KR20050044561A - 총 시스테인 검정법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 호모시스테이나제와 비특이적 데설푸라제를 갖는 체액의 유사 처리 부분을 체액 내의 총 시스테인 측정방법에 사용하는 것에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈액 또는 혈장 내의 총 시스테인에 대한 효소 검정법에 관한 것이다.
플라즈마 내의 총 시스테인 함량(tCys)이 심혈관 질환의 위험을 평가하는 중요한 매개변수임이 명백하다. 250 내지 275μM의 tCys 농도는 심혈관 질환의 위험이 낮은 반면, 더 낮은 농도(〈225μM) 및 더 높은 농도(〉300μM) 모두는 심혈관 질환의 위험이 더 높다고 보고되어 왔다[참조: El-Khairy, et al., Circulation (2001) 2544-2549]. 또한, 시스테인 동족체인 호모시스테인(tHcy)의 농도는 정맥 혈전증의 위험과 관련되며, 심근 경색증은 호모시스테인의 높은 농도에서 증가한다[참조: Marcucci, et al., M. J. Chin. Pathol.(2001) 116:56-60]. 시스테인 농도과 호모시스테인 농도는, 시스테인이 순환시 알부민과 함께 호모시스테인의 공유 담체(covalent carrier)이고 시스테인이 또한 세포 흡수에 있어 호모시스테인 뿐만 아니라 황전환 경로를 통한 호모시스테인 대사물의 경쟁자이기 때문에, 서로 관련된다[참조: Hortin, et al., J. Chin. Chem. (2001) 47:1121-1124].
또한, 황전환 경로시의 결핍으로 인해 호모시스테인의 농도가 매우 높은 개체는 총 시스테인의 농도가 낮다고 공지되어 있다. 집단의 1%가 관련 효소가 결핍되어 있고, 동형 접합성 결핍으로 인해 저인삼염혈증이 발생한다고 추정된다. tCys/tHcy의 비는 이질 접합체를 동정하는데 도움이 될 것이다[참조: Boddie, et al., Metabolism (1998) 47:207-211].
또한, 총 시스테인의 농도는 호모시스테인 농도과는 달리, 금연 상태, 엽산 및 비타민 섭취량, 심박 및 신체 활동을 제외한, 연령, 총 콜레스테롤 농도, 확장기 혈압 및 커피 소비량과 서로 관련된다[참조: El-Khairy, et al., Am. J. Clin, Nutr. (1999) 70: 1016-1024] tCys와 tHcy 둘 다는 신부전증과 관련된다[참조: Mansoor, et al., Clin. Chem. (1993) 39:980-985].
또한, 총 호모시스테인을 효소로 측정하는 방법은, 예를 들면, 명세서가 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,468,762호(허여일: 2002년 10월 22일) 뿐만 아니라, 미국 특허 제6,066,467호, 미국 특허 제5,998,191호 및 미국 특허 제5,985,540호에 기재되어 있다.
또한, 총 시스테인을 측정하는 대안적인 방법은 상기한 특허 '762호에 기재되어 있는데, 여기서 검정할 샘플은 비특이적 데설푸라제로 처리한다. 시스테인을 직접적으로 측정하기 위해, S-아데노실 호모시스테인 하이드롤라제(SAHH) 및 아데노신을 비특이적 데설푸라제 함유 샘플에 첨가하는데, 여기서 SAHH는 샘플 내의 호모시스테인 모두를 SAH로의 전환을 촉진시키기에 충분한 양으로 존재하여, 데설푸라제의 작용으로부터 호모시스테인을 보호한다. 따라서, 샘플 내의 시스테인 농도만을 측정한다.
본 발명은 총 시스테인에 대한 대안적인 효소계 검정법을 제공한다. 검정법 둘 다는 측정될 각각의 총 호모시스테인 및 총 시스테인 뿐만 아니라, tCys/tHcy 비에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 검정법의 전형적인 표준 곡선을 나타내는 그래프를 도시한 것이다.
본 발명의 수행 방식
본 발명은 호모시스테인과 시스테인 둘 다의 농도를 체액에서 측정할 수 있다는 데설푸라제 효소의 특이성을 이점으로 갖는다. 적합한 체액에는, 예를 들면, 소변, 뇌척수액, 혈액, 및 혈장 또는 혈청이 포함된다. 이러한 농도의 중요성과 관련한 문헌의 대부부은 혈장 또는 혈청에 관한 것이다. 일반적으로, 시스테인 및 호모시스테인을 이들의 설프하이드릴 형태로 유리시켜 데설푸라제의 작용을 받도록 하기 위해, 검정을 수행하기 전에, 샘플을 이황화물 결합을 감소시키기에 유효한 환원제(예: 디티오에리트리톨)로 처리할 필요가 있다.
본 발명에 유용한 데설푸라제는 호모시스테인을 α-케토글루타레이트, 암모니아 및 황화수소로 전환시키고, 시스테인을 피루베이트, 암모니아 및 황화수소로 전환시킬 수 있다. 검정법에는 이러한 생성물 모두를 측정할 수 있다. 그러나, 암모니아 또는 황화수소의 측정은, 동일한 방법이 두가지 아미노산의 생성물들에 대해 사용될 수 있기 때문에, 보다 편리할 수 있다. 황화수소의 측정은 이러한 측정 방법이 비교적 용이하기 때문에, 특히 바람직하다. 그러나, α-케토글루타레이트, 피루베이트 및 암모니아의 측정, 및 이러한 생성물의 농도 측정에 대해 당해 기술분야에 익히 공지되어 있는 방법을 잘 이용할 수 있다.
생성된 황화수소의 농도를 편리하게 측정하는 하나의 방법은 상기 참조한 미국 특허 제6,468,762호에 기재되어 있다. 간단히, 이러한 방법은 산화제(예: 페리시안화칼륨)를 함유하는 제1 발색제 및 N,N-디알킬 페닐렌디아민을 포함하는 제2 발색제를 포함한다. 상기 시약은 생성된 황화수소와 반응하여 착색 착물을 형성하는데, 이는 흡광도 또는 보다 감도 있는 착물의 형광을 사용하여 분광 광도측정법으로 측정할 수 있다. 바람직한 디알킬페닐렌디아민은 N,N-디프로필 페닐렌디아민(DPPDA) 또는 N,N-디부틸 페닐렌디아민(DBPDA)이다.
그러나, 반응 생성물을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 데설푸라제들 중의 하나를 시스테인 및 호모시스테인 둘 다에 기질로서 사용하여, 체액을 이러한 데설푸라제로 처리하는 경우, 적합한 반응 시간, 예를 들면, 10분 또는 20분 후에, 데설푸라제는 생체 샘플 내의 호모시스테인 및 시스테인 둘 다를 상기한 생성물로 전환시킬 것이다. 이러한 효소는 적합하게는 미생물로부터 제조할 수 있다. 하나의 예는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 재조합으로 제조된 데설푸라제이다. 이러한 효소는 문헌[예: Tan, et al., Protein Purification & Expression (1997) 9: 233-245]에 기재되어 있다.
본 발명에서 "호모시스테이나제"로서 나타낸 호모시스테인에 특이적인 데설푸라제는, 호모시스테인의 농도가 당해 샘플 내의 시스테인 농도보다 10배 적은 경우일지라도 피검자의 혈액, 소변, 조직 체액, 혈청 또는 혈장 샘플을 당해 효소로 처리함으로써 유리된 황화수소의 양이 상기 샘플 내의 시스테인으로부터가 아니라 호모시스테인으로부터 실질적으로 발생하는, 기질로서의 시스테인 보다 오히려 기질로서의 호모시스테인에 대해 데설푸라제 활성을 갖는 효소로서 정의된다. 또한, 상기 체액 내의 호모시스테인 및 시스테인의 농도가 각각 약 5 내지 15μM 및 약 100 내지 300μM인 경우, 호모시스테이나제는 체액과의 접촉시 당해 호모시스테이나제의 작용에 의해 생성된 황화수소의 약 90% 이상이 호모시스테인에 의해 제공되거나, 체액이 호모시스테인 5μM 및 시스테인 1,000μM을 함유하는 경우, 호모시스테이나제는 체액과의 접촉시 당해 호모시스테이나제의 작용에 의해 생성된 황화수소의 약 90% 이상이 호모시스테인에 의해 제공되는 특성을 갖는다. 이러한 호모시스테이나제 효소는 상기 참조한 특허문헌 및 문헌[참조: Han, et al., Protein Expression & Purification (1998) 14: 267-274]에 기재되어 있다.
상기한 바와 같이, 체액을 바람직하게는 동일하게 처리한 2개의 샘플로 나눈다. 통상적으로, 데설푸라제를 최종 농도 0.01 내지 1,000㎍/ml를 성취하기 위해 필요한 양으로 샘플에 첨가하고, 시약은 완충액의 최종 농도 1 내지 100mM, 보다 바람직하게는 5 내지 50mM; 이황화물 결합에 사용하기 위한 환원제 0.01 내지 100mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10mM을 성취하기 위해 필요한 양으로 첨가한다. 나머지 시약의 성질은 검정을 위해 선택한 검출 시스템에 좌우된다.
하나의 특히 바람직한 검출 방법에 있어서, 생성물의 농도는 생성된 황화수소의 농도 또는 양을 측정함으로써 측정한다. 또한 형광 특성을 갖는 발색단의 형성이 특히 바람직하다. 광을 흡수하고 형광을 발할 수 있는 착물은 N,N-디알킬 페닐렌디아민, 바람직하게는 N,N-디프로필 페닐렌디아민(DPPDA) 또는 N,N-디부틸 페닐렌 디아민(DBPDA)와 반응시킴으로써 수득한다. 이 후, 착물을, 예를 들면, 페리시안화물 형태의 3가 철 이온과 같은 적합한 산화제로 산화시킨다. 착색된 시약의 농도는 통상적으로 대략 670 내지 680nm에서의 흡광도로 측정할 수 있으며, 이러한 착물의 형광은 대략 665nm 또는 640nm의 범위의 여기 파장을 사용하여 측정하고, 측정치는 더 낮은 파장에서의 방출에 상응한다. 흡광도와 반대되는 형광 검출의 사용은 하기에 설명되어 있으며, 분석 감도가 개선되었음을 나타낸다.
비특이적 데설푸라제 함유 샘플의 결과는 tHcy와 tCys의 합의 농도를 제공한다. 호모시스테이나제 함유 샘플의 결과는 tHcy의 농도를 제공한다. 다라서, 이러한 농도 차이는 체액내의 총 시스테인 농도를 나타낸다.
다음 실시예는 본 발명은 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위해 제공된다.
본 발명은, 총 호모시스테인 및 호모시스테인과 시스테인 농도의 총합 둘 다에 대해 동시에 또는 그렇치 않으면 조절된 측정법에 의해 체액, 바람직하게는 혈장 내의 총 시스테인의 측정에 관한 것이다. 한 반응 용기에서 암모니아, 황화수소 및 개별적인 α-케토-카복실산(α-케토글루타레이트 또는 피루베이트)를 생성하기 위해 호모시스테인과 시스테인 둘 다와 반응하는 효소 및 또다른 반응 용기에서 단지 호모시스테인과 이러한 데설푸라제(리아제) 반응을 수행하는 효소를 사용함으로써, 총 시스테인 농도는 상이한 농도로 측정할 수 있다. 결과는 혈장의 2 내지 1,000μM 범위에서 선형이다.
따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은
체액의 제1 샘플을 호모시스테인 및 시스테인 둘 다를 기질로서 사용하는 데설푸라제로 처리하고, 당해 데설푸라제 중의 하나 이상의 생성물의 농도를 측정하여, 시스테인의 농도(tCys)와 호모시스테인의 농도(tHcy)의 합을 측정하는 단계(a),
체액의 제2 샘플을 호모시스테인을 기질로서 특이적으로 사용하는 데설푸라제로 처리하고, 하나 이상의 생성물의 농도를 측정하여, 총 호모시스테인의 농도(tHcy)를 측정하는 단계(b) 및
단계(a)에서 수득한 tCys 및 tHcy로부터 단계(b)에서 수득한 tHcy를 감하여 총 시스테인 농도를 수득하는 단계(c)를 포함하여, 체액에서 총 시스테인 농도(tCys)를 측정하는 방법에 관한 것이다.
또다른 측면에 있어서, 시스테인과 호모시스테인 둘 다를 기질로서 사용하는 데설푸라제, 호모시스테인을 기질로서 특이적으로 사용하는 데설푸라제 및, 임의로, 이황화물 결합을 감소시키는데 유효한 환원제 및 하나 이상의 생성물을 검출하기 위한 임의의 시약을 검정을 수행하는 방법을 설명하는 지시서와 함께 적합한 용기에 포함하는, 총 시스테인 농도 측정용 키트에 관한 것이다.
실시예 1
시스테인 및 호모시스테인의 측정
검정할 샘플을 2개의 부분으로 나눈다: 한 부분은 비특이적 데설푸라제로 처리하고, 나머지 부분은 호모시스테이나제로 처리한다.
각각의 경우에 있어서, 총 샘플 1ml에 대해 샘플 10 내지 20㎕ 및 상응하는 변환 완충액 980 내지 990㎕를 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 변환 완충액은 인산칼륨 20mM, pH 8.3, NaCl 150mM, 0.2% 트리톤 X-100 30㎍/ml 및 DTT 1mM로 이루어진다.
이 후, 샘플을 재조합 호모시스테이나제 10㎕ 또는 특이적 데설푸라제(0.275mg)로 처리한다. 슈도모나드 푸티다로부터 분리된 데설푸라제가 재조합으로 생성되고, 이는 문헌[참조: Tan, et al.(supra)]에 기재되어 있으며, 호모시스테이나제는 문헌[참조: Han, et al.(supra)]에 기재되어 있다. 샘플 둘 다는 37℃에서 10분 동안 항온처리한다.
이 후, 반응은 발색제(6M HCl 중의 40mM N,N-디부틸-페닐렌디아민 하이드로클로라이드) 50㎕를 첨가한 다음, 산화제(20mM 인산칼륨 중의 40mM 페리시안화칼륨 pH: 8.3) 50㎕를 첨가하여 정지시킨다. 이 후, 일부를 37℃에서 10분 동안 항온처리하고, 665nm의 여기 파장 및 690nm의 방출 파장에서 형광을 판독하거나 675nm에서 흡광도를 판독한다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 U.S.C. 119조하에 2001년 11월 20일에 출원한 가출원 제60/333532호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 가출원의 내용은 본원에 참조로 인용된다.
Claims (10)
- 체액의 제1 샘플을 호모시스테인 및 시스테인 둘 다를 기질로서 사용하는 비특이적 데설푸라제로 처리하고, 당해 데설푸라제 중의 하나 이상의 생성물의 농도를 측정하여, 시스테인의 농도(tCys)와 호모시스테인의 농도(tHcy)의 합을 측정하는 단계(a),체액의 제2 샘플을 호모시스테인을 기질로서 특이적으로 사용하는 데설푸라제로 처리하고, 하나 이상의 생성물의 농도를 측정하여, 총 호모시스테인 농도(tHcy)의 합을 측정하는 단계(b) 및단계(a)에서 수득한 (tCys + tHcy)로부터 단계(b)에서 수득한 tHcy를 감하여, 총 시스테인 농도를 수득하는 단계(c)를 포함하는, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 제1항에 있어서, 단계(a) 및 단계(b)에서 측정한 생성물이 황화수소인, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 제2항에 있어서, 황화수소를 산화제 및 디알킬 페닐렌디아민으로 처리함으로써 측정하는, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 제3항에 있어서, 산화제가 3가 철 이온인, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 제1항에 있어서, 비특이적 데설푸라제가 피. 푸티다(P. putida)로부터 분리될 수 있는, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 제1항에 있어서, 호모시스테이나제가 티. 바기날리스(T. vaginalis)로부터 분리될 수 있는, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 제1항에 있어서, 체액이 혈청 또는 혈장인, 체액내의 총 시스테인 농도(tCys)의 측정방법.
- 시스테인과 호모시스테인 둘 다를 기질로서 사용하는 비특이적 데설푸라제와 호모시스테인을 기질로서 특이적으로 사용하는 호모시스테이나제를 검정을 수행하는 방법을 설명하는 지시서와 함께 적합한 용기에 포함하는, 총 시스테인 농도 측정용 키트.
- 제8항에 있어서, 이황화물 결합을 감소시키는데 유효한 환원제를 추가로 포함하는, 총 시스테인 농도 측정용 키트.
- 제8항에 있어서, 하나 이상의 생성물을 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는, 총 시스테인 농도 측정용 키트.
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