-2 MV mit 5% FBS) ausgesät. Nach 48 Stunden unter
Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 100 μl Tyrode ausgetauscht. Die
Tyrode enthielt, wie in Fig. 4 illustriert aufsteigende Konzentrationen der NO-freisetzenden
Substanzen ATP oder Bradykinin. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase- Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzenden Substanzen ATP und Bradykinin eine signifikante und stabile Signalerhöhung des Reportergens bewirken und der Assay zur Identifizierung und Charakterisierung verwendet werden kann.
Beispiel 3
Nachweis der erhöhten NO-Freisetzung durch synergistisch stimulierende Substanzen an primären humanen HUVEC Zellen
Die Detektorzelle CHOsGCmut wurde mit HUVEC Zellen im Verhältnis 2:1 gemischt und 15000 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in lOOμl Kulturmedium (EGM-2 mit 2% FBS) ausgesät.
Nach 24 Stunden unter Standartkulturbedingungen wurde der Hälfte der Kulturen die Substanz
Sepiapterin (Sigma, Bestell-Nr. S 154) in einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben (Fig. 5 graue Balken). Nach weiteren 24 h unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 50 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in Fig. 5 illustriert entweder keine Zusätze oder wurde mit dem eNOS-Inhibitor L-NAME mit einer Endkonzentration von 10 μM versetzt (Fig. 5 schraffierte Balken). Nach 30 Minuten Inkubation wurden 50 μl einer Testsubstanz gelöst in Tyrode zugegeben, wie in Fig. 5 illustriert wurden die NO-freisetzende Substanz A23187 verwendet. Zur Lösungsverbesserung wurde eine Endkonzentration von 0,25% DMSO v/v verwendet. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase-Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität). Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzende Substanz A23187 signifikante und stabile Signalerhöhung des Reportergens bewirken und die NO-Freisetzung durch Sepiapterin gesteigert werden kann. Die Kontrolle mit dem eNOS Inhibitor L-NAME zeigt, dass Sepiapterin spezifisch das durch NO erzeugte Signal erhöht und nicht auf eine anderweitige Art das Reportergensignal erhöht. Der Assay kann zur Identifizierung und Charakterisierung von direkten und synergistisch wirkenden Substanzen verwendet werden kann.
Beispiel 4
Nachweis der erhöhten NO-Freisetzung durch Zugabe von Superoxiddismutase
Die Detektorzelle CHOsGCmut wurde mit HUVEC Zellen im Verhältnis 2:1 gemischt und 15000 Zellen pro Well in einer 96-well MTP in lOOμl Kulturmedium (EGM-2 mit 2% FBS) ausgesät. Nach 48 h unter Standartkulturbedingungen wurde das Kulturmedium durch 50 μl Tyrode ausgetauscht. Die Tyrode enthielt, wie in Fig. 6 illustriert entweder keine Zusätze oder wurde mit Superoxiddismutase (SOD) (Sigma, Bestell-Nr. S5395) mit einer Endkonzentration von 10 U/ml versetzt (Fig. 6 schraffierte Balken). Nach 30 Minuten Inkubation wurden 50 μl einer Testsubstanz gelöst in Tyrode zugegeben, wie in Fig. 6 illustriert wurden die NO-freisetzenden Substanzen ATP, Histamin und A23187 verwendet. Zur Lösungsverbesserung wurde eine Endkonzentration von 0,25% DMSO v/v verwendet. Nach 4 h Inkubation wurde zur Detektion des Luciferase- Signals 50 μl einer Luciferin/Triton Lösung dazu pipettiert und die resultierende Lumineszenz mit einer CCD-Kamera gemessen (30 sec. bei hoher Sensitivität).
Das Beispiel zeigt, dass die NO-freisetzenden Substanzen signifikante und stabile Signalerhöhung des Reportergens bewirken und die NO-Freisetzung durch SOD gesteigert werden kann. Der Assay kann zur Identifizierung und Charakterisierung von direkten und synergistisch wirkenden Substanzen verwendet werden kann.
Material und Methoden:
Zellkultur: CHOsGCmut wurde in DMEM/F12 (Invitrogen, Bestell-Nr. 21331-020), 2% Glutamax (Invitrogen, Bestell-Nr. 35050-087), 10% FBS (Invitrogen, Bestell-Nr. 10082-147), 1% PenVStrep (Invitrogen, Bestell-Nr. 15070-063), 2% HEPES (Invitrogen, Bestell-Nr. 15630-122), Natrium- Pyruvat (Invitrogen, Bestell-Nr. 11360-039) und 2% Natrium-Bicarbonat (Invitrogen, Bestell-Nr. 25080-102) kultiviert (alle Angaben in v/v). Die Zellen wurden geemtet und für die Experimente verwendet, wenn sie 70-80% Konfluenz erreichten. Die Zellen wurden unter normalen Zellkulturbedingungen (37°C, 5% Cθ2-Atmosphäre) gehalten und zweimal die Woche passagiert. HUVEC Zellen (Cambrex, Bestell-Nr. CC-2519) wurden in EGM-2 (Cambrex, Bestell-Nr. CC- 3162) nach Angaben des Herstellers kultiviert. BPAEC Zellen (Cambrex, Betsell-Nr. BW-6004) wurden in EGM-MV (Cambrex, Bestell-Nr. CC-3125) nach Angaben des Herstellers kultiviert.
Verwendete Substanzen und Puffer: ODQ (Sigma, Bestell-Nr. 03636), Bay41-2272 (Alexis, Bestell-Nr. ALX-420-030), Histamin (Fuka, Bestell-Nr. 53290), ATP (Sigma, Bestell-Nr. A6419),
A23187 (Calbiochem, Bestell-Nr. 100105), Forskolin (Sigma, Bestell-Nr. F3917), Bradykinin
(Sigma, Bestell-Nr. B3259) Tyrode Puffer (1 mM Mg Cl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5 mM
KCl, 5 mM NaHCO3 und 20 mM HEPES, pH 7,4), Luciferin/Triton Lösung (530 μM ATP, 470 μM Luciferin, 270 μM Coenzym A, 20 mM Tricine, 2,67 mM MgSO4, 33,3 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 15 Triton, 10% Glycerin, 25 mM Na2HPO4, 25 mM TRIS-HCL, pH 7,8) Luciferin (Sigma,
Bestell-Nr. L9504), Coenzym A (Sigma, Bestell-Nr. C4282), L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methylesterhydrochlorid, Sigma, Bestell-Nr. N5751).

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO-produzierenden Zellen modulieren, welches folgende Stufen umfasst:
a. Bereitstellung einer Stickstoffmonoxid produzierenden Zelle, und
b. Bereitstellung einer mittels eines Reportergenkonstruktes Stickstoffmonoxid detektierenden Detektorzelle, und
c. in Kontakt bringen der Zellen aus (a) und (b), und
d. in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus (c) mit einer zu testenden Substanz, und
e. Messung des durch Stickstoffmonoxid generierten Detektionssignals der Detektorzelle, und
f. Identifizierung einer Substanz, die die Freisetzung von Stickstoffmonoxid aus NO- produzierenden Zellen moduliert, gemäß eines in (f) gemessenen Detektionsignals.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Schritt (d) und (e) in Anspruch 1 ein weiterer Schritt eingeführt wird, der das in Kontakt bringen der Zusammensetzung aus Anspruch l(d) mit einer zweiten zu testenden Substanz umfasst, wenn dies für die Identifizierung von Inhibitoren oder synergistischen Modulatoren notwendig ist.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Stickstoffmonoxid produzierende Zelle zuerst mit einer zu testenden Substanz in Kontakt gebracht und dann erst mit der Detektorzelle in Kontakt gebracht wird.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die NO-produzierende
Zelle eine nicht-rekombinante oder rekombinante Zelle ist.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die NO-produzierende Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus eNOS, iNOS oder nNOS exprimierenden Zellen.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die NO-produzierende Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus endothelialen Zellen, Gliazellen, Macrophagen, Neutrophilen oder daraus abgeleiteten immortalisierten Zellen.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorzelle
a. ein Reportergen enthält, welches funktional an einen cAMP-induzierbaren
Promoter gekoppelt ist, und
b. eine modifizierte lösliche Guanylylzyklase enthält, welche die Reaktion von ATP in cAMP katalysieren kann.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die lösliche Guanylylzyklase aus Ratte verwendet wird und worin die Aminosäure Arginin 592 der alpha-Untereinheit durch Glutamin, die Aminosäuren Glutamat 473 der beta-Untereinheit durch Lysin und Cystein 541 der beta-Untereinheit durch Aspartat ausgetauscht wurde.
9. Verfahren nach Ansprüchen 7-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorzelle ein
Reportergen enthält, welches funktional an einen durch CRE oder MRE/CRE-Elemente gesteuerten Promoter gekoppelt ist.
10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Genen und deren Genprodukte, die lumineszente oder fluoreszente Reaktionen katalysieren können.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Firefly Luciferase aus Photinus pyralis, beta-Galactosidase, Green
Fluorescent Protein (GFP), beta-Lactamase, Aequorin aus Aequorea victoria, CAT (Chloramphenicoltransferase) oder Renilla Luciferase.
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