DE102012101885A1

DE102012101885A1 - Verfahren zur Bestimmung der katalytischen Aktivität von Molekülen mit deiodierender Aktivität

Info

Publication number: DE102012101885A1
Application number: DE201210101885
Authority: DE
Inventors: Lutz Schomburg; Kostja Renko; Josef Köhrle
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-03-06
Filing date: 2012-03-06
Publication date: 2013-09-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Sätze, die zur Bestimmung der katalytischen Aktivität von Molekülen mit biologisch deiodierender Aktivität nützlich sind, Verfahren zur Identifikation solcher Moleküle und Verfahren zur Identifikation von Substraten und/oder Effektoren besagter katalytischer Aktivität.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Sätze, die zur Bestimmung der katalytischen Aktivität von Molekülen mit biologisch deiodierender Aktivität nützlich sind, Verfahren zur Identifikation solcher Moleküle und Verfahren zur Identifikation von Substraten und/oder Effektoren besagter katalytischer Aktivität.
Aktivierung und Inaktivierung von Iodthyroninen und Iodthyronaminen werden durch 5'- und 5-Deiodierung katalysiert. L-Thyroxin (T4) ist das hauptsächliche Hormon, das von der Schilddrüse sekretiert wird, während Triiodthyronin (T3) das aktivste Schilddrüsenhormon (thyroid hormone, TH) ist. Die TH-Aktivität wird in den Zielzellen durch lokale Aktivierung und Inaktivierung des TH mittels der kleinen Selenoprotein-Familie der Iodthyronin-Deiodasen (DIO) streng kontrolliert, insbesondere katalysieren die Typ 1 Deiodase (DIO1) und die Typ 2 Deiodase (DIO2) die aktivierenden 5'-deiodierenden Reaktionen und die DIO1 und die Typ 3 Deiodase (DIO3) jeweils die inaktivierenden 5-deiodierenden Reaktionen (2).
Die Expression von Deiodasen in den Zielzellen ist ein wesentlicher Einflussfaktor auf die TH-Aktivität und wird durch den TH-Status als Teil des endokrinen Rückkopplungs- und Regelkreises reguliert. Metabolische Faktoren, entzündliche Zytokine und umgebungsbedingte Stimuli kontrollieren des Weiteren die gewebespezifischen Muster der DIO-Isoenzymexpression. Die Regulation der DIO-Biosynthese wird auf transkriptionaler und posttranskriptionaler Ebene durch den Selenstatus oder das Substratlevel kontrolliert, die die Bildung und den Abbau der DIO-Isoenzyme beeinflussen. Folglich korrelieren die Enzymaktivitäten nicht immer mit den mRNA-Konzentrationen; deshalb sind Enzymtests erforderlich, um die DIO-Aktivitäten und ihre jeweiligen regulatorischen Wege zu untersuchen.
Zum Beispiel dient die DIO-Expression als wichtiger Reporter bei der Bewertung der Schilddrüsenachse und von Faktoren, die den TH-Status beeinträchtigen, zum Beispiel in Studien mit transgenen Tieren, zur Identifizierung chemischer Verbindungen oder Naturstoffen als endokrine Disruptoren oder zur Analyse des Spurenelementstatus. Diesbezüglich wird die hepatische Dio1-Aktivitat als der empfindlichste perire Biomarker der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen (HPT) – Achse angesehen.
Bekannte Testverfahren zur Bestimmung der DIO-Enzymaktivität bestimmen die Menge an radioaktivem Iodid (I^–), welches aus einem markierten Tracersubstrat, z. B. ¹²⁵I reverses T3(¹²⁵I-rT3), freigesetzt wird (1). Nach der Abtrennung des freien ¹²⁵I^–-Tracers von der Reaktionsmischung durch Kationenaustauschchromatographie wird die Enzymaktivität pro Zeit und mg Protein aus der Menge an freigesetztem radioaktivem Iodid berechnet. Dieser Test erzielt hervorragende Ergebnisse und ist geeignet, zwischen DIO1- und DIO2-Aktivitäten zu unterscheiden, z. B. durch Hinzufügen von 6-n-propyl-2-thio-uracil (PTU), das als selektiver DIO1-Inhibitor bekannt ist. Allerdings ist die Wahl des Substrates durch die Verfügbarkeit isotopenmarkierter Moleküle begrenzt. Obgleich der Test hochsensitiv ist und für die Bestimmung aller bekannten Deiodase-Isoenzyme geeignet ist, erfordert die Durchführung des Tests die Verfügbarkeit entsprechend markierter radioaktiver Substrate, die Ausrüstung eines Isotopenlabors, behördliche Zulassungen und zeitaufwendige Strahlensicherheitsmaßnahmen. Darüber hinaus sind die Kostendes Testverfahrens durch die Handhabung radiomarkierter Tracer und Abfälle hoch.
Eine alternative Technik wurde mit der LC-MS/MS-basierten Trennung und Quantifizierung von TH-Metaboliten beschrieben (2). Diese komplexe Technologie erlaubt die simultane Bestimmung von Substraten, Intermediaten und Produkten, wobei ein detaillierteres und vollständiges Bild der katalytischen Reaktion gegeben wird. Das technisch anspruchsvolle Verfahren liefert verlässliche Ergebnisse und erlaubt eine Metabolitspezifische Analyse, sofern entsprechende Standards verfügbar sind. Das Verfahren ist allerdings sehr zeitaufwendig, die Ausrüstung ist sehr teuer, störempfindlich gegenüber Verfahrensfehlern, erzeugt hohe Unterhaltskosten und erfordert gut ausgebildetes Personal.
Eine weitere Studie verwendete die klassische Sandell und Kolthoff-Reaktion (3) zur Messung der Funktion des Natrium-Iodid-Symporters (5). Der Iodid-Nachweis nach Sandell und Kolthoff basiert auf der Redox-Reaktion von As³⁺ und Ce⁴ ⁺, die in Gegenwart von Iodid unter sauren Bedingungen katalysiert wird. Die Iodidkonzentration in der Reaktionsmischung ist proportional zur Entfärbungsgeschwindigkeit des farbigen Ce⁴⁺ zum farblosen Ce³ ⁺. Die Methode wurde durch Moxon & Dixon weiterentwickelt (4).
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem war es, die Durchführung von Tests zum Nachweis und der Quantifizierung der katalytischen Aktivität von Molekülen mit deiodierender Aktivität in einem hochdurchsatzfähigen Screeningtestformat (high-throughput screening, HTS) zu ermöglichen, ohne das Erfordernis der ortsspezifischen Markierung von jeder einzelnen Testverbindung (wie z. B. potentieller Substrate und/oder Effektoren). Ein solcher Test würde ein kosteneffektives, nichtradioaktives und paralleles automatisiertes Screening von Hunderten und Tausenden von Testverbindungen aus verfügbaren Substanzbibliotheken ermöglichen.
Es wurde nun gefunden, dass die Kombination von Grundlagen der Sandell-Kolthoff-Reaktion (3) (seit 1937 bekannt) und dem klassischen Deiodase-Test (1) (seit 1978 bekannt) nicht nur die Übertragung des DIO-Tests in ein HTS-Format ermöglicht, sondern eine Untersuchung völlig neuer Substratklassen ermöglicht, die einer ortsspezifischen ¹²⁵I-Radiomarkierung nicht zugänglich sind, wie z. B. komplex iodierte Naturstoffe.
Dementsprechend gestatten die verbesserten Verfahren gemäß vorliegender Erfindung die Bestimmung der katalytischen Aktivität von Molekülen mit deiodierender Aktivität, von Molekülen mit der biologischen Aktivität einer DIO, stellen Mittel für das HTS zur Verfügung sowie für die Identifikation von Verbindungen, die Substrate und/oder Effektoren (d. h., Aktivatoren, Modulatoren, und/oder Inhibitoren) besagter Moleküle sind, wobei ein großes Potential in der Entwicklung neuer Ansätze in der effektiven Behandlung endokriner Fehlfunktionen und/oder anderen Erkrankungen mit veränderter DIO-Expression liegt, z. B. von neoplastischen oder kritischen Erkrankungen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen leistungsfähige Werkzeuge zur Bestimmung der Enzymaktivität von Enzymen des DIO-Typs dar, z. B. für DIO 1, 2 und/oder 3, wobei der Einsatz radioaktiver Substrate vermieden wird, sind schnell, leicht durchzuführen, kosteneffektiv und können leicht für das HTS adaptiert werden. Die Verfahren können zum Screening nach Effektoren oder Substraten der Enzyme und/oder endokrinen Disruptoren verwendet werden, auch wenn solche Verbindungen nicht leicht durch Analysen nachweisbar sind oder ortspezifisch mit vertretbarem Aufwand markiert werden können. Alle diese Probleme werden durch die vorliegende Erfindung gemäß der technischen Merkmale der Ansprüche adressiert.
Der Test gemäß vorliegender Erfindung trägt dazu bei, Standards und Kontrolle von Nahrungsmitteln, pharmazeutischen und industriellen Produkten sowie der Umwelt in Bezug auf die Identifikation und Kontrolle auf potentielle endokrine Disruptoren zu verbessern. Diesbezüglich hat sich die hepatische Dio1 als ein zuverlässiger und vielseitiger Biomarker der Schilddrüsenhormonachse in verschiedenen Tierexperimenten erwiesen. Demnach weisen die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung das Potential auf, tierexperimentellen Aufwand zu verringern.
Generell ermöglichen die erfindungsgemäßen Verfahren den Nachweis und die Quantifizierung freigesetzten (”freien”) Iodids und sind somit für die Charakterisierung von Proben wertvoll, die in Kontakt mit iodierten Verbindungen stehen und klassifiziert werden müssen, z. B., Transport-, Reaktions- oder Anwendungsbehältnisse für Chemikalien, Nahrungsmittel oder medizinische Produkte.
Somit besteht eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Bestimmung der katalytischen Aktivität eines oder mehrerer Moleküle mit deiodierender Aktivität, umfassend i) Bereitstellen eines aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität; ii) Bereitstellen einer Substratverbindung für das in i) definierte Molekül; iii) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis ii) definiert unter geeigneten Bedingungen; iv) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und v) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren. Gegebenenfalls kann das Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung als weiteren Schritt vi) das Vergleichen der aus Schritt v) erhaltenen Informationen mit einem oder mehreren Referenzwerten umfassen.
Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Identifikation eines Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines Moleküls, das auf seine deiodierende Aktivität getestet wird; ii) Bereitstellen einer Substratverbindung; iii) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis ii) definiert unter geeigneten Bedingungen; iv) gegebenenfalls, Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und v) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren.
Eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Identifikation einer Substratverbindung für ein Molekül mit deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität; ii) Bereitstellen einer als Substrat für besagtes Molekül zu testenden Verbindung; iii) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis ii) definiert unter geeigneten Bedingungen; iv) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und v) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren.
Eine vierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Identifikation eines Effektors der katalytischen Aktivität eines Moleküls mit deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität; ii) Bereitstellen einer Substratverbindung für besagtes Molekül; iii) Bereitstellen einer Testverbindung, die auf ihren Einfluss auf besagte katalytische Aktivität getestet wird; iv) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis iii) definiert unter geeigneten Bedingungen; v) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und vi) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren; und vii) gegebenenfalls Vergleichen der Menge an freiem Iodid in An- und Abwesenheit besagter Testverbindung.
Eine erste Art bevorzugter Ausführungsformen jedes der erfindungsgemäßen Verfahren (d. h., der 1., 2., 3. oder 4. Ausführungsform) kann eine Sequenz besagten aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität umfassen bzw. verwenden, die tierischen oder humanen, vorzugsweise humanen Ursprungs oder davon abgeleitet ist.
Eine zweite Art bevorzugter Ausführungsformen jedes der erfindungsgemäßen Verfahren (d. h., der 1., 2., 3. oder 4. Ausführungsform) kann ein gereinigtes oder rekombinantes aktives Molekül mit biologisch deiodierender Aktivität umfassen bzw. verwenden.
Eine dritte Art bevorzugter Ausführungsformen jedes der erfindungsgemäßen Verfahren (d. h., der 1., 2., 3. oder 4. Ausführungsform) kann die Abtrennung des freien Iodids mittels Ionenaustauschchromatographie umfassen bzw. verwenden.
Eine vierte Art bevorzugter Ausführungsformen jedes der erfindungsgemäßen Verfahren (d. h., der 1., 2., 3. oder 4. Ausführungsform) kann für die Bestimmung der Menge an freiem Iodid eine Reaktion basierend auf den Grundlagen des Verfahrens nach Sandell und Kolthoff umfassen bzw. verwenden.
Eine fünfte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Testsatz zur Bestimmung der katalytischen Aktivität eines oder mehrerer Moleküle mit deiodierender Aktivität umfassend a) Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität, vorzugsweise eine DIO, noch bevorzugter eine rekombinante DIO und noch weiter bevorzugt ein rekombinantes DIO Isoenzym; b) ein oder mehrere Substratverbindungen für besagtes Molekül mit biologisch deiodierender Aktivität; und gegebenenfalls c) einen geeigneten Reaktionspuffer und/oder Cosubstrate zur Durchführung der Deiodierungsreaktion der Reaktionspartner a) und b); und/oder d) ein oder mehrere Teströhrchen oder Mikrotiterplatten; und/oder e) ein oder mehrere Teströhrchen oder Mikrotiterplatten die Ionenaustauschchromatographie material enthalten; und/oder f) Reagenzien zur Herstellung einer Iodlösung; und/oder g) Reagenzien zur Herstellung einer Inhibitorlösung für das Molekül wie in a) definiert; und/oder h) ein Reagenz zum Stoppen besagter Deiodierungsreaktion; und/oder i) Reagenzien zur Durchführung der Iodnachweisreaktion; und/oder k) ein oder mehrere geeignete Pipetten, Spritzen oder Messvorrichtungen. Besagte Satzbestandteile c) bis k) sind für sich und in Kombination optionale Bestandteile des Testsatzes. Die genannten Satzbestandteile c) bis k) liegen innerhalb des üblichen Fachwissens des Fachmannes.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bestehen in der Verwendung jedes der erfindungsgemäßen Verfahrens für a) die Identifikation von pro- oder eukaryontischen Zell- oder Gewebeextrakten und/oder Molekülen mit biologisch deiodierender Aktivität; b) die Identifikation von Effektoren von Molekülen mit biologisch deiodierender Aktivität aus pro- oder eukaryontischen Zell- oder Gewebeextrakten, insbesondere aus Pflanzen, Algen oder Pilzen; und c) zur Identifikation eines Effektors eines Deiodase-Isoenzyms ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DIO 1, DIO 2, und DIO 3, insbesondere aus Substanzbibliotheken, Pflanzenextrakten, Algen oder Pilzen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die unten stehenden Definitionen sollen das Verständnisgemäß der Lehre der beanspruchten Erfindungen illustrieren und keine Inhalte ausschließen, die üblicherweise im Fachwissen des Fachmannes liegen oder von einer Person, die mit der Bestimmung der katalytischen Aktivität dehalogenierender Proteine und Nukleinsäuren vertraut ist.
Der Begriff ”katalytische Aktivität” bedeutet erfindungsgemäß vorzugsweise jede deiodierende katalytische oder enzymatische Aktivität. Gegebenenfalls kann die katalytische Aktivität ein Cosubstrat erfordern.
Der Begriff ”Molekül mit biologisch deiodierender Aktivität” bedeutet erfindungsgemäß vorzugsweise jedes Protein und Nukleinsäure mit einer dehalogenierenden Aktivität, insbesondere einer deiodierenden Aktivität, vorzugsweise Proteine des Dehalogenase-Typs, insbesondere des Deiodase-Typs (DIO) und am bevorzugten DIO 1, DIO 2 und/oder DIO 3, einschließlich der Analoge oder Derivate jedes der vorgenannten Moleküle.
Beispiele solcher Moleküle schließen Dehalogenasen, Deiodasen, Ribozyme und deren Derivate und Analoge ein. ”Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität” können aus pro- oder eukaryontischen Organismen, ausgewählten Geweben oder Zellarten stammen, einschließlich Tieren, Pflanzen, Pilzen und Menschen. ”Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität” können angereichert oder aufgereinigt sein, wobei sie im wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Nukleinsäuren sind, die nicht für besagte katalytische oder enzymatische Aktivität erforderlich sind, vorzugsweise sind sie frei von anderen dehalogenierenden oder deiodierenden Enzymaktivitäten, die aus der Anwesenheit von mehr als einem Isoenzym resultieren. Sofern das ”Molekül mit biologisch deiodierender Aktivität” ein integrales Membranprotein ist, kann es in einer Membran oder membranartigen. Umgebung bereitgestellt werden, falls dies zur Erhaltung seiner Aktivität erforderlich ist, z. B. durch das Bereitstellen von Mikrosomenpräparationen oder der Verwendung micellarer Umgebungen. ”Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität” können weiterhin rekombinanten Ursprungs sein, d. h., sie wurden mittels molekularbiologischer und rekombinanter Proteinexpressionstechniken hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind.
Der Begriff ”geeignete Bedingungen” bedeutet erfindungsgemäß jede Reaktionsbedingung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, insbesondere zur Bestimmung besagter deiodierender Aktivität. Vorzugsweise werden solche geeigneten Bedingungen spezifisch festgelegt in Bezug auf einen oder mehrere der Versuchsparameter ausgewählt aus Temperatur, Reaktionszeit, Konzentrationen der Reagenzien oder Reaktionspartner wie Enzyme, Substrate, Co-Substrate, Testverbindungen wie Effektoren, Lösungsmittelzusammensetzung, Puffersubstanzen, pH-Wert, Ionenstärke, u. a., ausgenommen solche Parameter, die nach der jeweiligen Zweckbestimmung des Testformates zu bestimmen sind. Geeignete Bedingungen werden vorzugsweise entsprechend der jeweils bekannten Referenzmoleküle oder bekannten Enzymen oder Nukleinsäuren gewählt.
Der Begriff ”Substrat” bedeutet erfindungsgemäß jede Verbindung, die bekanntermaßen als Reaktionspartner bezüglich der Iodidaufnahme oder abgabe der oben definierten Moleküle mit deiodierender Aktivität dient.
Der Begriff ”Testverbindung” gemäß der vorliegenden Erfindung soll jede Probe chemischen oder biologischen Ursprungs einschließen, z. B., eine reine oder ungereinigte Verbindung, Mischung oder Rohextrakt, gegebenenfalls angereichert oder aufgereinigt, die Gegenstand für die Untersuchung ihrer Eignung als Substrat oder Effektor der oben definierten Moleküle mit deiodierender Aktivität sein soll.
Der Begriff ”Molekül, das auf seine deiodierende Aktivität getestet wird” soll erfindungsgemäß jede Probe chemischen oder biologischen Ursprungs einschließen, z. B., eine reine oder ungereinigte Verbindung, Mischung oder Rohextrakt, gegebenenfalls angereichert oder gereinigt, die Gegenstand für die Untersuchung ihrer deiodierenden Aktivität sein soll.
Eine „Probe” kann erfindungsgemäß jeder lösliche Stoff, Flüssigkeit, Lösung oder Suspension einschließen, vorzugsweise biologischen oder chemischen Ursprungs. Proben können aus Substanzbibliotheken entnommen oder können mittels bekannter Techniken erhalten werden und können Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Urin, Samenflüssigkeit, Tränenflüssigkeit etc., Faeces, anderes Exkrement, separierte Zellen, Homogenate von Zellen, Geweben, oder Organen beinhalten, die aus tierischen (z. B., Maus, Ratte, Meerschweinchen, Hund, Schwein, Primaten) oder humanen Individuen, oder alternativ aus Pflanzen, Pilzen oder anderen pro- oder eukaryontischen Zellen stammen. Gewebe- oder Organproben können aus jedem Gewebe oder Organ z. B. durch Biopsie oder Nekropsie erhalten werden. Separierte Zellen können aus Körperflüssigkeiten oder Geweben oder Organen durch Abtrennungstechniken wie Zentrifugieren oder Zeltsortierung erhalten werden. Vorzugsweise werden Zell-, Gewebe- oder Organproben aus solchen Zellen, Geweben oder Organen entnommen, die Moleküle exprimieren, enthalten, akkumulieren, konzentrieren oder produzieren, auf die hierin Bezug genommen wird.
Die Probe kann nach dem Wissen des Fachmanns Gegenstand einer Behandlung und/oder Modifikation geworden sein, um Lagerung oder Weiterbehandlung in einem erfindungsgemäßen Verfahren zu erlauben. Zum Beispiel ist es dem Fachmann geläufig, Proben in einem geeigneten Puffer vorzubehandeln, zu verdünnen oder zu stabilisieren, oder, sofern die Probe aus spezifischen Quellen stammt, interferierende Substanzen vor Durchführung des Tests notwendigerweise zu entfernen.
Der Probe kann von einem Individuum gewählt sein, das vermutlich eine im Entstehen befindliche oder bestehende Störung aufweist, insbesondere kann die Probe von einem Individuum gewählt werden, das unter einer schweren Erkrankung, Krebs oder endokrinen Fehlfunktion leidet.
Der Begriff ”Abtrennung des freien Iodids” bedeutet erfindungsgemäß das teilweise oder vollständige Entfernen freien Iodids und/oder Iods, das während der Reaktion gebildet wurde. Die Abtrennung kann während des Reaktionsverlaufes oder nach Stoppen der Reaktion erfolgen, zum Beispiel durch einen Temperatur- oder pH-Sprung oder durch Zugabe eines inhibierenden oder denaturierenden Agens, wie bei Enzymen mit TCA. Es liegt innerhalb des Fachwissens des Fachmannes, ein geeignetes Trennungsverfahren zu wählen, das das nachfolgend durchgeführte Nachweisverfahren nicht stört oder mit diesem interferiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das freie Iodid mittels Ionenaustauschchromatographie abgetrennt. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das freie Iodid mittels einer Säulenfilterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen abgetrennt, die mit einem Ionenaustauschchromatographiematerial beladen ist. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Reaktion zunächst gestoppt, z. B., durch Denaturierung des Enzymes (z. B. mittels TCA oder Hitze), das Protein nachfolgend durch Zentrifugieren präzipitiert und das freie Iodid aus dem Überstand genommen.
Der Begriff ”Bestimmung der Menge an freiem Iodid” bedeutet jedes Verfahren oder jede Verfahrenskombination, die eine direkte oder indirekte Quantifizierung der Menge an Iodid und/oder Iods auf nicht-radioaktive Weise erlaubt, die während der Reaktion gebildet wurde. Solche nichtradioaktive Nachweisverfahren können kolorimetrische Verfahren ähnlich der Verfahren nach Sandell-Kolthoff oder Moxon & Dixon einschließen. Alternativ können Polymerlösungen, z. B. Stärke bzw. Glykogen (Amylose oder Amylopektin) verwendet werden, um ein farbiges Signal zum Nachweis zu erhalten, sofern freies Iodid zu Iod oxidiert wurde. Solche Farbsignale können mittels photometrischer Verfahren detektiert werden, die dem Fachmann geläufig sind. Andere hoch-sensitive nicht-radioaktive Nachweisverfahren für Iodid und/oder Iod können spektroskopische, luminometrische, elektrochemische, potentiometrische oder voltametrische Verfahren umfassen, die dem Fachmann geläufig sind.
Ein ”Effektor” bedeutet erfindungsgemäß einen selektiven, nicht-selektiven oder semi-selektiven Inhibitor, Aktivator oder Modulator eines oder mehrerer Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff ”Effektor” einen Effektor eines Enzyme mit DIO-Aktivität, wobei
ein ”selektiver DIO-Inhibitor” eine Verbindung bedeutet, die jeweils nur DIO I, DIO II oder DIO III, inhibiert; ein ”nicht-selektiver Inhibitor” eine Verbindung bedeutet, die DIO I, DIO II, und DIO III inhibiert; ein ”semi-selektiver Inhibitor” eine Verbindung bedeutet, die a) DIO I und DIO II, oder b) DIO I und DIO III, oder c) DIO II und DIO III inhibiert;
ein ”selektiver Aktivator” eine Verbindung bedeutet, die jeweils nur DIO I, DIO II oder DIO III, aktiviert; ein ”nicht-selektiver Aktivator” eine Verbindung bedeutet, die DIO I, DIO II, und DIO III aktiviert; ein ”semi-selektiver Aktivator” eine Verbindung bedeutet, die a) DIO I und DIO II, oder b) DIO I und DIO III, oder c) DIO II und DIO III aktiviert;
ein ”Modulator” eine Verbindung bedeutet, die das enzymatische Verhalten eines Moleküls mit Deiodase-Aktivität verändert, wobei die Veränderungen der enzymatischen Eigenschaften im Vergleich zu einem Aktivator oder Inhibitor in unterschiedlicher Weise erfolgen, wobei ein ”selektiver Modulator” eine Verbindung bedeutet, die jeweils nur DIO I, DIO II oder DIO III, moduliert; ein ”nicht-selektiver Modulator” eine Verbindung bedeutet, die DIO I, DIO II, und DIO III moduliert; und ein ”semi-selektiver Modulator” eine Verbindung bedeutet, die a) DIO I und DIO II, oder b) DIO I und DIO III, oder c) DIO II und DIO III moduliert;
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise als für die vorliegende Erfindung beschränkend zu verstehen sind.
Beispiele:
Das in den folgenden Beispielen ausgeführte Versuchsprotokoll funktionierte gut zur Aktivitätsbestimmung und Inhibitortitrierung mit mikrosomalangereicherten Leberextraktproben als Dio1-Quelle. Titrierungen mit PTU resultierten in einer Dosis-abhängigen Inhibition der Dio1-Aktivität, so dass der Test als Screening-Verfahren zur Ermittlung des inhibitorischen Potentials unbekannter Verbindungen geeignet ist. Das gleiche gilt für den Nachweis von Aktivatoren oder Modulatoren der katalytischen Aktivität von Molekülen mit deiodierender Aktivität. Der Test wurde weiterhin dazu verwendet, den vermeintlichen DIO1-Inhibitor Iopansäure (IA) zu charakterisieren, ein gut bekanntes Radiokontrastmittel, das zu einer spezifischen Klasse oraler cholecystographischer Mittel (OCA) gehört, die bekannt sind, den peripheren TH-Metabolismus zu beeinträchtigen. Eine andere ungünstige Nebenwirkung nach Verabreichung iodierter Kontrastmittel besteht in der Entwicklung einer Thyrotoxikose aufgrund der Iodfreisetzung im Patienten. Auch hier erlaubt die vorliegende Erfindung die Identifikation von solchen unerwünschten Nebenwirkungen durch in-vitro Versuche der DIO-abhängigen Iodidfreisetzung.
Materialien
Alle Chemikalien wurden in analytischer Reinheit verwendet und von Merck (Darmstadt, Deutschland) oder Sigma-Aldrich (München, Deutschland) bezogen. Ioxaglat und Iopromid wurden in ihrer klinischen Formulierung, Hexabrix (sodiumioxaglate und megluminioxaglate in wässriger Lösung, Guerbet, Sulzbach, Deutschland) bzw. Ultravist^TM 300 (Bayer AG, Berlin, Deutschland) eingesetzt. PTU und Dowex^TM W50-X2 wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Das vacuum plate prep manifold stammte von SUPELCO^TM (Sigma-Aldrich Gruppe), deep well Platten sowie Filterplatten, die zur Herstellung der Dowex-Säulen verwendet wurden, wurden dem Eppendorf Perfectprep^TM Plasmid 96 Vac Direct Bind Kit (Hamburg, Deutschland) entnommen.
Beispiel 1: Tiervorbereitung
Lebergewebe wurde hypo- und hyperthyroiden sowie entsprechenden Kontrollmäusen wie beschrieben entnommen (6). C57BI/6-Mäuse (gezüchtet an der Charité-Universitätsmedizin Berlin) wurden entsprechend der lokalen Vorschriften gehalten. Die Tiere wurden mit einer Kombination von 0,1% Methimazol (MMI) und 1% Perchlorat im Trinkwasser 21 Tage lang behandelt, um eine Schilddrüsenunterfunktion zu induzieren (7) oder erhielten 14 Tage lang 2× wöchentlich eine Injektion (i. p.) mit 30 μg T4/100 g Körpergewicht, um eine Schilddrüsenüberfunktion zu induzieren.
Beispiel 2: Enzymprobenvorbereitung
Leber von C57BL/6-Mäusen wurde entnommen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Gewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff in einem Mikrodismembrator (Braun, Melsungen, Deutschland) mittels einer 5 ml Teflonkammer mit Edelstahlkugeln pulverisiert. Aliquots des Gewebepulvers wurden auf Eis mittels eines Glashomogenisators in etwa 5 Volumenteilen Puffer A (250 mM Saccharose, 20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA und 1 mM DTT) und weiter durch Trituration mittels einer Spritze (0,9 mm Durchmesser) oder Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Homogenate wurden bei 13.000 g 15 min lang zentrifugiert und die Pellets in Puffer A resuspendiert, um die erwünschten mikrosomalen DIO1-Präparate als Enzymquelle zu erhalten. Die Proteinkonzentrationen wurden in einem modifizierten Bradford-Test (Bio-Rad, München, Deutschland) unter Verwendung von IgG als Standard bestimmt.
Beispiel 3: DIO Test
Pro 100 μl Reaktionsvolumen wurden 10 μl destilliertes Wasser oder PTU (10 mM, sofern nicht anders angegeben) in eine 0,2 ml Reaktionsvertiefung vorgelegt. 40 μl der mikrosomalen Dio1-Präparation wurden hinzugegeben. Die Substratmischung (10 μM rT3, 0,2 M KH₂PO₄ pH 6,8, 2 mM EDTA, 80 mM DTT) wurde frisch hergestellt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl der Enzymprobe wie in Beispiel 2 beschrieben oder Mischungen aus Enzymprobe und Testverbindung gestartet. Die Röhrchen wurden für eine definierte Zeitspanne bei 37°C inkubiert, die Reaktion auf Eis gestoppt und 5 min lang bei 15,000 g und 4°C zum Ausfällen des Proteins zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde sofort zur Quantifizierung des Iodidgehalts verwendet. Soweit zutreffend, ist jede Änderung bezüglich des oben genannten DIO-Testprotokolls in der Tabellenlegende genannt.
Beispiel 4: Iodidquantifizierung
Dowex W50-X2 Harz wurde zur Trennung der Reaktionspartner (Edukte oder Produkte) vom freien Iodid verwendet. Für die Durchführung als high throughput Testformat wurde das Chronatographieharz in ein 96-well Säulenpaket (0,6 ml/well, Filter Plate A, Eppendorf Perfectprep Plasmid 96 Vac Direct Bind Kit) gepackt. Nachfolgend wurden zu 75 μl des Überstandes der Deiodierungsreaktion 100 μl Essigsäure (10%) auf jede Säule gegeben. Das freie Iodid wurde aus den Säulen in eine 96-er deep well Platte mittels Vakuum eluiert. 50 μl des unverdünnten oder verdünnten Eluats wurden in eine Mikrotiterplatte transferiert, um deren Iodidgehalt nach der Sandell und Kolthoff Reaktion zu bestimmen.
Beispiel 5: Sandell-Kolthoff Reaktion
Ein Volumen von 50 μl Cer-Puffer (22 mM (NH₄)₄Ce(SO₄)₄, 0,44 M H₂SO₄) wurde zu allen Proben in der Mikrotiterplatte gegeben. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Arsenit-Puffer (25 mM NaAsO₂, 0,8 M NaCl, 0,5 M H₂SO₄) gestartet. Änderungen in der Absorption (OD bei 415 nm) wurden am Startpunkt und nach 21 min bestimmt. Die Temperatur während der Reaktion wurde bei 25°C gehalten (Microplate Reader 3550 mit Inkubator, Bio-Rad). Um einen schnellen und möglichst synchronen Start aller Proben sicherzustellen, wurden die Puffer mittels elektronischer Pipettiervorrichtungen (Proline 1200 μl, Biohit) mit serieller multikanal Abgabemöglichkeit zugegeben.
Änderungen der OD wurden nach Abzug der PTU-inhibierten Kontrollen unter Verwendung einer mitgeführten Standardkurve und polynomischer Standardfunktion auf die Iodidkonzentration in der Reaktion und weiter in Aktivität in pmol I^–(mg Protein·min) umgewandelt.
Die Säulen wurden durch mehrere Waschschritte regeneriert (1 × 180 μl Essigsäure (50%), 3 × 180 μl Essigsäure (10%)). Die feuchten Säulen wurden mit Plastikband versiegelt und bei 4°C aufbewahrt.

Es können verschiedene Herangehensweisen zur Herstellung einer Standardkurve zur Bestimmung der Gesamtenzymaktivitäten verwendet werden. Eine besteht darin, die Linearität von Iodidkonzentrationen und Änderungen der OD anzunehmen und dafür eine lineare Gleichung nach Abzug des Hintergrundes anzunehmen (ΔOD zu einer Iodid-freien Kontrolle enthaltend PTU als DIO I-Inhibitor). Die Standardkurve kann auch durch Verwendung einer polynomischen Funktion ersten, zweiten, oder dritten Grades ermittelt werden. In einer anderen Weise zur Verbesserung der Standardkurve wurde der Reaktionsmischung Iodid in einem Bereich von z. B. 0 bis 500 pmol hinzugegeben. Die resultierenden Eluate können unverdünnt oder verdünnt gemessen werden. Die Messungen wurden dreimal wiederholt und die erhaltenen Standardkurven zusammengeführt. Es wurden Polynome zweiten Grades ausgewählt, um die Enzymaktivität unter Standardbedingungen zu berechnen. Die Daten, die aus diesem Test erhalten wurden, waren stabil und reproduzierbar. Tabelle 1A Reproduzierbarkeit des DIO-Tests

pmol Iodid/100 μl Reaktionsvolumen (1:4 v/v)
pmol Iodid/100 μl Reaktionsvolumen (1:4 v/v)	Test 1 [dOD 415 nm]	Test 2 [dOD 415 nm]	Test 3 [dOD 415 nm]
0	0	0	0
20	0,041	0,059	0,031
40	0,06	0,052	0,092
60	0,06	0,090	0,080
80	0,133	0,111	0,125
100	0,155	0,126	0,144
120	0,199	0,174	0,206
140	0,257	0,18	0,202
160	0,267	0,222	0,248
180	0,267	0,269	0,307
200	0,296	0,282	0,364
220	0,322	0,308	0,351
240	0,398	0,348	0,38
260	0,338	0,332	0,383
280	0,439	0,349	0,412
300	0,420	0,362	0,419
320	0,421	0,383	0,431
340	0,432	0,404	0,497
360	0,501	0,4	0,511
380	0,442	0,387	0,539
400	0,447	0,478	0,529
420	0,531	0,440	0,531
440	0,516	0,436	0,544
460	0,505	0,469	0,588
480	0,589	0,494	0,577
500	0,642	0,517	0,628

Die Intra-Test und tageweise Reproduzierbarkeit wurde durch Messung einer Reihe von Reaktionen des gleichen Materials (Mäuseleberprotein, jeweils n = 96 und 46) an 2 verschiedenen Tagen (nicht gezeigt) überprüft. Eine Aktivität von 19,5 +/– 1,7 (Tag 1) und 20,4 +/– 2,7 (Tag 2) [Mittelwert +/– SD, pmol/(mg Protein·min)] wurde in den nicht inhibierten Reaktionen (75 μg Protein, 2 h bei 37°C) gemessen.
Beispiel 6: Flüssigchromatographie-Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS)
LC-MS/MS Analysen wurden wie beschrieben durchgeführt (7). Der Nachweis von IA erfolgte mittels negativer Elektrosprayionisation (ESI-) bei multipler Reaktionsbeobachtung (MRM mode). Alle substanzspezifischen massenspektrometrischen Arbeitsparameter wurden optimiert, indem 10 μM IA Standardlösung bei einer Flußrate von 10 μl/min in das Massenspektrometer direkt Injiziert wurden. Die gerätespezifischen Parameter des Massenspektrometers sind: Verhältnis Masse/Ladung der Mutterionen im ersten Quadrupol (m/z). Q1 für IA (569,9); Verhältnis Masse/Ladung der intensivsten Tochterionen im dritten Quadrupol (m/z) Q3 für IA (126,7), declustering potential (DP) für IA (–40,0 V), collision energy (CE) für IA (–22,0 V) und collision cell exit potential (CXP) für IA (–21,0 V).
Die MS/MS Spektren des [M-H](–) Ions von IA resultieren in einem Produktion von m/z 126 (Iod(–)). Somit wurde der Übergang (M-H)(–) → (M-H-I)(–) für den MS/MS-Nachweis genutzt. Ein kombiniertes MRM und negativer Vorläuferionenscan von m/z 126 wurde zur Untersuchung der Deiodierungsprodukte der IA (m/z 569) in einem m/z-Bereich von 300–600 gescannt. DIO-Reaktionen, die Gegenstand der IC-MS/MS-Analyse waren, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Enzymreaktionen wurden durch Zugabe von 0,1 Volumenteilen 100% Trichloressigsäure (TCA) zu der Reaktionsmischung gestoppt und die Proteine präzipitiert. Nach 5 min Zentrifugieren bei 14.000 g und 4°C wurden die Überstände bei –20°C bis zur LC-MS/MS-Analyse aufbewahrt. Die Injektionsvolumina betrugen 10 μl pro Probe.
Beispiel 7A: Effektorstudien

Der Test wurde mit Proben aus in-vivo Experimenten und als Screening-Test zur Identifizierung potentieller Effektoren der DIO durchgeführt. Dio1-Aktivitäten wurden von Gewebeproben hypo-, eu- und hyperthyroider Tiere (d. h. nachjeweiliger Behandlung mit methimazole (MMI)/NaClO₄, Lösungsmittel (Kontrolle) und T4) bestimmt. (Tabelle 1B). Tabelle 1B Enzymaktivität der Leberextraktproben

	pmol/(mg·min)
	Kontrollgruppe	MMI/NaClO₄ Gruppe	T4 Gruppe
	29,19	2,66	40,71
	30,94	0,57	41,16
	34,85	5,88	41,66
	37,05	0,69	42,69
	34,94	2,52	39,38
	35,74	6,30	48,41
Mittelwert (n = 3)	33,78	3,10	42,33
SD	3,04	2,48	3,17

Tabelle 1B: Leberproben von MMI und T4-behandelten Mäusegruppen wurden gemessen. Hepatische Dio1 Aktivität war in der hypothyroiden Gruppe stark herabgesetzt, während die T4-behandelte Gruppe einen signifikanten Anstieg der Dio1 Aktivität verglichen mit der Kontrollgruppe (100 μg Protein, 2 h bei 37°C, ANOVA mit Dunnets Post-Hoc, *** p < 0,001) zeigte.
Für das Screenen auf endokrine Disruptoren (ED) wurde die Testbasismischung aus einer einzigen Enzymquelle (microsomales Mausleberprotein enthaltend Dio1) hergestellt und verschiedene Konzentrationen (0,06–1000 μM) an PTU zur Reaktion hinzugefügt. Eine Dosis-Antwort-Kurve wurde gebildet und ein IC₅₀ von etwa 1,3 μM für PTU berechnet.

Tabelle 1C: Dosis-Antwort-Kurve der Titration des DIO1 Inhibitors PTU zeigte einen IC₅₀ von etwa 1,3 μM (66 μg Protein, 2 h bei 37°C).

[PTU]	Mittelwert (n = 4) [pmol/(mg·min)]	Standardabweichung
1000 μM	0,00	2,04
500 μM	0,60	0,54
250 μM	0,73	1,35
125 μM	0,21	1,13
62,5 μM	0,32	0,85
31,3 μM	1,94	1,25
15,6 μM	3,98	1,32
7,8 μM	5,13	2,88
3,9 μM	9,33	4,54
2 μM	14,13	1,67
1 μM	25,81	6,30
0,5 μM	30,92	2,09
0,24 μM	36,37	2,88
0,12 μM	40,52	5,51
0,06 μM	39,29	7,95

Beispiel 7B: Effektorstudien

Da Pflanzen der Spezies Brassica dafür bekannt sind, die Schilddrüsenachse potentiell zu beeinträchtigen, wurden isolierte Glucosinolat (GS)-Extrakte (eine hauptsächlich bioaktive Verbindung dieser Pflanzen) aus Wasserkresse auf ihr inhibitorisches Potential gegenüber der Dio1-Aktivität getestet. Die Versuche wurden mit unhydrolysierten und hydrolysierten Extrakten durchgeführt. Letztere reflektieren den Zustand dieser Verbindungen nach Aufnahme/Adsorption in den Organismus. Die Verbindungen wurden zu der vollständigen Dio1-Reaktionsmischung mit Mäuseleberextrakten als Dio1-Aktivitätsquelle wie oben beschrieben hinzugegeben. Es zeigte sich, dass Wasserkresse-GS die Dio1-Aktivität ausschließlich in ihrer hydrolysierten Form inhibiert, aber in einer unphysiologisch hohen Konzentration von etwa 100 μM.

Tabelle 1D		Wasserkresse-Glucosinolatehydrolysiert
	Kontrolle	1 μM	10 μM	100 μM
Dio1 = Aktivität [% der Kontrolle]	127	124	95	21
	103	125	108	9
	108	110	106	13
	99	87	72	32
	107	79	67	20
	118	66	78	22
	106
	81
	58
	93
MW	100	98	88	19
SD	19	25	18	8

	Wasserkresse-Glucosinolate – nicht hydrolysiert
	Kontrolle	1 μM	10 μM	100 μM
Dio1-Aktivität [% der Kontrolle]	127	103	137	115
	103	116	96	81
	108	88	121	102
	99	82	89	82
	107	71	55	84
	118	65	68	105
	106
	81
	58
	93
MW	100	88	94	95
SD	19	19	31	14

Beispiel 8: Substratstudien
Iopansäure (IA als mögliches Substrat) wurde in der Standardreaktionsmischung im Austausch für rT3 genommen. Eine wesentliche Iodidfreisetzung wurde in den Reaktionen festgestellt, was auf die Deiodierung der IA hinweist. Der Gesamtverbrauch an Substrat war in allen Versuchen weit oberhalb der für kinetische Untersuchungen kritischen 10% Grenze, nichtsdestotrotz zeigt der Zeitverlauf (vgl. Tabelle 2B) eine nahezu konstante Reaktionsgeschwindigkeit, auch nachdem mehr als 50% des Substrats verbraucht wurden. PTU Zugabe oder Hitze-Inaktivierung inhibierten die Iodidfreisetzung vollständig (Tabelle 2A). Tabelle 2A

Behandlung [Iopansäure] Mittelwert (n = 3) [pmol/(mg·min)] Standardabweichung

Keine 10 μM 37,54 2,85

PTU 10 μM 2,02 1,18

Hitze 10 μM 0,65 1,65
Tabelle 2A: Iopansäure (IA) wurde unter den Reaktionsbedingungen ohne rT3 getestet. Die Reaktion wurde durch PTU oder vorherige Hitze-Inaktivierung des Mäuseleberproteins inhibiert (66 μg Protein, 2 h bei 37°C, ANOVA mit Dunnets Post-Hoc, *** p < 0,001).
Weiterhin wurde die Reaktion mittels IC-MS/MS-Analyse untersucht. Entsprechend der festgestellten Iodidfreisetzung wurde eine Abnahme des IA-Peaks in der IC-MS/MS in den nicht inhibierten Reaktionen beobachtet (Beispiel 6). Genauere Betrachtung der Chromatogramme zeigte selektiv die Bildung eines einzigen Peaks von 444 kDa, womit gezeigt wurde, dass IA unter den experimentellen Bedingungen eine spezifische Mono-deiodierung ohne weitere nachfolgende Modifikationen erfährt.

Die Iodidfreisetzung aus IA war von den Substrat-(IA) und Cosubstrat-(DTT) Konzentrationen abhängig, was verifiziert, dass IA der DIO1 als Substrat dient. Im Vergleich dazu waren zweiweitere iodierte Radiokontrastmittel, Ioxaglat und Iopromid, unter den Testbedingungen stabil. Diese Ergebnisse zeigen, dass von den drei iodierten Radiokontrastmitteln DIO1 selektiv IA als Substrat annimmt und deren Monodeiodierung unter den Testbedingungen katalysiert (Tabelle 2B). Tabelle 2B-a

[DTT]	[Iopansäure]	Mittelwert (n = 2) [(pmol/(mg·min)]	Standardabweichung
10 μM	80 μM	11,06	0,32
	40 μM	11,87	0,62
	20 μM	11,89	0,86
	10 μM	8,73	0,48
	5 μM	4,56	1,16
	2,5 μM	2,46	0,10
	0 μM	0,27	0,33
	5 μM rT3	16,24	1,23

[DTT]	[Iopansäure]	Mittelwert (n = 2) [(pmol/(mg·min)]	Standardabweichung
20 μM	80 μM	16,06	2,22
	40 μM	15,96	0,76
	20 μM	13,74	0,53
	10 μM	11,07	0,93
	5 μM	6,90	0,11
	2,5 μM	2,37	0,22
	0 μM	1,00	0,14
	5 μM rT3	22,22	1,05

[DTT]	[Iopansäure]	Mittelwert (n = 2) [(pmol/(mg·min)]	Standardabweichung
40 μM	80 μM	19,21	0,44
	40 μM	19,20	2,26
	20 μM	17,49	0,69
	10 μM	9,54	0,31
	5 μM	7,24	0,06
	2,5 μM	2,62	0,08
	0 μM	1,54	0,30
	5 μM rT3	25,37	0,18

Tabelle 2B-b

Substrat	Zeit [min]	Mittelwert (n = 3) [(pmol/(mg·min)]	Standardabweichung
rT3	0	5,98	16,54
	30	101,23	26,29
	60	210,43	17,85
	90	327,09	68,61
Iopansäure	0	2,50	6,24
	30	31,18	7,59
	60	64,20	19,51
	90	85,34	13,56
Iopromid	0	17,90	17,50
	30	1,87	5,80
	60	10,46	0,45
	90	0,84	8,03
Tabelle 2B-b Forts.
Ioxaglat	0	31,63	24,52
	30	4,91	9,80
	60	2,15	3,83
	90	3,40	13,43

Tabelle 2B: Die Reaktion war von der DTT-Konzentration als reduzierendes Co-Substrat abhängig. V_max wurde durch steigende DTT-Konzentrationen beschleunigt. Die Iodidfreisetzung stieg mit der Zeit sowohl bei rT3 als auch IA an, während bei den zwei anderen iodierten Röntgenkontrastmittel, Ioxaglat und Iopromid, keine Iodidfreisetzung in der PTU-abhängigen enzymatischen Umsetzung unter den experimentellen Bedingungen erfolgte. Dieses Ergebnis zeigt, dass IA, das als Deiodierungs-Inhibitor bekannt ist, als ein Substrat der DIO1 identifiziert wurde.
Zum einen sind die nicht-radioaktiven Testverfahren in verschiedener Hinsicht eine Verbesserung des klassischen DIO-Tests, z. B. bezüglich Kosten, Durchsatz, Handhabung, Flexibilität und Unabhängigkeit von radioaktiven Tracern. Letztere eröffnet zudem mit der Eignung des Assays ein neues Gebiet, jede iodierte Verbindung auf ihr Potential als DIO-Substrat und Quelle einer Iodidfreisetzung unter verschiedenen Inkubationsbedingungen auszutesten. Zum anderen stellen sie praktische Hochdurchsatztechniken dar, um Moleküle mit deiodierenden Aktivitäten sowie Modulatoren der DIO-Aktivität zu identifizieren und zu charakterisieren.
Literaturnachweise:

1. Leonard JL & Rosenberg IN 1978 Thyroxine 5'-deiodinase activity of rat kidney: observations on activation by thiols and inhibition by propylthiouracil. Endocrinology 103:2137–2144
2. Piehl S et al. 2008 Development of a validated liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the distinction of thyronine and thyronamine constitutional isomers and for the identification of new deiodinase substrates. Rapid Commun Mass Spectrom 22:3286–3296
3. Sandell EB & Kolthoff IM 1937 Micro determination of iodine by a catalytic method. Microchimica Acta 1:9–25
4. Moxon RED & Dixon EJ 1980 Semi-automatic method for the determination of total iodine in food. Analyst 105, 344–352
5. Waltz F, Pillette L, Ambroise Y 2009 A nonradioactive iodide uptake assay for sodium iodide symporter function. Anal Biochem 396:91–95
6. Braun D, Kinne A, Brauer AU, Sapin R, Klein MO, Kohrle J, Wirth EK, Schweizer U 2011 Developmental and cell type-specific expression of thyroid hormone transporters in the mouse brain and in primary brain cells. Glia 59:463–471
7. Kinne A, Kleinau G, Hoefig CS, Gruters A, Kohrle J, Krause G, Schweizer U 2010 Essential molecular determinants for thyroid hormone transport and first structural implications for monocarboxylate transporter 8. J Biol Chem 285:28054–28063

Claims

Verfahren zur Bestimmung der katalytischen Aktivität eines oder mehrerer Moleküle mit deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität; ii) Bereitstellen einer Substratverbindung für das in i) definierte Molekül; iii) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis ii) definiert unter geeigneten Bedingungen; iv) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und v) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren.
Verfahren zur Identifikation eines Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines Molekül, das auf, seine deiodierende Aktivität getestet wird; ii) Bereitstellen einer Substratverbindung; iii) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis ii) definiert unter geeigneten Bedingungen; iv) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und v) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren.
Verfahren zur Identifikation einer Substratverbindung für ein Molekül mit deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität; ii) Bereitstellen einer als Substrat für besagtes Molekül zu testenden Verbindung; iii) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis ii) definiert unter geeigneten Bedingungen; iv) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und v) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren.
Verfahren zur Identifikation eines Effektors der katalytischen Aktivität eines Moleküls mit deiodierender Aktivität umfassend i) Bereitstellen eines aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität; ii) Bereitstellen einer Substratverbindung für besagtes Molekül; iii) Bereitstellen einer Testverbindung, die auf ihren Einfluss auf besagte katalytische Aktivität getestet wird; iv) Zusammenbringen der Reaktionspartner wie in i) bis iii) definiert unter geeigneten Bedingungen; v) gegebenenfalls Stoppen der Reaktion und/oder Abtrennung des freien Iodids von der Reaktionsmischung; und vi) Bestimmung der Menge an freiem Iodid durch ein nicht-radioaktives Nachweisverfahren; und vii) Vergleichen der Menge des freien Iodids in An- und Abwesenheit besagter Testverbindung.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Sequenz des besagten aktiven Moleküls mit biologisch deiodierender Aktivität humanen Ursprungs oder davon abgeleitet ist.
Das Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, worin besagtes aktives Molekül mit biologisch deiodierender Aktivität ein aufgereinigtes oder rekombinantes Molekül ist.
Das Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, worin die Abtrennung des freien Iodids mittels Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, worin die Bestimmung der Menge an freiem Iodid auf den Grundlagen des Verfahrens nach Sandell und Kolthoff basiert.
Testsatz zur Bestimmung der katalytischen Aktivität eines oder mehrerer Moleküle mit deiodierender Aktivität umfassend a) Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität; und b) ein oder mehreren Substratverbindungen für besagte Moleküle mit biologisch deiodierender Aktivität.
Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 1 zur Identifikation eines Effektors eines Deiodase-Isoenzyms, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DIO 1, DIO 2, und DIO 3.