ES2369979T3 - Ensayos de ciclación enzimática para la homocisteína y la cistationina. - Google Patents

Abstract

Kit de prueba adecuado para su utilización en la evaluación de la cantidad de homocisteína en una solución de muestra que comprende cistationina ß-sintasa, o un derivado de la misma, L-serina, cistationina ß-liasa, o un derivado de la misma, en el que los derivados conservan la actividad enzimática de una enzima natural aislada.

Description

Ensayos de ciclación enzimática para la homocisteína y la cistationina.

Antecedentes de la invención

Las grandes concentraciones de homocisteína en el plasma humano se correlacionan con el aumento del riesgo de cardiopatía coronaria, ictus, arterioesclerosis y otras enfermedades. Como resultado, es deseable examinar en la población en general las cantidades elevadas de este aminoácido. Para la viabilidad de la prueba a gran escala de la homocisteína, deben desarrollarse nuevos ensayos y menos costosos.

La homocisteína en el plasma se mide de forma rutinaria por cromatografía líquida a alta presión (HPLC) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) a un coste superior a 100 $ por ensayo, haciendo demasiado costosos estos métodos de separación física para un estudio en toda la población. Por ejemplo, pueden prepararse muestras de orina o de sangre para cromatografía de aminoácidos, y cuantificar la L-homocisteína por separación y detección por HPLC. Fiskerstrand et al.,(Clin. Chem., 39:263-271 (1993)) describen un método de ensayo de L-homocisteína que utiliza el marcaje fluorescente de tioles del suero, seguido de separación y detección por HPLC del derivado de L-homocisteína procedente de varios otros compuestos que contienen azufre. Sin embargo dichos métodos son por lo general prolongados, costosos y no resultan fácilmente disponibles en muchos laboratorios.

Se ha desarrollado también un inmunoensayo indirecto para la homocisteína, sin embargo, estos métodos de anticuerpos son todavía relativamente costosos a razón de aproximadamente 24 $ por prueba. Un inmunoensayo indirecto específico convierte mediante enzimas la homocisteína en adenosil-homocisteína y la cantidad de adenosilhomocisteína se determina por un ELISA competitivo (inmunoensayo con enzima ligada), utilizando un anticuerpo anti-adenosil-homocisteína (por ejemplo, véase la patente US nº 5.827.645).

Se han desarrollado ensayos enzimáticos indirectos para la cuantificación de L-homocisteína. Por ejemplo, la enzima S-adenosil-homocisteína hidrolasa y la adenosina se añaden a una muestra de prueba. La concentración resultante, o el cambio en la concentración, de adenosina en la mezcla de reacción se utiliza como indicador para la concentración inicial de homocisteína en la muestra.

Se han publicado también ensayos enzimáticos directos para cuantificar la homocisteína. Por lo general, estos protocolos convierten de manera irreversible la homocisteína en otros compuestos que son cuantificables. Por ejemplo, la enzima homocisteína deshidratasa se ha utilizado para eliminar el grupo sulfhidrilo de la homocisteína. La concentración del resto sulfhidrilo eliminado se mide a continuación. Un inconveniente principal en éste y otros ensayos enzimáticos para la homocisteína es que las enzimas utilizadas reaccionan con otros aminoácidos que contienen azufre y compuestos relacionados con la homocisteína, conduciendo a un fondo elevado e inconstante y a determinaciones de homocisteína en el plasma que son inexactas.

Se han publicado ensayos de ciclación enzimática para un número muy pequeño de analitos. En un ensayo de ciclación enzimático se utilizan dos o más actividades enzimáticas que reciclan el sustrato y no convierten de manera irreversible el compuesto cuantificado. En su lugar el "compuesto" se utiliza como catalizador para controlar la velocidad de conversión para el compuesto cuantificado en el ensayo. Como resultado, el analito de interés continúa en una concentración estacionaria que es lo suficiente baja como para crear una velocidad de reacción de seudoprimer orden. La concentración estacionaria del analito de este modo está relacionada linealmente con la velocidad de todo el ensayo. Al medir las velocidades de reacción, la cantidad del analito se determina fácilmente. Los ensayos de ciclación enzimática se denominan a veces ensayos de "ampliación", porque los métodos por lo general aumentan la sensibilidad de la cuantificación de un analito de 100 a 1.000 veces. La ampliación de la cuantificación es un resultado directo de no reducir la concentración estacionaria del compuesto. Se ha publicado un ensayo de ciclación enzimática para la cuantificación de la homocisteína en el documento WO 00/28071.

La presente invención proporciona un ensayo de ciclación enzimática para la homocisteína y/o la cistationina que es menos costoso, y proporciona un resultado superior de la muestra que los ensayos de diagnóstico actualmente disponibles. Además, la invención proporciona métodos y vectores para la producción recombinante de enzimas que pueden utilizarse en la producción de reactivos de ensayo y kits de prueba para evaluar la cantidad de homocisteína y cistationina en una muestra.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un kit de prueba para su utilización en la evaluación de la cantidad de homocisteína en una solución de la muestra que contiene cistationina β-sintasa, o un derivado de la misma, L-serina, cistationina β-liasa, o un derivado de la misma, en el que los derivados conservan actividad enzimática de una enzima natural aislada.

La invención proporciona además una enzima aislada que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 19 y nº 20.

La invención proporciona además un procedimiento de utilización de la cistationina como calibrador del ensayo de homocisteína que comprende las etapas siguientes:

(a)

tomar una concentración conocida de cistationina;

(b)

añadir dicha concentración conocida a una muestra biológica;

(c)

utilizar dicha muestra que contiene cistationina en una reacción enzimática que convierte la homocisteína en cistationina y reconvertir la cistationina en homocisteína con la producción acompañante de piruvato y amoniaco;

(d)

medir las cantidades de piruvato o amoniaco producidas; y

(e)

utilizar dichas cantidades medidas de piruvato o amoniaco como patrones de referencia para dicho ensayo de homocisteína.

Ésta aprovecha la reacción de homocisteína y L-serina para formar cistationina mediante la enzima cistationina βsintasa (CBS), o un derivado de la misma que conserva actividad enzimática de una enzima natural aislada y la conversión enzimática por la cistationina β-liasa (CBL) de cistationina a homocisteína, piruvato y amoniaco. El kit puede utilizarse para un ensayo que proporciona una concentración estacionaria de la homocisteína y/o la cistationina que está linealmente relacionado con la velocidad de la reacción completa. La cantidad de homocisteína y/o cistationina determinada en una muestra se basa en la cantidad de piruvato y/o amoniaco que se forma o en la cantidad de serina eliminada de la mezcla de reacción. Las soluciones que pueden someterse a prueba utilizando el kit de la presente invención pueden incluir muestras de laboratorio de sangre, suero, plasma, orina y otras muestras biológicas. Además, puede someterse a prueba cualquier otra muestra líquida.

Se da a conocer un procedimiento para evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina en una solución que comprende las etapas siguientes:

(a)

poner en contacto la solución que contiene homocisteína y/o cistationina (bien antes y/o después de llevar a cabo una etapa de reducción de disulfuro) para formar una mezcla de reacción con CBS, o un derivado de la misma, L-serina y CBL, o un derivado de la misma, durante un periodo suficiente para catalizar la conversión cíclica de homocisteína en cistationina, y la reconversión de cistationina en homocisteína con producción de piruvato y amoniaco;

(b)

determinar la cantidad de piruvato y/o amoniaco presente en la mezcla de reacción; y

(c)

evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en la solución basándose en la cantidad de piruvato y/o amoniaco formada.

Más específicamente, el procedimiento proporciona la evaluación de la cantidad de homocisteína mediante la adición del aminoácido L-serina económico. La cantidad de piruvato presente en la mezcla de reacción puede medirse de numerosas maneras. En un kit específico de la presente invención lactato-deshidrogenasa (LDH) y NADH (cofactor de nicotinamida reducido), están presentes en la mezcla de reacción. LDH en presencia de NADH convierte piruvato en lactato con la oxidación de NADH a NAD+ (cofactor de nicotinamida oxidado).

La oxidación de NADH a NAD+ puede medirse por numerosos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo el seguimiento de la mezcla de reacción a 340 nm. La producción de NAD+ puede también seguirse por la oxidación de un colorante para producir un cambio de color observable. Los colorantes preferidos para su utilización en la presente invención comprenden de manera no limitativa 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), 2,6-diclorofenilindofenol, compuestos de tetrazolio, metosulfato de fenazina, metilo viológeno o derivados de cualquiera de estos colorantes. La cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en la solución se basa en la intensidad del color observado en comparación con una curva patrón construida para muestras de analito de concentración conocida.

Se da a conocer que la piruvato oxidasa con peroxidasa de rábano picante, en presencia de peróxido de hidrógeno y un cromógeno pude utilizarse para detectar la cantidad de piruvato presente en la muestra. N-etil-N-2-hidroxi-3sulfopropil) m-toluidina sódica (TOOS) y otros derivados de N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-anilina son cromógenos preferidos para esta reacción colorimétrica. Como anteriormente, la cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en la muestra está basada en la intensidad del color observado comparada con una curva patrón construida para muestras de concentraciones conocidas del analito.

La cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en una solución puede medirse también basándose en la cantidad de amoniaco presente en la mezcla de reacción. Los métodos para determinar la concentración de amoniaco en una solución son abundantes. La cantidad de amoniaco puede medirse utilizando un sensor de amoniaco patrón normalmente disponible.

Se da a conocer un procedimiento para evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina en una muestra que comprende las etapas que consisten en poner en contacto la solución con un agente reductor durante un periodo suficiente para reducir sustancialmente toda la homocisteína y otros disulfuros que están presentes en la solución para homocisteína. El tratamiento con un agente reductor puede actuar también para liberar homocisteína que está unida a una proteína y/o a otras moléculas presentes en una solución mediante un enlace disulfuro. Tras la reducción la solución se pone en contacto a continuación con CBS, o un derivado de la misma, L-serina, y CBL, o un derivado de la misma, durante un periodo suficiente para catalizar la conversión cíclica de homocisteína en cistationina y la conversión de cistationina en homocisteína con producción de piruvato y amoniaco. Para evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en la solución, la cantidad de piruvato y/o amoniaco presente en la mezcla de reacción puede determinarse como se indicó anteriormente. Los agentes de reducción preferidos incluyen sales de borohidruro y agentes reductores de tiol. Los agentes reductores de tiol típicos apropiados para su utilización incluyen ditioeritritol (DTE), ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol (βME), hidrocloruro de tris-(carboxietil) fosfina (TCEP) o ácido tioacético, o algunos derivados de los mismos, y similares.

En otro procedimiento todavía para evaluar la cantidad de homocisteína y /o cistationina presente en una solución, la solución puede pretratarse con cistationina γ-liasa (CGL), o un derivado de la misma, durante un periodo suficiente para eliminar cualquier cistationina de la mezcla de reacción por conversión de cistationina en α-cetoglutarato. Después de la eliminación de cistationina la cistationina γ-liasa se elimina de la mezcla de reacción o se destruye. La cistationina γ-liasa puede destruirse calentando la solución durante un periodo suficiente para eliminar sustancialmente su actividad enzimática. La cistationina γ-liasa puede inmovilizarse también en un sustrato o superficie insoluble, tal como, por ejemplo, una micropartícula o bolita, que puede eliminarse fácilmente.

Se da a conocer un procedimiento para evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en una solución que comprende la reacción de la solución con L-serina y CBS, o un derivado de la misma, y CBL, o un derivado de la misma, que han sido inmovilizados en una superficie sólida. La superficie sólida puede ser, por ejemplo, papel, papel de filtro, nilón, vidrio, cerámica, sílice, alúmina, tierra de diatomeas, celulosa, polimetacrilato, polipropileno, poliestireno, polietileno, cloruro de polivinilo y derivados de los mismos. La superficie sólida puede ser los lados y el fondo del recipiente de prueba o puede ser un material añadido al recipiente de prueba. La superficie sólida puede comprender una bolita que se añade al recipiente de prueba.

La CBS, o el derivado de la misma, CBL, o el derivado de la misma, y cistationina γ-liasa, o un derivado de la misma, útil en la presente invención puede obtenerse en forma de extracto de una célula en bruto. En una forma de realización de la presente invención la cistationina β-sintasa (CBS), o el derivado de la misma, cistationina β-liasa (CBL), y/o cistationina γ-liasa (CGL) se purifican a partir de células humanas, de levadura o bacterianas. En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención los genes que codifican las enzimas se aíslan o sintetizan y se expresan como una proteína recombinante en una célula hospedadora. Resulta específicamente preferido que una secuencia de ADN que codifica una etiqueta de afinidad se añada al montaje génico para ayudar en la purificación y/o detección de las enzimas producidas de manera recombinante. Los métodos recombinantes pueden utilizarse también para proporcionar proteínas de fusión que comprenden las actividades enzimáticas de CBS y CBL en una sola proteína. Se puede incluir también una etiqueta de afinidad como parte del montaje de la proteína de fusión para ayudar a la purificación de la proteína de fusión.

Una forma de realización de la presente invención proporciona un kit de prueba tal como se define en la reivindicación 1, que comprende un recipiente para mantener la solución en la que debe evaluarse la cantidad de homocisteína y/o cistationina, L-serina, CBS, o un derivado de la misma, CBL, o un derivado de la misma, y algunos tampones, sustancias auxiliares y disolventes necesarias para proporcionar condiciones conductoras para gran actividad enzimática. El kit de prueba puede comprender además lactato deshidrogenasa y NADH, NADH puede medirse directamente a 340 nm o, puede incluirse un colorante que puede proporcionar un cambio de color cuando se oxida. La cantidad de homocisteína y/o cistationina está correlacionada con el cambio en la medida de absorbancia a lo largo del tiempo.

En una forma de realización preferida se proporcionan las enzimas inmovilizadas en un soporte sólido. El soporte sólido puede comprender la superficie del recipiente provisto para mantener la muestra de prueba o puede ser una bolita u otro artículo añadido al recipiente. En una forma de realización adicional de la presente invención, puede proporcionarse cistationina γ-liasa como parte del kit de prueba para eliminar cualquier cistationina de la solución de prueba antes del ensayo de ciclación enzimática. Sustancialmente toda la actividad de la cistationina γ-liasa, o un derivado de la misma, debe eliminarse de la mezcla de reacción o destruirse en la misma antes de la adición de los componentes restantes para la ciclación enzimática de la homocisteína.

Se ha observado que el ensayo preferido puede realizarse en un periodo relativamente corto y con cantidades relativamente pequeñas de enzima, proporcionando un ensayo que presenta sustanciales ventajas comerciales. Por ejemplo, el ensayo preferido implica la creación de una mezcla de reacción que incluye una muestra que contiene homocisteína, serina, CBS, CBL, lactato deshidrogenasa, NADH y un reductor tal como DTE o DTT, siendo la relación CBS/CBL en la mezcla desde aproximadamente 1:1 a 25:1, más preferentemente desde aproximadamente 1:10, y aún más preferentemente desde aproximadamente 2:1 a 5:1. De manera ventajosa, se ha observado que el reductor puede estar presente junto con el sistema de detección (es decir, la lactato deshidrogenasa y NADH) sin afectar perjudicialmente el ensayo. Por lo tanto, el ensayo se realiza sin una etapa de reducción independiente de modo que los tiempos de ensayo totales se reducen. Por lo tanto, cuando una variedad de muestras que deben ensayarse creando sucesivamente una mezcla de reacción en un recipiente (por ejemplo, una cubeta espectrofotométrica) constituida por una muestra, serina, CBS, CBL, lactato deshidrogenasa, NADH y el reductor, y evaluando la cantidad de piruvato presente en la mezcla de reacción controlando la producción de NAD+ a lo largo del tiempo, el intervalo de tiempo entre las respectivas etapas de reacción-creación puede ser como mucho de 100 a 50 segundos siendo el tiempo de reacción total de hasta aproximadamente 20 minutos para una muestra dada. Más preferentemente, el tiempo de reacción total para una muestra dada es de hasta aproximadamente 15 minutos, y aún más preferentemente hasta de aproximadamente 13 minutos. El número total de muestras ensayadas por hora puede ser de aproximadamente de 15 a 30 para instrumentos más lentos, pero tan elevada como 200 a 400 para instrumentos más rápidos. En este ensayo preferido, se prepara una mezcla de reacción que comprende la muestra, serina, lactato deshidrogenasa, NADH y el reductor, con un periodo de incubación adecuado que permita la liberación de un predominio (y preferentemente esencialmente su totalidad) la homocisteína (homocisteína total) presente en los estados ligado, oxidado y/o libre en la muestra. Después, se añaden CBS y CBL para completar la mezcla de reacción e iniciar la ciclación enzimática de homocisteína y/o cistationina.

En otra forma de realización preferida, puede utilizarse cistationina para construir un o unos calibrador(es) para el ensayo enzimático (ya que el ensayo de ciclación enzimática interconvierte la homocisteína y la cistationina). En otras palabras, pueden utilizarse niveles variables conocidos de cistationina en el sistema de ensayo para "calibrar"

o "normalizar" el ensayo y/o el instrumento lo que permite la cuantificación de los resultados de la muestra. En esta forma de realización, se añade una concentración conocida de cistationina a una muestra biológica y a continuación se somete al ensayo descrito en la presente memoria. Los resultados se utilizarán para crear una línea de calibración que a continuación se usará para ajustar la línea de homocisteína, debido al alto grado de correlación entre las dos líneas. Alternativamente, pueden utilizarse conocidas concentraciones de cistationina como medida de control de calidad, para asegurar que el ensayo está actuando de manera apropiada. En esta forma de realización de control de calidad, estas concentraciones "conocidas" de cistationina se ensayan como si fueran muestras desconocidas, y los resultados se comparan con sus valores conocidos (esperados), a fin de asegurar que el sistema de ensayo está funcionando apropiadamente.

Los ensayos preferidos se realizan utilizando enzimas CBL y CBS aisladas (purificadas) que tienen por lo menos aproximadamente 80% (y preferentemente por lo menos aproximadamente 90%) de identidad de secuencia con las enzimas seleccionadas de entre el grupo constituido por SEC. ID. nº 19 y nº 20. Tal como se utiliza en la presente memoria, "identidad de secuencia" como se conoce en la técnica se refiere a una relación entre dos o más proteínas

o secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, a saber una secuencia de referencia y una secuencia dada para ser comparada con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia una vez se han alineado las secuencias de manera óptima para producir el mayor grado de similitud de secuencia, determinado por la ajuste entre series de dichas secuencias. En dicha alineación, la identidad de secuencia se determina posición por posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición específica si en esta posición, los nucleótidos o restos de aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide a continuación por el número total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para dar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitarse a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1998), Biocomputing: Informatics y Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1998). Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia se diseñan para proporcionar un mayor ajuste entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos públicamente disponibles que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de dichos programas comprenden, de manera no limitativa el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), a BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al.,.Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX está públicamente disponible en NCBI y otros proveedores (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). Estos programas alinean de manera óptima secuencias utilizando ponderaciones de hueco por defecto para producir el nivel mayor de identidad de secuencia entre las secuencias dada y la de referencia. Como ilustración, mediante un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica que tiene por lo menos, por ejemplo, 95% de "identidad de secuencia" con una secuencia nucleotídica de referencia, se pretende que la secuencia nucleotídica del polinucleótido dado sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleotídica dada puede incluir hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 95% de identidad en relación con la secuencia nucleotídica de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden eliminarse o sustituirse por otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5’ o 3’ de la secuencia del nucleótido de

referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Asimismo, mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tiene por los menos, por ejemplo, 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de referencia, se desea que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos dada pueda incluir hasta alteraciones de 5 aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos dada con por lo menos el 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los restos de aminoácidos en la secuencia de referencia puede eliminarse o sustituirse con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta el 5% del número total de restos de aminoácidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones del terminal amino o del carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente ente los restos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferentemente, las posiciones del residuo que no son idénticas se diferencian por las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Sin embargo, no se incluyen sustituciones conservadoras como ajuste al determinar la identidad de secuencia.

Los reactivos útiles en la presente invención incluyen CBS, CBL, L-serina, LDH, NADH, DTE, βME, DTT, TCEP, ácido tioacético y CGL. Las concentraciones de la enzima CBS útiles en la presente invención oscilan entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 100 KU/l. Más preferentemente, la concentración de CBS oscila entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 75 KU/l, y aún más preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 KU/l. Aún más preferentemente, la concentración de CBS oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 KU/l. Las concentraciones de la enzima CBL útiles en la presente invención oscilan entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 KU/l. Más preferentemente, la concentración de CBS oscila entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 50 KU/l, y aún más preferentemente, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 30 KU/l. Aún más preferentemente, la concentración de CBS oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 15 KU/l. L-serina puede estar presente a una concentración final entre aproximadamente 1 µM y aproximadamente 50 mM. Más preferentemente, la L-serina se añade a una concentración final entre aproximadamente 10 µM y aproximadamente 40 mM y aún más preferentemente a una concentración final entre aproximadamente 100 µM y aproximadamente 20 mM. Aún más preferentemente, la concentración final de L-serina añadida oscila entre aproximadamente 0,2 mM y aproximadamente 10 mM. Cuando se utiliza en cualquier forma de realización, LDH está presente en la mezcla de reacción a una concentración final entre aproximadamente 30 y aproximadamente 5000 U/l. Más preferentemente, la concentración final de la LDH presente en la mezcla de reacción está comprendida entre aproximadamente 30 y aproximadamente 3000 U/l, y aún más preferentemente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2500 U/l. Aún más preferentemente, LDH está presente en la mezcla de reacción a una concentración final entre aproximadamente 100 y aproximadamente 2000 U/l. Además, cuando se utiliza NADH en cualquier forma de realización, la cantidad de NADH presente en la mezcla de reacción puede oscilar entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 2 mM. Más preferentemente, NADH está presente en la mezcla de reacción a una concentración final entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 1,5 mM, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 mM. Aún más preferentemente, NADH está presente en la mezcla de reacción a una concentración final entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,8 mM. Cuando se utiliza DTE en la presente invención, puede oscilar en una concentración final entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 100 mM. Más preferentemente, las concentraciones de DTE oscilarán entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 50 mM, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 25 mM. Aún más preferentemente, las concentraciones de DTE oscilarán entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 10 mM. Asimismo, cuando se utiliza DTT en la presente invención, puede oscilar en una concentración final entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 100 mM. Más preferentemente, las concentraciones de DTT oscilarán entre aproximadamente 0,01 mM y aproximadamente 50 mM, y aún más preferentemente entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 25 mM. Aún más preferentemente, las concentraciones de DTT oscilarán entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 10 mM. Por último, cuando se utiliza CGL en la presente invención, puede oscilar en la concentración final entre aproximadamente 0,1 KU/l y aproximadamente 100 KU/l. Más preferentemente, CGL oscilará entre aproximadamente 0,5 KU/l y aproximadamente 75 KU/l, y aún más preferentemente entre aproximadamente 1 KU/l y aproximadamente 50 KU/l. Aún más preferentemente, las concentraciones finales de CGL oscilarán entre aproximadamente 1 KU/l y aproximadamente 30 KU/l.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la absorbancia frente a diagramas de tiempo obtenidos utilizando soluciones acuosas de piruvato (5-100 µM) que demuestran la cuantificación de piruvato. Los componentes del reactivo fueron los descritos en la Tabla 1 y los ajustes del instrumento los descritos en la Tabla 2;

la figura 2 representa una curva patrón de valores de absorbancia representados frente a cantidades conocidas de piruvato (0-100 µM). La duración del ensayo fue de 5 min.;

la figura 3 representa la absorbancia frente a gráficos de tiempo obtenidos utilizando soluciones acuosas de cistationina (0-100 µM). La cistationina se cuantificó por conversión enzimática de cistationina a homocisteína, piruvato y amoniaco con CBL;

la figura 4 representa las curvas patrón del ensayo de cistationina obtenidas utilizando soluciones acuosas de cistationina (0 a 100 µM). La duración de la reacción fue 5 ó 20 min.;

la figura 5 representa la absorbancia frente a gráficos de tiempo que demuestran la ciclación de CBS/CBL/piruvato oxidasa/peroxidasa y el sistema de señalización. Se disolvió cistationina en agua para preparar patrones a concentraciones entre 1 y 100 µM;

la figura 6 representa la absorbancia frente a gráficos de tiempo que demuestran la ciclación de CBS/CBL/piruvato oxidasa/peroxidasa y el sistema de señalización. Se disolvió cistationina en agua para preparar patrones a concentraciones entre 0 y 100 µM;

la fig. 7 representa una curva de calibración típica obtenida utilizando soluciones acuosas de homocisteína (0100 µM) utilizando el sistema de ciclación y detección CBS/CBL/PO/HRP;

la figura 8 representa gráficos típicos de absorción frente al tiempo obtenidos utilizando homocisteína (0-100 µM) en solución acuosa utilizando el sistema CBS/CBL/LDH sin ditiotreitol;

la figura 9 representa gráficos típicos de absorción frente al tiempo obtenidos utilizando homocisteína (0-100 µM) en solución acuosa utilizando el sistema de ciclación CBS/CBL/LDH con ditiotreitol;

la figura 10 representa un gráfico de calibración de la concentración de homocisteína (0 a 100 µM) frente a la absorbancia con y sin ditiotreitol. La duración de la reacción fue de 5 minutos;

la figura 11 representa una correlación entre los resultados de cuantificación obtenidos utilizando el sistema de ciclación enzimática CBS/CBL/LDH para medir la homocisteína en muestras de plasma humano utilizando DTT como agente reductor en comparación de los resultados de la cuantificación obtenidos por el método IMx homocisteína de Abbott;

la figura 12 representa un gráfico de correlación que ilustra la correlación entre ensayo de la presente invención (y) frente al ensayo IMx (x) comercializado, como se describe en el ejemplo 7;

la figura 13 representa un gráfico de correlación que ilustra la correlación entre ensayo de la presente invención (y) frente a un ensayo de HPLC convencional (x), como se describe en el ejemplo 7;

la figura 14 representa un gráfico de correlación que ilustra la correlación entre ensayo IMx (x) y el ensayo HPLC (y), como se describe en el ejemplo 7;

la figura 15 representa un gráfico de absorbancia frente al tiempo para el ensayo de piruvato sin DTT descrito en el ejemplo 9; y

la figura 16 representa un gráfico de absorbancia frente al tiempo para el ensayo de piruvato que contiene DTT descrito en el ejemplo 9.

Descripción de las formas de realización específicas

La presente invención proporciona un kit tal como se define en la reivindicación 1 para evaluar la cantidad de homocisteína en una muestra. La ciclación enzimática mantiene un nivel estacionario de homocisteína y proporciona además un aumento de la sensibilidad del ensayo de homocisteína. Además, la presente invención proporciona enzimas que son útiles en la presente invención tal como se define en la reivindicación 18.

La homocisteína está presente en células como aminoácido intermediario producido cuando la metionina se metaboliza a cisteína. Generalmente, la homocisteína producida en el cuerpo es metabolizada rápidamente por una de las dos vías: (1) condensación con serina para formar cistationina o (2) conversión a metionina, y su concentración (y la de su forma ionizada, homocistina) en el cuerpo es baja en condiciones normales. La concentración media de homocisteína en el plasma para un adulto sano es aproximadamente 12 µM para varones que oscilan desde aproximadamente 8,6 a aproximadamente 17,1 µM y 10 µM para hembras que oscilan desde aproximadamente 3,9 a 16,8 µM (Vester et al., Eur. J. Clin. Chem. Biochem., 29:549-554 (1991); Jacobsen et al., Clin. Chem., 40:873-881 (1994)).

Recientemente se ha determinado que la cantidad de concentraciones de homocisteína en una muestra biológica es de significación clínica en numerosas enfermedades. Cantidades elevadas de homocisteína en la sangre se han correlacionado con el desarrollo de aterosclerosis (Clarke et al., New Eng. J. Med., 324:1149-1155 (1991)). Además, la homocisteinemia moderada se considera actualmente como un factor de riesgo para cardiopatías y vasculopatías.

La precisión en el intervalo normal de homocisteína observada en los adultos normales es muy importante ya que se ha determinado que el riesgo de cardiopatía aumenta notablemente como mínimo el 30% sobre la concentración normal aumentando el factor de riesgo asociado 3,4 veces (Stampfer et al., JAMA 268:877-881 (1992)).

Tal como se utiliza en la presente memoria el término "evaluación" está destinado a incluir tanto la determinación cuantitativa como cualitativa de la cantidad de homocisteína y/o cistationina presente en una solución de prueba. Una "solución" o "solución de prueba" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una muestra de fluido clínico o biológico o un extracto tisular y puede incluir, por ejemplo, sangre, derivados de la sangre, tal como plasma, y orina, y similares.

Una muestra que contiene homocisteína reacciona con L-serina para formar cistationina en presencia de la enzima CDS; la cistationina puede convertirse a continuación en homocisteína, piruvato y amoniaco con una segunda enzima, CBL. El resultado de utilizar estas enzimas anabólicas y catabólicas que operan simultáneamente es un "ciclo sin sentido", mediante el cual (1) cistationina y homocisteína se interconvierten continuamente, (2) serina se degrada, y (3) se crean piruvato y amoniaco.

La utilización de concentraciones relativamente elevadas de serina con homocisteína proporciona condiciones conductoras a una velocidad de reacción global que sigue la cinética de seudoprimer orden dependiente directamente de la cantidad de homocisteína y cistationina en la reacción. Si la concentración de cistationina es muy baja comparada con la concentración de homocisteína, la velocidad de la reacción global variará linealmente con la cantidad de homocisteína. Midiendo la reducción en serina o el aumento en piruvato o amoniaco, la cantidad de homocisteína en una solución o muestra desconocida puede determinarse por comparación con reacciones de referencia que comprenden concentraciones conocidas de homocisteína que experimentan las reacciones enzimáticas idénticas. El método de ciclación enzimática proporciona un procedimiento de ampliación que produce cantidades mucho mayores de productos finales que la cantidad de homocisteína probablemente que está en la solución de prueba, es decir, la sangre. Por lo tanto los ensayos para determinar la cantidad de piruvato o amoniaco producido por la reacción no tienen que ser sumamente sensibles y puede medirse por procedimientos existentes conocidos por los especialistas expertos.

El piruvato se mide típicamente por la conversión enzimática en lactato con lactato deshidrogenasa, o un derivado de la misma. Esta reacción de conversión enzimática requiere el cofactor NADH (cofactor nicotinamida reducido), o un derivado del mismo, que se convierte en NAD+ (cofactor de nicotinamida oxidado). La reacción puede controlarse midiendo la absorbancia a 340 nm. Tal como se utiliza la presente memoria, el término "derivados", con respecto a los cofactores, se refiere a las sales, solvatos y otras formas químicamente modificadas que conservan la actividad del cofactor global, pero puede haber extendido la estabilidad en soluciones acuosas. Los derivados pueden incluir, pero no se limitan a derivados acetílicos de NADH, incluyendo 3-piridinaldehído-NADH, 3-acetilpiridina-NADH, 3tioico-tinamida-NADH y similares (véase, por ejemplo, la patente US nº 5.801.006).

Otros ensayos convenientes para determinar la oxidación de NADH, o un derivado del mismo, incluyen por ejemplo, la medición de fluorescencia, tal como describen Passoneau et al., en Enzymatic Analysis, A Practical Guide, páginas 219-222 (1993). En otra forma de realización, NADH, o un derivado de la misma, reacciona con piruvato en presencia de lactato deshidrogenasa para formar NAD+, que reacciona además con un colorante capaz de producir un cambio de color, preferentemente en el espectro visible, cuando se oxida. El cambio de color del colorante puede utilizarse para determinar la cantidad total de oxidación de NADH a NAD+ que corresponde a la cantidad de piruvato formado en la reacción de ciclación enzimática. Ejemplos de colorantes que pueden utilizarse en la presente invención comprenden de manera no limitativa 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), 2,6 diclorofenolindofenol, compuestos de tetrazolio, metosulfato de fenacina, metilo viológeno y derivados de cada uno de ellos.

El piruvato puede medirse también en la reacción con piruvato oxidasa, o un derivado de la misma, en presencia de una peroxidasa, es decir peroxidasa de rábano picante y similares. La cantidad de piruvato convertido en peróxido de hidrógeno se determina por la condensación oxidativa, por ejemplo, de un donante de hidrógeno soluble en agua que proporciona un compuesto coloreado para determinación fotométrica de la concentración de peróxido. Los donantes de hidrógeno particularmente preferidos que proporcionan un producto de reacción de color estable incluyen derivados solubles en agua de derivados de N-alquil-N-sulfopropilamilina, es decir la sal sódica de N-etil-N(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina (TOOS) (Tamaoku et al., Chem. Pharm. Bull. 30:2492-2497 (1982)). La cantidad de H2O2 puede medirse también por electrometría. Esto incluye mediciones amperométricas y potenciométricas. La determinación de la cantidad de homocisteína y/o cistationina se realiza a partir de la correlación de la cantidad de peróxido producida a partir de la conversión de piruvato en piruvato oxidasa a lo largo de un periodo de tiempo definido.

El amoniaco puede medirse por diferentes métodos, incluyendo mediante la utilización de un sensor de amoniaco (Willems et al., Clin. Chem. 34:2372 (1988). El amoniaco puede detectarse también fácilmente utilizando técnicas colorimétricas conocidas. Por ejemplo, el amoniaco generado en la muestra puede hacerse reaccionar para formar un producto coloreado, cuya formación puede detectarse por espectrofotometría. Dicho procedimiento, descrito en Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer) 1:1049-1056 (1970), se basa en la reacción de amoniaco con fenol en presencia de hipoclorito en condiciones alcalinas para formar el colorante coloreado indofenol. Puede utilizarse nitroprusida sódica como catalizador. Las modificaciones del procedimiento utilizando, por ejemplo, varios derivados pueden utilizarse también. El producto final coloreado se forma en cantidades directamente proporcionales a la concentración de amoniaco y por lo tanto de homocisteína. Otros procedimientos pueden incluir, por ejemplo, análisis por microdifusión (Seligson et al., J. Lab. Clin. Med., 49:962-974 (1957), una técnica de intercambio iónico (Forman, Clin. Chem., 10:497-508 (1964), y varios métodos enzimáticos (véase, por ejemplo, Mondzac et al., J. Lab. Clin. Med., 66:526-531 (1979)).

El método de ciclación enzimática para evaluar la cantidad de homocisteína y/o cistationina reduce las dificultades observadas en otros ensayos anteriores en los que los compuestos de fondo y las reacciones de fondo produjeron "ruido". Grandes cantidades de un aminoácido económico, por ejemplo, L-serina pueden añadirse para proporcionar la conversión total de L-serina a piruvato y amoniaco. Una concentración en serina de 250 µM o más puede utilizarse, y posteriormente convertirse en piruvato y amoniaco. El plasma contiene por lo general serina aproximadamente 100 µM. Esta cantidad de serina endógena es inmaterial para el ensayo presente ya que el ensayo mide una velocidad de conversión que está limitada por la cantidad de homocisteína y no la cantidad de serina. Concentraciones de L-serina de aproximadamente 0,1 mM hasta 10 mM no serían de esperar que afecten a la sensibilidad o precisión del ensayo dado a conocer.

Además, la reacción de ciclación enzimática proporciona una velocidad de conversión de L-serina que depende de la concentración de homocisteína en una reacción de seudoprimer orden. Las concentraciones de piruvato en la sangre normales están comprendidas por lo general entre aproximadamente 0,4 y 2,5 mg/100 ml (Lehninger, AL. Principles of Biochemistry. 1982. Worthingtom Publishers, Inc. Pág. 707), que corresponde a aproximadamente 45 a 284 µM. Esta concentración de piruvato podría proporcionar una medición de fondo menor, pero el presente ensayo mide un cambio a lo largo del tiempo y puede ajustarse fácilmente para el nivel de partida de piruvato en una solución. Además, el piruvato puede eliminarse antes de la incubación con lactato deshidrogenasa u otras enzimas. De manera más importante, la cisteína y otros compuestos que llevan azufre, por ejemplo, en la sangre, no contribuyen de manera significativa a la reacción de ciclación enzimática y, por lo tanto, se consideran ruido insignificante en el sistema.

La muestra puede tratarse para eliminar cistationina con objeto de aumentar la precisión de la cuantificación de homocisteína. Como ejemplo específico, el tratamiento comprende poner en contacto cistationina γ-liasa con la solución para convertir cistationina en α-cetoglutarato (compuesto que puede no participar en la ciclación enzimática descrita anteriormente). Antes de proceder con el ensayo de ciclación de la enzima para evaluar la cantidad de homocisteína, debe eliminarse de la muestra o destruirse la actividad de cistationina γ-liasa, por ejemplo, mediante calor o similar.

Esto puede utilizarse también para la evaluación de la cantidad de cistationina comparando las diferencias de la velocidad de producción de piruvato y/o amoniaco en una muestra tratada y sin tratar con cistationina γ-liasa antes de experimentar el ensayo de ciclación enzimática. Por lo tanto, el procedimiento y el kit pueden utilizarse para determinar la cantidad de cistationina en una muestra desconocida, incluso si la muestra contiene homocisteína.

En determinadas muestras biológicas, tal como sangre, la homocisteína está unida con frecuencia mediante un enlace disulfuro a las proteínas, tioles y otros componentes celulares. Por lo general, la muestra puede tratarse con un agente reductor, tal como borohidruro sódico o potásico; un tiol, tal como ditioeritrirol, β-mercaptoetanol, ditiotreitol, ácido tioglicólico o glutatión; o una fosfina o una trialquilfosfina, tal como tributilfosfina y tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP), y similares, para liberar el enlace y la homocisteína ligada al disulfuro. Los ensayos anteriores que requieren anticuerpos para la etapa de detección deben cambiar las condiciones redox de la mezcla de reacción (la mayoría de los anticuerpos se mantienen unidos con un enlace disulfuro). Sin embargo en el presente método no es necesario lavar o alterar las condiciones redox porque el CBS y CBL utilizados son activos en condiciones reductoras. Por lo tanto, se requieren menos etapas para los ensayos dados a conocer en la presente memoria que para muchos inmunoensayos de la técnica anterior.

Una muestra que contiene sangre, fracciones sanguíneas, suero, plasma u orina puede tratarse con un agente reductor y ensayar directamente la homocisteína. El calentamiento de la muestra antes del ensayo para acelerar la liberación de homocisteína y para inactivar enzimas degradadoras y otros factores que pueden interferir con el ensayo puede resultar asimismo preferido. La manipulación general de las muestras de sangre para ensayo de homocisteína es conocida por los expertos en la materia para otros métodos tales como las pruebas por HPLC.

Las CBS y CBL son enzimas encontradas normalmente en la naturaleza. La especie humana y la levadura utilizan CBS para la síntesis de metionina; y el ADNc humano para CBS puede sustituir el gen CBS en levadura de cerveza (Kruger et al., Hum. Molec. Genet., 4:1155-1161 (1995)). CBL se encuentra en muchas bacterias, incluyendo E. coli (Laber et al., FEBS Lett., 3 79:94-96 (1996). Las secuencias completas de ADN para los genes de CBS y CBL son conocidas en estos organismos y en otras especies, proporcionando a un biólogo molecular experto una fuente para clonar o sintetizar fácilmente estos genes o derivados de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente memoria "derivados" con respecto a las enzimas se refiere a mutantes producidos por adición, eliminación, sustitución y/o modificación de aminoácidos; mutantes producidos por recombinación y/o reordenación del ADN; y sales, solvatos y otras formas químicamente modificadas de la enzima que conservan actividad enzimática de la enzima natural aislada. Un procedimiento para crear una enzima derivada por reordenamiento del ADN útil en la presente invención se describe en la patente US nº 5.605.793. Incluso sin clonación, se han purificado las dos enzimas de numerosos organismos diferentes. Véase por ejemplo, Ono et al., Yeast 10:333-339 (1994); Dwivedi et al., Biochemistry 21:3064-3069 (1982). Se dan a conocer organismos genéticamente modificados para producir una CBS, o un derivado de la misma, y para producir una CBL, o un derivado de la misma, que puede utilizarse en el ensayo de ciclación enzimática para proporcionar reactivos a un coste reducido y para aumentar la facilidad de purificar las enzimas.

Se han secuenciado el gen de la CBS y el genoma completo de Saccharomyces cerevisiae. Asimismo el gen de la CBL y los genes restantes de E. coli son también conocidos. Por lo tanto, utilizando técnicas habituales en materia de biología molecular, los genes que codifican CBS y CBL pueden clonarse y expresarse en ambos organismos. Los procedimientos publicados para purificar las dos enzimas son conocidos los cuales utilizan métodos de purificación de proteínas habituales. Sin embargo cada una de las enzimas pueden construirse como proteínas de fusión incluyendo por ejemplo, una fracción de otra proteína que ayuda a la disolución y/o replegamiento de las secuencias activas de la enzima o aminoácidos que pueden añadirse para ayudar a la purificación. Un ejemplo de secuencias de aminoácidos añadidas para la purificación incluyen, etiquetas para la afinidad, tales como poli-His, o glutation-Stransferasa (GST) pueden añadirse para permitir la purificación más rápida de las proteínas en una sola columna de afinidad. Aunque las enzimas no requieren purificación hasta homogeneidad para la presente invención, las proteasas y sus actividades que convierten serina en piruvato pueden reducirse a niveles insignificantes mediante purificación.

Además, la concentración de las enzimas generalmente conduce a mayor estabilidad de la actividad enzimática durante la reacción y en el almacenamiento de larga duración. Es de esperar que CBS y CBL de otros organismos a parte de S. cerevisiae y E. coli, especialmente termófilos, sean fuentes de enzimas incluso con mayor estabilidad. Las enzimas aisladas pueden seleccionarse también para una mayor afinidad a la homocisteína. Además, la ingeniería de proteínas de la CBS de levadura y de la CBL bacteriana pueden conducir a enzimas con mejores propiedades comerciales, incluyendo mayores afinidades, velocidades de reacción más rápidas, purificación más fácil y una vida media más larga durante el almacenamiento.

Asimismo, se ha descrito con detalle la cistationina γ-liasa (CGL) en muchas especies (véase, por ejemplo, Yamagata, et al., J. Bacteriol., 175:4800-4808 (1993)). La manipulación de los genes que codifican CGL puede modificarse más genéticamente por métodos de recombinación habituales e insertarse en una célula hospedadora para desarrollar mayores niveles de cepas de producción.

Las expresiones recombinantes de los genes de CBS, CBL y CGL son típicas. Estos métodos pueden proporcionar grandes cantidades de enzima purificada y los genes pueden modificarse, por ejemplo, para añadir una secuencia peptídica definida (una etiqueta de afinidad) a las enzimas expresadas que pueden utilizarse para purificación por afinidad. Mediante la utilización de etiquetas de afinidad en la expresión de las enzimas recombinantes, la purificación e inmovilización de éstas enzimas puede simplificarse en gran medida, conduciendo a costes menores. Las etiquetas de afinidad son conocidas en la técnica e incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, poli-histidina, GST (glutation-S-transferasa), estrep-tag, "flag", secuencias c-myc y similares. Las etiquetas se utilizan ampliamente para la purificación por afinidad de proteínas expresadas de manera recombinante, y muchas están disponibles en el mercado.

En una forma de realización preferida, CBS y CBL se inmovilizan en una superficie sólida de manera que mantienen las actividades de las enzimas y de manera que mantienen la homocisteína libre para interactuar directamente con las proteínas. Al inmovilizar las enzimas a altas densidades, las distancias de difusión entre las diferentes proteínas se reducen con relación a las enzimas en solución. Como resultado, la velocidad de reacción global del ensayo aumenta en gran medida, ya que el producto de una enzima puede hacerse reaccionar mediante la otra enzima y viceversa. La aceleración de las velocidades de reacción se debe a un aumento local en las concentraciones de los intermedios, que están en más íntima proximidad con la enzima siguiente como resultado de la inmovilización. Aumentar la velocidad del ensayo de homocisteína puede ser un factor importante para comercialización del producto para diagnóstico porque la Km de CBS y de CBL están en un intervalo milimolar pero las concentraciones en la sangre de homocisteína son aproximadamente de 10 µM. Las reacciones de difusión limitada son conocidas por requerir una gran concentración de enzimas para proporcionar una velocidad de reacción rápida. La inmovilización de las enzimas en el kit de ciclación supera las dificultades que pueden presentarse por las bajas afinidades de estas dos enzimas para sus sustratos respectivos.

Todavía en otra forma de realización preferida CBS y CBL se inmovilizan en forma de una proteína de fusión. La distancia y orientación de las dos proteínas diferentes con relación entre sí puede controlarse durante la construcción del vector de expresión del gen de fusión. Colocando apropiadamente las dos actividades en una proteína de fusión, la interconversión de homocisteína y cistationina puede ocurrir de forma sumamente rápida prácticamente dentro de la proteína, ya que las distancias de difusión pueden minimizarse entre los dos centros activos. La homocisteína, por lo tanto, se comporta como un cofactor en toda la reacción de ciclación enzimática, que construye piruvato y amoniaco a partir de L-serina.

El kit de ciclación enzimática de la presente invención puede proporcionarse en numerosos formatos. El formato más sencillo de kit proporciona una solución de reactivo que contiene L-serina, CBS o un derivado de la misma, CGL o un derivado de la misma tal como se define en la reivindicación 1, y varios tampones y sustancias auxiliares necesarios para la optimización de las reacciones enzimáticas. En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención CBS, o el derivado de la misma, y CBL, y el derivado de la misma, se proporcionan inmovilizadas en una superficie sólida.

La inmovilización de las enzimas a una superficie sólida conservando sustancialmente a la vez toda la actividad de la enzima es bien conocida en la técnica. Se han utilizado varios métodos para la inmovilización incluyendo, enlace covalente, absorción física, oclusión y deposición electroquímica. Como ejemplo se ha utilizado glutaraldehído para inmovilizar creatinina desaminasa y glutamato oxidasa a bolitas de vidrio con poro controlado modificadas con propilamina (Rui et al., Ann. NY. Acad. Sci., 672:264-271 (1992)). Otros ejemplos comprenden de manera no limitativa la utilización de carbodiimidas para unir por enlace covalente enzimas a bolitas de vidrio modificadas con succinato (Rui et al., anteriormente), y la utilización de reactivos reticulantes hetero-u homo-bifuncionales (por ejemplo, SPDP, 3-(2-pirilditio)-propionato de N-succinimidilo; SMPT, succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridil-ditio)tolueno; DSP, ditiobis(succinimidil propionato); DTSSP, 3,3’-ditiobis(sulfa-succinimidilpropionato); DSS, suberato de disuccinimidilo y similares) para acoplar por enlace covalente una enzima mediante, por ejemplo una amina o grupo sulfhidrilo a una superficie sólida modificada (Wilson, et al., Biosens. Bioelectro., 11:805-810 (1996)).

La "superficie sólida" tal como se utiliza en la presente memoria puede incluir un material poroso o no poroso insoluble en agua que puede tener una cualquiera de numerosas formas, tales como de tira, varilla, partícula, incluyendo una bolita o similar. Los materiales adecuados son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, papel, papel de filtro, nilón, vidrio, cerámica, sílice, alúmina, tierra de diatomeas, celulosa, polimetacrilato, polipropileno, poliestireno, polietileno, cloruro de polivinilo y derivados de cada de éstos. La superficie sólida puede ser los lados y el fondo del recipiente de prueba o puede ser un material añadido al recipiente de prueba. En una forma de realización preferida la superficie sólida comprende una bolita que se añade al recipiente de prueba.

Tanto las levaduras como las bacterias tienen enzimas que convierten la L-serina en piruvato, actividades que algunas veces se refieren a serina desaminasa o serina deshidratasa. Pueden utilizarse procedimientos mutagénicos muy probados para reducir en gran medida o eliminar estas actividades, que pueden contribuir de manera significativa al fondo en el ensayo de ciclación de homocisteína. Sacaromices cerevisiae, en particular, puede manipularse genéticamente para eliminar las actividades de serina desaminasa, que son necesarias para (1) la síntesis de isoleucina y (2) el crecimiento en serina como fuente de carbono o nitrógeno, utilizando un método sencillo conocido como "destrucción génica". Eliminando el gen chaI de la levadura, se elimina una actividad principal de serina desaminasa, con lo que se elimina un problema de fondo potencial para el ensayo de ciclación. Además, la eliminación de chaI puede ser útil para seleccionar proteínas de fusión CBS-CBL y para modificar genéticamente estas proteínas de fusión. La cepa para eliminación de chaI no puede crecer en serina como única fuente de carbono o nitrógeno. El gen de fusión de la CBS-CBL puede complementar la eliminación, siempre que esté disponible la homocisteína como "cofactor", porque el sistema de ciclación produce el mismo resultado neto que la serina desaminasa. Por lo tanto, la eliminación de chaI puede utilizarse para seleccionar y mantener las fusiones CBS-CBL mejoradas, especialmente si una población de los genes de fusión se muta y se coloca en vectores de una sola copia o en los cromosomas en levadura. Las células que crecen más rápido en el medio de serina o que tienen un requisito reducido para la homocisteína pueden contener mutaciones que codifican enzimas o proteínas más rápido con mayores afinidades para la homocisteína y la cistationina.

La cantidad de homocisteína en una muestra puede determinarse mediante la utilización enzimática de homocisteína en la muestra. La conversión de homocisteína en el metabolismo celular por lo general libera un protón del resto sulfhidrilo de homocisteína. La liberación de este protón se utilizó para medir la afinidad de unión de la homocisteína a la sintasa metionina dependiente de cobolamina de E. coli (Jerret et al., Biochemistry, 36:1573915748 (1997)). Las reacciones enzimáticas catalizadas por proteínas, tal como la metionina sintasa, requieren generalmente cofactores o sustratos adicionales para completar la reacción. Si estos cofactores y sustratos no están presentes, la homocisteína continua estando unida a la enzima. La medición de los protones liberados elimina los protones liberados por la reacción enzimática que conduce a la reacción hacia el consumo de homocisteína presente en la muestra. La medición del cambio en el pH asociado a los protones liberados proporciona una determinación de la cantidad de homocisteína en la muestra., En el ensayo puede utilizarse, por ejemplo, metionina sintasa independiente de cobolamina.

Por cuestión de conveniencia, los reactivos para su utilización en la presente invención pueden suministrarse en un kit de prueba para su utilización en el método de ensayo. Un kit típico como se define en la reivindicación 1 comprende una combinación envasada de un recipiente para contener la solución de ensayo, L-serina, CBS, o un derivado de la misma, y CBL, o un derivado de la misma, y tampones y sustancias auxiliares requeridas para las condiciones óptimas de reacción. Curiosamente, varios agentes conservantes y/o estabilizantes pueden incluirse además con algunos o todos los reactivos del kit y/o enzimas para prolongar el periodo de descomposición así como la vida "en línea" durante la prueba de la muestra. El kit puede comprender además agentes reductores o CGL para pretratar la muestra antes del ensayo de ciclación. Además, el kit puede incluir lactato deshidrogenasa, NADH y un colorante capaz de un cambio de color observable durante la oxidación.

En circunstancias apropiadas uno o más de los reactivos en el kit puede proporcionarse en solución (con o sin agentes conservantes y/o estabilizantes) o en forma de polvo seco, normalmente liofilizado, incluyendo excipientes, agentes conservantes y/o estabilizantes, que en disolución pueden proporcionar una solución de reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para realizar el ensayo según la presente invención. Para mejorar la versatilidad de la presente invención, los reactivos pueden suministrarse en una combinación envasada, en el mismo recipiente o por separado, de modo que la relación de los reactivos proporciona sustancial optimización del procedimiento y del ensayo. Los reactivos cada uno puede estar en recipientes separados o varios recipientes pueden combinarse en uno o más recipientes dependiendo de la estabilidad de los reactivos. Por cuestión de conveniencia, los reactivos en el kit de la presente invención pueden suministrarse en cantidades predeterminadas. El kit de prueba puede contener además instrucciones escritas sobre cómo utilizar los reactivos y/o cómo llevar a cabo un ensayo específico, por ejemplo en forma de un prospecto del envase.

Los ejemplos siguientes son proporcionados a título ilustrativo y no limitativo.

Ejemplo 1

Clonación y expresión del gen de la cistationina β-liasa de E. coli

En este ejemplo se utilizaron procedimientos normalizados de RCP para clonar el gen de la CBL de E. coli. El gen aislado se insertó en un vector de expresión con una secuencia de etiqueta de afinidad (6HIS) y la proteína expresada se purifico en una columna de afinidad. Una cantidad sustancial de la actividad de la enzima CBL en las células hospedadoras se transformó con el vector de expresión, el montaje se purificó a partir de los lisados celulares.

Clonación del gen de la cistationina β-liasa (CBL, EC 4.4.1.8) de E. coli

Se utilizaron procedimientos normalizados de RCP que utilizan el sistema RCP EXPAND HIGH FIDELITY PCR (Roche Biochemicals) para ampliar el gen de la CBL de E. coli utilizando células competentes ONE SHOT TOP10 de

E. coli (Invitrogen) como fuente de ADN genómico. Las secuencias de cebador de RCP para la clonación de CBL fueron las siguientes: (cebador con terminal N de CBL: 5’-CGACGGATCC GATGGCGGACAAAAAGCTTG-3’: SEC. ID. nº 1) y (el cebador con terminal C de CBL: 5’-CGCAGCAGCT GTTATACAATTCGCGCAAA3’; SEC. ID. nº 2). El producto génico para CBL ampliado por RCP se purificó a continuación por electroforesis en gel de agarosa, se digerió con endonucleasas de restricción BamHI y PvuII, y se purificó otra vez por electroforesis en gel de agarosa. El gen de la CBL de E. coli purificado se ligó a continuación en el gel purificado, vector de expresión de la proteína pRSETB digerido con BamHI/PvuII (Invitrogen). El montaje resultante proporcionó el gen de la CBL bajo en control del activador de transcripción T7, se clonó en el marco con una secuencia principal con resto seis Histidina (6HIS) con terminal amino (denominada en lo sucesivo 6HISCBL) que permite la expresión conveniente, la purificación por afinidad y el análisis con inmunotinción de la proteína 6HISCBL recombinante procedente de las células de E. coli. La secuencia de ADN del gen de la cistationina β-liasa (CBL) de E. coli se presenta (SEC. ID. nº 21). La secuencia proteica de cistationina β-liasa (CBL) de E. coli clonada con una etiqueta de afinidad de 6 histidina (6 His) en el terminal amino-(NH3), procedente de la clonación del gen de la CBL en el plásmido de expresión bacteriana pRSETB se presenta también (SEC. ID. nº 19).

Expresión y purificación de la proteína cistationina β-liasa

El montaje del plásmido pRSETB(6HISCBL) se transformó en la cepa BL21(DE3)pLysS de E. coli (Invitrogen), se extendió en placas LB/Agar-agar que contenían (100 µg/ml de ampicilina, 35 µg/ml de cloranfenicol) y a continuación se incubó durante la noche a 37ºC. Las colonias bacterianas aisladas se transfirieron a continuación y se cultivaron durante la noche en matraces que contenían 100 ml de medio de cultivo LB que contenía ampicilina y cloranfenicol. Los 100 ml de cultivo de toda la noche se añadieron a continuación a múltiples matraces que contenían 1 l de medio de cultivo LB reciente que contenía ampicilina, y se dejó crecer hasta alcanzar una A600 de 0,6 (aprox. 2,5 horas). A fin de provocar la expresión de la proteína CBL (dirigida por el activador T7), se añadió a continuación isopropil-β-Dtiogalactopiranósido (IPTG) al medio de cultivo hasta una concentración final de 0,1 a 1 mM. Se añadió además piridoxal 5’-fosfato (PLP) cofactor de la enzima CBL hasta una concentración final de 100 µM en el medio de cultivo durante la inducción. Después de hacer el seguimiento del crecimiento celular y de la expresión de la proteína 6HISCBL durante un periodo de 5 horas, se recogieron por centrifugación las células de E. coli, se volvieron a poner en suspensión y se lisaron mediante la adición de reactivo de extracción de proteínas BUGBUSTER (Novagen Inc.) en presencia de inhibidor de proteasa completo exento de EDTA (Roche Biochemicals) tal como se describe en el protocolo del fabricante. El lisado celular se trató a continuación con ADNasa I, se purificó por centrifugación y se cargó en una columna de afinidad que contenía la resina de purificación de proteínas Poly-His (Roche Biochemicals). Se lavó a continuación la columna con 10 volúmenes de lecho de tampón equilibrador (KPi 50 mM, pH 7,8, NaCl 0,5 M) seguido de la elución con 5 volúmenes de lecho de tampón 1 de elución (KPi 50 mM, pH 7,8, NaCI 0,5 M, imidazol 10 mM; EB1), 5 volúmenes de lecho de tampón 2 de elución (KPi 50 mM, pH 7,8, NaCl 0,5 M, imidazol 50 mM, EB2) y 5 volúmenes de lecho de tampón 3 de elución (KPi 50 mM, pH 7,8, NaCl 0,5 M, imidazol 500 mM, EB3). Las muestras tomadas durante cada etapa del procedimiento de purificación se analizaron a continuación por electroforesis en gel de proteína desnaturalizante (SDS-PAGE) y se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue, o se sometieron a análisis de inmunotransferencia Western utilizando una inmunoglobulina de ratón conjugada con peroxidasa antipolihistidina monoclonal para la detección tal como describe el fabricante (Sigma).

Se observó que la proteína 6HISCBL purificada eluye principalmente en tampones 2 y 3 de elución (EB2 y EB3). El eluido que contiene la CBL se concentró a continuación utilizando cámaras de filtración centrífugas (Amicon) y se dializó durante la noche a 4ºC frente a tampón de almacenamiento (TrisHCl 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, PLP 5 mM), se dividió en alícuotas y se almacenó congelado a -80ºC. Se calculó a continuación la concentración de la enzima CBL homogénea purificada basándose en el coeficiente de extinción a 280 nm y un peso de la subunidad de

43.312 Da. (Clausen et al., Biochem. 36:12633-42 (1997)). Un rendimiento típico de 6 HISCBL purificada estaba comprendido en el intervalo entre 20 y 30 mg de 6 HISCBL por gramo de pasta de células E. coli.

Ensayo de actividad de CBL

La actividad de CBL de la proteína 6HisCBL recombinante purificada por afinidad expresada en el montaje del plásmido pRSETB (6HisCBL) se llevó a cabo esencialmente como se describió anteriormente (Clausen et al., Biochem. 36:12633-42 (1997) incorporada en la presente memoria por referencia). En resumen, las mezclas de ensayo contenían Tris/HCl 100 mM (pH 8,5), L-cistationina 5 mM, 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) 1 mM (DTNB; reactivo de Ellman) y enzima 6HisCBL en un volumen de reacción final de 1 ml. La reacción fue seguida registrando el aumento en absorbancia a 412 nm a lo largo del tiempo. La misma reacción enzimática se realizó también en muestras que tienen concentraciones conocidas de sustrato para producir una curva patrón. Sustancialmente se recuperó toda la actividad de CBL detectada en todo el lisado celular y se observó presente en las muestras purificadas experimentalmente de la enzima recombinante 6HisCBL producida a partir del montaje del plásmido pRSETB(6HisCBL).

Ejemplo 2

Clonación y expresión del gen de la cistationina B-sintasa (CBS) de levadura en levadura

En este ejemplo se utilizaron procedimientos de RCP para clonar el gen de la CBS en levadura. El fragmento de RCP que comprende el gen de la CBS se insertó en un vector de expresión tanto con como sin una etiqueta de afinidad que se añadió para ayudar a la purificación del producto génico expresado.

Una cepa de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae (5153-11-1 (his3 met2)) se utilizó como fuente del gen de la CBS. Se cultivaron las células YEPD a 32ºC, se centrifugaron, se lavaron con agua y se transfirieron en 200 µl de tampón plásmido de levadura (NaCl 100 mM, Tris 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM, SDS al 0,2%). La suspensión celular se mezcló con un volumen igual de bolitas de vidrio de 0,45 mM y se agitó intensamente a alta velocidad durante 3 x 30 segundos. Se eliminó el líquido pipeteando y se centrifugó durante dos minutos en una microcentrifugadora para eliminar el residuo celular. Se extrajo el sobrenadante con PCI (fenol:cloroformo:alcoholes isoamílicos (25:24:1) y cloroformo. Se añadió cloruro sódico (5 M) (aproximadamente 20 µl) y se precipitó el ADN con un volumen igual de isopropanol.

Se amplió por RCP este ADN genómico de levadura con cebadores CI-001 (CGGGGATCCTGATGCATGCATGATAAGGA, SEC. ID. nº 3) y Cl-012 (CGGCATTACCGTTT CACTAATTTATTG; SEC. ID. nº 4), que son secuencias nucleotídicas publicadas que flanquean el gen estructural para la CBS de levadura. El cebador CI-001 (SEC. ID. nº 3) contiene una secuencia BamHI encontrada en el lateral 3’ no traducido del gen de la CBS. Para añadir una secuencia BamHI al lateral 5’ del fragmento de RCP, el gen se amplió más por RCP con CI-001 (SEC. ID. nº 3) y CI-002 (GTTGGATCCGGCATTACCGTTTCAC; SEC. ID. nº 5). El producto de la RCP resultante era una secuencia de ADN de aproximadamente 1937 pares de bases, incluyendo 1521 pares de bases que codifican la proteína CBS. El ADN adicional que flanquea la secuencia de codificación comprende el activador natural y las secuencias de terminación de la transcripción del gen de la CBS de levadura.

Un activador más potente se insertó corriente arriba del gen de la CBS para favorecer unos niveles más elevados de expresión de la proteína. El activador 1 de TPI de levadura se clonó en el mismo ADN genómico de levadura utilizando los cebadores CI-009 (GGTGGATCCATCAATAGATACGTA CGTCCT; SEC. ID. nº 6) y CI-010 (TTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG; SEC. ID. nº 7) en una reacción de RCP convencional. Para acoplar la zona de codificación de CBS al activador de TPI 1, se utiliza un cebador adaptador: CI-011 (AACACATACATAAACTAAAAATGACT AAATCTGAGCAGCAA; SEC. ID. nº 8), que contiene 20 bases del activador TPI1 y las primeras 21 bases del gen de la CBS. La secuencia de CBS obtenida anteriormente se amplió por RCP con cebadores CI-001 (SEC. ID. nº 3) y CI-011 (SEC. ID. nº 8). El producto de la RCP resultante se mezcló con el producto activador de TPI1 del anterior, y la mezcla se amplió por PCR utilizando los cebadores CI-001 (SEC. ID. nº 3) y CI-009 (SEC. ID. nº 6) para producir un gen de fusión denominado "TPICBS", que comprende el activador de TPI1, la secuencia de codificación de CBS y el terminador de la transcripción de CBS.

Los productos CBS y TPICBS de RCP comprenden cada uno secuencias BamHI tanto en los laterales 5’ y 3’ de la zona de codificación. Estos productos de RCP se purificaron con una PCR WIZARD PREP (Promega), según las recomendaciones del fabricante y se cortaron con BamHI. Los fragmentos nucleotídicos de BamHI resultantes se ejecutaron en un gel TBE de agarosa al 1% y se purificaron con papel NA45 (S&S). La levadura, el vector lanzadera CI-1 de E. coli tiene una única secuencia de BamHI en el gen de resistencia a la tetraciclina se utilizó para la expresión del gen de la CBS. El vector CI-1 se cortó con BamHI y se trató con fosfatasa alcalina de gamba, según las instrucciones del fabricante (Roche Biochemicals). Los fragmentos de BamHI CBS y TPICBS se ligaron en el vector CI-1 linealizado. La reacción de ligadura se transformó en las células TOP10 (Invitrogen), que se colocaron en placas LB con ampicilina. Transformantes resistentes a Amp se transfirieron a placas LB amp y LB tet para determinar los clones sensibles a tetraciclina. Se seleccionaron varias colonias sensibles a tet procedentes de placas LB amp, se cultivaron durante la noche en placas LB amp y se procesaron más por el procedimiento de lisis alcalina para el ADN plásmido. Se cortó el ADN con BamHI y se separó en gel de agarosa al 1% para determinar qué plásmidos contienen las inserciones de CBS o de TPICBS.

Los plásmidos CI-1 que llevan inserciones se transformaron en la cepa de levadura, INVSc-1, cepa diploide que está comercialmente disponible en Invitrogen. INVSc-1 tiene una mutación en ambas copias del gen de la LEU2 y requiere el gen de la LEU2 procedente del plásmido CI-1 para el crecimiento selectivo en medio sin leucina. INVSc-1 se transformó con los plásmidos relacionados con CI-1, utilizando el kit de transformación de levadura de Invitrogen, según las instrucciones del fabricante. Este kit implicaba la preparación de esferoplastos de las células con zimoliasa, seguido de un tratamiento con calcio para la transformación del ADN. Los transformantes se colocaron en placas en un medio sintético que contenía sorbitol 1 M, base nitrogenada de levadura y complementos de levadura, excluyendo leucina. Los transformantes eran visibles en el revestimiento de agar-agar después de tres días de incubación a 32ºC.

Acoplamiento de polihistidina a cistationina β-sintasa para la expresión de la levadura

Las secuencias de ADN que codifican seis histidinas se añadieron al extremo 3’ de la zona de codificación de CBS, tanto en los montajes de CBS como del vector TPICBS. Las secuencias de codificación de polihistidina se añadieron al clon para CBS original por ampliación del fragmento de RCP de CBS desde el anterior con el cebador CI-017 (ATGATGATGATGATGATGACCTGCT AAGTAGCTCAGTAA; SEC. ID. nº 9) y el cebador CI-02 (SEC. ID. nº 5). El producto de RCP resultante comprende la zona del activador de CBS natural, la zona de codificación de CBS y una secuencia de codificación más para los restos de glicina y seis histidinas. El resto de glicina se añadió para aumentar la flexibilidad espacial del péptido poli-his tras la traducción. El producto poli-his CBS de RCP se purificó en gel aparte del ADN de CBS original y se amplió por RCP sucesivamente dos veces después con cebadores, CI02 (SEC. ID. nº 5) y CI-017 (SEC. ID. nº 9) para eliminar prácticamente el ADN de CBS original.

Asimismo, el producto TPICBS de PCR anterior se amplió con cebadores, CI-009 (SEC. ID. nº 6) y CI-017 (SEC. ID. nº 9). El producto de RCP se purificó en gel y se volvió a ampliar dos veces con CI-009 (SEC. ID. nº 6) y CI-017 (SEC. ID. nº 9) para reducir en gran medida la secuencia de ADN TPICBS de entrada.

El gen de la CBS se clonó también para RCP con los cebadores CI-001 (SEC. ID. nº 3) y CI-018 (CATCATCATCATCATCATTAAATAAGAACCCACGCT: SEC. ID. nº 10) para producir una secuencia de polihistidina con un codón TAA de terminación, seguido de la secuencia terminadora de transcripción. Este producto de RCP corto ("terminador") de aproximadamente 190 pb se purificó también en gel y se clonó por PCR con los mismos cebadores. La poli-his CBS y los fragmentos del "terminador" se combinaron en una reacción RCP con los cebadores, CI-001 (SEC. ID. nº 3) y CI-002 (SEC. ID. nº 5). La ampliación resultante produjo una molécula de ácido nucleico denominada "CBSH", que comprende el activador CBS natural, la zona de codificación de CBS completa, un resto de glicilo adicional, seis restos de histadilo con un codón de terminación, y el terminador de transcripción de CBS.

Asimismo, la poli-his TPICBS y los fragmentos del terminador se combinaron en una reacción RCP con los cebadores. CI-001 (SEC. ID. nº 3) y CI-009 (SEC. ID. nº 6). El producto del ácido nucleico resultante, denominado "TPICBSH" fue el mismo que la secuencia CBSH, excepto que el activador TPI1 sustituyó el activador CBS natural. El CBSH y TPICBSH (que contiene cada uno una secuencia con etiqueta de afinidad de poli-histidina) se cortó con BamHi y se ligó en CI-1, como se hizo anteriormente para las secuencias de CBS y TPICBS. Las mezclas de ligadura se transformaron en INVSc-1. Se examinaron las colonias sensibles a tet para la inserción de los genes apropiados clonados en CI-1 por análisis con enzima de restricción.

Ejemplo 3

Clonación, expresión y purificación del gen de la cistationina β-sintasa (CBS) de levadura en E. coli

En este ejemplo se utilizan técnicas normalizadas de RCP y de biología molecular para clonar el gen de la cistationina β-sintasa (CBS) de Saccharomyces cerevisiae (INVSc1) como proteína de fusión con una glutatión Stransferasa (GST) con terminal amino. La adición de esta zona de glutatión S-transferasa permite la purificación por afinidad en una sola etapa de la proteína CBS procedente del medio de cultivo de E. coli y puede también ayudar a la disolución y/o favorecer el replegamiento apropiado de la enzima en una forma activa.

Clonación

La cepa de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae (INVSc1) (Invitrogen) se utilizó como fuente del gen de la CBS. Una sola colonia de levadura INVSc1 se hirvió en 100 µl de agua desionizada durante 5 min. y se agitó rápidamente en presencia de un volumen igual de bolitas de vidrio de 0,45 mM durante 2 min. Se utilizó a continuación un microlitro de este lisado celular como fuente de ADN para la ampliación por RCP del gen de la CBS de levadura utilizando los cebadores CI-024 (GCGGGTCGACTATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCC; SEC. ID. nº 12) y CI-025 (GCGTGCGGCCGCGTTATGCTAAGTAGCTCAG; SEC. ID. nº 13) que contiene secuencias flanqueantes para el gen de la CBS de levadura publicado y enzimas de restricción para la clonación en el vector de expresión pGEX-6P2 (Amerhsam Pharmacia). El producto de RCP resultante (aproximadamente 1548 pb) se aisló a continuación y se purificó por extracción de ADN en gel de agarosa utilizando un kit comercial (Roche). El producto de RCP purificado que contenía el gen CBS flanqueado por las secuencias de las enzimas de restricción SaII (extremo 5’) y NotI (extremo 3’) se digerió a continuación (por SaII y NotI), se purificó el gel y se ligó en el vector de expresión pGEX6P2 (Amersham Pharmacia). Se utilizó cartografía de enzima de restricción para confirmar la identidad del ADN ampliado por RCP como gen de la CBS de levadura. Se representa la secuencia de ADN (SEC. ID. nº 14) para el gen clonado para cistationina β-sintasa (CBS) de Saccharomyces cerevisiae. La secuencia del CBS clonado de Saccharomyces cerevisiae que tiene una proteína de fusión GST con terminal amino-(NH3) unida como resultado de la clonación en el vector de expresión pGEX6P-2 bacteriano se presenta también (SEC. ID. nº 20).

Expresión y purificación

El vector de expresión pGEX6P-2 que contenía el gen de la CBS de levadura clonado (descrito anteriormente) se transformó en las células TOP10 de E. coli (Invitrogen). Se seleccionaron colonias aisladas y se cultivaron cultivos celulares en medio LB que contenía 100 µg/ml de ampicilina en 30EC hasta alcanzar una absorbancia a 600 nm de aprox. 0,5 D.O. Para provocar la expresión de la proteína de fusión GST-CBS (dirigida por el activador tac), se añadió isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) al medio de crecimiento hasta una concentración final de 0,1 mM. El cofactor de CBS, piridoxal-5’-fosfato, se añadió también al medio de cultivo a una concentración final de 100 µM durante la inducción. Las células inducidas se dejaron crecer a continuación a 30ºC durante 21 h más antes de recoger por centrifugación.

La purificación por afinidad de la proteína GST-CBS utilizando resina de afinidad Glutathione Sepharose 4B se llevó a cabo a continuación como se describe esencialmente en el protocolo del fabricante (Amersham Pharmacia). En resumen, se pusieron en suspensión las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se destruyeron por tratamiento con ultrasonidos en hielo. Se añadió a continuación Triton X-100 a una concentración final de 0,1% (v/v) y el tratado con ultrasonidos se agitó a temperatura ambiente de 30 a 45 min. El lisado celular se purificó a continuación del residuo insoluble por centrifugación, se trató con ADNasa I, y se cargó en una columna de resina por afinidad Glutathione Sepharose 4B. Las proteínas no unidas específicamente se lavaron con 10 volúmenes de columna de PBS, y la proteína GST-CBS deseada se eluyó a continuación de la resina de afinidad por adición de 5 volúmenes de columna de tampón de elución (Tris 50 mM, pH 8, fi-mercaptoetanol (BME) 1,4 mM, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,1% (v/v), glutatión reducido 50 mM). La purificación de la proteína de fusión GST-CBS se confirmó a continuación por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida, dodecilsulfato sódico) teñido con Coomassie Blue). La GST-CBS eluida se dializó a continuación en tampón para almacenamiento (TrisHCl 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, PLP 5 µM) se dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC. La concentración de GST-CBS purificada se determinó a continuación utilizando el kit de ensayo de proteínas MICRO BCA (Pierce Chemical). Un rendimiento típico de GST-CBS purificada estaba comprendido en el intervalo de 5 a 10 mg de GST-CBS por gramo de pasta de

E. coli.

Ensayo de actividad para CBS

La actividad de CBS de la proteína de fusión GST-CBS de levadura purificada se llevó a cabo tal como describe Kashiwamata y Greenberg (Biochim. Biophy. Acta 212:488-500 (1970)). Este ensayo se basa en la capacidad de CBS para sintetizar cistationina a partir de serina y homocisteína. La cantidad de cistationina formada por CBS se determinó a continuación por espectrofotometría detectando el cromógeno de la reacción con ninhidrina a 455 nm y se comparó con una curva patrón generada utilizando muestras de concentraciones conocidas de cistationina. La actividad de CBS se determinó también mediante los ensayos enzimáticos descritos anteriormente, o mediante otros ensayos bien conocidos por el experto en la materia.

Ejemplo 4

Construcción del montaje de fusión ADH2CYS4

Expresión y purificación de cistationina β-sintasa de levadura en levadura

En este ejemplo un activador potente, ADH2, se insertó corriente arriba del gen de CYS4 y se construyó como una fusión con el gen de la CBS de levadura para estimular la expresión mayor de la proteína. El activador ADH2 está regulado por la Adr1P, y se reprime cuando las células de levadura se cultivan en medio que contiene glucosa y se desreprime cuando las células se cultivan en una fuente de carbono no fermentable. Esto permite la expresión regulada, si la sobreproducción de una proteína es letal para la célula.

Construcción del gen ADH2CYS4

El ADN genómico de levadura se amplió con los cebadores CI-029 (CTATATCGTAATAATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCCGATTCA; SEC. ID. nº 15) y CI-017 (ATGATGATGATGATGATGACCTCGTAAGTAGCTCAGTAA; SEC. ID. nº 9) para producir todo el gen de CYS4 sin el codón de terminación y el terminador de transcripción. El cebador CI-029 (SEC. ID. nº 15) contiene las 13 bases últimas de la zona del activador ADH2 clonadas además de los primeros diez codones del gen de CYS4. El cebador CI-017 (SEC. ID. nº 9) tiene la secuencia de los seis codones últimos del gen CYS4, excepto el codón de terminación más un resto glicilo y seis restos de histadilo. El producto resultante de la RCP comprende una zona de codificación CYS4, y una secuencia de codificación más para glicina y seis restos de histidina. Se añadió glicina para aumentar la flexibilidad espacial del péptido poli-his después de la traducción. El fragmento "terminador" se produjo ampliando el mismo ADN genómico con los cebadores CI-018 (CATCATCATCATCATCATTAAATAAG AACCCACGCT; SEC. ID. nº 10) y CI-040 (AGGGCTCGAGGATCCCGGGGGT GCTATTATGAATGCACGG; SEC. ID. nº 16) para producir una secuencia de polihistidina con un codón de terminación TAA, seguido del terminador de la transcripción. La reacción RCP de CI-029/CI-017 produjo un fragmento de aproximadamente 1530 pb mientras que la reacción de CI-018/CI-040 produjo un fragmento de aproximadamente 331 pb. Estos dos fragmentos se unieron mezclando sus productos de RCP y ampliando con cebadores CI-029/CI-040. El producto resultante se denominó CYS4H y tenía aproximadamente 1861 pb de longitud.

Para unir el activador ADH2 al fragmento génico CYS4H, se generó en primer lugar producto de RCP con el cebador CI-027 (CGGGGATCCGACGTTTTGCCCGCAGGCG GGAAACC; SEC. ID. nº 17) y el cebador CI-028 (AGATTTAGTCATTATTACGATAT AGTTAATAGTTGATAG; SEC. ID. nº 18) del mismo ADN genómico de levadura para producir la secuencia activadora ADH2. El cebador CI-028 (SEC. ID. nº 18) contiene los primeros 12 nucleótidos de la zona de codificación del gen de CYS4. Por lo tanto, entre los cebadores CI-028 (SEC. ID. nº 18) y CI-029 (SEC. ID. nº 15) existen 25 nucleótidos de ADN de complementariedad en sus productos respectivos. El producto ADH2 de la RCP se mezcló con el fragmento CYS4H y se amplió con los cebadores CI-027 (SEC. ID. nº 17) y CI-040 (SEC. ID. nº 16) para producir un fragmento de producto de aproximadamente 2201 pb denominado ADH2CYS4H. Cada uno de estos productos de RCP se confirmó por análisis con endonucleasa de restricción.

El producto ADH2CYS4H se clonó en YEp24 cortando ambos ADN con BamHI y ligándolos utilizando T4 ADN ligasa. Los productos ligados se transformaron dentro de células de E. coli (TOP10; Invitrogen) y se colocaron en placas en LB-agar-agar más placas de ampicilina. Los plásmidos, preparados utilizando el kit de preparación de plásmidos (Roche) según la recomendación del fabricante de supuestos recombinantes, fueron analizados mediante endonucleasa de restricción. Los plásmidos de los clones que se observó que tienen la inserción correcta se transformaron en S. cerevisiae (BJ5460) y se colocaron en medio completo sintético menos uracilo (SC-ura), enriquecido con glucosa al 2%. Después de dos días los supuestos recombinantes se volvieron a rayar en el mismo tipo de placas para aislar las colonias. Las células se provocan cultivando en SC-ura más 2% de etanol y 1% de peptona, enriquecido normalmente con 0,1% de glucosa para permitir que las células crezcan en 24 horas. Después de toda la noche las células de cultivo se recogen por centrifugación y el sedimento celular se guarda a -70ºC hasta la lisis. Se lisan las células volviendo a poner en suspensión el sedimento celular en un volumen de 0,05 del volumen original el tampón de lisis. Las bolitas de vidrio se añaden a continuación al menisco del tampón.

Toda la suspensión se agitó intensamente durante 1 min. cada una durante cuatro veces. Se enfriaron las células en hielo durante 1 min. entre cada agitación. Se transfirió el lisado a un tubo reciente y se centrifugó durante 10 min. a 10.000x g. El lisado purificado se estratificó en una columna con resina de His (Roche) y la proteína se purificó se recuperó una proteína parcialmente purificada en la elución tres.

Ejemplo 5

Ejemplos de fragmento sin ciclación de formatos de ensayo para homocisteína

En este ejemplo se presenta la fracción sin ciclación del ensayo para piruvato y cistationina.

Ensayo de piruvato

Piruvato: La presente invención proporciona la medición de homocisteína basada en la utilización de las enzimas CBS y CBL para ciclar homocisteína con producción de piruvato y amoniaco. La velocidad de producción de piruvato y amoniaco se previó que era proporcional a la concentración original de homocisteína en la muestra. La medición de esta velocidad utilizando la(s) enzima(s) apropiada(s) presenta una oportunidad para un procedimiento homogéneo de homocisteína.

En un aspecto de la presente invención se ha desarrollado un procedimiento muy sensible para la cuantificación de piruvato. En el procedimiento la piruvato oxidasa convierte piruvato en fosfato de acetilo, dióxido de carbono y peróxido. La peroxidasa posteriormente convierte el peróxido, TOOS, y 4-aminoantipirina en cromógeno, que presenta un máximo de absorción cerca de 550 nm. La absorbancia molar de este cromógeno es muy elevada, aproximadamente 36 l mol-1 cm -1 .

5 Utilizando los componentes del reactivo presentados en la Tabla 1 y los parámetros del instrumento Cobas FARA (Roche, Basilea, Suiza) presentados en la Tabla 2, se cuantificó fácilmente el piruvato en el intervalo de µM mediante un blanco de lectura anticipada y reacción de punto final en aproximadamente 5 a 10 minutos. En la figura 1 se muestran los gráficos de absorbancia frente al tiempo. En la figura 2 se muestra una curva de calibración real.

Tabla 1. Método del piruvato: componentes del reactivo

Compuesto químico

Concentración

Reactivo 1

HEPES, sal hemisódica

21,5 mM

HEPES, ácido

28,6 mM

EDTA (4 Na)

5,0 mM

MgSO4·7H2O

49,8 mM

K2HPO4, dibásico

7,5 mM

TOOS

1,4 mM

TTHA

0,8 mM

TPP

0,2 mM

4-aminoantipirina

1,0 mM

BSA

1,9 g/l

Ferrocianuro potásico

0,07 mM

Peroxidasa de rábano picante

3,0 KU/l

Piruvato oxidasa

3,0 KU/l

pH = 7,0

Tabla 2. Método del piruvato: parámetros de Cobas FARA

Parámetro

Ajuste

GENERAL

Modo de medición

ABS

Modo de reacción

P-A

Modo de calibración

PROMEDIO DE LA AVG

Blanco reactivo

REAG/DIL

Longitud de onda

550 nm

Temperatura

37ºC

ANÁLISIS

volumen de muestra

40 µl

volumen de diluyente

10 µl

denominación del diluyente

H2O

volumen de reactivo

250 µl

tiempo de incubación

60 s

volumen de reactivo inicial

n.a.

denominación del diluyente

H2O

volumen del diluyente

n.a.

tiempo de incubación

n.a.

volumen inicial del reactivo 2

n.a.

denominación del diluyente

H2O

volumen de diluyente

n.a.

retardo de temperatura

n.a.

LECTURAS DE ABSORBANCIA

Primera

0,5 s

Número

14

Intervalo

30 s

CÁLCULO

Número de etapas

I

etapa A de cálculo

CINÉTICA

Primero

1

Último

14

CALIBRACIÓN

Número de patrones

1

Patrón

50 µM

repetición

2

Ensayo de cistationina

Se analizó cuantitativamente la cistationina añadiendo CBL al reactivo de piruvato descrito anteriormente. CBL

5 convierte la cistationina en homocisteína, piruvato y amoniaco. El piruvato se analizó cuantitativamente a continuación como se describió anteriormente. La composición del reactivo utilizado para cuantificar cistationina se muestra en la Tabla 3. La cuantificación puede hacerse utilizando cualquier instrumento adecuado. En el presente ejemplo, se utilizó un Cobas FARA (Roche, Basilea, Suiza). Los parámetros típicos de la reacción se presentan en la Tabla 4. La figura 3 representa gráficos de absorbancia frente al tiempo obtenidos utilizando soluciones acuosas de

10 cistationina. La reacción alcanza el punto final en menos de diez minutos.

Tabla 3. Método de la cistationina: componentes del reactivo

Compuesto químico

Concentración

Reactivo 1

HEPES, sal hemisódica

20,3 mM

HEPES, ácido

27,0 mM

EDTA (4 Na)

4,7 mM

MgSO4·7H2O

47,1 mM

K2HPO4, dibásico

7,1 mM

TOOS

1,3 mM

TTHA

0,8 mM

TPP

0,2 mM

4-aminoantipirina

0,9 mM

BSA

1,8 g/l

Ferrocianuro potásico

0,07 mM

Peroxidasa de rábano picante

2,8 KU/l

Piruvato oxidasa

2,8 KU/l

CBL

1,9 g/l

pH = 7,0

Tabla 4. Método de la cistationina: parámetros de Cobas FARA

Parámetro

Ajuste

GENERAL

Modo de medición

ABS

Modo de reacción

P-A

Modo de calibración

LIN INTER

Blanco reactivo

REAG/DIL

Longitud de onda

550 nm

Temperatura

37ºC

ANÁLISIS

volumen de muestra

30 µl

volumen de diluyente

10 µl

denominación del diluyente

H2O

volumen de reactivo

260 µl

tiempo de incubación

60 s

volumen de reactivo inicial

n.a.

denominación del diluyente

H2O

volumen del diluyente

n.a.

tiempo de incubación

n.a.

volumen inicial del reactivo 2

n.a.

denominación del diluyente

H2O

volumen de diluyente

n.a.

retardo de temperatura

n.a.

LECTURAS DE ABSORBANCIA

primera

5 s

número

21

intervalo

60 s

CÁLCULO

número de etapas

1

etapa A de cálculo

PUNTO FINAL

primera

1

última

10

Tabla 4 (continuación)

Parámetro

Ajuste

CALIBRACIÓN

Número de patrones

1

Patrón

50 µM

repetición

2

La figura 4 representa curvas patrón obtenidas utilizando soluciones acuosas de cistationina. Estas curvas son lineales en todo el intervalo de 0 a 100 µM de concentración de cistationina por lo menos. El cromóforo formado era

5 estable en aproximadamente 15 a 20 minutos. Sin embargo, si las muestras que contenían 10 a 20 veces concentraciones más elevadas de cistationina se sometían a ensayo, resultaba evidente alguna inestabilidad del cromóforo.

En algunos experimentos se incluyó la serina en la mezcla de reacción. La serina a una concentración de 250 µM no

10 presentaba ningún efecto significativo. Las concentraciones mayores de serina se toleraban también en este ensayo. La falta de interferencia de serina es una observación importante debido a que la presencia de serina es necesaria para el ensayo de la homocisteína.

Ejemplo 6

15 Ensayos de ciclación enzimática para homocisteína

En este ejemplo se proporcionan sistemas de ciclación enzimática para determinar la concentración de homocisteína utilizando el sistema de señalización piruvato oxidasa/peroxidasa o el sistema de señalización de la lactato

20 deshidrogenasa.

Demostración de la ciclación: Sistema de ciclación enzimática CBS/CBL/PO/HRP

Se ha demostrado el sistema de ciclación en el que se inició la reacción utilizando homocisteína o cistationina. Los

25 componentes del reactivo utilizados en estos experimentos se muestran en la Tabla 5. Se añadieron por separado CBS y serina después del mezclado de la muestra con reactivo 1 que contiene todos los demás componentes. Los parámetros pertinentes de Cobas FARA se muestran en la Tabla 6. Se disolvió cistationina u homocisteína en agua para preparar patrones a concentraciones apropiadas. En las figuras 5 y 6 se muestran el tiempo frente a la absorbancia. Después de un retraso de tiempo de tres a seis minutos los gráficos con lineales. Una curva de

30 calibración típica de homocisteína (figura 7) que, aunque no es completamente lineal, puede utilizarse para cuantificar concentraciones de homocisteína en muestras adecuadas utilizando una técnica de ajuste de la curva apropiada.

Tabla 5. Ciclación de CBS/CBL, método PO/HPR

Componentes del reactivo

Compuesto químico

Concentración

Reactivo 1

HEPES, sal hemisódica

20,3 mM

HEPES, ácido

27,0 mM

EDTA (4 Na)

4,7 mM

MgSO4·7H2O

47,1 mM

K2HPO4, dibásico

7,1 mM

TOOS

1,3 mM

TTHA

0,8 mM

TPP

0,2 mM

4-aminoantipirina

0,9 mM

BSA

1,8 g/l

Ferrocianuro potásico

0,07 mM

Peroxidasa de rábano picante

3,0 KU/l

Piruvato oxidasa

3,0 KU/l

CBL

pH = 7,0

Reactivo SR1

Serina

3,1 mM

Reactivo SR2

CBS

1,23 g/l

Tabla 6. Sistema de ciclación CBS/CBL/PO/HPR: parámetros de Cobas FARA

Parámetro

Ajuste

GENERAL

Modo de medición

ABS

Modo de reacción

P-I-SR1-I-SR2-A

Modo de calibración

LIN INTER

Blanco reactivo

REAG/DIL

Longitud de onda

550 nm

Temperatura

37ºC

ANÁLISIS

volumen de muestra

30 µl

volumen de diluyente

10 µl

denominación del diluyente

H2O

volumen de reactivo

260 µl

tiempo de incubación

60 s

volumen de reactivo inicial

30 µl (serina)

denominación del diluyente

H2O

volumen del diluyente

5 µl

tiempo de incubación

10 s

volumen inicial del reactivo 2

30 µl (CBS)

denominación del diluyente

H2O

volumen de diluyente

5 µl

retardo de temperatura

n.a.

LECTURAS DE ABSORBANCIA

primera

0,5 s

número

14

intervalo

30 s

CÁLCULO

número de etapas

1

etapa A de cálculo

PUNTO FINAL o CINÉTICA

primera

1

última

14

CALIBRACIÓN

Número de patrones

1

Patrón

50 µM

repetición

2

Reducción de enlaces disulfuro

Muy poca homocisteína está presente en estado reducido, enlazado sin disulfuro en el plasma humano. La mayor

5 parte de la homocisteína está acopla a las proteínas o a pequeñas moléculas mediante enlaces disulfuro. La reducción con disulfuro de estos compuestos es necesaria para liberar homocisteína para la cuantificación por cualquier método de determinación de homocisteína total. Este ejemplo demuestra esta utilización de agentes reductores compatibles con un sistema que utiliza lactato deshidrogenasa y NADH. Los agentes reductores del candidato potencial incluyen DTE, DTT, n-acetilcisteína, ácido tioglicólico, TCEP y similares. Para la utilización de

10 estos compuestos en el procedimiento de la presente invención, son necesarios el ajuste preciso de la concentración del agente reductor y los parámetros del instrumento. Las indicaciones iniciales de que determinados agentes reductores podrían impedir la acción de piruvato oxidasa y/o la peroxidasa de rábano picante condujeron a la investigación del sistema de detección de piruvato alternativo descrito a continuación.

15 Demostración de la ciclación: Sistema CBS/CBL/LDH

El piruvato reacciona con NADH en presencia de la enzima lactato deshidrogenasa para producir ácido láctico y NAD. El piruvato puede cuantificarse midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm. La absorbancia molar de NADH es aproximadamente seis veces menor de la peroxidasa generada de cromógeno. Sin embargo, esto no

20 afecta al sistema de la presente invención porque la ciclación de la homocisteína de CBL/CBS puede generar cantidades relativamente grandes de piruvato.

El sistema de reacción utilizado para generar los datos presentados en las figuras 8, 9, 10 y 11 comprende serina, CBL y lactato deshidrogenasa en tampón HEPES (pH 7,2) como primer reactivo. NADH en tampón TRIS (pH 8,5) y 25 CBS se añaden a continuación sucesivamente. Todos los componentes pueden combinarse, sin embargo, de manera diferente para formar un sistema de cuantificación de homocisteína con dos o tres reactivos. Las concentraciones del reactivo se muestran en la Tabla 7, y los parámetros Cobas FARA se muestran en la Tabla 8. Se ajustó la concentración de NADH para proporcionar suficiente linealidad mientras que se permite la absorción de

la muestra de plasma a 340 nm. 5

Tabla 7. Sistema de ciclación CBS/CBL/LDH: Componentes del reactivo

Compuesto químico

Concentración

Reactivo 1

HEPES, sal hemisódica

39,4 mM

HEPES, ácido

12,6 mM

Serina

0,72 mM

Lactato deshidrogenasa

33.000 U/l

CBL

6,05 µg/l

pH = 7,2

Reactivo SR1

NADH

4,16 mM

TRIS

50 mM

pH = 8,5

Reactivo SR2

CBS

996 mg/l

TRIS

50 mM

Cloruro sódico

100 mM

Piridoxal fosfato

5 µM

Diluyente de la muestra

DTT

13 mM

HEPES, sal hemisódica

56,7 mM

HEPES, ácido

18,1 mM

pH = 7,2

Tabla 8. Sistema de ciclación CBS/CBL/LDH: parámetros de Cobas FARA

Parámetro

Ajuste

GENERAL

Modo de medición

ABS

Modo de reacción

P-I-SR1-I-SR2-A

Modo de calibración

LIN INTER

Blanco reactivo

REAG/DIL

Longitud de onda

340 nm

Temperatura

37ºC

ANÁLISIS

volumen de muestra

30 µl

volumen de diluyente

10 µl

denominación del diluyente

H2O (o agente reductor)

volumen de reactivo

250 µl

tiempo de incubación

60 s

volumen de reactivo inicial

15 µl (NADH)

denominación del diluyente

H2O

volumen del diluyente

5 µl

tiempo de incubación

10 s

volumen inicial del reactivo 2

30 µl (CBS)

denominación del diluyente

H2O

volumen de diluyente

10 µl

retardo de temperatura

n.a.

LECTURAS DE ABSORBANCIA

primera

5 s

número

16

intervalo

30 s

CÁLCULO

número de etapas

1

etapa A de cálculo

PUNTO FINAL o CINÉTICA

primera

6

última

20

CALIBRACIÓN

Número de patrones

1

Patrón

25 ó 50 µM

repetición

2

Análisis de soluciones acuosas

El sistema funcionó bien para la detección de homocisteína en solución acuosa. En las figuras 8 y 9 se muestran gráficos típicos de absorción frente al tiempo. Estos gráficos eran lineales con poco o ningún retraso aparente de fase. Las velocidades de desaparición de NADH eran relativamente altas. Además, el gráfico de calibración de la concentración de homocisteína frente a la absorbancia era lineal en todo el intervalo de 0 a 100 µM en la muestra (figura 10). Por lo tanto, solamente un calibrador, por ejemplo 25 µM, junto con un blanco de reactivo fue necesario para la calibración.

Se prepararon soluciones de homocisteína a varias concentraciones para demostrar el funcionamiento del método en todo el intervalo de concentración de homocisteína de 2 a 20 µM. Los resultados se muestran en la Tabla 9 tanto en presencia como en ausencia de DTT. Como se mencionó anteriormente, El DTT sirve para reducir los enlaces disulfuro en las muestras (por ejemplo suero, plasma, etc.). El DTT no interfiere de manera significativa con la reacción catalizada por lactato deshidrogenasa.

Tabla 9. Demostración de linealidad: sistema de ciclación CBS/CBL/LDH Tiempo de reacción = 3 min.

Conc. de homocisteína (µM)

Valor observado (µM)

(-) DTT

(+) DTT

2

2

1,2

5

5,2 4,3

8

8,2 7,4

10

10,4 9,9

12,5

12,7

12,5

16,7

16,8 16,3

20

20,5

20

Análisis de plasma humano basado en productos de referencia

Se ha demostrado en la presente memoria el funcionamiento exacto del sistema de ciclación CBS/CBL/LDH utilizando plasma humano basado en productos de referencia con homocisteína fabricados por Bio-Rad Co. Se han utilizado varias concentraciones de DTT, y los tiempos de incubación se han variado para conseguir la recuperación óptima de homocisteína. Los tiempos de incubación de 5-1 min con concentraciones de DTT de 1,6-3,2 mM dieron determinaciones de homocisteína comprendidas en los intervalos especificados para varios otros métodos.

Muestras de plasma humano

El ensayo de ciclación de homocisteína ha demostrado buen funcionamiento utilizando muestras de plasma humano con DTT como agente reductor. Los resultados concuerdan bien con los obtenidos por un laboratorio independiente utilizando el método IMx para homocisteína de Abbott (figura 11). Los parámetros FARA de Cobas utilizados en este experimento se muestran en la Tabla 10 y los componentes del reactivo se muestran en la Tabla 7. En este ensayo se utilizó un calibrador de homocisteína acuosa (25 µM). Los gráficos de absorbancia frente al tiempo para muestras acuosas fueron lineales en ausencia de DTT y casi lineales en presencia de DTT. Sin embargo, los gráficos obtenidos utilizando muestras de plasma eran diferentes, es decir, no lineales después de los primeros tres minutos. En las condiciones esbozadas en la Tabla 7 y en la Tabla 10, la ciclación aparece disminuyendo poco a poco lentamente a lo largo del tiempo. No obstante, el estudio de correlación presentado en la figura 11 demuestra una coincidencia relativamente próxima entre el presente método (esbozado en la Tabla 7 y Tabla 10) con los obtenidos por IMx cuando se prueban las muestras de suero humano.

Tabla 10. Sistema de ciclación CBS/CBL/LDH: parámetros de Cobas FARA para estudio de correlación en plasma humano

Parámetro

Ajuste

GENERAL

Modo de medición

ABS

Modo de reacción

P-I-SR1-I-SR2-A

Modo de calibración

LIN INTER

Blanco reactivo

REAG/DIL

Longitud de onda

340 nm

Temperatura

37ºC

ANÁLISIS

volumen de muestra

30 µl

volumen de diluyente

µl

denominación del diluyente

H2O (o agente reductor)

Tabla 10. (continuación)

Parámetro

Ajuste

retardo de temperatura

900 s

volumen de reactivo

250 µl

tiempo de incubación

60 s

volumen de reactivo inicial

15 µl (NADH)

denominación del diluyente

H2O

volumen del diluyente

5 µl

tiempo de incubación

10 s

volumen inicial del reactivo 2

30 µl (CBS)

denominación del diluyente

H2O

volumen de diluyente

10 µl

retardo de temperatura

n.a.

LECTURAS DE ABSORBANCIA

primera

5 s

número

24

intervalo

30 s

CÁLCULO

número de etapas

1

etapa A de cálculo

PUNTO FINAL o CINÉTICA

primera

1

última

6

CALIBRACIÓN

número de patrones

1

Patrón

25 ó 50 µM

repetición

2

En una forma de realización preferida, las velocidades se miden en los primeros tres minutos después del comienzo de la reacción. La optimización adicional del sistema, incluyendo la variación en las concentraciones de sal y detergente, producirán probablemente un funcionamiento más constante con muestras acuosas y de plasma. El

5 ensayo ha sido igualmente preciso cuando los componentes se combinaron en dos o tres mezclas de reactivos.

Ejemplo 7

Comparación de ensayos de homocisteína

10 En este ejemplo, un ensayo de homocisteína preferido según la invención se probó y comparó con dos ensayos existentes, a saber una técnica de HPLC convencional y el ensayo de IMx disponible en el mercado.

El ensayo de la invención se realizó utilizando tres reactivos como se muestra en la Tabla 11. El primer reactivo R1

15 estaba inicialmente en forma de polvo y se redisolvió hasta una concentración de 1,5 g de polvo por 100 ml de agua. El kit de ensayo global incluía además calibradores que contienen L-cistationina enriquecida a varias concentraciones en una matriz de plasma humano, así como dos muestras de referencia preparadas en una matriz de plasma humano procesada.

Tabla 11. Sistema de ciclación CBS/CBL/LDH: Componentes del reactivo

Compuesto químico

Concentración

Reactivo 1

HEPES, sal hemisódica

43,3 mM

HEPES, ácido

12,7 mM

Serina

1,295 mM

Lactato deshidrogenasa

>800 U/l

NADH

1,06 mM

Triton X-100

0,05% v/v

Azida sódica

7,7 mM

pH = 8,0

Reactivo SR1

DTE

6,75 mM

Ácido cítrico

50 mM

pH = 2,0

Tabla 11 (continuación)

Compuesto químico

Concentración

Reactivo SR2

CBS

18,7 KU/l

CBL

8,9 KU/l

Sorbitol

1,65 M

Cloruro sódico

100 mM

Piridoxal fosfato

5 µM

Azida sódica

7,7 mM

Tris/HCl

50 mM

pH = 8,0

Tabla 12. Sistema de ciclación de CBS/CBL/LDH: parámetros de Cobas MIRA

Parámetro

Ajuste Parámetro Ajuste

GENERAL Modo de medición Modo de reacción Modo de calibración Blanco reactivo Limpiador Longitud de onda Posición de decimal Unidad

Absorb. R-S-SR1-SR2 Regresión lineal React./dil. Ninguno 340 nm 2 µmol/l Factor de conversión Anulado Intervalo de pruebaBajo Alto Intervalo Bajo Alto Número de etapas 1,00 0,00 On On Ninguno Ninguno 1

ANÁLISIS Factor de posdil. Factor de conc. Ciclo de muestra Volumen Denominación del diluyente Volumen Ciclo de reactivo Volumen Ciclo de R1 de partida Volumen Denominación del diluyente Volumen Ciclo R2 de partida Volumen Denominación del diluyente Volumen

Ninguno Ninguno 1 30,0 µl H2O 25,0 µl 1 90 µl 2 25 µl H2O 25 µl 17 35 µl H2O 15 µl Etapa de cálculo A Lecturas Primera Última Reacción Límite CALIBRACIÓN Intervalo de calibración Blanco Intervalo de reacción Bajo Alto Intervalo del blanco Bajo Alto Patrón Posición 1 2 3 4 5 6 Cinética 18 32 Ninguno Cada serie Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno 1 3,5 µmoles/l 7,0 µmoles/l 17 µmoles/l 27 µmoles/l 47 µmoles/l Ninguno

CÁLCULO Límite de la muestra Dirección de la reacción Comprobación Exceso de antígeno

Ninguno Disminución Off Ninguno 7 Replicado Desviación Patrón Corrección Ninguno Individual Ninguno

Referencia Posición de CS1 Posición de CS2 Posición de CS3

Ninguno Ninguno Ninguno

En la realización de este ensayo, se utilizó el instrumento Cobas MIRA disponible en el mercado. El programa informático Cobas MIRA permite 50 ciclos programables de 25 segundos. En particular, el instrumento se programó 5 según los parámetros en la Tabla 12. En el ciclo se añadieron 1,30 µl de la muestra a una cubeta, seguido de 25 µl de agua de enjuague y 90 µl de reactivo líquido R1. Al comienzo del ciclo 2 se añadieron 25 µl de reactivo SR1 con unos 25 µl adicionales de agua de enjuague. Acto seguido, se dejó la mezcla incubar durante 15 ciclos (6,25 min.) para dejar liberar el reductor cualquier homocisteína ligada y para destruir cualquier piruvato endógeno presente. En este momento, se añadieron 35 µl del reactivo enzimático CBS/CBL con 15 µl más de agua de enjuague. La 10 disminución de la absorbancia a 340 nm se midió a lo largo del tiempo entre los ciclos 18 y 32 como una cuantificación de la homocisteína en la muestra. El tiempo de ensayo total entre la adición de la muestra y la lectura de absorbancia final fue de 32 ciclos, o 13 min. y 20 s. Dado que múltiples muestras se desarrollan en paralelo, se producen resultados adicionales de la muestra por el MIRA a un ritmo de aproximadamente uno cada 30 a 90 segundos dependiendo de la longitud de la serie y del número de calibraciones del instrumento utilizadas. Utilizando

parámetros de programación similares este ensayo puede adaptarse a instrumentos aún más rápidos (por ejemplo INTEGRA de Roche, Hitachi, ACE, etc.) que podrían dar aún mayores velocidades de transferencia.

Se probaron un total de 24 muestras utilizando el ensayo de la invención y los ensayos comparativos conocidos. La

5 Tabla 13 a continuación indica las concentraciones de homocisteína obtenidas utilizando estos tres métodos. Las figuras 12 a 14 son gráficos de correlación respectivos que representan gráficamente los resultados de la Tabla 13. Como puede observarse, el procedimiento de la invención se correlaciona estrechamente tanto con IMx como con HPLC; con la coincidencia más estrecha observada por lo general con IMx. Sin embargo, el presente procedimiento es sustancialmente menos costoso, puede desarrollarse más rápido y puede realizarse utilizando analizadores

10 químicos generalmente disponibles.

La invención presenta muy buena precisión entre series como se muestra en la Tabla 14. Se observó que los CV típicos dentro de la serie eran menos del 4% sobre las concentraciones de homocisteína de aproximadamente 7 a 20 µmoles/l.

Tabla 13. Comparación de ensayos de homocisteína

Concentración de homocisteína [µM]

Muestra nº

HPLC Invención IMx

1

9,5 11,5 11,7

2

14,3 13,1 12,1

3

8,8 7,8 7,5

4

10,6 10,1 9,4

5

10,5 10,1 9,9

6

8,6 9,2 7,2

7

7,6 5,8 6,2

8

5,2 3,5 3,1

9

9,6 9,3 9,7

10

7,7 8,7 7,5

11

11,2 11,1 9,4

12

10,5 8,3 8,1

13

11,9 8,4 8,3

14

10,8 9,2 8,9

15

14,1 12,3 12,5

16

24,3 16,3 17,9

17

20,9 17,7 17,8

18

24,2 22,7 22,1

19

33,6 26,4 26,4

20

21,0 20,7 18,9

21

22,7 19,6 18,1

22

20,5 17,3 16,6

23

25,6 23,3 22,0

24

20,5 17,0 15,8

Promedio

15,2 13,3 12,8

Intersección [HPLC]

1,4 0,9

Pendiente [HPLC]

1,2 1,2

R [HPLC]

0,957 0,974

Intersección [IMx]

-0,3 0,5

Pendiente [IMx]

0,8 1,0

r [IMx]

0,976 0,990

Tabla 14. Precisión entre series

Homocisteína (µmoles/l)

Muestra

Serie 1 Serie 2 Promedio % CV

1

16,35 16,46 16,41 0,47

2

12,13 12,58 12,36 2,58

3

19,45 21,6 20,53 7,41

4

16,29 16,79 16,54 2,14 ,

5

11,13 10,01 10,57 7,49

6

7,33 7,56 7,45 2,18

7

6,31 7,24 6,78 9,71

8

7,13 5,54 6,34 17,75

9

14,87 14,5 14,69 1,78

10

13,81 13,41 13,61 2,08

Tabla 14 (continuación)

Homocisteína (µmoles/l)

Muestra

Serie 1 Serie 2 Promedio % CV

11

26,86 28,66 27,76 4,58

12

12,45 13,05 12,75 3,33

13

10,15 10,74 10,45 3,99

14

9,6 10,39 10,00 5,59

15

12,53 13,67 13,10 6,15

16

14,60 15,20 14,90 2,85

17

25,03 25,65 25,34 1,73

18

20,77 20,03 20,40 2,56

19

31,83 32,10 31,97 0,60

20

36,86 36,43 36,65 0,83

21

11,65 11,48 11,57 1,04

22

40,22 38,25 39,24 3,55

23

31,68 32,62 32,15 2,07

24

7,68 6,38 7,03 13,08

CV media (%) = 4,22

Ejemplo 8

5 Efecto de las variaciones de concentración de reactivo

En este ejemplo, el ensayo preferido de la invención descrito en el ejemplo 7 se realizó con variaciones en algunos de los componentes del reactivo, a saber LDH, NADH y serina. Esto se realizó a fin de determinar las cantidades óptimas de estos componentes de reactivo. Los ensayos se realizaron como se describió anteriormente, con los

10 componentes respectivos variados en concentración. La Tabla 15 expone los resultados de estas pruebas.

Tabla 15. Efecto de las variaciones en la concentración de componentes del reactivo

Mezcla de reacción final [LDH] (U/l)

PENDIENTE (mA/min/µM) INTERSECCIÓN mA/min BLANCO mA/min Intervalo de homocisteína diana de la muestra de referencia: 25-35 µM

114,5

1,21 -0,14 -10,2 25,8

229,3

1,14 0,12 -11,2 28,1

458,7

1,17 0,14 -11,3 26,6

917,5

0,88 1,89 -11,3 27,2

[NADH] (mM)

0,130

0,77 4,23 -10,7 32,9

0,259

1,12 0,05 -11 25,2

[NADH] (mM)

0,389

1,09 0,45 -10,7 26,8

0,519

1,13 0,49 -11,1 26,0

[SERINA] (mM)

0,125

0,64 2,23 -6,7 30,9

0,25

0,92 1,26 -9,0 28,1

0,5

1,13 0,63 -10,8 27,1

1

1,16 0,15 -13,6 28,3

2

1,23 0,33 -15,4 28,2

Los resultados mostrados en la Tabla 15 permitieron la selección de concentraciones del componente reactivo final que proporcionaba sensibilidad adecuada con una cantidad de blanco mínima a la vez que también tratando de 15 minimizar los costes de reactivo.

Ejemplo 9

Estudio de los ensayos con homocisteína descritos en el documento WO 00/28071

20 La publicación PCT WO 00/28071 describe con detalle dos ensayos con homocisteína. En la "primera forma de realización", el ensayo se realiza sin una etapa de reducción. Para convertir este procedimiento en uno útil para las determinaciones de homocisteína en el plasma humano, debe incorporarse una etapa de reducción ya sea independiente autónoma o una homogénea. La publicación WO 00/28071 describe una etapa de reducción

25 autónoma y independiente quizás debido a que se utiliza un sistema de ciclación con piruvato oxidasa. Esta etapa implica una incubación de 20 min. antes que la muestra reducida pueda analizarse, lo que aumenta en gran medida la duración total del ensayo y el coste de operación. Por otra parte, si la muestra debe ensayarse para más de un analito en el laboratorio clínico, la muestra primaria de suero o plasma debe dividirse en dos alícuotas, una para la prueba de homocisteína y la otra para algunas otras de la prueba de laboratorio ordenadas. En cambio, la presente invención permite la reducción homogénea ya que se utiliza un sistema de ciclación de LDH (Ejemplo 7).

5 En el ejemplo 9 (Tabla 16), se demuestra que DTT de hecho no interfiere con el sistema de detección de piruvato oxidasa descrito en la "segunda forma de realización" del documento WO 00/28071. En particular, se utilizaron el reactivo y las composiciones de DTT descritas en la "segunda forma de realización", y se realizaron ensayos con y sin DTT frente a conocidos patrones de piruvato (12,5, 25 y 50 µmoles/l) utilizando un instrumento Cobas FARA. En el caso de la prueba DTT, se mezclaron 40 µl de cada patrón con 30 µl de la solución de DTT, seguido de

10 incubación durante 100 s. Después, se añadieron 90 µl de reactivo piruvato oxidasa y se incubaron durante 30 s. Se tomaron a continuación lecturas de absorbancia a los 30, 60, 90, 120, 150, 180 y 210 s. En la prueba "sin DTT", se siguió el mismo procedimiento excepto que no se añadió DTT. La Tabla 16 expone los resultados de este experimento utilizando las lecturas a 210 s. Las Figuras 15 y 16 ilustran más los resultados de esta prueba.

Tabla 16. Efecto de DTT sobre el sistema de detección de piruvato PO/HRP

SIN DTT

CON DTT

Blanco

0,0021 -0,0021 1

Factor

2212 2 -11765

Patrón 50 f.1 mol/l

51,5 35,3

Patrón 25 f.1 mol/l

24,1 1 0,0

Patrón 12,5 f.1 mol/l

9,7 -21,2

Cambio de delta a los 30 s. (patrón 50 pmoles)

0,0643 -0,0062

Cambio de delta a los 90 s. (patrón 50 f.1 mol)

0,0890 -0,0103

Cambio de delta a los 120 s. (patrón 50 µmoles)

0,0903 -0,0113

Cambio de delta a los 210 s. (patrón 50 µmoles)

0,0906 -0,0113

15 Estos datos demuestran claramente la necesidad de la etapa de reducción independiente descrita en la "segunda forma de realización" de la publicación WO 00/28071. La presencia del reductor interfiere con el sistema de detección de piruvato oxidasa utilizado para someter a ensayo el piruvato. Por lo tanto, los datos presentados aquí confirman que la etapa de reducción autónoma independiente que utiliza mucho tiempo es esencial en la "segunda

20 forma de realización". Además, la etapa de reducción autónoma descrita en el documento WO 00/28071 elevará probablemente de manera significativa la complejidad del ensayo y el coste relativo a la presente invención.

Listado de secuencias

25 <110> KAWASAKI, GLENN WEBB, HEATHER OWENS, JEFFREY LIEDTKE, RAYMOND FOREST, DOREEN

30 LEGAZ, MARK LAWSON, SOBOMABO

<120> ENSAYOS DE CICLACIÓN ENZIMÁTICA PARA LA HOMOCISTEÍNA Y LA CISTATIONINA

35 <130> 30865

<150> 60/163.126 <151> 1999-11-02

<150> 60/203.349 <151> 2000-05-10 40

<160> 21

<170> PatentIn versión 3.0

45 <210> 1

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 3

<210> 4

<211> 27

<212> ADN .

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 5

<210> 6

<211> 30 .

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 7

<210> 8

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 8

<210> 9

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 9

<210> 10

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 10 <210> 11

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<221> misc feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de receptor MetR consenso 10

<400> 11

15 <210> 12

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<221> misc_feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

25 <400> 12

<210> 13 30 <211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <221> misc_feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 13 40

<210> 14

<211> 1524 45 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 14

<210> 15

<211> 43

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> () .. () 15 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 15

<210> 16

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 16

<210> 17

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> () .. ()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 17

<210> 18

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> ()..()

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador PCR

<400> 18

<210> 19

<211> 428

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 19

<210> 20

<211> 1252

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 20

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 21 10

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Kit de prueba adecuado para su utilización en la evaluación de la cantidad de homocisteína en una solución de muestra que comprende cistationina β-sintasa, o un derivado de la misma, L-serina, cistationina β-liasa, o un derivado de la misma, en el que los derivados conservan la actividad enzimática de una enzima natural aislada.

2. 2.

   Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además un recipiente para contener dicha muestra.

3. 3.

   Kit de prueba según la reivindicación 1, estando presente dicha cistationina β-sintasa en una concentración final de 0,1 a 100 KU/l.

4. 4.

   Kit de prueba según la reivindicación 1, estando presente dicha L-serina en una concentración final de 1 µMa 50 µM.

5. 5.

   Kit de prueba según la reivindicación 1, estando presente dicha cistationina β-liasa en una concentración final de 0,01 a 100 KU/l.

6. 6.

   Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende lactato deshidrogenasa y NADH.

7. 7.

   Kit de prueba según la reivindicación 6, estando presente dicha lactato deshidrogenasa en una concentración final de 30 a 5.000 U/l.

8. 8.

   Kit de prueba según la reivindicación 6, estando presente dicha NADH en una concentración final de 0,1 mM a 2 mM.

9. 9.

   Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además un colorante que puede experimentar un cambio de color cuando se oxida.

10. 10.

    Kit de prueba según la reivindicación 9, en el que dicho colorante es seleccionado de entre el grupo constituido por 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), 2,6-diclorofenolindofenol, compuesto de tetrazolio, metosulfato de fenazina o metilo viológeno.

11. 11.

    Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además un recipiente separado, conteniendo dicho recipiente separado un agente reductor.

12. 12.

    Kit de prueba según la reivindicación 11, en el que dicho agente reductor comprende una sal de borohidruro o un agente reductor de tiol.

13. 13.

    Kit de prueba según la reivindicación 12, en el que dicho agente reductor de tiol es seleccionado de entre el grupo constituido por β-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, TCEP o ácido tioacético, o cualquier sal de cada uno de los mismos.

14. 14.

    Kit de prueba según la reivindicación 13, estando presente dichos ditiotreitol, β-mercaptoetanol, ditioeritritol o ácido tioacético en una cantidad de 0,2 mM a 3 mM.

15. 15.

    Kit de prueba según la reivindicación 1, que comprende además cistationina γ-liasa, o un derivado de la misma, en el que el derivado conserva la actividad enzimática de una enzima natural aislada.

16. 16.

    Kit de prueba según la reivindicación 2, 16 ó 15, en el que dicha cistationina β-sintasa, o un derivado de la misma, cistationina β-liasa, o un derivado de la misma, cistationina γ-liasa, o un derivado de la misma, lactato deshidrogenasa, o un derivado de la misma, están inmovilizadas dentro de dicho recipiente, en el que los derivados conservan la actividad enzimática de una enzima natural aislada.

17. 17.

    Kit de prueba según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada una de las enzimas se construye como proteínas de fusión.

18. 18.

    Enzima aislada que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 19 y nº 20.

19. 19.

    Procedimiento de utilización de cistationina como calibrador del ensayo de homocisteína que comprende las etapas siguientes:

    (a)

    tomar una concentración conocida de cistationina;

    (b)

    añadir dicha concentración conocida a una muestra biológica;

    (c)

    utilizar dicha muestra que contiene cistationina en una reacción enzimática que convierte la homocisteína en cistationina y reconvierte la cistationina en homocisteína con la producción acompañante de piruvato y amoniaco;

    (d)

    medir las cantidades de piruvato o amoniaco producidas; y

    (e)

    utilizar dichas cantidades medidas de piruvato o amoniaco como patrones de referencia para dicho ensayo de homocisteína.