JP2003503065A - 高い特異性を持つホモシステイナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ホモシステイン量を超えるかなりの量のシステインが存在する場合でも、生物学的流体中のホモシステイン測定に硫化水素を使用し得るような、システインと比べて、ホモシステインに対して十分な特異性を持つホモシステイナーゼ酵素を開示する。天然に存在するホモシステイナーゼの変異およびスクリーニングにより、またはキメラ体を構築することにより、所望する特異性を持つ酵素を容易に調製し得る。ホモシステインおよびシステインに対して、所望する特異性を持つホモシステイナーゼの同定方法と同時に、硫化水素から生成する色素団を蛍光定量的に読み取り、硫化水素アッセイを行う改良法もまた開示する。また、本発明範囲には、同一試料内でのシステインおよびホモシステイン値測定方法が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、システインと対照的にホモシステインに対して高レベルの特異性を
有するホモシステイナーゼ（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎａｓｅ）酵素に関する。本
発明はまた、１つ以上のホモシステイナーゼ酵素を含む酵素調製物およびこれら
の酵素を備えた診断キットに関する。このホモシステイナーゼの高い特異性によ
り、生物学的流体中に存在するホモシステイン量の測定として、硫化水素発生を
利用し得るアッセイが可能である。本発明は、また、これらのアッセイの感度を
上昇させるために蛍光性読み取り（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｄｏｕｔ
）を用いることに関する。さらに、本発明は、システインおよびホモシステイン
の両方に関して信頼度を向上させ、生物学的試料中のシステインおよびホモシス
テイン濃度の両方を測定する方法に関する。

【０００２】 （背景技術） １９９９年２月４日に公開された、ＰＣＴ公開 ＷＯ９９／０５３１１（参考
として本明細書中で援用される）で開示されたように、血漿中ホモシステイン濃
度の上昇と動脈硬化疾患との相関関係に起因して、血漿中ホモシステインレベル
の測定に対して正当な臨床的関心が持たれている。このような関心および心血管
系の状態および予後のインディケーターとしてのホモシステインレベルの診断的
な面における価値が理由で、この評価を行うための改良法が所望される。さらに
また、このようなアッセイを単純化することが強く求められる特徴である。本発
明は、それらの有用性に寄与するこれらのアッセイの種々の局面に関する。１つ
の局面は、システインと比較して、ホモシステイン対して改良された特異性を有
するホモシステイナーゼの使用にある。別の局面は、ホモシステイナーゼの作用
による硫化水素産生の測定手段として蛍光を使用することに関する。別の局面は
、システインおよびホモシステインの両方を同じアッセイにおいて評価し得ると
言う改良点に関する。

【０００３】 「ホモシステイナーゼ」は、硫化水素、アンモニアおよびα−ケトブチレート
を産生するようにホモシステインを分解する脱硫酵素をいう。ホモシステイナー
ゼは通常、完全にホモシステインに特異的という訳ではなく、そしてまた、シス
テインも分解して、硫化水素、アンモニアおよびα−ケトプロピオネートが得ら
れる。さらに、血漿中のシステインの正常レベルは、ホモシステインの正常レベ
ルよりもかなり高い。システインレベルの正常な範囲は約３０〜１２０μＭであ
り、そしてホモシステインの正常な範囲はわずか約５〜１５μＭである。従って
、ホモシステイナーゼで血漿を処理すること、および一般的産物である硫化水素
（または、アンモニア）を測定することによってホモシステインの含有量を測定
する場合、システインレベルからの妨害を受けずに正確な測定値を得るために、
ホモシステイナーゼは、システインと対照的にホモシステインに対して十分に特
異的でなければならない。本発明により、このようなホモシステイナーゼ酵素が
提供される。

【０００４】 Ｔｈｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ
ｇｙ（１９８７）６３：１４３−１５１；Ｔｈｏｎｇ，Ｋ−Ｗら、ＩＲＣＳ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）１３：４９３−４９６で記述されて
いるような、ホモシステイナーゼの使用および硫化水素の検出に関する先行技術
のアッセイでは、システインの存在による妨害が観察された。本発明の一局面の
ホモシステイナーゼの場合、システインと相対的にホモシステインに対して十分
な特異性が達成され、ここで血漿中のホモシステインの正確な測定値は、検出産
物として硫化水素を用いる単一の酵素アッセイによって直接得られ得る。

【０００５】 （発明の開示） 本発明により、生物学的流体（例えば、患者由来の尿、組織液、血液、血清ま
たは血漿の試料）中のホモシステイン濃度を測定するための方法が提供される。
これらの方法は、心血管系疾患の危険性を評価するために有用である。本方法に
より、関連するが妨害する物質（とりわけ特に、システインおよびメチオニン）
の検出を回避しつつ、生物学的流体中のホモシステイン濃度を測定する。本発明
は、十分に特異的なホモシステイナーゼ酵素を提供することによって、これを達
成する。

【０００６】 １つの局面において、本発明は、通常の量のシステイン存在下であっても生物
学的流体中のホモシステインを正確に測定するために、システイン分解能力と比
較してホモシステインに対して十分に特異的なホモシステイナーゼに関する。好
適には、生物学的流体中のホモシステイン濃度およびシステイン濃度が、それぞ
れ約５〜１５μＭおよび約１００〜３００μＭである場合、本発明のホモシステ
イナーゼは、生物学的流体と接触して本発明のホモシステイナーゼの作用により
産生された硫化水素の少なくとも約９０％が、ホモシステインによって与えられ
るような性質を有する。好ましくは、これらの条件下で、上記ホモシステイナー
ゼにより産生された硫化水素の少なくとも約９９％が、ホモシステインによって
与えられる。本発明はまた、本発明によって必要とされる特異性を有するホモシ
ステイナーゼを調製するための組換え材料および方法を包含する。

【０００７】 従って、例えば、ホモシステインおよびシステインを含む生物学的試料中に存
在するホモシステイン量を測定する方法が提供され、この方法は、上記試料を、
ホモシステインから硫化水素を産生させる酵素調製物と接触させる工程、および
ホモシステインから産生される硫化水素量を測定することにより、この試料中の
ホモシステイン量を測定する工程を包含する。酵素調製物は、システインと比較
して、システインから産生される硫化水素が無視され得る程に、ホモシステイン
に対する反応性が十分である１つ以上の酵素のみから構成される。あるいは、ホ
モシステインレベルに対する相関物として、α−ケトブチレートが測定され得る
。

【０００８】 この酵素調製物は、ホモシステイナーゼとして言及され、そして下記のような
他の名称によっても言及され得る酵素を含む。さらに、「酵素調製物」なる用語
はまた、他に示されない限り、単回および複数回のアリコートの両方、すなわち
、アッセイ手順の過程の間に、単回量または複数回量のいずれかの１つ以上の酵
素が添加され得ることを包含することが理解されるべきである。そして、この語
の使用は、アッセイの間に全ての必要な酵素を添加するために、どのように、ま
たは、どれだけのアリコートまたは工程が使用されるかということに制限を伴な
わない。

【０００９】 本発明の好適な局面によると、生物学的試料（例えば、体液）中に存在するホ
モシステインの全体の濃度には、遊離形態では存在しないが、代わりに他の分子
と共有結合しているホモシステイン分子が含まれることが理解される。本発明の
方法は、ホモシステイン由来の硫化水素を測定する前に、このホモシステインを
放出するためのさらなる工程を提供する。

【００１０】 しかし、本発明の方法により、関連物質（例えばシステイン）からの妨害を受
けずに遊離ホモシステインレベルの正確な測定が提供されるので、遊離ホモシス
テインのみが検出されるとしても、臨床医に対して価値ある情報が提供されると
いうことに留意すべきである。多くの用途の中で、このような情報が、例えば、
全新生児を試験するにおいて、迅速な初期診断ツールとして非常に有用であるこ
とが予想される。

【００１１】 １つの好適な実施態様において、ホモシステイナーゼは、天然に産生されるホ
モシステイナーゼであり、これは、その特異性を向上させるために必要に応じて
変異されている。そのような変異をランダムに生成し得、そして必要とされる特
異性を有するホモシステイナーゼ生じる変異について選択するために容易にスク
リーニングし得る技術を、下記に記載する。

【００１２】 従って、別の局面において、本発明は、適切な特異性を有するホモシステイナ
ーゼを同定する方法に関する。この方法は、発現系の形態中において候補ホモシ
ステイナーゼコード配列を含むコロニーの培養物を、ホモシステインまたはシス
テインと接触させる工程、そして産生された硫化水素の比較量（ｃｏｍｐａｒａ
ｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）を測定する工程を包含する。

【００１３】 別の好適な実施態様において、ホモシステイナーゼをコードするヌクレオチド
配列は、ホモシステイナーゼをコードする、１より多くの遺伝子または他のポリ
ヌクレオチドに由来する。ここで、そのような配列の発現は、キメラホモシステ
イナーゼの産生へと導く。好適な例としては、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇ
ｉｎａｌｉｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａのホモシステイナー
ゼの両方に由来するアミノ酸配列を含む、キメラ酵素が挙げられる。

【００１４】 従って、本発明の一局面のホモシステイナーゼ酵素は、例えば、被験体の組織
液、尿、血液、血清または血漿の試料中に存在するホモシステイン濃度が、単一
工程のアッセイで測定され得るほどに十分にシステインまたはメチオニンに対し
て非反応的であり、ここでは、上記試料中のホモシステインに対する上記ホモシ
ステイナーゼの反応から生じる１つ以上の産物量が測定され、そしてここで、上
記測定は、その中のシステインまたはメチオニンの濃度によって、実質的に影響
を受けない。

【００１５】 特に好適な実施態様において、ホモシステイナーゼは、配列番号１０の置換改
変体、付加改変体、欠失改変体または誘導体であり、ここでこの改変体または誘
導体は以下の性質の１つまたは両方を有する： （ａ）適切なアッセイにおいて、ホモシステインに対して、少なくとも約１１
０％の配列番号１０の活性を有する；および／または （ｂ）適切なアッセイにおいて、システイン（またはメチオニン）に対して、
約９０％以下の配列番号１０の活性を有する。

【００１６】 本発明の臨床的実施のために、生物学的試料中のホモシステイン量を測定する
において使用するための診断キットが提供される。ここでは、このキットに備え
られるホモシステイナーゼは以下の通りである。好適な実施態様において、診断
キットは、以下を備える：（ａ）必要とされる特異性を有するホモシステイナー
ゼ（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓまたはＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ（例えば、ｏｖａｌｉｓ種またはｐｕｔｉｄａ種）由来）、および（
ｂ）ホモシステイナーゼ反応で形成される硫化水素量を測定するために使用され
得る少なくとも１つの試薬。

【００１７】 一般的に硫化水素測定に基づいたアッセイにおいて、このようなキットを使用
することによって、感度の上昇が得られ得る。ここで、硫化水素は、酸化型のＮ
，Ｎ−ジアルキルフェノレンジアミン複合体のような、発色試薬を用いて測定さ
れる。複合体の濃度は、分光光度的に測定され得；本発明の改良法によれば、複
合体の蛍光が測定される。

【００１８】 本発明の一局面を形成する別の改善点では、システインおよびホモシステイン
の両方が、同一試料中で測定される。このアッセイを実施するために、本発明の
酵素よりもホモシステインに対する特異性が低いホモシステイナーゼ（例えば、
改変されていない形態のＰ．ｐｕｔｉｄａ由来の酵素）が使用される。このアッ
セイは、アッセイされる試料を２つの部分に分配する工程、両方をホモシステイ
ナーゼによって等しく処理する工程、そして等しく測定する工程であるが、ここ
で１つの試料を、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）およ
びアデノシンで処理する、工程によって実施される。ＳＡＨＨは、試料中の実質
的に全てのホモシステインのＳＡＨへの変換を触媒するために十分な量で存在し
、従って、それをホモシステイナーゼの作用から防御する。ＳＡＨＨ処理を欠く
部分は、ホモシステインおよびシステインの両方から硫化水素を産生する；ＳＡ
ＨＨを含有する試料は、システイン由来のみの硫化水素を産生する。システイン
レベルを、この第２の試料から直接評価し；減算することによってホモシステイ
ンレベルを得る。典型的な生理学的試料ではシステインが優勢であること（ｐｒ
ｅｖａｌｅｎｃｅ）から、大半の機器において、より信頼できる範囲にまで、検
出レベルを上昇させる。

【００１９】 （本発明の実施様式） 血漿ホモシステインレベルの上昇は、血管性疾患の危険因子として認識されて
いる。集合的にホモシスチン尿症として言及される遺伝的疾患を有する稀な群と
関連して、ホモシステインのアテローム発生性質が最初に着目された。この疾患
状態は、典型的に正常血液中濃度の１０倍（またはそれ以上）である循環ホモシ
ステインレベルにより特徴付けられる。これらの環境下において、ホモシステイ
ンはまた、尿中でも検出される。早発性の血管性疾患は、この状態と強く相関す
る。

【００２０】 本発明の１つの局面に従って、本明細書中で後に「ホモシステイナーゼ」とし
て言及される酵素を用いて、生物学的試料中のホモシステイン濃度を酵素的に測
定する。この「ホモシステイナーゼ」は、ホモシステインから硫化水素を生成す
る反応を触媒し得る酵素として定義付けられる。代表的な場合において、アンモ
ニアおよびα−ケトブチレートも生成される。本明細書中で説明されるように、
アンモニアおよび／またはα−ケトブチレートまたは他の産物もまた検出され得
るが、硫化水素産物を検出することが好ましい。本明細書中で定義するように、
ホモシステイナーゼは、他のスルフヒドリル化合物を含む他の反応を触媒し得、
そして参考文献中で名付けられた複数の名称を有し得る。しかし、それらがホモ
システインからの硫化水素産生を触媒する性質を保持する場合、それらは、本発
明の実施において概して有用である。

【００２１】 システインに対するこのホモシステイナーゼの反応により産生されるいかなる
硫化水素も、心血管性疾患に対する危険性を評価するために、この酵素を含むキ
ットの使用を実質的に妨害することはないという、十分にシステインに対して非
反応性であるホモシステイナーゼが提供される。

【００２２】 本発明の方法により同定されたホモシステイナーゼは、例えば、上記流体中の
ホモシステイン濃度およびシステイン濃度が、それぞれ、約５〜１５μＭおよび
約１００〜３００μＭである場合、好適には、ホモシステイン濃度が５μＭ、そ
してシステイン濃度が３００μＭである場合に、ホモシステインについてのアッ
セイにおいて生物学的試料の接触に際して、このホモシステイナーゼの作用によ
り産生される硫化水素の少なくとも約９０％が、このホモシステインによって与
えられるという性質を有する。好適には、含まれるホモシステイナーゼが、上記
のいずれかの状態の下で、生物学的試料の接触に際して、このホモシステイナー
ゼの作用により産生される硫化水素の少なくとも約９９％が上記ホモシステイン
によって与えられるという性質を有する。

【００２３】 この酵素を備える診断キットが、例えば、約１〜５００μＭ（または、必要に
応じてより高濃度）の範囲である、生物学的流体中のホモシステイン濃度を正確
に決定するために使用され得、ここで、この流体はまた、典型的な例では、０〜
約１０００μＭのシステインを含む。

【００２４】 本発明に従うアッセイについてのアッセイ手順に関して、他の分子とジスルフ
ィド結合している、生物学的試料中のホモシステイン（またはシステイン）分子
もまた検出し得るように、一般的に、ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）のよう
なジスルフィド還元剤の使用を包含することが好ましい。

【００２５】 以前に単離されたホモシステイナーゼは、細菌供給源Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ由来のＬ−メチオニン−α−デアミノ−γ−メルカプトメタンリ
アーゼ（メチオニンリア−ゼ）である。この酵素は、Ｉｔｏ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７６）７９：１２６３−１２７
２によって精製されており、そして約１７０ｋＤａの分子量を有することが決定
されている。Ｉｔｏにより研究された内容において、その酵素は、メチオニンの
α−ケトブチレート、メタンチオールおよびアンモニアへのα−γ排除を行うが
、この酵素はまた、ホモシステインをα−ケトブチレート、硫化水素およびアン
モニアにも変換する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓから、その相同な
酵素が単離された（Ｈ．Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７７
）１６：１００−１０６）。このＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ酵素の組換え産生方法
もまた、開発されている（Ｔａｎ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９７）９：２３３−２４５を参
照のこと）。

【００２６】 Ｐ．ｐｕｔｉｄａ酵素の基質特異性もまた決定されている。例えば、Ｅｓａｋ
ｉ，Ｎ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１４３
：４５９−４６５は、メチオニンに対する活性を１００とした時の相対的活性ス
ケールで、システインが１０、そしてホモシステインが１８０であることを報告
している。システインよりもホモシステインに対して、この酵素が見かけ上１０
倍優先的であるということは、生物学的試料中のシステイン濃度が、通常ホモシ
ステイン濃度よりもかなり高いということを考慮に入れていない。本発明の技術
を使用することにより、システインと比較して、ホモシステインに対する酵素の
特異性を容易に改善し得る。従って、Ｐ．ｐｕｔｉｄａから単離された酵素は、
ホモシステインに対する特異性を増強した改変体形態を誘導するために有用な出
発物質である。変異形態を得るための出発物質として使用するために適切な触媒
活性を有するホモシステイナーゼ酵素は、当該分野において認められている慣用
的なスクリーニング手順およびアッセイを使用して、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ種から、または他の細菌から誘導され得る。

【００２７】 ホモシステイナーゼの供給源である生物のさらなる群は、Ｔｒｉｃｏｍｏｎａ
ｄ寄生生物および関連の原生生物の種である。Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｄは、泌尿生
殖器管の重要な寄生生物であり、そして耐気性（それでもなお、嫌気性である）
鞭毛虫原生生物である。Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来のホ
モシステイナーゼの使用は、好適な実施態様である。

【００２８】 Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ種は、宿主組織における酸素毒性に対抗するために、
チオール代謝に関するその能力を使用すると考えられる。Ｋ−Ｗ Ｔｈｏｎｇら
、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ（１９８７）６３：１
４３−１５１、およびこの中で引用されている文献を参照のこと。Ｔｒｉｃｈｏ
ｍｏｎａｓ種の間で、ホモシステイナーゼ活性（その中で、ホモシステインデス
ルフラーゼ活性と称される）における、かなりのバリエーションが見出されたが
、酵素活性の許容し得るレベルに関して、利用可能な種のスクリーニングを行う
ことは慣用的である。概して、異なる酵素活性を有する、より多量またはより少
量の酵素または酵素調製物を使用するアッセイにおいてバリエーションを設計す
ることは、関連分野に精通した当業者に周知であるが、ホモシステイナーゼが、
少なくとも約１ユニット／ｍｇの精製タンパク質の比活性を有することが好適で
ある。高度に精製された活性化Ｐ．ｐｕｔｉｄａ酵素が約２０ユニット／ｍｇ（
酵素活性のユニットは、標準的状態で、１分あたり１μｍｏｌの基質が転換され
るとして説明され得る）の比活性を有するということに留意のこと（Ｙ．Ｔａｎ
ら、上記参照）。

【００２９】 上記のＫ−Ｗ．Ｔｈｏｎｇら（１９８７）によって報告された「ホモシステイ
ンデスルフラーゼ活性（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｄｅｓｕｌｆｕｒａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、Ｂ．Ｃ．ＬｏｃｋｗｏｏｄおよびＧ．Ｈ．Ｃｏｏｍｂ
ｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９１）２７９：６７５−６
８２、ここではまた、この酵素の精製についても記載されている）によって後に
メチオニン−γ−リアーゼと称された、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓにおけるメチオ
ニン異化活性を担い得る同一の酵素から生じるようである。

【００３０】 酵素の組換えバージョンの使用は好適である。１つの潜在的なクローニングス
トラテジーは、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ遺伝子が数個のイントロン有し得るとい
う観察に従う。従って、ゲノムライブラリーを構築し、そして、いくつかの部分
的に保存された配列を反映すると予想される、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ酵素に対応するＤＮＡフラグメントでスクリーニングする。

【００３１】 Ｌｏｏｋｗｏｏｄらはまた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍおよびＡｅｒｏｍｏｎａｓ種を含む、メチオニン−γ−リアーゼ活性を有する
細菌に関する他の報告を挙げている。

【００３２】 このような種が、本発明の実施に際して有用なホモシステイナーゼ活性の供給
源であることが予想される。有用なホモシステイナーゼ酵素を供給することが予
想されるさらなる生物は、特定の海藻（例として、Ｄ．Ａ．Ｇａｇｅら、Ｎａｔ
ｕｒｅ（１９９７）３８７：８９１−８９７参照、広範囲のメチオニン関連代謝
を有する種を記述）；硫黄細菌；および、極限環境条件下で生存する土壌微生物
（ｇｅｏｍｉｃｒｏｂｅｓ）または他の微生物（例として、Ｒ．Ａ．Ｋｅｒｒ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７６：７０３−７０４および、Ｅ．Ｐｅｎｎｉ
ｓｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７６：７０５−７０６参照）である。ホ
モシステイナーゼ型酵素の有用な供給源となり得るさらなる微生物の例には、シ
ステインから揮発性の硫黄化合物を形成し得るような、歯周病に関係する細菌が
含まれる。この点において、Ｓ．Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９０）５（４）：１９５−
２０１を参照。

【００３３】 最後に、体液中のホモシステインの測定に有用な「ホモシステイナーゼ」の定
義に関して、硫化水素が必ずこのような酵素の産物であるという制限ではないと
みなされるべきある。まとめると、本発明により、高い試料処理能力を有する診
断ツールが提供され、これにより、妨害物質の検出を防ぐ一方で、コストを抑え
た非常に多数のホモシステイン含有試料のアッセイが可能になる。

【００３４】 従って、ホモシステインと類似の物質（システインのような）の妨害を防ぎ得
る条件下で、このような代謝物の検出方法が存在する場合、本発明の実施におい
てホモシステインを代謝する他の酵素が有用であることが予想される。以下の実
施例により、妨害物質の検出を防ぐ一方でホモシステインを測定する技術の重要
な範囲について説明する。従って、下記に開示する技術が、ホモシステインに対
して作用する多くの他の酵素を用いた方法を見つけるために当業者により適応さ
れ得るということが理解される。

【００３５】 下記で説明するように、有望な特異性比率を有する天然に存在するホモシステ
イナーゼは（または、あまり良くない比率を有するものでさえも）、変異または
それらの「変異形態」を産生するための有用な出発物質として作用し得る。ホモ
システイナーゼの「変異形態」は、天然に生じるホモシステイナーゼと、少なく
とも約７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の相同性であり、
特定の生物で同定されているホモシステイナーゼを意味する。もちろん、変異は
、通常、遺伝子を変異させることにより達成されるが、上記の相同性の必要性は
、還元アミノ酸配列に関するものである。

【００３６】 従って、適切なホモシステイナーゼを得ること、または、上記で示したような
あるいはこのような酵素を保有し、酵素を組み換えを利用して産生するさらなる
生物のような宿主生物から、これらのタンパク質をコードする遺伝子を検索する
こと、またはそれらの酵素の特異性アッセイと組み合わせて、単純にこれらの生
物からホモシステイナーゼを精製することに加えて、適切な特異性を有する変異
遺伝子を検索するために、これらの酵素をコードする遺伝子の変異形態を迅速に
スクリーニングするのための技術が利用可能である。ホモシステインおよびシス
テイン両方の溶解により硫化水素が産生されるので、比較的に同様にアッセイさ
れた培養物（これらのアミノ酸の各々を与えた）を、特異性を決定するために使
用され得る。与えられるシステインまたはホモシステイン濃度を調整することに
よって、特異性の程度を任意に調整し得る。

【００３７】 例として、例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来または相当する生物由来の、ホモシ
ステイナーゼをコードする遺伝子を、適切な発現ベクターに連結し得、そしてコ
ロニーは、培養されたホモシステイナーゼタンパク質を産生し得る。発現系には
、天然に生成された本明細書も使用ステイナー前記をコードするヌクレオチド配
列が含まれ得るか、またはその変異形態が含まれ得る。ヌクレオチド配列にラン
ダム変異をもたらすための標準的方法は、当該分野で周知である。コロニーを同
じ培養物に分け、ホモシステインまたはシステインと接触させる。ホモシステイ
ンまたはシステインのどちらかを、所望する濃度で、そのような生物の２つの同
じ培養物のそれぞれに添加する。一方にシステインを添加し、もう一方にホモシ
ステインを添加する。例えば、適切な時間で、培養を検出可能な産物を生じさせ
るために、硫化水素と反応する酢酸鉛または他の物質と接触させる。ホモシステ
インを添加したときには高い反応性を示すが、システインを添加した時には本質
的に検出不可能な活性または非常に低い検出性を示すコロニーは、適切な特異性
を有する。

【００３８】 システインおよびホモシステイン濃度の適切な選択によって特異性レベルを調
整し得ることは明白である。非常に低濃度、例えば、約１μＭホモシステインを
供給し、非常に高濃度、例えば，約１００μＭのシステインを供給することによ
って、ホモシステインに対する非常に高い特異性を保証し得る。このレベルのホ
モシステインの存在下で、検出可能な硫化水素を産生するが、システインについ
て高いレベルで検出可能なレベルの硫化水素を産生しないコロニーは適切な特異
性を有すると言える。

【００３９】 この生物からホモシステイナーゼを単離し、別々に行うインビトロアッセイま
たは系統的に組み合わせたアッセイを用いてホモシステインおよびシステインに
対する活性を比較することによって、産生コロニーの適切な選択が確認され得る
。この方法で、明確な割合の反応度が得られ得る。さらに、血漿中ホモシステイ
ンアッセイにおいて、単離酵素または培養培地が使用され得、必要に応じてシス
テインをスパイクし、適切な特異性を調べる。従って、ホモシステインおよびシ
ステイン濃度がそれぞれ、約５−１５μＭおよび約１００−３００μＭである時
に体液との接触で起こったホモシステイナーゼの反応により生成した硫化水素の
うち約９０％の硫化水素がホモシステイン由来であるという、上記で選択した基
準が確認され得る。

【００４０】 変異はまた、規定された様式で遺伝子を操作することによって天然の配列に系
統的に導入され得る。すなわち、遺伝学的操作は、特定の同定された変化を得ら
れるタンパク質になすようであり得る。上記と同じような様式または任意の他の
通常的なプロトコールで、これらの場合、スクリーニングを行い得る。

【００４１】 従って、任意の特定の特異性を有する天然に生じるホモシステイナーゼ（例え
ば、ホモシステインについての活性が、システインについての１０倍以上である
改変体）を用いて開始することによって、以下のような変異が選択され得る：変
異が、ホモシステインに関する始めのネイティブなホモシステイナーゼの活性の
、少なくとも約１１０％、好ましくは少なくとも１２５％、より好ましくは少な
くとも１５０％、である変異、および／または同じアッセイにおいて、システイ
ンまたはメチオニンに関する始めのホモシステイナーゼの活性の、９０％以下、
このましくは８０％以下、そしてよりこのましくは６０％以下である変異。

【００４２】 配列番号１０で示された新規のＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ
ホモシステイナーゼの活性は特に注目すべきものである。非変異形態においてで
さえも、システインと比較してホモシステインに対する酵素の相対的活性は、生
体内試験試料中に存在する任意のシステインに関して補正を行う必要なく容易に
ホモシステイン測定を可能にする。

【００４３】 本発明の他の実施例において、新規酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ，ＡｅｒｏｍｏｎａｓまたはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓを含む様
々な微生物で発見されたホモシステイナーゼを模倣し、特に好ましいホモシステ
イナーゼは、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来であり、それらとしては、そのｍｇｌ
１遺伝子（配列番号１１）またはｍｇｌ２から発現された形態が挙げられる。
図１（パネルＡおよびＢ）は、２つのＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌ
ｉｓホモシステイナーゼのアミノ酸配列を示し、１つは、配列番号１０を含む本
発明新規クローン（ｐＡＣ２−１）由来であり、そしてもう一方は、既知のｍｇ
ｌ１遺伝子由来酵素である。（アミノ酸配列を比較にのために配列番号１０およ
び１２を参照；またコードＤＮＡを比較のために配列番号９および１１を参照）
。ｐＡＣ２−１にコードされるホモシステイナーゼは、ｍｇ１１と比べて、３つ
の差異（変異）の存在によって特徴付けられる： アミノ酸配列位置４７における、ＰｈｅからＬｅｕ， アミノ酸配列位置１７２における、ＡｓｐからＧｌｕ、および アミノ酸配列位置３０８における、ＳｅｒからＴｙｒ。

【００４４】 １つ以上のこれらの差異（変異）を含むアミノ酸置換を組み入れることにより
作られた改変ホモシステイナーゼアミノ酸配列は、本発明の実施において特に有
用である。従って、本発明の好ましい例は、以下からなる群から選択された配列
番号１０の１つ以上のペプチド（部分）配列を含むホモシステイナーゼの提供に
関する： （ａ）Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ（配列番号１０の残基４３−５１を参照）； （ｂ）Ｌｅｕを含む（ａ）のサブセット； （ｃ）Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｎ（配列番号１０の残基１６８−１７６を参照）； （ｄ）Ｇｌｕを含む（ｃ）のサブセット； （ｅ）Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｉ
ｌｅ（配列番号１０の残基３０４−３１２を参照）；および （ｆ）Ｔｙｒを含む（ｅ）のサブセット。

【００４５】 Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓゲノムＤＮＡから遺伝子として
単離された、本発明の好ましいホモシステイナーゼである配列番号１０が、ＤＮ
Ａ配列（ｐＡＣ２−１、配列番号９参照）から発現されるということもまた注目
すべきことである。対照的に、報告されたｍｇｌ１およびｍｇｌ２の単離は、ｃ
ＤＮＡ手順に関連しているようである。したがって、ｐＡＣ２−１は、新規ホモ
システイナーゼＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ遺伝子を示し得る。

【００４６】 典型的な例において、ホモシステイナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，ＡｅｒｏｍｏｎａｓまたはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ由来の
酵素を模倣する。その本来のポリペプチド配列の１つ以上のペプチド（部分）配
列が、以下からなる群から選択された配列番号１０の１つ以上の対応するペプチ
ド配列に対応して置換される： （ａ）Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ（配列番号１０の残基４３−５１を参照）； （ｂ）Ｌｅｕを含む（ａ）のサブセット； （ｃ）Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｎ（配列番号１０の残基１６８−１７６を参照）； （ｄ）Ｇｌｕを含む（ｃ）のサブセット； （ｅ）Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｉ
ｌｅ（配列番号１０の残基３０４−３１２を参照）；および （ｆ）Ｔｙｒを含む（ｅ）の部分集合。

【００４７】 この点において、用語「対応する」の使用は、相同性が正確であるとことを示
唆することを意図しておらず、むしろ、一般的に認識されているモデルを用いる
このような配列の比較によって、このような配列が、たとえ現時点で有意に異な
っていたとしても、共通の祖先遺伝子またはそのサブセットから進化し得たこと
を示唆する。同様に、本明細書中で使用される用語「変異」は、天然または実験
的など、どのような手段によっても、生じる改変を含むことが広く理解されるべ
きである。

【００４８】 従って、一般的に好ましい例には、キメラホモシステイナーゼが含まれ、それ
は最初のＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ホモシステイナーゼにならい、ここでその１
以上のアミノ酸（２番目のＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ホモシステイナーゼ（配列
番号１０で示されるｐＡＣ２−１由来）のＬｅｕ⁴⁷、Ｇｌｕ¹⁷²およびＴｙｒ³⁰⁸ 残基に対応する）は、前記Ｌｅｕ⁴⁷、Ｇｌｕ¹⁷²およびＴｙｒ³⁰⁸の１つ以上に、
対応して置換される。

【００４９】 満足すべき改変体には、配列番号１０の置換改変体、付加改変体、欠失改変体
または他の誘導体であるホモシステイナーゼが含まれる。ここで、前記改変体ま
たは誘導体は、以下に示す性質の１つまたは両方を有する： （ａ）適切なアッセイにおいて、ホモシステインに対して、配列番号１０の少な
くとも約１１０％、好ましくは１２５％、より好ましくは１５０％の活性；およ
び／または （ｂ）適切なアッセイにおいて、システインまたはメチオニンに対して、配列番
号１０の約９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは５０％以下ノ活
性。

【００５０】 配列番号１０によって示される配列に関して、少し低い特異性を有する配列も
また、満足すべき改変体に含まれる。従って、適切なアッセイにおいてホモシス
テイナーゼの変異形態の活性が、配列番号１０の活性の５０％まで減少し、そし
てシステインに対する活性が、システインについて２倍に上昇したとしても、適
切な特異性は維持され得る。

【００５１】 このような範囲の特性は、一般的に、１工程の方法論がまだ実施される、ホモ
システインに関して（システインまたはメチオニンに比較すると）酵素の十分に
増強された活性を維持すると考えされるが、ホモシステイナーゼの相対的感度に
ついての正確な要求性を、それぞれの臨床適用において容易に調べ得るというこ
とが理解される。例えば、システインは、尿試料において、少なくとも非疾患患
者では、低濃度であると一般的に予想される。例えば適切な組換え法によって産
生された、他の生物由来の変異ホモシステイナーゼの供給について、上記の相対
的ガイドラインは、有用であると証明されると予想される。配列番号１０によっ
て示された酵素は、ホモシステインに対するこのホモシステイナーゼの明白な活
性が、システインおよびメチオニンについて少なくとも約１００倍より大きいこ
とを示す、特に有用な例である。

【００５２】 単一工程アッセイ方法論についての有用性を向上させるために、ホモシステイ
ナーゼを改変する代表的な例において、野生型Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓアミノ酸
配列（ｍｇｌ１由来、配列番号１１および１２を参照）が、以下のように改変さ
れる（一般的に、もちろん適切なコードＤＮＡの改変による）： １つ以上のＰｈｅ⁴⁷、Ａｓｐ¹⁷²およびＳｅｒ³⁰⁸を欠失させるか、または次に式
に従う。 （１）Ｐｈｅ⁴⁷を、Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，ＭｅｔおよびＴ
ｒｐと置換； （２）Ａｓｐ¹⁷²を、Ｇｌｕ，ＧｌｎまたはＡｓｎと置換； （３）Ｓｅｒ³⁰⁸に対して、Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｔｒｐ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ
またはＡｓｎと置換、 ここでは当該分野で認識されている比較的保存的な少ないアミノ酸置換を示唆
し、そして、この点におけるその効果を、通常的実験で測定し得る。

【００５３】 あるいは、キメラホモシステイナーゼ酵素をコードする１つ以上の遺伝子（ま
たは、ｃＤＮＡまたは他のイントロンのない配列のような他のポリヌクレオチド
）由来の、キメラヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を構築し
得る。好ましい例は、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａホモシステイナーゼ両方に対応するアミノ酸
配列から構成されるキメラ酵素をコードする。

【００５４】 様々な状態においてＰ．ｐｕｔｉｄａホモシステイナーゼは、Ｔ．ｖａｇｉｎ
ａｌｉｓ酵素より安定であると考えられている。１つの可能な結果（Ｂ．Ｌｏｃ
ｋｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，（１９９１）２７９
：６７５−６８２参照）のように、精製時のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ酵素の回収
率は非常に低かった（ｐ．６７９、表２参照、「ｍｅｈｔｉｏｎｉｎｅ γ ｌ
ｙａｓｅ」を参照）。従って、このより増強された安定性を利用するために、キ
メラ酵素においてＰ．ｐｕｔｉｄａ配列を含むことが好ましい。一方、Ｔ．ｖａ
ｇｉｎａｌｉｓ酵素は、基質としてのシステインまたはメチオニンに対してより
高い反応性を示し得るＰ．ｐｕｔｉｄａ酵素よりも、基質としてのホモシステイ
ンに対してより高い反応性を有する。この点において、Ｌｏｃｋｗｏｏｄら、１
９９１（その表４）によって報告されている結果は注意すべきであり、Ｔ．ｖａ
ｇｉｎａｌｉｓ酵素についての相対活性データにより、基質としてのホモシステ
インに対する非常に明白な「優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」の証拠となるこ
とを示している（この６７８頁で報告されているＫ_mデータも参照）。これは、
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ酵素に関して上記でＮ．Ｅｓａｋｉら、によって報告されたデ
ータと対照的である。

【００５５】 以前開示されたＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓホモシステイナーゼは、２つの遺伝子
に由来する２つのタンパク質種（Ｊ．Ｃ．Ｍｏｔｔｒａｎ，Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ
への配列直接の提出、１９９７年７月１７日に提出、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ
ｍｇｌ１遺伝子、登録番号ＡＪ０００４８６、ＮＩＤ ｇ２３３０８８４、およ
びＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ ｍｇｌ２遺伝子、登録番号ＡＪ０００４８７，ＮＩ
Ｄ ｇ２３３０８８６）を示す。それらの完全な配列は、直接示すかのように、
本明細書中で参考として完全に引用する。また、１９９８年２月２６日に刊行さ
れた、国際特許出願 ＷＯ ９８／０７８７２および、Ａ．ＭｃＫｉｅら、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９９８）
２７８：５５４９−５５５６も参照のこと。

【００５６】 従って本発明は、ホモシステイナーゼ活性を有する機能的タンパク質を発現し
得る、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａホモシステイナーゼのアミノ酸配列
、およびＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓホモシステイナーゼ（の
アミノ酸配列をコードするキメラ核酸配列ｐＡＣ２−１にコードされる酵素から
のｍｇｌ１またはｍｇｌ２のいずれか、またはその組み合わせ由来）を含む精製
および単離ＤＮＡ分子を提供する。好ましい局面において、核酸構築物（または
対応するアミノ酸構築物）は、主としてＰ．ｐｕｔｉｄａのそれと一致し、従っ
てＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａホモシステイナーゼのコード核酸配列を
含むＤＮＡ分子を提供する。ここで、前記酵素の１つ以上のアミノ酸をコードす
る１つ以上のその部分配列が、それに相当するものとして、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎ
ａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓホモシステイナーゼの対応するアミノ酸をコードする
１つ以上の核酸配列と置換される。ｍｇ１１遺伝子によりコードされるＴ．ｖａ
ｇｉｎａｌｉｓ酵素は本明細書中で、この後、Ｔ１タンパク質として呼び、ｍｇ
１２遺伝子によりコードされるものは、Ｔ２タンパク質として、ｐＡＣ２−１に
よりコードされるものはＴ３タンパク質と呼ぶ（ｐＡＣ２−１によってコードさ
れるものをＴ３タンパク質とするように）。

【００５７】 Ｔ１、Ｔ２およびＴ３配列が実質的に異なる、限定された数の部分領域が存在
し、同時に公開されたＰ．ｐｕｔｉｄａ配列と実質的な相同性を示す。実際に、
公開されたＰ．ｐｕｔｉｄａ配列は、Ｔ１配列との実質的な相同性を示す。

【００５８】 従って、本発明のさらに好ましい局面において、Ｔ２配列および対応するＴ１
配列がお互いに非常に異なり、さらにＴ１配列が実質的にＰ．ｐｕｔｉｄａの配
列と類似であるＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ酵素のコード配列の領域が同定される。
理論に関して制限されずに、Ｔ２またはＴ３、のこれらのコード部分領域は、Ｐ
．ｐｕｔｉｄａコードポリヌクレオチドに、ホモシステインに対するキメラ種の
増強された反応性を提供するアミノ酸配列ドメインを挿入するための、独特の機
会を提示し、それによって本発明の診断手順を容易にすると考えられる。

【００５９】 従って、本発明により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａホモシステイナ
ーゼのコード配列を含むＤＮＡ分子が提供され、ここで、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａ
ｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓホモシステイナーゼの１以上の対応するアミノ酸をコー
ドする各々に比べて、上記の酵素の１以上のアミノ酸を各々がコードするその１
以上の部分配列が、１以上のヌクレオチド配列部分配列によって、対応するもの
として置換され、ここで、上記の得られたアミノ酸置換は、以下からなる群より
選択される： （ａ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａ由来の、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（
配列番号２）、または任意そのサブセットに対する、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ
ｖａｇｉｎａｌｉｓ（Ｔ２）由来のＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号１）、ま
たはそのあるサブセット； （ｂ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａ由来のＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配
列番号４）または任意のそのサブセットに対する、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖ
ａｇｉｎａｌｉｓ（Ｔ２）由来の、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号３）また
は任意のそのサブセット； （ｃ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａ由来のＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ（配列番号６）、または任意のそののサブセットに対する、Ｔｒｉｃｈｏｍ
ｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（Ｔ２）由来のＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
（配列番号５）、または任意のそのサブセット； （ｄ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｉｄａ由来のＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａ
ｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号８）または
任意のそのサブセットに対する、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ
（Ｔ２）由来のＣｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ―Ｉｌｅ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号７）、または任意のそのサブセット； （ｅ）上記の群（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）によって提供される１、２
、３、または４つの置換を含む任意の組み合わせ。

【００６０】 上記で挙げたＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ｍｇｌ２（「Ｔ
２」）アミノ酸配列に関して注目すべきことは、それらが、以下のアミノ酸配列
位置におよそ一致することである： Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号１）、約２２６−２３７； Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号３）、約３１８−３２０； Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号５）、約３３１−３３５；および Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ（配列番号７）、約３８１−３９０。

【００６１】 本発明のこの局面の実施との関連において、上記で挙げたＴ．ｖａｇｉｎａｌ
ｉｓ部分配列はさらに、保存的なアミノ酸置換を受け入れて改変され得る。さら
に、標的とされるＰ．ｐｕｔｉｄａ配列が所定の位置において全体または一部分
残っている一方で、例えば、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ部分配列が近くに挿入され
得るように（すなわち、そこから約１０アミノ酸位置まで離れている）、Ｔ．ｖ
ａｇｉｎａｌｉｓ部分配列は、対応するものとして上記に挙げたＰ．ｐｕｔｉｄ
ａ配列と置換される必要がない。さらに、ホモシステインに対して反応性が向上
する利点は、減少した酵素安定性のために妥協しない限り、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌ
ｉｓ挿入フラグメントが、上記で示したその配列のＮ−末端側またはＣ−末端側
で見られるさらなるアミノ酸の転移を含み得る。

【００６２】 上記改変ホモシステイナーゼ、天然ホモシステイナーゼおよび天然ホモシステ
イナーゼの変異形態の全てにおいて、コードする遺伝子を例えば、当該分野で周
知であるように、Ｎ−末端ヒスチジン残基またはクロマトグラフィー手順で用い
られ得るリガンドに対してアフィニティーを示す他の融合配列を与えることによ
って、より好都合な精製を達成するように操作し得る。

【００６３】 例えば、適切なホモシステイナーゼコードＤＮＡ配列でトランスフェクトされ
たＥ．ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞からのホモシステイナーゼ精製を容易にする
ために、ニッケル−ＮＴＡアフィニティー精製手順（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手可能）を使用し得る。これらの手順は、ＮＴＡ樹
脂マトリックスに固定化されたニッケルの作用に対するタンパク質イミダゾール
基の選択的な結合の利点を利用するものである。本発明のこの局面の好適な例に
おいて、適切なコードＤＮＡの改変により、例えば、６個連続するヒスチジン残
基を含むアミノ末端タグをホモシステイナーゼに挿入し、これにより、宿主細胞
物質からのその精製を容易にする。

【００６４】 ホモシステイナーゼ配列番号１０（上記図１ＡＢもまた参照のこと）は、この
タンパク質、システインまたはメチオニンに対して十分に非反応的であるこの改
変酵素のＮ末端の上流に位置する１つ以上のヒスチジン残基を含む改変ホモシス
テイン酵素の代表的なものである（被験体の組織液、尿、血液、血清、または血
漿の試料中に存在するホモシステイン濃度は、単一工程アッセイにおいてこのよ
うな酵素の使用によって決定され得る）。そのようなアッセイにおいて、ホモシ
ステインに対する前記改変ホモシステイナーゼの反応から生じる１つ以上の産物
の量が測定され、そしてこのような測定は、試料中のシステインまたはメチオニ
ン濃度によって実質的に影響を受けない。本開示のこの局面に従って、本発明の
実施に有用なホモシステイナーゼは、天然ホモシステイナーゼのＮ末端側に位置
する１つ以上、好適には２−１５個、そして最も好適には５−８個連続するヒス
チジン残基を含む。

【００６５】 適切なコードポリヌクレオチドの構築は、当業者にとって容易に理解され、そ
して部位特異的変異誘発またはループアウト変異誘発の技術、またはＰＣＲ技術
の使用を含む。このようなコードポリヌクレオチドの発現に適切な宿主細胞につ
いては、例えば、Ｙ．Ｔａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（１９９７）９：２３３−２４５にて記述され
ている。一旦、適切な遺伝子を構築すれば、適切な発現ベクターまたはプラスミ
ドを提供する、あるいは、コード配列および、必要であれば、調節配列または制
御配列の、宿主生物の染色体への挿入を達成することは十分に当該分野の範囲内
である。細菌、酵母、哺乳類細胞および植物を含む、広範種々の宿主において組
換え発現に必要とされるパラメーターは、現在、当該分野において周知である。
従って、一旦、所望のコードヌクレオチド配列が利用可能になれば、本発明ホモ
システイナーゼを産生するために標準的組換え技術が使用され得る。 （ホモシステインのためのアッセイ系） 上記したように、本発明ホモシステイナーゼは、キットまたは、他に、体液中
、特に血漿、尿などにおけるホモシステインのために、単一酵素アッセイにおい
てまたは、単一工程アッセイにおいて、このような酵素を用いる場合の成分とし
て有用である。特異的な例示的なアッセイおよびキットは、本明細書中で参考と
して援用される、上記ＷＯ９９／０５３１１に示されている。一般的なこととし
て、代表的に、ホモシステインレベルのアッセイ方法において、最終濃度が０．
０１〜１０００μｇ／ｍｌに達するのに必要な量で、試料に対してホモシステイ
ナーゼが添加され；そして試薬は、最終濃度が緩衝液中に１〜１００ｍＭ、より
好適には５〜５０ｍＭに達するのに必要な量で添加され；還元試薬の場合は、０
．０１〜１００ｍＭ、さらにより好適には、０．１〜１０ｍＭに達するのに必要
な量で添加される。残存している試薬の性質は、アッセイのために選択された検
出システムに依存する。

【００６６】 １つの特に好適な検出方法において、産生した硫化水素の濃度または量を測定
することによってホモシステイナーゼ産物のレベルが測定される。蛍光性の性質
を有する色素団形成は特に好適である。Ｎ，Ｎ−ジアルキルフェニレンジアミン
、好適には、Ｎ，Ｎ−ジプロピルフェニレンジアミン（ＤＰＰＤＡ）またはＮ，
Ｎ−ジブチルフェニレンジアミン（ＤＢＰＤＡ）との反応によって、光を吸収し
、そして蛍光を発し得る複合体が得られ得る。次に、この複合体を、例えばフェ
リシアニドの形での第二鉄イオンのような適切な酸化剤で酸化する。発色試薬の
レベルが、本発明に従って代表的に約６７０〜６８０ｎｍでの吸収によって測定
され得る一方で、約６６５ｎｍまたは６４０ｎｍの範囲の励起波長およびより高
波長における対応する発光を使用してこの複合体の蛍光が測定される。吸収に対
して、蛍光検出の使用は、アッセイの感度を向上させることが以下で説明され、
そして示される。従って、本発明のさらなる局面は、硫化水素レベルを明らかに
するための蛍光検出の使用である。

【００６７】 （ホモシステイン／システインのためのアッセイ系） 生物学的試料において、システインおよびホモシステインの両方を決定するこ
とがしばしば所望される。上記で述べたように、一般的に、ホモシステイナーゼ
酵素は、システインおよびホモシステインの両方、ならびにメチオニンを溶解し
得る。ホモシステイナーゼが、システインまたはホモシステインのいずれかに十
分に特異的でない場合、またはいくつかの追加的な工程が含まれない場合、硫化
水素検出法を用いて、これらのアミノ酸の両方のレベルを同時に測定することに
なり、個々の値に組み合わせることはできない。

【００６８】 生物学的試料中のホモシステインおよびシステイン両方が測定可能である１つ
の改善したアッセイにおいて、試料を２つに分ける。１つを、Ｓ−アデノシルホ
モシステインヒドラ−ゼ（ＳＡＨＨ）で処理し、アデノシン存在下でホモシステ
インをＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）に変換する。ＳＡＨは、ホモシ
ステイナーゼによって分解されにくい。従って、生物学的試料のうち一方では、
ＳＡＨＨおよびアデノシンを添加することによって、効果的な基質としてホモシ
ステインが除去される。代表的に、アデノシンは、５０−２００ｍＭ、好適には
、約１００ｍＭの範囲で添加され、そして組換えＳＡＨＨを０．５−４ｍｇ／ｍ
ｌで添加する。これらの量は概算であり、そして使用するＳＡＨＨ酵素の特異的
性質および他の反応条件に依存する。ホモシステインをＳＡＨＨに完全に変換す
ることを確実にするためのＳＡＨＨレベルおよびアデノシンレベルの最適化は、
当該分野の範囲内に十分入る。ホモシスチンをホモシステインに（シスチンから
システインに）変換するために、ホモシステインおよび／またはシステインが酸
化型となっている状態下で試料に還元剤を添加することが望ましい。）典型的な
反応時間は、例えば、３７℃にて、１５分から１時間である。

【００６９】 生物学的試料の他方を同じように、アデノシンまたはＳＡＨＨのいずれか、ま
たはこの両方を除去して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤の存在
下で処理する。

【００７０】 次に、この２つの試料を、ホモシステイナーゼ酵素、好適には、この場合、ホ
モシステインに対する特異性が高くないホモシステイナーゼを使用して同じよう
にアッセイする。このアッセイにおいて使用する好ましい酵素は、Ｐ．ｐｕｔｉ
ｄａ由来のホモシステイナーゼである。次に、上記のように、好適には発色複合
体の形成および、生成した硫化水素を反映する吸収または蛍光のいずれかの測定
によって、アッセイを行う。

【００７１】 ＳＡＨＨおよびアデノシンで処理しない試料を次の段階において生成した硫化
水素レベルは、試料中のホモシステインおよびシステインを組み合わせた測定値
である。１つ目の試料における硫化水素レベルはシステイン量のみの測定値であ
る。従って、２つ目の試料の値から１つ目の試料の値を差し引くことによって、
ホモシステインレベルが得られ得る。

【００７２】 ほとんどの生物学的流体中のホモシステインレベルによる差異が、必然的に、
多数の相対的に小さい差異であるが、代表的に、この試料の１つ目および２つ目
で得られる値は、光学密度または蛍光単位の信頼できる範囲内にあり、その結果
その差異の精度および正確性が非常に高い。

【００７３】 以下の実施例は本発明を例示することを意図するものであって、本発明を制限
するものではない。

【００７４】 （実施例１） （Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＡＣ２−１クローンの産生） Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓのｐＡＣ２−１ホモシステイナ
ーゼ遺伝子のクローニングを、下記のように行った。一般的に、他の微生物にお
いて適切であるとして認識される組換え方法論は、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ Ｄ
ＮＡ、特に前記の、イントロンを欠失した多くのＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ遺伝子
の操作に関して有用である。従って、Ｙ．Ｔａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９７）９：２３３−２
４５、および１９９６年１２月１９日に公開された、Ｙ．Ｔａｎらの国際特許公
開番号ＷＯ９６／４０２８４は、有用な参考であり得る。

【００７５】 標準的な方法によりＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来のゲノ
ムＤＮＡを単離し（Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、そしてテンプレートとして、ＰＣＲ試薬キット（Ｒｏｃｈ
ｅ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）とともに提供された方法に従って行うＰＣＲ
反応に使用した。ｍｇｌ１遺伝子のヌクレオチド配列を基にしてオリゴヌクレオ
チドプライマーを作製した（Ｊ．Ｃ．Ｍｏｔｔｒａｍら、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ、
登録番号ＡＪ０００４８６、ＮＩＤ ｇ２３３０８８４、１９９７年７月１７日
提出）。

【００７６】 使用した特異的プライマーを以下に示す： （センス）５’−ＧＧＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ
ＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＡＴＣＧＡＣ−３’（配列番号１３）（Ｎ
ｄｅＩ部位であるＣＡＴＡＴＧを含む）；および、（アンチセンス）５’−ＧＧ
ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＣＴＡＡＧＴＣＧＡＧＡＧＣＣ−３’（
配列番号１４）（ＢａｍＨＩ部位であるＧＧＡＴＣＣを含む）。他に使用する試
薬には、制限エンドヌクレア−ゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＢＬ２１（ＤＥ３
）コンピテント細胞が含まれていた。これらは全てＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入した。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ試薬キットを、
Ｒｏｃｈｅ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）より購入し、そしてＤＮＡ ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＤＮＡ精製キット）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）より購入した。ＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプローブは
、ＩＤＴ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成された。全ての
他の試薬は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。野生型Ｔｒ
ｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入
した。

【００７７】 ＰＣＲ反応条件は、以下の通りである。変性：９４^oＣにて１分間、アニ−リ
ング：５０^oＣにて２分間、そして伸長：７２^oＣにて２分間、これを１サイクル
として、３５サイクル行った。この後、最後の伸長反応を、７２^oＣで１０分間
行った。（Ｋｂ−ラダーマーカーにより、１．２Ｋｂｐの１つのバンドとして同
定される）ＰＣＲ−増幅産物を回収し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消
化し、次に、標準的なプロトコルでｐＴ７−７ベクターのＮｄｌＩおよびＢａｍ
ＨＩクローニング部位に連結した（ｐＴ７−７ベクターは、Ｄｒ．Ｓｔａｎ Ｔ
ａｂｏｒ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍ
Ａより譲渡された。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９０，１６．２
．１頁−１６．２．１１頁，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ中の、Ｔａｂｏｒ，Ｓ
．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ」を参照のこと）。次に、得られた
プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に、エレクトロトランスフ
ォーメーションにより、形質転換した。

【００７８】 ３７℃にて一晩インキュベーションした後、アンピシリン含有プレートからア
ンピシリン−耐性クローンを選択した。選択したコロニー由来の細胞を、５ｍｌ
ＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ）において、３７℃にて一晩増殖させた。α−ケトブ
チレートアッセイ（Ｋ．Ｓｏｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、１４３、４５９−４６５、１９８１（メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾンの反応を基にしている）の方法の改変方法を使用した）、および／また
はＨ₂Ｓを生成し、そして定量する脱メチル化アッセイ（Ａ．Ｅ．Ｂｒａｕｎｓ
ｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，
（１９７１）２４２：２４７−２６０を参照のこと）によって、未精製培養抽出
物の酵素活性を基にして適切なクローンを選択した。これら２つのアッセイ方法
は、直ぐ下で述べる。

【００７９】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＡＣ２−１クローンの改変体もまた構築
した。この改変体は、含まれているプラスミド（発現ベクターｐＡＣ２−１１、
またｐＴ−７−７を基にしている）が、一列に並んで存在する２コピーのホモシ
ステイナーゼ−コード配列を含んでいるという点でのみ異なる。Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＡＣ２−１１と呼ばれるこの特定のクローンは、本発明の
診断手順において使用する組換えホモシステイナーゼの高発現を提供する。簡潔
に言うと、ｐＴ７−７のＮｄｅＩ部位とＢｓｐ１０６Ｉ部位との間に２コピーの
コード配列を置いた。第１のコピーを、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩに結合させ、第２
のコピーをＢａｍＨＩとＢｓｐ１０６Ｉに結合させた。ｐＡＣ２−１またはｐＡ
Ｃ２−１１のどちらかのクローンから、同じ手順で、組換えホモシステイナーゼ
を精製し得る。

【００８０】 （α−ケトブチレート／ピルビン酸アッセイ） このアッセイの第１の工程で、約１〜１００ユニットのホモシステイナーゼ（
「ＨＣＹａｓｅ」）酵素を得るために十分な未精製細胞抽出物試料（細胞を超音
波処理し、そして上清を遠心分離後に回収した）（代表的に５０μｌ）とともに
１ｍｌ容量の、１０μＭ ピリドキサルリン酸および、異なる濃度（２５μＭ−
２５ｍＭ）のＤＬ−ホモシステインまたはＬ−メチオニン、またはＬ−システイ
ンをそれぞれ含む１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０を、３７℃にて、１０分
間インキュベーションした。０．１ｍｌの５０％ ＴＣＡを添加して反応を停止
した。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機を用いて、１３ｋ ｒｐｍで、２分間、
懸濁液を遠心分離した。次に、上清の０．５ｍｌ試料を、０．８ｍｌの１Ｍ酢酸
ナトリウム、ｐＨ５．２中０．５ｍｌの０．０５％ ３−メチル−２−ベンゾチ
アゾリノンヒドラゾン（「ＭＢＴＨ」）に添加し、５０^oＣにて３０分間インキ
ュベーションした。分光光度計を用いて、ＯＤ₃₂₀を測定することにより、それ
ぞれの試料の反応産物量を決定した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ５００−０００６キット
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて、牛血清アルブミンを標
準試料として、タンパク質量を決定した。ユニット／ｍｇタンパク質として、酵
素比活性を算出した。酵素の１ユニットを、１分間あたりの、ホモシステインか
らの１μｍｏｌのα−ケトブチレート形成を触媒する量として定義した。もちろ
ん、例えば、１アッセイ試験あたりに１−１００ユニットの酵素を含む精製ホモ
システイナーゼ試料を用いてこのアッセイ手順をまた使用し得る。

【００８１】 （脱チオメチル化スクリーニングアッセイ） 前記のように、使用するアッセイは、Ａ．Ｅ．Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎら（上記
）の改変方法である。標準的反応混合液は、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５
、１００ｍＭ）、酢酸鉛（０．３３ｍＭ）および１−１００ユニットのホモシス
テイナーゼを提供する、十分な未精製細胞抽出物で構成され、そこに、異なる濃
度（５μＭ−１００μＭ）の基質ＤＬ−ホモシステイン、またはＬ−システイン
、またはＬ−メチオニン混合物を、添加した。全反応容量は、１．５ｍｌであっ
た。３７℃にて、１０分間インキュベーションした後、分光光度計で、ＯＤ₃₆₀
にて、硫化鉛量を測定した。このアッセイ手順をまた、例えばアッセイ試験あた
り１−１００ユニットを含む精製ホモシステイナーゼ試料を用いて使用し得る。

【００８２】 （産物ホモシステイナーゼの精製） 上記初期アッセイスクリーニングの使用によって、ＤＥＡＥ−セファロース
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ クロマトグラフィー（ｐＡＣ２−１クローンから得られた
酵素活性プロフィールに対して（図３を参照のこと））、またはニッケル−ＮＴ
Ａアフィニティークロマトグラフィー（ｐＡＣ２−１クローンから得られた酵素
活性プロフィールに対して（図４を参照のこと））を含むプロトコールを用いて
見込みのあるクローンからホモシステイナーゼ（「ＨＣＹａｓｅ」）を精製した
。

【００８３】 （細胞増殖条件） 特定のクローンに対応する１０μｌの凍結Ｅ．ｃｏｌｉストックを、１０μｇ
／ｍｌアンピシリンをまた含む５ｍｌ ＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ）に播種し、そ
して穏やかに振盪（３００ｒｐｍ）しながら３０^oＣにて、一晩培養した。次に
、この培養液を５００ｍｌのフラスコにおいて２つの、新鮮な１００ｍｌ容量の
ＬＢ培地を添加したフラスコに分割し、さらに３０^oＣにて、３００ｒｐｍでま
た、６時間培養した。次に、全培養液を、８００ｍｌのＬＢ培地を含む１８本の
フラスコ（それぞれ６リットルの容積）に分注した。３７℃にて、３００ｒｐｍ
で一晩増殖を続け、ＯＤ₆₀₀が約１０に達した。菌体を４０００ｇでスピンダウ
ンし、新鮮なＬＢを用いる増殖培地に交換し、さらに６時間、３７℃にて、３０
０ｒｐｍでインキュベーションを続けた。ＯＤ₆₀₀が２０に達したら、４^oＣにて
１０分間、４０００ｇの遠心によって菌体を回収した。上記手順に対する広範種
々な変更もまた効果的であることが認識される。

【００８４】 （クロマトグラフィー前の前処理） 細菌ペレットを初めに、抽出溶液（２０ｍＭ リン酸カリウム、１０μＭピリ
ドキサルリン酸および０．０１％ β−メルカプトエタノール、ｐＨ９．０）に
懸濁し、そしてキャビテーター型（ｃａｖｉｔａｔｏｒ−ｔｙｐｅ）ホモジナイ
ザー（モデルＨＣ８０００、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）で、細胞を破砕した。冷却遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ
，ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ ＲＣ２−Ｂ）を用いて、８０００ｇ、４^oＣにて３０
分間、懸濁液を遠心分離した。次に、上清を回収し、５０^oＣにて１分間、熱し
、次いで分離用スケール装置（モデルＴＦＦ ＰＬＨＫ １００ｋ、Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．
３を含む２．５ｆｔ²圧力カートリッジを用いる）を用いて限外ろ過に供した。
限外ろ過中、ｐＨを７．２に調整した。

【００８５】 （クロマトグラフィー条件−第１のカラム） 上記由来濃縮液（ｐＨ７．２）を、４０ｍＭ ＫＣｌ−ＰＰＭ緩衝液（４０ｍ
Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭリン酸カリウム、１０μＭピリドキサルリン酸、０．
０１％ β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．２）中に２４００ｍｌパック容量
のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む第１カラム（１００ｍｍ直径×３０ｃｍ）に
アプライした。タンパク質試料をロードした後、カラムを、ＯＤ₂₈₀値が０．１
以下になるまで、約１０倍容量の４０ｍＭ ＫＣｌ−ＰＰＭ緩衝液で予め洗浄し
た。次に、ＰＰＭ緩衝液中のＫＣｌ濃度が４０ｍＭから３００ｍＭの直線的勾配
を用いてタンパク質を溶出し、そして５００ｍｌの画分を回収した。その画分が
黄色を呈することおよび、活性アッセイによって、ホモシステイナーゼを含む画
分を同定した。

【００８６】 （クロマトグラフィー条件−第２のカラム） ８０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ８．３の溶液に対する透析
を２４時間行った後、回収した溶出液（５〜１０グラムの全タンパク質の回収を
示す、約２〜５ｍｇ／ｍｌ）を第２のカラムにアプライした。ロード後、ＯＤ_{28 0} が０．１以下になるまで、４倍容量の８０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ リン酸カ
リウム、ｐＨ８．３（流速は約６〜８ｍｌ／分）で、第２のカラム（ＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦを満たしてあるＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ
５０／３０、５００ｍｌ容量、５０ｍｍ直径×２５ｃｍ）を予め洗浄した。次
に、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）中の塩化カリウム濃度を８０
ｍＭから３００ｍＭの直線的濃度勾配を用いて、ホモシステイナーゼを溶出した
。溶出液を３００ｍｌのフラスコに回収し、活性画分は、黄色を呈すること、お
よびホモシステイナーゼ酵素活性から同定可能であった。（ホモシステイン、シ
ステインおよびメチオニンに対する）この様式で精製されたホモシステイナーゼ
の酵素活性について、以下の実施例８にて考察する（図３もまた参照のこと）。

【００８７】 あるいは、さらなる２段階ストラテジーを使用し得る。第１段階において、分
離物質は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦであり、２０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２を用いてロードおよび予め洗浄を行った。
タンパク質の溶出は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２（溶液Ａ
）から２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ（
溶液Ｂ）までの直線的勾配（８ｍｌ／分）を用いて達成した。第２段階において
、分離物質は、ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） ６−ＦＦであ
り、そしてロードおよび前洗浄は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）中０．６Ｍ ＮＨ₄ＳＯ₄を用いて行った。タンパク質の溶出は、０．６Ｍ
ＮＨ₄ＳＯ₄、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２（溶液Ａ）から２
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２（溶液Ｂ）までの直線的勾配（５ｍ
ｌ／分）を用いて達成した。この改変手順により次の精製結果を得た。上記細胞
溶解物は、５．２（ユニット／ｍｇ）の比活性で、８，４００ユニットのホモシ
ステイナーゼを含んだ。前−カラム手順の完了後、６４の比活性で６，３００ユ
ニットが回収された（約７５％の回収率）。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登
録商標）−ＦＦ工程（第１のカラム）の終了後、１７２の比活性で、５，０４０
ユニットが回収された（回収率６０％）が、ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
（登録商標） ６−ＦＦ工程（第２のカラム）の終了後、３００の比活性で、４
，２００ユニットが回収された（回収率５０％）。

【００８８】 （得られたホモシステイナーゼの分析） ＨＰＬＣ分析に対して、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｐｒｏｇｅｌ^TM ＴＳＫ カラム（
Ｇ３０００ＳＷ_XL，３０ｃｍ×７．８ｍｍ，Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎ
ｔｅ，ＰＡ）とともに、Ｌ−６２００Ａ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ポンプ（Ｈ
ｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた。代表的に、２０
μｌサイズの試料（約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含む）をロードし
、そして０．１２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．
２の溶液で、流速約１ｍｌ／分で溶出した。分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ２
０００）を用いて、２８０ｎｍの波長で、タンパク質を含む画分を同定した。Ｍ
Ｗ標準物として、牛血清アルブミン（ＭＷ６６，０００）およびサツマイモ由来
β−アミラーゼ（ＭＷ２００，０００）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
）を用いた。得られた保持時間は、ＢＳＡの場合、８．８８分、β−アミラーゼ
の場合、７．８２分で、産物ホモシステイナーゼでは、８．２８分であった。

【００８９】 （非還元性の）７．５％または１０％ポリアクリルアミド−前形成化プレート
で、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液、ｐＨ８．３中で、０．１％ＳＤＳを
含む、または含まない状態で、得られたタンパク質の電気泳動を行った。使用し
た分子量標準物は、Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａ
ｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）であった。０．１％
ＳＤＳ存在下で約４３ｋＤの単一バンドとして、０．１％ＳＤＳ非存在下で約１
７２ｋＤの単一バンドとして産物ホモシステイナーゼを観察した。

【００９０】 次に、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびジデオキシヌクレオチド終結反応を用
いてＡＣＧＴ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ，ＩＬ）により適切なクローン
のＤＮＡの配列決定を実施した。プライマーウォーキング法を用いて、そしてＤ
ＮＡアナライザーによりこの配列を分析した。

【００９１】 （Ｎｉ−ＮＴＡ法を用いた６×ヒスチジン−タグ化タンパク質としての、ホモ
システイナーゼの精製） Ｅ．ｃｏｌｉ由来の組換えホモシステイナーゼを精製する他の方法には、ニッ
ケルーＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーの使用が挙げられる。この技術
は、タンパク質ヒスチジンイミダゾールの、ＮＴＡ樹脂マトリックスに固定化さ
れたニッケル陽イオンに対する親和性を利用するものである。この技術（Ｑｉａ
ｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を完全に利用するために、ホモシス
テイナーゼのＮ末端のタンパク質上流（配列番号９および１０を参照のこと）に
６個の付加的なヒスチジン残基の配列を（好適には、次いで、発現されるコード
ＤＮＡの改変によって）付加する。

【００９２】 この精製手順に従って（さらなる情報については、「Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎｉｓｔ，Ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ６×Ｈｉｓ
−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、１９９７年３月、第３版（Ｑｉａｇｅｎ
より入手可能）もまた参照のこと）１００ｍｌの、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）、クローンｐＡＣ２−１の高密度増殖培養液を遠心分離により回収し、そ
して４ｍｌの溶解緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、５
０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０）にて、得たペレットを再懸濁した。次に、
氷上で１分間、得られた細胞懸濁液を超音波処理した。

【００９３】 最高速度に設定し、２０分間、卓上遠心機を用いて、細胞破片を除去した。次
に、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡスラリー（Ｑｉａｇｅｎ）と透明な上清を混合し、そ
して吸着するように氷上で６０分間穏やかに振った。次に、混合物を、使い捨て
のポリプロピレンカラムに移し、素通り画分を捨てた。次にＮｉ−ＮＴＡ樹脂ビ
ーズを、８ｍｌの洗浄緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール
、５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０）で洗浄し、その後、組換えタンパク質
を、２ｍｌの溶出緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、
５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０）を用いて溶出することによって最終的に
回収した。次に、精製タンパク質を上記のように特徴付けた。（ホモシステイン
、システインおよびメチオニンに対する）この様式で精製されたホモシステイナ
ーゼの酵素活性の結果を、以下の実施例２に記述する（図４もまた参照のこと）
。

【００９４】 （実施例２） （本発明ホモシステイナーゼの代表的な触媒性質） 図２から４で、単一工程アッセイにおいて、本発明ホモシステイナーゼが持つ
有意に増強された有用性について示す。図２で示される結果は、ｐＡＣ２−１ク
ローンを含む宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の、未精製溶解物を使用した場合について示
しており、ホモシステイン、システイン、およびメチオニンをそれぞれ２５ｍＭ
で別々にアッセイした場合の、３つの基質に対する特異的な活性（ｕ／ｍｇ）を
示す。図３および４で示す結果（ｐＡＣ２−１クローンを含む宿主Ｅ．ｃｏｌｉ
）は、ホモシステイン、システイン、およびメチオニンに対する精製した酵素調
製物の相対的活性について表している。上記のように、図３で示されるアッセイ
では、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 法を用いて酵素を
精製した。図４に示されるアッセイでは、ニッケル−ＮＴＡアガロースアフィニ
ティー試薬を用いた精製法を行った（方法論について、上記の表題「α−ケトブ
チレートアッセイ／ピルビン酸アッセイ」を参照）。

【００９５】 宿主Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から組換えホモシステイナーゼを精製するために多数の
方法が利用できることがよく認識されるであろう。例示するように、本発明新規
ホモシステイナーゼは、（本発明アッセイを用いて）システイン、またはメチオ
ニンに対して示される活性よりも、典型的にその１００倍で、さらに約１０００
倍までのホモシステインに対する活性を表す。

【００９６】 （実施例３） （単一工程／単一酵素臨床アッセイ） ホモシステイナーゼの新規酵素種の基質特異性を利用するために、生物学的流
体中のホモシステインの多数の工程／多数の酵素アッセイ手順が、簡易化した単
一工程／単一酵素アッセイでの使用に適用されることが即座に認識される（用語
「単一工程アッセイ」および「単一酵素アッセイ」は、システインおよび（また
は）メチオニンの存在下でホモシステインを正確に測定するために、生物学的試
料がただ１つの酵素と接触することのみ必要であるということを示すために本明
細書中で交換可能に使用される）。このような手順に適切なホモシステイナーゼ
の濃度は、容易に決定される。

【００９７】 本発明単一酵素診断法に従って、システインおよび（または）メチオニンの濃
度が混入することにより妨害することなく、医師に対して価値ある診断情報を与
えるために十分正確に、例えば、全血、血漿、血清、尿または組織液などの生物
学的試料中のホモシステイン濃度を測定し得る。このような診断アッセイは迅速
、正確で、少数の試薬から構成されるため、臨床実験室での大スケールのスクリ
ーニング操作、および公衆衛生的な測定として、適用可能である。

【００９８】 代表的な実施例において、正常血漿中のシステイン濃度は、約３０−１２０μ
Ｍであり得、そして正常血漿中のホモシステイン濃度は、わずか約５−１５μＭ
である。当該分野で認識されているように、被験者の心血管系疾患に対するリス
クは、血漿中ホモシステイン濃度が１５μＭレベルへ上昇すると、有意に増加し
得る。数百μＭレベルまでのホモシステインレベルを持つ場合、心血管系疾患高
リスク患者として同定する。同様に、システイン代謝障害を持つ患者では、５０
０またはさらに１０００μＭまでのシステインレベルを有し得る。本発明診断キ
ットは、１−５００μＭの範囲の生物学的流体中ホモシステイン濃度測定に有用
である。例えば、前記体液はまた、０μＭ（典型的には１０μＭから）から約１
０００μＭまたはそれ以上のシステインを含む。

【００９９】 本発明の好適な実施に従って、ホモシステイアーゼのホモシステイン対システ
インに対する相対的活性は、産物である硫化水素を検出することによって、患者
試料中で測定されたホモシステインの見かけの濃度（システインの濃度も反映す
る）が、その実際の値の約１５０％以下、好適には、約１１０％以下、最も好適
には約１０２％以下であるような、ホモシステイナーゼを提供する。本発明のさ
らに好適な実施例において、例えば、ｐＡＣ２−１から発現される新規Ｔｒｉｃ
ｈｏｍｏｎａｓホモシステイナーゼを使用して、単一酵素アッセイにおいて測定
された見かけのホモシステイン濃度には、システインからの約１％以下の寄与し
か示さない。

【０１００】 本発明の実施に従って、このような単一酵素アッセイ方法（例えば、ホモシス
テイナーゼとして配列番号１０を用いたもの）を、様々な範囲の天然の濃度の、
ホモシステインおよびシステイン（およびまた、適切な場合にメチオニン）の両
方の生体内濃度（および濃度比率）に対して適用可能であり、従って、正確に、
健康な被験者および疾患状態の危険性を持つ被験者の両方、特に、心血管系疾患
を持つ被験者に関して体内液の化学的性質を反映させ得る。

【０１０１】 被験者の生物学的流体中ホモシステイン濃度に対する単一酵素アッセイでの使
用を目的とした診断キットには、ホモシステイナーゼ酵素、および、ホモシステ
インに対するホモシステイナーゼ反応により形成される硫化水素産生量測定を行
なうために使用される少なくとも１つの試薬が含まれる。前記ホモシステイナー
ゼは、システインに対して非常に非反応的であり、システインに対する前記ホモ
システイナーゼ反応によって産生される硫化水素が、心血管系疾患のリスクを調
べるために必要な前記キットの使用に際して実質的に妨害しない。

【０１０２】 本発明診断キットは、幅広い範囲のホモシステインおよびシステイン濃度なら
びに相対濃度に対して有用であるので、本発明の満足すべき多様な実施例が存在
することが予想されるはずである。典型的な実施例も、以下に示す。

【０１０３】 （１）ほぼ一般的に、ホモシステインのかわりにシステインからのものだとさ
れる測定された硫化水素分画は、十分に小さいはずであり、有資格の治療者によ
って、有用な結果判断を阻害しない。一般的に、ホモシステインからのものだと
される産生された硫化水素量がおよそ全体の半分である場合、有用な診断情報が
得られ得る。患者試料中において、ホモシステインに比べて一般的に高濃度のシ
ステインが含まれるため、このような酵素の特異性がさらに明らかである。しか
しながら、好適に、本アッセイにおいて検出される全体のホモシステインに起因
する全ての硫化水素分画は少なくとも９０％、好適には９５％、より好適には９
８％、最も好適には、９９％以上である。例えば、本発明の実施に従って、配列
番号：１０で示されるホモシステイナーゼを使用する場合９９％のレベルを容易
に得る。

【０１０４】 （２）ホモシステイン濃度が約２０μＭ以上に達する、心血管性疾患に対する
リスクを示す患者試料のアッセイにおいて、３００μＭあるいはそれ以上のシス
テイン濃度が全体の硫化水素量に寄与するのは、１％以下である。明らかに、よ
り高濃度のシステインを含む生物学的試料に関しても、このような酵素は非常に
有用である。

【０１０５】 （３）ホモシステイン濃度に対するシステイン濃度の比が、例えば約１５：１
になるような、心血管系疾患に対するリスクを示す患者試料のアッセイにおいて
、検出される全体の硫化水素量に対するシステインの寄与は約１％未満である。

【０１０６】 次の事柄によりさらに、既知のホモシステイナーゼおよび本発明新規酵素の性
質の相違が明らかにされる。

【０１０７】 Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓから単離したホモシステイナー
ゼ（１つ以上の遺伝子からの発現を反映しうる。）がホモシステインに対して、
約０．５ｍＭのＫ_mを持つことが報告された（Ｌｏｃｋｗｏｏｄら、１９９１、
上記）。ｐＡＣ２−１クローンから発現された新規酵素に関して測定されたＫ_m
値は、（全て３７℃、ｐＨ８．０）ホモシステインに対して４．８ｍＭ、システ
インに対して３．４５ｍＭ、メチオニンに対して３．１ｍＭである。

【０１０８】 異なる濃度（１０μＭから１．６ｍＭ）のＤＬ−ホモシステイン、Ｌ−メチオ
ニンまたはＬ−システインに対して、１ｍｌの、１０μＭピリドキサルリン酸を
含有する１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ８．０中で、３７℃にて１０分間、５
０μｌの酵素（３００ユニット／ｍｌ）を用いて行われたアッセイから、Ｋ_m値
計算を行った。０．１ｍｌの５０％ＴＣＡを添加して反応を停止した。次に、Ｅ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（遠心機）で、１３ｋ ｒｐｍ、２分
間、得られた懸濁液を遠心した。次に、０．５ｍｌの上清試料を０．５ｍｌ体積
の、０．８ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２中に溶解した０．０５％ ３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンに添加し、５０^oＣにて３０分間
インキュベーションを行った。その後、分光光度計を用いて、ＯＤ₃₂₀で、反応
生成物量を測定した。図５で報告されているＫ_cat（代謝回転数）値は、標準的
な速度論式およびプロットを用いたＶ_max値の計算から算出した。

【０１０９】 ｐＡＣ２−１クローンより発現された酵素の速度論が、先行酵素と非常に異な
ることは明白である。本発明のさらなる局面には、速度論的な性質を向上させる
ために、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ酵素のアミノ酸配列においてある一定の変化が
説明されているとはいえ、これを遂行することを目的とした他の可能性ある機構
が当業者により認識されるだろうとの認識が含まれる。その例は、活性部位また
はそれ以外の部位での、酵素のコバレント修飾である。ホモシステイナーゼを改
変するこれらの他の方法は、それらにより、本明細書で最初に示したような速度
論性を持つ酵素産物得ることができる場合、本発明の実施範囲内である。

【０１１０】 （実施例４） （硫化水素検出方法の改善） 硫化水素の強化した検出方法を開発した。本発明のこの局面に従った診断キッ
トを次のように用意した。 次に示す試薬／保存溶液を用意する： （ａ）緩衝溶液−５０ｍＭ ホウ酸緩衝保存溶液、ｐＨ７．５は、３０９ｍｇの
Ｈ₃ＢＯ₃、ｆ．ｗ．６１．８３を、９０ｍｌのｄｄ水に添加し、ＮａＯＨでｐＨ
を７．５に調整した後、ｄｄ水で体積を全部で１００ｍｌに調製する。本実施例
で用いたホウ酸緩衝液の代わりに、リン酸ナトリウム緩衝液およびトリス緩衝液
のような、任意の許容可能な緩衝液をも使用し得る。 （ｂ）還元剤−１５．４ｍｇのＤＬ−ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）、Ｓｉ
ｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、を１ｍｌのホウ酸緩衝液（ａ）に溶解し、１
００ｍＭ溶液を調製する。本実施例で用いたＤＴＴのかわりに、ＴＣＥＰ（トリ
ス（２−カルボエチル）ホスフィンおよびβ−メルカプトエタノールなどのよう
な、任意の許容可能な還元剤をも使用し得る。 （ｃ）発色試薬Ｉ−３３．２５ｍｇのフェリシアン化カリウム、Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ
）₆，Ｓｉｇｍａ、を、１０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、Ｓｉｇｍａの溶液で溶解し、第二鉄イオンの１０ｍＭ 保存溶液
を調製する。この溶液は、使用前によく混合しなければならない。Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００界面活性剤以外の、他の許容可能な界面活性剤をも使用し得る。 （ｄ）発色試薬ＩＩ−５２．５ｍｇのＮ，Ｎ−ジプロピル−フェニレンジアミン
（「ＤＰＰＤＡ」）、Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ、を、ｄｄ水で、最終濃度が１００ｍＭになるよ
うに溶解する。 （ｅ）組換えホモシステイナーゼ−産物であるＨＹａｓｅ^TMとして、Ａｎｔｉ
Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより、配列番号１０（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ クローン ｐＡＣ２−１，ＡＴＣＣ ９８５４９）で示される酵素を購
入しうる。この酵素の分子量は、１７２，０００および比活性は、４０ユニット
／ｍｇである。４ユニット／ｍｌになるよう、前記で使用したホウ酸緩衝液で酵
素を希釈し、アッセイの間、０−４^oＣに保存し、それぞれの使用ごとに新鮮な
酵素溶液を調製するべきである。 （ｆ）ＤＬ−ホモシステイン−２．７ｍｇのＤＬ−ホモシステイン、Ｓｉｇｍａ
、を、２ｍｌホウ酸緩衝液に添加し（最終濃度４ｍＭ）、検定標準液として毎日
新鮮なものを調製する。使用中は、０−４^oＣで保存する（注意：一般的には、
ホモシステイナーゼはホモシステインの天然のＬ−光学異性体とのみ反応するが
、Ｄ／Ｌ体混合物から経済的にＬ−異性体を得ることができる。もちろん、効果
的なＬ−濃度を得るために、５０％の補正要素を考慮する必要がある）。

【０１１１】 代表的なアッセイプロトコールは次に示すようなものである。０．１ｍｌ 血
漿を、０．９ｍｌホウ酸緩衝液に添加する。次に、１０μｌの１００ｍＭ ＤＴ
Ｔ溶液を添加し、よく混合した後、３７℃にて３０分間インキュベーションを行
う。３０μｌのＨＹａｓｅ^TM組換えホモシステイナーゼ（ホウ酸緩衝液で予め４
ユニット／ｍｌに希釈したもの）を添加して混合した後、さらに３７℃にて１分
間インキュベーションを行う。次に２００μｌの発色試薬Ｉおよび１０μｌの発
色試薬ＩＩを同時に添加し、試料を３７℃にて２０分間インキュベーションを行
う。次いで、分光光度計を用いて６７７ｎｍでのＯＤを測定することにより、産
物であるメチレンブルー型色素団を検出する。次に、ホモシステインおよび（ま
たは）そのジスルフィド結合２量体（ホモスチン）を標準物として使用し得る、
構築した検量線から、Ｌ−ホモシステイン血漿中濃度を算出する。ここで挙げた
代表例において、アッセイ試薬または試薬濃度を選択する場合にかなりの変化が
可能であり、技術の熟練の範囲内としてそのような改変がすぐに認識されるであ
ろうことはもちろん明白である。

【０１１２】 （実施例５） （蛍光発色に基づいたホモシステイン診断アッセイ） ホモシステインアッセイで得られた色素団濃度測定に蛍光を使用することによ
って、吸光度を用いた感度と比較して約１０００倍に感度を増強しうる。従って
、より感度の高い蛍光発色に基づいた測定法を用いて、上記の吸光度に基づいた
測定法よりも、約１０分の１から１００分の１程度の少量の試料をアッセイし得
る。例えば、指に針を刺し採取した血液試料は、ホモシステインアッセイにおい
て強い蛍光シグナルを達成するのに十分な量である。

【０１１３】 吸光度に基づいたアッセイと比較して蛍光発色に基づいたアッセイにおいて感
度が増強されていることを、図６で示す。この図において、Ｘ軸は、アッセイに
おける硫化水素濃度を表す。様々な濃度に対して行った同一のアッセイにおける
吸光シグナルよりも蛍光シグナルに対するカーブは鋭く、蛍光シグナルが吸光シ
グナルよりもかなり感度が高いことを示す。

【０１１４】 蛍光による測定時、適当なシグナルを提供するどのような適した試薬も適切で
ある。図６で示した蛍光発色に基づいたアッセイにおいて、例えば、発色試薬と
して、上記で考察した吸光度測定に使用されたＮ，Ｎ−ジブチル−フェニレン−
ジアミン（ＤＢＰＤＡ）を使用した。一般的に、このアッセイが蛍光で計測され
ることを除いて、吸光度に基づいたアッセイに使用する同一の条件を、蛍光発色
に基づいたアッセイで使用し得る。

【０１１５】 励起波長および発光波長の適切な組み合わせを用いて蛍光による非常に強いシ
グナルが得られ得る。これらの波長は、当業者により決定され得る。例えば、６
５５ｎｍの励起波長および６９０ｎｍの発光波長、または６４０ｎｍの励起波長
および６７５ｎｍの発光波長を、一定の条件下で使用し得る。

【０１１６】 蛍光測定によるホモシステインに対する図７標準曲線および、固定した量のシ
ステインも含むホモシステイン試料に対する図８曲線の比較により、システイン
によるホモシステイン測定に対する妨害が最小限に抑えられていることが示され
る。これらの結果は、吸光度に基づいたアッセイと一致する。図９において、様
々な濃度のシステイン試料により及ぼされる妨害について示す。

【０１１７】 指を針で刺すことにより採血した少量の血液試料を用いて、そこに含まれるホ
モシステイン濃度測定を行った。図７の標準曲線において、正確な濃度が既知で
ある試料の蛍光読み取り結果と対応させることにより、図７の図表における結果
を示す濃度が得られた。

【０１１８】 （実施例６） （システインおよびホモシステインの測定） アッセイする試料を２つに分注する。ホモシステインを除去するために片方を
処理し、もう一方には処理を行わない。

【０１１９】 ホモシステインを除去した部分については、１０−２０μｌの試料および、試
料に対してそれに対応するものとして９８０−９９０μｌの変換緩衝液、合わせ
て１ｍｌを、３７℃にて３０分間インキュベーションを行う。変換緩衝液は、２
０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ８．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０μｇ／ｍｌ
ＳＡＨＨ（組換えを利用して産生）、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１
ｍＭ ＤＴＴ および１００ｍＭ アデノシンである。

【０１２０】 コントロールとして第二部分において、１０μｌの試料を、ＳＡＨＨもしくは
アデノシンのいずれかまたは両方が除外されることを除いて、１ｍｌの同様の緩
衝液に提供する。この試料はまた、３０分間３７℃でインキュベートする。

【０１２１】 次に、両方の試料を、１０μｌの組換えホモシステイナーゼ（０．２７５ｍｇ
）で処理する。ホモシステイナーゼは、組換え技術を利用して産生され、そして
Ｐ．ｐｕｔｉｄａより単離した上記ホモシステイナーゼである。両試料に対して
３７℃にて１０分間インキュベーションを行う。

【０１２２】 次に、５０μｌの発色試薬（４０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジブチルフェニルレン−ジア
ミン塩酸（６Ｍ ＨＣｌ中））を添加して反応を停止した後、５０μｌの酸化剤
（４０ｍＭ フェリシアン化カリウム（２０ｍＭ リン酸カリウム中）ｐＨ８．
３）を添加する。次に、この部分を３７℃にて１０分間インキュベーションを行
い、６６５ｎｍの励起波長、および、６９０ｎｍの発光波長で蛍光を、または６
７５ｎｍで吸光度を読み取る。

【０１２３】 ある特定のアッセイにおいて、１０μｌの血漿試料を、０，５，１０，２０ま
たは４０μＭのホモシステインを含む１０μｌの溶液と混合した。６７５ｎｍで
の吸光度を読み取った結果を以下の表１に示す。

【０１２４】

【表１】 表１で示すように、ＳＡＨＨ処理し、従ってシステインのみを推定して測定し
た部分（１）において、ホモシステインを添加した範囲を通して、吸光度は相対
的に一定している。しかしながら、ＳＡＨＨ非処理部分（２）において、添加し
たホモシステイン量の増加に伴い、吸光度は明らかに増加している。表のカラム
４（ΔＯＤ）で示されるように、血漿試料そのものは、ＳＡＨＨ非処理試料が、
ＳＡＨＨ処理試料より大きい吸光度を示すように、このアッセイによると測定可
能な量のホモシステインが存在する。もちろん、この相違は、添加量増加レベル
に対応して増加している。表のカラム５（ΔＯＤ）により、ホモシステイン（Ｈ
Ｃ）添加に起因するＯＤ変化が示される。これらのデータを、グラフとして図１
０で示す。上のグラフは、部分（１）および（２）の結果を、下のグラフはカラ
ム５におけるデータを示す。

【０１２５】 本開示のさらなる補足において、１９９７年９月２６日に、確証された生存率
を持つ生物物質の寄託を、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ下の、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
，ＭＤ，ＵＳＡに対して行った。その物質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３
）、クローンｐＡＣ２−１として同定されるもので、ＡＴＣＣ番号９８５４９を
割り当てられている。本明細書中の特許の付与において、公衆に対するこの物質
の利用可能性上の全ての制限は、決定的に除かれるであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１（パネルＡおよびＢ）は、ｍｇｌ１遺伝子によりコードされるＴｒｉｃｈ
ｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓホモシステイナーゼのアミノ酸配列と、Ｔｒ
ｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ｐＡＣ２−１クローンによりコード
されるアミノ酸配列との比較を提供する。

【図２】 図２は、システイン、メチオニンおよびホモシステインに対するｐＡＣ２−１
クローンのホモシステイナーゼに対応する比活性比較（ユニット／ｍｇの粗Ｅ．
ｃｏｌｉ抽出物）を示す。

【図３】 図３は、システイン、メチオニンおよびホモシステインに対する、ホモシステ
イナーゼ（ＤＥＡＥ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ手順を使用して精製された、ｐＡＣ２
−１クローン）の比活性比較を示す。

【図４】 図４は、システイン、メチオニン、ホモシステインに対する、ホモシステイナ
ーゼ（ニッケルカチオンアフィニティー試薬を使用して精製された、ｐＡＣ２−
１クローン）の比活性比較を示す。

【図５】 図５は、システイン、メチオニンおよびホモシステインに対するホモシステイ
ナーゼ（ｐＡＣ２−１クローン）の測定されたＫ_cat値を示す。

【図６】 図６は、種々の硫化水素濃度における蛍光および紫外線吸収の比較を提供する
。

【図７】 図７は、Ｌ−ホモシステインの検量線を示す。

【図８】 図８は、蛍光によって測定される酵素的ホモシステインアッセイでのシステイ
ンによる妨害の相対的欠如を示すホモシステインの曲線、および指に針を刺して
得られた血液試料の結果を示す。

【図９】 図９は、種々のシステイン濃度での、蛍光によって測定されるシステインによ
る妨害を示す。

【図１０】 図１０は、減算によってホモシステインレベルを算出した、血漿中のホモシス
テインおよびシステインの両方に対するアッセイ結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ ４Ｂ０６５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 31/00 Ｐ 1/48 31/10 Ｇ０１Ｎ 31/00 33/483 Ｃ 31/10 33/68 // Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ (72)発明者 タン， ユイン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92111， サン ディエゴ， リンダ ビスタ ロ ード 7575， アパートメント 80 (72)発明者 ハン， チンホン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122， サン ディエゴ， デコロ ストリート 4158， アパートメント 40 (72)発明者 タン， リー アメリカ合衆国 カリフォルニア 92111， サン ディエゴ， スタルマー ストリ ート 7850， アパートメント ディー29 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 CA10 CB03 DA03 FA04 FA07 FA11 FB02 GA01 GA04 GA05 HA07 2G045 AA13 CA26 FA11 FB12 4B024 AA11 BA07 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD01 DD02 LL03 4B063 QA01 QQ80 QR18 QS31 4B065 AA09Y AA23Y AA26X AA41Y AA86Y AB01 AC14 CA27 【要約の続き】

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 精製および単離されたホモシステイナーゼであって、ここで
   、該ホモシステイナーゼは、生物学的流体中のホモステイン濃度が５〜１５マイ
   クロモル濃度であり、そしてシステインの濃度が１００〜３００マイクロモル濃
   度である場合、該生物学的流体と接触する際に、該ホモシステイナーゼの作用に
   より産生される硫化水素の少なくとも９０％が、ホモシステイン由来のものであ
   る特性を有する、ホモシステイナーゼ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のホモシステイナーゼであって、ここで、生
   物学的流体中のホモステイン濃度が５〜１５マイクロモル濃度であり、そしてシ
   ステインの濃度が１００〜３００マイクロモル濃度である場合、該生物学的流体
   と接触する際に、該ホモシステイナーゼの作用により産生される硫化水素の少な
   くとも９９％が、ホモシステイン由来のものである、ホモシステイナーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のホモシステイナーゼであって、ここで、生
   物学的流体が５マイクロモル濃度のホモステインおよび１０００マイクロモル濃
   度のシステインを含有する場合、該生物学的流体と接触する際に、該ホモシステ
   イナーゼの作用により産生される硫化水素の少なくとも９０％が、ホモシステイ
   ン由来のものである、ホモシステイナーゼ。
4. 【請求項４】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ａｅｒ
   ｏｍｏｎａｓまたはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓあるいはこれらの変異形態由来の脱
   硫酵素のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のホモシステイナーゼ。
5. 【請求項５】 Ｎ末端に少なくとも１個のヒスチジン残基をさらに含む、請
   求項１に記載のホモシステイナーゼ。
6. 【請求項６】 精製および単離されたホモシステイナーゼであって、該ホモ
   システイナーゼは、適切なアッセイにおいて、ホモシステインに対する配列番号
   ８のホモシステイナーゼの活性の少なくとも１１０％を有し、そしてシステイン
   またはメチオニンに対する配列番号８のホモシステイナーゼの活性の９０％以下
   を有する、ホモシステイナーゼ。
7. 【請求項７】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ａｅｒ
   ｏｍｏｎａｓまたはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓあるいはこれらの変異形態由来の脱
   硫酵素のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のホモシステイナーゼ。
8. 【請求項８】 Ｎ末端に少なくとも１個のヒスチジン残基をさらに含む、請
   求項６に記載のホモシステイナーゼ。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載のホモシステイナーゼを
   コードする、精製および単離されたヌクレオチド配列。
10. 【請求項１０】 発現系を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子であって、該発
    現系は、本質的に、請求項９に記載のヌクレオチド配列の発現のための制御配列
    に作動可能に連結された、請求項９に記載のヌクレオチド配列からなる、ＤＮＡ
    またはＲＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 請求項１０のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含有するように改
    変された組換え宿主細胞。
12. 【請求項１２】 システインと比較してホモシステインに対して高度な特異
    性を有するホモシステイナーゼを調製する方法であって、該方法は、該ホモシス
    テイナーゼが産生される条件下で、請求項１１に記載の細胞を培養する工程を包
    含する、方法。
13. 【請求項１３】 試料中の硫化水素のレベルを決定するための改良方法であ
    って、該方法は、該試料中の任意の硫化水素とＮ，Ｎ−ジアルキルフェニレンジ
    アミンおよび酸化剤とを反応させ、発色錯体を得る工程を包含し、ここで改良点
    として、該錯体によって放射される蛍光を測定する工程を包含する、方法。
14. 【請求項１４】 前記硫化水素を、システインおよび／またはホモシステイ
    ンの分解によって産生される、請求項１３に記載の改良方法。
15. 【請求項１５】 前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルフェニレンジアミンが、Ｎ，Ｎ−
    ジ−ｎ−ジブチルフェニレンジアミンである、請求項１３に記載の改良方法。
16. 【請求項１６】 第１部分および第２部分に分割された、試料中のホモシス
    テインおよび／またはシステインを測定する方法であって、該方法は、以下： ある量のＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）およびある
    量のアデノシンを用いて、該第１部分を処理して、該第１部分中の任意のホモシ
    ステインをＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）に変換する工程； 該第１部分および第２部分中の任意のシステインおよび任意のホモシステイン
    を硫化水素を含む産物に変換するのに有効なホモシステイナーゼ酵素を用いて、
    該試料の該第１部分および第２部分を処理する工程；ならびに 該第１部分および第２部分中で産生される硫化水素を測定する工程、を包含し
    、 ここで、該第１部分中の硫化水素のレベルは、システインによって産生される
    硫化水素を表し、そしてここで、該第２部分中で産生される硫化水素のレベルは
    、ホモシステインおよびシステインの両方によって産生される硫化水素を表す、
    方法。
17. 【請求項１７】 システインと比較してホモシステインに対して所望の程度
    の特異性を有するホモシステイナーゼをコードするヌクレオチド配列を同定する
    ための方法であって、該方法は、以下： 候補ホモシステイナーゼのための発現系を含むように改変された細胞のコロニ
    ーの、一致する第１培養物および第２培養物を培養する工程； 該第１培養物を所定の濃度のホモシステインと接触させる工程； 該第２培養物を所定の濃度のシステインと接触させる工程； 所定の時間、該培養物をインキュベートする工程；および 各々の該培養物中の硫化水素のレベルを測定する工程、を包含し、 ここで、各々の該培養物中で産生される硫化水素のレベルは、該培養による、
    ホモシステインまたはシステインの硫化水素への変換レベルを示す、 方法。
18. 【請求項１８】 ヌクレオチド配列をコードする前記候補ホモシステイナー
    ゼが、天然に存在するホモシステイナーゼの変異によって産生される、請求項１
    ７に記載の方法。