DE69936136T2

DE69936136T2 - Methode und zusammensetzungen zur luciferase-detektierung in biologischen proben

Info

Publication number: DE69936136T2
Application number: DE69936136T
Authority: DE
Inventors: Christiaan Roelant
Original assignee: Packard Instrument Co Inc
Current assignee: PerkinElmer Health Sciences Inc
Priority date: 1998-01-29
Filing date: 1999-01-18
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2019-01-19
Also published as: WO1999038999A1; EP1060263B1; AU2323399A; DE69936136D1; EP1060263A4; US6171809B1; JP2002501758A; JP4242560B2; EP1060263A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Lumineszenz bei der Analyse biologischer Materialien. Ganz besonders betrifft sie Verfahren, die Reportergen-Techniken einbeziehen, bei denen Zellen exprimiert werden, die eine Luciferase enthalten, und dann durch Reaktionen nachgewiesen werden, die Lumineszenz produzieren.
Man findet Luciferasen in einer Vielfalt von Organismen, einschließlich, unter anderen, Glühwürmchen, Photobakterien, Quallen und Seequallen. Luciferasen können verwendet werden, um Reportergene zu messen. Bei dieser Technologie wird ein Reportergen, wie zum Beispiel ein Polynucleotid, das eine Luciferase kodiert, als Indikator für die Transkription und Translation eines Gens in einem zellulären Expressionssystem verwendet. Das Reportergen ist mit einem Promotor funktionell verbunden, der durch das zelluläre Expressionssystem erkannt wird. in einem typischen Reportergen-Assay wird ein DNA-Vektor, der das Reportergen enthält, in eine Zelle transfiziert, die fähig ist, das Reportergen zu exprimieren. Nachdem ausreichend Zeit für die Expression des Reportergens vergangen ist, wird die Zellmembran aufgebrochen, um das exprimierte Genprodukt freizusetzen. Die notwendigen Reagenzien werden dann zugegeben, um eine Messung der Enzymaktivität des Reportergens zu gestatten. Im Falle, dass eine Luciferase als Reportergen verwendet wird, werden die durch Oxidation eines Substrates, das Luciferin genannt wird, produzierten Lichtphotone gemessen.
Während es sich bei der am häufigsten bei einer Analyse durch Lumineszenz verwendeten Luciferase um Glühwürmchen-Luciferase handelt, können andere Luciferasen verwendet werden. Bei einer derartigen Luciferase handelt es sich um Renilla-Luciferase, die aus Seequallen abgeleitet ist, einem marinen Coelenteraten der Klasse Anthozoa. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von Renilla-Luciferase, entweder allein oder in Anwesenheit von Glühwürmchen-Luciferase. Bisher ist die Verwendung von Renilla-Luciferase als Reporter durch die kurze Zeit der Lichterzeugung beschränkt gewesen, was auch bei Glühwürmchen-Luciferase der Fall gewesen war.
Im US-Patent Nr. 5.618.682, erteilt an die Packard Instrument Company, wurde gezeigt, dass durch die Verwendung bestimmter Reagenzzusammensetzungen die kurze Freisetzung von Licht ("ein Blitz") von der Glühwürmchen-Luciferase auf viele Stunden verlängert werden konnte ("ein Glühen"). Der Vorteil des Verlängerns der Zeit, während der Licht freigesetzt wird, ist, dass es möglich wird, ein Durchmustern mehrerer Proben gleichzeitig auszuführen, was nicht praktikabel ist, wenn der Lichtblitz nur wenige Sekunden oder Minuten dauert. Derartige Reagenzzusammensetzungen sind unter der Handelsmarke LucLite^TM kommerziell sehr erfolgreich gewesen.
Die Freisetzung von Licht durch Biolumineszenz mit Glühwürmchen-Luciferase bezieht die Oxidation eines Substrates, d. h. eines Luciferins, in Anwesenheit von Adenosintriphosphat (ATP) und Sauerstoff ein, um Adenosinmonophosphat (AMP), Pyrophosphat und Kohlendioxid zu produzieren.
Diese Reaktion wird im US-Patent Nr. 4.286.057 veranschaulicht, in dem ein Verfahren zum Messen von Kreatinkinase durch die Reaktion von Adenosindiphosphat mit Kreatinphosphat, die durch Kreatinkinase katalysiert wird und ATP produziert, offenbart wird. Das Produkt ATP wird durch die Reaktion der Glühwürmchen-Lumineszenz gemessen und somit indirekt die Aktivität der Kreatinkinase. Es wurde festgestellt, dass sich eine Zunahme der Lichtdauer durch Zugeben des Reaktionsprodukts AMP ergab, obwohl die Patentinhaber in dem '057 Patent nicht angaben, dass sie eine Glühzeit von mehreren Stunden erhielten, wie es der Patentinhaber in dem '682 Patent tat.
Die Reaktion von Renilla-Luciferase unterscheidet sich von derjenigen der Glühwürmchen-Luciferase darin, dass es sich bei dem Substrat um ein anderes Molekül, Coelenterazin, anstelle des Glühwürmchen-Luciferins handelt, und nur Sauerstoff beteiligt ist.
Kohlendioxid wird wie mit der Glühwürmchen-Luciferase produziert, aber weder ATP noch AMP sind erforderlich. Somit brauchen die verwendeten Reagenzien ATP und AMP, wie sie in der Glühwürmchen-Luciferasereaktion verwendet werden, nicht einzuschließen. Es ist jetzt jedoch entdeckt worden, dass, wenn die in der im '682 Patent gelehrten Glühwürmchen-Luciferasereaktion verwendeten Reagenzien vorliegen, wenn Renilla-Luciferase nachgewiesen wird, die verlängerte Glühzeit, die mit Glühwürmchen-Luciferase erhalten wird, ebenfalls mit Renilla-Luciferase vorliegt. Zur gleichen Zeit wird die produzierte Lichtmenge in einem dualen Assaysystem relativ zu derjenigen der Glühwürmchen-Luciferase um einen Faktor von zehn erhöht.
In einem kommerziell erhältlichen System von der Promega Corporation wird eine duale Reportertechnik verwendet, bei der zuerst ein Assay mit Glühwürmchen-Luciferase durchgeführt wird, wonach die erste Reaktion gequencht wird und ein zweiter Assay mit Renilla-Luciferase durchgeführt wird. Man sagt, dass die für beide Assays erforderliche Gesamtzeit etwa 30 Sekunden beträgt. Somit hängt das Verfahren nicht davon ab, eine lange Glühzeit aufrechtzuerhalten, und die kurze Zeit wird als ein Vorteil des Systems betrachtet. Für Mehrfachdurchmusterungstests mit mehreren Proben gleichzeitig ist eine derartig kurze Zeit nicht wünschenswert. Stattdessen sind viel längerer Glühzeiten vorteilhaft. Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren bereitstellen, um dieses Ziel zu erreichen.
In WO 96/40988, erteilt an die Promega Corporation, werden sowohl einzelne als auch duale Reporterassays diskutiert. Sie sind durch die Verwendung von Quenchmitteln gekennzeichnet, um Nebensignale zwischen benachbarten Probenzellen in einer Platte mit mehreren Zellproben zu verhindern, oder in dualen Assays, um eine erste Reaktion zu stoppen, so dass eine zweite Reaktion ausgeführt werden kann. Man sagt, dass durch die Verwendung dieses Verfahrens genauere einzelne Assays erreicht werden können und dass duale Assays in einer einzelnen Probenzelle ausgeführt werden können. Gemäß den Patentinhabern ist es möglich, einen dualen Assay in etwa 30 Sekunden auszuführen. Somit scheint es, dass die verlängerte Glühzeit, die von den jetzigen Erfindern gewünscht wird, in keiner der beiden Reaktionen vorlag, noch wurde sie als erwünscht betrachtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die folgenden Ausführungsformen gerichtet:

A) Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Renilla-Luciferase in einer Probe durch Messen der Lumineszenz der Probe, umfassend: a) Mischen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie Renilla-Luciferase enthält, mit einem Reagenzgemisch, das Coelenterazin und, als Fänger freier Radikale, Dithiothreitol (DTT) und, als Chelatbildner, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder funktionelle Äquivalente von DTT und EDTA enthält, und b) Messen der durch das Gemisch nach (a) produzierten Lumineszenz, wobei die Lumineszenz eine verlängerte Glühzeit von mindestens einer Stunde aufweist, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert.
B) Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von sowohl Glühwürmchen-Luciferase als auch Renilla-Luciferase in einer Probe durch Messen der Lumineszenz der Probe, umfassend: a) Mischen der Probe mit einem ersten Reagenzgemisch, das Glühwürmchen-Luciferin, Adenosintriphosphat (ATP), für Glühwürmchen-Luciferaseaktivität notwendige Kofaktoren, Dithiothreitol (DTT) oder funktionelle Äquivalente davon und Adenosinmonophosphat (AMP) enthält, wobei die Mengen des Glühwürmchen-Luciferins, des ATPs, der Kofaktoren, des DTTs oder Äquivalentes und des AMPs ausreichend sind, um Lumineszenz mit einer Dauer von mindestens einer Stunde und einer Intensität, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert, zu produzieren, und b) Messen der Lumineszenz, die durch das Gemisch nach (a) produziert wird, c) Zugeben eines zweiten Reagenzgemisches, umfassend eine Pufferlösung, die Coelenterazin und, als Chelatbildner, EDTA oder funktionelle Äquivalente davon enthält, zum Gemisch nach (a) nach dem Messen nach (b), und d) Messen der Lumineszenz, die durch die Zugabe von (c) produziert wird, wobei die Lumineszenz eine höhere Intensität als die in (b) gemessene und eine verlängerte Glühzeit von mindestens einer Stunde aufweist und wobei sie im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert.
C) Assaykit zum Nachweisen von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase in einer Probe, umfassend a) ein erstes Reagenzgemisch zur Zugabe zu der Probe zum Nachweisen von Glühwürmchen-Luciferaseaktivität, wobei das Reagenzgemisch Glühwürmchen-Luciferin, ATP, für Glühwürmchen-Luciferaseaktivität notwendige Kofaktoren, als Fänger freier Radikale Dithiothreitol (DTT) oder funktionelle Äquivalente davon und Adenosinmonophosphat (AMP) enthält, wobei die Mengen des Glühwürmchen-Luciferins, des ATPs, der Kofaktoren, des DTTs oder Äquivalentes und des AMPs ausreichend sind, um Lumineszenz mit einer Dauer von mindestens 1 Stunde und einer Intensität, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert, zu produzieren, und b) ein zweites Reagenzgemisch zur Zugabe zu der Probe, nachdem die Aktivität der Glühwürmchen-Luciferase nachgewiesen worden ist, wobei das zweite Reagenzgemisch eine Pufferlösung, die Coelenterazin und, als Chelatbildner, EDTA oder funktionelle Äquivalente davon umfasst, wobei die Mengen des Coelenterazins und des EDTAs oder funktionellen Äquivalentes davon ausreichend sind, um eine Glühlumineszenz mit einer höheren Intensität als die der Lumineszenz nach (a) und einer bis zu mindestens einer Stunde verlängerten Glühzeit zu produzieren, wobei sie im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert.

In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Analysieren biologischer Proben auf die Anwesenheit von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase zusammen oder auf Renilla-Luciferase allein bereit. Eine Reagenzzusammensetzung wird zugegeben, die Verbindungen einschließt, die ausgewählt sind, um eine Lumineszenz mit verlängertem Glühen statt einer Blitz-Lumineszenz zu produzieren. Zum Nachweis von Glühwürmchen-Luciferase sind Glühwürmchen-Luciferin, ATP und AMP erforderlich. Zum Nachweis von Renilla-Luciferase ist das entsprechende Luciferin, Coelenterazin, erforderlich. Zusätzlich kann die Zusammensetzung Fänger freier Radikale wie zum Beispiel Dithiothreitol (DTT), Chelatbildner wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Detergenzien wie zum Beispiel Triton^® N-101 (Nonylphenoxypolyethoxyethanol), Puffer wie zum Beispiel HEPES, N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N¹-[2-ethansulfonsäure] und Protease-Inhibitoren wie zum Beispiel Phenylessigsäure (PAA) und Oxalsäure (OA) einschließen.
In einer Ausführungsform wird eine Probe, von der vermutet wird, dass sie Renilla-Luciferase enthält, mit einem Reagenzgemisch gemischt, das Coelenterazin, als Fänger freier Radikale DTT und als Chelatbildner EDTA oder funktionelle Äquivalente von DTT und EDTA enthält. Wahlweise kann das Gemisch ein oder mehrere Detergenzien, Puffer und Protease-Inhibitoren einschließen. Die Lumineszenz wird durch Verfahren gemessen, die Fachleuten bekannt sind, wie zum Beispiel dem von der Packard Instrument Company, Inc., Downers Grove, Illinois, erhältlichen TopCount^TM Szintillations- und Lumineszenz-Zählgerät für Mikroplatten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten je 100 ml des Reagenzgemisches etwa 0,2–30 mg Coelenterazin, etwa 200–2000 mg DTT und etwa 0,05–100 mg EDTA. Bei dem Coelenterazin kann es sich um natives Coelenterazin oder um ein Analogon, wie zum Beispiel m-, e-, v- oder f-Coelenterazin handeln. Das Reagenz kann wahlweise einen Protease-Inhibitor wie zum Beispiel Phenylessigsäure (PAA) oder Oxalsäure (OA) und ein Detergenz wie zum Beispiel Nonylphenoxypolyethoxyethanol enthalten.
In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von sowohl Glühwürmchen- als auch Renilla-Luciferasen in einer einzigen Probe. Die Glühwürmchen-Luciferase wird gemessen, indem zu der Probe ein Reagenzgemisch gegeben wird, das Glühwürmchen-Luciferin, Adenosintriphosphat (ATP), für Glühwürmchen-Luciferaseaktivität notwendige Kofaktoren, wie zum Beispiel Mg⁺² und Ca⁺², Dithiothreitol (DTT) oder funktionelle Äquivalente davon und Adenosinmonophosphat (AMP) in Mengen enthält, die ausgewählt sind, um eine Lumineszenz mit einer Dauer von mindestens 1 Stunde und einer Intensität zu produzieren, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert, und indem die Lumineszenz, die produziert wird, gemessen wird. Wahlweise kann das Gemisch ein oder mehrere Detergenzien, Puffer, und Protease-Inhibitoren einschließen. Nach der Messung der Menge an Glühwürmchen-Luciferase in der Probe wird eine Pufferlösung, die Coelenterazin und EDTA oder dessen funktionelles Äquivalent enthält, zugegeben. Die produzierte Lumineszenz wird wie vorher gemessen und zu der in der Probe vorliegenden Menge Renilla-Luciferase in Beziehung gesetzt. Bei dem Coelenterazin kann es sich um natives Coelenterazin oder um ein Analogon, wie zum Beispiel m-, e-, v- oder f-Coelenterazin handeln. EDTA wird in einer Molarität zwischen etwa 10 μM und 10 mM verwendet, und der pH-Wert wird zwischen 6 und 8,5 aufrechterhalten. Vorzugsweise liegt das Coelenterazin in einer Konzentration von 2–5 μM in einer Pufferlösung mit 1–10 mM EDTA mit einem pH-Wert zwischen 7,2–8,0 vor.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Reagenzzusammensetzungen und Testkits zum Ausführen der Verfahren der Erfindung. In einer Anwendung handelt es sich bei der Erfindung um einen Assaykit zum Nachweis G Protein-gekoppelter Reaktionen unter Verwendung des dualen Glühsignals, das durch Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase produziert wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Assaykit zum Nachweis von Transduktionswegen mit zwei Signalen innerhalb der gleichen Zelle verwendet werden, zum Beispiel, um Klone mit selektiven Agonisten durchzumustern. Alternativ dazu kann der Assaykit verwendet werden, um Verbindungen oder Arzneistoffe gegen zwei Rezeptoren zu analysieren, die in der gleichen Vertiefung einer Mikrotiterplatte ausplattiert oder auf einem festen Träger aufgetragen sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1a–d veranschaulichen die Renilla- und Glühwürmchen-Lumineszenz von mit Forskolin stimulierten Zellen.
Die 2a–d veranschaulichen die Renilla- und Glühwürmchen-Lumineszenz von mit Isoprenalin und Vasopressin stimulierten Zellen.
BESCHREIBUNG DER VERANSCHAULICHENDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN Lumineszenzreaktionen
Die mit Glühwürmchen-Luciferase zusammenhängende Lumineszenz bezieht eine Reaktion ein, bei der ein Substrat, Luciferin, mit ATP und Sauerstoff in Anwesenheit eines Kofaktors, wie zum Beispiel Mg⁺², reagiert, um eine oxidierte Form des Luciferins, AMP, Pyrophosphat, Kohlendioxid und Licht zu produzieren. Die Lichtmenge wird gemessen, um die Menge vorliegender Luciferase zu bestimmen. Es ist typisch für diese Reaktion, dass das Licht als kurzer Blitz erscheint. Während er gemessen werden kann, ist es in vielen Fällen, wo mehrere Proben gleichzeitig durchmustert werden, nicht günstig, es zu tun. Im US-Patent Nr. 5.618.682 offenbarte Scheirer eine optimale Zusammensetzung für das Reaktionsgemisch, die den Vorteil hat, den Lichtblitz zu verlängern, so dass er zu einem Glühen wird, das eine Stunde lang oder mehr dauert. Diese Zusammensetzung ist unter der Handelsmarke LucLite^TM von der Packard Instrument Company erhältlich und hat einen deutlichen Erfolg erreicht. Das Reaktionsgemisch schließt AMP und andere Verbindungen ein, welche die verlängerte Glühzeit bereitstellen, insbesondere den Fänger freier Radikale Dithiothreitol (DTT), den Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Protease-Inhibitoren wie zum Beispiel Phenylessigsäure oder Oxalsäure. Funktionelle Äquivalente dieser Verbindungen können verwendet werden. Ein Detergenz kann vorliegen, falls Zellen lysiert werden sollen, auch ein pufferndes Mittel, wie zum Beispiel HEPES, kann verwendet werden. Es ist jetzt festgestellt worden, dass diese Zusammensetzung eine verlängerte Glühzeit produziert, wenn ein dualer Assay ausgeführt wird, bei dem die erste Reaktion durch die Glühwürmchen-Luciferase und die zweite durch Renilla-Luciferase katalysiert wird.
Die Luciferinverbindung, die als Substrat für die Licht produzierende Reaktion dient, die durch Renilla-Luciferase katalysiert wird, unterscheidet sich in ihrer chemischen Struktur von dem Luciferin, das unter Einfluss von Glühwürmchen-Luciferase reagiert. Der allgemeine Name für diese Verbindung ist Coelenterazin. Es oxidiert auch, um Licht und Kohlendioxid zu produzieren. Es erfordert jedoch nicht die Anwesenheit von ATP und produziert kein AMP und Pyrophosphat als Koprodukte. Somit würde man nicht voraussagen, dass das im Scheier-Patent offenbarte Reaktionsgemisch eine vorteilhafte Wirkung auf das Licht, das bei der durch Renilla-Luciferase katalysierten Reaktion von Coelenterazin mit Sauerstoff produziert wird, haben würde. Der jetzige Erfinder hat festgestellt, dass es möglich ist, die Reaktion von Coelenterazin mit Sauerstoff in Anwesenheit einer derartigen Zusammensetzung auszuführen und dass eine verlängerte Glühzeit von mindestens einer Stunde erreicht wird. Darüberhinaus variiert die Glühintensität im Wesentlichen linear mit der Zeit. Dies ist nützlich, wenn ein dualer Assay ausgeführt wird. Jedoch wird die ganze Zusammensetzung nicht benötigt, wenn nur die Reaktion von Coelenterazin mit Sauerstoff ausgeführt werden soll, um die Anwesenheit von Renilla-Luciferase zu bestimmen. In einem derartigen Fall kann eine verlängerte Glühzeit durch Einschließen nur bestimmter wirksamer Mengen von DTT und EDTA oder ihren funktionellen Äquivalenten, wie nachstehend gesehen werden wird, erhalten werden.
Verlängern des Zeitraums für die Lichtemission
Wie vorstehend nahegelegt wurde, kann die Zeit, während der in der durch Glühwürmchen-Luciferase katalysierten Oxidationsreaktion Licht emittiert wird, um viele Stunden und mit einer linearen Abklingcharakteristik verlängert werden, wodurch eine Analyse von vielen Proben in einer Probenplatte mit mehreren Vertiefungen, wie zum Beispiel der von der Packard Instrument Company erhältlichen ViewPlate^TM, gestattet wird. Während es erscheint, dass dies wahrscheinlich ein unerwünschtes Nebensignal zwischen den Probenzellen verursacht, wie in der vorstehend diskutierten Promega-Patentanmeldung nahegelegt wird, sollte angemerkt werden, dass es auch praktikabel (und bei kommerziellen Geräten typisch) ist, dass Korrekturen gemacht werden, um Nebensignaleffekte aus den Ergebnissen zu entfernen.

Zu Proben, die ein exprimiertes Genprodukt einschließlich Glühwürmchen-Luciferase enthalten, wird ein Reagenzgemisch gegeben, von dem ein Beispiel auf je 100 ml einschließen kann:

Glühwürmchen-Luciferin	etwa 0,2–30 mg
DTT	etwa 200–2000 mg
EDTA	etwa 0,05–100 mg
AMP	etwa 0,2–30 mg
ATP	etwa 10–300 mg
PAA (wahlweise)	etwa 1–6 mg
OA (wahlweise)	etwa 0,5–1 mg
HEPES (wahlweise)	etwa 50–1000 mg
Triton N-101 (wahlweise)	etwa 50–100 mg
	(Nonylphenoxypolyethoxyethanol)

Von diesen wird die Anwesenheit von DTT und AMP beim Bereitstellen einer verlängerten Glühzeit für am wichtigsten gehalten. Während von jeder dieser Verbindungen in der Literatur berichtet worden ist, war die Zusammensetzung des '682-Patents darin einzigartig, dass sie eine verlängerte Glühzeit von mindestens einer Stunde und einen im Wesentlichen linearen Lichtertrag möglich machte, die früher nicht erhältlich waren. Sogar längere Glühzeiten sind möglich.
Bei Dithiothreitol (DTT) handelt es sich um einen bevorzugten Radikalfänger. Andere, die als funktionelle Äquivalente betrachtet werden, schließen Hydrosulphydrylverbindungen, wie zum Beispiel Dithioerythritol, Glutathion, Cystein, -SH enthaltende Aminosäuren, Coenzym A, Betamercaptoethanol und dergleichen, ein. Derartige Verbindungen erhöhen die Dauer einer nachweisbaren Photonemission und, wie in dem '682-Patent gezeigt, kann DTT das emittierte Licht tatsächlich vermehren.
Bei Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) handelt es sich um einen bevorzugten Chelatbildner. Andere, die als funktionelle Äquivalente betrachtet werden, schließen, unter anderem, Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether) und N,N,N¹,N¹-Tetraessigsäure (EGTA) ein. Derartige Verbindungen neigen dazu, Mg⁺², Ca⁺² und andere divalente Kationen zu binden, bei denen es sich um notwendige Kofaktoren für Glühwürmchen-Luciferaseaktivität handelt. Die Menge an EDTA oder Äquivalent, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist signifikant weniger als durch die vorstehend diskutierte Patentanmeldung von Promega nahegelegt wird, in der gezeigt wird, dass große Mengen EDTA die Glühwürmchen-Luciferasereaktion quenchen können.
Bei Phenylessigsäure (PAA) und Oxalsäure (OA) handelt es sich um die bevorzugten Protease-Inhibitoren. Andere in Betracht gezogene funktionelle Äquivalente schließen Monensin, Acetylphenylalanin, Leupeptin, Ammoniumchlorid und Oprotinin ein. Derartige Verbindungen beschränken die Inaktivierung von Luciferasen mit den Zelllysaten durch endogene Proteasen und verlängern dadurch die Zeit, in der Licht emittiert wird.
Detergenzien wie zum Beispiel Nonylphenoxypolyethoxyethanol werden verwendet, um Zellen zu lysieren. Sie können in den Reagenzien der Erfindung verwendet werden, obwohl Detergenzien nicht notwendig sind, falls die Luciferase frei ist, statt aus Zellen exprimiert zu werden.
Der pH-Wert der Probe ist ein Faktor bei der Oxidation von Luciferinen. Dementsprechend können puffernde Mittel, wie zum Beispiel HEPES, N-[2-Hydroxyethyl]- piperazin-N¹-[2-ethensulfonsäure], eingeschlossen werden, um den pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs aufrechtzuerhalten.
BEISPIELE
Ein Kit für den aufeinanderfolgenden Nachweis von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase wurde hergestellt, der aus einem Assayreagenz für Glühwürmchen-Luciferase und einem Assayreagenz für Renilla-Luciferase bestand.
Das Reagenz für Glühwürmchen-Luciferase bestand aus AMP, EDTA, Glühwürmchen-Luciferin, ATP, DTT, Phenylessigsäure und Oxalsäure, wie ursprünglich im US-Patent Nr. 5.618.682 beschrieben.
Das Reagenz für Renilla-Luciferase bestand aus 5 μM Coelenterazin in 2 mM EDTA-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5.
Stabile Säugerzelllinien, die mit auf c-AMP reagierenden Reportergenen transfiziert waren, die entweder die Glühwürmchen- oder Renilla-Luciferase-Reporterproteine (CRE-Glühwürmchen und CRE-ren) enthielten, wurden erzeugt.
Als nächstes wurden die CRE-Glühwürmchen-Zellen weiter mit dem menschlichen Vasopressinrezeptor V2 transfiziert und CRE-ren-Zellen wurden mit dem menschlichen beta-2-Adrenorezeptor transfiziert. Bei diesen Rezeptoren handelt es sich um Mitglieder der Superfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren, die mit der stimulatorischen alpha-Einheit des G Proteins in Wechselwirkung treten.
CHO-Zellen (Ovarzellen des chinesischen Hamsters), die Glühwürmchen-Luciferase und/oder Renilla-Luciferase produzieren, werden in Gewebekulturflaschen gezüchtet und bis zu 90% Konfluenz wachsen gelassen. Vierundzwanzig Stunden vor dem Assay werden die Zellen in serumfreiem Medium, das 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) enthält, ruhiggestellt. Unmittelbar vor dem Assay, werden Zellen mit HBSS/EDTA (Hanks balancierte Salzlösung, die EDTA enthält) entnommen, zentrifugiert und in 10 ml Phenolrot-freiem und serumfreiem Medium, ergänzt mit 1 mg/ml BSA, resuspendiert. Als nächstes werden die Zellen in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit 90 μl/Vertiefung ausplattiert und in den Inkubator zurückgestellt. Nach 1 Stunde werden 10 μl der Testverbindung, in entweder Wasser oder Phenolrot-freiem Medium zubereitet, zugegeben. Die Mikroplatten werden dann weitere 4 Stunden lang inkubiert. Schließlich wird das Nachweisreagenz für Glühwürmchen-Luciferase zubereitet und 100 μl dieser Nachweislösung werden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 10 Minuten wird die Mikroplatte auf Glühwürmchen-Luciferaseaktivität gezählt. Als nächstes werden zu jeder Vertiefung 100 μl/Vertiefung 5 μM Coelenterazin in 2 mM EDTA-Pufferlösung gegeben. Die Platte wird 15 Minuten lang im Dunkeln gelassen und dann auf Renilla-Luciferaseaktivität gezählt.
BEISPIEL 1
Stabilität der Lumineszenz der Renilla-Luciferase
CRE-ren Zellen wurden mit 10 μM Forskolin stimuliert, einer Verbindung, welche die Adenylcyclase direkt aktivert, um eine Erhöhung des interzellulären cAMP-Spiegels zu verursachen. Um die Art der Forskolin-Reaktion zu untersuchen, wurden CRE-Glühwürmchen und CRE-ren Zellen gemischt und in einzelne Vertiefungen einer schwarzen ViewPlate^TM (Packard Instrument Company) mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve für Forskolin wurde konstruiert und Zellen wurden entweder mit dem Glühwürmchen-Nachweisreagenz oder dem Nachweisreagenz für Renilla-Luciferase analysiert. Die Assayplatten wurden 15 oder 160 Minuten nach Reagenzzugabe in einem TopCount^TM Lumineszenz-Zählgerät (Packard Instrument Company) gezählt. Die EC50 (wirksame Konzentration, um 50% Aktivität zu produzieren) für eine Forskolin-Aktivierung der eAMP-Reportergene war zu allen Zeitpunkten und sowohl mit den Reportergenen für Renilla- als auch für Glühwürmchen-Luciferase ähnlich. Wie in den 1a–d gezeigt wird, war die Art der Glühwürmchen-Lumineszenz 15 und 160 Minuten nach Reagenzzugabe identisch, was die Stabilität des Nachweisreagenzes für Glühwürmchen-Luciferase demonstriert. Nach Zugabe des Renilla-Nachweisreagenzes zu diesen Platten wird die Glühwürmchen-Luciferasereaktion teilweise gequencht und die Renilla-Luciferasereaktion wird aufgedeckt. Während die luminometrische Reaktion der Renilla-Luciferase von 3,5 × 10⁶ bei 15 Minuten auf 1,8 × 10⁶ bei 160 Minuten abklingt, bleibt die EC50 für eine Forskolin-Stimulation der Adenylcyclase ähnlich. Darüberhinaus ist die mit der Zusammensetzung dieser Erfindung erzeugte Renilla-Lumineszenz 10-mal heller als das durch die Glühwürmchen-Luciferase erzeugte Lichtsignal.
BEISPIEL 2
Verwendung von Nachweisreagenzien für die Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase, um das Rezeptor-Signalisieren zu charakterisieren
CRE/Glühwürmchen/V2 und CRE/ren/beta2 Zellen wurden gemischt und in einzelne Vertiefungen einer schwarzen ViewPlate mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Dosis-Wirkungs-Kurven auf den V2-Agonisten Vasopressin und den beta2-Agonisten Isoprenalin wurden mit Glühwürmchen-Luciferase konstruiert, um die Isoprenalinaktivität zu bestimmen. Nach der Zugabe des Nachweisreagenzes für Glühwürmchen-Luciferase wurde gesehen, dass Vasopressin den V2-Rezeptor mit einer EC50 von 11 nM aktivierte (2a). Wie in 2b gezeigt wird, stimulierte Vasopressin die Renilla-Lumineszenz nicht. Nach der anschließenden Zugabe des Renilla-Nachweisreagenzes zu den gleichen Zellen wurde die Reaktionskurve auf Vasopressin abgeflacht (2c) und eine Dosis-Wirkungs-Kurve auf Isoprenalin wurde mit einer EC50 von 0,11 nM aufgedeckt (2d).
BEISPIEL 3
Durchmustern von Verbindungen mit kombinierter luminometrischer Glühmessung von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase
CRE/Glühwürmchen/V2 und CRE/ren/beta2 Zellen wurden gemischt und in einzelne Vertiefungen einer schwarzen ViewPlate mit 96 Vertiefungen ausplattiert und eine Reihe von Verbindungen wurde auf diese Zellen angewendet. Nach dem Assay mit dem Nachweisreagenz für Glühwürmchen-Luciferase wurden Reaktionen mit den V2 Rezeptor-Agonisten Vasopressin und Desmopressin erhalten. Wie erwartet wurde eine Glühwürmchen-Luciferasereaktion mit Forskolin und auch mit Thyrocalcitonin erhalten (CHO Zellen exprimieren einen endogenen Calcitonin-Rezeptor). Nach der Zugabe des Nachweisreagenzes für Renilla-Luciferase war das durch Vasopressin und Desmopressin erzeugte Lumineszenzsignal nicht signifikant höher als der Grundwert. Ein lumineszentes Signal wurde mit Forskolin und Thyrocalcitonin aufrechterhalten und wurde jetzt nach einer Stimulation mit Isoprenalin gesehen. Also demonstriert der Assay richtig, dass es sich bei Vasopressin und Desmopressin um Agonisten am V2-Rezeptor handelt, bei Isoprenalin um einen beta2-Adrenorezeptor-Agonisten handelt und dass Forskolin und Thyrocalcitonin auf CHO-Zellen wirken, um eine endogene Reaktion zu erzeugen. Bei Glutamat, Nociceptin und Serotonin handelt es sich nicht um an diesen Zellen wirksame Agonisten.

Claims

Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Renilla-Luciferase in einer Probe durch Messen der Lumineszenz der Probe, umfassend: a) Mischen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie Renilla-Luciferase enthält, mit einem Reagenzgemisch, das Coelenterazin und, als Fänger freier Radikale, Dithiothreitol (DTT) und, als Chelatbildner, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder funktionelle Äquivalente von DTT und EDTA enthält, und b) Messen der durch das Gemisch nach (a) produzierten Lumineszenz, wobei die Lumineszenz eine verlängerte Glühzeit von mindestens einer Stunde aufweist, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich um ein Verfahren zur Verwendung in einem Mehrfachdurchmusterungstest mit mehreren Proben gleichzeitig handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Zelle umfasst, die Renilla-Luciferase produziert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenzgemisch nach (a) auf je 100 ml etwa 0,2–30 mg Coelenterazin, etwa 200–2000 mg DTT und 0,05–100 mg EDTA enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenzgemisch nach (a) ferner einen Protease-Inhibitor enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Protease-Inhibitor um Phenylessigsäure oder Oxalsäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Reagenz ferner ein Detergenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Detergenz um Nonylphenoxypolyethoxyethanol handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz ferner einen Puffer enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Puffer um HEPES handelt.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von sowohl Glühwürmchen-Luciferase als auch Renilla-Luciferase in einer Probe durch Messen der Lumineszenz der Probe, umfassend: a) Mischen der Probe mit einem ersten Reagenzgemisch, das Glühwürmchen-Luciferin, Adenosintriphosphat (ATP), für Glühwürmchen-Luciferaseaktivität notwendige Kofaktoren, Dithiothreitol (DTT) oder funktionelle Äquivalente davon und Adenosinmonophosphat (AMP) enthält, wobei die Mengen des Glühwürmchen-Luciferins, des ATPs, der Kofaktoren, des DTTs oder Äquivalentes und des AMPs ausreichend sind, um Lumineszenz mit einer Dauer von mindestens einer Stunde und einer Intensität, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert, zu produzieren, und b) Messen der Lumineszenz, die durch das Gemisch nach (a) produziert wird, c) Zugeben eines zweiten Reagenzgemisches, umfassend eine Pufferlösung, die Coelenterazin und, als Chelatbildner, EDTA oder funktionelle Äquivalente davon enthält, zum Gemisch nach (a) nach dem Messen nach (b), und d) Messen der Lumineszenz, die durch die Zugabe von (c) produziert wird, wobei die Lumineszenz eine höhere Intensität als die in (b) gemessene und eine verlängerte Glühzeit von mindestens einer Stunde aufweist und wobei sie im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das erste Reagenzgemisch auf je 100 ml etwa 0,2–30 mg Glühwürmchen-Luciferin, etwa 200–2000 mg DTT, etwa 0,2–30 mg AMP und etwa 10–300 mg ATP enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Coelenterazin um natives Coelenterazin oder ein Analogon davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Pufferlösung etwa 10 μM bis 10 mM EDTA enthält und einen pH-Wert von etwa 6–8,5 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Probe um eine Probe handelt, umfassend Zellen, die Glühwürmchen-Luciferase und/oder Renilla-Luciferase produzieren.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das erste Reagenzgemisch ferner ein Detergenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Detergenz um Nonylphenoxypolyethoxyethanol handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das erste Reagenzgemisch nach (a) ferner, als Protease-Inhibitor, Phenylessigsäure oder Oxalsäure oder funktionelle Äquivalente davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das erste Reagenzgemisch ferner einen Puffer enthält.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Puffer um HEPES handelt.
Assaykit zum Nachweisen von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase in einer Probe, umfassend a) ein erstes Reagenzgemisch zur Zugabe zu der Probe zum Nachweisen von Glühwürmchen-Luciferaseaktivität, wobei das Reagenzgemisch Glühwürmchen-Luciferin, ATP, für Glühwürmchen-Luciferaseaktivität notwendige Kofaktoren, als Fänger freier Radikale Dithiothreitol (DTT) oder funktionelle Äquivalente davon und Adenosinmonophosphat (AMP) enthält, wobei die Mengen des Glühwürmchen-Luciferins, des ATPs, der Kofaktoren, des DTTs oder Äquivalentes und des AMPs ausreichend sind, um Lumineszenz mit einer Dauer von mindestens 1 Stunde und einer Intensität, die im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert, zu produzieren, und b) ein zweites Reagenzgemisch zur Zugabe zu der Probe, nachdem die Aktivität der Glühwürmchen-Luciferase nachgewiesen worden ist, wobei das zweite Reagenzgemisch eine Pufferlösung umfasst, die Coelenterazin und, als Chelatbildner, EDTA oder funktionelle Äquivalente davon enthält, wobei die Mengen des Coelenterazins und des EDTAs oder funktionellen Äquivalentes davon ausreichend sind, um eine Glühlumineszenz mit einer höheren Intensität als die der Lumineszenz nach (a) und einer bis zu mindestens einer Stunde verlängerten Glühzeit zu produzieren, wobei diese im Wesentlichen linear mit der Zeit variiert.
Assaykit nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Coelenterazin um natives Coelenterazin oder ein Analogon davon handelt.
Assaykit nach Anspruch 21, wobei die Pufferlösung etwa 10 μM bis 10 mM EDTA enthält und einen pH-Wert von etwa 6–8,5 aufweist.
Assaykit nach Anspruch 21, wobei das erste Reagenzgemisch ferner, als Protease-Inhibitor, Phenylessigsäure oder Oxalsäure oder funktionelle Äquivalente davon umfasst.
Assaykit nach Anspruch 21, der ferner ein Detergenz enthält.
Assaykit nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem Detergenz um Nonylphenoxypolyethoxyethanol handelt.
Assaykit nach Anspruch 21, der ferner einen Puffer enthält.
Assaykit nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Puffer um HEPES handelt.
Verfahren zum Nachweisen von G Protein-gekoppelten Reaktionen, die das Nachweisen eines dualen Glühsignals unter Verwendung des Assaykits nach Anspruch 21 umfassen.
Verfahren zum Nachweisen von Transduktionswegen mit zwei Signalen innerhalb der gleichen Zelle unter Verwendung des Assaykits nach Anspruch 21.
Verfahren zum Analysieren von Verbindungen oder Arzneistoffen gegen zwei Rezeptoren, die in der gleichen Vertiefung einer Mikrotiterplatte ausplattiert oder auf einem festen Träger aufgetragen sind, unter Verwendung des Assaykits nach Anspruch 21.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei Klone mit selektiven Agonisten durchgemustert werden.