DE60026603T2

DE60026603T2 - Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer(BRET)-System mit großer spektraler Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptoremissionswellenlänge sowie dessen Verwendun

Info

Publication number: DE60026603T2
Application number: DE60026603T
Authority: DE
Inventors: Erik Blainville JOLY
Original assignee: PerkinElmer Biosignal Inc
Current assignee: PerkinElmer Biosignal Inc
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: DE60026603D1; AU2334801A; EP1295121A1; WO2001046691A1; EP1295121B1; ATE320000T1; US20030203404A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gehört in das Gebiet der in vitro Detektionsverfahren
HINTERGRUND
Die Interaktionen zwischen Proteinen und anderen Molekülen spielen eine wichtige regulatorische Rolle in nahezu jedem biologischen Prozess. Deshalb wurden viele Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren dieser Interaktionen entwickelt. Ein Werkzeug, welches den Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) nutzt, basiert auf der Verwendung von Renilla-Luciferase (Rluc) als Donator und einem Grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Akzeptormolekül bei einer Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-ähnlichen Untersuchungskonfiguration.
Es wurde ein BRET-System entwickelt, bei dem Rluc und EYFP (verstärktes Gelb fluoreszierendes Protein; Enhanced Yellow Fluorescent Protein) verwendet wurden. Rluc ist ein Enzym, welches in Gegenwart seines Substrates Wildtyp-Coelenterazin blaues Licht erzeugt (Peak bei 480 nm) (Lorenz et al., 1996; Lorenz et al., 1991; Matthews et al., 1977a). Wenn es sich in der geeigneten räumlichen Ausrichtung befindet, dann ist das EYFP in der Lage, einen Teil des blauen Lichtes zu absorbieren und anschließend Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen zu emittieren. Dieses Phänomen kann folglich angepasst werden, um Interaktionen zwischen Molekülen zu überwachen.
Derzeit sind verschiedene Coelenterazin-Derivate im Handel erhältlich (Molecular Probes Eugene, OR, BioSynth Napierville, IL). Im Vergleich zum nativen Coelenterazin weisen die meisten Coeleterazin-Derivate eine verbesserte Helligkeit auf, wenn sie durch ein biolumineszierendes Enzym wie Rluc oder ein Photoprotein wie Aequorin verarbeitet werden. Andere Derivate (z.B. hcp) verändern die Position des Emissionspeaks. Das EYFP ist ein in Richtung rot verschobenes GFP (Tsien, 1998). Bei einer Anregung bei 513 nm emittiert es gelbes Licht bei 527 nm. Aneinandergekoppelt (z.B. als ein Fusionsprotein und bei einem Protein-Protein-Interaktionsuntersuchung) vollziehen Rluc und EYFP BRET, wobei ein Teil der Energie (strahlungslos) vom Rluc das EYFP anregt. Dementsprechend emittiert das EYFP bei Zugabe des Substrates Coeleterazin gelbes Licht, wenn sich das Rluc- und das EYFP-Protein nahe beieinander befinden (< 100 Å). Wenn Rluc und EYFP zu weit voneinander entfernt sind, wird die Energie nicht effizient übertragen und es wird nur das blaue Licht des Rluc erfasst. Daher werden zum Quantifizieren von Energietransfereffizienzen die Lichtausbeuten bei der Donatorwellenlänge und der Akzeptorwellenlänge nach Zugabe des Coelenterazin gemessen.
Anschließend wird das Verhältnis von Akzeptorlichtausbeute zu Donatorlichtausbeute berechnet, um den BRET zu quantifizieren.
Der vorliegende Anmelder und andere haben unter Verwendung von Rluc und EYFP demonstriert (siehe Xu et al., 1999 und Angers et al., 2000; US-Patentschrift 5,976,796), dass die Verwendung von BRET bei Arzneimittelentdeckungsanwendungen machbar ist und dass BRET-Systeme das Potential haben, zu ausgezeichneten Erfassungssystemen für Frischzellenuntersuchungen zu werden. Dieses BRET-System zeigt jedoch einen relativ niedrigen Signal-zu-Basis- (S/B) und dynamischen Bereich (oder DR: die Differenz zwischen dem maximalen Verhältnis und dem minimalen Verhältnis) mit etwa 1,4 bzw. 0,5. Weiters ist aufgrund der geringen Differenz zwischen Donator- und Akzeptoremissionswellenlänge immer etwas Donatorlicht vorhanden, welches im Wellenlängenbereich der Akzeptoremission ausgestrahlt wird, welches eine Erhöhung des Hintergrundlichtes verursacht.
Diese Hintergrundinformationen dienen dem Zweck der Bekanntmachung von Informationen, von denen der Anmelder glaubt, dass sie eine mögliche Relevanz für die vorliegende Erfindung haben. Es ist weder notwendigerweise ein Zugeständnis beabsichtigt, noch soll ausgelegt werden, dass die vorhergehenden Informationen den Stand der Technik gegenüber der vorliegenden Erfindung darstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) -Systems mit großer spektraler Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptoremissionswellenlänge sowie dessen Verwendung. In einem Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) -System, welches Folgendes aufweist:

(a) ein biolumineszentes Donatorprotein (BDP), welches an ein erstes Molekül oder an einen ersten Modulator angelagert ist;
(b) ein fluoreszierendes Akzeptormolekül (FAM), welches an ein zweites Molekül oder einen zweiten Modulator angelagert ist, wobei das FAM in Gegenwart des geeigneten Substrats die Energie von dem BDP entgegennehmen kann, wenn sie miteinander assoziiert sind; und

In einer Ausführungsform kann der Modulator zwei getrennte molekulare Einheiten aufweisen, welche an das FAM bzw. an das BDP angelagert sind. Bei dieser Ausführungsform kann die Interaktion zwischen den molekularen Einheiten von der Aktivität eines weiteren Moleküls abhängig sein und sie kann konstitutiv sein. Die beiden getrennten molekularen Einheiten können gleich oder verschieden sein. Eine der molekularen Einheiten kann oder beide Moleküleinheiten können ein Rezeptor (welcher ein Orphan-Rezeptor sein kann), eine Rezeptor-Untereinheit oder ein Fragment davon sein.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine der molekularen Einheiten ein rezeptorbindendes Molekül sein, welches an einen aktivierten Rezeptor binden wird, während die andere ein Rezeptor, eine Rezeptor-Untereinheit oder ein Fragment davon ist. Das rezeptorbindende Molekül kann β-Arrestin, ein G-Protein oder Ubiquitin sein.
In einer weiteren Ausführungsform des ersten Aspektes können der Modulator, das FAM und das BDP ein Fusionsmolekül aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform weist das BRET-System des ersten Aspektes außerdem ein Gerät zur BRET-Signal-Erfassung auf, welches fähig ist, speziell BDP- und/oder FAM-Emissionen zu bestimmen. Ein oder mehrere optische Filter können in das Gerät eingebaut sein, um die Überlappung zwischen den Emissionsspektren zu vermindern und die breite spektrale Auflösung zu erzeugen. Das Gerät kann ein Mikroplattenleser oder ein Bildgebungssystem sein, und ein oder mehrere Monochromatoren oder Prismen können in das Gerät eingebaut sein, um die Überlappung zwischen den Emissionsspektren zu vermindern und die große spektrale Auflösung zu erzeugen.
Das Gerät kann ein Spektrophotometer oder ein Spektrofluorometer sein, und ein Algorithmus kann angewandt werden, um rechnerisch die in dem FAM-Peak vorhandene BDP-Emission abzuziehen und die breite spektrale Auflösung zu erzeugen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das BRET-System nach dem ersten Aspekt in Gegenwart eines geeigneten Substrates Luciferaseaktivität aufweisen. Die Luciferase kann Renilla-Luciferase oder Leuchtkäfer-Luciferase, Gaussia-Luciferase oder Aequorin sein, und eine breite spektrale Auflösung kann durch Verwendung einer nicht natürlich vorkommenden Luciferase erreicht werden.
Ein geeignetes Substrat kann verwendet werden, um die Lumineszenzaktivität des BDP zu aktivieren, wobei es sich um ein nicht natürlich vorkommendes Substrat wie ein Coelenterazin-Derivat (z.B. coel400a) handeln kann.
Die breite spektrale Auflösung des ersten Aspektes kann durch Verwenden eines nicht natürlich vorkommenden FAM erreicht werden, bei welchem es sich um ein mutiertes Grün fluoreszierendes Protein oder ein mutiertes Rot fluoreszierendes Protein handeln kann. Das mutierte Grün fluoreszierende Protein kann die folgenden Substitutionen aufweisen:

(a) Phenylalanin-64 zu Leucin;
(b) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin;
(c) Phenylalanin-64 zu Leucin und Serin-202 zu Phenylalanin;
(d) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin und Serin-202 zu Phenylalanin;
(e) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin und Tyrosin-203 zu Isoleucin; oder
(f) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin, Serin-202 zu Phenylalanin und Tyrosin-203 zu Isoleucin.

In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung des BRET-Systems des ersten Aspektes zum Überwachen von Protein-Protein-Interaktionen in vitro bereit.
In einem dritten Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines BRET-Systems des ersten Aspektes, welches folgende Schritte aufweist:

(a) das Auswählen eines biolumineszierenden Donatorproteins (BDP) und eines fluoreszierenden Akzeptormoleküls (FAM), derart, dass das FAM in Gegenwart eines geeigneten Substrats die Energie von dem BDP entgegennehmen kann, wenn sie miteinander assoziiert sind; und
(b) entweder
(i) das Anwenden eines Algorithmus, um rechnerisch die BDP-Emission von dem FAM-Peak abzuziehen,
(ii) das Vermindern der Überlappung zwischen dem BDP- und dem FAM-Emissionsspektrum durch den Einsatz optischer Filter,
(iii) das Anwenden einer ortsspezifischen Mutagenese, um das Emissionsspektrum des BDP zu verändern,
(iv) das Verwenden eines Coelenterazin-Derivats-, Luciferin- oder biolumineszierenden Substrates, welches eine Verschiebung in dem BDP-Emissionsspektrum bewirkt, oder
(v) das Anwenden einer ortsspezifischen Mutagenese, um die Anregung und/oder das Emissionsspektrum des FAM zu verändern,

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine bildliche Beschreibung einer Ausführungsform eines BRET-Systems, wobei das BDP und das FAM an verschiedenen Proteinen oder Peptiden angelagert sind. Bei dieser Ausführungsform gibt es im Allgemeinen zwei Einheiten, welche den Modulator aufweisen, wobei das BDP kovalent an eine Modulatoreinheit angelagert ist, und das FAM ist kovalent an die zweite Modulatoreinheit angelagert. Die Interaktion zwischen den beiden Modulatoreinheiten beeinflusst die Effizienz des Energietransfers zwischen dem BDP und dem FAM und somit auch die Lichtemission vom System.
2 ist eine bildliche Beschreibung einer weiteren Ausführungsform des BRET, wobei das BDP und das FAM an das gleiche Protein oder Peptid angelagert sind. In dieser Ausführungsform sind das BDP und das FAM an einen gemeinsamen Linker angelagert, welcher die Modulatorkomponente des Systems aufweist. Ein typisches Beispiel dieser Ausführungsform ist die Verwendung des Modulators als ein Sensor, welcher Veränderungen in einer Komponente in der Umgebung erfasst, wodurch der Sensor wiederum einer Veränderung unterzogen wird, welche die Energietransfereffizienz zwischen dem BDP und dem FAM beeinflusst, was sich in der Lichtemission vom System wiederspiegelt.
3 gibt die Ergebnisse eines Experimentes wieder, welches die Reaktion auf eine Calcitonin-Dosis von CHO-K1-Zellen transfiziert mit dem cAMP-Sensor (CBP:CREB-Konstrukte) demonstriert.
4 zeigt die Reaktion auf eine Isoproterenol-Dosis von CHO-K1-Zellen transfiziert mit dem cAMP-Sensor (CBP:CREB-Konstrukte). In diesem Fall wurde das Verhältnis mittels der in Beispiel II dargestellten Algorithmusformel korrigiert.
5 präsentiert die Spektralanalyse von Coel400A. Die Zellen wurden mittels LipofectAMINE vorübergehend mit den geeigneten Konstrukten transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen zur Durchführung von Emissionsscans mittels eines Spektrofluorometers bei abgeschaltetem Anregungslicht verwendet.
6 zeigt die BRETCount-Analyse des Coelenterazin 400A. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen auf Mikroplatten verteilt und im BRETCount analysiert. (-
- Rluc 400a, -
- Rluc-sph 400a und -
- Rluc-GFPuv 400a)
7 zeigt die BRETCount-Analyse des Coel400A mittels Schwarzblech. (-
- Rluc 400a, -
- Rluc-sph 400a und -
- Rluc-GFPuv 400a)
8 zeigt die Lumineszenz bei t = 0 (d.h. sofort nach Zugabe des Coelenterazins) für die verschiedenen Coelenterazin 400A-Stammlösungen.
9 zeigt die Lumineszenz bei t = 5 (5 Minuten nach Zugabe des Coelenterazins) für die verschiedenen Coelenterazin 400A-Stammlösungen.
10 demonstriert eine Vergleichsstudie zwischen wt Rluc und hRluc in Frischzellen. Die Zellen wurden mittels LipofectAMINE zusammen mit einem internen Standard mit den geeigneten Konstrukten transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen entnommen und zur Durchführung von Emissionsscans mittels eines Spektrofluorometers verwendet. (––– hRluc Nr. 4, ------ hRluc Nr. 6 und - - - - Rluc)
11 zeigt die BRETCount-Analyse der hRluc-Expression in Frischzellen. (-
- pRluc, -♢- phRluc Klon Nr. 4 und -
- phRluc Klon Nr. 6)
12 zeigt die BRETCount-Analyse der GFP-Mutanten. Die Zellen wurden mittels LipofectAMINE mit den geeigneten Konstrukten transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen entnommen und in Mikroplatten platziert, bevor sie im BRETCount analysiert wurden. (-
- pRluc, -o- pRluc-GFPuv, -
- pRluc-GFP1, -☐- pRluc-GFP6 und -•- pRluc-GFP9)
13 zeigt die BRETCount-Analyse der GFP-Mutanten. Die Zellen wurden mittels LipofectAMINE mit den geeigneten Konstrukten transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen entnommen und in Mikroplatten platziert, bevor sie im BRETCount analysiert wurden. (-
- pRluc, -
- pRluc-GFPuv, -∇- pRluc-GFP9, -⧫- pRluc-GFP10 und -o- pRluc-GFP11)
14 zeigt die BRETCount-Analyse der GFP-Mutanten. Die Zellen wurden mittels LipofectAMINE mit den geeigneten Konstrukten transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen entnommen und in Mikroplatten platziert, bevor sie im BRETCount analysiert wurden. Wirkung von DTT auf die Verhältnisse. (-
- pRluc, -o- pRluc-GFPuv, -
- pRluc-GFP1, -⧫- pRluc-GFP9, -•- pRluc-GFP10 und -☐- pRluc-GFP11)
15 zeigt einen Vergleich zwischen hcp- und Coel400a-Derivaten in CHO-Zellen, wenn sie mittels BRETCount analysiert werden. (-
- pRluc Coel400a, -☐- pRluc-GFP10 Coel400a, -
- pRluc hcp und -
- pRluc-GFP10 hcp)
16 zeigt die Spektralanalyse von GFP10. Die Zellen wurden entweder mit pRluc::GFP10 (GFP Nr. 10) oder mit pRluc::GFP11 (GFP Nr. 11) transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen zur Durchführung von Emissionsscans mittels des coel400a verwendet. (––– GFP Nr. 10 und - - - - GFP Nr. 11)
17 demonstriert einen Vergleich zwischen Zellen, welche Rluc, Rluc + GFP10 und die Fusion Rluc::GFP10 exprimieren. a) Zellen waren nicht lysiert. b) Zellen waren lysiert. (-
- Rluc, -
- Rluc + GFP10 und -
- Rluc::GFP10)
18 demonstriert die Verwendung des BRET-Systems der vorliegenden Erfindung bei Protein-Protein-Interaktionsuntersuchungen. Die Zellen wurden mit den erwähnten Konstrukten transfiziert oder co-transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen entnommen und mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in BRET-Puffer in 96-Kammer-Platten (Optiplate weiß) platziert. a) Untersuchung wurde ohne DTT durchgeführt. b) Untersuchung wurde mit DTT durchgeführt. (-
- Rluc::kaiB (Lumineszenz), -•- Rluc::kaiB/GFP::kaiB (Lumineszenz), -
- Rluc::kaiB/GFP::kaiA (Lumineszenz), -☐- Verhältnis Rluc::kaiB, -o- Verhältnis Rluc::kaiB/GFP::kaiB und -Δ- Verhältnis Rluc::kaiB/GFP::kaiA)
19 zeigt das Ergebnis des Einsatzes des Emissionsfilterpaares GG4/5 (Akzeptor) und D410/80 (Donator) unter Verwendung von Zellen, welche Rluc-, Rluc::GFP1- oder Rluc::GFP10-Fusionskonstrukte exprimieren. (-
- Rluc, -⧫- Rluc::GFP1 und -
- Rluc GFP10)
20 zeigt das Ergebnis des Einsatzes des Emissionsfilterpaares D515/30 (Akzeptor) und D410/80 (Donator) unter Verwendung von Zellen, welche Rluc-, Rluc::GFP1- oder Rluc::GFP10-Fusionskonstrukte exprimieren. (-
- Rluc, -⧫- Rluc::GFP1 und -
- Rluc::GFP10)
21 zeigt die Ergebnisse die Verwendung eines BRET-Systems der vorliegenden Erfindung in dem konstitutiven Protein-Protein-Interaktions-Kai-System.
22 zeigt die Ergebnisse aus β-adrenergen Rezeptor- und Vasopressin2-β-Arrestin-BRET-Untersuchungen. A) Die BRET-Verhältnisse wurden in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (–) einer sättigenden Dosis von Antagonisten bestimmt (iso: Isoproterenol für β2- und β3-Rezeptoren; AVP für den V2-Rezeptor). B) Dosisreaktionskurve von AVP nur für den V2-Rezeptor.
23 bietet einen Vergleich der verschiedenen Coelenterazin-Derivate. Die Zellen wurden mit der negativen und positiven Kontrolle transfiziert und in BRET²-Untersuchungen verwendet.
24 bietet einen Vergleich des Emissionsscans der Rluc-Mutanten und dem Wildtyp-Rluc. In allen Fällen wurde DeepBlueC als Substrat verwendet.
25 bietet einen Vergleich der Rluc-Mutanten mit dem Rluc-Wildtyp in der BRET-Untersuchung.
26 demonstriert die Ergebnisse von GPCR-Oligomerisation in Rohmembranen mittels BRET. β2-AR:EYFP wurde entweder mit β2-AR:Rluc oder CCR5:Rluc oder GABA-R2:Rluc transfiziert. Die Membranen wurden aus transfizierten Zellen hergestellt und in BRET-Untersuchungen verwendet, um die GPCR-Oligomerisation zu bestimmen.
27 zeigt eine DNA-Sequenz (SEQ. ID NR.:), welche das GFP:Rluc-Fusionsprotein codiert, welches eine einmalige 14-Aminosäuren-Linkerregion zwischen dem GFP und dem Rluc aufweist.
28 zeigt die DNA-Sequenz für das GFP1:Caspase-3:Rluc-Konstrukt (SEQ ID NR.:).
29 demonstriert die Induktion von Apoptose mit Hilfe von Staurosporin in HeLa-Zellen transfiziert mit dem GFP1:Caspase-3:Rluc-Sensor.
30 zeigt die Auswirkungen von Ca²⁺ auf die Interaktion von Rluc:p53- und S100b:GFPuv-Fusionsproteinen. His-tag-gereinigtes Rluc:p53-Fusionsprotein wurde bei unterschiedlichen molekularen Verhältnissen (1:1 oder 1:3) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von 1 mM Ca²⁺ mit his-tag-gereinigtem S100b:GFPuv-Fusionsprotein gemischt.
31 demonstriert die Ergebnisse eines Vergleichs zwischen dem β-Arrestin2:GFP1- und dem GFP1:β-Arrestin2-Fusionskonstrukt im BRET-Untersuchung.
32 zeigt Schema I: Synthese von Pyrazinen.
33 zeigt Schema II: Synthese von Benzylglyoxal beginnend mit Phenylacetylchlorid.
34 zeigt Schema III: Synthese von Phenylcoelentrazin.
Tabelle 1: molekularen Komponenten der ersten (BRET) und zweiten BRET-Generation (BRET²).
Tabelle 2: Weitere Donator/Substrat/Akzeptor-Kombinationen, welche sich von der in Tabelle 1 unterscheiden, mit einer spektralen Trennung von > 50 nm zwischen Donator- und Akzeptoremissionswellenlängen. Kleinere Peaks sind in Klammern gezeigt. Der spektrale Positionspeak kann von der Art der Untersuchungen abhängig sein. Bei Säugetierzellen, welche Rluc exprimieren, emittiert Rluc Licht zwischen 470–480 nm, wenn es Wildtyp-Coelenterazin verarbeitet. Bei Bakterien emittiert Rluc Licht mit geringeren Wellenlängen (460–470 nm) mit dem gleichen Substrat.
Tabelle 3: Weitere biolumineszierende Donatoren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen können (* gemäß der Literatur früher Cypridina genannt, ** neues Derivat)
Tabelle 4: Getestete GFP-Mutanten der Klasse 1. (* Allelmutationen wurden nicht in Betracht gezogen, EGFP ist bereits Kodon-humanisiert, ** (h) bedeutet Kodon-humanisiert)
Tabelle 5: Auswirkung der Mutationen. Bei allen humanisierten Versionen wurde ein Valin-Rest nach dem ersten Methionin eingefügt, um eine Kozak-Sequenz herzustellen.
Tabelle 6: Lichtausbeute gemessen in BRETCount und TopCount. (* Mittel von acht Messungen)
Tabelle 7: Beispiele berechneter Verhältnisse für beide Konstrukte mittels den unterschiedlichen Gleichungen.
Tabelle 8: Vergleich der Biolumineszenzaktivitäten von Rluc-Mutanten.
Tabelle 9: PCR-Amplifikation von humanem p53.
Tabelle 10: RT-PCR-Amplifikation von humanem S100B.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) -System, welches so modifiziert wurde, dass es eine breite spektrale Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptoremissionswellenlänge zeigt. Der Zweck der breiten spektralen Trennung, welche das BRET-System charakterisiert, ist die Überlappung zwischen dem BDP- und dem FAM Emissionspektrum zu minimieren und dadurch die Auswirkung der BDP-Emission auf die FAM-Emission zu vermindern. Dies wiederum resultiert in einem verbesserten Signal-zu-Basis-Verhältnis (S/B) und dynamischen Bereich (DR) im BRET-System der vorliegenden Erfindung gegenüber einem einfachen BRET-System.
Definitionen
Falls nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise durch den Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, dem diese Erfindung angehört, verstanden wird. Im Allgemeinen sind die hierin verwendete Terminologie und die unten beschriebenen Laborverfahren der Spektroskopie, Arzneimittelentdeckung, Zellkultur, molekulare Genetik, Kunststoffherstellung, Polymerchemie, Diagnose, Aminosäure- und Nukleinsäurechemie und Zuckerchemie diejenigen, welche in der Technik gut bekannt sind und üblicherweise angewandt werden. Standardverfahren kommen üblicherweise bei der Kunststoffherstellung, Signalerfassung, bei rekombinanten Nukleinsäureverfahren, der Polynukleotidsynthese und mikrobiellen Kultur und -transformation (z.B. Elektroporation, Calciumchlorid-Hitzeschock) zum Einsatz.
Die Techniken und Verfahren werden im Allgemeinen gemäß herkömmlicher Verfahren in der Technik und verschiedener allgemeiner Referenzen durchgeführt (siehe allgemein Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY und Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York, Plenum Press (1983) für Fluoreszenzverfahren), welche im gesamten Dokument angegeben werden. Standardverfahren werden für chemische Synthesen, chemische Analysen und biologische Untersuchungen verwendet.
Wie in der gesamten Offenbarung angewandt, haben die folgenden Begriffe, falls nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen:
„Biolumineszentes Donatorprotein (BDP)" betrifft jedes Protein, welches in der Lage ist, auf einem geeigneten Substrat zu agieren, um Lumineszenz zu erzeugen. Es gibt eine Reihe unterschiedlicher biolumineszenter Donatorproteine, welche in dieser Erfindung eingesetzt werden können.
„Fluoreszentes Akzeptormolekül (FAM)" betrifft jedes Molekül, welches Energie entgegennehmen kann, welche als ein Resultat der Aktivität eines biolumineszenten Donatorproteins emittiert wurde, und welches diese Energie als Lichtenergie re-emittiert. Es gibt eine Reihe unterschiedlicher fluoreszenter Akzeptormoleküle, welche in dieser Erfindung eingesetzt werden können. Das FAM kann proteinös oder nicht-proteinös sein.
„Substrat" betrifft jedes Molekül, welches durch das biolumineszente Donatorprotein eingesetzt wird, um Lumineszenz zu erzeugen.
„Modulator" bedeutet, im weitesten Sinne, ein Molekül oder Moleküle (Proteine, Lipide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, organische Moleküle, anorganische Moleküle usw.), welche eine physikalische Veränderung durchlaufen (z.B. Spaltung, Phosphorylierung, Ligation, einschließlich Ausrichtungs-, Konformations- und Energieänderung), und zwar als Reaktion auf eine Interaktion mit einem weiteren Faktor wie z.B. einem Molekül (interagierender Faktor genannt), wodurch die Energietransfereffizienz zwischen dem BDP und dem FAM beeinflusst wird.
„Interagierender Faktor (IF)" betrifft, im weitesten Sinne, jede „Substanz", einschließlich Energie oder ein Molekül (wie z.B. Ionen, sekundärer Botenstoff, Protein, Proteindomäne, Polypeptid oder Peptid), welche in der Lage ist, mit dem Modulator zu interagieren, was in einer physikalischen Veränderung im Modulator resultiert und letztendlich auch die Energietransfereffizienz zwischen dem BDP und dem FAM beeinflusst.
In der Technik wird verstanden, dass das BDP ein Enzym ist, welches ein Substrat in ein aktiviertes Produkt umwandelt, welches dann bei seiner Entspannung Energie freisetzt. Obwohl die Spezifikation den Transfer von Energie zwischen dem BDP und dem FAM betrifft, wird, technisch gesehen, verstanden, dass das aktivierte Produkt (erzeugt durch die Aktivität des BDP auf das Substrat) die Quelle der BDP-erzeugten Lumineszenz ist, welche auf das FAM übertragen wird. Zum Zweck dieser Erfindung ist die Ausrichtung des BDP relativ zum FAM, wenn es das Substrat in das aktivierte Produkt umwandelt, ein entscheidender Faktor für die angemessene Funktion der Erfindung.
„Protein" betrifft ein ganzes Protein oder ein Fragment davon, wie eine Proteindomäne oder eine Bindungsstelle für einen sekundären Botenstoff, Co-Faktor, Ion usw. Es kann ein Peptid oder eine Aminosäuresequenz sein, welche/s als ein Signal für ein anderes Protein im System funktioniert, wie z.B. eine proteolytische Spaltungsstelle.
„Bindungspaar" betrifft zwei Komponenten (z.B. chemisch oder biochemisch), welche eine Affinität füreinander aufweisen. Zu Beispielen von Bindungspaaren zählen Homodimere, Heterodimere, Antigen/Antikörper, Lectin/Avidin, Zielpolynukleotid/Sonde, Oligonukleotid, Antikörper/Anti-Antikörper, Rezeptor/Ligand, Enzym/Ligand und ähnliche. „Ein Teil eines Bindungspaares" betrifft eine Einheit des Paares wie ein Antigen oder einen Liganden.
„Membran-durchdringendes Derivat" betrifft ein chemisches Derivat einer Verbindung, welches im Vergleich zu einer nicht derivatisierten Verbindung eine verstärkte Membranpermeabilität aufweist. Zu Beispielen zählen Ester-, Ether- und Carbamat-Derivate. Diese Derivate sind besser dazu geeignet, Zellmembranen zu durchqueren, d.h. sie sind Membran-durchdringend, weil hydrophile Gruppen maskiert sind, um mehr hydrophobe Derivate bereitzustellen. Außerdem sind Maskierungsgruppen so ausgebildet, dass sie von einem Präkursor (z.B. fluorogener Substratvorläufer) innerhalb der Zelle abgespaltet werden, um das abgeleitete Substrat intrazellulär zu erzeugen. Da das Substrat hydrophiler als das Membran-durchdringende Derivat ist, ist es nun innerhalb der Zelle gefangen.
„Isoliertes Polynukleotid" betrifft ein Polynukleotid von genomischem-, cDNA-, RNA- oder synthetischem Ursprung oder einigen Kombinationen davon, wobei aufgrund seines Ursprungs das „isolierte Polynukleotid" (1) nicht mit der Zelle in Verbindung steht, in der das „isolierte Polynukleotid" in der Natur vorkommt oder (2) wirkungsmäßig mit einem Polynukleotid verbunden ist, mit dem es in der Natur nicht verbunden ist.
„Isoliertes Protein" betrifft ein Protein aus cDNA, rekombinanter RNA oder mit synthetischem Ursprung oder einigen Kombinationen davon, wobei aufgrund seines Ursprungs das „isolierte Protein" (1) nicht mit Proteinen in Verbindung steht, mit welchen es in der Natur vorkommt oder (2) von der Zelle isoliert ist, in welcher es normalerweise vorkommt oder (3) frei von anderen Proteinen aus der gleichen Zellquelle isoliert ist, z.B. frei von humanen Proteinen oder (4) durch eine Zelle von einer anderen Spezies exprimiert ist oder (5) nicht in der Natur vorkommt. „Isoliertes natürlich vorkommendes Protein" betrifft ein Protein, wobei aufgrund seines Ursprungs das „isolierte natürlich vorkommende Protein" (1) nicht mit Proteinen in Verbindung steht, mit denen es normalerweise in der Natur vorkommt oder (2) von der Zelle isoliert ist, in welcher es normalerweise vorkommt oder (3) frei von anderen Proteinen aus der gleichen Zellquelle isoliert ist, z.B. frei von menschlichen Proteinen.
„Polypeptide" betreffen, wie hierin als generischer Begriff verwendet, natives Protein, Fragmente oder Analoga einer Polypeptidsequenz. Daher sind natives Protein, Fragmente und Analoga Spezies der Polypeptidgattung.
„Natürlich vorkommend" betrifft, wie hierin verwendet, auf einen Gegenstand angewandt die Tatsache, dass ein Gegenstand in der Natur gefunden werden kann. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, welche in einem Organismus (einschließlich Viren) vorliegt, welche aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und welche nicht absichtlich durch den Menschen im Labor modifiziert wurde, natürlich vorkommend.
„Wirkungsmäßig verbunden" betrifft eine Nebeneinanderstellung, wobei sich die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, welche es ihnen gestattet, in der beabsichtigten Art und Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, welche mit einer Codiersequenz „wirkungsmäßig verbunden" ist, ist in einer Art und Weise ligiert, dass die Expression der Codiersequenz unter Bedingungen erreicht wird, welche mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
„Kontrollsequenz" betrifft Polynukleotidsequenzen, welche notwendig sind, um die Expression von codierenden und nicht-codierenden Sequenzen zu bewirken, an die sie ligiert sind. Die Natur solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich abhängig vom Wirtsorganismus; in Prokaryoten weisen solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotor-, Ribosomenbindungsstellen- und Transkriptionsterminierungssequenzen auf; in Eukaryoten beinhalten solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotoren und Transkriptionsterminierungssequenzen. Der Begriff „Kontrollsequenzen" soll zumindest Komponenten einschließen, deren Gegenwart die Expression beeinflussen kann, und es können auch zusätzliche Komponenten beinhaltet sein, deren Gegenwart von Vorteil ist, wie zum Beispiel Leitsequenzen und Fusionspartnersequenzen.
„Polynukleotid" betrifft eine polymere Form von Nukleotiden mit einer Länge von mindestens 10 Basen, entweder Ribonukleotide oder Deoxynukleotide, oder eine modifizierte Form einer der Nukleotidarten. Der Begriff beinhaltet Einzel- und Doppelstrang-Formen von DNA, RNA und Kombinationen davon.
„Polypeptidfragment" betrifft ein Polypeptid mit einer Amino-Terminus- und/oder Carboxy-Terminus-Deletion, wobei aber die verbleibende Aminosäuresequenz üblicherweise identisch mit den entsprechenden Positionen der natürlich vorkommenden Sequenz abgeleitet zum Beispiel von einer cDNA-Sequenz mit voller Länge ist. Fragmente sind üblicherweise mindestens 5, 6, 8 oder 10 Aminosäuren lang, bevorzugt mindestens 14 Aminosäuren lang, bevorzugter mindestens 20 Aminosäuren lang, üblicherweise mindestens 50 Aminosäuren lang und noch bevorzugter mindestens 70 Aminosäuren lang.
„Platte" betrifft eine Multikammerplatte, es sei denn, dies ist im Kontext anderweitig modifiziert.
Der Begriff „Testchemikalie" oder „Testverbindung" betrifft eine durch ein oder mehrere Screening-Verfahren der Erfindung als ein mutmaßlicher Kandidat zu testende Chemikalie.
Die Begriffe „Markierung" oder „markiert" betreffen den Einschluss detektierbarer Marker, z.B. durch Einschluss einer radioaktiv markierten Aminosäure oder das Anhaften von Biotinylresten an ein Polypeptid, welche von markiertem Avidin erkannt werden können (z.B. Streptavidin, welches einen fluoreszierenden Marker enthält oder Enzymaktivität, welche durch optische oder colorimetrische Verfahren erkannt werden kann). Verschiedene Verfahren der Markierung von Polypeptiden und Glycoproteinen sind in der Technik bekannt und können verwendet werden. Zu Beispielen von Markierungen für Polypeptide zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Folgenden: Radioisotope (z.B. ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), fluoreszierende Markierungen (z.B. FTTC, Rhodamin, Lanthanid-Phosphoren), enzymatische Markierungen (oder Reportergene) (z.B. Meerrettichperoxidase, Beta-Galactosidase, Beta-Lactamase, Luciferase, alkalische Phosphatase), Chemilumineszenz, Biotinylgruppen, vorbestimmte Polypeptidepitope erkannt durch einen sekundären Reporter (z.B. Leucin-Zipper-Paar-Sequenzen, Bindungsstellen für sekundäre Antikörper, Metallbindungsdomänen, Epitop-Tags). In einigen Ausführungsformen sind die Markierungen durch Spacer-Arme verschiedener Längen angebracht, um potentielle sterische Behinderung zu vermindern.
„Analyt" betrifft eine Substanz, für welche die Gegenwart, Abwesenheit oder Quantität zu bestimmen ist. Ein Analyt ist normalerweise ein kleines Molekül oder ein ionischer gelöster Stoff wie K⁺, H⁺, Ca²⁺, CO₂, Na⁺, Cl^–, Mg², O₂, HCO₃, NO und ATP.
Zu üblichen Beispielen von sekundären Botenstoffen zählen cAMP, cGMP, Ca²⁺, IP₃, NO, DAG, Ceramid und Derivate davon, Arachidonsäure und Derivate davon sowie Isoprenyl und Derivate davon.
Weitere Begriffe der Chemie werden hierin gemäß dem üblichen Gebrauch in der Technik verwendet, wie von The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco exemplifiziert.
In einem Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) -System mit einer breiten spektralen Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptoremissionswellenlänge. Der Zweck der breiten spektralen Trennung, welche das BRET-System charakterisiert, ist die Überlappung zwischen dem BDP- und dem FAM-Emissionsspektrum zu minimieren und dadurch die Auswirkung der BDP-Emission auf die FAM-Emission zu vermindern. Dies wiederum resultiert in einem verbesserten Signal-zu-Basis-Verhältnis (S/B) und dynamischen Bereich (DR) im BRET-System der vorliegenden Erfindung gegenüber einem einfachen BRET-System.
1 stellt eine exemplarische Ausführungsform eines BRET-Systems dar, welches verwendet werden kann, um die Interaktion (aufeinander zu bewegen, voneinander weg bewegen oder Änderung der Ausrichtung zueinander) von zwei Modulatoreinheiten zu erfassen. In einem Beispiel, bei dem diese Ausführungsform verwendet werden kann, um Bindungspartner zu erfassen, kann das BDP an ein Genprodukt angelagert sein und das FAM kann an ein unbekanntes Genprodukt angelagert sein, so dass die Interaktion zwischen den beiden Genprodukten durch die Lichtemission des FAM angezeigt wird. In einer weiteren Anwendung, wie der Arzneimittelentdeckung, wird diese Ausführungsform verwendet, um zu bestimmen, ob eine chemische oder molekulare Substanz verursacht, dass sich die molekularen Einheiten wie Homodimere oder Heterodimere aufeinander zu oder voneinander weg bewegen. Durch das Anlagern des BDP an eines der Dimer-Proteine und des FAM an das andere Dimer-Protein werden Veränderungen in der räumlichen Beziehung zwischen den Dimer-Proteinen als Reaktion auf eine chemische Verbindung wie einen Arzneimittelkandidaten in die räumliche Beziehung zwischen dem BDP und dem FAM übersetzt, was durch eine Veränderung in der Lichtemission vom System signalisiert wird.
Dieses System kann bei in vitro Untersuchungen angewandt werden, um molekulare Veränderungen bei einer Vielzahl von Anwendungen zu erfassen und es ist für die Automatisierung geeignet. Insbesondere ist es geeignet für die Untersuchung von Proteininteraktionen, Enzymaktivitäten und der Konzentration von Analyten oder Signalisierungsmolekülen in Zellen oder in Lösung. Es ist geeignet für die Arzneimittelentdeckung, Analyten-Screening, Screening von sekundären Botenstoffen, Arzneimittel-Screening, Diagnose, Genotoxizität, Identifikation der Genfunktion, Genentdeckung, und Proteomik.
Es gibt eine Vielzahl von Beispielen zur Demonstration der Vielseitigkeit und Eignung des BRET-Systems, einschließlich Funktionsgenomik, Rezeptorüberwachung, Identifikation von Orphan-Rezeptor-Liganden und Orphan-Rezeptor-Aktivität usw.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das BRET-System in in vitro Untersuchungen verwendet. Im Allgemeinen werden die Proteine eingefügt, indem eine Zelle in vitro mit einem oder mehreren Vektoren transformiert oder transfiziert wird, welche rekombinante DNA aufweisen, welche einige oder alle der Komponenten des BRET-Systems codieren. Die Zelle erzeugt dann das Protein und BRET findet statt, wenn sich das BDP, das FAM und das Substrat in der geeigneten räumlichen Beziehung befinden. Das Substrat kann entweder exogen hinzugefügt werden, im Anschluss an die Expression der Proteine, oder es wird in seiner Nukleinsäureform eingeführt, wie über einen Vektor mit einem induzierbaren Promotor.
Die Komponenten des BRET-Systems können mit Hilfe molekularbiologischer Verfahren hergestellt oder aus natürlichen Quellen isoliert werden. Nach der Reinigung können sie in nicht-zellbasierten in vitro Untersuchungen zum Überwachen von Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden, oder sie können in in vitro Untersuchungen zum Überwachen von Protein-Protein-Interaktionen in Zellen verwendet werden.
Das BRET-System der vorliegenden Erfindung ist leicht an Automatisierungsmittel und Mittel zum Screening mit hohem Durchsatz anpassbar.
Verbreiterung der spektralen Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptor-Emissionswellenlänge
Wie zuvor angegeben, weisen die aktuellen BRET-Systeme einen relativ niedriges/n Signal-zu-Basis-Verhältnis (S/B) und dynamischen Bereich (DR) auf, und aufgrund des geringen Unterschiedes zwischen der BDP- und der FAM Emissionswellenlänge gibt es immer etwas BDP-Licht, welches im Wellenlängenbereich der FAM-Emission emittiert wird, was zu einer Erhöhung des Hintergrundlichtes führt. Somit besteht Bedarf an der Verbreiterung der spektralen Auflösung zwischen der BDP- und der FAM-Emissionswellenlänge. In einem Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) -System mit einer breiten spektralen Auflösung zwischen der BDP- und der FAM-Emissionswellenlänge.
Es gibt eine Reihe von Ausführungsformen für das verbesserte BRET-System dieser Erfindung, welches Folgendes umfassen: 1) das Subtrahieren des Hintergrundlichtes mittels eines geeigneten Algorithmus; 2) das Optimieren der Interferenzfilter, welche für die Lichterfassung verwendet werden, um die Überlappung zwischen den erfassten Emissionssignalen zu vermindern (die Verwendung von Filtern für enge Bandbreiten erhöht die Auflösung zwischen den Donator- und den Akzeptor-Emissionspeaks); und 3) das Modifizieren der molekularen Komponenten der Technologie zum Auswählen derer, welche einen größeren Unterschied zwischen der Donator- und der Akzeptor-Emissionswellenlänge bieten, wodurch sowohl das S/B als auch der DR eines BRET-Systems verbessert wird.
Verwendung eines Algorithmus zur Korrektur des Hintergrundlichts
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet die Verwendung eines Algorithmus zur rechnerischen Verringerung des Hintergrundlichtniveaus während der BRET-Untersuchung. Obwohl einem Fachmann klar sein dürfte, dass andere Algorithmen verwendet werden können, ist ein einfacher Ansatz das Entfernen des Anteils der BDP-Emission im FAM-Peak. Dies könnte zum Beispiel mit der folgenden einfachen Formel berechnet werden: EmFAM – (EmBDP × Korrekturfaktor) = Korrekturverhältnis EmBDPwobei EmFAM der Emissionswert ist (üblicherweise ausgedrückt als Zählung pro Sekunde: CPS – count per second), welchen man mit dem Filter erhält, der spezifisch für die FAM-Emission ist, und der EmBDP ist der Emissionswert (CPS), welchen man mit dem Filter erhält, der spezifisch für die BDP-Emission ist. Der Korrekturfaktor ist das Verhältnis von EmFAM/EmBDP des BDP in Abwesenheit von FAM. Ein Beispiel der Anwendung dieses Algorithmus ist in Beispiel II dargestellt.
Änderung von Emissionsfiltern
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet die Verwendung des BRET mit einem Spektrophotometer, zum Beispiel einem TopCount^TM (Packard Instrument Company, Meriden, CT), wobei Interferenzfilter hinzugefügt werden, um die Überlappung zwischen dem Licht zu minimieren, welches von der BDP- und der FAM-Emission erfasst wird und wodurch das S/B verbessert wird. Beispiel VIII demonstriert die Verwendung von unterschiedlichen Filterpaar-Spektren zur Verbesserung des BRET-Verhältnisses. Durch die Veränderung der spektralen Eigenschaften der für die Erfassung verwendeten Filter ist es möglich, die spektrale Leistung des Systems zu verbessern. In diesem bestimmten Beispiel wurde ein Filterpaar verändert und dies resultierte in einer größer als vierfachen Verbesserung im S/B.
Veränderung der BDP-Emission
Wie bereits zuvor diskutiert, kann die BDP-Emission durch Modifikationen am BDP-Substrat manipuliert werden. Im Falle von Luciferasen ist das Substrat Coelenterazin. Das Grundprinzip hinter der Änderung der BDP-Emission ist, die Auflösung zwischen der Donator-Emission und der Akzeptor-Emission zu verbessern. Das ursprüngliche BRET-System verwendet Rluc als Donator, EYFP (oder Topas) als Akzeptor und Coelenterazin-h-Derivat als Rluc-Substrat. Diese Komponenten erzeugen, wenn sie in einer BRET-Untersuchung kombiniert werden, Licht im 475–480 nm Bereich für das BDP und im 525–530 nm Bereich für das FAM, was eine spektrale Auflösung von 45–55 nm ergibt. Leider erzeugt Rluc einen breiten Emissionspeak, welcher die GFP-Emission wesentlich überlappt, was wiederum dazu beiträgt, den Rauschabstand des Systems zu verringern.
Eine Ausführungsform des BRET-Systems der vorliegenden Erfindung (siehe Beispiele und unten) bietet bei Verwendung von coel400a als Rluc-Substrat eine breite spektrale Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptor-Emissionswellenlänge (–105 nm). Rluc erzeugt mit coel400a Licht zwischen 390–400 nm, und es wurde ein GFP hergestellt (siehe unten), welches Licht in diesem Bereich absorbiert und Licht bei 505–508 nm re-emittiert. Aufgrund dieser Erhöhung der spektralen Auflösung zwischen der Rluc- und der GFP-Emission, bietet dieses BRET-System ein ausgezeichnetes biologisches Werkzeug zum Überwachen geringfügiger Veränderungen in der Nähe von zwei interagierenden Proteinen. Dies ist eine signifikante Verbesserung gegenüber dem zuvor beschriebenem System, welches das Coelenterazin-h-Derivat und EYFP verwendet, welches einen Wellenlängenunterschied zwischen Donator und Akzeptor von etwa 51 nm aufweist.
Verschiedene Coelenterazin-Derivate sind in der Technik bekannt, einschließlich coel400a (Struktur Nr. VI beschrieben in Biochemistry 18, 2204–2210, 1979), welche als Ergebnis der Rluc-Aktivität Licht bei verschiedenen Wellenlängen erzeugen (welche sich von denen unterscheiden, welche durch das Wildtyp-Coelenterazin erzeugt wird) (siehe Tabelle 1 und Beispiele). Einem Fachmann dürfte klar sein, dass es, da sich der Lichtemissionspeak des Donators verändert hat, notwendig ist, ein FAM auszuwählen, welches Licht bei dieser Wellenlänge absorbiert und dadurch einen effizienten Energietransfer erlaubt. Dies kann zum Beispiel durch Veränderung eines GFP der Klasse 4 erfolgen, so dass es zu einem GFP der Klasse 3 oder 1 wird (siehe Tsien, 1998, für die Klassenbeschreibung). Die spektrale Überlappung zwischen der Lichtemission des Donators und dem Lichtabsorptionspeak des Akzeptors ist, neben anderen, eine Bedingung für einen effizienten Energietransfer (Lakowicz, 1983). GFPs der Klasse 3 und 1 sind bekannt dafür, dass sie Licht bei 400 nm absorbieren und zwischen 505–511 nm re-emittieren. Dies führt zu einem Wellenlängenunterschied zwischen der Donator- und der Akzeptor-Emission von etwa 111 nm.
Einem Fachmann dürfte klar sein, dass im vorliegenden BRET-System jedes Protein verwendet werden kann, welches zu Biolumineszenz in der Lage ist. Nicht-einschränkende Beispiele biolumineszenter Proteine finden sich in Tabelle 3. Alternativ können Enzyme in Kombination mit geeigneten Substraten, wie in der Technik bekannt, verwendet werden, um Biolumineszenz zu erzeugen. Beispiele solcher Enzyme sind β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase. Unabhängig von der Auswahl des BDP ist es möglich, das Emissionsspektrum des Proteins mittels hierin dargelegter Verfahren weiter anzupassen. Insbesondere sind, zur Verwendung mit biolumineszenten Proteinen und anderen Enzymen, verschiedene Substrate von Unternehmen wie Tropix Inc. und Molecular Probes, Inc. kommerziell erhältlich und andere können mit Hilfe von Standardsyntheseverfahren hergestellt werden.
Veränderung des FAM- oder des BDP-Proteins
Ein Teil des Grundprinzips hinter der Veränderung des FAM ist die Anpassung seines Absorptionsspektrums an die Emission des BDP und das spezifische Coelenterazin-Derivat. Die Energietransfer-Effizienzen, welche im BRET auftreten, werden durch die Förster-Gesetze bestimmt. Förster schlug vor, dass der Energietransfer durch Dipol-Dipol-Resonanz (strahlungslose Energie) -Interaktion unter spezifischen Bedingungen zwischen einem angeregten Donator und einem Akzeptor-Chromophor stattfindet. Eine dieser Bedingungen ist der physikalische Abstand zwischen dem Donator- und dem Akzeptor-Rest. Da die Energietransfereffizienz umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstandes ist, ist die Energietransfereffizienz hochempfindlich gegenüber Abstandsveränderungen zwischen dem Donator und dem Akzeptor. Dieser Bereich korreliert gut mit den meisten biologischen Interaktionen, wodurch dieses Verfahren ein ausgezeichnetes Werkzeug zum Überwachen von Protein-Protein-Interaktionen ist. Eine weitere wichtige Bedingung ist die relative Ausrichtung des Donator- und des Akzeptor-Dipols. Wenn sie parallel liegen, ist der Energietransfer maximal, und wenn sie sich in entgegengesetzter Richtung befinden, wird keine Energie übertragen. Weitere intrinsische Parameter in Bezug auf die spektralen Eigenschaften des Donators und des Akzeptors sind wichtig um einen effizienten Energietransfer zu erhalten. Zum Beispiel sind die Quantenausbeute bzw. der Extinktionskoeffizient des Donators bzw. des Akzeptors von sehr hoher Bedeutung; mit der Erhöhung dieser Werte erhöht sich auch die Energietransfereffizienz. Ein weiterer wichtiger Parameter ist die Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Donators und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors. Diese Überlappung muss so hoch wie möglich sein. Dies sind Eigenschaften des FAM (und des BDP), welche verändert werden können, indem die Aminosäuresequenz oder die chemische Struktur verändert werden.
In einer Ausführungsform ist das FAM ein proteinbasiertes Molekül. Das Absorbanz- und Emissionsspektrum des FAM kann mit Hilfe von Standardverfahren verändert werden, welche einem Fachmann bekannt sind, einschließlich ortsspezifischer Mutagenese oder zufällige Mutagenese. In vitro ortsspezifische Mutageneseverfahren sind in der Technik gut bekannt und Sätze zum Ausführen ortsspezifischer Mutagenese sind im Handel erhältlich (z.B. QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Sätze von Stratagene). Im Allgemeinen wird unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese die Codiersequenz für das FAM Protein mutiert, um ein oder mehrere Punktmutationen einzufügen, um Aminosäuren auszutauschen und/oder einzelne oder mehrere Aminosäuren zu löschen oder einzufügen. Das Ergebnis ist eine Codiersequenz für ein mutiertes FAM-Protein. Dieses Protein wird dann mit Hilfe von Standardmolekularbiologischen Verfahren, welche dem Fachmann gut bekannt sind, exprimiert und untersucht, um zu bestimmen, ob sich sein Absorptions- und/oder Emissionsspektrum verändert hat. Das Emissions-/Anregungsspektrum kann sich aufgrund der Mutation verändert haben, sodass das Absorptions- und/oder Emissionsspektrum verschoben ist oder so, dass sich die Intensität des Emissionsspektrums erhöht oder verringert hat.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das FAM ein Grün fluoreszierendes Protein (GFP). Es ist in der Technik gut bekannt, welche Mutationen in der Sequenz des GFP für Veränderungen im Spektrum, der Quantenausbeute und dem Extinktionskoeffizienten verantwortlich sind (US-Patentschrift Nr. 6,077,707, 6,054,321, 5,804,387, 6,066,476, 5,625,048 und 5,777,079).
Weiters können, da es häufig wichtig ist, die relative Genexpression des BDP- und des FAM-Fusionsproteins zu regulieren, Mutationen in das BDP oder das FAM eingefügt werden, welche die spektralen Eigenschaften der Proteine nicht beeinträchtigen, sondern Einfluss auf ihre Zellexpressionsniveaus (Anzahl der Moleküle pro Zelle) haben. Verfahren zum Einleiten des Einbaus solcher Modifikationen sind in der Technik gut bekannt. Zum Beispiel ist in der Technik bekannt, dass die Mutationen F64L und V163A im GFP Thermotoleranz und gute Faltungsfähigkeit bieten (US-Patentschrift Nr. 6,027,881). Außerdem verursacht die Kodon-Humanisierung der cDNAs, welche das Rluc und das GFP codieren, einen Anstieg in der Zellexpression zwischen dem Sechs- und dem Dreißigfachen, wenn sie in Säugetierzellen exprimiert werden (für GFP siehe US-Patentschrift Nr. 6,020,192 und Beispiel V für Rluc). Das Einführen einer Kozak-Konsenssequenz in die cDNA des BDP oder des FAM ist ein Verfahren zum Erhöhen der Proteinexpression in Säugetierzellen, ohne die spektralen Eigenschaften des Proteins zu beeinträchtigen.
Zum Modifizieren des FAM können weitere Verfahren angewandt werden. Es kann eine chemische Modifikation von Aminosäureresten auf gereinigtem oder halbgereinigtem FAM durchgeführt werden. Es kann auch zufällige Mutagenese gekoppelt mit einem Mutanten-Screening-Verfahren angewandt werden, um modifizierte FAMs zu bestimmen, welche für die BDP-/Substrat-Emission besser geeignet oder angepasst sind. Es kann jedes Mittel, welches eine in dem FAM-Protein vorkommende Aminosäure verändert oder modifiziert (sowohl auf dem DNA- als auch dem Proteinniveau, unter Verwendung von in vitro Verfahren) verwendet werden, um das FAM auf die BDP-/Substrat-Emission anzupassen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das FAM ein nicht-proteinöses Molekül sein (z.B. Fluorescein, Rhodamin, Cascade Blue usw.), welches an ein BDP gekoppelt sein kann, um eine BRET-Untersuchung aufzubauen. Es gibt verschiedene bekannte nicht-proteinöse FAM, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können (siehe Tabelle 2 für nicht-einschränkende Beispiele von Donator/Akzeptor-Paaren, welche nicht-proteinöse FAM verwenden). Solche Moleküle können mit Hilfe von in der Technik bekannten chemischen Standardverfahren erzeugt werden. Das nicht-proteinöse FAM muss geeignete spektrale Eigenschaften für den effizienten Energietransfer mit einem BDP aufweisen, wie das Überlappen des BDP-Emissionsspektrums mit dem Anregungsspektrum des FAM. Ein nicht-proteinöses FAM kann mit Hilfe von in der Technik bekannten Standardverfahren chemisch modifiziert werden, um seine spektralen Eigenschaften anzupassen, seine Stabilität zu verbessern, seine Permeabilität zu verändern usw.
Der BDP-Rest kann mit Hilfe der gleichen Verfahren wie für das proteinöse FAM modifiziert werden, um seine spektralen Eigenschaften (Quantenausbeute oder seine Emissionspeakposition für ein spezifisches Substrat) und/oder seine biologischen Eigenschaften (z.B. Zellexpression) zu verbessern. Im Beispiel V wurde das Rluc-Gen Kodon-humanisiert, um seine Expression in Säugetierzellen zu erhöhen und dadurch die Lichtemission zu erhöhen. Ortsspezifische Mutagenese kann auf dem Rluc-Gen durchgeführt werden, um die Quantenausbeute der Lichtproduktion zu verbessern, wenn das Rluc das Coelenterazin bindet. Zum Beispiel haben Liu and Escher (Gene 237, S. 153–159, 1999) gezeigt, dass man, wenn das Cystein an Position 124 (Position 152 in ihrem Konstrukt) mit einem Alanin ersetzt wird, im Vergleich zum nicht-modifizierten Rluc eine erhebliche Steigerung in der Biolumineszenz-Aktivität (unter Verwendung nativen Coelenterazins) des Rluc erhält.
Wie zuvor angegeben, werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung alternative Enzyme als BDPs verwendet, welche auf spezifisch ausgelegten lumineszierenden Substraten agieren können. Die Lichtemission von der Enzymaktivität dieser BDPs ist abhängig von der Struktur des lumineszierenden Substrates. Es dürfte einem Fachmann klar sein, dass zum Verbreitern der spektralen Auflösung zwischen den Emissionswellenlängen ein Substrat ausgewählt wird, welches eine Lichtemission erzeugt, welche eine Auflösung von mindestens 60 nm und bevorzugt 80 nm zwischen den Emissionen erlaubt.
Überwachung der Reaktion des BRET-Systems
In einer Ausführungsform wird der Energietransfer, welcher zwischen den Donator- (BDP) und Akzeptor- (FAM) Resten stattfindet aus den Emissionen berechnet, welche mit Hilfe von Lichtfiltern gemessen werden (einer für die Akzeptoremission und der andere für die Donatoremission), welche spezifische Wellenlängen auswählen (siehe Gleichung 1). Ea/Ed = BRET-Effizienz (1)wobei Ea als die FAM-Emissionsintensität definiert ist (Emissionslicht wird mit Hilfe spezifischer Filter angepasst für die Emission des Akzeptors ausgewählt), und Ed ist als die BDP-Emissionsintensität definiert (Emissionslicht wird mit Hilfe spezifischer Filter angepasst für die Emission des BDP ausgewählt).
Der Fachmann dürfte leicht verstehen, dass es sich bei den Lichtfiltern um jegliche Art von Filtern handeln kann, welcher eine für den BRET geeignete Wellenlängendiskriminierung zulässt. Zum Beispiel können Lichtfilter, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Interferenzfilter, Langpassfilter, Kurzpassfilter usw. sein. Die Intensitäten (üblicherweise in Zählungen pro Sekunde (CPS)) der Wellenlängen, welche die Filter passieren, werden entweder mit einem Photovervielfacher (PMT – photo-multiplier tube) oder einer CCD- Kamera quantifiziert. Die quantifizierten Signale werden anschließend verwendet, um Energietransfereffizienzen zu berechnen. Die Energietransfereffizienz erhöht sich mit ansteigender Intensität der Akzeptoremission. Im Allgemeinen wird ein Verhältnis der Akzeptoremissionsintensität zur Donatoremissionsintensität bestimmt (siehe Gleichung 1), bei welchem es sich um ein abstrakte Zahl handelt, welche die Energietransfereffizienz reflektiert. Das Verhältnis erhöht sich mit einem Anstieg des Energietransfers (siehe Xu et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 151–156).
Die Energietransfereffizienzen können auch mit Hilfe des umgekehrten Verhältnisses der Donatoremissionsintensität zur Akzeptoremissionsintensität berechnet werden (siehe Gleichung 2). In diesem Fall verringern sich die Verhältnisse beim Anstieg der Energietransfereffizienz. Ed/Ea = BRET-Effizienz (2)wobei Ea und Ed wie zuvor definiert sind.
Die Lichtintensität der BDP- und FAM-Emission kann auch mit Hilfe eines Monochromator-basierten Gerätes wie z.B. einem Spektrofluorometer, einer Digitalkamera (CCD) oder einem Dioden-Array-Detektor quantifiziert werden. Unter Verwendung des Spektrofluorometers erfolgt ein Emissionsscan, sodass bei Zugabe des Substrates sowohl der BDP- als auch der FAM-Emissionspeak erfasst werden. Die Flächen unter den Peaks stellen die relative Lichtintensitäten dar und werden verwendet, um wie zuvor beschieben die Verhältnisse zu berechnen. Jedes Gerät, welches in der Lage ist, Licht für das BDP und das FAM aus der gleichen Probe zu messen, kann verwendet werden, um das BRET-System der vorliegenden Erfindung zu überwachen.
In einer alternativen Ausführungsform ist die FAM-Emission allein geeignet für die effektive Erfassung und/oder Quantifizierung des BRET. In diesem Fall wird die Energietransfereffizienz unter Verwendung der Akzeptoremissionsintensität allein berechnet. Es dürfte einem Fachmann klar sein, dass zur Messung des Energietransfers die Akzeptoremissionsintensität verwendet werden kann, ohne eine Verhältnisberechnung durchzuführen. Dies beruht auf der Tatsache, dass der Akzeptor idealerweise nur dann Licht emittiert, wenn er das Licht, welches vom BDP übertragen wurde, absorbiert. In diesem Fall ist nur ein Lichtfilter notwendig.
In einer alternativen Ausführungsform wird die Energietransfereffizienz mit nur einem Lichtfilter gemessen, erfordert aber außerdem eine ratiometrische Messung. In diesem Fall wird die Lichtintensität für den Donator oder der Akzeptor mittels eines geeigneten Lichtfilters bestimmt und eine weiter Messung der Proben erfolgt ohne die Verwendung eines Filters (Intensität des offenen Spektrums). Bei dieser letzteren Messung wird die gesamte Lichtausbeute (für alle Wellenlängen) quantifiziert. Die Verhältnisberechnungen erfolgen dann unter Verwendung von entweder Gleichung 3 oder 4. Für Gleichung 3 ist nur der Lichtfilter für den Akzeptor erforderlich. Für Gleichung 4 ist nur der Lichtfilter für den Donator erforderlich. Ea/Eo – Ea = BRET-Effizienz oder = Eo – Ea/Ea (3) Eo – Ed/Ed = BRET-Effizienz oder = Ed/Eo – Ed (4)wobei Ea und Ed wie oben definiert sind, und Eo ist definiert als die Emissionsintensität für alle Wellenlängen kombiniert (offenes Spektrum).
Es dürfte einem Fachmann klar sein, dass aus Gleichung 1 bis 4 weitere Gleichungen abgeleitet werden können. Zum Beispiel beinhaltet eine solche Ableitung eine Korrektur des Hintergrundlichts, welches bei der Emissionswellenlänge für BDP und/oder FAM vorliegt.
Bei der Durchführung einer BRET-Untersuchung können Lichtemissionen von jeder Kammer mit Hilfe des BRETCount bestimmt werden. Das BRETCount-Gerät ist ein modifizierter TopCount^TM, wobei es sich bei dem TopCount^TM um einen Mikroplatten-Szintillations- und Lumineszenzzähler, verkauft von Packard Instrument (Meriden, CT), handelt. Anders als klassische Zähler, welche zum Eliminieren von Hintergrundrauschen zwei Photovervielfacher (PMTs) in Übereinstimmung verwenden, setzt der TopCount^TM einfache PMT-Technologie und zeitaufgelöste Impulszählung ein zur Rauschverringerung, um die Zählung in standardmäßigen, opaken Mikroplatten zu ermöglichen. Die Verwendung von opaken Mikroplatten kann optische Nebensignaleffekte auf vernachlässigbare Niveaus verringern. TopCount^TM gibt es in verschiedenen Formaten, einschließlich mit 1, 2, 6 und 12 Detektoren (PMTs), welche das gleichzeitige Lesen von 1, 2, 6, bzw. 12 Proben ermöglichen. Neben dem BRETCount sind weitere handelsübliche Geräte in der Lage, BRET durchzuführen: das Victor 2^TM (Wallac, Finnland (Perking Elmer Life Sciences)) und das Fusion (Packard Instrument, Meriden). BRET kann mit Hilfe von Lesegeräten durchgeführt werden, welche mindestens die FAM-Emission und bevorzugt zwei Wellenlängen (für das FAM und das BDP) oder mehr erfassen können.
Die Verwendung des BRET
Das BRET-System ist geeignet zur Untersuchung von Rezeptor-Dimerisierung/Multimerisierung. Gemäß eines Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein System zum Erfassen der Interaktion (aufeinander zu bewegen, von einander weg bewegen oder das Verändern ihrer Ausrichtung relativ zu einander) der beiden Zielmoleküle geboten. In einem Beispiel, bei dem diese Ausführungsform zum Erfassen von Bindungspartnern verwendet wird, ist das BDP an ein Genprodukt angelagert und das FAM ist an ein unbekanntes Genprodukt angelagert, so dass die Interaktion zwischen den beiden Genprodukten durch die Energieemission von dem System angezeigt wird.
Eine Ausführungsform wird zum Überwachen von Rezeptor- oder Rezeptor-Untereinheits-Homo-Multimerisierung oder -Hetero-Multimerisierung verwendet. Um dies zu erreichen wird ein Genkonstrukt mit dem Rezeptor- oder dem Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit einer BDP- oder FAM-Codiersequenz hergestellt, und ein zweites Genkonstrukt wird einem zweiten Rezeptor- oder einem zweiten Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit dem Gegenstück (FAM oder BDP) hergestellt, wobei der zweite Rezeptor oder die zweite Rezeptor-Untereinheit der/die gleiche sein kann wie der/die erste. Die Genfusionskonstrukte werden verwendet, um Zellen zu transfizieren oder zu transformieren, und die Proteinfusionsprodukte werden exprimiert. In Gegenwart eines geeigneten BDP-Substrates wird als ein Ergebnis der Verbindung der Genprodukte ein BRET-Signal erzeugt, welche erfasst und, wenn nötig, quantifiziert werden kann.
In einer verwandten Ausführungsform kann das Untersuchung in vitro durchgeführt werden, wobei jedes der Genfusionskonstrukte in einem zellfreien System exprimiert wird. In Gegenwart eines geeigneten BDP-Substrates wird die Verbindung der Genprodukte wieder durch Erzeugung eines BRET-Signals angezeigt, welches erfasst und, wenn nötig, quantifiziert werden kann.
Alternativ können die untersuchten Proteine des Rezeptors oder der Rezeptor-Untereinheit chemisch an das BDP und FAM angelagert werden. Auf diese Art und Weise ist es möglich, ein nicht-proteinöses FAM zu verwenden, was bei der Untersuchung der Rezeptorsignalisierung unter variablen Bedingungen von Nutzen ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für die Charakterisierung von Orphan-Rezeptoren verwendet. Ein Genkonstrukt wird mit dem Rezeptor- oder dem Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit einer BDP- oder FAM-Codiersequenz hergestellt, und ein zweites Konstrukt wird mit einer potentiellen Liganden- Codiersequenz fusioniert, im Rahmen, mit der Codiersequenz für das Gegenstück (FAM oder BDP) hergestellt. Die Genfusionen werden verwendet, um Zellen zu transfizieren oder zu transformieren, und die Genfusionen werden exprimiert, um die Proteinprodukte herzustellen. In Gegenwart eines geeigneten BDP-Substrates wird als Ergebnis der Verbindung der Genprodukte ein BRET-Signal erzeugt, welches erfasst und, wenn nötig, quantifiziert werden kann. Ein BRET-Signal gibt an, dass der Orphan-Rezeptor den Liganden bindet. Diese Untersuchung kann für das Screening einer Vielzahl potentieller Liganden durch Herstellung von Genfusionen aus der Codiersequenz einer Sammlung potentieller Liganden verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform, welche auch zum Identifizieren von Liganden für Orphan-Rezeptoren verwendet wird, nutzt die Veränderungen im Zielrezeptor bei der Ligandenbindung. Ein Genkonstrukt wird mit dem Rezeptor- oder dem Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit einer BDP- oder FAM-Codiersequenz hergestellt. Ein zweites Konstrukt wird mit einer Codiersequenz für ein Protein hergestellt, welches sich spezifisch an die aktivierte Form des Zielrezeptors (d.h. der Rezeptor gebunden an seinen Liganden) fusioniert, im Rahmen, mit der Codiersequenz des Gegenstücks (FAM oder BDP) hergestellt. Die Genfusionen werden verwendet, um Zellen in vitro zu transfizieren oder zu transformieren, und die Genfusionen werden exprimiert, um die Genprodukte herzustellen. Ein potentielles Ligandenmolekül wird zu den transfizierten oder transformierten Zellen hinzugegeben, und bei der Bindung dieses Liganden wird der markierte Zielrezeptor einer Veränderung unterzogen (z.B. Konformationsveränderung, Phosphorylierung usw.), sodass er durch das Proteinprodukt der zweiten Genfusion erkannt wird. Das zweite Proteinprodukt bindet dann spezifisch den markierten und nun aktivierten Zielrezeptor, und es wird ein BRET-Signal erzeugt. Das BRET-Signal wird erfasst und, wenn nötig, quantifiziert. Nicht-einschränkende Beispiele von Proteinen, welche sich spezifisch an aktivierte Rezeptoren binden, sind Effektormoleküle (z.B. β-Arrestin, G-Protein, Ubiquitin) und Antikörper, welche gegen die aktive Form des Zielrezeptors erzeugt wurden.
In einer verwandten Ausführungsform können diese Untersuchungen in vitro durchgeführt werden, wobei jedes der Genfusionskonstrukte in einem zellfreien System exprimiert wird. In Gegenwart eines geeigneten BDP-Substrates wird die Verbindung der Genprodukte wieder durch Erzeugung eines BRET-Signals angezeigt, welches erfasst und, wenn nötig, quantifiziert werden kann.
Alternativ dazu kann das Protein des Ziel-Orphan-Rezeptors oder der -Rezeptor-Untereinheit chemisch an das BDP und FAM angelagert werden. Ähnlich kann der Bindungspartner durch chemische Anlagerung des Gegenstückes (FAM oder BDP) markiert werden. Beim Screening von Nicht-Protein-Liganden auf Rezeptorbindung ist es notwendig, das Rezeptormolekül (FAM oder BDP) chemisch an den potentiellen Liganden anzulagern. Auf diese Art und Weise ist es möglich, ein Nicht-Protein-FAM zu verwenden, was für die Untersuchung der Rezeptor-Signalisierung unter variablen Bedingungen von Nutzen ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bietet ein System zum Erfassen von Interaktionen, welche als Konsequenz der Rezeptor-Signalisierung stattfinden, und wobei eine solche Signalisierung durch sekundäre Botenstoffe erfolgt. In dieser Ausführungsform sind die beiden potentiell interagierenden Partner bekannt und mit BDP bzw. FAM markiert. Die markierten interagierenden Partner können mit Hilfe genetischer Verfahren hergestellt werden, durch Fusionierung des Gens, welches einen Partner codiert, im Rahmen, mit einer BDP- oder FAM-Codiersequenz und Fusionieren des Gens, welches den zweiten Partner codiert, im Rahmen, mit dem Gegenstück (entweder FAM bzw. BDP). Die Genfusionen werden dann verwendet, um Zellen in vitro zur Expression der Genfusionsprodukte zu transfizieren oder zu transformieren. Diese Zellen exprimieren auch den Zielrezeptor, und bei Zugabe eines potentiellen Agonisten, Antagonisten oder umgekehrten Agonisten wird das BRET-Signal als eine Anzeige der Rezeptoraktivierung und -signalisierung überwacht.
In einer verwandten Ausführungsform sind die potentiell interagierenden Partner mittels chemischer Verfahren mit BDP und FAM markiert. Dies ist von besonderem Nutzen, wenn einer oder beide Partner Nicht-Protein-Moleküle sind, und wenn das FAM ein Nicht-Protein-Molekül ist.
Zu Beispielen interagierender Partner, welche in dieser Ausführungsform verwendet werden können, zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Adenylatcyclase, welche mit der G-Protein-α-Untereinheit interagiert; G-Protein-α-Untereinheit, welche sich an G-Protein-βγ-Untereinheiten bindet; und Cap-Response-Element-Bindungsprotein (CREB), welches sich an das Cap-Response-Element (CRE) und den Cap-Response-Element-Modulator (CREM) bindet.
Das BRET-System und darauf aufgebaute Untersuchungen können verwendet werden, um die Auswirkung zusätzlicher Moleküle auf die Rezeptorfunktion zu untersuchen. Nachdem eine Interaktion als Teil der Zielrezeptor-Signalisierung identifiziert wurde, kann eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden, um Modulatoren der Rezeptorfunktion zu analysieren. Diese Ausführungsformen können auf Situationen angewandt werden, bei denen es wünschenswert ist, ein Screening auf Modulatorverbindungen durchzuführen oder um Umweltauswirkungen wie den pH-Wert, die Konzentration des Modulators, die Rolle von Ionen usw. zu untersuchen.
Hinsichtlich seiner Anwendung auf Modulatoren von Rezeptor-Dimerisierung/Multimerisierung wird in einer Ausführungsform ein Genkonstrukt mit dem Rezeptor- oder dem Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit einer BDP- oder FAM-Codiersequenz hergestellt, und ein zweites Genkonstrukt wird mit einem zweiten Rezeptor- oder einem zweiten Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit dem Gegenstück (FAM oder BDP) hergestellt, wobei der zweite Rezeptor oder die zweite Rezeptor-Untereinheit der/die gleiche sein kann wie der/die erste oder nicht. Die Genfusionskonstrukte werden verwendet, um Zellen in vitro zu transfizieren oder zu transformieren, und die Proteinfusionsprodukte werden exprimiert. In Gegenwart eines geeigneten BDP-Substrates wird als Ergebnis der Verbindung der Genprodukte ein BRET-Signal erzeugt, welches vor, während und nach der Zugabe einer potentiellen Modulatorverbindung überwacht werden kann, als Anzeichen der Inhibierung oder Verstärkung von Rezeptor- oder Rezeptor-Untereinheits-Interaktionen.
In einer verwandten Ausführungsform sind die Genprodukte physikalisch mit den Reportermolekülen verbunden, was die Verwendung eines Nicht-Peptid-FAM erlaubt.
In einer Ausführungsform betreffend Modulatoren der Rezeptor-Liganden-Bindung wird ein Genkonstrukt mit dem Rezeptor- oder dem Rezeptor-Untereinheits-Gen fusioniert, im Rahmen, mit einer BDP- oder FAM-Codiersequenz hergestellt, und ein zweites Konstrukt wird mit einer potentiellen Liganden-Codiersequenz fusioniert, im Rahmen, mit der Codiersequenz für das Gegenstück (FAM oder BDP) hergestellt. Die Genfusionen werden verwendet, um Zellen in vitro zu transfizieren oder zu transformieren, und die Genfusionen werden exprimiert, um die Proteinprodukte herzustellen. In Gegenwart eines geeigneten BDP-Substrates wird als Ergebnis der Verbindung der Genprodukte ein BRET-Signal erzeugt, welches vor, während und nach der Zugabe einer potentiellen Modulatorverbindung überwacht werden kann, als Anzeichen der Inhibierung oder Verstärkung von Rezeptor- oder Rezeptor-Untereinheits-Interaktionen.
In einer verwandten Ausführungsform sind die Genprodukte physikalisch mit den Reportermolekülen verbunden, was die Verwendung eines Nicht-Peptid-FAM erlaubt.
Zum Erreichen eines besseren Verständnisses der hierin beschriebenen Erfindung, sind die folgenden Beispiele dargelegt. Es dürfte verständlich sein, dass diese Beispiele lediglich illustrativen Zwecken dienen. Daher schränken sie den Umfang dieser Erfindung in keiner Weise ein.
BEISPIELE
BEISPIEL I: Herstellung des BRET-Systems
1. Auswahl einer geeigneten BDP-FAM-Substrat-Kombination
Zur Entwicklung eines effektiven BRET-Systems ist es notwendig, ein BDP und ein FAM auszuwählen, wobei jedes von ihnen oder beide gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert sein kann/können. In der Natur interagieren einige biolumineszierende Protein-Fluorophor-Paarungen direkt miteinander (siehe Ward and Cormier, 1978, für eine Liste natürlich vorkommender Interaktionen). In anderen Fällen wird die Paarungsinteraktion durch andere Proteine mediiert, in deren Abwesenheit die interaktive Kopplung mit einer signifikant niedrigeren Affinität stattfindet. Wenn eine solche verringerte Affinität auf Expressionslevels vorkommt, welche zum Erreichen von BRET erforderlich sind, wobei das BDP und das FAM jeweils an andere Proteinkomponenten gekoppelt sind, dann ist eine solche Paarung zum BRET geeignet. Zu Beispielen von natürlich vorkommenden Systemen zählen die Renilla Luciferase (Rluc)/Renilla GFP-Kopplung (Cormier (1978) Methods Enzymol. 57: 237–244) und die Aequorin/Aequorea GFP-Kopplung (Wilson and Brand (1998) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 197–230). Ein Beispiel eines technisch entwickelten Systems, welches für BRET geeignet ist, ist eine Paarung aus Rluc und verstärktem gelbem Mutanten von GFP (EYFP), welche in Abwesenheit mediierender Proteine nicht direkt in einem signifikanten Ausmaß miteinander interagieren (Y. Xu, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 151–156). Ward and Cormier (1978) beschreiben eine Liste von Coelenterat-Luciferase/GFP-Kombinationen, welche Energietransfer durchführen können. Zu weiteren Fluorophoren, welche geeignete Paarungen für Rluc sind, zählen Fluorophore der GFP-Klassen 1, 2, 4 und einige aus 5. Zu spezifischen Beispielen geeigneter Fluorophore zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Wildtyp-GFP, Cycle 3, EGFP, Smaragd, Topas, 10C Q69K und 10C.
Ein weiterer Aspekt, der bei der Auswahl einer geeigneten BDP/FAM/Substrat-Kombination zu bedenken ist, sind die spektralen Eigenschaften sowohl des BDPs als auch des FAMs. BDP erzeugt Licht, wenn es sein Substrat verarbeitet. Die spektralen Eigenschaften dieses Lichtes sind abhängig von dem verwendeten Substrat-Derivat. Wenn zum Beispiel Renilla Luciferase (Rluc) Wildtyp-Coelenterazin verarbeitet, dann entstehen Lichtemissionspeaks um 460–480 nm und wenn Rluc Coelenterazin-hcp-Derivat verarbeitet, wird Licht mit einem Peak um 445 nm erzeugt. Daher kann Rluc abhängig davon, welches Substrat es verarbeitet, bei verschiedenen Wellenlängen emittieren. Dementsprechend muss, gemäß der Förster-Gesetze, welche den Energietransfer zwischen Donator und Akzeptor beschreiben, das FAM basierend auf der Emissionswellenlänge des BDP ausgewählt werden. Um bei Zugabe des Substrates effizienten Energietransfer zwischen BDP und FAM zu erzielen, muss das FAM-Anregungsspektrum das Emissionsspektrum von BDP überlappen.
Basierend auf den beobachtbaren Emission Spektralpeaks ist demonstriert worden, dass eine Rluc/EGFP-Paarung nicht so gut ist wie eine Rluc/EYEF-Paarung (Y. Xu, (1999), supra und Wang, et al. (1997) in Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photones, Eds. Hastings et al. (Wiley, New York), S. 419–422), selbst wenn Rluc/EGFP in der Theorie (gemäß der Förster-Gesetze) aufgrund der besseren spektralen Überlappung ein besseres Paar sein sollte. Der Emissionspeak des EGFP ist in lebenden Säugetierzellen zu nahe am Emissionspeak des Rluc, was die Schwierigkeit erhöht, jede Emission mit Hilfe von Standardinterferenzfiltern spezifisch zu quantifizieren.
Unter Verwendung von Rluc als BDP, mit Wildtyp-Coelenterazin als Substrat und EYFP als FAM ist der Wellenlängenunterschied, welcher die Donator- und die Akzeptoremission trennt, etwa 50 nm. Da der Emissionspeak des Donators sehr breit ist (> 65 nm), verdeckt er teilweise die Akzeptoremission, was dazu führt, dass das Signal-zu-Basis-Verhältnis (S/B) verringert wird. Um diesen Nachteil zu minimieren, sollte der Unterschied zwischen den Wellenlängen der Donator- und der Akzeptoremission maximiert werden. Der Emissionswellenlängenunterschied kann durch sorgfältige Auswahl des BDP und des FAM basierend auf ihren spektralen Eigenschaften maximiert werden. Dies kann weiters durch eine Veränderung der Emissionswellenlänge des BDP verbessert werden, zum Beispiel durch Verwendung eines anderen Coelenterazin-Substratmoleküls, wenn das BDP eine Luciferase ist, oder durch Veränderung der Absorbanz- und Emissionsspektren des FAM, zum Beispiel durch Verwendung eines mutierten Grün fluoreszierenden Proteins (GFP). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination sowohl aus einer veränderten Emissionswellenlänge des BDP als auch einem veränderten Absorbanz- und Emissionsspektrum des FAM verwendet, um den Abstand zwischen der Donator- und der Akzeptoremission zu maximieren.
Es gibt eine Reihe unterschiedlicher biolumineszierender Donatorproteine, welche in dieser Erfindung eingesetzt werden können. Ein sehr gut bekanntes Beispiel ist die Klasse der Proteine, welche als Luciferasen bekannt sind, welche eine energieliefernde chemische Reaktion katalysieren, bei der eine spezifische biochemische Substanz, ein Luciferin (ein natürlich vorkommendes Fluorophor), durch ein Enzym oxidiert wird, welches Luciferaseaktivität aufweist. Viele verschiedene Organismen, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, einschließlich Spezies von Bakterien, Algen, Pilzen, Insekten, Fischen und anderen marinen Formen, können in dieser Art und Weise Lichtenergie emittieren und jede von ihnen weist spezifische Luciferaseaktivitäten und Luciferine auf, welche sich chemisch von denen anderer Organismen unterscheiden. Luciferin/Luciferase-Systeme sind sehr unterschiedlich in ihrer Form, Chemie und Funktion. Zum Beispiel gibt es Luciferaseaktivitäten, welche kontinuierliche Chemilumineszenz erleichtern, wie sie von einigen Bakterien und Pilzen gezeigt wird, und es gibt diejenigen, welche so angepasst sind, dass sie sporadische oder Stimulus-induzierte Emissionen erleichtern, wie das bei Dinoflagellat-Algen der Fall ist. Als ein Phänomen, welches die Transformation chemischer Energie im Licht einschließt, ist Biolumineszenz nicht auf lebende Organismen beschränkt, und die Gegenwart lebender Organismen ist auch nicht erforderlich. Es ist einfach eine Art chemilumineszierende Reaktion, welche eine Luciferaseaktivität erfordert, welche in dem einen oder anderen Stadium von einem biologischen Katalysator stammt. Daher ist die Erhaltung oder Konstruktion der wesentlichen Aktivitäten und Chemikalien ausreichend als Mittel zur Bereitstellung des Biolumineszenz-Phänomens. Biolumineszierende Proteine mit Luciferaseaktivität sind daher aus einer Vielzahl von Quellen oder durch eine Vielzahl von Mitteln erhältlich. Beispiele biolumineszierender Proteine mit Luciferaseaktivität finden sich in US-Patentschrift Nr. 5,229,285, 5,219,737, 5,843,746, 5,196,524, 5,670,356.
Alternative BDPs, welche in dieser Erfindung eingesetzt werden können, sind Enzyme, welche auf geeigneten Substraten agieren können, um ein lumineszierendes Signal zu erzeugen. Spezifische Beispiele solcher Enzyme sind β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, β-Glucuronidase und β-Glucosidase. Synthetische lumineszierende Substrate für diese Enzyme sind in der Technik gut bekannt und sind im Handel erhältlich von Unternehmen wie z.B. Tropix Inc. (Bedford, MA, USA).
Es dürfte einem Fachmann klar sein, dass andere Nicht-GFP-Fluorophore oder andere BDPs für das BRET-System der vorliegenden Erfindung geeignet sein können, wenn die Hauptpaarungskriterien erfüllt werden. Zu anderen Quellen können zum Beispiel Paarungen zählen, welche aus Insekten (US-Patentschrift Nr. 5,670,356) oder anderen marinen Organismen (PCT WO 99/49019 und Review in Hastings, 1996) isoliert oder hergestellt sind. Alternativ dazu kann es bevorzugt sein, dass das biolumineszierende Protein mit Luciferaseaktivität und das Fluorophor aus völlig unterschiedlichen Quellen (Organismen) abgeleitet sind, um das Potential für direkte und spontane Affinität zwischen den Paarungen zu minimieren. Tabelle 2 listet nicht-einschränkende Beispiele von FAMs gepaart mit geeigneten BDPs und Substraten auf, wobei die Trennung zwischen den entsprechenden Emissionswellenlängen größer als 50 nm ist. Tabelle 3 listet potentielle Donatoren auf, welche als Alternativen zu Rluc verwendet werden können.
Es gibt eine Reihe unterschiedlicher FAMs, welche in dieser Erfindung eingesetzt werden können. Ein sehr gut bekanntes Beispiel ist die Gruppe der Fluorophore, welche das Grün fluoreszierende Protein aus der Qualle Aequorea victoria und zahlreiche andere Varianten (GFPs) enthalten, welche sich aus der Anwendung der Molekularbiologie, zum Beispiel Mutagenese und chimäre Proteintechnologien, ergeben (R. Y. Tsien (1998) Ann. Rev. Biochem. 63: 509–544). GFPs werden basierend auf der charakteristischen Komponente ihrer Chromophoren klassifiziert, wobei jede Klasse unterschiedliche Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweist: Klasse 1, Wildtyp-Mischung aus neutralem Phenol und anionischem Phenolat; Klasse 2, Phenolat-Anion; Klasse 3, neutrales Phenol; Klasse 4, Phenolat-Anion mit gestapeltem π-Elektronensystem; Klasse 5, Indol; Klasse 6, Imidazol; und Klasse 7, Phenyl (R. Y. Tsien (1998) supra). Weitere nicht-einschränkende Beispiele von FAMs sind in der Tabelle unten aufgeführt, welche Beispiele von Nicht-Protein-FAMs gepaart mit geeigneten BDPs und Substraten auflistet.
Einem Fachmann dürfte klar sein, dass das FAM ein Protein-basiertes Molekül (wie GFPs) oder eine nicht-proteinöse Verbindung (z.B. Fluorescein) sein kann. In letzterem Fall muss das FAM chemisch an den Modulator angelagert sein. Wenn es sich bei dem FAM um ein Protein handelt, kann es genetisch oder chemisch an den Modulator gekoppelt sein. Da das BDP immer ein Enzym ist, folgt, dass es immer ein Protein ist, und daher kann es mit Hilfe rekombinanter DNA- oder chemischer Verfahren an den Modulator angelagert werden.
Zum Untersuchen einer potentiellen BDP-FAM-Paarung werden Proteinfusionen hergestellt, welche das zu testendende BDP und FAM enthalten. Dies kann zum Beispiel mit Hilfe des Verfahrens von Xu et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 151–6, oder wie hierin beschrieben erreicht werden.
Es sollte bestätigt werden, dass die Donator- und Akzeptor-Fluorophoren nicht-störend miteinander in Verbindung stehen. Dies kann durch getrennte Co-Expression der Fluorophoren in den gleichen Zellen und die anschließende Überwachung des Lumineszenzspektrums, um zu bestimmen, ob BRET stattfindet, erreicht werden. Dies kann zum Beispiel mit Hilfe des Verfahrens von Xu et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 151–6, geschehen.
Abschließend sollten Tests durchgeführt werden, um die Erzeugung von BRET aus dem BDP und FAM zu bestätigen, wenn diese mit interagierenden Proteinen fusioniert wurden. Dies kann erfolgen, indem Fusionsproteine unter Verwendung des BDP und FAM mit Testproteinen erzeugt werden, von denen bekannt ist, dass sie miteinander interagieren, und Überwachungen des Lumineszenzspektrums nach der Assoziation. Dies kann zum Beispiel mit Hilfe des Verfahrens von Xu et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 151–6, oder wie hierin beschrieben erreicht werden.
2. Anlagerung des BDP und FAM an ein/en Modulator und/oder Protein(e) von Interesse
Es gibt eine Reihe in der Technik gut bekannter Verfahren zur chemischen oder genetischen Anlagerung des BDP und des FAM an den Modulator oder an die Zielproteine oder -polypeptide von Interesse.
Es können chemische Quervernetzungsreagenzien verwendet werden, um das Reportermolekül (BDP oder FAM) an das untersuchte Protein anzulagern. Diese Reagenzien sind in der Technik gut bekannt und zu ihnen zählen homobifunktionelle und heterobifunktionelle Reagenzien, welche zwei reaktive Gruppen aufweisen (die gleichen bzw. unterschiedliche), welche ein Mittel zum Verbinden der beiden Moleküle darstellen. Zu den reaktiven Gruppen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Succinimidylester, Maleimide und Iodacetate. Diese Reagenzien können weiters ein Spacer-Molekül zwischen dem Reportermolekül und dem untersuchten Protein bereitstellen und dadurch die sterische Behinderung vermindern. Eine weitere Art eines chemischen Quervernetzungsreagens, welches in der Technik gut bekannt ist, ist eines, welches eine chemische Bindung zwischen dem untersuchten Protein und dem Reportermolekül bildet, ohne selbst in das Produkt eingeschlossen zu werden. Diese Art des Reagens erlaubt es dem Reportermolekül und dem untersuchten Protein, ohne ein Zwischenmolekül verbunden zu sein.
In einigen Fällen kann eine nicht-kovalente Interaktion mit ausreichender Affinität als eine Quervernetzung zwischen dem Reportermolekül (BDP oder FAM) und dem untersuchten Protein funktionieren; zu Beispielen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Avidin-Biotin- und Antikörper-Hapten-Interaktionen. Biotinylierungs- und Haptenylierungsreagenzien sind in der Technik gut bekannt und können verwendet werden, um das Reportermolekül oder das zu untersuchende Protein effektiv mit einem Tag zu versehen, so dass es mittels eines markierten Erfassungsreagens erkannt werden kann. Für dieses System ist das Erfassungsreagens entweder mit dem zu untersuchenden Protein bzw. mit dem Reportermolekül markiert.
Verfahren zum genetischen Anlagern des zu untersuchenden Proteins an das Reportermolekül (BDP oder FAM, wobei FAM ein Protein ist), sind in der Technik auch gut bekannt. Im Allgemeinen beinhalten diese Verfahren die Fusion der Codiersequenzen für jedes Protein, im Rahmen, und unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen, gefolgt von der Expression des entstehenden Fusionsgens in vitro (nach Transfektion oder Transformation in geeignete Zellen).
Für die in vitro Produktion können BDP- und FAM-Proteine gemäß der Erfindung durch Transformation (Transfektion, Transduktion oder Infektion) einer Wirtszelle mit dem gesamten oder einem Teil eines BDP- oder FAM-codierenden DNA-Fragmentes in einem geeignetem Expressionsvehikel hergestellt werden. Zu geeigneten Expressionsvehikeln zählen: Plasmide, Viruspartikel und Phagen. Bei Insektenzellen sind Baculovirus-Expressionsvektoren geeignet. Das gesamte Expressionsvehikel, oder ein Teil davon, kann in das Wirtszellengenom integriert werden. Unter einigen Umständen ist es wünschenswert, einen induzierbaren Expressionsvektor zu verwenden, z.B. das LACSWITCH^TM Inducible Expression System (Stratagene, LaJolla, Kalif.).
Fachleute auf dem Gebiet der Molekularbiologie werden verstehen, dass jedes einer Vielzahl von Expressionssystemen verwendet werden kann, um das rekombinante Protein herzustellen. Die genau verwendete Wirtszelle ist nicht kritisch für die Erfindung. Das BDP- und/oder FAM-Protein kann in vitro in einem prokaryotischen Wirt (z.B. E. coli oder B. subtilis) oder in eukaryotischen Wirtszellen (z.B. Saccharomyces oder Pichia; Säugetierzellen, z.B. COS, NIH3T3, CHO, BHK, 293 oder HeLa-Zellen; oder Insektenzellen; oder Pflanzenzellen) hergestellt werden.
Die Wirtszellen, welche das Expressionsvehikel enthalten, können in herkömmlichem Nährstoffmedien kultiviert werden, welches wie benötigt zur Aktivierung eines ausgewählten Gens, Unterdrückung eines ausgewählten Gens, Auswahl von Transformanten oder Amplifikation eines ausgewählten Gens angepasst ist.
Für die effiziente Transkription und Translation von eingefügten Nukleinsäuresequenzen, in vitro, können auch spezifische Initiierungssignale erforderlich sein. Zu diesen Signalen zählen das ATG-Initiierungskodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen ein ganzes natives BDP- oder FAM-Gen oder -cDNA, einschließlich des eigenen Initiierungskodons und benachbarter Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor eingefügt ist, sind möglicherweise keine weiteren Translationssteuerungssignale erforderlich. In anderen Fällen müssen exogene Translationssteuerungssignale, einschließlich möglicherweise das ATG-Initiierungskodon, bereitgestellt werden. Des Weiteren muss das Initiierungskodon in Phase mit dem Leserahmen der gewünschten Codiersequenz sein, um die Translation der gesamten Einfügung sicherzustellen. Diese exogenen Translationssteuerungssignale und Initiierungskodons können verschiedene Ursprünge haben, sowohl natürlich als auch synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch das Einfügen geeigneter Transkriptionsverstärkungselemente, Transkriptionsterminatoren erhöht werden (z.B. Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol. 153, 516).
Zusätzlich kann eine Wirtszelle ausgewählt werden, welche die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in einer spezifischen gewünschten Art und Weise modifiziert und verarbeitet. Solche Modifikationen (z.B. Glykosylierung) und Verarbeitung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten kam für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Verarbeitung und Modifikation von Proteinen und Genprodukten. Es können geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen, welche die Zellmaschinerie für die ordnungsgemäße Verarbeitung des primären Transkriptes besitzen, Glykosylierung und Phosphorylierung des Genproduktes verwendet werden. Zu solchen Säugetierwirtszellen zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 und insbesondere Plexis-choroidei-Zelllinien.
Alternativ dazu kann jedes Fusionsprotein durch Verwendung eines Bindungsmoleküls spezifisch für das exprimierte Fusionsprotein leicht gereinigt werden. Zum Beispiel ermöglicht ein System beschrieben in Janknecht et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972 die einfache Reinigung von nicht-denaturierten in humanen Zelllinien exprimierten Fusionsproteinen. Bei diesem System wird das Gen von Interesse in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subkloniert, sodass der offene Leserahmen des Gens translational mit einem Amino-terminalen-Tag bestehend aus sechs Histidin-Resten fusioniert wird. Extrakte aus Zellen infiziert mit rekombinantem Vaccinia-Virus werden auf Ni²⁺-Nitrilessigsäure-Agarose-Säulen geladen und Histidin-markierte Proteine werden selektiv mit Imidazol-haltigen Puffern eluiert.
Alternativ dazu kann BDP und/oder FAM mit einer Immunglobulin-Fc-Domäne fusioniert werden. Ein solches Fusionsprotein kann mittels einer Protein-A-Säule leicht gereinigt werden.
3. Herstellung des BDP-FAM-Fusionsmoleküls
Einem Fachmann dürfte klar sein, dass die Komponenten des BRET-Systems (d.h. BDP, FAM und M) und ihre Derivate kombiniert werden können, um ein einzelnes Fusionsmolekül zu bilden, welches mittels rekombinanter Verfahren hergestellt, aus natürlichen Quellen isoliert oder chemisch synthetisiert werden kann, oder durch eine Kombination davon. Weiters können die Komponenten entweder als einzelne Einheit oder getrennt hergestellt werden, mit anschließender Kopplung unter Verwendung von Standardkopplungsverfahren. Es sind verschiedene Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins möglich und diese sind im Folgenden aufgelistet:
BDP-M-FAM: der Modulator ist genetisch oder chemisch zwischen die BDP- und FAM-Anteile eingefügt.
FAM-M-BDP: umgekehrte Konfiguration von BDP-M-FAM
BDP-M-FAM: T-Variation, bei welcher der Modulator chemisch an eine Linker- (Peptid oder Nicht-Peptid) Sequenz angelagert ist, wodurch die BDP- und FAM-Anteile miteinander verbunden werden.
FAM-M-BDP: umgekehrte Konfiguration von BDP-M-FAM
BDP-FAM-M: der Modulator ist genetisch oder chemisch nur an den FAM-Anteil angelagert
BDP-FAM(M): der Modulator ist genetisch entweder am Amino- oder am Carboxy-Terminus des FAM-Anteils oder intern in den FAM-Anteil eingefügt
M-BDP-FAM: der Modulator ist genetisch oder chemisch nur an den BDP-Anteil angelagert
BDP(M)-FAM: der Modulator ist genetisch entweder am Amino- oder am Carboxy-Terminus des BDP-Anteils oder intern in den BDP-Anteil eingefügt
Das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe standardmäßiger rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden, welche dem Fachmann gut bekannt sind. Zum Beispiel kann bei der Herstellung der BDP-M-FAM-Konfiguration die BDP-Codiersequenz genetisch in die Mehrfachklonierungsstelle eines Bakterienexpressionsvektors eingefügt werden, so dass die notwendigen regulatorischen Sequenzen wirkungsmäßig mit der BDP-Codiersequenz verbunden werden.
Abschließend werden die verschiedenen Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins nach Herstellung in vitro für die BRET-Untersuchung verwendet, und zwar in den gleichen Zellen, welche zur Herstellung des Fusionsproteins verwendet wurden, jedoch nur wenn die Zellen den interagierenden Faktor exprimieren (endogen oder exogen). Das Substrat Coelenterazin oder jedes Derivat davon wird verwendet, um die Biolumineszenz-Reaktion (BRET-Untersuchung) zu starten und kann zu jeder Zeit vor, während oder nach der BRET-Reaktion zugegeben werden. Das Substrat Coelenterazin, welches zum Starten der Biolumineszenz-Reaktion benötigt wird, kann von kommerziellen Lieferanten (z.B. Molecular Probes) erworben oder mit Hilfe von Standardsyntheseverfahren hergestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden die verschiedenen Konfigurationen von BRET-Fusionsproteinen in vitro als eine Einheit hergestellt, werden jedoch in einem in vitro BRET-Untersuchung verwendet. Die DNA-Konstrukte für verschiedene Konfigurationen von BRET-Fusionsproteinen werden in geeigneten Zelllinien (eukaryotisch oder prokaryotisch) lediglich für ihre Herstellung transfiziert/transformiert. Die verschiedenen Konfigurationen von BRET-Fusionsproteinen, welche in vitro in Zellen hergestellt wurden, werden dann aus den transfizierten/transformierten Zellen gereinigt oder halbgereinigt. Das einfachste Verfahren zum Reinigen von BDP-M FAM ist die Verwendung der Affinitätschromatographie, wobei ein His-Tag, eingefügt in das DNA-Konstrukt (am Amino-Terminus), nach der Translation ein Nickelkügelchen bindet. Es können auch standardmäßige biochemische Verfahren entweder allein oder in Kombination mit Affinitätschromatographie verwendet werden, um die verschiedenen Fusionsproteine auf verschiedene Niveaus zu reinigen. Schließlich können diese gereinigten Fusionsproteine vor ihrem Einsatz im BRET-Untersuchung auch chemisch oder enzymatisch modifiziert werden. Als ein Beispiel einer Modifikation kann eine Phosphatgruppe an einen spezifischen Aminosäurerest, welcher sich in der Modulatorsequenz befindet (z.B. Tyrosin), hinzugefügt werden. Dies erfolgt, damit ein bestimmter interagierender Faktor den Modulator erkennt. Die Phosphatgruppe kann mit Hilfe eines Tyrosin- oder Serin/Threoninkinase-Enzyms angefügt werden, oder chemisch mittels eines exemplarischen Phosphoramidit-Reagens. Weitere Arten von Modifikationen können in Betracht gezogen werden. Diese sind, jedoch darauf beschränkt, Methylierung, Isoprenylierung, Zugabe von Palmitat, Myristat, Sulfat und Zuckergruppen).
In einer weiteren Ausführungsform wird das Fusionsprotein durch eine Kombination von in vitro Verfahren hergestellt. Zuerst wird ein Fusionsprotein genetisch hergestellt und mit Hilfe rekombinanter Verfahren in Zellen exprimiert. Das Fusionsprotein wird dann vor der Modifikation durch chemische oder enzymatische Anlagerung des Modulators in die Linker-Region gereinigt oder halbgereinigt. In diesem Fall kann der Modulator angelagert an die Linker-Region Peptid-basiert oder chemisch-basiert sein. Diese Konfiguration kann in einer in vitro (biochemischen) Untersuchung verwendet werden oder in Zellen in vitro, und zwar unter Verwendung verschiedener Verfahren wie Proteintransfektionsverfahren, permeabilisierendem Wirkstoff, durch Mikroinjektion oder Elektroporation zum Einfügen des Proteins in die Zellen. In allen Fällen wird das Substrat Coelenterazin oder jedes Derivat davon verwendet, um die Biolumineszenz-Reaktion (BRET-Untersuclung) zu starten.
(ii) Verfahren zur Herstellung der verschiedenen Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins in vitro als eine rekombinante Einheit
In einer Ausführungsform können die verschiedenen Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins als eine Einheit in vitro mit Hilfe von IVTT (in vitro Transkriptions-Translations) -Verfahren synthetisiert werden. Bei Herstellung in vitro wird das Gen, welches die verschiedenen Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins codiert, stromabwärts von einem Promotor eingefügt (z.B. normalerweise ein Virus-basierter Promotor: T7, T3, SP6), welcher durch die spezifische virlale RNA-Polymerase erkannt wird, welche der IVTT-Reaktion zugegeben wurde und daher zur Herstellung von mRNA verwendet wird. mRNAs werden dann in einer in vitro Translationsreaktion unter Verwendung von Zellextrakten (z.B. Hasen-Reticulozyten, Weizenkeimextrakt) verwendet, um das Protein herzustellen, welches durch die mRNA codiert wird. Die in vitro Translationsreaktion kann gegebenenfalls an das in vitro Transkriptionsverfahren gekoppelt werden, mit Hilfe von in der Technik bekannten Standardverfahren (z.B. TnT-Kits von Promega). Diese Verfahren zum Herstellen großer Mengen von spezifischer mRNA und Proteinen in vitro sind in der Technik gut bekannt. Weiters bieten verschiedene Lieferanten (Invitrogen, Lifetechnologies, Stratagene, Promega) Sätze und Reagenzien, welche zur Durchführung dieser Reaktionen notwendig sind.
Falls nötig, können die Konfigurationen der mittels IVTT hergestellten BRET-Fusionsproteine gereinigt oder halbgereinigt werden, bevor sie in einer BRET-Untersuchung zum Einsatz kommen, und zwar unter Verwendung der zuvor für die in vitro hergestellten Fusionsproteine beschriebenen Verfahren. Das Fusionsprotein kann nach Herstellung in vitro und Reinigung weiter chemisch oder enzymatisch modifiziert werden, bevor es in einer BRET-Untersuchung zum Einsatz kommt, und zwar wie zuvor für das in vitro hergestellte Fusionsprotein beschrieben.
Schließlich kann das ungereinigte Fusionsprotein, das gereinigte oder halbgereinigte Fusionsprotein oder das gereinigte und modifizierte Fusionsprotein nach Herstellung in vitro in einer in vitro (biochemischen) Untersuchung oder in Zellen in vitro verwendet werden, und zwar unter Verwendung verschiedener Verfahren wie z.B. Proteintransfektionsverfahren, permeabilisierendem Wirkstoff, durch Mikroinjektion oder Elektroporation zum Einfügen des Proteins in die Zellen. In allen Fällen wird das Substrat Coelenterazin oder jedes Derivat davon verwendet, um die Biolumineszenz-Reaktion (BRET-Untersuchung) zu starten.
(iii) Verfahren zum Herstellen der verschiedenen Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins als zwei Einheiten, welche unter Verwendung rekombinanter BDP- und FAM-Anteile miteinander gekoppelt sind
Die Anteile (BDP und FAM) der verschiedenen Konfigurationen des BRET-Fusionsproteins können separat hergestellt (zwei unterschiedliche Einheiten) und vor der Durchführung der BRET-Untersuchung miteinander verbunden werden. In diesem Fall werden das BDP- und das FAM-Protein mittels zuvor beschriebener rekombinanter Technologie hergestellt und gereinigt, oder aus natürlichen Quellen isoliert. Kurz, für die rekombinante Herstellung des BDP- und des FAM-Proteins, werden Gene, welche das BDP und das FAM codieren separat in Expressionsvektoren eingefügt. Diese werden dann verwendet, um das BDP- und das FAM-Protein mit Hilfe von in vitro Verfahren wie zuvor beschrieben herzustellen. Das BDP- und das FAM-Protein werden gereinigt oder halbgereinigt, bevor sie miteinander verbunden werden. Zum Beispiel sind Verfahren für die Reinigung von GFPs (ein Beispiel eines FAM) und Luciferasen (ein Beispiel eines BDP) in der Technik bekannt (Deschamps, et al. (1995) Protein Expression and purification 6: 555–558; Matthews, J. C., et al. (1977) Biochemistry 16: 85–91; Ward, W. W. and Cormier, M. J. (1978) Photochemistry and Photobiology 27: 389–396). Die beiden Anteile werden über eine Brücke mit Hilfe chemischer Mittel verbunden. Dies ist bevorzugt, falls es sich bei dem Modulator nicht um ein Peptid handelt. Eine Reihe von homo-heterobifunktionellen Quervernetzungsreagenzien, alle in der Technik gut bekannt, können verwendet werden, um den Modulator (wie z.B. DSP, GMBS usw.; siehe Pierce Katalog und Handbuch für die Bedeutung dieser Akronyme) zu bilden. Moleküle und chemische Gruppen, welche den Modulator oder einen Teil des Modulators bilden, können kovalent entweder an den Amino- oder Carboxy-Terminus der Anteile angelagert werden oder unter Verwendung interner Aminosäuren. Die Modulatorregion oder -sequenzen können während der Anlagerung der beiden Anteile gebildet werden oder nach der Anlagerung der beiden Anteile durch chemische Mittel (BDP-_M-FAM) angefügt werden (in den Linker, der die beiden Anteile miteinander verbindet). Einem Fachmann dürfte leicht verständlich sein, dass die Proteinanteile vor der Kopplung modifiziert werden können, um ihre Anlagerung aneinander zu erleichtern. Die chemische Zusammensetzung des Modulators, oder in einigen Fällen des Linkers, ist nicht kritisch. Der molekulare Abstand zwischen dem Donator- und dem Akzeptoranteil ist wichtiger. Er sollte zwischen 10 und 100 Å betragen.
In einer weiteren Ausführungsform werden die beiden BRET-Anteile (BDP und FAM) mit Hilfe rekombinanter Verfahren exprimiert und als eine Einheit gereinigt, in welcher sowohl Donator als auch Akzeptor durch eine Peptidlinkerregion genetisch miteinander verbunden sind (wodurch ein BDP-FAM- oder ein FAM-BDP-Fusionsprotein gebildet wird), und der Modulator ist chemisch entweder an den Donator- (M-BDP-FAM) oder den Akzeptor- (BDP-FAM-M) Anteil angelagert, nach der Reinigung oder teilweisen Reinigung des BDP-FAM- oder des FAM-BDP-Fusionsproteins.
Es dürfte einem Fachmann klar sein, dass das BDP und das FAM vor dem BRET-Untersuchung nicht auf die gleiche Art und Weise hergestellt werden müssen. Zum Beispiel kann das BDP aus einem Organismus isoliert werden, und das FAM kann mit Hilfe rekombinanter Technologie oder IVTT-Technologie hergestellt und gereinigt werden. Oder das BDP kann unter Verwendung eines modifizierten Gens und rekombinanter Technologie hergestellt und gereinigt werden, und das FAM kann aus einem Organismus isoliert oder chemisch synthetisiert werden.
BEISPIEL II: Ein Algorithmus für das BRET-Untersuchung
Dieses Beispiel nutzt den folgenden Algorithmus zur Korrektur bei Hintergrundlichts: (Em550 – Em470 × Korrekturfaktor) = Korrekturverhältnis Em470wobei Em550 die Emission bei 550 nm von einem FAM, ausgedrückt als CPS, darstellt, und Em470 stellt die Emission bei 470 nm von einem BDP, ausgedrückt als CPS, dar. Der Korrekturfaktor wurde experimentell unter Verwendung des Rluc-Konstruktes allein transfiziert (ohne das EYFP-Konstrukt) berechnet. Der Korrekturfaktor ist das Verhältnis (550/470 nm) erzeugt durch ein Rluc-Konstrukt zu einer gegebenen Zeit nach Zugabe von Coelenterazin. 3 und 4 zeigen die nicht-korrigierten bzw. korrigierten Daten. Bei beiden Figuren wurden die gleichen Rohdaten verwendet (Lichtemissionen bei Verwendung beider Filter). Der einzige Unterschied ist, dass in 4 das Verhältnis unter Verwendung der oben genannten Formel korrigiert wurde. In diesem Beispiel verändert der obige Algorithmus die Bereichsdynamik des Untersuchungen nicht, welche in beiden Figuren noch immer etwa 0,1 ist (der Unterschied zwischen dem maximalen und dem minimalen Verhältnis). Jedoch verändert sich das S/B (Signal-Rausch-Verhältnis). S/B ist das Verhältnis zwischen den maximalen und minimalen BRET-Verhältnis-Werten. In 3 ist das S/B 1,07 im Vergleich zu 4,77 in 21. Die Einführung des Algorithmus in die Berechnung der BRET-Verhältnisse könnte während des HTS-Prozesses von großem Nutzen sein, da er den Hintergrund verringert und das S/B erhöht und somit die Ergebnisinterpretation erleichtert.
BEISPIEL III: Chemische Synthese von Coelenterazin-Derivaten
Eine Reihe von Veröffentlichungen (Hart et al., 1979; Chen et al., 1991; Chen et al., 1992; Matthews et al., 1977b; Shimomura et al., 1988; Shimomura et al., 1990; Shimomura et al., 1993; Shimomura, 1995) offenbart ein Derivat von Coelenterazin, welches hierin als coel400a oder Phenylcoelenterazin bezeichnet wird (Struktur Nr. VI beschrieben in Biochemistry 18, 2204–2210, 1979), welches, wenn es durch Rluc verarbeitet wird, Licht bei 400 nm erzeugt. Die Verwendung dieses coel400a mit Rluc, kombiniert mit einem GFP, welches Licht bei 400 nm absorbiert (z.B. GFPs der Klasse 1 und 3), könnte ein BRET-System bereitstellen, welches einen breiten Unterschied zwischen den Emissionswellenlängen aufweist. 1962 entdeckte Shimomura et al. das lumineszierende Protein aus der Qualle Aequorea victoria und demonstrierte, dass Aequorin aus einem Komplex aus Apoaequorin und Coelenterazin besteht. Die Coelenterazinverbindung ist verantwortlich für die Lichtemission in der Biolumineszenz-Reaktion. Seit Shimomura wurde das Biolumineszenz-System extensiv untersucht und die Synthese von Coelenterazin-Derivaten gestartet.
Ursprünglich wurde die Synthese von Coelenterazinen am besten von Chart et al. beschrieben, nach einem Syntheseweg, welcher ursprünglich von Kishi veröffentlicht wurde. Dieser Syntheseweg ist als das Kishi-Verfahren bekannt, welches von Shimomura rezensiert und angewandt wurde, um eine Vielzahl von Coelenterazinen herzustellen. Von den frühen 1970ern bis 1990 variierten die Verfahren zur Herstellung von Coelenterazinen nicht sehr. Bei einem Beispiel verwendet ein Zwischen-Entmethylierungsverfahren inzwischen Ethanthiol. Um 1990 erschienen einige neue synthetische Verfahren zum Einfügen von Aryl-Gruppen in Pyrazine. Ebenfalls erarbeitete eine italienische Gruppe der Universität Bologna, Paradisi et al., ein verbessertes Verfahren. Synthese von Phenylcoelenterazin (siehe Schema 3, 34, R₁ = R₂ = H)
All diese Verfahren führen letztendlich zu Schema 3 (34), der Kopplung eines Arylpyrazins und eines α-Oxoaldehyds. Das entstehende Coelenterazin wird durch Flash-Chromatographie gereinigt, um eine Verbindung zu erhalten, welche ausreichend rein ist, um sie zur Erzeugung der Aequorin-Biolumineszenz zu verwenden. In Schema 3 (34) stellen beide Substituenten R₁ und R₂ ein Wasserstoffatom in dem Phenylcoelenterazin dar.
In Schema 1 (32) und Schema 2 (33) ist die Synthese der Zwischenprodukte von Aminopyrazin (Schema 1) und α-Oxoaldehyd (Schema 2) dargestellt. In den separaten Beschreibungen der Synthese sind die Referenzen für jeden einzelnen Schritt bereitgestellt. Arylpyrazine, eine der Schlüsselverbindungen bei der Coelenterazinsynthese (siehe Schema 3, 34) können leicht durch Verwendung der Suzuki-Aryl-Borsäure-Kopplungsreaktion oder eine Stille-Kopplung hergestellt werden. Die Synthese verschiedener Coelenterazine ist unter Verwendung eines der veröffentlichten Verfahren möglich. Jedoch erfordert die Synthese viel Erfahrung, da die Zwischenprodukte manchmal instabil sind, und die Endprodukte sind lichtempfindlich, und in Lösung sind die Verbindungen empfindlich gegenüber Zerstörung. Die Reinigung ist häufig schwierig, jedoch ist die Flash-Chromatographie geeignet, um ausreichend reine Coelenterazine zu erhalten.
Schema 1: Synthese von Aminopyrazinen (32)
Herstellung von 3-Chlor-2-(1-hydroxybenzyl)pyrazin (I B)
Unter Verwendung des Verfahrens von Turck et al. (Communications, 881–884, 1988) wurden Benzaldehyd und THF (Tetrahydrofuran) frisch destilliert. Unter einer Argon-Atmosphäre wurden in einem 3-Hals-Kolben 450 ml THF auf –10°C abgekühlt. Als nächstes wurden 52,2 ml einer Buli-Lösung (in Hexan 84 mMol) zugegeben und weiter auf –70°C abgekühlt. Mittels einer Spritze wurde 15 ml (88 mMol) Tetramethylpiperidin zugegeben. Die Mischung wurde für eine halbe Stunde bei 0°C gerührt und danach wieder auf –70°C abgekühlt. Dazu wurden 6 ml Chlorpyrazin zugegeben, gefolgt von Rühren für 30 Minuten bei –70°C. Frisch destilliertes Benzaldehyd wurde in 15 Minuten bei einer Temperatur zwischen –65°C und –60°C zugegeben. Die Mischung wurde mit einer Mischung aus 30 ml HCl/30 ml Ethanol/60 ml THF bei –60°C in etwa 15 Minuten hydrolysiert. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und mit 150 ml gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung neutralisiert. Nach Verdunstung eines Teils der Lösungsmittel wurde die Lösung mit 2 × 100 ml Dichlormethan extrahiert und die kombinierten Schichten auf MgSO₄ getrocknet. Das Produkt wurde auf einer Kieselgelsäule in 60 ml Dichlormethan filtriert und 400 ml Lösung wurden von der Säule wiedergewonnen. Nach Evaporation des Lösungsmittels wurde ein leicht gelber Feststoff entnommen, Ausbeute 12 Gramm (80%).
Herstellung von 3-Chlor-2-pyrazinylketon (I C)
Unter Verwendung des Verfahrens von Turck et al., (Communications, 881–884, 1988) wurden 14 g MnO₂ als ein feines Pulver in eine Kolben gegeben. Während des Rührens wurde eine Menge von 5,5 g (I B) in 50 ml trockenem THF zugegeben. Bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 24–48 Stunden reagieren lassen (Reaktion gefolgt von NMR). Die Mischung wurde durch einen Glastunnel gefiltert und mit 80 ml THF gewaschen. Trocknung auf MgSO₄. Nach Evaporation des Lösungsmittels erhielt man ein leicht farbiges Öl (5 Gramm, 89%).
Herstellung von 3-Amino-pyrazinylphenylketon
Unter Verwendung der Verfahren von Jones et al. (Synlett, S. 509–510, 1996) und Thomson et al. (J. Org. Chem., Nr. 53, S. 2052–2055, 1988) wurden 6,6 g 3-Chlor-2-pyrazinylketon unter einer Argon-Atmosphäre in 50 ml Ethanol (100%) aufgelöst, während die Mischung auf –20°C bis –30°C abgekühlt wurde. Über 25 Minuten hinweg wurde Ammoniakgas in das System eingeleitet. Die Lösung wurde auf Stahlröhrchen aufgeteilt, und nach dem Verschließen wurden die Röhrchen in einem Ofen über Nacht auf 120°C erhitzt. Nach der Abkühlung wurden die Röhrchen in einen Becher geleert und mit einer Natriumbicarbonat-Lösung neutralisiert. Nach Evaporation eines Teils der Lösungsmittel wurde die Mischung mit Dichlormethan extrahiert und auf MgSO₄ getrocknet. Die Evaporation des Lösungsmittels ergab 3 g des Produktes (60% Ausbeute durch NMR, 80–90% rein).
Herstellung von 2-Amono-3-benzoyl-5-brompyrazin (I E)
Unter Verwendung der Verfahren von Jones et al. (Synlett, S. 509–510, 1996) wurde eine Mischung aus 75 ml Eisessig und 6 g Natriumcarbonat unter einer Argon-Atmosphäre hergestellt. Dazu wurden die rohen 3 g Aminopyrazinylphenylketon zugegeben. Danach wurden 2,4 Gramm Br₂ zugegeben und die Mischung für 30 Minuten gerührt. Die Mischung wurde auf 200 g Eis gegossen und mit Natriumbicarbonat-Lösung neutralisiert, bis die CO₂-Bildung aufhörte. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan extrahiert, die organische Fraktion wurde getrocknet und das Dichlormethan wurde durch Evaporation entfernt. Die Ausbeute lag bei 4 g des Produktes (Reinheit 80% durch NMR), welches ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Herstellung von 2-Amino-3-benzoyl-5-phenylpyrazin (I F)
Unter Verwendung der Verfahren von Jones et al. (Synlett, S. 509–510, 1996) und McKillop et al. (Tetrahedron, Vol. 48 (37), S. 8117–8126, 1992) wurde die Reaktion in einem 3-Hals-Kolben unter einer Argon-Atmosphäre durchgeführt. Zu 7 ml Toluen wurden während des Rührens 100 mg bis (Benzonitril) Cl₂Pd (II) und 125 mg bis (Diphenylphoshino) Butan zugegeben, was zur Bildung eines Schlammes führte. Es wurde eine Mischung hergestellt, welche aus Folgendem bestand: 1 g rohes I E, 650 mg Methoxyphenyl-Borsäure, 2 ml Ethanol, 10 ml Toluen und 3,5 ml 1 M Natriumcarbonat. Die Mischung wurde zu dem oben genannten Schlamm hinzugegeben und die Zusammensetzung für 2,5 Stunden reflexiert. Nach der Abkühlung wurden 20 ml Wasser und 100 ml Ethylacetat zugegeben und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Nach Waschung mit Salzlösung und Trocknung (MgSO₄) wurden die Lösungsmittel evaporiert. Ausbeute 1 g Rohprodukt. Säulenchromatographie (Ethylacetat:Hexan 1:1) ergab 400 mg (90%) reines Produkt.
Herstellung von 2-Amino-3-benzylsphenylpyrazin (I G)
Unter Verwendung des Verfahrens von Jones et al. (Synlett, S. 509–510, 1996) wurde eine Mischung aus 200 mg (I F), 0,55 ml 80% Hydrazinhydrat, 1,3 g KOH und 4 ml Ethylenglykol hergestellt. Die Mischung wurde auf 200–220°C erhitzt und blieb für mindestens 5 Stunden auf dieser Temperatur. Nach Abkühlung und Ansäuerung mit 2 M HCl wurden die Schicht mit Ethylacetat extrahiert. Nach Waschung mit Salzlösung und Trocknung wurden die Lösungsmittel evaporiert. Säulenchromatographie (Ethylacetat:Hexan 1:1) ergab ein leicht gelbes Aminopyrazin I G. Ausbeute 350 mg (70%).
Schema II: (33)
Herstellung von 1-Phenyl-3-diazoaceton (II B)
Unter Verwendung des Verfahrens von F. Arndt & J. Amende (Ber. Btsch. Chem. Ges., S. 1122–1124 und 2259–2265, 1928) wurde Diazomethan im Voraus gemäß Organic Synthesis Vol. 41, S. 16 hergestellt. Die Diazomethanlösung wurde kühl gelagert. Eine Diazomethanlösung (0,3 Mol) wurde nach der Lagerung in der Kühle dekantiert, um gefrorenes Wasser zu entfernen. Die verbleibende Diazomethanlösung wurde auf 0°C abgekühlt. Als nächstes wurden in etwa 20 Minuten 12 Gramm Phenylacetylchlorid in 30 ml trockenem Ether zugegeben. Es kam zu einer Gasentwicklung. Dann wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt, und nach etwa 1 Stunde wurde Argon durch das System geleitet, um überschüssiges Diazomethan zu entfernen. Der Ether wurde teilweise abdestilliert und das Produkt durch NMR analysiert. Das Rohprodukt II B wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Ausbeute etwa 50%.
Herstellung von Benzylglyoxal-1-triphenylphosphazin (II C)
Unter Verwendung des Verfahrens von Bestmann et al. (Chem. Ber. 1345–1355, 1959) wurde die Phenyldiazoaceton-Lösung (II B) auf etwa 0°C abgekühlt. Über die nächsten 15 Minuten hinweg wurden insgesamt 25 Gramm Triphenylphosphin in Portionen von etwa 2 Gramm zu der gerührten Reaktionsmischung zugegeben. Danach wurde die Mischung langsam auf Raumtemperatur erwärmt und nach einer Weile trennten sich leicht gelbe Kristalle von der Reaktionsmischung. Die Mischung wurde über Nacht stehen lassen. Am nächsten Tag wurden die Kristalle abgetrennt und aus Toluen/Ethanol 1:1 rekristallisiert. Reinheit: < 1% Triphenylphosphin. Verbindung > 99% rein. Ausbeute 99%.
Herstellung von Benzylglyoxal (II D)
Unter Verwendung des Verfahrens von Bestmann et al. (Chem. Ber. 2259–2265, 1963) wurde Benzylglyoxaltriphenylphosphazin (10 mMol) in THF (30 ml) aufgelöst, Natriumnitrit (1,52 g) wurde zugegeben und die Mischung wurde in einem Eisbad abgekühlt. Über die nächsten 15 Minuten hinweg wurde die Mischung auf einer Temperatur von 10 bis 15°C gehalten und 18 ml einer 2 M HCl-Lösung wurden zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt und die Mischung wurde gerührt, bis keine Stickstoffentwicklung mehr zu verzeichnen war (1 h). Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht über MgSO₄ getrocknet. Das Produkt wurde durch Vakuumdestillation destilliert. (0,05–0,01 mm Hg) und das Produkt wurde bei 90–110°C gesammelt. Ausbeute 15–25%.
Schema III (34)
Herstellung von „Phenylcoelenterazin"
Unter Verwendung des Verfahrens von Cheng Fen Qi et al. (J. Chem. Soc. Perkin Trams 1, 1992, S. 1607) wurde eine Mischung aus 0,173 mMol Aminopyrazin (I G) und 0,26 mMol Benzylglyoxal (II D), 4 und 50 ml wässr. 36% HCl unter Rühren für 4 Stunden auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der gelbe Feststoff wurde aus Ethanol rekristallisiert und die Reinheit durch NMR geprüft (Reinheit > 95%). Ausbeute 45%.
BEISPIEL IV: Testen der Coelenterazin-Derivate
Nach seiner Synthese und Lyophilisierung wurde das coel400a (beschrieben in Beispiel III) in 100% Ethanol auf eine Konzentration von 2 mM aufgelöst. Das Derivat wurde weiters in BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺, Glukose, Aprotinin mit oder ohne 10 mM DTT) auf eine Arbeitskonzentration von 40 μM oder 20 μM (Vorverdünnung) und eine Endkonzentration von 5 oder 10 μM in der Reaktion verdünnt.
Es wurden zwei unterschiedliche Konstrukte hergestellt, in welchen das EYFP aus dem ursprünglichen Rluc::EYFP (1. Generation) entweder durch Saphir oder GFPuv ersetzt war. Beide Konstrukte wurden separat getestet. Die Konstrukte wurden für ihre Expression in Säugetierzellen in pCDNA3.1 (+) zeo subkloniert.
Verwendete Konstrukte:

pCDNA3.1/Rluc negative Kontrolle
pCDNA3.1/Rluc::Sph positive Kontrolle
pCDNA3.1/Rluc::GFPuv positive Kontrolle

Eine CHO-K1-Zelllinie wurde mittels der DNA-Konstrukte und LipofectAMINE (BRL/Gibco) in 100 mm Schalen (gemäß dem Herstellerprotokoll) transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen gewaschen, geerntet und in BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺, Glukose, Aprotinin mit oder ohne 10 mM DTT) verdünnt. Die biolumineszierenden Reaktionen wurden entweder mit Hilfe des Spektrofluorometers (Fluorolog-3) oder mit Hilfe des BRETCount mit entsprechenden Filtern analysiert. Das Coelenterazin-Derivat wurde mit einer Konzentration von 40 μM (Ende 10 μM oder 5 μM) zu jeder Kammer zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten.
Bei Verwendung von Fluorolog-3: 2 × 10⁶ Zellen wurden pro Untersuchung zugegeben (Küvette 1 oder 2 ml). Die Analyse wurde durchgeführt bei: 22–37°C, Schlitz bei 10 nm, Integrationszeit 0,5–1 Sek., Schritt 2 nm, keine Anregung, Scan zwischen 400–600 nm.
Bei Verwendung des BRETCount wurden 50.000 Zellen pro Kammer in weiße oder schwarze 96-Kammer-Platten gegeben. Die Analyse erfolgte bei 20–25°C, Integrationszeit 1–5 Sek., Lumineszenz-Modus. Die folgenden Filter wurden verwendet: für Rluc 410DF80 (von Omega); für den GFP-Anteil D515/50M (von Chroma). Temperatur: 20–25°C.
Coel400a wurde mit dem BDP mit Hilfe des Fluorolog-3 untersucht, um die Emissionswellenlängen zu bestimmen. Es wurden drei DNA-Konstrukte für die Expression des BDP verwendet: Rluc allein, Rluc::Sph oder Rluc::GFPuv. Diese wurden in CHO-Zellen transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gewaschen, geerntet und zusammen mit den anderen Coelenterazin-Derivaten zur Spektralanalyse in eine Küvette gegeben. 5 zeigt die Spektralanalyse für Coel400A, wenn es durch Rluc verarbeitet wird. Wie erwartet ergab Coel400A, wenn es durch Rluc verarbeitet wird, einen Emissionspeak beim 400 nm. Weiters schien es, dass der Energietransfer zwischen Rluc und dem GFP-Anteil (Sph oder GFPuv) erfolgreich war, da nur eine Emission von etwa 510 nm von dem Rluc::Sph- oder dem Rluc::GFPuv-Konstrukt erfasst wurde. Die spektrale Differenz zwischen Rluc- und GFP-Anteil-Emissionen ist beachtlich. GFPuv schien bei Verwendung dieser Konfiguration und dieses Substrates ein besserer Akzeptor als Saphir zu sein. Während der Spektralanalyse war der Emissionspeak für das GFPuv immer höher im Vergleich zum Saphir für eine ähnliche Rluc-Peak-Höhe. Dies ist nicht ungewöhnlich in Anbetracht dessen, dass GFPuv für den 400 nm Peak eine/n höhere/n Quantenausbeute und Extinktionskoeffizienten aufweist als Saphir (Tsien, 1998). Dieser Unterscheid zwischen den GFPs bedeutet, dass jedes der GFPs hinsichtlich der Akzeptanz von Energietransfer unterschiedlich ist.
Die neuen Coelenterazin-Derivate wurden mit Hilfe des BRETCount getestet. Es wurden Lichtfilter ausgewählt, welche die Anforderungen der neuen BDP und FAMs erfüllen.
Transfizierte Zellen wurden entweder in schwarze oder weiße 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard BioScience, Meriden CT) verteilt, und zwar mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in PBS Ca²⁺/Mg²⁺, Glukose, Aprotinin und mit oder ohne DTT. 6 und 7 stellen die Daten dar, welche man für Coel400A erhielt. Die Verhältnisse (510/400 nm) zu Beginn der biolumineszierenden Reaktion lagen bei etwa 0,6 für Rluc allein, 1,2 für Rluc::Sph und 1,5 für Rluc::GFPuv (6). Rluc::Sph und Rluc::GFPuv lagen etwa 2× bzw. 2,5× höher als das Rluc-Verhältnis. Dies ist ein erheblicher Unterschied im Vergleich zur vorhergehenden Generation. Rluc::EYFP/Rluc lag bei etwa 1,6× (siehe PCT Nr. WO 99/66324). Ein Fachmann dürfte dies erkennen, da es sich bei diesen Daten um ratiometrische Daten handelt und jede kleine Erhöhung signifikant ist.
In 7 wurde das in 6 demonstrierte Experiment wiederholt, außer dass eine schwarze Mikroplatte und eine Leselänge von 2 Sek. anstelle von 1 Sek. verwendet wurden. In diesem Fall erhielt man ein Rluc-Verhältnis von 0,10, ein Rluc::Sph-Verhältnis von 0,29 und ein Rluc::GFPuv-Verhältnis von 0,42. Dieses letztere Resultat demonstriert, dass das zum Messen des BRET verwendete Format (einschließlich des Mikroplattentyps und der Leselänge) von Bedeutung sein kann.
Coelenterazin-Stabilität: Es wurden drei unterschiedliche Stammlösungen von Coelenterazin 400a (gelöst in wasserfreiem Ethanol), welche zu unterschiedlichen Zeiten hergestellt wurden, mit Hilfe des BRETCount getestet. CHO-Zellen wurden vorübergehend nur mit pCDNA3.1-Rluc transfiziert. Achtundvierzig Stunden später wurden 50.000 Zellen in komplettem BRET-Puffer in Kammern aufgeteilt (96-Kammer, weiß, Optiplate). Coelenterazin 400a aus den verschiedenen Stammlösungen wurde dann zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten. 8 zeigt das lumineszierende Signal für die verschiedenen Stammlösungen sofort nach Zugabe des Substrats. Im Vergleich zu einer frisch hergestellten Stammlösung (hergestellt 6. August 1999) wurde für die ältere Stammlösung (hergestellt 19. Februar 1999) eine Reduktion von 22% beobachtet. Die am 22. Juli 1999 hergestellte Stammlösung zeigte keine wesentliche Lumineszenzverringerung.
9 stellt die gleichen biolumineszierenden Reaktionen dar wie 8, jedoch bei t = 5 Min. nach Zugabe des Coelenterazins. In diesem Fall wurde zwischen den verschiedenen Coelenterazin-Stammlösungen kein signifikanter Unterschied festgestellt.
Dieses Beispiel demonstriert, dass coel400a, nachdem es in Ethanol aufgelöst wurde, keinen signifikanten Verlust im lumineszierenden Potential über einen Monat hinweg zeigt. Für einen längeren Zeitraum (6 Monate) gelagertes Coel400a zeigt einen Potentialverlust, jedoch bleibt es akzeptabel und funktioniert auch weiterhin für das BRET-System.
Das Coel400a kann als ein Substrat für BDP verwendet werden, als Teil eines BRET-Systems, welches eine breite spektrale Trennung zwischen der BDP- und der FAM-Emissionswellenlänge zeigt. Die BDP- und FAM-Anteile können modifiziert werden, um die Lichtausbeute-Niveaus zu verbessern und dadurch die Leichtigkeit der Detektion zu erhöhen. Zu weiteren Modifikationen zählen die Kodon-Humanisierung von GFPuv und Rluc.
BEISPIEL V: Modifikation und Adaptation der BDP (Rluc) und FAM (GFP) -Anteile für das coel400A
Nach dem Forster's Gesetz sind drei intrinsische Parameter wichtig, um die Energie von dem Donatoranteil effizient auf den Akzeptoranteil zu übertragen: 1) die Quantenausbeute (QA) des Donators; 2) der Extinktionskoeffizient des Akzeptors; und 3) die Überlappung zwischen der Emission des Donators und der Anregung des Akzeptors. Während der Entwicklung des vorliegenden BRET-Systems wurde erkannt, dass die gesamte Lichtausbeute im Vergleich zum Grundsystem niedrig war. Dieses Problem entsteht aufgrund der Tatsache, dass Rluc, wenn es mit dem neuen Coelenterazin (coel400) verwendet wird, eine viel geringere Quantenausbeute aufweist (> 100× niedriger) als Coelenterazin h. Weiters besitzt der Akzeptoranteil (GFP der Klasse 1) im vorliegenden BRET-System einen Extinktionskoeffizienten, welcher 3 Mal niedriger ist als der von EYFP. Daher ist, selbst wenn die Überlappung zwischen der Donatoremission und der Akzeptoranregung nahezu perfekt ist, dieser BRET-System- Energietransfer nicht effizienter als der grundlegende BRET. Das BRET-System dieser Erfindung besitzt den Vorteil der verbreiteten Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptoremissionswellenlänge.
Die verringerte Energietransfereffizienz könnte bedeuten, dass längere Erfassungszeiten notwendig sein können. Eine Lösung zum Abschwächen der geringen Lichtausbeute ist die Erhöhung der Zellsensorkonzentration durch Erhöhung der Expression der Proteine. Dies wurde folgendermaßen erreicht: 1) die Humanisierung des Rluc und des GFP der Klasse 1 (GFPwt oder GFPuv) und 2) das Testen verschiedener GFP-Mutanten, welche löslicher und thermo-stabiler wären, und weniger empfindlich gegenüber Dimerisation und Photoisomerisation. Die GFP-Mutanten, welche getestet werden konnten, sind in Tabelle 4 angegeben. Die Auswirkungen der getesteten unterschiedlichen Mutationen sind in Tabelle 5 beschrieben.
Eine weitere Möglichkeit zum Verbessern des Systems ist das Ausfindigmachen von Mutationen sowohl im Donator als auch im Akzeptor, welche die Energietransfereffizienzen erhöhen würden. Man fand ein GFP (GFP10 siehe unten), welches als ein besserer Akzeptor agierte.
Rluc-Humanisierung: Die cDNA des Rluc wurde mit Hilfe von zuvor beschriebenen Verfahren Kodon-humanisiert (Patentschrift Nr. US 5874304 und Zolotukhin et al., J. Virol., 70: 4646–4654, 1996). Kurz, humanisiertes Rluc (hRluc) wurde mittels einer Reihe ligierter Polymerase-verlängerter Oligonukleotide synthetisiert. Die hRluc-Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. hRluc wurde in pCDNA3.1 zeo (+) subkloniert. Die Expression von hRluc wurde mit Rluc in vorübergehend transfizierten Säugetierzellen verglichen, 24 und 48 Stunden nach der Transfektion und mit Hilfe von GFP als interner Standard zum Normalisieren der Transfektionen.
GFP-Mutanten und Humanisierung: Die Konstruktion sämtlicher GFP-Mutanten basierte auf einer handelsüblichen GFP-Sequenz. Die Mutationen wurden mit Hilfe eines in vitro ortsspezifischen Mutagenese-Kits, QuickChange^TM von Stratagene, eingefügt. EGFP wurde bereits Kodon-humanisiert und mit einem Valin-Rest nach dem ersten Methionin zum Erzeugen einer Kozak-Übereinstimmungs-Sequenz in der codierenden Nukleinsäure erworben. Sämtliche Mutationen wurden mit Hilfe des ursprünglichen EGFP-Vektors (pEGFP-N1, Clontech) als Quelle der Ausgangsnukleinsäure durchgeführt. Zum Erhalt von GFP1 wurde zuerst eine T65S-Mutation eingefügt. Von diesem Mutanten wurden drei weitere Mutationen (F99S, M153T, V163A), welche für den GFPuv-Phänotyp (GFP4) erforderlich sind, eingefügt. Dann wurden S202F, T203I, S147P und L64F in beide Zwischenprodukte eingefügt. GFPuv zur Verwendung für den Vergleich wurde von Clontech erworben.
Die verschiedenen GFP-Mutanten wurden zuerst mit Hilfe von spektrofluorometrischen Analysen getestet. CHO-Zellen wurden mit der Mutanten-DNA und mit dem pRL-CMV-Vektor als eine interne Kontrolle co-transfiziert. Die Transfektionen erfolgten in 100 mm Schalen mit Hilfe von LipofectAMINE-Reagens unter Einsatz von 7,5 μg Mutanten-DNA und 0,5 μg pRL-CMV. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und vor der Messung der Rluc-Aktivitäten im LumiCount mit Coelenterazin h gezählt. Die Zellen wurden dann durch Verdünnung gemäß ihrer spezifischen Rluc-Aktivität normalisiert. Das gleiche Volumen von Zellen, welche die gleiche Rluc-Aktivität aufweisen, wurde im Spektrofluorometer für die Spektralanalyse verwendet. Das Anregungsspektrum wurde unter Verwendung der folgenden Parameter erhalten: Scan 300–505 nm, em 530 nm Schlitze ex:2 em:5, Scan-Geschwindigkeit 2 nm in Zeit 0,5 Sekunden. Für das Emissionsspektrum wurden die folgenden Parameter angewandt: Scan 430–600 nm, ex 400 nm Schlitze ex:5 em:2, Scan-Geschwindigkeit 2 nm in Zeit 0,5 Sekunden. Es wurden Photoisomerisationsexperimente durchgeführt, und zwar durch Messung der Emissionsintensität konstanter Illumination bei 400 nm für 30 Minuten. Nach diesem Zeitraum wurden auf der zuvor illuminierten Probe Anregungsscans durchgeführt.
Die GFP-Mutanten 1, 6, 9, 10 und 11 wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, Energietransfer von Rluc entgegenzunehmen. Sie wurden in pCDNA3.1-Rluc::EYFP subkloniert (siehe PCT WO 99/66324), wobei das EYFP-Gen mit Hilfe der BamHI-NotI Restriktionsstellen mit den GFP-Mutanten ersetzt wurde, so dass alle GFP-Mutanten im Rahmen mit einem Rluc-Gen subkloniert wurden, um ein Fusionsprotein zu bilden, welches folgende Struktur aufweist: Rluc:Linker:GFP-Mutant. Die Linkerregion, welche sich zwischen dem Rluc und dem GFP-Mutanten befindet, ist die gleiche (9 Aminosäuren in Länge und Zusammensetzung) für alle Konstrukte. CHO-K1-Zellen wurden mit Hilfe der DNA-Konstrukte und LipofectAMINE (BRL/Gibco) in 100 mm Schalen (gemäß dem Herstellerprotokoll) transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen gewaschen, geerntet und in BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺, Glukose, Aprotinin mit oder ohne 10 mM DTT) verdünnt. Die transfizierten Zellen wurden mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in weiße Optiplate gesät (Packard BioScience, Meriden, CT). Die biolumineszierenden Reaktionen wurden mit Hilfe des BRETCount mit entsprechenden Filtern analysiert. Es wurde ein Aliquote von Coelenterazin-Derivat mit einer Konzentration von 20 μM (Ende 5 μM) zu jeder Kammer zugegeben, um die biolumineszente Reaktion zu starten.
Ergebnisse der Rluc-Kodon-Humanisierung: Nach den Sequenzierungsanalysen der hRluc-Gene (Klon 4 und 6), wurden Vergleichsexperimente in Frischzellen (CHO) durch Transfektion von Säugetiervektoren, welche das Rluc-Gen oder das hRluc-Gen exprimieren durchgeführt. Für jeden Vektor wurde ein Reporter-Vektor (welcher konstitutiv ein GFP exprimiert) co-transfiziert, um die Transfektionseffizienzen zu normalisieren (mit Hilfe des FluoroCount). Nach der Normalisierung wurden die Zellen mit Hilfe des SPEX-Spektrophotometers und im BRETCount analysiert. 10 zeigt die Ergebnisse, welche man mit SPEX erhielt. Es wurde kein Unterschied in der Position des Emissionssignals (sofort nach der Zugabe von Coel400a) zwischen den beiden getesteten hRluc-Klonen (Nr. 4 und 6) und wtRluc beobachtet. In allen drei Fällen hatten die Lumineszenzsignale einen Peak bei etwa 400 nm. Das gleiche Ergebnis wurde unter Verwendung des Coelenterazin-Derivates h anstelle des Coel400a (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Dieses Experiment wurde unter Verwendung des BRETCount wiederholt, um den Anstieg des Signals zu quantifizieren, welches erzeugt wird, wenn hRluc anstelle von Rluc verwendet wird (11). 1 Minute nach der Zugabe von coel400a wurde ein 30-facher Unterschied in der Genexpression zu Gunsten von hRluc im Vergleich zu Rluc beobachtet.
Ergebnisse der GFP-Mutanten: Unter Verwendung von standardmäßigen ortsspezifischen Mutageneseverfahren und einem handelsüblichen GFP als Ausgangsmaterial wurden verschiedene GFP-Mutanten erzeugt (siehe Tabelle 4). Es fanden Vergleichsexperimente zwischen den Mutanten statt, um zu bestimmen, welcher die besten Eigenschaften für das BRET-System aufzeigt. Es wurden drei Parameter in Betracht gezogen: i) die Energietransfereffizienz; ii) die relative Helligkeit (welche die intrinsische Fluoreszenz und die Zellexpression beinhaltet); und iii) die Photoisomerisation.
Mit Hilfe eines Spektrofluorometers wurden Emissions- und Anregungsscans durchgeführt, um die GFP-Mutanten zu identifizieren, welche die höhere Helligkeit aufweisen, wenn sie in Frischzellen bei sowohl 25°C als auch 37°C (Daten nicht gezeigt) exprimiert werden. Dies demonstrierte, dass die GFP-Mutanten in Frischzellen auf akzeptablen Niveaus exprimiert wurden. Drei GFP-Mutanten, GFP1, 6 und 9 (und später 10, 11, siehe unten) wurden weiter getestet, um zu bestimmen, ob sie als gute FAMs agieren. Der GFP-Mutant Nr. 9 (F64L, S147P, S202F und T203I) erwies sich als ein sehr gutes FAM (siehe 12).
Es wurden zwei zusätzliche GFP-Mutanten hergestellt, welche eine Mutation entweder an 202 oder 203 aufwiesen (GFP-Mutant Nr. 10: F64L, S147P und S202F und GFP-Mutant Nr. 11: F64L, S147P und T203I). Wie zuvor beschrieben, wurde jeder Mutant, im Rahmen mit dem Rluc-Gen, in einen Expressionsvektor eingefügt. Die zusätzlichen Sequenzen waren identisch mit denen der zuvor hergestellten Vektoren, welche GFP-Mutanten enthielten (d.h. Promotor, Linker zwischen Rluc und dem GFP usw.). Die Vektoren wurden mittels Lipofectamine in CHO-Zellen transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen durch Bestimmung der Rluc-Expression nach der Zugabe von Coelenterazin h im LumiCount für ihre Transfektionseffizienzen normalisiert. 13 zeigt Ergebnisse der BRETCount-Analyse. Der GFP-Mutant Nr. 10 ergab das höchste Verhältnis unter allen im Vergleich zu Rluc allein (negative Kontrolle) (nahezu 8-Fach bei Zeit Null). GFP Nr. 11 ergab ein Verhältnis, welches viel niedriger war als GFP Nr. 10, und selbst noch niedriger als GFP Nr. 9. Eine Liste hergestellter GFP-Mutanten ist in Tabelle 4 dargestellt.
14 stellt das gleiche Experiment wie für die BRETCount-Analyse der GFP-Mutanten der 13 dar, außer dass 40 mM DTT zugegeben wurden, um das Verhältnis über die Zeit zu stabilisieren (siehe PCT WO 99/66324). Bei allen exprimierten Konstrukten, hilft die Zugabe von DTT das Verhältnis zu stabilisieren.
Es können weitere Coelenterazin-Derivate mit einem BRET-System verwendet werden, welches einen GFP-Mutanten enthält. Das einzige handelsübliche Derivat, welches geeignete Lumineszenzeigenschaften nach der Verarbeitung durch Rluc aufweist, ist das hcp-Derivat, welches Licht bei 445 nm erzeugt. 15 zeigt ein Experiment unter Verwendung dieses Derivates in CHO-Zellen, welche vorrübergehend Rluc allein oder die Fusion Rluc::GFP10 exprimieren. Die Daten unter Verwendung des hcp-Derivates wurden mit den Daten verglichen, welche man mit dem coel400a-Derivat erhielt. Bei Verwendung des hcp-Derivates wurde ein Unterschied im Verhältnis von Rluc und dem Fusionskonstrukt Rluc::GFP10 beobachtet. Dieser Unterschied war geringer als bei Verwendung des coel400a. Dies ist nicht überraschend, da das hcp-Coelenterazin Licht bei 445 nm erzeugt, was etwa 45 nm höher ist als das durch coel400a erzeugte Licht. Daher wird durch den Akzeptorkanal (durch den Akzeptorfilter) eine signifikante Lichtmenge erkannt, was in einem Anstieg des Hintergrunds resultiert.
Analyse des GFP10-Mutanten: Während der Entwicklung des BRET-Systems der vorliegenden Erfindung erwies sich ein GFP-Mutant (GFP10) als besser als die anderen Mutanten bei der Entgegennahme des Energietransfers für das Rluc. Die Spektralanalyse des Fusionskonstruktes Rluc::GFP10 ist in 16 gezeigt. Im Vergleich zu Rluc::GFP11 zeigt Rluc::GFP12 einen 3–4-Fachen Unterschied bei der Entgegennahme von Energie vom Rluc. Beim Vergleich der BDP- und FAM-Peakhöhen des GFP11- und GFP10-Konstruktes ist die FAM-Peakhöhe (515 nm) für GFP10 sogar höher als der BDP-Peak.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass dies das Ergebnis einer spontanen Verbindung zwischen Rluc und GFP10 ist, wurde das Rluc::GFP10-Konstrukt in CHO-Zellen exprimiert und mit der Expression von Rluc allein oder Rluc + GFP10 (nicht miteinander fusioniert) in CHO-Zellen verglichen. 17a und 17b demonstrieren, dass GFP10 nicht spezifisch mit Rluc interagiert. 17a demonstriert, dass das Verhältnis von Rluc + GFP10 höher war als für Rluc allein, was anzeigt, dass eine spontane Interaktion zwischen den beiden Anteilen auftreten kann. Diese Interaktion kann jedoch als Resultat einer Überexpression des GFP10 im Vergleich zum Rluc-Protein auftreten. Wenn Zellen mit einer geringen Menge Detergenz (NP-40 0,1%) und einem Dounce-Potter lysiert wurden, um die Zellen zu öffnen (visuelle Beobachtung zeigte mehr als 95% lysierte Zellen), verringerte sich das Verhältnis von Rluc + GFP10 nahezu auf das Level von Rluc, und das Verhältnis der Fusion Rluc::GFP10 veränderte sich nicht.
BEISPIEL VI: Protein-Protein-Interaktions-Untersuchung
Die vorherigen Beispiele demonstrieren, dass das BRET-System dieser Erfindung, welches den GFP-Mutanten, Rluc und Coel400 aufweist, hinsichtlich des Signal-zu-Basis-Verhältnisses (S/B) und des DR eine bessere Leistung erzielt als Systeme des Standes der Technik (welche Rluc und EYFP verwenden), wenn das Rluc mit dem GFP-Mutanten fusioniert ist (Fusionskonstrukt Rluc::GFP). Dieses BRET-System wurde dann in einem Protein-Protein-Interaktions-Untersuchung eingesetzt. Die GFP-Mutanten wurden mit dem kai-A- und -B-Protein fusioniert und zusammen mit Rluc-kaiB in BHK-Zellen co-transfiziert. Subklonierungen wurden wie für die in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/66324 beschriebenen Konstrukte durchgeführt. Die BHK-Zelllinie wurde mit Hilfe der DNA-Konstrukte und LipofectAMINE (BRL/Gibco) in 100 mm Schalen (nach dem Herstellerprotokoll) transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen gewaschen, geerntet und in BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺, Glukose, Aprotinin 2 μg/ml mit oder ohne 10 mM DTT) verdünnt. Transfizierte Zellen wurden mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in weiße Optiplate (Packard BioScience, Meriden CT) gesät. Die biolumineszierenden Reaktionen wurden mittels dem BRETCount analysiert. Das Coel400a-Derivat wurde mit einer Konzentration von 20 μM zu jeder Kammer zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten (Ende Coelenterazin-Konzentration 5 μM).
18a und 18b demonstrieren, dass Rluc-kaiB, wie erwartet, mit GFP-kaiB interagiert. Es ist bekannt, dass kaiB mit sich selbst (siehe Xu et al., 1999) und mit kaiA interagiert, dies jedoch auf einem viel niedrigeren Niveau (EMBO J. 18: 1137–1145, 1999). Zellen, welche Rluc:kaiB und GFP:kaiB exprimieren, wiesen ein viel höheres Verhältnis auf als Zellen, welche Rluc:kaiB und GFP:kaiA exprimieren. Wie erwartet wiesen Zellen, welche Rluc:kaiB allein exprimieren, das niedrigste Verhältnis auf. Die Verwendung von DTT verursachte keine signifikante Veränderung in den Untersuchungsergebnissen: die Verhältnisse waren in Abwesenheit von DTT relativ stabil. Die Verwendung von DTT ist abhängig von der Art der Untersuchungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass das BRET-System unter Verwendung von Rluc und dem GFP-Mutanten zusammen mit coel400a erfolgreich in Protein-Protein-Interaktions-Untersuchungen eingesetzt werden kann.
BEISPIEL VII: Berechnung von Energietransfereffizienzen – Quantifizierung des BDP- und FAM-Emissionslichtes
Ein 2-Detektor-TopCount wurde modifiziert, um den BRET zu messen. Dieser Prototyp wurde später als BRETCount bezeichnet. Unter jedem TopCount PMT wurden Bandpassinterferenzfilter positioniert (zwischen dem PMT und der Detektorbefestigungsplatte). Außerdem wurde die TopCount-Software modifiziert, damit jeder Kammer einer Mikroplatte von jedem PMT gelesen werden kann. Diese Modifikationen erlauben die sequentielle Erfassung von Licht bei spezifischen Wellenlängen, welche von den Proben emittiert werden. Dementsprechend erhielt man für jede Kammer (oder jede Probe) zwei Lichtausbeutewerte, welche jedem Lichtfilter entsprachen. TopCount ist ein temperaturgesteuertes Instrument, welches bei der Durchführung von zellbasierten Untersuchungen oder Zeitverlaufsexperimenten besonders geeignet ist.
Für die hierin dargestellten Beispiele wurden die Bandpassinterferenzfilter basierend auf den Emissionspektren von BDP und FAM ausgelegt, wie unten angegeben: 1) für die Akzeptoremission (Fluorophor): 410DF80 (Omega Optical Inc., Brattleboro, VT); und 2) für die Donatoremission (biolumineszierendes Protein): 515/50 nm (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT). Es können alternative Lichtfilterkombinationen konstruiert werden, je nachdem, welches BDP und FAM in der Untersuchung verwendet wird.
Bei diesem Beispiel wird der BRET durch Dividieren der Lichtausbeute für die 515 nm Filter durch die 410 nm Filter (Akzeptor/Donator) berechnet. Die für den BRETCount verwendeten Instrumentenparameter waren: 1) Untersuchungstemperatur: 25°C; 2) Single-Photon-Zähl-Modus; und 3) Leselänge von 2 Sekunden. für jeden PMT. Die Zellen (CHO-K1) wurden mittels LipofectAMINE (Life Technologies, Rockville, MD) entweder mit pRL-CMV-DNA (welche konstitutiv Rluc exprimiert) oder einem Vektor pCDNA3.1/Rluc::GFPuv (welcher konstitutiv das Fusionskonstrukt Rluc::GFPuv exprimiert) (GFPuv kommt von Clontech, Palo Alto, CA) transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, gezählt und mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in PBS + Ca²⁺ + Mg²⁺ + Glukose + 2 μg/ml Aprotinin in 96-Kammer-Platten (weiße Optiplate von Packard Instruments, Meriden, CT) verteilt.
Typische Transfektionseffizienzen lagen im Bereich von 50–60% (berechnet durch Zählung der GFP-fluoreszierenden Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop), wenn für die Transfektion das Herstellerprotokoll befolgt wurde. Dann wurde zu jeder Kammer Coelenterazin 400a zugegeben (Endkonzentration 5 μM), um die biolumineszierende Reaktion zu initiieren. Die Lichtausbeuten wurden mit Hilfe des BRETCount mit dem 400 nm Lichtfilter (Donatoremission) und dem 510 nm Lichtfilter (Akzeptoremission) und unter Verwendung des normalen TopCount (ohne einen Filter), welcher die Lichtausbeute für alle Wellenlängen (offenes Spektrum) feststellt, bestimmt.
Es wurden acht Messungen für jede Art von transfizierter Zelle und für jede Art der Messung für insgesamt 48 Messungen pro Untersuchung durchgeführt. Tabelle 6 zeigt die Mittelwerte für die unterschiedlichen Untersuchungs-Bedingungen. Die Instrumentenparameter waren folgende: für BRETCount 25°C, Lesezeit 2 Sekunden Photon-Zähl-Modus; für TopCount 19°C, Lesezeit 2 Sekunden., Photon-Zähl-Modus.
BEISPIEL VIII: Veränderung der Emissionsfilter zur Verbesserung der spektralen Leistung des BRET-Systems
CHO-Zellen wurden mittels LipofectAMINE^TM (Life Technologies) unter Befolgung des Herstellerprotokolls in 100 mm Schalen mit DNA-Vektoren transfiziert, welche entweder Rluc, die Rluc::GFP1-Fusion oder die Rluc::GFP10-Fusion exprimieren (siehe 19). Außer dem FAM (GFP) wiesen beide Fusionskonstrukte eine ähnliche Struktur auf. Sie besaßen den gleichen Linker zwischen Rluc und GFP und sie waren unter Verwendung der gleichen Restriktionsstellen in den gleichen Expressionsvektor subkloniert (pCDNA3.1/zeo; Invitrogen). Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit BRET-Puffer (PBS mit Ca²⁺, Mg²⁺, Glukose, 2 μg/ml Aprotinin und 10 mM DTT) gewaschen, geerntet, gezählt und mit einer Dichte von 500.000 Zellen pro ml in BRET-Puffer resuspendiert. Transfizierte Zellen wurden dann mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer auf weiße 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard Instrument Company) aufgeteilt. Fünfzig Mikroliter Coel400a (verdünnt auf 20 μM) wurden zu jeder Kammer zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten (Endkonzentration des Coel400a: 5 μM). Das Gesamtvolumen betrug 200 μl.
Die Mikroplatten wurden dann in ein Victor2-Instrument (Perkin Elmer) eingeschoben. Bei Verwendung im dualen Lumineszenz-Modus ist dieses Instrument in der Lage, die BRET-Signale zu erfassen. Die Instrumentenparameter waren folgende: 2 Sekunden Lesezeit pro Filter, normale Blende, Brennpunkt bei 8 mm. Bei dem in 19 dargestellten Experiment wurden der D410/80 (Chroma Technology Corp.) und der GG475 Langpass- (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT) Filter verwendet, um die Donator- und die Akzeptoremission zu erfassen. Die spektralen Eigenschaften an den Filtern (Blockierungsagens, Bandpass, Transmissionspeak usw.) wurden entsprechend des Emissionsspektrums des Systems ausgewählt (Beispiel III). Die Filter wurden in einem Victor2-Instrument installiert.
Die Rluc-, Rluc::GFP1- und Rluc::GFP10-Fusionskonstrukte erzeugten BRET-Verhältnisse von 0,46, 1,17 bzw. 4,94 (bei Zeit 0). Daher waren die S/B (Anstieg-Fach im BRET-Verhältnis des Fusionskonstruktes gegenüber dem Rluc allein) 2,5 und 10,7 für das Rluc::GFP1 bzw. Rluc::GFP10. Bei dem in 48 dargestellten Experiment wurden dann die gleichen transfizierten Zellen wieder mit einem anderen Filterpaar verwendet: D410/80 (Chroma Technology Corp.) für die Donator- und D515/30 (Chroma Technology Corp.) für die Akzeptoremission. Alle anderen Parameter wurden wie für 20 beschrieben beibehalten. Unter Verwendung dieses neuen Filterpaares erhielt man die BRET-Verhältnisse 0,057, 0,49 und 2,48 für Rluc, Rluc::GFP1 bzw. Rluc::GFP10. Die S/B waren dann 8,6 und 43,7 für das Rluc::GFP1 bzw. das Rluc::GFP10-Fusionskonstrukt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Optimierung/Anpassung der spektralen Eigenschaften der Filter an die Donator- und Akzeptoremission die Gesamtleistung des BRET-Systems signifikant verbessern kann.
BEISPIEL IX: Konstitutives Protein-Protein-Interaktions-Untersuchung
Die CHO-K1-Zelllinie wurde vorübergehend mittels der DNA-Konstrukte und LipofectAMINE^TM (BRL/Gibco), wie im Herstellerprotokoll beschrieben, in 100 mm Schalen transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen gewaschen, geerntet und in BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺ + Glukose + 2 μg/ml Aprotinin) auf eine Dichte von 2.000.000 Zellen pro ml verdünnt. Die biolumineszierenden Reaktionen wurde mittels des BRETCount mit entsprechenden Filtern analysiert. Der BRETCount ist ein modifizierter TopCount, welcher in der Lage ist, Licht zu messen, welches von einer Kammer mit einer spezifischen Wellenlänge (für den Donator und den Akzeptor) kommt. Da der in diesem Beispiel verwendete BRETCount keine optimierten Emissionsfilter für dieses BRET- System aufwies, wurde das BRET-Verhältnis mit Hilfe eines Algorithmus korrigiert (Angers, S. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3684–3689).
Zu den Kammern in weißen 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard Instrument) wurden transfizierte Zellen zugegeben (50.000 Zellen in BRET-Puffer pro Kammer). Die Analyse erfolget bei 25°C, Integrationszeit: 2 Sekunden pro. Wellenlänge im Lumineszenz-Modus. Die verwendeten Filter waren Folgende: für die Rluc-Emission 410DF80 (von Omega); für GFP D515/50M (von Chroma). Coel400a wurde mit einer Arbeitskonzentration von 40 μM (Ende 5 μM) zu jeder Kammer zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten. Das endgültige Reaktionsvolumen lag bei 50 μl. Die Untersuchungen wurden vierfach ausgeführt.
Die zum Transfizieren der Zellen verwendeten DNA-Konstrukte waren Folgende: pCDNA3.1/Rluc-kaiB, pCDNA3.1/GFP-kaiB, pCDNA3.1/GFP-kaiA, und die positive Kontrolle war pBRET+. Die Zellen wurden entweder mit pCDNA3.1/Rluc-kaiB oder pBRET+ allein transfiziert oder mit pCDNA3.1/Rluc-kaiB + pCDNA3.1/GFP-kaiA oder pCDNA3.1/Rluc-kaiB + pCDNA3.1/GFP-kaiB, unter Verwendung gleicher Mengen an DNA in allen Fällen, co-transfiziert.
Kai-Proteine sind CLOCK-Proteine aus Cyanobakterien, welche im Tagesrythmus beteiligt sind. Von kaiB ist bekannt, dass es mit sich selbst, jedoch nicht mit kaiA interagiert (Xu, Y. et al. (1999) Cell Biol., 96: 151–156). Die Proteindomäne von kaiB, welche für diese Homodimerisation verantwortlich ist, wurde entweder mit Rluc oder GFP fusioniert. KaiA wurde nur mit GFP fusioniert. Sämtliche Fusionskonstrukte wurden in den pCDNA3.1/zeo-Säugetierexpressionsvektor (Invitrogen) subkloniert. Die Zellen wurden mit den verschiedenen DNAs (siehe Protokoll) transfiziert und achtundvierzig Stunden nach der Transfektion analysiert. Zellen, welche nur die Rluc-kaiB-Fusion exprimieren, erzeugten ein sehr niedriges BRET-Verhältnis, da kein GFP vorhanden war, um den Energietransfer von Rluc entgegenzunehmen. Zellen, welche Rluc-kaiB und GFP-kaiA exprimieren, wiesen auch ein niedriges BRET-Verhältnis auf, jedoch war es höher als für Rluc-kaiB allein. Wie zuvor angegeben, interagiert kaiB nicht mit kaiA und dürfte kein Signal erzeugen. Zellen, welche das Rluc-kaiB und GFP-kaiB exprimieren, zeigten eine sehr hohe Energietransfereffizienz (BRET-Verhältnis), und zwar aufgrund der kaiB-Homodimerisation, welche das Rluc in die Nähe des GFP bringt. Diese Ergebnisse sind in 21 zusammengefasst.
BEISPIEL X: Interaktions-Untersuchung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors und β-Arrestin
Es wurde eine BRET-Untersuchung entwickelt, um die Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) zu überwachen. Diese Untersuchung nutzt die natürliche Interaktion von β-Arrestin für GPCRs. Wenn sich ein Ligand an einen GPCR bindet, dann löst es stromabwärts befindliche Effektoren (Adenylatcyclase, IP₃/DAG) aus, welche die Niveaus von zellulären sekundären Botenstoffen modulieren. Nach seiner Aktivierung wird der GPCR durch das Hinzufügen einer/von Phosphorylierungsgruppe/n an seinem C-Terminus bzw. seiner dritten intrazellulären Schleife entsensibilisiert. β-Arrestin erkennt diese phosphorylierten Stellen und bindet sich an den Rezeptor, um den Internalisierungsprozess zu starten. Die Internalisierung ist wichtig zum Loslösen des Liganden vom Rezeptor nach der Internalisierung und zum Rückführen des Rezeptors zu der Plasmamembran. Derzeit nutzen über acht Prozent der bekannten GPCR diesen Prozess.
Das Rluc (BDP) wurde mit dem C-Terminus des GPCR fusioniert und das GFP (FAM) wurde mit dem C-Terminus des β-Arrestin fusioniert. Dadurch sollte sich, kurz nach der Ligandenbindung (5–30 Minuten), das BRET-Verhältnis aufgrund der Bindung des β-Arrestin an den GPCR, welche das GFP in die Nähe des Rluc bringt, erhöhen. Dieses Untersuchung ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für das GPCR-Orphan-Screening.
Die HEK293-Zelllinie wurde vorübergehend mit Hilfe der DNA-Konstrukte und LipofectAMINE^TM 2000 (BRL/Gibco), wie im Herstellerprotokoll beschrieben, in 100 mm Schalen transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen gewaschen, geerntet und in BRET-Puffer (PBS + Ca²⁺/Mg²⁺ + Glukose + 2 μg/ml Aprotinin) auf eine Dichte von 2.000.000 Zellen pro ml verdünnt. Die biolumineszierenden Reaktionen wurde mittels des BRETCount mit entsprechenden Filtern analysiert. Der BRETCount ist ein modifizierter TopCount, welcher in der Lage ist, Licht zu messen, welches von einer Kammer mit einer spezifischen Wellenlänge (für den Donator und den Akzeptor) kommt. Da der in diesem Beispiel verwendete BRETCount keine optimierten Emissionsfilter für dieses BRET-System aufwies, wurde das BRET-Verhältnis mit Hilfe eines Algorithmus korrigiert (Angers, S. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3684–3689).
Die transfizierten Zellen wurden zu den Kammern in weißen 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard Instrument) zugegeben (50.000 Zellen (in BRET-Puffer) pro Kammer). Agonisten (Isoproterenol (Iso) oder Arg⁸-Vasopressin (AVP)) wurden dann zur Hälfte der Kammern zugegeben. Zu der anderen Hälfte wurde nur BRET-Puffer zugegeben. Die Zellen wurden dann für 10–20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor coel400a zugegeben wurde. Die Analyse erfolgte bei 25°C, Integrationszeit 2 Sekunden pro Wellenlänge im Lumineszenz-Modus. Die verwendeten Filter waren folgende: für die Rluc-Emission 410DF80 (von Omega); für GFP D515/50M (von Chroma). Coel400a wurde zu jeder Kammer mit einer Arbeitskonzentration von 40 μM (Ende 5 μM) zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 50 μl. Die Untersuchungen wurden vierfach durchgeführt.
Die zum Transfizieren der Zellen verwendeten DNA-Konstrukte waren folgende: pCDNA3.1/β2AR:-Rluc (h) (Kodon-humanisiertes Rluc), pCDNA3.1/β3AR-Rluc (h), pCDNA3.1/V2-Rluc (h) und pCDNA3.1/β-Arrestin2-GFP. Die Zellen wurden mit einem der Rluc-Vektoren und dem pCDNA3.1/β-Arrestin2-GFP-Vektor unter Verwendung eines DNA-Verhältnisses von 8 μg:42 μg (Rluc-Vektor:GFP-Vektor) co-transfiziert. Bei allen Fusionskonstrukten wurde ein 6-Aminosäuren-Linker zwischen dem Rluc oder GFP und dem Rezeptor (β2, β3 oder V2) oder β-Arrestin2 eingefügt.
HEK293-Zellen wurden mit verschiedenen Kombinationen von Rluc- und GFP-Fusionskonstrukten co-transfiziert. Die Agonisten Isoproterenol (Iso) und AVP wurden verwendet, um ihren entsprechenden Rezeptor (β-Arrestin-Rezeptor oder V2-Rezeptor) zu aktivieren. Die Rezeptoraktivierung führte schließlich zur Entsensibilisierung und Internalisierung des Rezeptors, wie zuvor beschrieben. Wie erwartet erhöhte sich das BRET-Verhältnis in Gegenwart der Agonisten, blieb jedoch niedrig in deren Abwesenheit, außer beim β3-Arrestin-Rezeptor (β3-AR)-Rluc (siehe 22). Vom β3-AR ist bekannt, dass er das in diesem Untersuchung verwendete β-Arrestin nicht bindet, und er wurde daher als eine Negativkontrolle verwendet. Das BRET-Verhältnis für β2-AR-Rluc in Abwesenheit von Isoproterenol war hoch. Dies wurde der Tatsache zugeschrieben, dass bei dieser bestimmten Untersuchung die Zellen nicht erschöpft worden waren, oder es kann einer spontanen Rezeptoraktivierung zugeschrieben werden. 22b zeigt eine Dosisreaktionskurve, welche man für Zellen erhielt, die mit V2-Rluc und β-Arrestin-GFP transfiziert und durch AVP stimuliert worden waren. Ein EC₅₀ von 3,3 nM wurde beobachtet, welche mit den in der Literatur gefundenen Werten übereinstimmt. Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse in Kombination mit der Tatsache, dass achtzig Prozent der derzeit bekannten GPCRs mit β-Arrestin interagieren, stellt diese Interaktions-Untersuchung ein leistungsfähiges Werkzeug für das Screening von Orphan-Rezeptoren dar.
BEISPIEL XI: Die Verwendung eines Coelenterazin-hcp-Derivates beim BRET
Es wurde eine BRET-Untersuchung unter Verwendung von Rluc als das BDP und GFP1 als das FAM entwickelt, welches unterschiedliche Coelenterazin-Derivate verwendet. Die Coelenterazin-Derivate h, hcp und DeepBlueC (DBC auch Coel400a genannt) wurden in diesem Beispiel verglichen. Die Derivate hcp und h erzeugen Licht mit einem Emissionspeak bei 445 nm bzw. 470–480 nm, wenn sie von Aequorin und Renilla Luciferase katalysiert werden (Shimomura et al., Biochem. J. 261, 913–920, 1989; Hart et al., Biochemistry 18, 2204–2210, 1979; Matthews et al., Biochemistry 16, 5217–5220, 1977; Shimomura et al., Biochem. J. 296, 549–551, 1993; Matthews et al., Biochemistry 16, 85–91, 1977). DBC erzeugt Licht mit einem Emissionspeak bei etwa 390–400 nm (Hart et al., Biochemistry 18, 2204–2210, 1979).
CHO-Zellen wurden unter Verwendung von LipofectAMINE^TM 2000 (Life Technologies) gemäß dem Herstellerprotokoll in 100 mm Schalen mit dem pRluc::GFP1-Konstrukt (positive Kontrolle (+)) und dem pRluc-Konstrukt (negative Kontrolle (-)) transfiziert. Sowohl die positive als auch die negative Kontroll-DNAs sind bereits zuvor hergestellt worden und sind nun von BioSignal Packard unter dem Namen pBRET+ bzw. pRluc-N1 (h) im Handel erhältlich. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS+ gewaschen, mit Versin geerntet, gezählt und mit einer Dichte von einer Million Zellen pro ml in PBS+ suspendiert. Die transfizierten Zellen wurden mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in 150 μl PBS+ auf weiße 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard Instrument Company) aufgeteilt. Zum Starten der biolumineszierenden Reaktion wurden zuletzt 50 μl DBC- (BioSignal Packard, Montreal), hcp- (Molecular Probes Inc. OR) oder h-Derivat (Molecular Probes Inc., OR) mit einer Arbeitskonzentration von 20 μM (in PBS+) zu jeder Kammer hinzugegeben zu einer Endkonzentration von 5 μM. Das Gesamtuntersuchungsvolumen betrug 200 μl.
Die Platten wurden in das Fusion^TM-Mikroplatten-Analyzer-Instrument (Packard Instrument Company) eingesetzt, um die FAM- und BDP-Emission zu messen.
Instrumenteneinstellungen: PMT-Spannung: 1100 Volt, Verstärkung: 25, Lesezeit: 1 Sekunde, Platte: 96-Kammer, Temperatur: 25°C. Der Emissionsfilter für das BDP war 410 nm mit einem Bandpass von 80 nm und der Emissionsfilter für das FAM war 515 nm mit einem Bandpass von 30 nm. Beide Filter wurden von der Chroma Technology Corp. (Brattleboro, VT) erworben. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert +/– SEM von drei Experimenten dar. Die Diagramme wurden unter Verwendung der GraphPad PRISM-Software erstellt. In jedem Fall wurde die Hintergrundemission von den Wells, welche nur DBC in PBS+ enthalten, von den gemessenen Emissionen subtrahiert.
Die in 23 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass bei diesem BRET-Untersuchung auch andere Coelenterazin-Derivate als DeepBlueC verwendet werden können. Die Verwendung von DeepBlueC erzeugte ein höheres S/B-Verhältnis (siehe Zahlen über den Balken) im Vergleich zu hcp und h. Die S/B-Verhältnisse wurden durch Division des Wertes, welchen man für das positive Kontrollverhältnis erhielt, durch das Verhältnis für die negative Kontrolle berechnet.
BEISPIEL XII: Rluc-Mutanten
Liu and Escher (Gene, 237, 153–159, 1999; PCT W/O 00/20619) haben demonstriert, dass einer der sekretierten Rluc-Mutanten, bei welchem ein Cystein-Rest zu Alanin gewandelt wurde, eine höhere Lichtausbeute als der Wildtyp erzeugte, wenn Coelenterazin als Substrat verwendet wurde. Die zellulären Sekretionseigenschaften und biochemischen Eigenschaften wurden durch Messung der relativen Lichtintensitäten des Mutanten analysiert, welcher mit dem sekretierten Rluc verglichen wurde. Es wurde festgestellt, dass dieser Mutant (C124A; basierend auf der Rluc-Wildtyp-Nummerierung) sowohl beim sekretierten Rluc als auch beim Rluc eine erhöhte Lichtausbeute erzeugte. Es wurde demonstriert, dass die Mutation die zelluläre Halbwertszeit des Mutantenenzyms erhöhte.
Da sowohl das biolumineszierende Enzym als auch sein Substrat die Emissionswellenlänge der biolumineszierenden Reaktion bestimmen (Inouye and Shimomura, Biochem. Biophys. Res. Com. 233, 349–353, 1997), demonstriert dieses Beispiel, dass Rluc-Mutanten immer noch Licht um 390–400 nm emittieren, wenn DeepBlueC wie für Wildtyp-Rluc verwendet wird. Es wurden vier Rluc-Mutanten hergestellt: C124A, C124S, C124V und C124Y. Der Mutant C124A wurde bereits durch Liu et al. (SRUC3 genannt) beschrieben. Diese Mutanten wurden mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese (QuickChange-Kit von Stratagene) gemäß dem Herstellerprotokoll und Oligonukleotiden (Life Technologies) hergestellt. Das Kodon-humanisierte Rluc-Gen im pBlueScripII-Vektor (Stratagene), subkloniert zwischen der XbaI- und EcoRI-Restriktionsstelle (siehe oben für Details der Subklonierung), wurde als Matrize für die Mutagenese verwendet. Nach der Herstellung wurden die Mutanten mit Hilfe von XbaI und EcoRI von pBlueScriptII zu pCDNA3.1zeo (~) (Invitrogen) subkloniert. Es wurde für jeden Mutanten eine Sequenzanalyse durchgeführt, um zu verifizieren, ob sie die erwartete DNA-Sequenz aufwiesen (ABI Prism 310 Genetic Analyzer von Perkin Elmer).
Die Auswirkung der Substitutionen an Position 124 auf die Lichtausbeute in Frischzellen wurde verzeichnet. Wildtyp-Rluc und Mutanten-Rluc (in pCDNA3.1zeo) wurden unter Verwendung von LipofectAMINE (gemäß dem Herstellerprotokoll) in 100 mm Schalen zusammen mit dem pGFPend-N1-Vektor (Packard Instrument Company) bei einem DNA-Verhältnis von 7:1 in CHO-Zellen co-transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen gewaschen und in PBS+ (PBS Mg²⁺ 1 mM, Ca²⁺ 1 mM, Glukose 1000 g/ml, Aprotinin 2 μg/ml) entnommen.
Die GFPemd-Fluoreszenz von transfizierten Zellen wurde mittels eines FluoroCount (Packard Instrument Company) unter Verwendung der folgenden Instrumenteneinstellungen bestimmt: 1100 Volt, 2 Sekunden Leselänge, Verstärkung 1, Anregungsfilter 485 nm, Emissionsfilter 530 nm. Zu diesem Zweck wurden transfizierte Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Kammer in 200 μl PBS+ (dreifach) in eine schwarze 96-Kammer ViewPlate (Packard Instrument Company) gegeben. Die GFPemd-Fluoreszenz wurde verwendet, um die Transfektionseffizienzen zwischen transfizierten Zellen zu normalisieren. Die normalisierten Zellmengen (etwa 100.000 Zellen) in PBS+ wurden in weiße 96-Kammer Optiplate (Packard Instrument Company) hinzugefügt, um die gesamte Lumineszenzausbeute des Rluc-Wildtyps und der Rluc-Mutanten exprimiert in Zellen (dreifach) zu bestimmen. Zu jeder Kammer wurde DeepBlueC hinzugefügt (Endkonzentration 5 μM), um die biolumineszierende Reaktion zu starten, und die Biolumineszenzniveaus wurden mittels eines LumiCount (Packard Instrument Company) quantifiziert. Instrumenteneinstellungen: 1100 Volt, Verstärkung 1, Leselänge 0,5 Sekunden Das endgültige Untersuchungsvolumen betrug 200 μl.
Die Biolumineszenz wurde sofort nach Zugabe von DeepBlueC bestimmt (siehe Tabelle 8). Der Rluc-Mutant C124A ergab die höchste Lumineszenz (nahezu 3 Mal höher im Vergleich zum Rluc-Wildtyp). Der C124Y-Mutant erzeugte praktisch keine Biolumineszenz im Vergleich zum Rluc-Wildtyp und Hintergrundniveau (50–60 RLU). Die Biolumineszenz von C124V war zu gedämpft, um von Nutzen zu sein. Diese beiden Mutanten wurden nicht weiter analysiert.
Es wurden Emissionsscans durchgeführt, um die Position der Emissionspeaks für die Rluc-Mutanten C 124A und C 1245 (siehe 24) zu bestimmen. Die transfizierten Zellen (insgesamt 1,8 × 10⁶) wurden in eine 2 ml Küvette eines Spektrofluorometers (FluoroLog3.2 von Instruments S. A., Inc.) zugegeben. DeepBlueC (Ende 5 μM) wurde zugegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten. Mit den folgenden Einstellungen wurden Emissionsscans aufgezeichnet: Scan 300–500 nm, Emissionsschlitz 10 nm, Inkrement 2 nm, Integrationszeit 0,2 Sekunden, Anregungslampe aus.
24 zeigt, dass die Rluc-Mutanten C124A und C124S auch noch Licht um 390–400 nm abgaben, wenn DeepBlueC als Substrat wie für den Rluc-Wildtyp verwendet wurde. Weiters besitzt, wie von Liu et al. gezeigt, der C124A-Rluc-Mutant eine höhere Emissionsintensität im Vergleich zum Wildtyp-Coelenterazin (etwa 4,5-Fach beim Vergleich der Fläche unter den Kurven). Wie mit Hilfe des LumiCount bestimmt, erzeugte der C124S-Mutant eine niedrigere Lichtintensität im Vergleich zum Wildtyp-Rluc. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine einzelne Mutation in der Rluc-Primärstruktur die Lichtemission für ein bestimmtes Substrat beeinträchtigen kann. Und schließlich demonstrieren diese Ergebnisse, dass Rluc-Mutanten mit DeepBlueC verwendet werden können.
Diese Verbesserung in der Lichtintensität des Mutanten C124A kann von einer allgemeinen Erhöhung der Zellexpression oder einem Anstieg in der Quantenausbeute des Mutanten oder beidem herrühren. Um zu demonstrieren, dass die Mutation C124A die Quantenausbeute der Reaktion beeinträchtigt, wurden die folgenden BRET-Experimente durchgeführt. Da BRET ein Energietransferprozess unter Verwendung der Dipol-Dipol-Resonanz zwischen einem Donator und Akzeptoranteilen (????8) ist, ist die Effizienz des Energietransfers von der Quantenausbeute des Donators abhängig. Wenn sich die Mutation C124A auf die Quantenausbeute des Rluc auswirkt, dann wird ein verbesserter Energietransfer (BRET-Signal) im Vergleich zum Wildtyp-Rluc erzeugt. Zu diesem Zweck wurden Wildtyp- und Mutanten-Rluc-Gene im Rahmen mit einem Akzeptoranteil fusioniert (GFP1-Mutant, siehe oben).
Die Rluc-Wildtyp- und Rluc-Mutanten-Gene wurden mittels der Restriktionsstellen ApaI und BamHI in den pGFP-C1-Vektor (BioSignal Packard) aus pCDNA3.1zeo (siehe oben) subkloniert. Alle abschließenden DNA-Konstrukte wiesen die gleiche Gesamt-GFP::Rluc-Struktur und den gleichen Linker (14 Aminosäuren lang) zwischen dem GFP- und dem Rluc-Anteil auf. Fusions-GFP::Rluc-Konstrukt-Vektoren wurden mittels LipofectAMINE (Life Technologies) in CHO-Zellen unter Befolgung des Herstellerprotokolls in 100 mm Schalen transfiziert. Die Co-Transfektion von Rluc und GFP wurde als negative Kontrolle verwendet. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in PBS+ geerntet und mit einer Dichte von einer Million Zellen pro ml resuspendiert. Fünfzigtausend Zellen wurden auf weiße 96-Kammer Optiplate-Platten (dreifach) aufgeteilt. DeepBlueC (Endkonzentration 5 μM) wurde zu den Zellen hinzugefügt, um die Biolumineszenzreaktion zu starten. Das endgültige Untersuchungsvolumen betrug 200 μl.
Die Biolumineszenzniveaus wurden mittels eines Fusion Microplate Analyzers (Packard Instrument Company) mit den folgenden Einstellungen für BRET2 bestimmt: Leselänge 1 Sekunde pro Kammer pro Kanal, PMT 1100 Volt, Verstärkung 25, Temperatur 25°C, die Emissionsfilter für Donator und Akzeptor waren 410/80 bzw. 515/30 (Chroma Technology Corp.). Die BRET-Signale (Verhältnis der Lichtausbeute bei 515 nm dividiert durch die Lichtausbeute bei 410 nm) wurden für jedes Fusionskonstrukt berechnet und mit dem BRET-Signal für ein nicht-interagierendes Rluc für GFP (negative Kontrolle) verglichen. Die Ergebnisse sind der Mittelwert +/– SEM aus dreifachen Kammern. Die Diagramme wurden mittels der GraphPad PRISM-Software erstellt. In allen Fällen wurden die Hintergrundniveau (Kammern mit nur DBC in PBS+) subtrahiert.
Das BRET-Signal bei Zeit 0 für das Fusionskonstrukt unter Verwendung des Wildtyp-Rluc lag bei 1,04 und bei 1,09 für das Fusionskonstrukt unter Verwendung des Mutanten C124S. Das BRET-Signal für die negative Kontrolle (Rluc + GFP) lag bei 0,068. Dieser Unterschied zwischen dem BRET-Signal des Wildtyp-Rluc-Fusionskonstruktes und des C124S-Fusionskonstruktes ist gering, aber signifikant. Diese Ergebnisse geben an (unter Berücksichtigung von Liu et al. des gleichen Mutanten), dass sowohl die zellulären Expressionseigenschaften als auch die Quantenausbeute durch die Substitution modifiziert werden. Das BRET-Signal für das Fusionskonstrukt unter Verwendung des C124S lag bei 0,81. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass es möglich ist, die Energietransfereigenschaften eines Donator-Akzeptor-Paares durch Modifikation der Primärstruktur des Donators zu verbessern.
BEISPIEL XIII: Erfassung der Oligomerisation des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) mit Hilfe von aus Säugetierzellen abgeleiteten biologischer Membranen durch (BRET)
Zum Untersuchen der Oligomerisation des β2-adrenergen Rezeptors (β2-AR) wurden das Rluc und das GFP10 wie in Angers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7: 3684–3689) beschrieben genetisch mit dem C-Terminusende des β2-AR fusioniert. Das β2-AR:Rluc- und das β2-AR:GFP10-Konstrukt wurden mit einem DNA-Verhältnis von 1:1 mittels des Standard-Ca²⁺-Phosphat-Transfektionsverfahrens (Ausubel, F. M., et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) in HEK293T transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden Rohmembranen hergestellt. Zellen aus einer 100 min Schale wurden zweimal mit PBS gewaschen und in 10 ml Lyse-Puffer (5 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 7,4, ergänzt mit Proteaseinhibitormischung bestehend aus 5 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Benzamidin und 5 μg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor) für 10 Minuten bei 4°C lysiert, und das Lysat wurde dann mittels eines Polytrons mechanischer Beanspruchung ausgesetzt. Homogenate wurden bei 500 × g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde bei 45.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert, wonach die Pellets zweimal im gleichen Puffer gewaschen wurden.
Die BRET-Untersuchungen erfolgten in weißen 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard Instrument Company), unter Verwendung von fünfzehn μg rohgereinigter Membran pro Kammer in PBS. Fünfzig μl Coelenterazin-h-Derivat (Molecular Probes, Eugene, OR) wurden mit einer Konzentration von 20 μM zu jeder Kammer zugegeben, um die Biolumineszenzreaktion zu starten, wobei das Gesamtuntersuchungsvolumen 200 μl betrug. Die Rluc- und GFP10-Emission wurde mittels eines Mikrotiterplattenlesegerätes (BRETCount-Instrument, siehe Angers, S. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3684–3689), ausgestattet mit Filtern, welche spezifisch für die GFP10-Fluoreszenz und die Rluc-Emission sind, quantifiziert. Das BRET-Signal wurde mit Hilfe des in Angers, S. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3684–3689) beschriebenen Algorithmus bestimmt.
Man erhielt ein niedriges BRET-Signal (> 0,05), wenn Membran aus Zellen verwendet wurde, welche einfach entweder mit β2AR-Rluc oder mit β2AR-GFP transfiziert worden waren, bei Zugabe von Coelenterazin-h-Derivat (nicht gezeigt). Wenn jedoch beide Rezeptor-Fusionskonstrukte exprimiert waren, erhielt man ein robustes BRET-Signal, welches sich am besten durch die konstitutive Gegenwart von β2-AR-Oligomeren in HEK293T-Zellen erklären lässt. Bei einem Versuch, die Spezifität der Interaktion zu steuern, wurden zwei unterschiedliche, entfernt verwandte GPCR, der Chemokin-CCR5-Rezeptor und der GABA-R2, mit dem Rluc fusioniert und in der gleichen Art von Experimenten mit dem β2AR-GFP10 verwendet. Wenn zwei entfernt verwandte Rezeptoren untersucht wurden, konnten wenige Heterointeraktionen in der aus Zellen hergestellten Membran gemessen werden, was anzeigt, dass die Oligomerisation von GPCR selektiv ist.
BEISPIEL XIV: Alternativer Apoptosesensor
Bei diesem Beispiel wird durch Einführung einer Caspase-3-Erkennungsstelle in die Linkerregion des GFP-Rluc-Fusionskonstruktes ein BRET-Apoptosesensor hergestellt. Bei Induktion der Apoptose erkennt und spaltet Caspase-3 die Linkerregion, wodurch das Rluc vom GFP getrennt wird. Daher verringert die Induktion von Apoptose das BRET-Verhältnis mit der Zeit.
pGFP1::Rluc wurde durch Einführung des Kodon-humanisierten Rluc-Gens aus dem pCDNA3.1/Rluc(h)-Vektor in den pGFP1-C2-Vektor hergestellt (siehe Technisches Datenblatt von BioSignal Packard, Montreal). GFP1 ist ein Mutant des Grün fluoreszierenden Proteins (GFP), welcher eine einmalige Mutation an Position 64 aufweist (die Aminosäurepositionierung ist relativ zum GFP-Wildtyp), wobei das Phenylalanin durch ein Leucin ersetzt wurde. Das pCDNA3.1/Rluc (h) wurde mit ApaI und BamHI verdaut. Nach dem Verdau wurden die Produkte auf einem Agarosegel getrennt. Eine Bande, welches dem Rluc-(h)-Gen entspricht (rund 920 Basenpaare lang) wurde aus dem Agarosegel herausgeschnitten und mit dem Qiaquick-Spin-Kit (Qiagen) gereinigt. Die gereinigte Bande wurde dann in den pGFP1-C2-Vektor, verdaut mit ApaI und BamHI, subkloniert. Der Linker zwischen GFP1 und Rluc wurde dann durch Verdauen des pGFP1::Rluc-Vektors mit BspE1 gekürzt, gefolgt von einer Einfüllreaktion mittels des Klenow-Enzyms zum Abstumpfen des Endes. Nach der Klenow-Reaktion wurde das Produkt mit dem Qiaquick-Spin-Kit gereinigt, mit EcoRV verdaut, nochmals gereinigt (Qiaquick) und dann unter Verwendung von Ligase ligiert. Dieses Verfahren entfernte 47 Nukleotide vom ursprünglichen pGFP1-C2-Vektor und erzeugt den folgenden Linker zwischen GFP1 und Rluc:
Dieser Linker enthält geeignete einmalige Restriktionsstellen, welche verwendet werden können, um Fragmente zwischen das GFP1- und das Rluc-Gen zu subklonieren. Diese Restriktionsstellen sind (5' zu 3' Richtung): BspE1, HindIII, KpnI, SacII, ApaI und XbaI. 27 zeigt eine DNA-Sequenz, welche das GFP:Rluc-Fusionsprotein codiert, welches eine einmalige 14 Aminosäuren-Linkerregion zwischen dem GFP und dem Rluc beinhaltet.
Die Caspase-3-Stelle wurde mittels annealed komplementärer Oligonukleotide in den pGFP1::Rluc-Vektor eingeführt. Es wurden zwei komplementäre Oligonukleotide annealed, welche folgende Caspase-3-Stelle codieren: Gly-Asp-Glu-Val-Asp-Gly. Lediglich die Sequenz Asp-Glu-Val-Asp ist für die Erkennung durch Caspase-3 erforderlich. Caspase-3 schneidet zwischen dem Asp- und dem Gly-Rest.
Die beiden obigen Oligonukleotide (Sinn und Gegensinn) wurden synthetisiert (durch BRL/Gibco – Life Technologies). Die beiden Oligonukleotide sind komplementär zueinander und wurden mittels Standard-Molekularbiologieverfahren (Ausubel, F. M. et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) miteinander annealed. Die Oligonukleotide wurden manipuliert, um nach ihrem Annealing kohäsive Enden zu erzeugen. HindIII befindet sich am 5'-Ende und ApaI am 3'-Ende. Das Doppelstrangprodukt, welches nach dem Annealen entstanden war, wurde in das GFP1::Rluc-Konstrukt, verdaut mittels HindIII und ApaI verdaut wurde, eingefügt. HindIII und ApaI sind einmalige Restriktionsstellen, welche sich in der Linkerregion zwischen dem GFP- und dem Rluc-Gen befinden. Die endgültige Struktur ist GFP1:Caspase-3:Rluc und ist in 28 gezeigt. Da sich das GFP::Rluc ursprünglich bereits in einem Expressionsvektor befand, welcher kompatibel für die Transfektion und Expression des Proteins in Säugetierzellen war (pGFP-Hintergrund), war keine weitere Modifikation erforderlich. Die für die Transfektion verwendete pGFP1:Caspase-3:Rluc-Plasmid-DNA wurde mit dem Maxi-Prep-Kit von Qiagen gereinigt.
pGFP1:Caspase-3:Rluc-DNAs und das ursprüngliche Plasmid pGFP1::Rluc (ohne die Caspase-3-Stelle) wurden mittels LipofectAMINE (BRL/Gibco – Life Technologies), wie im Herstellerprotokoll beschrieben, und 8 μg Plasmid-DNA in 100 mm Schalen in HeLa-Zellen transfiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen geerntet und mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Kammer auf 96-Kammer-Mikrotiterplatten (weiße Optiplate von Packard) aufgeteilt. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen mit PBS gewaschen und durch Zugabe von 100 μl Iscove-Medium ohne Serum und Phenol-Rot (BRL/Life Technologies), welches Staurosporin mit einer Endkonzentration von 1 μM (+Inducer, siehe 29) oder 100 μl Iscove allein (–Inducer) enthielt, wurde die Apoptose induziert. Die Zellen wurden für 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach diesem Zeitraum wurden 50 μl BRET-Puffer (PBS Ca²⁺/Mg²⁺ + Glukose ohne Aprotinin) und 50 μl DeepBlueC (20 μM) zugegeben, um die Biolumineszenzreaktion zu starten. Das Gesamtuntersuchungsvolumen betrug 200 μl. Die Lichtemissionen wurden mittels des BRETCount erfasst (Leselänge 1 Sekunde für jeden Filter, SPC-Modus, Temperatur 25°C). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert +/– SEM aus vier Kammern dar. Das Diagramm in 29 wurde mit der GraphPad PRISM-Software erstellt. In allen Fällen wurden die Hintergrundniveaus (Kammern mit nur DBC in PBS+) subtrahiert.
30 stellt die Verhältnisveränderungen in den HeLa-Zellen nach 5 Stunden der Apoptose-Induktion durch Staurosporin dar. Eine signifikante Veränderung des BRET-Verhältnisses (0,72 Einheiten bei Zeit Null) erfolgte, wenn die Zellen mit dem Apoptosesensor (pGFP1:Caspase-3:Rluc) transfiziert wurden und dann eine Apoptose-Induktion durch Staurosporin stattfand. Wie erwartet verringerte sich das Verhältnis, wodurch angezeigt wurde, dass die zelluläre Caspase-3 die Spaltstelle zwischen den GFP1- und Rluc-Anteilen erkannt und geschnitten hat. Es wurde keine Veränderung im BRET-Verhältnis bei Zellen beobachtet, welche mit dem pGFP::Rluc transfiziert worden waren, oder in Zellen, welche mit dem pGFP-Caspase-3:Rluc ohne Staurosporin (–Inducer) transfiziert worden waren.
Das GFP1::Rluc-Konstrukt wurde mit einem ABI automatisierten Sequenzer (ABI Prism 310 Genetic Analyzer von Perkin Elmer) in seiner Gesamtheit sequenziert.
BEISPIEL XVI: Calciumsensor
Calcium ist ein wichtiges sekundäres Botenstoff Molekül, welches vom G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) verwendet wird, um stromabwärtige Effektoren zu aktivieren. Viele GPCR können bei Aktivierung über ihre Liganden über das Gαq-G-Protein das Einströmen von zellulärem Calcium hervorrufen. Die Amplitude des Calcium-Einstroms wird häufig gemessen, um die GPCR-Aktivierung zu bestimmen. Viele fluoreszierende Verbindungen wie z.B. Fluo-3 und Fura-2 wurden hergestellt, um Calcium zu binden (Methods in cell biology: A practical guide to the study of calcium in living cells. Vol. 4 (1994) Academic Press, Inc.). Die Bindung von Calcium an diese Moleküle verändert deren Fluoreszenzeigenschaften. Auch wenn diese Verbindungen sehr empfindlich sein können, so haben sie doch den Nachteil, dass sie in die Zellen geladen werden, müssen bevor die Untersuchung durchgeführt wird. Außerdem können nicht alle Zellen mit genügend Verbindungen für die Calcium-Messung beladen werden.
Im Folgenden wird die Herstellung eines BRET-Calciumsensors auf der Grundlage der spezifischen Interaktion des p53- und des S100b-Proteins beschrieben. Diese Proteine können durch Zellen synthetisiert werden, wodurch der Bedarf wegfällt, Zellen vor der Durchführung der Untersuchung mit einer chemischen Verbindung zu beladen. S100b ist Teil der Calmodulin-Familie. Von Mitgliedern dieser Familie ist bekannt, dass sie mittels der EF-Hand-Domäne Calcium binden (Allore et al., J. Biol. Chem. 265, 15537–15543, 1990). Wenn S100b Calcium bindet, dann wird es strukturellen Veränderungen unterzogen, welche seine Bindung an das Tumor-Suppressor-Protein p53 zulassen. Delphin et al. (J. Biol. Chem. 274, 10539–10544, 1999) haben die Proteindomänen von sowohl p53 als auch S100b, welche an ihrer Interaktion beteiligt sind, charakterisiert. Diese Domänen wurden mit Hilfe rekombinanter Technologie isoliert und mit Donator- und Akzeptor-BRET-Anteilen fusioniert. Die Aminosäuren des p53, welche an der Interaktion mit dem S100b beteiligt sind, befinden sich am C-Terminus des Proteins zwischen Aminosäure 320–393. Diese Domäne wurde mit Hilfe von RT-PCR (siehe unten) amplifiziert und an den C-Terminus des Rluc subkloniert. Das S100b-Protein wurde durch RT-PCR geklont und an den N-Terminus des Akzeptors GFPuv subkloniert. Diese Fusionskonstrukte wurden amplifiziert und mittels eines geeigneten Expressionsvektors aus Bakterien gereinigt. Die gereinigten Fusionsprodukte wurden in zellfreien Untersuchungen verwendet.
Amplifizierung durch PCR und Subklonierung der p53-Domäne, welche für die Interaktion mit S100b erforderlich ist: Die humane p53-Domäne wurde kloniert und die p53-Domäne, welche für die Bindung an S100b (Aminosäuren 320–393) verantwortlich ist, wurde durch PCR amplifiziert (Ausubel, F. M. et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die für die PCR verwendete Matrize war pCMV-p53 (von Clontech Kat. Nr. K6004-1). Die PCR-Amplifizierung wurde mit Hilfe der folgenden Primere (Life Technologies) durchgeführt:
Das Stoppkodon von p53 ist fett dargestellt. Die Primer wurden mit einmaligen Restriktionsstellen (BamHI und XbaI) in ihrer Sequenz hergesellt, um die Subklonierung zu erleichtern. Die Primer wurden gemäß der p53-DNA-Sequenz hergesellt, welche sich in der Genbank unter der Zugangsnummer U94788 findet. Die PCR wurde in 50 μl unter Verwendung eines GeneAmp-PCR-System 9600 Instruments von Perkin Elmer (siehe Tabelle 9 für die PCR-Bedingungen) durchgeführt.
Die PCR-Reaktionen wurden wie Folgt durchgeführt:
Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 Minuten
Heißstart bei 75°C
Abschließender Verlängerungsschritt 72°C 10 Minuten.
Das amplifizierte Produkt wurde durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese getrennt und die Bande, welche der p53-Domäne (228 Basenpaare lang) entsprach, wurde mit dem Qiaquick-Spin-Kit (Qiagen) Gel-gereinigt. Die gereinigte Bande wurde dann in einen Zwischenvektor pCDNA3.1/Rluc::EYFP (siehe PCT/CA99/00561) subkloniert, indem das EYFP durch die amplifizierte p53-Domäne ersetzt wurde. Zu diesem Zweck wurde pCDNA3.1/Rluc::EYFP mit BamHI und XbaI verdaut, um das EYFP zu entfernen, und die Vektorbande wurde mittels Qiaquick Gel-gereinigt. Die amplifizierte p53-Domäne wurde im Rahmen mit dem Rluc-Gen in den linearisierten pCDNA31./Rluc-Vektor subkloniert, um das endgültige Rluc::p53-Fusionsprotein herzustellen. Das Fusionsgen wurde mit dem BigDye ABI-Prism-Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) und ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) zur Gänze sequenziert, um sicherzustellen, dass es im Vergleich zur Originalsequenz nicht zu einem Versatz gekommen ist. Die Aminosäuresequenz des Linkers zwischen Rluc und p53 war RARDP (Ein Buchstaben Aminosäure-Code). Das Rluc:p53-Fusionsgen wurde mit Hilfe von Restriktionsverdauen (NheI und ApaI) aus dem pCDNA31./Rluc:p53-Vektor gewonnen, mit Qiaquick Gel-gereinigt, mit Klenow-Enzym abgestumpft (Ausubel, F. M. et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) und in pQE32-Vektor, linearisiert mit SmaI, subkloniert, um den endgültigen pQE32/Rluc::p53-Vektor herzustellen. Nach dem Subklonieren in pQE32 wurde das Rluc::p53-Fusionsgen automatisch mit einer His-Tag-Sequenz am N-Terminus des Rluc::p53-Gens fusioniert. Die His-Tag-Sequenz wurde verwendet, um das Rluc::p53-Fusionsgen mittels eine Ni-Säule (The QIAexpressionist: A handbook for high-level expression and purification of 6 × His-tagged proteins. Juli 1998, Qiagen) zu reinigen. Nach der Transformation von pQE32/Rluc:p53 in Bakterien (M15) wurde IPTG zugegeben, um die Expression des His-Tag-Rluc::p53 zu induzieren. Das Fusionsprotein wurde dann gemäß dem Herstellerprotokoll (The QIAexpressionist: A handbook for high-level expression and purification of 6 × His-tagged proteins. Juli 1998, Qiagen) mit einer Ni-Kügelchen-Säule gereinigt. Die Proteinbestimmungen erfolgten mit dem BioRad-Protein-Untersuchung (von BioRad). Die Reinheit des His-Tag-gereinigten Fusionsproteins wurde durch Standard-SDS-PAGE erreicht. Gereinigtes His-Tag-Rluc::p53-Fusionsprotein wurde im BRET-Untersuchung (siehe unten) verwendet.
RT-PCR-Amplifizierung und Subklonierung des S100b-Proteins: humane S100b-cDNA wurde ohne ihr Stoppkodon durch RT-PCR geklont (Ausubel, F. M. et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die für die RT-PCR verwendete Matrize war Einzelstrang-cDNA (erster Strang), welche gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem SuperscriptII-Kit (Life Technologies) und 1 μg humaner Gehirn-mRNA (Clontech) hergestellt worden war. Eine erste RT-PCR-Amplifizierung mit der cDNA als Matrize wurde mit Hilfe der folgenden Primere (synthetisiert durch Life Technologies) durchgeführt:
Das Startkodon des S100b ist fett dargestellt.
Die Primer wurden gemäß der Sequenz von S100B hergesellt, welche sich in der Genbank unter der Zugangsnummer M59486 findet. Die PCR wurde in 50 μl unter Verwendung eines GeneAmp-PCR-System 9600 Instruments von Perkin Elmer (siehe Tabelle 10 für die PCR-Bedingungen) durchgeführt. Eine zweite Amplifizierung wurde mit der Reaktionsmischung der ersten RT-PCR als Matrize durchgeführt.
Die PCR-Reaktionen wurden wie Folgt durchgeführt:
Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 Minuten
Heißstart bei 75°C
Abschließender Verlängerungsschritt 72°C 10 Minuten.
Das amplifizierte Produkt wurde durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese aufgelöst und die Bande, welche dem S100b (278 Basenpaare lang) entsprach, wurde mit dem Qiaquick-Spin-Kit Gel-gereinigt. Die gereinigte Bande wurde dann in einen Zwischenvektor pCDNA3.1hyg/GFPuv an den N-Terminus des GFPuv subkloniert. GFPuv ist ein von Clontech verkauftes mutiertes GFP. Zu diesem Zweck wurde pCDNA3.1hyg/GFPuv mit NheI- und KpnI-Enzym linearisiert und mit Qiaquick Gel-gereinigt. Amplifiziertes S100b wurde im Rahmen mit GFPuv-Gen in den linearisierten pCDNA3.1hyg/GFPuv-Vektor subkloniert, um das endgültige S100b:GFPuv-Fusionsprotein herzustellen. Das Fusionsgen wurde mit dem BigDye ABI-Prism-Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) und ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) zur Gänze sequenziert, um sicherzustellen, dass es im Vergleich zur Originalsequenz nicht zu einem Versatz gekommen ist. Die Aminosäuresequenz des Linkers zwischen dem S100b- und dem GFPuv-Gen war TVPVEK (Ein-Buchstaben Aminosäure-Code). Das S100b:GFPuv-Fusionsgen wurde mit Hilfe von Restriktionsverdauen (NheI und ApaI) aus dem pCDNA3.1hyg/S100b:GFPuv-Vektor gewonnen, mit Qiaquick Gel-gereinigt, mit Klenow-Enzym (4,5) abgestumpft und in den mit SmaI linearisierten pQE31-Vektor, subkloniert, um das endgültige pQE31/S100b:GFPuv herzustellen. Nach dem Subklonieren in pQE31 wurde das S100b:GFPuv-Fusionsgen automatisch mit einer His-Tag-Sequenz am N-Terminus des S100b:GFPuv-Fusionsgens fusioniert. Die His-Tag-Sequenz wurde verwendet, um das S100b:GFPuv-Fusionsgen mittels eine Ni-Säule (7) zu reinigen. Nach der Transformation von pQE31/S100b:GFPuv in Bakterien (M15) wurde IPTG zu den Zellen zugegeben, um die Expression des His-Tag-S100b:GFPuv zu induzieren. Das Fusionsprotein wurde dann gemäß dem Herstellerprotokoll (7) mit einer Ni-Kügelchen-Säule gereinigt. Die Proteinbestimmungen wurden mit der BioRad-Protein-Untersuchung (von BioRad) durchgeführt. His-Tag-gereinigtes Fusionsprotein erhielt man durch Standard-SDS-PAGE. Gereinigtes His-Tag-S100b:GFPuv wurde im BRET-Untersuchung verwendet.
In vitro BRET-Untersuchung: His-Tag-gereinigtes Rluc::p53 (320 ng Protein) wurde mit His-Tag-gereinigtem S100b::GFPuv (260 ng oder 780 ng Protein) in 150 μl PBS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺), welches 10 mM DTT enthielt, in weißen 96-Kammer Optiplate-Platten (Packard Instrument Company) gemischt. In Gegenwart von Ca²⁺ (siehe Symbol (+) in 30) wurde CaCl₂ mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Fünfzig μl DeepBlueC (auch Coel400a genannt) wurden mit einer Konzentration von 20 μM in der Kammer gegeben, um die biolumineszierende Reaktion zu starten. Die Endkonzentration des DeepBlueC betrug 5 μM. Das Gesamtuntersuchungsvolumen betrug 200 μl. Die Donator- und Akzeptorlichtemission wurde mit dem BRETCount mit den folgenden Instrumenteneinstellungen quantifiziert: Leselänge 1 Sekunde pro Kammer pro Filter, SPC-Modus, Temperatur: 25°C, Donatorfilter: 410DF80 (Omega Opticals Inc.), Akzeptorfilter: D515/50m (Chroma Technology Corp.). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert +/– SEM von vier Kammern dar. Das Diagramm in 30 wurde mit der GraphPad PRISM-Software erstellt.
30 zeigt, dass in Gegenwart von Ca²⁺ eine Interaktion zwischen S100b und p53 stattfand. In Abwesenheit von Ca²+ sind die BRET-Signale von Rluc:p53 + S100b:GFPuv (Proteinverhältnis 1:1) und Rluc:p53 + S100b:GFPuv (Proteinverhältnis 1:3) ähnlich dem BRET-Signal von Rluc:p53 allein, was anzeigt, dass Rluc:p53 in Abwesenheit von Ca²+ nicht mit S100b: GFPuv interagiert. In Gegenwart von 1 mM Ca²⁺ erhöhte sich das BRET-Signal für das Rluc:p53 + S100b:GFPuv (1:1) signifikant (leeres Dreieck) im Vergleich zum Zustand in Abwesenheit von Ca²⁺ (volles Dreieck). Ein ähnliches Ergebnis erhielt man für Rluc:p53 + S100b:GFPuv (1:3) (im Vergleich leere und volle Vierecke). Das BRET-Signal für Rluc:p53 + S100b:GFPuv (1:3) in Gegenwart von Ca²⁺ war im Vergleich zu Rluc:p53 + S100b:GFPuv (1:1) höher, was bedeutet, dass im Zustand Rluc:p53 + S100b:GFPuv 1:1 nicht das gesamte Rluc:p53 durch das S100b:GFPuv getitert wurde. Da GFP-Mutanten und Rluc selbst in Gegenwart von Ca²⁺ nicht zusammen interagieren und da man von S100b weiß, dass es in Gegenwart von Ca²⁺ p53 bindet, zeigt der Anstieg des BRET-Signals an, dass eine Interaktion zwischen S100b und p53 stattfand. Dieses Experiment demonstriert auch, dass GFPuv als ein Akzeptor im BRET-Untersuchung basierend auf der Verwendung von DeepBlueC verwendet werden kann.
BEISPIEL XX: β-Arrestin
Um die strukturelle Vielseitigkeit von BRET zu demonstrieren, wurden die BRET-Signale, welche mit GFP:β-Arrestin2 erzeugt wurden, in BRET-GPCR-Arrestin-Untersuchungen mit β-Arrestin2:GFP verglichen.
β-Arrestin2: GFP1-Fusionskonstrukt
Klonen des humanen β-Arrestin2
Humane β-Arrestin2-cDNA wurde ohne ihr Stoppkodon durch RT-PCR (Ausubel, F. M. et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) kloniert. Die für die RT-PCR verwendete Matrize war Einzelstrang-cDNA (erster Strang), welche mit dem SuperscriptII-Kit (Life Technologies), gemäß dem Herstellerprotokoll, und 1 μg humaner Gehirn-mRNA (Clontech) hergestellt worden war. Eine erste RT-PCR-Amplifizierung mit der cDNA als Matrize wurde mit Hilfe der folgenden Primer durchgeführt.
Eine zweite Amplifizierung (verschachtelte PCR) wurde mit dem amplifizierten Produkt der ersten Amplifizierung als Matrize und den folgenden Primern (synthetisiert durch Life Technologies) durchgeführt:
Die NheI-Restriktionsstelle ist unterstrichen und die β-Arrestin2-Codiersequenz ist kursiv. Das Startkodon des β-Arrestin2 ist fett dargestellt.
Die KpnI-Restriktionsstelle ist unterstrichen und die β-Arrestin2-Codiersequenz (Umkehrstrang) ist kursiv.
Die Primer für die RT-PCR wurden gemäß der Sequenz des β-Arrestin2 hergestellt, welche in der Genbank unter folgender Zugangsnummer zu finden ist: NM004313. Die RT-PCR-Reaktionen wurden in 50 μl mit einem GeneAmp PCR-System 9600 Instrument von Perkin Elmer durchgeführt (siehe Tabelle 11 für PCR-Bedingungen). Die PCR-Reaktionen wurden wie Folgt durchgeführt:
• ERSTE RT-PCR

Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 Minuten
Heißstart bei 75°C
Abschließender Verlängerungsschritt 72°C 10 Minuten

• ZWEITE PCR

Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 Minuten
Heißstart bei 75°C
Abschließender Verlängeruungsschritt 72°C 10 Minuten

Das amplifizierte DNA-Produkt der zweiten Amplifizierung wurde durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese aufgelöst und die Bande, welche dem β-Arrestin2 (1230 Basenpaare lang) entsprach, wurde mit dem Qiaquick-Spin-Kit (Qiagen) Gel-gereinigt. Die gereinigte Bande wurde dann gemäß dem Herstellerprotokoll in den Shuttle-Vektor pCR aus dem Zero Blunt TOPO-cloning Kit (Invitrogen Kat. Nr. K2800-20) subkloniert.
Der rekombinante Vektor wurde verwendet, um Bakterien mittels eines Standardprotokolls zu transformieren. Positive Klone wurden durch Restriktionsverdau isolierter Vektor-DNA identifiziert, unter Verwendung der in den PCR-Primern (NheI und KpnI) als Identifikatoren bereitgestellten Restriktionsstellen. Zwei Klone wurden mit dem BigDye ABI-Prism-Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) und ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) zur Gänze sequenziert, um sicherzustellen, dass es im Vergleich zur Originalsequenz nicht zu einem Versatz gekommen ist. Ein positiver Klon im pCR-Vektor wurde mit NheI- und KpnI-Enzymen verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden mit Hilfe von Agarosegel-Elektrophorese getrennt und die Bande, welche in der Länge der β-Arrestin2-Codiersequenz entsprach, wurde Gel-gereinigt (Qiaquick). Die gereinigte Bande wurde dann verwendet, um den endgültig pCDNA3.1hyg/β-Arrestin2:GFP1-Vektor wie unten beschrieben herzustellen.
Endgültiges β-Arrestin2:GFP-Fusionskonstrukt: der pCDNA3.1/hyg-β-Arrestin2-(Ratte):GFP1-Säugetierexpressionsvektor, welcher das β-Arrestin2-(Ratte):GFP1-Fusionskonstrukt beinhaltet, wurde mit NheI und KpnI verdaut, um das β-Arrestin2-(Ratte)-Gen zu entfernen. Die Verdauungsprodukte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und die Bande, welche dem Vektor entspricht, wurde herausgeschnitten, gereinigt (Qiaquick) und zum Subklonieren der gereinigten β-Arrestin2-DNA (siehe oben) an der NheI- und KpnI-Stelle verwendet. Der entstehende pCDNA3.1hyg/β-Arrestin2-(human):GFP1-Vektor wurde dann verwendet, um Säugetierzellen zur Verwendung in einer BRET-Untersuchung zu transfizieren. Das β-Arrestin2:GFP1-Fusionskonstrukt besaß einen Linker, welcher sechs Aminosäuren (GSGTGS) codierte, zwischen dem β-Arrestin2- und dem GFP1-Gen. Die pCDNA3.1hyg/β-Arrestin2:GFP1-Vektor-DNA wurde in Bakterien amplifiziert und mit dem Maxi-Prep-DNA-Kit von Qiagen gereinigt.
GFP1: β-Arrestin2-Fusionskonstrukt
Einführung eines Stopp-Kodons in das humane β-Arrestin2 durch PCR
Da das humane β-Arrestin2-Gen zuvor ohne sein Stoppkodon amplifiziert worden war, wurde dieses noch einmal durch RT-PCR amplifiziert, um ein Stoppkodon am C-Terminus einzuführen (Ausubel, F. M. et al.: Current protocols in molecular biology, Vol. 1 (1995) John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die für die PCR verwendete Matrize war der Vektor pCR-TOPO/β-Arrestin2, welcher zuvor hergestellt worden war (siehe oben). Die Primere (von Life Technologies) wurden basierend auf dem humanen β-Arrestin2-Gen hergestellt, welches in der Genbank gefunden wird (Zugangsnummer: NM004313). Im Gegensinn-Primer wurde ein Stoppkodon hinzugefügt, um dieses Merkmal in das endgültige Konstrukt einzuführen. In den Primer-Sequenzen wurden einmalige Restriktionsstellen hergestellt, um den Subklonierungsprozess des amplifizierten Produktes zu vereinfachen. Die PCR wurde in 50 μl mit einem GeneAmp PCR-System 9600 Instrument von Perkin Elmer durchgeführt (siehe Tabelle 12 für PCR-Bedingungen).
Das Startkodon des β-Arrestin2 ist fett dargestellt.
Das Stoppkodon des β-Arrestin2 ist fett dargestellt.
Die PCR-Reaktionen wurden wie Folgt durchgeführt:
Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 Minuten
Heißestart bei 75°C
Abschließender Verlängerungsschritt 72°C 10 Minuten
Das PCR-amplifizierte Produkt wurde durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese aufgelöst und die Bande, welche dem β-Arrestin2 (rund 1230 Basenpaare lang) entsprach, wurde mit dem Qiaquick-Spin-Kit (Qiagen) Gel-gereinigt. Die gereinigte Bande wurde dann gemäß dem Herstellerprotokoll in den Shuttle-Vektor pCR (Invitrogen) subkloniert. Nach Transformation in Bakterien mittels Standardprotokollen wurden positive Klone durch Restriktionsverdau unter Verwendung der in den PCR-Primeren hergestellten Stellen (KpnI und XbaI) identifiziert. Zwei Klone wurden mit dem BigDye ABI-Prism-Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) und ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) komplett sequenziert, um sicherzustellen, dass es im Vergleich zur Originalsequenz nicht zu einem Versatz gekommen ist. Ein positiver Klon im pCR-Vektor wurde mit KpnI- und XbaI-Enzymen verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden mit Hilfe von Agarosegel-Elektrophorese getrennt und die Bande, welche in der Länge dem β-Arrestin2 entsprach, wurde Gel-gereinigt (Qiaquick). Die gereinigte Bande wurde dann verwendet, um den endgültigen pCDNA3.1hyg/GFP1:β-Arrestin2-Vektor herzustellen.
PCR-Amplifizierung des GFP1 ohne sein Stoppkodon: GFP1-cDNA wurde durch PCR (1,2) ohne ihr Stoppkodon amplifiziert, wobei als Matrize der im Handel erhältliche pGFP-C1-Vektor (BioSignal Packard) verwendet wurde. Primer (von Life Technologies) wurden basierend auf der mit dem Vektor bereitgestellten GFP1-Sequenz hergestellt. In den Primer-Sequenzen wurden einmalige Restriktionsstellen bereitgestellt, um den Subklonierungsprozess des amplifizierten Produktes zu vereinfachen. Die PCR wurde in 50 μl mit einem GeneAmp PCR-System 9600 Instrument von Perkin Elmer durchgeführt (siehe Tabelle 13 für PCR-Bedingungen).
Das Startkodon des GFP1 ist fett dargestellt.
Die PCR-Reaktionen wurden wie Folgt durchgeführt:
Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 Minuten
Heißstart bei 75°C
Abschließender Verlängerungsschritt 72°C 10 Minuten
Die amplifizierte GFP1-DNA wurde mit dem Qiaquick-Spin-Kit (Qiagen) Gel-gereinigt und gemäß dem Herstellerprotokoll in den Shuttle-Vektor pCR (Invitrogen) subkloniert. Nach Transformation in Bakterien mittels Standardprotokollen wurden positive Klone durch Restriktionsverdau unter Verwendung der in den PCR-Primeren hergestellten Restriktionsstellen (NheI und KpnI) identifiziert. Zwei Klone wurden mit dem BigDye ABI-Prism-Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) und ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer) komplett sequenziert, um sicherzustellen, dass es im Vergleich zur Originalsequenz nicht zu einem Versatz gekommen ist. Ein positiver Klon im pCR-Vektor wurde mit NheI- und KpnI-Enzymen verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden mit Hilfe von Agarosegel getrennt und die Bande, welche in der Länge dem GFP1 entsprach, wurde Gel-gereinigt (Qiaquick). Die gereinigte Bande wurde dann verwendet, um den endgültigen pCDNA3.1hyg/GFP1:β-Arrestin2-Vektor herzustellen.
GFP:β-Arrestin2-Fusionskonstrukt: Der pCDNA3.1/hyg-Expressionsvektor (Invitrogen) wurde zuerst mit NheI und KpnI verdaut. Der verdaute Vektor wurde Gel-gereinigt und verwendet, um das amplifizierte GFP1 (ohne Stoppkodon) zu subklonieren, um den pCDNA3.1hyg/GFP1-Vektor herzustellen. Die Klone wurden durch Restriktionsverdau (KpnI und NheI) gescreened. Ein positiver Klon wurde mit KpnI und NheI verdaut, um das amplifizierte β-Arrestin2-Gen zu subklonieren, um den endgültigen pCDNA3.1hyg/GFP1:β-Arrestin2-Vektor herzustellen. Die Klone wurden nochmals durch Restriktionsverdau gescreent, um positive Klone ausfindig zu machen. Das endgültige GFP1:β-Arrestin2-Fusionskonstrukt besaß einen Linker zwischen dem β-Arrestin2- und dem GFP1-Gen, bestehend aus sechs Aminosäuren (Sequenz im Ein-Buchstabencode: GSGTGS). Die pCDNA3.1hyg/GFP1:β- Arrestin2-Vektor-DNA wurde in Bakterien amplifiziert und mit dem Maxi-Prep-DNA-Kit von Qiagen gereinigt.
BRET-Untersuchungen: Die HEK293-Zelllinie wurde vorübergehend mittels der Donator- und der Akzeptor-Fusionskonstrukt-DNA und LipofectAMINE 2000 (Life Technologies) wie im Herstellerprotokoll beschrieben in 100 min Schalen transfiziert. Für die Transfektionen wurde ein DNA-Verhältnis von 4 μg:46 μg (Donatorfusionskonstrukt:Akzeptorfusionskonstrukt) verwendet. Die Donatorfusionskonstrukte waren die V2-R:Rluc-(h)-Fusionskonstrukte und das Akzeptorfusionskonstrukt war entweder pCDNA3.1hyg/GFP1:β-Arrestin2 oder pCDNA3.1hyg/β-Arrestin2:GFP1. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde die transfizierten Zellen gewaschen, geerntet und mit einer Dichte von zwei Millionen Zellen pro ml in BRET-Puffer (PBS Ca²⁺ 0,9 mM/Mg²⁺ 0,5 mM, Glukose 1000 g/l, Pyruvat 36 mg/l (Life Technologies Kat. Nr. 18287) + 2 μg/ml Aprotinin) verdünnt. Fünfzigtausend transfizierte Zellen pro Kammer wurden zu weißen 96-Kammer-Platten (Optiplate, Packard Instrument Company) zugegeben. Der Agonist Arg⁸-Vasopressin (AVP) von Bachem wurde zur Hälfte der Kammer (siehe 31: +AVP) auf eine endgültige sättigende Konzentration von 50 nM zugegeben. Zur anderen Hälfte wurde BRET-Puffer zugegeben (–AVP). Die Zellen wurden dann für 20 Minuten bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 37,5 μl inkubiert. Nach dem Inkubationszeitraum wurden 12,5 μl DeepBlueC (auch Coel400a genannt) mit 20 μM zu jeder Kammer zugegeben (Endkonzentration 5 μM). Das endgültige Untersuchungsvolumen betrug 50 μl. Die Donator- und Akzeptorlichtausbeute wurde mit dem Fusion Microtiterplate Analyzer (Packard Instrument Company) mit den folgenden Instrumenteneinstellungen quantifiziert:
PMT: 1100 Volt
Verstärkung: 100
Temperatur: 25°C
Dualer Lumineszenz Modus

Leselänge: 1 Sekunde pro Kammer pro Filter
Filter: Donator: D410/80m (von Chroma Technology Corp.)
Akzeptor: D515/30m (von Chroma Technology Corp.)

Die Ergebnisse stellen den Mittelwert +/– SEM aus vier Kammern dar. Das Diagramm in 31 wurde mit Hilfe der GraphPad PRISM-Software unter Verwendung experimenteller Daten beim 10-Minuten-Zeitpunkt nach Zugabe von DeepBlueC erzeugt. In allen Fällen wurden die Hintergrundniveaus (Kammern mit nur DBC in PBS+) subtrahiert. Die Zahlen über den Balken repräsentieren die -fache Erhöhung (Bedingung +AVP dividiert durch –AVP).
31 demonstriert, dass beide Konfigurationen des β-Arrestin2-Fusionskonstruktes (β-Arrestin2:GFP1 und GFP1:β-Arrestin2) ein BRET-Signal, wenn sie mit dem V2-R:Rluc-Fusionskonstrukt co-transfiziert wurde, bei Zugabe des V2-R-Liganden AVP erzeugten. Beide Konfigurationen ergaben ähnliche BRET-Signale (0,042) in Abwesenheit von AVP (–AVP). In Gegenwart von AVP (+AVP) erzeugte das GFP1:β-Arrestin2-Fusionskonstrukt ein höheres BRET-Signal im Vergleich zu der anderen Konfiguration (0,129 gegenüber 0,087). Die Zahlen über den Balken stellen die -fache Lrhöhung der BRET-Signale in Gegenwart von AVP im Vergleich zur Abwesenheit von AVP für eine spezifische Bedingung dar. Das Beispiel zeigt die strukturelle Vielseitigkeit des BRET-Untersuchungen. Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3

Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
Tabelle 7
Tabelle 8
Tabelle 9

* zugegeben während Heißstart-Schritt

* zugegeben während einem Heißstart-Schritt

* zugegeben während einem Heißstart-Schritt

* zugegeben während Heißstart-Schritt

* zugegeben während Heißstart-Schritt

Claims

Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) -System, das Folgendes aufweist: (a) ein biolumineszierendes Donorprotein (BDP), das an ein erstes Molekül oder einen ersten Modulator angelagert ist; (b) ein fluoreszierendes Akzeptormolekül (FAM), das an ein zweites Molekül oder einen zweiten Modulator angelagert ist, wobei das FAM in Gegenwart eines geeigneten Substrats die Energie von dem BDP entgegennehmen kann, wenn sie miteinander in Verbindung gebracht sind, und wobei eine physikalische Veränderung bei dem(den) Modulator(en) die Effizienz des Energietransfers zwischen dem BDP und dem FAM beeinflusst und wobei das System eine große spektrale Auflösung von mindestens 80 nm zwischen den Peaks des BDP-Emissionsspektrums und des FAM-Emissionsspektrums aufweist.
BRET-System nach Anspruch 1, wobei der Modulator zwei getrennte Moleküleinheiten aufweist, die an das FAM bzw. an das BDP angelagert sind.
BRET-System nach Anspruch 2, wobei die zwei getrennte Moleküleinheiten gleich sind.
BRET-System nach Anspruch 2, wobei die zwei getrennten Moleküleinheiten verschieden sind.
BRET-System nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, wobei eine der Moleküleinheiten ein Rezeptor, eine Rezeptor-Untereinheit oder ein Fragment davon ist oder beide Moleküleinheiten Rezeptoren, Rezeptor-Untereinheiten oder Fragmente davon sind.
BRET-System nach Anspruch 5, wobei der Rezeptor ein Orphan-Rezeptor ist.
BRET-System nach Anspruch 2 oder Anspruch 4, wobei eine der Moleküleinheiten ein rezeptorbindendes Molekül ist, das an einen aktivierten Rezeptor binden wird, während die andere ein Rezeptor, eine Rezeptor-Untereinheit oder ein Fragment davon ist.
BRET-System nach Anspruch 7, wobei das rezeptorbindende Molekül β-Arrestin, ein G-Protein oder Ubiquitin ist.
BRET-System nach Anspruch 1, wobei der Modulator, das FAM und das BDP ein Fusionsmolekül umfassen.
BRET-System nach Anspruch 2 oder Anspruch 9, wobei eine Interaktion zwischen dem Modulator, dem FAM und dem BDP von der Aktivität eines weiteren Moleküls abhängig ist.
BRET-System nach Anspruch 2, wobei die Interaktion zwischen den Molekülen konstitutiv ist.
BRET-System nach Anspruch 1, das außerdem ein Gerät zur BRET-Signal-Erfassung aufweist, das fähig ist, speziell BDP und/oder FAM-Emissionen zu bestimmen.
BRET-System nach Anspruch 12, wobei eine oder mehrere optische Filter in das Gerät eingebaut sind, um die Überlappung zwischen den Emissionsspektren zu vermindern und eine große spektrale Auflösung zu erzeugen.
BRET-System nach Anspruch 12, wobei das Gerät ein Mikroplattenleser oder ein Abbildungssystem ist.
BRET-System nach Anspruch 12, wobei in das Gerät ein oder mehrere Monochromatoren oder Prismen eingebaut sind, um die Überlappung zwischen den Emissionsspektren zu vermindern und eine große spektrale Auflösung zu erzeugen.
BRET-System nach Anspruch 12, wobei das Gerät ein Spektrophotometer oder ein Spektrofluorometer ist.
BRET-System nach Anspruch 12, wobei ein Algorithmus benutzt wird, um rechnerisch die in dem FAM-Peak vorhandene BDP-Emission abzuziehen und die große spektrale Auflösung zu erzeugen.
BRET-System nach Anspruch 1, wobei das BDP in Gegenwart eines geeigneten Substrats Luciferaseaktivität aufweist.
BRET-System nach Anspruch 18, wobei die Luciferase Renilla-Luciferase oder Leuchtkäfer-Luciferase, Gaussia-Luciferase, Aequorin ist.
BRET-System nach Anspruch 19, wobei eine große spektrale Auflösung durch Verwendung einer nicht natürlich vorkommenden Luciferase erreicht wird.
BRET-System nach Anspruch 1, welches zusätzlich ein geeignetes Substrat, das die Lumineszenzaktivität des BDP aktiviert, aufweist.
BRET-System nach Anspruch 1, wobei die große spektrale Auflösung durch Verwenden eines nicht natürlich vorkommenden Substrats erreicht wird.
BRET-System nach Anspruch 22, wobei das Substrat ein Derivat von Coelenterazin ist.
BRET-System nach Anspruch 23, wobei das Coelenterazin-Derivat coel400a ist.
BRET-System nach einem der Ansprüche 1, 12, 20 oder 22, wobei die große spektrale Auflösung durch Verwenden eines nicht natürlich vorkommenden FAM erreicht wird.
BRET-System nach Anspruch 25, wobei das FAM ein mutiertes grün fluoreszierendes Protein oder ein mutiertes rot fluoreszierendes Protein ist.
BRET-System nach Anspruch 26, wobei das mutierte grün fluoreszierende Protein die folgenden Substitutionen aufweist: (a) Phenylalanin-64 zu Leucin, (b) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin; (c) Phenylalanin-64 zu Leucin und Serin-202 zu Phenylalanin; (d) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin und Serin-202 zu Phenylalanin; (e) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin und Tyrosin-203 zu Isoleucin; oder (f) Phenylalanin-64 zu Leucin, Serin-147 zu Prolin, Serin-202 zu Phenylalanin und Tyrosin-203 in Isoleucin.
Verwendung des BRET-Systems nach Anspruch 1, um Protein-Protein-Interaktionen in vitro zu überwachen.
Verfahren zum Herstellen eines BRET-Systems nach Anspruch 1, das folgende Schritte aufweist: (a) Auswählen eines biolumineszierenden Donorproteins (BDP) und eines fluoreszierenden Akzeptormoleküls (FAM), derart, dass das FAM in Gegenwart eines geeigneten Substrats die Energie von dem BDP entgegennehmen kann, wenn sie miteinander in Verbindung gebracht sind; und (b) entweder (i) Anwenden eines Algorithmus, um rechnerisch die BDP-Emission von dem FAM-Peak abzuziehen, (ii) Vermindern der Überlappung zwischen dem BDP-Emissionsspektrum und dem FAM-Emissionsspektrum mit optischen Filtern; (iii) Anwenden einer ortsspezifischen Mutagenese, um das Emissionsspektrum des BDP zu verändern; (iv) Verwenden eines Coelenterazin-Derivat-, Luciferin- oder biolumineszierenden Substrats, das eine Verschiebung bei dem BDP-Emissionsspektrum bewirkt; oder (v) Anwenden einer ortsspezifischen Mutagenese, um die Anregung und/oder das Emissionsspektrum des FAM zu verändern, wobei das System eine große spektrale Auflösung von mindestens 80 nm zwischen den Peaks des BDP-Emissionsspektrums und des FAM-Emissionsspektrums aufweist.