DE60037311T2

DE60037311T2 - Homogene enzymatische bestimmungsmethode für vitamin b6

Info

Publication number: DE60037311T2
Application number: DE60037311T
Authority: DE
Inventors: Mingxu San Diego Xu; Qinghong San Diego HAN; Yuying San Diego TAN
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2020-02-02
Also published as: DE60037311D1; EP1157128B1; JP4098475B2; CA2361077A1; WO2000044932A9; WO2000044932A2; US6426194B1; WO2000044932A3; CN1353768A; CA2361077C; AU3220900A; AU780804B2; JP2002535009A; EP1157128A2; CN100420755C; ATE380253T1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine Bestimmungsmethode bzw. einen Assay für Vitamin B₆, dessen aktive Form Pyridoxal-5'-phosphat darstellt und Verbesserungen beim Nachweis von H₂S durch Verwenden von Fluoreszenz. Spezifischer betrifft die Erfindung Kits und Verfahren zum Bestimmen von Pyridoxalphosphatkonzentrationen in biologischen Fluiden unter Verwendung des Apoenzyms einer Homocysteinase. Sie betrifft auch das Verbessern der Empfindlichkeit solcher Assays durch Messen der Fluoreszenz eines Komplexes, der durch die Umsetzung von H₂S mit einem Dialkylphenylendiamin und einem Oxidationsmittel erzeugt wird.
Stand der Technik
Die PCT Veröffentlichung WO 99/05311 beschreibt Homocystein-Assays mit hoher Spezifität in biologischen Proben unter Verwendung eines Homocysteinase-Enzyms mit hoher Spezifität für Homocystein im Vergleich zu Cystein, welches für Mengen in biologischen Fluiden ausreicht. Dies erlaubt die Messung des gängigen Produkts H₂S, das von diesen Enzymen sowohl aus Cystein, als auch aus Homocystein erzeugt wird, als ein zulässiges Maß von Homocystein an sich in physiologischen Fluiden. Das erzeugte H₂S kann in einer Vielzahl von Wegen gemessen werden, wie in dieser Anmeldung beschrieben wird. Es ist nun gefunden worden, dass die Empfindlichkeit dieses Assays durch Messen der Fluoreszenz des Komplexes verbessert werden kann, der von Schwefelwasserstoff mit den chromoge nen Reagenzien und einem N,N-Dialkyl-p-phenylendiamin und einem Oxidationsmittel, wie Kaliumferricyanid, gebildet wird. Das sich ergebende 3,7-(Bisdialkylamino)phenothiazin-5-chlorid kann durch Absorption oder durch Anregung und Messung der Fluoreszenz gemessen werden.
Diese Messung der Fluoreszenz ist auch in dem hier beschriebenen Assay für Pyridoxal-5'-phosphat geeignet.
Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) stellt die biologisch aktive Form von Vitamin B₆ dar. PLP stellt einen Kofaktor für viele essenzielle Enzyme dar, die am Aminosäuremetabolismus und Fettsäuremetabolismus beteiligt sind, einschließlich Methioninase und Homocysteinase. Zusätzliche Enzyme, für die PLP die prosthetische Gruppe darstellt, schließen Glykogenphosphorylase, sowie alle Aminotransferasen ein. PLP ist auch an Decarboxylierungen, Desaminierungen, Racemisierungen, Transaminierungen und Aldolspaltungen am α-Kohlenstoffatom von Aminosäuren beteiligt. Diese Enzyme sind abhängig von PLP, um aktiv zu sein, sodass PLP einen wichtigen metabolischen Faktor darstellt. PLP wird von Vitamin B₆ abgeleitet; Vitamin B₆ wird von den meisten Säugetieren, einschließlich den Menschen, nicht synthetisiert. Daher wird dieses Vitamin am häufigsten in der Nahrung ergänzt. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass ein PLP-Mangel die stärkste ernährungsbedingte Korrelation zur Sterblichkeit durch kardiovaskuläre Erkrankungen darstellt. Mangel an Vitamin B₆ führt zu Symptomen, wie Dermatitis und nervösen Störungen.
Angesichts der Beteiligung von PLP am Metabolismus und seines Mangels an verschiedenen Krankheitszuständen, sind vielfältige Verfahren für die Bestimmung von Vitamin B₆-Mengen und des B₆-Status im Stand der Technik bekannt.
Mikrobiologische Assays unter Verwendung von Saccharomyces carlsbergensis (S. uvarum), Streptococcus faecium und Lactobacillus casei wurden verwendet, um verschiedene Formen von B6 im Blut und Urin zu messen. Fluorometrische Assays von 4'-Pyridoxalsäure im Urin und Blut-PLP nach einer Umwandlung in einen Cyanidkomplex oder eine Kondensation mit einem Fluorophor, wie Methylanthranilat, gefolgt durch eine Reduktion, werden auch verwendet. 4'-Pyridoxalsäure kann auch durch eine HPLC bestimmt werden. Die PLP-Konzentration im Plasma wird auch durch Bestimmen der Bildung von radioaktiv markiertem Tyramin aus markiertem Tyrosin unter Verwendung der Apoenzymform der Tyrosindecarboxylase gemessen. Das Referenzintervall beträgt 5 bis 30 ng/ml Plasma (Reynolds, R.D., Fed. Proc. (Abst. Nr. 2185) (1983) 42: 665). Diese Form des Assays ist auch kommerziell als ein "ALPCO"-Kit von der American Laborstory Products Company, Ltd. (Windham, New Hampshire 03087) verfügbar.
Blut-Transaminasen wurden als Indikator des Vitamin B₆-Status verwendet. Die Enzymaktivität im Serum ist bei B₆-Mangel erniedrigt. Die Freisetzung dieser Enzyme spiegelt jedoch den Zelltod wieder, und ein Zusammenbruch in verschiedenen Geweben verursacht Variabilität. Erythrozytenmengen der Aspartat- und Alaninaminotransferasen stellen eine bessere Indikation des Vitamin B₆-Status dar (Briggs, M., Hrsg., Vitamins in Human Biology and Medicine, Boca Raton, FL, CRC Press, Inc., 1981).
Eine Messung der Tryptophan-Metaboliten im Urin, wie Xanthurensäure, die einer oralen Gabe (2–5 g) L-Tryptophan folgt, wurde auch verwendet, um den B₆-Status auszuweisen. Mengen des Xanthurenats über der normalen Menge (25 mg/d) weisen auf einen Vitamin B₆-Mangel hin. Ein Methionin-Belastungstest wurde auch verwendet (Briggs, M., op. cit., Brown, M.L., Hrs. Present Knowledge in Nutrition. 6. Aufl., Washington, D.C., International Life Sciences Institute-Nutrition Foundation, 1990). Das Verhältnis von Cystathionin zu Cysteinsulfinsäure, das durch eine Aminosäureanalyse gemessen wird, ist in einem 24 h-Urin von B₆-Mangelpatienten nach einer 3 g Methioningabe erhöht.
Angesichts der steigenden Erkenntnis der Rolle des Vitamin B₆ bei kardiovaskulären Erkrankungen und des Ziels des öffentlichen Gesundheitswesens, Patienten auf ein Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung zu screenen, gibt es einen entscheidenden Bedarf für praktischere und verlässlichere analytische Verfahren, die verwendet werden können, um PLP-/Vitamin B₆-Mengen in Patienten zu bestimmen. Von diesen Verfahren wird erwartet, dass sie einen erheblichen medizinischen Nutzen sowohl in jenen Fällen bereitstellen, in denen verminderte PLP-/Vitamin B₆-Konzentrationen ein Risiko für einen besonderen Krankheitszustand für ein Individuum darstellen, als auch in Fällen, in denen verminderte PLP-/Vitamin B₆-Konzentrationen ein nachweisbares Nebenprodukt eines bestehenden Krankheitszustands darstellen.
Solche analytischen Verfahren würden einen großen Nutzen durch Vorhersagen der Anfälligkeit eines Patienten für eine kardiovaskuläre Erkrankung, bevor ein Ausbruch durch andere Verfahren nachgewiesen werden kann, bereitstellen. Diesbezüglich würde ein großer Nutzen durch Anpassen solcher Verfahren an das weit verbreitete Screenen der allgemeinen Bevölkerung und insbesondere an Patienten, für die ansonsten ein Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung vermutet wird, erreicht werden. Es ist daher entscheidend wichtig, dass der Assay praktisch zu verwenden, einfach und kostengünstig ist. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren, einschließlich diagnostischen Kits für eine Verwendung im klinischen Rahmen bereit.
Die Reinigung der Methionin-γ-lyase aus Trichomonas vaginalis und die nachfolgende Präparation des Apoenzyms wird von Lockwood & Coombs, Biochem. J., 279: 675–682 (1991) beschrieben.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung stellt Assays bereit, die in der Lage sind, PLP-Mengen in einer biologischen Probe, Fluiden, wie Urin, Gewebefluid, Blut, Gesamtblut, Blutserum oder Blutplasma aus einer Person nachzuweisen. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind daher geeignet, das Risiko für eine kardiovaskuläre Erkrankung zu untersuchen. Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen auch Verfahren zum Bestimmen von Ergebnissen ein, die nicht nur in Verfahren zum Bestimmen von PLP/B₆ geeignet sind, sondern auch in Assayverfahren, die die Herstellung von H₂S als Produkt und Maß des gewünschten Analyten unter Verwendung von chromogenen Reagenzien untersuchen.
In einem Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Bestimmen der Menge von PLP in einer biologischen Probe gerichtet, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit der Apoenzymform eines PLP-benötigenden Enzyms umfasst, welches ein Produkt erzeugen kann, wenn PLP anwesend ist, vorzugsweise eines, das durch Farbe oder Fluoreszenz bestimmbar ist. Daher stellen bevorzugte erfindungsgemäße Apoenzyme Homocystein-/Methionin-alpha-gamma-Lyasen dar, bei denen das normalerweise verbundene PLP entfernt wurde. Auch bevorzugt sind solche Enzyme, die Schwefelwasserstoff aus Cystein erzeugen. Diese Enzyme erzeugen Produkte, die einfach durch kolorimetrische oder fluorometrische Hilfsmittel nachweisbar sind, wenn die Enzyme in die/zu der Holoenzymform wiederhergestellt/aktiviert werden. Die Empfindlichkeit des Assays wird durch die Funktion des PLP als ein Kofaktor stark vervielfacht; es können daher große Mengen Substrat verwendet und große Mengen des Produkts erzeugt werden.
In anderen Aspekten ist die Erfindung auf diagnostische Kits für die erfindungsgemäßen Verfahren gerichtet.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Spektrum der Homocystein-alpha,gamma-Lyase, die aus Trichomonas vaginalis kloniert wurde, vor der Behandlung mit Hydroxylamin.
2 zeigt das Spektrum der Homocystein-alpha,gamma-Lyase, die aus Trichomonas vaginalis kloniert wurde, nach der Behandlung mit Hydroxylamin.
3 zeigt eine Standardkurve, die die Konzentration des PLP in Standards verschiedener Konzentrationen unter Verwendung des erfindungsgemäßen kolorimetrischen Assays bestimmt.
4 zeigt ähnliche Ergebnisse, wobei die kolorimetrischen Messungen durch Fluoreszenzmessungen ersetzt wurden.
5 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse beim Verwenden von kolorimetrischen oder fluorometrischen Nachweishilfsmitteln.
6 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung des PLP im Plasma von drei Patienten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, verglichen mit einer solchen Bestimmung durch eine HPLC.
7 zeigt einen Vergleich der Fluoreszenz und der ultravioletten Absorption eines chromogenen Produkts bei verschiedenen Schwefelwasserstoffkonzentrationen.
8 zeigt eine Standardkurve von L-Homocystein, die durch Fluoreszenz bestimmt wurde.
9 zeigt eine Kurve von Homocystein, die das relative Fehlen der Interferenz durch Cystein in einem enzymatischen Homocystein-Assay zeigt, gemessen durch Fluoreszenz, und die Ergebnisse einer Blutprobe, die aus einem Stich in den Finger stammt.
10 zeigt das relative Fehlen der Interferenz durch Cystein, gemessen durch Fluoreszenz bei verschiedenen Cystein-Konzentrationen.
Art und Weise der Ausführung der Erfindung
Erniedrigte PLP-/Vitamin-Mengen werden als ein Risikofaktor für eine kardiovaskuläre Erkrankung erkannt. Die vorliegende Erfindung ist auf PLP-/Vitamin B₆-Assayverfahren und Reagenzien dafür gerichtet, die direkt eine praktische Bestimmung der PLP-/Vitamin B₆-Konzentrationen in einer biologischen Probe erlau ben. Gemäß der Ausführung der Erfindung werden die PLP-/Vitamin B₆-Konzentrationen in biologischen Proben enzymatisch mit Apoenzymformen von PLP-benötigenden Enzymen bestimmt, die hier nachfolgend als "Apoenzyme" bezeichnet werden. Die Menge des PLP in der Probe bestimmt die Wiederherstellung ihrer entsprechenden Holoenzymaktivität, wodurch die PLP-/Vitamin B₆-Konzentrationen in einer gegebenen Probe durch Nachweisen der enzymatischen Aktivität nach einem Kontakt mit einem geeigneten Substrat bestimmt werden. Bevorzugte Apoenzyme sind jene Formen von Methioninase/Homocysteinase/Cysteinase, die den Abbau dieser Aminosäuren katalysieren. Es ist bevorzugt, Schwefelwasserstoff als Produkt nachzuweisen, obwohl Ammoniak als Produkt und/oder Umwandlungsprodukte, wie alpha-Ketobutyrate oder andere Produkte auch nachgewiesen werden können.
Bezüglich der Methioninase und der Homocysteinase ist ein nmol Enzym äquivalent zu 172 μg Enzym, was äquivalent zu ungefähr 10 Einheiten Enzym ist. Da das Methioninase- oder Homocysteinase-Holoenzym 1 PLP pro Untereinheit oder 4 PLP pro Tetramer bindet, können nur 4 nmol PLP 1 nmol Enzym, was äquivalent zu 10 Einheiten Enzym ist, aktivieren. Zehn Einheiten des Enzyms werden eine OD oder 10 oder mehr in der Anwesenheit von 10 mM Homocystein oder Methionin ergeben, gemessen nach dem Methylenblau-Prinzip, durch Bleisulfidbildung aus Bleiacetat oder durch die Bildung von α-Ketobutyrat unter Verwendung des MBTH-Assays. Serummengen von B₆ induzieren eine Katalyse von 10^–2 M Homocystein oder Methionin, eine Vervielfältigung von 10⁷.
Das Signal von dem wiederhergestellten/aktivierten Holoenzym weist eine ausreichende Stärke auf, sodass eine homogene klinische Chemie-Diagnostik möglich ist. Ein spektralfotometrischer Nachweis stellt das praktischste Nachweisverfahren dar. Mit "Nachweisen eines Produkts spektralfotometrisch" ist gemeint, dass das Produkt entweder gefärbt oder fluoreszent ist. Der spektralfotometrische Nachweis kann mit dem bloßen Auge stattfinden oder er kann ein Instrument, wie ein Spektralfotometer oder ein Fluorometer verwenden. Der Assay weist auch eine ausreichende Empfindlichkeit auf, sodass ein Trockenchemie-Test, wie durch das Ver wenden eines Teststreifens, auf dem das Apoenzym immobilisiert ist, verwendet werden kann, um PLP im Serum oder Urin nachzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das zur Homocysteinase und Methioninase gehörende PLP vorsichtig durch einen Kontakt mit Hydroxylamin entfernt, um zu Apoenzymen zu führen, die später erneut PLP binden können, um die Aktivität wiederherzustellen. Zum Beispiel werden solche Apoenzyme auf Filterpapier, wie auf einem Teststreifen, immobilisiert, dessen Apoenzyme anschließend durch PLP in Serum oder Urin aktiviert werden können. Die Teststreifenreaktion kann in der Anwesenheit von überschüssigem Homocystein oder Cystein und von Bleiacetat stattfinden, welches den Teststreifen aufgrund der Bildung von Bleisulfid schwarz färben wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erhält das wiederhergestellte Holoenzym die Fähigkeit zurück, Homocystein zu hydrolysieren, wobei H₂S in direkter Beziehung zu der Menge des verfügbaren PLP hergestellt wird.
Die Apoenzyme können auf irgendeinem festen Medium durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, immobilisiert werden, wie Filterpapier oder Kügelchen, die für eine Erleichterung des Kontakts mit der Probe geeignet sind. Die Wiederherstellung/Aktivierung der enzymatischen Aktivität kann auch in der Anwesenheit von geeignetem/n Substraten für das Holoenzym stattfinden, um zur Herstellung von enzymatischen Produkten zu führen, die direkt die Menge des PLP in der Probe widerspiegeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Erfindung in der Anwesenheit von überschüssigem Homocystein ausgeführt werden, im Fall von PLP-freier Methionin-/Homocystein-α,γ-Lyase. Zusätzlich kann die Erfindung unter Verwendung von Methylenblauderivaten, um H₂S zu messen, das von Homocystein oder Cystein abgeleitet wurde, unter Verwendung von MBTH, um α-Ketobutyrat zu messen, unter Verwendung von Bleiacetat, um H₂S zu messen oder unter Verwendung von Dimethylphenylendiamin (PDA), Diethyl-PDA, Dipropyl-PDA oder Dibutyl-PDA, um H₂S zu messen, ausgeführt werden. Alternativ kann die Erfindung durch Messen von Pyruvat, das von überschüssigem Cystein unter Verwendung von Lactatdehydrogenase und NADH abgeleitet wurde, oder durch Messen von Ammoniak in der Anwesenheit von überschüssigem Methionin, Homocystein oder Cystein ausgeführt werden. Wenn sie auf Filterpapier immobilisiert wurde, kann die Erfindung auch mit einem Überschuss an Homocystein oder Cystein und Bleiacetat ausgeführt werden, um Bleisulfid in der Anwesenheit der oben erwähnten Lyasen zu bilden.
Es wird erkannt, dass die Gesamtkonzentration des PLP, das in biologischen Proben anwesend ist, zum Beispiel in Körperfluiden, PLP-Moleküle einschließt, die nicht in freier Form vorliegen, sondern stattdessen kovalent an andere Moleküle gekoppelt sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Schritte zum Freisetzen von diesem PLP vor dem Messen ein. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass, da die erfindungsgemäße Methodik genaue Messungen von freien PLP-Mengen bereitstellt, nützliche Information bereitgestellt wird, selbst wenn nur freies PLP nachgewiesen wird. Unter vielen Verwendungen wird erwartet, dass eine solche Information als ein schnelles anfängliches diagnostisches Werkzeug, zum Beispiel bei einem anfänglichen Testen auf Vitamin-B₆-Mangel, sehr geeignet ist.
Abhängig von der Art der Messung können andere Probenpräparationstechniken wünschenswert oder nötig sein. Zum Beispiel sollte für kolorimetrische Assays Gesamtblut behandelt werden, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Eine weitere Fraktionierung kann auch wünschenswert sein.
Die Erfindung betrifft auch diagnostische Kits, die diese Apoenzyme enthalten, und insbesondere einen homogenen diagnostischen Test für Vitamin B₆ unter Verwendung einer Methionin-/Homocystein-α,γ-Lyase oder Cystein-α,β-Lyase, wie jener aus Pseudomonas putida und Trichomonas vaginalis und Pseudomonas ovalis. Diese Enzyme können aus natürlich vorkommenden Quellen oder mit rekombinanten Hilfsmitteln hergestellt werden.
Die technischen Aspekte der Erfindung umfassen die Isolierung von Methioninase oder Homocysteinase, in welcher eine ausreichende PLP-Entfernung vorliegt, um irgendeine Aktivität in der Anwesenheit von überschüssigem Methionin oder Ho mocystein zu eliminieren. Dieser Zustand wird es nM Mengen von B₆ erlauben, das Enzym zu aktivieren und das hoch verstärkte Signal zu ergeben, wie es oben beschrieben wurde. Daher wirkt das Enzym analog zu einem Transistor oder Schalter, um ein hoch verstärktes Signal aus einer sehr geringen Menge Vitamin B₆ zu ergeben.
Ein PLP-benötigendes Enzym, das in der Ausführung der Erfindung bevorzugt wird, stellt L-Methionin-alpha-desamino-gamma-mercaptomethanlyase (Methioninlyase) dar, die von der bakteriellen Quelle Pseudomonas putida abgeleitet wurde. Das Enzym wurde von S. Ito, et al., Journal of Biochemistry, (1976), 79, S. 1263–1272, gereinigt, und es wurde bestimmt, dass es ein Molekulargewicht von ungefähr 170 kDa aufweist. In dem von S. Ito untersuchten Zusammenhang führt das Enzym die alpha-gamma-Eliminierung des Methionins zu alpha-Ketobutyrat, Methanthiol und Ammoniak durch. Wenn Homocystein das Substrat darstellt, dann sind alpha-Ketobutyrat, Schwefelwasserstoff und Ammoniak die sich ergebenden Produkte. Das homologe Enzym wurde aus Pseudomonas ovales isoliert, H. Tanaka, et al., Biochemistry, (1977), 16, S. 100–106. Verfahren für die rekombinante Herstellung von diesem Peudomonas-Enzym wurden auch entwickelt (siehe Y. Tan, et al., Protein Expression and Purification, (1997), 9, S. 233–245) und es wird erwartet, dass die Verwendung des rekombinanten Enzyms in der erfindungsgemäßen klinischen Ausführung Vorteile im Sinne der Kosten des diagnostischen Kits und der Assay-Reproduzierbarkeit bereitstellt. Die Literaturstelle von Tan, et al. beschreibt die Konstruktion eines Klons, der pAC1-1 bezeichnet wurde, der eine einzelne Kopie der Enzym kodierenden Sequenz enthält. Ein zusätzlicher Klon, der pAC1-11 bezeichnet wurde, wurde konstruiert, der zwei Kopien der kodierenden Sequenz in Tandemanordnung enthält. Wie bei der pAC1-1 Struktur wurde das pT7-7-Plasmid verwendet, um pAC1-11 zu konstruieren. Die zwei kodierenden Sequenzen sind miteinander an einer BamHI-Stelle verbunden, wobei das erste Gen über NdeI mit BamHI verbunden ist und das zweite über BamHI mit einer weiteren BamHI-Stelle verbunden ist.
Die Substratspezifität des P. putida-Enzyms wurde auch bestimmt. Zum Beispiel berichten N. Esski, et al., Methods in Enzymology (1987) 143, S. 459–465, dass auf einer relativen Aktivitätskala, wo die Aktivität gegenüber Methionin auf 100 gesetzt ist, Cystein bei 10 liegt und Homocystein bei 180 liegt. Das Enzym ist daher reaktiv gegenüber allen drei Thiol enthaltenden Aminosäuren. Es sollte erwähnt werden, dass die deutliche 10-fache Präferenz des Enzyms für Homocystein gegenüber Cystein nicht berücksichtigt, dass die Konzentration von Cystein in einer biologischen Probe hoch sein kann -- in der Tat im Allgemeinen viel höher liegt, als die Konzentration von Homocystein. PLP benötigende Enzyme mit geeigneter katalytischer Aktivität können von anderen Pseudomonas-Arten oder von anderen Bakterien unter Verwendung von routinemäßigen Screeningverfahren und Assays, die im Stand der Technik bekannt sind, abgeleitet werden.
Eine zusätzliche Gruppe von Organismen, die eine Quelle für ein PLP benötigendes Enzym darstellen, das für die Ausführung der Erfindung geeignet ist, stellen Arten der Trichomonaden-Parasiten und verwandten Protozoen dar. Trichomonaden stellen wichtige Parasiten des Urogenitaltrakts dar und sind aerotolerante (aber trotzdem anaerobe) flagellate Protozoen. Die Verwendung von Homocysteinase aus Trichomonas vaginalis wird gemäß der Ausführung der Erfindung bevorzugt.
Es wird angenommen, dass Trichmonas-Arten ihre Fähigkeiten für den Thiolmetabolismus verwenden, um der Sauerstofftoxizität in Wirtsgeweben entgegenzuwirken, siehe K.-W. Thong, et al., Experimental Parasitology (1987) 63, S. 143–151, und die darin zitierten Veröffentlichungen. Obwohl eine erhebliche Variation in der Homocysteinaseaktivität (dort Homocysteindesulfuraseaktivität genannt) zwischen Trichomonas-Arten gefunden wurde, ist es Routine, verfügbare Arten auf annehmbare Mengen der Enzymaktivität zu screenen. Allgemein gesprochen wird es bevorzugt, dass ein PLP benötigendes Enzym eine spezifische Aktivität von mindestens ungefähr 1 Unit/mg gereinigtem Protein für die Verwendung in den unten beschriebenen Assays aufweisen sollte, obwohl es durchaus in den Fähigkeiten des Fachmanns liegt, Variationen dieser Assays zu entwerfen, die größere oder niedrigere Mengen des Enzyms oder Enzympräparationen mit unterschiedlicher Enzymaktivität verwenden. Es wird erwähnt, dass das hoch gereinigte und aktive P. putida-Enzym eine spezifische Aktivität von ungefähr 20 Einheiten/mg aufweist (eine Einheit der Enzymaktivität kann als 1 Mikromol Substrat, das pro Minute unter Standardbedingungen umgesetzt wird, beschrieben werden (siehe Y. Tan, et al., oben)).
Die von K.-W. Thong, et al. (1987) oben berichtete "Homocystein-Desulfuraseaktivität" scheint sich aus demselben Enzym zu ergeben, das für die Methionin katabolisierende Aktivität in Trichomonas verantwortlich ist, und welches später von B.C. Lockwood und G.H. Coombs Methionin-gamma-Lyase bezeichnet wurde (Biochemical Journal (1991) 279, S. 675–682), worin auch die Reinigung dieses Enzyms beschrieben wird. Wie zuvor erwähnt, wird die Verwendung der Methionin-gamma-Lyase (eine Homocysteinase) aus Trichomonas vaginalis in der Ausführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Verwendung einer rekombinanten Version des T. vaginalis-Enzyms wird auch bevorzugt. Eine potenzielle Klonierungsstrategie folgt den Beobachtungen von A. Marcos, et al., FEMS Microbiology Letters (1996) 135, S. 259–264, dass T. vaginalis-Gene wenig Introns aufweisen können. Folglich würde eine genomische Bibliothek konstruiert werden (siehe D.E. Riley, et al., Molecular and Biochemical Parasitology (1992) 51, S. 161–164) und mit DNA-Fragmenten gescreent werden, die dem Pseudomonas putida-Enzym entsprechen und von welchen erwartet wird, dass sie einige teilweise konservierte Sequenzen widerspiegeln.
Lockwood, et al., listen auch andere Berichte von Bakterien auf, die eine Methionin-gamma-Lyase-Aktivität aufweisen, einschließlich Arten von Pseudomonas, Clostridium und Aeromonas.
Es wird erwartet, dass solche Arten Quellen einer Homocysteinaseaktivität darstellen, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Zusätzliche Organismen, von denen erwartet wird, dass sie geeignete Homocysteinase- Enzyme bereitstellen, sind bestimme marine Algen (siehe zum Beispiel D.A. Gage, et al., Nature (1997) 387, S. 891–897, die Arten mit einem extensiven Methionin-abhängigen Metabolismus beschreiben), Schwefelbakterien und Geomikroben oder andere Mikroben, die unter extremen Umweltbedingungen leben (siehe zum Beispiel R.A. Kerr, Science (1997) 276, S. 703–704, und E. Pennist, Science (1997) 276, S. 705–706). Zusätzliche Beispiele für Mikroorganismen, die geeignete Quellen für Enzyme des Homocysteinasetyps darstellen können, schließen Bakterien ein, die an der Parodontalerkrankung beteiligt sind, wie jene, die befähigt sind, flüchtige Schwefelverbindungen aus Cystein zu bilden. Siehe diesbezüglich S. Persson, et al., Oral Microbiology and Immunology (1990) 5(4), S. 195–201.
Die oben zitierte PCT Veröffentlichung WO 99/05311 beschreibt auch verschiedene Formen der Homocysteinase, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Einige dieser Enyzme stellen chimäre Formen von jenen dar, die aus P. putida und T. vaginalis isoliert wurden.
Zusätzlich beschreibt die PCT Veröffentlichung WO 99/05311 verschiedene Verfahren zum Nachweisen der Produkte des Holoenzyms. Zum Beispiel wird ein Assay für alpha-Ketobutyrat oder Pyruvat (abhängig davon, ob das Substrat Homocystein, Methionin oder Cystein ist) beschrieben. Der Assay verwendet 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH), um ein Reaktionsprodukt zu entwickeln, das durch Spektralfotometrie bei 320 nm gemessen werden kann. Bleiacetat oder andere Bleisalze können auch verwendet werden, um H₂S, das aus Homocystein oder Cystein hergestellt wurde, nachzuweisen und zu messen. Weiterhin kann der Ammoniak, der in der Reaktion hergestellt wurde, unter Verwendung von zum Beispiel Glutamatdehydrogenase nachgewiesen werden. Methanthiol, das hergestellt wurde, wenn das Substrat Methionin ist, kann durch die Herstellung von Methylenblau, einschließlich Varianten davon, durch Messen der optischen Dichte bei ungefähr 500 nm unter Verwendung eines N,N-Dialkyl-p-phenylendiamins als Reaktant nachgewiesen werden. Dies wird von Tanaka, et al., J. Applied Biochem (1980) 2; 439–444 beschrieben.
Wie oben dargelegt wurde, stellt ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweisen des Produkts des Holoenzyms als ein Maß der PLP-Konzentration ein chromogenes Verfahren dar, in dem das hergestellte H₂S mit einem N,N-Dialkyl-p-phenylendiamin, einschließlich den Dimethyl-, Diethyl-, Dipropyl- oder Dibutylformen, umgesetzt wird. Diese Verbindungen sind kommerziell verfügbar. Das Gemisch aus dem N,N-Dialkylphenylendiamin mit H₂S wird in ein gefärbtes Produkt, 3,7-bis-Dialkylaminophenylthiazin-5-chlorid, durch die Behandlung mit einem Oxidationsmittel, wie Eisenionen, die durch Kaliumferricyanid bereitgestellt werden, umgewandelt. Die sich ergebende Verbindung wird durch die optische Absorption bei ungefähr 675 nm gemessen.
Eine Verbesserung der Empfindlichkeit kann eher durch Messen der Fluoreszenz dieses Produkts, als der Absorption erhalten werden. Typischerweise wird es einer Anregungswellenlänge von ungefähr 665 nm ausgesetzt, und die Fluoreszenz wird bei 690 nm abgelesen. Eine solche Verbesserung der Empfindlichkeit ist wichtig, wenn das Enzym verwendet wird, um die Anwesenheit eines Substrats, wie Homocystein, zu untersuchen. Obwohl hilfreich, ist der Anstieg der Empfindlichkeit jedoch nicht so signifikant in den Formaten, in denen der Analyt den Kofaktor PLP darstellt, da die Empfindlichkeit des Assays durch Anheben der Konzentration des Substrats Homocystein verstärkt werden kann. Beispiel 4 unten zeigt die Vorteile von Fluoreszenzassays im Zusammenhang eines Assays für Homocystein.
Es wird erkannt werden, dass der erfindungsgemäße Assay für PLP/B₆ in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden kann. Ein Format, in dem das Enzym auf einem Festträger bereitgestellt wird, wird oben beschrieben. Es wird jedoch ein homogener Assay bevorzugt, der ein einfaches Ablesen im Sinne einer spektralfotometrischen Messung bietet.
Auch eingeschlossen in die Erfindung sind diagnostische Kits zur Durchführung des PLP-Assays. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kit das Apoenzym in der Form einer rekombinanten Homocysteinase, eine Standard- Pyridoxalphosphat-Probe, chromogene Reagenzien, vorzugsweise N,N-Dibutyl-p-phenylendiamin, ein Oxidationsmittel, wie Kaliumferricyanid, und das Substrat Homocystein einschließen. Diese Reagenzien werden in einer praktischen Weise verpackt, vorzugsweise mit geeigneten Puffern, um das Binden des Pyridoxalphosphats in der Probe an das Apoenzym zu bewirken, und einen Assaypuffer zur Durchführung des Assays. Der Bindungspuffer ist vorzugsweise leicht sauer im Bereich von pH-Wert 4,5–5,5, vorzugsweise ungefähr 5–5,2, und der Assaypuffer ist vorzugsweise leicht alkalisch, vorzugsweise pH-Wert 7,5–9, weiter bevorzugt ungefähr pH-Wert 8,3. Ein geeignetes stabilisierendes Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol, und ein Chelator, wie EDTA, können auch eingeschlossen sein.
Die folgenden Beispiele beabsichtigen, die Erfindung zu illustrieren, sie aber nicht zu beschränken.
Beispiel 1
Herstellung von Apo-Homocysteinase
Ein Gemisch wurde aus 1,80 ml rekombinanter Holo-Homocysteinase (rHCYase)-Lösung (3,75 mg Protein/ml 20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,6), 40 μl 100 mM Dithiothreitol (DTT) und 200 μl 100 mM Hydroxylaminphosphat hergestellt. Das Gemisch wurde gevortext und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Die sich ergebende Apo-rHCYase wurde mit 45% Ammoniumsulfat präzipitiert und bei 1200 RPM für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 1 ml 20 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) gelöst. Ein ml dieser Lösung wurde auf eine 1,0 × 10 cm G-25 Gel-Filtrationssäule geladen, und die Säule wurde mit 20 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) gewaschen. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, und es wurde gefunden, dass sie frei von Pyridoxalphosphat (PLP) waren. Die Konzentration des Proteins wurde auf 0,1 mg Protein/ml, die 1,0 mg/ml Trehalose enthielt, eingestellt.
Eine Analyse bestätigte, dass die Apo-rHCYase nur 0,018 ± 0,002 mol PLP pro Untereinheit enthielt (beim Verwenden desselben Assays enthält das Holoenzym 0,93 ± 0,10 mol PLP pro Untereinheit).
Beispiel 2
Assay für Pyridoxalphosphat
Eine Standardkurve wurde durch Verdünnen von 5 μl einer Lösung, die verschiedene Konzentrationen von PLP enthielt, in 0,475 ml Bindungspuffer (10 mM Citrat/Phosphatpuffer, pH-Wert 5,2, 1 mM EDTA, 0,2 mM DTT) hergestellt und mit 20 μl der Apo-rHCYase-Lösung gemischt, die wie in Beispiel 1 beschrieben, in Assaypuffer (200 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,3, 1 mM EDTA, 0,2 mM DTT) hergestellt wurde. Die Proben wurden gut gemischt und bei 37°C für 120 Minuten präinkubiert und vor Licht geschützt. 50 μl einer Lösung aus DL-Homocystein (eine Konzentration) wurden zu 0,450 ml Assaypuffer hinzugefügt, gemischt und zu den oben erwähnten Proben hinzugefügt, gut gemischt und bei 37°C für 20 Minuten mit Schutz vor Licht präinkubiert. Zu diesem Gemisch wurden anschließend 50 μl 50 mM Di-n-butyl-p-phenylendiamin, das in 6 M HCl gelöst war, und 50 μl 50 mM Kaliumferricyanid, das in Assaypuffer gelöst war, hinzugefügt, gemischt und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Die Absorption wurde anschließend bei 675 nm abgelesen. Die Absorption ist über den Bereich von 0–200 nM PLP linear, wie in 1 gezeigt wird.
Die Empfindlichkeit des Assays wird etwas verstärkt durch das Ersetzen der Messung der optischen Dichte bei 675 durch eine Fluoreszenzbestimmung. Unter Verwendung desselben Protokolls, aber des Ablesens der Ergebnisse unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 640 nm und einer Emissionswellenlänge von 675 nm wird die in 2 gezeigte Standardkurve erhalten. Ein Vergleich dieser Ergebnisse ist in 3 gezeigt. In beiden Fällen wird eine lineare Kurve erhalten, beim Verwenden der Fluoreszenzemission wird ein Messwert von 110 Fluoreszenzeinheiten bei einer Konzentration von 100 nM erhalten, beim Verwen den der Absorption wird ein Messwert von 0,25 OD (ungefähr) bei 675 nm erhalten.
Beispiel 3
Bestimmung von PLP in humanem Plasma
Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, aber die 5 μl der PLP enthaltenden Standardlösung wurden durch 5 μl mit EDTA behandeltem Plasma ersetzt.
Die Ergebnisse für drei Individuen sind in 4 gezeigt. Die Ergebnisse sind im Vergleich zu einer Bestimmung von PLP unter Verwendung des Verfahrens der HPLC gezeigt, wie in J. Chromatog (1996) 722: 295–301 beschrieben. Obwohl die absoluten Werte, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden, sich von jenen, die durch eine HPLC erhalten wurden, unterscheiden, stehen sie, wie in 4 gezeigt, in einer linearen Beziehung zueinander. Es gibt jedoch eine gute Übereinstimmung mit Ergebnissen, die unter Verwendung des Apotyrosincarboxylase-Assays des ALPCO-Kits erhalten wurden:

Probe erfindungsgemäßes Verfahren ALPCO-Verfahren

1 248 nM 223 nM

2 62 nM 54 nM

Claims

Verfahren zum Nachweis der Konzentration von Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren (a) das Inkubieren der biologischen Probe oder einer Fraktion davon mit einer Apoenzymform von PLP-abhängiger Homocysteinase, Methioninase oder Cysteinase in Gegenwart von ausreichendem Substrat zum Bewirken der Umwandlung in ein spektrophotometrisch beobachtbares Produkt, welches proportional zur Konzentration von PLP in der Probe ist, und (b) das spektrophotometrische Nachweisen des Produkts umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das spektrophotometrische Nachweisen durch Visualisieren mit bloßem Auge erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nachgewiesene Produkt Schwefelwasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Schwefelwasserstoff durch Umsetzung mit N,N-Dialkyl-p-phenylendiamin und ein Oxidationsmittel nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Produkt durch Fluoreszenz nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Schwefelwasserstoff durch Beobachten der Präzipitation von Schwefelwasserstoff mit Bleiionen nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Apoenzym eine Homocysteinase ist.
Kit zum Testen von PLP in einem biologischen Fluid, welcher verpackte Reagenzien umfaßt, wobei die verpackten Reagenzien ein verpacktes Apoenzym, welches eine rekombinante Homocysteinase, Cysteinase oder Methioninase ist, und verpackte chromogene Reagenzien umfaßt.
Kit nach Anspruch 8, wobei die chromogenen Reagenzien eine Lösung von N,N-Dialkyl-p-phenylendiamin und ein Oxidationsmittel umfassen.
Kit nach Anspruch 8 oder 9, welcher weiter mindestens eines aus einem Testpuffer im Bereich von 4,5–5,5, verpacktes Pyridoxalphosphat, verpackte Homocysteinase, Cysteinase oder Methioninase beinhaltet.
Apoenyzmform von Methioninase, Homocysteinase oder Cysteinase in isolierter und gereinigter Form, mit der Maßgabe, das das Apoenzym anders ist als das von Methionin γ-lyase (EC 4.4.1.11), isoliert von Trichomonas vaginalis.
Apoenzym nach Anspruch 11, welches an einen Festträger gekoppelt ist.