DE60212998T2

DE60212998T2 - Gesamtcystein-assay

Info

Publication number: DE60212998T2
Application number: DE60212998T
Authority: DE
Inventors: Qinghong San Diego HAN; Mingxu La Jolla XU; Yuying San Diego TAN; Li San Diego TANG
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2022-11-21
Also published as: US20030162239A1; EP1456399B1; JP4319545B2; JP2005509441A; AU2002346474B2; CN1589329A; WO2003044220A1; EP1456399A4; KR20050044561A; CA2466503A1; ATE332394T1; CN1289688C; DE60212998D1; CA2466503C; KR100976967B1; US6927038B2; AU2002346474A1; EP1456399A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft einen Enzymtest auf Gesamtcystein im Blut oder Plasma.
Technischer Hintergrund
Es hat sich gezeigt, dass der Gesamtcysteingehalt in Plasma (tCys) ein bedeutender Parameter bei der Bewertung des Risikos von Herz-Kreislauferkrankungen ist. Es wurde berichtet, dass ein geringes Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit tCys-Spiegeln bei 250-275 μm in Zusammenhang steht, wohingegen ein höheres Risiko sowohl mit geringeren Spiegeln (< 225 μm) als auch höheren Spiegeln (> 300 μm) verbunden ist. El-Khairy et al., Circulation (2001) 2544-2549. Die Spiegel des Cysteinhomologen Homocystein (tHcy) sind ebenfalls relevant, da das Risiko von Venenthrombose und Myokard-Infarkt bei hohen Homocysteinspiegeln erhöht ist. Marcucci et al., M. J. Clin. Pathol. (2001) 116:56-60. Die Cystein- und Homocysteinspiegel hängen anscheinend miteinander zusammen, da Cystein zusammen mit Albumin ein kovalenter Träger des Homocysteins im Kreislauf ist und Cystein auch ein Kompetitor von Homocystein bei der Zellaufnahme sowie ein Homocysteinmetabolit auf dem Transsulfurierungsweg ist. Hortin et al., J. Clin. Chem. (2001) 47:1121-1124.
Es ist auch bekannt, dass Individuen mit sehr hohen Homocysteinspiegeln, aufgrund von Defekten im Transsulfurierungsweg niedrige Gesamtcysteinspiegel aufweisen. Es wird davon ausgegangen, dass bei 1 Prozent der Bevölkerung das verantwortliche Enzym defekt ist; ein Homozygoten-Mangel führt zu Homocysteinurie. Das Verhältnis von tCys/tHcy hilft bei der Identifizierung von Heterozygoten. Boddie et al., Metabolism (1998) 47:207-211.
Zusätzlich sind die Gesamtcysteinspiegel mit dem Alter, der Cholesterin-Gesamtkonzentration, dem diastolischen Blutdruck und dem Kaffeeverzehr, allerdings im Gegensatz zu den Homocysteinspiegeln nicht mit dem Raucherstatus, der Folat- und Vitaminaufnahme, der Herzrate und der körperlichen Aktivität korreliert. El-Khairy et al., Am. J. Clin. Nutr: (1999) 70:1016-1024. Sowohl tCys als auch tHcy hängen mit Nierenversagen zusammen. Mansoor et al., Clin. Chem. (1993) 39:980-985.
Verfahren zur enzymatischen Bestimmung des Gesamthomocysteins sind ebenfalls bereits beschrieben worden, beispielsweise in der U.S.-Patentschrift 6,468,762, ausgegeben am 22. Oktober 2002, sowie in den U.S.-Patentschriften 6,066,467; 5,998,191; und 5,985,540.
Ein alternatives Verfahren zum Messen von Gesamtcystein ist ebenfalls in der oben erwähnten '762-Patentschrift beschrieben, wobei die zu testende Probe mit einer nicht spezifischen Desulfurase behandelt wird. Zum direkten Messen von Cystein werden S-Adenosylhomocysteinhydrolase (SAHH) und Adenosin der Probe, die eine nicht spezifische Desulfurase enthält, zugesetzt. Wo die SAHH in ausreichender Menge vorhanden ist, um die Umwandlung des gesamten Homocysteins in der Probe zu SAH zu katalysieren, schützt sie so vor der Einwirkung der Desulfurase. Somit werden in der Probe nur die Cysteinspiegel gemessen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen alternativen enzymbasierenden Test auf Gesamtcystein bereit. Die Verfügbarkeit beider Tests gestattet nicht nur jeweils die Bestimmung von Gesamthomocystein und Gesamtcystein, sondern auch des tCys/tHcy-Verhältnisses.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Gesamtcystein in biologischen Fluiden, vorzugsweise Plasma, durch gleichzeitige oder anderweitig kontrollierte Bestimmung sowohl von Gesamthomocystein als auch der Summe der Konzentrationen von Homocystein und Cystein. Unter Verwendung eines Enzyms, das sowohl mit Homocystein als auch Cystein unter Produktion von Ammoniak, Schwefelwasserstoff und der jeweiligen α-Ketocarbonsäuren (α-Ketoglutarat oder Pyruvat) in einem Reaktionsgefäß reaktiv ist, und eines Enzyms, das diese Desulfurase (Lyase)-Reaktion nur mit Homocystein in einem anderen Reaktionsgefäß durchführt, kann die Cystein-Gesamtkonzentration durch die Differenz der Konzentrationen bestimmt werden. Die Ergebnisse sind im Bereich von 2 μm-1000 μm im Plasma linear.
Somit betrifft die Erfindung nach einem Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung der Cystein-Gesamtkonzentration (tCys) in einem biologischen Fluid, wobei das Verfahren umfasst:

a) Behandeln einer ersten Probe des Fluides mit einer Desulfurase, die sowohl Homocystein als auch Cystein als Substrate verwendet, und Messen des Spiegels von mindestens einem Produkt der Desulfurase, um die Summe der Konzentrationen von Cystein (tCys) und Homocystein (tHcy) zu bestimmen;
b) Behandeln einer zweiten Probe des biologischen Fluides mit einer Desulfurase, die Homocystein spezifisch als Substrat verwendet, und Messen des Spiegels von mindestens einem Produkt, um die Gesamtkonzentration von Homocystein (tHcy) zu bestimmen, und
c) Subtrahieren des in Schritt b) erhaltenen tCys von tCys plus tHcy, das in Schritt a) erhalten wurde, um die Cystein-Gesamtkonzentration zu erhalten.

Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Testsatz zur Bestimmung der Cystein-Gesamtkonzentration, welcher in geeigneten Behältern eine Desulfurase, die sowohl Cystein als auch Homocystein als Substrat verwendet, eine Desulfurase, die Homocystein spezifisch als Substrat verwendet, und gegebenenfalls ein Reduktionsmittel, das zur Reduktion von Disulfidbindungen effektiv ist, und gegebenenfalls Reagentien zum Nachweis von mindestens einem Produkt, zusammen mit den Anweisungen zur Durchführung des Tests umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der eine typische Standardkurve des erfindungsgemäßen Tests zeigt.
Möglichkeiten zur Durchführung der Erfindung
Die Erfindung nutzt die spezifischen Merkmale von Desulfuraseenzymen, derart, dass die Spiegel sowohl von Homocystein als auch Cystein in einem biologischen Fluid bestimmt werden können. Geeignete biologische Fluide umfassen beispielsweise Urin, Cerebrospinalfluid, Blut und Plasma oder Serum. Ein Großteil der Literatur bezüglich der Bedeutung dieser Konzentrationen, betrifft Plasma oder Serum. Es ist in der Regel notwendig, die Probe mit einem Reduktionsmittel zu behandeln, das zur Reduktion von Disulfidbindungen wirksam ist (wie Dithioerythrit), bevor der Test durchgeführt wird, um das Cystein und Homocystein aus ihrer Sulfhydrylform freizusetzen, so dass sie der Wirkung einer Desulfurase ausgesetzt sind.
Die bei der Erfindung geeigneten Desulfurasen wandeln Homocystein in α-Ketoglutarat, Ammoniak und Schwefelwasserstoff um, und können Cystein zu Pyruvat, Ammoniak und Schwefelwasserstoff umwandeln. Die Tests können das Messen eines dieser Produkte umfassen. Allerdings kann die Messung von Ammoniak oder Schwefelwasserstoff zweckmäßiger sein, da die gleiche Methode bezüglich der Produkte beider Aminosäuren angewandt werden kann. Die Messung von Schwefelwasserstoff ist besonders bevorzugt, da die Verfahren für diese Messung relativ einfach sind. Allerdings sind aus der Technik Mittel zur Messung von α-Ketoglutarat, Pyruvat und Ammoniak gut bekannt, und die Messung der Konzentrationen dieser Produkte könnte ebenfalls angewandt werden.
Ein Verfahren zum zweckmäßigen Messen der Konzentrationen des produzierten Schwefelwasserstoffs ist in der oben erwähnten U.S. 6,468,762 beschrieben. Kurz gesagt, umfasst dieses Verfahren ein erstes chromogenes Reagens, das ein Oxidationsmittel, wie Kaliumferricyanid und ein zweites chromogenes Reagens, das N,N-Dialkylphenylendiamin umfasst, enthält. Diese Reagentien reagieren mit dem resultierenden Schwefelwasserstoff unter Bildung eines gefärbten Komplexes, der entweder spektralphotometrisch durch Extinktion oder mit stärkerer Empfindlichkeit unter Anwendung der Fluoreszenz des Komplexes gemessen werden kann. Ein bevorzugtes Dialkylphenylendiamin ist N,N-Dipropylphenylendiamin (DPPDA) oder N,N-Dibutylphenylendiamin (DBPDA).
Allerdings kann jedes beliebige Verfahren zum Messen der Produkte der Reaktion eingesetzt werden.
Wie vorstehend angegeben, verwendet eine der Desulfurasen sowohl Cystein als auch Homocystein als Substrat, so dass, wenn ein biologisches Fluid mit dieser Desulfurase behandelt wird, nach einer geeigneten Reaktionszeit, wie 10 oder 20 Minuten, die Desulfurase sowohl das Homocystein als auch das Cystein in der biologischen Probe zu den oben beschriebenen Produkten umgewandelt hat. Solche Enzyme können zweckmäßigerweise aus Mikroorganismen hergestellt werden. Ein Beispiel ist die rekombinant hergestellte Desulfurase aus Pseudomonas putida. Dieses Enzym ist von Tan et al., Protein Purification & Expression (1997) 9:233-245 beschrieben.
Eine auf Homocystein spezifische Desulfurase, die hier als "Homocysteinase" bezeichnet wird, ist als Enzym mit Desulfuraseaktivität bezüglich Homocystein als Substrat mit Präferenz gegenüber Cystein als Substrat beschrieben, derart, dass die Menge an bei der Behandlung einer Probe von Blut, Urin, Gewebefluid, Serum oder Plasma eines Individuums mit dem Enzym freigesetztem Schwefelwasserstoff im Wesentlichen aus dem Homocystein und nicht aus dem Cystein in der Probe erzeugt wird, auch wenn die Konzentration an Homocystein 10fach geringer ist als die Konzentration an Cystein in der Probe. Alternativ besitzt die Homocysteinase die Eigenschaft, dass mindestens etwa 90 % des durch die Einwirkung der Homocysteinase bei Kontakt mit einem biologischen Fluid produzierten Schwefelwasserstoff dem Homocystein zugeschrieben werden, wenn die Konzentrationen an Homocystein und Cystein in dem Fluid etwa 5-15 μM bzw. etwa 100-300 μM betragen, oder wobei mindestens etwa 90 % des durch die Einwirkung der Homocysteinase bei Kontakt eines biologischen Fluides produzierten Schwefelwasserstoffs dem Homocystein zugeschrieben werden, wenn das Fluid 5 μM Homocystein und 1000 μM Cystein enthält. Solche Homocysteinaseenzyme sind in der oben erwähnten Patentschrift und von Han et al., Protein Expression & Purification (1998) 14:267-274 beschrieben.
Wie vorstehend ausgeführt, wird das biologische Fluid in zwei vorzugsweise identisch behandelte Proben aufgeteilt. Typischerweise wird die Desulfurase einer Probe in einer Menge zugesetzt, die benötigt wird, um eine Endkonzentration von 0,01-1.000 μg/ml zu erreichen; und die Reagentien werden in Mengen zugesetzt, die benötigt werden, um Endkonzentrationen von 1-100 mM Puffer, stärker bevorzugt von 5-50 mM Puffer; 0,01-100 mM Reduktionsmittel für die Disulfidbindungen, noch stärker bevorzugt 0,1-10 mM zu erreichen. Die Natur der restlichen Reagentien hängt von dem für den Test gewählten Nachweissystem ab.
Bei einem bestimmten bevorzugten Nachweisverfahren wird die Konzentration der Produkte durch Messen der Konzentration oder Menge des produzierten Schwefelwasserstoffs bestimmt. Besonders bevorzugt ist die Bildung eines Chromophors, das auch die Eigenschaft hat, dass es fluoresziert. Der Komplex, der in der Lage ist, Licht zu absorbieren und zu fluoreszieren, wird durch Reaktion mit N,N-Dialkylphenylendiamin, vorzugsweise N,N-Dipropylphenylendiamin (DPPDA) oder N,N-Dibutylphenylendiamin (DBPDA), erhalten. Anschließend wird der Komplex mit einem geeigneten Oxidationsmittel, wie Eisen-Ionen beispielsweise in der Form von Ferricyanid, oxidiert. Obgleich die Konzentration des gefärbten Reagens durch Extinktion, typischerweise bei etwa 670-680 nm, gemessen werden kann, könnte die Fluoreszenz dieses Komplexes unter Anwendung einer Anregungswellenlänge im Bereich von etwa 665 nm oder 640 nm und durch Messen der entsprechenden Emission bei niedrigeren Wellenlängen gemessen werden. Die Verwendung des Fluoreszenznachweises im Gegensatz zur Extinktion ist nachstehend erläutert, und es wird gezeigt, dass es die Empfindlichkeit des Tests verstärkt.
Die Ergebnisse in der Probe, die nicht spezifische Desulfurase enthält, stellen die Konzentrationsspiegel von tHcy plus tCys bereit. Die Ergebnisse in der Probe, die die Homocysteinase enthält, liefern die Konzentration von tCys. Somit liefert die Differenz dieser Konzentrationen die Cystein-Gesamtkonzentration in dem biologischen Fluid.
Das folgende Beispiel ist zur Erläuterung jedoch nicht zur Einschränkung der Erfindung angegeben.
Beispiel 1
Bestimmung von Cystein und Homocystein
Die zu testenden Proben werden in zwei Teile aufgeteilt: Ein Teil wird mit nicht spezifischer Desulfurase und der andere mit Homocysteinase behandelt.
In jedem Fall werden 10-20 μl Probe und entsprechend 980-990 μl Umwandlungspuffer auf insgesamt 1 ml Probe 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Der Umwandlungspuffer ist 20 mM Kaliumphosphat, pH 8,3, 150 mM NaCl, 30 μg/ml, 0,2 % Triton X-100 und 1 mM DTT.
Die Proben werden anschließend mit 10 μl rekombinanter Homocysteinase oder nicht spezifischer Desulfurase (0,275 mg) behandelt. Die Desulfurase wird rekombinant hergestellt und ist diejenige, die von Tan et al. (supra) beschrieben ist, isoliert aus P. putida. Die Homocysteinase ist diejenige die von Han et al. (supra), beschrieben ist. Beide Proben werden 10 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 50 μl Chromogen (40 mM N,N-Dibutyl-phenylendiaminhydrochlorid in 6 M HCl) und anschließende Zugabe von 50 μl Oxidationsmittel (40 mM Kaliumferricyanid in 20 mM Kaliumphosphat, pH 8,3) gestoppt. Sodann werden die Portionen 10 Minuten bei 37 °C inkubiert und durch Fluoreszenz mit einer Extinktionswellenlänge von 665 nm und einer Emulsionswellenlänge von 690 nm oder durch Extinktion bei 675 nm gelesen.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Cystein-Gesamtkonzentration (tCys) in einem biologischen Fluid, wobei das Verfahren umfasst: a) Behandeln einer ersten Probe des Fluids mit einer nicht-spezifischen Desulfurase, die sowohl Homocystein als auch Cystein als Substrate verwendet, und Messen des Spiegels von mindestens einem Produkt der Desulfurase, um die Summe der Konzentration von Cystein (tCys) und Homocystein (tHcy) zu bestimmen; b) Behandeln einer zweiten Probe des biologischen Fluids mit einer Homocysteinase, die Homocystein spezifisch als Substrat verwendet, und Messen des Spiegels von mindestens einem Produkt, um die Gesamtkonzentration an Homocystein (tHcy) zu bestimmen; und c) Subtrahieren des in Schritt b) erhaltenen tHcy von dem in Schritt a) erhaltenen (tCys + tHcy), um die Cystein-Gesamtkonzentration zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt a) und Schritt b) gemessene Produkt Schwefelwasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schwefelwasserstoff durch Behandeln mit einem Oxidationsmittel und einem Dialkylphenylendiamin gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Oxidationsmittel ein Eisen(III)-Ion ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht spezifische Desulfurase aus P. putida isolierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Homocysteinase aus T. vaginalis isolierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das biologische Fluid Serum oder Plasma ist.
Testsatz zur Bestimmung der Cystein-Gesamtkonzentration, welcher, in geeigneten Behältern, eine nicht spezifische Desulfurase, die sowohl Cystein als auch Homocystein als Substrat verwendet, eine Homocysteinase, die Homocystein spezifisch als Substrat verwendet, umfasst.
Testsatz nach Anspruch 8, welcher weiterhin ein Reduktionsmittel, das zur Reduktion von Disulfidbindungen wirksam ist, einschließt.
Testsatz nach Anspruch 8, welcher weiterhin Reagenzien zum Nachweis von mindestens einem Produkt einschließt.