DE19842901A1 - Bioluminometrisches Verfahren zum zerstörungsfreien Messen von Zellaktivierungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein zerstörungsfreies bioluminometrisches Verfahren zum Erfassen von Zellaktivierungen.

Biolumineszenz bezeichnet die Lichtemission im Zusammenhang mit der enzymatischen Katalyse von Luciferasen. Die kommerziell wichtigsten Luciferasen werden aus Käfern, vorwiegend aus dem amerikanischen Leuchtkäfer, Photinus pyralis (Firefly luciferase EC 1.13.12.7), isoliert. Alle Leuchtkäfer katalysieren eine chemische Reaktion bei der D-luciferin zu Oxyluciferin umgewandelt wird (Deluca, Firefly Luciferase (1976) Advances in Enzymology Interscience, New York, 37-68, Wood et. al., Bioluminescent click beetles revisited (1989) J Biolum Chemilum 4, 31-39, Wood et. al., Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors (1989) Science 244, 700-702). Diese Reaktion benötigt Sauerstoff sowie MgATP als Cosubstrat, das zu AMP und Pyrophosphat abgebaut wird. Pro umgesetztes Molekül ATP wird dabei annähernd 1 Photon emittiert. Da sich Licht sehr empfindlich nachweisen läßt, werden biolumino­ metrische Methoden zum Nachweis sehr geringer Mengen von ATP angewendet. Alle Reaktionen, die sich an die Produktion oder den Verbrauch von ATP koppeln lassen, können auf diese Weise meßbar gemacht werden. Diese Messungen finden vor allem Anwendung in der biochemischen Analytik, in klinischen Untersuchungen, in der Mikrobiologie sowie in Hygienekontrollbereich (Lundin, Applications of Firefly Luciferase (1982) Luminescent assays: Perspectives in Endocrinology and clinical chemistry Raven Press, New York). Einen weiteren wichtigen Anwendungsbereich für bioluminometrische Messungen stellt die Detektion von intrazellulärer Luciferase als Reportergen dar. Ziel dieser Messungen ist der Nachweis von erfolgreicher Genexpression bei der Luciferase als Indikator coexprimiert wird. Die Anwesenheit von Luciferase wird dabei häufig als Biolumineszenz nach Zellyse und Zugabe von D-luciferin und ATP nachgewiesen.

Die enzymatische Katalyse von Firefly Luciferase, aber auch anderer Käferluciferasen, liefert bei hoher Konzentration von D-luciferin (bis zu millimolaren Konzentrationen) und niedriger ATP Konzentration (bis zu etwa 1 µM ATP) ein stabiles Leuchten (Lundin et. al., Optimised Bioluminescence Assay of Creatine Kinase and Creatine Kinase B- Subunit Activity (1982) Clin Chem 28, 609-614, Lundin et. al., Continous monitoring of ATP converting reactions by purified luciferase (1976) Anal Biochem 75, 611-620). Wird die ATP Substratkonzentration allerdings erhöht, so emittiert das Enzym nur einen initialen Lichtblitz. Die nachfolgende Reaktion ist dann stark gehemmt durch die Produktion von Oxyluciferin und die Lichtemission sinkt auf sehr niedrige Werte ab (Gates and DeLuca, The production of oxyluciferin during the firefly luciferase light reaction (1975) Arch Biochem Biophys 169, 616-621). Erneute Zugabe von ATP und D-luciferin kann das Enzym nicht zu erneuter Emission von Blitzen anregen. Nur die Messung bei konstant niedriger Enzymaktivität kann zum quantitativen Nachweis von ATP benutzt werden, da hier ein linearer Zusammenhang zwischen ATP und Lichtintensität hergestellt werden kann (Lundin et. al., Continous monitoring of ATP converting reactions by purified luciferase (1976) Anal Biochem 75, 611-620). Dagegen ist die Enzymaktivität nach einem initialen Lichtblitz nicht mehr zum quantitativen Messung von ATP geeignet.

Interessanterweise stimmen diese Formen der in vitro Lichtemission nicht mit dem natürlichen Signalrepertoire der Leuchtkäfer überein. So finden sich einerseits Käfer, die mittels artspezifischer Lichtblitze kommunizieren und andere, die mit Dämmerungsbeginn über viele Stunden glühen. Da die DNA von Luciferasen aus blitzenden sowie glühenden Käfern große Sequenzhomologien aufweist, wurden Unterschiede in der Luciferase Aminosäuresequenz als Grund für die unterschiedlichen Lichtsignale ausgeschlossen (Sala-Newby et. al., Sequence and biochemical similarities betwenn the luciferases of the glow-worm Lampyris notiluca and the firefly Photinus pyralis (1996) Biochem J 313, 761-767). Es ist vielmehr so, daß alle Käferluciferasen eine einheitliche biochemische Reaktion katalysieren und die Unterschiede in der Aminosäuresequenz lediglich zur Emission von Licht mit unterschiedlicher Wellenlänge führen (Wood et. al., Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors (1989) Science 244, 700-702).

Mehrere Mechanismen zur Regulation der in vivo Lichtproduktion wurden vorgeschlagen (Buck and Case, Control of flashing in fireflies. I. The lantern as neuroeffector organ. (1961) Biol Bull 121, 234-256, Case and Buck, Control of flashing of fireflies. II. Role of the central nervous system. (1963) Biol Bull 125, 234-250, Oertel et. al., Ultrastructure of the larval firefly light organ as related to control of light emission (1975) Cell Tiss Res 164, 27-44). Es ist bekannt, daß das Glühen oder Blitzen von verschiedenen Leuchtkäfern unter nervaler Kontrolle steht. Verschiedene Beobachtungen stützen diesen Befund. Die Leuchtorgane sind reich innerviert, das periodische Blitzen von Leuchtkäfern wird über ein kurzes Feuern von Aktionspotentialen eingeleitet. Leuchten kann ebenfalls durch künstliche elektrische Stimulation der Nerven hervorgerufen sowie nach Durchtrennung der Nerven zum Erlöschen gebracht werden. Der Neurotransmitter Octopamin stimuliert spezifisch die Adenylat Zyklase in Homogenaten von Leuchtorganen und Octopamininjektionen in intakte Leuchtorgane rufen Leuchten hervor (Nathanson, Cholera toxin, cyclic AMP, and the firefly flash (1985) J Cyclic Nucleotide Protein Phosphor Res 10,157-166, Nathanson, Octopamine receptors; adehine 3'-5'-monophosphate, and neural control of firefly flashing (1978) Science 203, 65-68). Dies deutet an, daß die Lichtproduktion im Leuchtorgan von der Aktivität der Adenylat Zyklase abhängt. Dieses Membranprotein katalysiert die Bildung von zyklischen AMP (cAMP) und Pyrophosphate (PPi). cAMP wird in vielen Zellen als second messenger benutzt und phosphoryliert Zielproteine, die dadurch aktiviert werden. Unerklärlicherweise besitzen weder die Luciferasen aus dem amerikanischen Leuchtkäfer Photinus pyralis noch die Luciferase aus Luciola noctiluca, dem englischen Glühwürmchen, eine Bindungsstelle für cAMP, die auf eine Wechselwirkung mit diesem second messenger schließen läßt (Sala- Newby et. al., Sequence and biochemical similarities betwenn the luciferases of the glow-worm Lampyris notiluca and the firefly Photinus pyralis (1996) Biochem J 313, 761-767). Neben cAMP wurden auch Pyrophosphat (PPi), Coenzym A sowie Cytidintriphosphat als Regulatoren der Luciferaseaktivität in vivo vorgeschlagen, da diese Substanzen die Hemmung der Luciferaseaktivität durch Oxyluciferin verringern (Airth et. al., The function of coenzyme A in luminescence (1958) Biochem Biophys Acta 27, 519-532, Ford et. al., Enhancement of firefly luciferase activity by cytidine nucleotides (1992) Anal Biochem 204, 283-291, McElroy et. al., Mechanism of bioluminescence, chemiluminescence and enzyme function the oxidation of firefly luciferin (1969) Photochem Photobiol 10, 153-170). In Gegenwart von hohen Konzentrationen an ATP und D-luciferin kann jedoch keine der vorgeschlagenen Substanzen Firefly Luciferase zum wiederholten Blitzen anregen.

L-luciferin ist ein starker kompetiver Hemmstoff für D-luciferin. Er wird in geringen Konzentrationen (4% der vorhandenen D-luciferin Konzentration) mit D-luciferin gemischt um die Lichtemission in Anwesenheit von niedrigen ATP Konzentrationen zu stabilisieren (Lundin, Applications of Firefly Luciferase (1982) Luminescent assays: Perspectives in Endocrinology and clinical chemistry Raven Press, New York). Es wurde kürzlich gezeigt, daß Firefly luciferase auch L-luciferin als Substrat zur Lichtemission benutzen kann und daß diese Lichtemission in der völligen Abwesenheit von D-luciferin erfolgt (Lembert, Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light (1996) Biochem J 317, 273-277). Wird Firefly luciferase mit MgATP, inorganischer Pyrophosphatase und L-luciferin präinkubiert, so emlttiert das Enzym zunächst kein Licht. Bei Zugabe von PPi erfolgt jedoch eine Lichtemission. Wiederholte Zugabe von PPi führt dabei zur wiederholten Emission. Die bisherigen experimentellen Daten der L-luciferin und PPi abhängigen Lichtemission korrespondieren jedoch ebenfalls nicht mit dem natürlichen Signalrepertoire unterschiedlicher Leuchtkäfer, da unüblich lange Zeitintervalle zwischen zwei PPi Stimulationen notwendig sind um Blitze gleicher Intensität zu erhalten, da die Lichtblitze länger als in vivo sind und da ein minuten- oder stundenlanges Glühen von hoher Intensität nicht hervorgerufen werden kann (Lembert, Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light (1996) Biochem J 317, 273-277).

Es hat sich jetzt überraschend gezeigt, daß es bereits in vitro möglich ist, die Lichtemission der L-luciferin-Katalyse so an die vorhandene PPi- Konzentration zu koppeln, daß sie vergleichbar dem natürlichen Signalrepertoire unterschiedlicher Käfer wird. Wird Luciferase unter Standardbedindungen (Lembert, Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light (1996) Biochem J 317, 273-277) hinsichtlich pH, Temperatur und Pufferzusammensetzung präinkubiert mit hohen Konzentrationen von L-luciferin (bis 200 µM) und unter physiologischen Bedingungen hinsichtlich ATP (bis 5 mM) und physiologischen, zytoplasmatischen Aktivitäten von Pyrophosphatase PPi-ase (bis zu 20 U/ml), so steuert die Zugabe von PPi die Lichtproduktion in einer Weise, wie sie typischerweise second messengern zugeschrieben wird. PPi initiiert eine augenblickliche und konzentrationsabhängige Lichtproduktion, die so lange andauert wie PPi vorhanden ist. Sowohl wiederholtes kurzes Blitzen mit hoher Frequenz als auch lang­ anhaltendes Glühen über viele Minuten können erzeugt werden. Diese Reaktionsbedingungen sind auf intakte, luciferaseenthaltende Zellen übertragbar, da ATP und PPi-ase bereits vorliegen und die intrazelluläre L-luciferinkonzentration leicht manipuliert werden kann. Da L-Luciferin relativ hydrophob ist und bei physiologischem pH nur schwach dissoziert vorliegt, passiert es die Zytoplasmamembran durch Diffusion und reichert sich im Zytoplasma an. Die Kontrolle der intrazellulären L-luciferinkonzentration ist dabei durch Variation der Konzentration im extrazellulären Nährmedium während des Experiments möglich. Zum Erreichen einer konstanten L-luciferinkonzentration und um Diffusion von zytoplasmatischem Luciferin aus der Zelle zu vermeiden, sollte die L-luciferin Konzentration im Nährmedium während der Inkubation möglichst konstant gehalten werden.

Da erstmals mit L-luciferin und PPi eine Lichtemission hervorgerufen werden kann, die dem natürlichen Signalrepertoire verschiedener Leuchtkäfer entspricht, kann man davon ausgehen, daß PPi auch in den Leuchtorganen der second messenger ist, der Luciferasen aktiviert. Da Luciferase heute routinemäßig in beliebige andere Zellen importiert oder exprimiert wird, kann die durch Zellaktivierung hervorgerufene PPi-Produktion und die davon abhängige Lichtproduktion in Gegenwart von L-luciferin bioluminometrisch untersucht werden. Import und/oder Expression von Luciferase können durchgeführt werden an eukaryotischen und prokaryotischen Zellen sowie Pilzen. Vielfache Beispiele von Luciferase enthaltenden Zellen (z. B. verschiedene Zellinien normaler oder entarteter Zellen) finden sich heute bereits in Produktkatalogen spezialisierter Firmen. Zellen können aber auch erhalten werden aus embryonalen oder ausdifferenzierten Organen von Tieren unterschiedlicher Entwicklungshöhe. Der Gebrauch menschlicher Zellen ist grundsätzlich ebenfalls möglich.

Dies erlaubt es, die Rolle eines neuen second messengers in intakten Zellen zu studieren und die Effekte unterschiedlicher Substanzen auf die intrazelluläre PPi Produktion im Zusammenhang mit einer Zellstimulierung zu erfassen.

Zellaktivierungen, die zur Freisetzung von PPi führen, können ausgelöst werden durch verschiedene physikalische Kräfte und chemische Stoffe.

Einen elektrischen Sinn findet man z. B. bei bestimmten Fischen, die zur Orientierung ein schwaches elektrisches Feld aufbauen und die Änderung des sie durchsetzenden elektrischen Stromes über Rezeptoren wahrnehmen (Penzlin (1981) Lehrbuch der Tierphysiologie, 434-436). Die Wechselwirkung von elektromagnetischen Wellen wie z. B. sichtbarem Licht mit Stäbchen und Zapfen der Retina führt zur Gyanylat Zyklase Aktivierung und damit zur PPi Produktion (Stryer (1988) Biochemie, 1063-1076). Die Wirkung von magnetischen Feldern auf Leukozyten führt zum Anstieg von cytoplasmatischen Ca²⁺ durch Rezeptorreizung, (Lindström et. al., Intracellular calcium oscillations in a T-cell line Line after exposure to extremely-low-frequency magnetic fields with variable frequencues and flux densities (1995) Bioelectromagnetics 16, 41-47), ein Effekt der ebenfalls mit PPi Freisetzung in Zusammenhang stehen könnte.

Chemische Stoffe können unspezifisch auf die Zellmembran und deren Proteine einwirken wie beispielsweise Inhalationsnakotika und osmotisch wirksame Laxantien und dabei zur Aktivierung oder Hemmung von membrangebundenen Enzymen und ihrer PPi Produktion beitragen. Chemische Stoffe können aber auch spezifisch über Rezeptoren wirken, die entweder in der Zytoplasmamembran oder zytosolisch liegen können. Von besonderer Bedeutung sind hier der G- Proteingekoppelte Adenylat-Zyklase-Komplex, membrangebundene oder zytosolische Guanylat Zyklase sowie zytosolische Steroidrezeptoren.

Als reizauslösende Substanzen zur Stimulierung der G-proteingekoppelten Adenylat Zyklase kommen infrage Hormone (z. B. Glukagon, Vasopressin, Somatostatin, Prostaglandine, ACTH u. a.), Neurotransmitter (Adenosin, Noradrenalin, Adrenalin, Acetylcholin, VIP, Dopamin, 5-Hydroxytryptamin, Histamin, Glucagon-like peptide (GLP1), Encephalin, Morphin u. a.). So wird z. B. die Insulinsekretion aus β-Zellen durch Adrenalin gesenkt und durch Glukagon gefördert. Da GLP1 die Insulinfreisetzung zusätzlich steigert wird es als Therapiemöglichkeit zur Verminderung der Insulinmenge bei Insulinabhängigen Diabetikern diskutiert.

Guanylat Zyklase kommt vor z. B. in der glatten Muskulatur der Blutgefäße und in den lichtempfindlichen Zellen der Retina. Als reizauslösende Stoffe zur Stimulierung der Guanylat Zyklase mit vasodilatorischer Wirkung wirken natürlicherweise solche Substanzen, die zur intrazellulären NO Produktion in der glatten Muskulatur führen (Acetylcholin, Histamin, Bradykinin, Noradrenalin, ATP, ADP u. a.). Arzneimittelwirkstoffe mit vasodilatorischer Wirkung sind ebenfalls NO Lieferanten und erhöhen so die cGMP und PPi Produktion. Als Wirkstoffe werden hier eingesetzt Nitrate, Nitrite und Molidomin. Vasodilatorisch aktive Substanzen sind von pharmakologischen Interesse bei der Behandlung von koronaren Herzkrankheiten (Angina pectoris) wie auch zur Behandlung von erektiler Dysfunktion und Potenzschwäche. Arzneimittelnebenwirkungen betreffen hier vor allem ungewünschte Guanylat Zyklase Aktivierung in den Perizyten des ZNS (Migräne) sowie in den Stäbchen und Zapfen der Retina (verminderte Lichtwahrnehmung).

Wachstumsfaktoren wirken als Stimulatoren von Steroidrezeptoren die als Transkriptionsverstärker zur DNA und RNA Polymerasenaktivierung und damit zur PPi Produktion beitragen können. Steroidrezeptoren werden auch durch gewisse Entzündungsmediatoren stimuliert. Da erhöhte Translationsaktivität ein Ausdruck von Zellentartung sein kann, kann dies durch eine erhöhte nukleare PPi Produktion meßbar sein.

Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, daß in Luciferase enthaltenden Zellen bisher lediglich intrazelluläres ATP bioluminometrisch gemessen werden kann. Andere Substanzen entziehen sich der zerstörungsfreien bioluminometrischen Messung. Zur Erweiterung des Messpektrums wird deshalb ein bioluminometrisches Verfahren zum zerstörungsfreien Messen der Aktivierung von Zellen vorgeschlagen, das durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist.

• - Luciferase enthaltende Zellen werden mit L-luciferin präinkubiert.
• - Die Emission von Licht kann nach Reizung der Zellen bestimmt werden.

Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - zur Durchführung der Experimente isolierte Zellen, Zellsuspensionen sowie Zellverbände oder Gewebe untersucht werden können.

Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Patentanspruch 3 und 4 um bioluminometrisch den Effekt einer großen Anzahl reizauslösender Effekte und Stoffe untersuchen zu können, da

• - zur Erregung der Zellen verschiedene physikalische und chemische Reize benutzt werden können.
• - Als chemische Reize Hormone und Neurotransmitter sowie deren Analoga, pharmakologische Agonisten und Antagonisten sowie pharmakologische und Arzneimittelwirkstoffe eingesetzt werden können.
• - Als physikalische Reize elektromagnetische Strahlung (z. B. Licht), Strom sowie Magnetfelder eingesetzt werden können.

Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Patentanspruch 5 um die dem jeweiligen Zell oder Gewebetyp optimal angepaßte Methode zum Einbringen der Luciferase auswählen zu können. Diese Methoden sind gekennzeichnet durch

• - den Import von Luciferasen DNA, cDNA, RNA oder auf den Import von Luciferaseprotein selbst. Zur Infektion von DNA oder RNA können Viren oder Retroviren benutzt werden. Als chemischen Methoden zur Transfektion oder zum Einbringen von Luciferaseprotein kommen in Frage Lipofektion, artifizielle Liposome und als physikalische Methoden CaPO4 oder DEAE- Dextran Behandlung, sowie osmotischer Schock. Als physikalischen Methoden eignen sich Mikroinjektion und Elektroporation. Eine weitere Möglichkeit zum Import von DNA/RNA oder Protein stellt die Fusion von entsprechend beladenen Zellen (z. B. Ghosts) mit Zielzellen dar, vermittelt durch physikalische, chemische oder viralen Einflüsse.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile liegen vor allem darin, daß durch die intrazelluläre bioluminometrische PPi Messung eine neue Stoffklasse meßbar wird, die es erstmals erlaubt zerstörungsfrei Zellaktivierungen untersuchen zu können. Dies erleichtert die biochemische Analyse, da der experimentelle Aufwand wesentlich geringer ist als bei traditionellen biochemisch analytischen Methoden, die immer mit der Zerstörung der Zellen verbunden sind. Da zerstörungsfrei gemessen wird, kann der Effekt verschiedener Reize nacheinander oder gleichzeitig in der selben Zelle oder Zellsuspension untersucht werden. Die erfindungsgemäße Anwendung erlaubt es somit schon im Zellmodell pharmakologisch wirksame Substanzen zu erkennen und Arzneimittelwechsel und Nebenwirkungen zu untersuchen. Auch der Einfluß krebsauslösender Substanzen kann untersucht werden. Die Messung am Zellmodell reduziert den Verbrauch an Versuchstieren, insbesondere dann, wenn zur Messung insgesamt nur sehr wenig biologisches Material zur Verfügung steht. Der Vorteil dieser Vorgehensweisen liegt auch darin, daß nicht nur einzelne Zellen, sondern auch Zellsuspensionen eingesetzt werden können. Auf geeigneten Mikrotiterplatten läßt sich die Erfindung auch im industriellen Maßstab anwenden. Es kann so z. B. ein pharmakologisch wirksamer Stoffen aus einer unüberschaubaren Anzahl strukturell verwandter Moleküle, hergestellt beispielweise durch kombinatorische Chemie, mit geringem Aufwand im Massenverfahren gescreent werden.

Claims (5)

1. Bioluminometrisches Verfahren zum zerstörungsfreien Messen der Aktivierung von Zellen dadurch gekennzeichnet, daß

• - Luciferase enthaltende Zellen mit L-luciferin Inkubiert werden.
• - Die Emission von Licht nach Reizung der Zellen bestimmt werden kann.

2. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - zur Durchführung der Experimente isolierte Zellen, Zellsuspensionen sowie Zellverbände oder Gewebe untersucht werden können.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - zur Erregung der Zellen verschiedene physikalische und chemische Reize benutzt werden können

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - als chemische Reize Hormone und Neurotransmitter sowie deren Analoga, pharmakologische Agonisten und Antagonisten sowie pharmakologische und Arzneimittelwirkstoffe eingesetzt werden können.
• - als physikalische Reize elektromagnetische Strahlung (z. B. Licht), Strom sowie Magnetfelder eingesetzt werden können.

5. Verfahren nach einem der oben genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

• - zum Erhalten von intrazellulärer Luciferase Methoden eingesetzt werden können, die auf den Import von Luciferasen DNA, cDNA, RNA oder auf den Import von Luciferaseprotein selbst zielen. Zur Infektion von DNA oder RNA können Viren oder Retroviren benutzt werden. Als chemischen Methoden zur Transfektion oder zum Einbringen von Luciferaseprotein kommen in Frage Lipofektion, artifizielle Liposome und als physikalische Methoden CaPO4 oder DEAE-Dextran Behandlung, sowie osmotischer Schock. Als physikalischen Methoden eignen sich Mikroinjektion und Elektroporation. Eine Weitere Möglichkeit zum Import von DNA/RNA oder Protein stellt die Fusion von entsprechend beladenen Zellen (z. B. Ghosts) mit Zielzellen dar, vermittelt durch physikalische, chemische oder virale Einflüsse.