DE60203123T2

DE60203123T2 - Photoprotein mit verbesserter Biolumineszenz

Info

Publication number: DE60203123T2
Application number: DE60203123T
Authority: DE
Inventors: Maria Foti; Stefan Lohmer
Original assignee: AXXAM Srl
Current assignee: AXXAM Srl
Priority date: 2002-10-21
Filing date: 2002-10-21
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2022-10-22
Also published as: CA2503145A1; ZA200503197B; KR20050053783A; IL168158A; EP1413584B1; PL376323A1; ATE290016T1; RU2340629C2; ES2237643T3; US20070065818A1; MXPA05004148A; JP4459058B2; US7601805B2; NO20051921L; WO2004035620A1; EP1413584A1; CN1317299C; DE60203123D1; RU2005111772A; JP2006517784A

Description

Die vorliegende Erfindung stellt ein chimäres Photoprotein mit verbesserter Lumineszenz-Aktivität, dessen Verwendung als Calciumindikator in Reporter-Gen-Systemen und in zellbasierten Assays für den Nachweis und die Messung von intrazellulärem Calcium bereit.
Hintergrund der Erfindung
Biolumineszenz ist die Fähigkeit von lebenden Organismen zur Emission von sichtbarem Licht durch eine Vielzahl von chemilumineszenten Reaktionssystemen. Biolumineszenz-Reaktionen erfordern drei Haupt-Komponenten: ein Luciferin, eine Luciferase und molekularen Sauerstoff. Andere Komponenten können jedoch ebenfalls in einigen Reaktionen erforderlich sein, einschließlich Kationen (Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺) und Cofaktoren (ATP, NAD(P)H). Luciferasen sind Enzyme, die die Oxidation eines Substrats, Luciferin, katalysieren und ein instabiles Zwischenprodukt bilden. Licht wird emittiert, wenn das instabile Zwischenprodukt unter Bildung von Oxyluciferin in seinen Grundzustand zurückfällt. Es gibt verschiedene nicht miteinander verwandte Typen von Luciferin, obwohl zahlreiche Arten aus mindestens sieben Phyla dasselbe Luciferin verwenden, welches als Coelenterazin bekannt ist, das einen aus drei Aminosäuren gebildeten Ring enthält (2 Tyrosine, und ein Phenylalanin). In einigen Tieren (z. B. Quallen) kann das Luciferin/Luciferase-System in Form eines stabilen „Photoproteins" extrahiert werden, welches bei Calciumbindung Licht emittiert. Photoproteine unterscheiden sich von Luciferasen dahingehend, dass sie stabilisierte oxygenierte Zwischenprodukt-Komplexe von Luciferase und Luciferin sind. Photoproteine liegen in vielen Meeres-Coelenteraten vor und ermöglichen diesen Organismen, Licht für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich Brut, Fütterung und Verteidigung zu emittieren (1). Während Bakterien Licht kontinuierlich emittieren, tritt in vielen anderen Organismen Lumineszenz in Blitzen auf, typischerweise von 0,1 bis 1 Sekunde Dauer. Dies erfordert ein schnelles Anschalten/Abschalten der enzymatischen Reaktion und die Gegenwart von Reagenzien, die in geeigneter Weise abgesondert werden und für die schnelle Mobilisierung bereit sind. In Coelenteraten wird das Blitzen durch Calciumeintritt verursacht. Die Calciumbindungsstellen von Photoproteinen sind homolog zu Calmodulin. In Gegenwart von Calcium emittieren Photoproteine sichtbares Licht durch eine intramolekulare Reaktion. Es gibt viele lumineszente Organismen, jedoch nur sieben Photoproteine, nämlich Thalassicolin (2, 3), Aequorin (4–6), Mitrocromin (syn. Halistaurin) (7, 8), Clytin (syn. mit Phialidin) (8, 9), Obelin (2, 6, 10, 11), Mnemiopsin (12, 13) und Berovin (12, 13), die bisher isoliert wurden. Alle diese Proteine sind Komplexe aus einem Apoprotein, einem Imidazopyrazin-Chromophor (Coelenterazin) und Sauerstoff. Ihre Strukturen sind hoch konserviert, insbesondere in der Region, die die drei Calciumbindungsstellen enthält (EF-Handstrukturen). Diese EF-Handstrukturen sind charakteristisch für die Calciumbindungsprotein-Familie. Das Photoprotein emittiert Licht bei Reaktion mit Calcium, welches fest an die EF-Hand-Tasche bindet. Diese Reaktion ist ein Einzel-Turnover-Event und resultiert in der Freisetzung von CO₂ und der Emission von Licht im blauen Bereich (λ_max = 479 nm). Der Begriff „Photoprotein" identifiziert das Luciferin-gebundene Polypeptid, welches zur Lumineszenz fähig ist, während „Apophotoprotein" verwendet wird, um das Protein ohne Luciferin zu bezeichnen.
Die am meisten untersuchten Photoproteine sind Aequorin, isoliert aus Aequorea victoria (14), und Obelin, isoliert aus Obelia longissima (15). Bei Bindung an Ca⁺⁺ erleidet Aequorin eine Konformationsänderung, und wandelt sich selbst in eine Oxigenase (Luciferase) um, welche dann die Oxidation von Coelenterazin durch den gebundenen molekularen Sauerstoff katalysiert. Das blaue fluoreszierende Protein besteht aus Coelenteramid, welches ein Oxidationsprodukt von Coelenterazin ist, welches nicht kovalent an das Apophotoprotein gebunden ist. Das Photoprotein kann aus dem Apophotoprotein durch Inkubation mit Coelenterazin, molekularem Sauerstoff, EDTA und 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol regeneriert werden. Da Coelenterazin das übliche lumineszente Substrat ist, das von den Photoproteinen Aequorin, Mitrocomin, Clytin und Obelin verwendet wird, ist die Licht emittierende Reaktion in diesen vier Photoproteinen wahrscheinlich dieselbe (16). Die vor kurzem erfolgte Aufklärung der Primärstruktur und der kristallographischen Daten von Aequorin und Obelin ergaben zusätzliche Informationen hinsichtlich ihrer Funktion. Natives Obelin aus dem Hydroid Obelia longissima ist ein einkettiges Protein aus 195 Aminosäureresten (aa) mit einer ungefähren Molekularmasse von 20 kDa, das die nicht-kovalent gebundene chromophore Gruppe Coelenterazin enthält. Die Analyse der Primärstrukturen von Clytin zeigt, dass es 189 aa enthält und zur Familie der Photoproteine gehört. Das hydrozoische Ca⁺⁺-Bindungs-Photoprotein unterscheidet sich von anderen Ca⁺⁺-Bindungs-Photoproteinen wie Calmodulin und Troponin C durch einen relativ hohen Gehalt an Cystein-, Histidin-, Tryptophan-, Prolin- und Tyrosin-Resten.
Photoproteine werden in der Reporter-Gen-Technologie zur Verfolgung der cellulären Ereignisse, die mit der Signaltransduktion und Genexpression zusammenhängen, verbreitet verwendet.
Die Untersuchung von cellulären Ereignissen und ihrer Regulation erfordert empfindliche, nicht-invasive analytische Methoden. Photoproteine und Biolumineszenz im allgemeinen sind hervorragende Reportersysteme, da sie praktisch keinen Hintergrund aufweisen, im Gegensatz zu Fluoreszenz-Systemen.
Photoproteine wurden in Säugerzellen zur Verfolgung der Calciumänderungen als Antwort auf verschiedene Stimuli exprimiert. Die intrazelluläre Calciumkonzentration kann durch Zugabe von Coelenterazin-Cofaktor zu Säugerzellen gemessen werden, die das Photoprotein exprimieren, und durch Nachweis der Photonenemission, die ein Indikator für die intrazelluläre Calciumkonzentration ist.
Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass durch Chimärisierung von Obelin-Protein (Apobelin) durch Ersetzen eines Bereichs davon, der zwischen den ersten beiden Calciumbindungsstellen angeordnet ist, durch eine entsprechende Region des Photoproteins Clytin ein neues Photoprotein mit verbesserter Biolumineszenz erhalten wird.
Wie hier verwendet bedeutet Obelin jedes der Photoproteine, die aus verschiedenen Spezies von Obelia isoliert werden, einschließlich Obelia longissima und Obelia geniculata (17). Ein Referenz-Obelin-Nukleotid und Aminosäuresequenzen sind jeweils in SEQ ID No. 1 und 2 aufgelistet. Referenz Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von Clytin sind bei GenBank unter der Zugangsnummer Q08121 bzw. L13247 hinterlegt.
Eine „entsprechende Region oder Fragment" wie hier verwendet bedeutet jede Aminosäuresequenz im Clytin-Photoprotein, die mit der Obelin-Sequenz in den jeweiligen Sequenzanordnungen übereinstimmt, wobei diese Region oder das Fragment bevorzugt die Reste 42 bis 122, bevorzugter die Reste 50 bis 95, bezogen auf die Obelin-Sequenz überspannt.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das chimäre Protein erhalten durch Ersetzen der Reste 50 bis 94 der Obelin-Aminosäure-Sequenz durch ein Fragment der Clytin-Sequenz von Rest 53 bis 97. Das so erhaltene Photoprotein, das Photina^TM genannt wurde, hat die Aminosäure-Sequenz SEQ ID No. 3.
Die chimären Proteine gemäß der Erfindung können weiter durch Weglassen, Zuführen oder Ersetzen von einem oder mehr Aminosäure-Resten modifiziert werden, vorausgesetzt, dass das Aktivitätsprofil des Photoproteins ausgedrückt als Lichtemission und Calciumempfindlichkeit beibehalten oder erhöht wird. Besonders bevorzugt sind die Substitutionen an den Positionen 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 und 94, bezogen auf die Obelin-Sequenz.
Wie in in vitro-Studien gezeigt, produziert Photina^TM eine intensive Biolumineszenz als Antwort auf Calciumstimulation, die allgemein höher ist als diejenige, die bei natürlichen Photoproteinen beobachtet wird.
Für die Herstellung der chimären Photoproteine wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt, welches Teile der Photoprotein-Kodierungssequenzen enthält, unter Verwendung üblicher Gentechnologie-Methoden hergestellt, wobei das resultierende chimäre Produkt in einen Vektor insertiert, in einem Wirt exprimiert und dann isoliert und gereinigt wird. Beispielsweise können die für Obelin bzw. Clytin kodierenden cDNAs durch PCR amplifiziert oder in vitro mit synthetischen Oligonukleotiden konstruiert werden, und die Produkte können unter Verwendung von geeigneten Restriktionsstellen, die natürlich auftreten, oder in die für die Amplifizierung oder für die in vitro-Konstruktion verwendeten Oligonukleotide eingeführt werden, rekombiniert werden. Der Expressionsvektor kann zusätzlich zu dem rekombinanten Konstrukt einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle, ein Initiationskodon, ein Stoppkodon oder eine Konsensusstelle für Transkriptionsenhancer enthalten. Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker für die Isolierung der das DNA-Konstrukt enthaltenen Wirtszellen umfassen. Geeignete Vektoren sind beispielsweise Hefe oder Bakterienplasmide, Bakteriophagen, Viren, Retroviren oder DNA. Die das rekombinante Konstrukt tragenden Vektoren können in den Wirt mit Hilfe von üblichen Techniken eingeführt werden. Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein wie Bakterien, Hefen oder Säugerzellen. Die bevorzugten Wirte für die Photoprotein-Expression/Produktion sind Säugerzellen, einschließlich Zellen mit Epithel- oder Lymhoblasten-Ursprung wie Hek-293, CHO-K1, HepK2 und HL-60. Diese Zellen können das Apophotoprotein im Cytoplasma (18), in den Mitochondrien durch Zugabe einer mitochondrialen Target-Sequenz zum Photoprotein, oder in jedem anderen Zell-Kompartment exprimieren (19–21). Alternativ können Nicht-Säuger-Zellen wie Bakterien oder Pilze verwendet werden. Wenn der Wirtszelltyp selektiert wurde, können die genetischen Konstrukte durch Calciumphosphat-Ausfällung, Elektroporation oder andere übliche Techniken eingeführt werden. Nach der Transfektion werden die Zellen in geeigneten Medien gezüchtet und hinsichtlich geeigneter Aktivitäten gescreent. Das erfindungsgemäße Photoprotein kann mit üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden wie Extraktion, Ausfällung, Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Elektrophorese.
Punktmutationen können in das chimäre Produkt mit Hilfe von Overlap-Extension-PCR eingeführt werden.
Zur Herstellung von Photina^TM wurde das NdeI/MunI-Fragment des Obelin-Gens durch ein Fragment von 135 Nukleotiden ersetzt, entsprechend der Clytin-Kodierungssequenz, die von Nukleotid 156 bis 291 reicht.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf ein Nukleinsäure-Molekül gerichtet, welches für die hier offenbarten chimären Proteine kodiert. Die DNA-Kodierungssequenzen können mit Hilfe von Degeneration des genetischen Kodes modifiziert werden, beispielsweise durch Austauschen der Kodon-Verwendung zur Verbesserung der Expression in heterologen Systemen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die für das Photina^TM-Protein kodierende DNA-Sequenz aus SEQ ID No. 4 und 5 ausgewählt.
Um zu testen, ob das chimäre Produkt funktionell ist, wurden in vitro-Transkriptions- und Translations-Experimente in einem zellfreien Weizenkeim-Translations-System in Gegenwart von Coelenterazin durchgeführt. In diesen Experimenten wird die Bildung des aktiven Photoproteins aufgezeichnet, indem die Lumineszenz der Translationsmischung nach Zugabe von Calciumionen aufgezeichnet wird. Um die gemessene Lumineszenz mit der Menge des gebildeten Produktes zu korrelieren, wurde eine Translationsreaktion in Gegenwart von ³⁵S-Methionin durchgeführt. Die Menge an neu gebildetem Polypeptid wurde durch Messung der ³⁵S-Methionin-Aufnahme in die Trichloressigsäure-unlösliche Fraktion bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen die Empfindlichkeit und Wirksamkeit von Photina^TM bei der Erzeugung von Biolumineszenz als Antwort auf Calciumionen-Stimulation.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die hier bereitgestellten chimären Proteine als Calciumindikatoren verwendet, insbesondere zur Messung der intrazellulären Calciumkonzentration. In einem typischen Assay wird ein Cofaktor wie Coelenterazin zu Säugerzellen gegeben, die das Photoprotein exprimieren, und die Lichtemission wird durch im Stand der Technik bekannte Methoden aufgezeichnet, beispielsweise durch Verwendung eines kommerziell verfügbaren Luminometers.
Zellen, die sowohl das Photoprotein als auch einen bei der intrazellulären Calciummobilisierung beteiligten Rezeptor exprimieren, können zum Test der Kandidatenmoleküle hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Rezeptormodulation verwendet werden. Das erfindungsgemäße chimäre Photoprotein kann in einer Vielzahl von funktionellen zellbasierten Assays eingesetzt werden, die die Messung von intrazellulärem Calcium zur Beurteilung der Aktivität von Proteinen verwenden, insbesondere G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und Plasmamembran-Ionenkanäle. Obwohl der große und schnelle Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration als Folge der Stimulation von GPCRs und Ionen-Kanälen durch verschiedene Reporter wie Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden kann, ist die Verwendung von Biolumineszenz-Photoproteinen (22) bevorzugt, da dabei Hintergrund im Gegensatz zu Fluoreszenzfarbstoffen praktisch vollständig abwesend ist; darüber hinaus erzeugt die Calciummessung mit Photoproteinen neben der Entwicklung schneller Signale ein hohes Signal-Rauschen-Verhältnis mit einem breiten Bereich der Nachweisempfindlichkeit (22, 23). Zellbasierte funktionelle Assays umfassen typischerweise die Zugabe eines geeigneten Agonisten zu einer Kultur von Zellen, die sowohl GPCRs oder Ionen-Kanäle als auch das Photoprotein exprimieren, und dann die Bestimmung einer Änderung der Calciumkonzentration, beispielsweise eines Calciumanstiegs, der durch entweder schnellen Influx aus extrazellulären Orten oder Freisetzung aus intrazellulären Speichern induziert wird (18), durch Messungen der Photoprotein-Aktivität.
Die Verwendung von Zellen, welche sowohl Photina^TM als auch einen bei der Modulation der intracellulären Calciumkonzentration beteiligten Rezeptor exprimieren, stellt ein gültiges System für die das Screening von Verbindungen hinsichtlich ihrer Effekte auf die Freisetzung von intrazellulären Calcium bereit. High-throughput-screening-Assays können auch unter Verwendung eines Photoproteins entsprechend der Erfindung als Reportersystem ausgerichtet werden. Die Empfindlichkeit des Systems genauso wie sein hohes Signal-Rauschen-Verhältnis ermöglicht die Verwendung von kleinen Assay-Volumina.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Photoprotein mit einem Molekül von analytischem, diagnostischem oder therapeutischem Interesse konjugiert, und das Konjugationsprodukt wird in einem kompetitiven Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung der Menge dieses Moleküls in biologischen Proben verwendet. Beispielsweise kann das Photoprotein chemisch mit einem Hormonprotein konjugiert und in einem Festphasen-Immunoassay mit hormonspezifischen Antikörpern zur Bestimmung der Speichelspiegel des Hormons verwendet werden (24). In einer noch weiteren Ausführungsform wird ein Fusionsprodukt zwischen einem erfindungsgemäßen Photoprotein und einem anderen Polypeptid wie einem Hormon, einem Antigenpeptid, einem leicht- oder schwerkettigem Immunoglubolin, Avidin, Streptavidin oder Protein A mit den bekannten Techniken der Gentechnologie produziert wie in US 6087476 offenbart und in immunodiagnostischen oder Abbildungsverfahren eingesetzt.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung in größerem Detail.
Beschreibung der Zeichnungen
1 Calcium-induzierte Biolumineszenz von neu gebildeten Photoproteinen. Die Photoproteine wurden in einem zellfreien Weizenkeim-System in Gegenwart von Coelenterazin translatiert. Alle Translations-Mischungs-Aliquots wurden während 2 Stunden im Dunkeln bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit CaCl₂ 50 mM beladen und die Lumineszenz während 10 Sekunden aufgezeichnet.
2 Photoprotein-DNA-Translation in Gegenwart von Coelenterazin, wobei die Lumineszenz durch Verdünnen der Reaktionsmischung gemessen wurde. AQ: Aequorin, PH: Photina^TM, OB: Obelin.
3(A) ATP-Dosis-abhängige Lichtemission bei Stimulierung des endogenen ATP-Rezeptors, der von mit Photina^TM-DNA transfizierten CHO-K1-Zellen exprimiert wird. Zell-Transfektion, Isolierung und Photina^TM-Expression wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden mit zwei verschiedenen Konzentrationen von ATP behandelt. (B) Die mit Obelin-DNA transfizierten CHO-K1-Zellen wurden als positive Kontrolle verwendet. Die Lumineszenz wird in RLU (relative Lichteinheiten, relative light units) ausgedrückt.
4 Dosis-abhängige Kurve der Photina^TM-Aktivität in CHO-K1-Zellen, die sowohl mit dem Endothelin-A-Rezeptor als auch mit Photina^TM transfiziert waren. Der Rezeptor wurde durch Injektion von Endothelin mit einer Konzentration von 100 und 500 nM aktiviert.
5 Dosis-abhängige Kurve, erhalten aus Zellen, die das Photoprotein Photina^TM und den Ratten-Vanilloid-Rezeptor 1 (VR1) exprimieren. Der spezifische Agonist, Capsaicin, wurde bei einer Konzentration von 10 und 50 μM verwendet.
Beispiele
1. In vitro-Transkription/Translation von Photoprotein-DNA
Die Translation der Photoproteine wurde in einem zellfreien Weizenkeim-System (TNT-Kit, Promega) durchgeführt, wobei die allgemeinen Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Ungefähr 2 μg DNA wurde für jede in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionsmischung verwendet. Das Translationsvolumen (50 μl) beinhaltete 25 μl des Weizenkeim- Extraktes, 2 μl des Reaktions-Puffers, ein Gemisch von Aminosäuren mit Ausnahme von Methionin, Rnasin und Coelenterazin (40 μM), T7-Polymerase. Die Mischung enthielt auch ³⁵S-Methionin (spezifische Aktivität 1000 Ci/mmol). ³⁵S-Methionin wurde zur Bestimmung der Menge des in vitro hergestellten Photoproteins verwendet. Dazu wurden 5 μl jeder Probe der Translations-Mischung mit TCA in Eis während 30 Minuten ausgefällt, abfiltriert, mit kalter 5%iger TCA und Methanol gewaschen, getrocknet und in Zählerampullen gegeben.
Die Mengen des im zellfreien System gebildeten Photina^TM und Obelin sind in Tabelle I angegeben.
Tabelle I Einbau von radioaktiver Markierung in Produkte der Translation der Photoproteine
2. Photoprotein-Assay
5 und 10 μl der Translationsmischung wurden direkt mit 95 bis 90 μl PBS-Lösung in einer 96-Vertiefungs-Platte gemischt, die in einem Luminometer (Berthold) montiert war. Zum Auslösen der Photoprotein-Lichtemission wurden 50 μl Lösung (50 mM CaCl₂) in die Vertiefung eingespritzt und die Lumineszenz während 10 Sekunden aufgezeichnet.
Die Ergebnisse der in vitro-Translation von Photina^TM-, Obelin- und Aequorin-DNA sind in 1 gezeigt. Die durch Verdünnen der Photoprotein-in-vitro-Translationsreaktionen erhaltenen Lumineszenz-Messungen sind in 2 gezeigt. Der Vergleich der Lumineszenz-Daten mit TCA-Zählungen, die während der Translation mit unterschiedlichen Mengen von Photina^TM und Obelin-DNA erhalten wurden, ist in Tabelle II gezeigt (die gemessene Lumineszenz ist proportional zur Menge an neu hergestelltem Photoprotein).
Tabelle II Gehalt an radiomarkiertem Photoprotein und seine Lumineszenz in der Translationsmischung
3. Beispiele für funktionelle Assay auf Zell-Basis

3.1 Photina^TM-exprimierende Klone wurden durch Transfektion von CHO-K1-Zellen (Materialien und Methoden) erhalten. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert und 10- oder 100fach verdünnt. Als die Zellen zu gut isolierten Kolonien gewachsen waren, wurden die Kolonien auf neue Platten übertragen und auf der Basis ihrer funktionellen Antwort (Lumineszenz-Signal) auf verschiedene Konzentrationen von ATP selektiert, von denen bekannt ist, dass sie den endogenen CHO-Rezeptor stimulieren und die cytoplasmatische Ca⁺⁺-Konzentration erhöhen. Am Ende jedes Experimentes wurden die Zellen durch Perfusion einer TritonX-100 und CaCl₂ enthaltenden Lösung lysiert. Das aktive Photoprotein wurde durch Inkubation der Zellen mit 10 μM Coelenterazin, verdünnt in 2 mM Calcium enthaltendem PBS, im Dunkeln bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre während 3 Stunden rekonstituiert. Zur Messung der Lichtemission wurden die Zellen in Gegenwart von Calcium lysiert, und die emittierte Lumineszenz aufgezeichnet. Die Anzahl der während der ersten 10 Sekunden emittierten Photonen wurde durch das Luminometer integriert und auf den Bildschirm visualisiert. Die mit einem leeren Plasmid transfizierten Zellen oder untransfizierte Zellen (Daten nicht gezeigt) zeigten keine erhöhte Photonen-Emission. Zum Nachweis von Änderungen der Calcium-Konzentration wurde 10, 50 und 100 μM ATP injiziert und die Kinetik der Calcium-Antwort bestimmt. Die erhaltene Kurve ist in 3(A) gezeigt. Eine das Photoprotein Obelin exprimierende Zell-Linie wurde als positive Kontrolle verwendet 3(B).
3.2 Eine den Endothelin A-Rezeptor und Photina^TM exprimierende CHO-Zell-Linie wurde etabliert. Nach Stimulierung mit einem Agonisten induziert dieser Rezeptor einen Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration, die durch die Photina^TM-Lumineszenz gemessen wird. Die Zellen wurden als Einzelschicht in DMEM/F12-Medium, enthaltend 10% fetales Rinderserum (FBS), in einer 96-Vertiefungs-Platte kultiviert. Am Tag des Experimentes wurde das Kulturmedium entfernt, und die Zellen wurden mit 10 μM Coelenterazin in PBS während mindestens 3 Stunden inkubiert. Das Endothelin-Peptid wurde in PBS bei einer Konzentration von 100 und 500 nM verdünnt. Ungefähr 50 μl Endothelin wurden in jede Vertiefung injiziert und die Antwort gemessen. Das emittierte Licht wurde sofort während einer Zeit von 30 Sekunden aufgezeichnet. Dieses Dosisabhängige Antwort auf Endothelin ist in 4 angegeben.
3.3 Sowohl ApoPhotina^TM und den Ratten-VR1-Capsaicin-Rezeptor – ein Calcium durchlässiger Ionen-Kanal – exprimierende CHO-Zell-Linien wurden bis 80–95% Konfluenz in Gewebekultur-Flaschen gezüchtet und durch Trypsinierung isoliert. Die Zellen wurden mit 10000 Zellen/Vertiefung in weiße 96-Vertiefungs-Platten in Wachstumsmedium verteilt und über Nacht bei 37°C in einem feuchten Inkubator bei 5% CO₂ inkubiert. Für Lumineszenz-Experimente wurden die Zellen mit Coelenterazin 10 μM während 3 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ belastet. Die Calciumantwort wurde durch Zugabe von 10 und 50 μM Capsaicin in jede Vertiefung stimuliert. Die Kinetiken der Blitzlumineszenz wurden unter Verwendung von Labsystem Luminoskan Ascent verfolgt, welches Reagenzien injiziert und die Lichtemission aus jeder einzelnen Vertiefung aufzeichnet. Die Zugabe von Capsaicin verursachte ein schnelles und vorübergehendes Lumineszenz-Signal innerhalb von 30 Sekunden, mit einem Peak, der nach etwa 10 Sekunden auftritt (5).

Materialien und Methoden
Reagenzien
Restriktions-Enzyme wurden von New England Biolabs erwoben und entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet. Rnasin und das TNT-Kit für die in vitro-Transkription und Translation stammten von Promega (Madison, WI). Pfu Turbo-Polymerase, Reagenzien für PCR und kompetente Zellen von E. coli-Stämmen XL-1 Blue und BL21 stammten von Stratagene (La Jolla, CA). Oligonukleotide wurden von Primm (Mailand) erworben. Coelenterazin stammte von Prolume Ltd. (Pittsburg, PA). Alle anderen Chemikalien stammten aus Standard-Quellen und waren Reagenzgrad oder besser.
Aufbau der PCT für die Einzelschritt-Synthese von Obelin-DNA-Sequenzen
Vier Schritte sind für den PCR-Aufbau erforderlich: Oligo-Synthese, Gen-Aufbau, Gen-Ampllifizierung und Klonierung. Wir stellten 30 Oligos her, 40 nt Länge, die kollektiv für beide Stränge der Obelin-Gen-Sequenz kodieren. Die Überlappung der komplementären Oligos ist 20 nt. Gleiche Volumina, die aus jeder der 30 Oligo-Lösungen entnommen wurden, wurden zu einer Endkonzentration von ungefähr 20 μM Misch-Oligos kombiniert, vor einer 250fachen Verdünnung in 20 μl Geneamp XL PCR-Mix (Perkin Elmer). Das Amplifizierungsverfahren wurde in drei Stufen durchgeführt. Der erste Schritt wurde mit gepoolten Oligos wie folgt durchgeführt: 40°C während 2 Minuten, dann Zugabe von Polymerase, 72°C für 10 Sekunden, dann 40 Zyklen (94°C während 15 Sekunden, 40°C während 30 Sekunden und 72°C während 10 Sekunden). Die Reaktionsmischung wurde dreifach mit frischer PCR und Polymerase-Mischung verdünnt. Der zweite Schritt war: 25 Zyklen (94°C während 15 Sekunden, 40°C während 30 Sekunden und 72°C während 45 Sekunden).
Die Reaktion wurde erneut dreifach in der kompletten PCR-Mischung verdünnt. Die Bedingungen für den dritten Schritt waren: 20 Zyklen (94°C während 15 Sekunden, 40°C während 30 Sekunden und 72°C während 70 Sekunden). Die Reaktionsprodukte wurden durch 1% Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert, und das spezifische Fragment in den pcrBlunt-Vektor für die weiteren Klonierungsschritte kloniert. Das Plasmid wurde pcr-OB genannt. Die Genauigkeit der PCR-Reaktionen wurde durch Dideoxy-Sequenzierung bestätigt.
Konstruktion des chimären Proteins
Vier Paare von Oligos wurden aus der Clytin-Gen-Sequenz entworfen. Die Region zwischen EF-Hand I und EF-Hand II wurden für die Gen-Chimärisierungen ausgewählt. Die Oligonukleotid-Primer waren die folgenden:
Die annelierten Oligos wurden in die einzelnen NdeI/MunI-Stellen im pcr-OB-Vektor kloniert. Das das chimäre Gen-Produkt enthaltende Plasmid wird pcr-Photina^TM genannt. Photina^TM-DNA wurde weiter in den pcDNA3-Vektor subkloniert, der den T7-Promoter enthält.
Codon-Verwendungsänderung auf PCR-Basis
Die Technik der Overlap-Extension-PCR wurde zur Herstellung der Obelin-Mutante verwendet. Sechs Primer-Paare wurden mit zehn verschiedenen Punkt-Mutationen entworfen, die zehn verschiedene Codon-Verwendungsänderungen produzieren. Zur Amplifizierung der DNA-Fragmente, die für die Overlap-Extension verwendet wurden, wurden PCR-Reaktionen mit 2,5 Einheiten Pfu-Polymerase, 50 ng DNA-Templat, 250 μM jedes dNTP und 50 pmol jedes Primers in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Die Zyklus-Parameter waren 94°C während 1 Minute, 45°C während 1 Minute und 72°C während 1 Minute 30 Sekunden für die ersten zehn Zyklen, gefolgt von 20 Zyklen mit einer Annelierungs-Temperatur von 50°C. Die ortsspezifischen Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt, die bei Primm (Mailand) durchgeführt wurde. Alle molekularen Verfahren wurden unter Verwendung von Standard-Protokollen durchgeführt.
CHO-Zellkultur
Alle Zellen wurden unter feuchten Standard-Bedingungen bei 37°C und 5 CO₂ kultiviert. CHO-Zellen wurden in DMEM/F12 + FBS 10% + Pen/Strep + G418 0,5 mg/ml + Pyruvat 1,6 mM + NaHCO₃ 0,2% gehalten, wobei alle Reagenzien von Life Technologies stammten. Die DNA-Transfektion wurde durchgeführt, als diese Zellen bis 70 bis 80% Konfluenz auf den Platten gewachsen waren.
Referenzen

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13. Ward, W. W. and Seliger H. H. (1974) Properties of mnemiopsin, and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroë ovata. Biochemistry 13, 1500–1510.
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Sequenzliste

Claims

Chimäres Photoprotein, erhältlich durch Ersetzen einer Region des Obelin-Proteins, welche zwischen der ersten und der zweiten Calciumbindungsstelle vorliegt, durch eine entsprechende Region des Photoproteins Clytin.
Chimäres Photoprotein nach Anspruch 1, wobei die Region vom Rest 42 bis 122 der Obelin-Proteinsequenz reicht.
Chimäres Photoprotein nach Anspruch 2, wobei die Region vom Rest 50 bis 95 der Obelin-Proteinsequenz reicht.
Chimäres Photoprotein nach den Ansprüchen 1 bis 3, in welchem die Reste 50 bis 94 des Obelin-Proteins durch ein Fragment der Clytin-Sequenz vom Rest 53 bis 97 ersetzt wird.
Chimäres Photoprotein nach Anspruch 4, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 3 aufweist.
Chimäres Photoprotein nach den Ansprüchen 4 bis 5, darüber hinaus umfassend eine oder mehr Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 und 94 der Obelin-Sequenz.
Fusionsprodukt zwischen einem Photoprotein nach den Ansprüchen 1 bis 6 und einem anderen Polypeptid.
Konjugationsprodukt zwischen einem Photoprotein nach den Ansprüchen 1 bis 6 und einem Molekül von analytischem, diagnostischen oder therapeutischem Interesse.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches für das Protein nach Anspruch 3 kodiert und eine Sequenz aufweist, die aus SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 5 ausgewählt wird.
Verwendung eines chimären Photoproteins nach den Ansprüchen 1 bis 6, in Kombination mit einem Luciferin-Substrat, zum Nachweis von Calciumionen.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Luciferin-Substrat Coelenterazin ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 10 bis 11 zur quantitativen Bestimmung von Calciumionen.
Verwendung nach den Ansprüchen 10 bis 11 zur Bestimmung der intracellulären Calciumkonzentration.
Wirtszelle, welche ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9 aufweist.
Wirtszelle nach Anspruch 14, welche aus Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- und Tierzellen ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung von Photoprotein, welches Züchten der rekombinanten Wirtszelle aus Anspruch 14 unter für die Photoproteinexpression geeigneten Bedingungen und Isolierung des exprimierten Proteins umfasst.
Verfahren zum Screening von biologisch aktiven Molekülen, welches Exponieren einer Wirtszelle nach Anspruch 14 gegen eine definierte Menge dieser Moleküle und Nachweis von gegebenenfalls vorhandenen Variationen der intracellulären Calciumkonzentration umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Wirtszelle mit einem heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor oder Ionenkanal transfiziert wird.
Verwendung eines Konjugationsprodukts zwischen einem Photoprotein nach den Ansprüchen 1 bis 6 und einem Molekül von analytischem, diagnostischem oder therapeutischem Interesse in einem kompetitiven Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung der Menge dieses Moleküls in biologischen Proben.
Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-System, umfassend ein fluoreszierendes Protein und das Photoprotein nach Anspruch 5.