JP6132350B2 - 人工生物発光酵素 - Google Patents
人工生物発光酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6132350B2 JP6132350B2 JP2013193508A JP2013193508A JP6132350B2 JP 6132350 B2 JP6132350 B2 JP 6132350B2 JP 2013193508 A JP2013193508 A JP 2013193508A JP 2013193508 A JP2013193508 A JP 2013193508A JP 6132350 B2 JP6132350 B2 JP 6132350B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- protein
- luminescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 215
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 215
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 146
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 139
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 129
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 125
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 112
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 99
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 84
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 68
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 33
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 33
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 31
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 29
- 241000239250 Copepoda Species 0.000 claims description 24
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 20
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 17
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 claims description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 238000003160 two-hybrid assay Methods 0.000 claims description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 124
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 120
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 43
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 41
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 40
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000002438 stress hormone Substances 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 19
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 13
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 13
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 12
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 12
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 11
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- AOUOVFRSCMDPFA-QSDJMHMYSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]butanedioic acid Chemical group OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AOUOVFRSCMDPFA-QSDJMHMYSA-N 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 7
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 6
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 5
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- 241000130437 Lucicutia Species 0.000 description 5
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- JYGXADMDTFJGBT-MKIDGPAKSA-N 11alpha-Hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-MKIDGPAKSA-N 0.000 description 4
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 4
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 4
- 241000186242 Metridia pacifica Species 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 4
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N N-[[(5S)-2-oxo-3-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)-1,3-oxazolidin-5-yl]methyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1O[C@H](CN1C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 3
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- JAWMENYCRQKKJY-UHFFFAOYSA-N [3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-ylmethyl)-1-oxa-2,8-diazaspiro[4.5]dec-2-en-8-yl]-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]methanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CC1=NOC2(C1)CCN(CC2)C(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F JAWMENYCRQKKJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003159 mammalian two-hybrid assay Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 3
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 2
- 241001343649 Gaussia princeps (T. Scott, 1894) Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023715 Poly(A)-specific ribonuclease PARN Human genes 0.000 description 2
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- SFMJNHNUOVADRW-UHFFFAOYSA-N n-[5-[9-[4-(methanesulfonamido)phenyl]-2-oxobenzo[h][1,6]naphthyridin-1-yl]-2-methylphenyl]prop-2-enamide Chemical compound C1=C(NC(=O)C=C)C(C)=CC=C1N1C(=O)C=CC2=C1C1=CC(C=3C=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=3)=CC=C1N=C2 SFMJNHNUOVADRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000003157 protein complementation Methods 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 2
- YIWGJFPJRAEKMK-UHFFFAOYSA-N 1-(2H-benzotriazol-5-yl)-3-methyl-8-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carbonyl]-1,3,8-triazaspiro[4.5]decane-2,4-dione Chemical compound CN1C(=O)N(c2ccc3n[nH]nc3c2)C2(CCN(CC2)C(=O)c2cnc(NCc3cccc(OC(F)(F)F)c3)nc2)C1=O YIWGJFPJRAEKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCSBOFLEOACXIR-UHFFFAOYSA-N 2-benzyl-8-(cyclopentylmethyl)-6-(4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2ccccc2)nc2c(CC3CCCC3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 UCSBOFLEOACXIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- WJOLQGAMGUBOFS-UHFFFAOYSA-N 8-(cyclopentylmethyl)-2-[(4-fluorophenyl)methyl]-6-(4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2ccc(F)cc2)nc2c(CC3CCCC3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 WJOLQGAMGUBOFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBLMZJSGNQTCLU-UHFFFAOYSA-N 8-(cyclopentylmethyl)-6-(4-hydroxyphenyl)-2-[(4-hydroxyphenyl)methyl]imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2ccc(O)cc2)nc2c(CC3CCCC3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 YBLMZJSGNQTCLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MEMQQZHHXCOKGG-UHFFFAOYSA-N 8-benzyl-2-[(4-fluorophenyl)methyl]-6-(4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2ccc(F)cc2)nc2c(Cc3ccccc3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 MEMQQZHHXCOKGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONVKEAHBFKWZHK-UHFFFAOYSA-N 8-benzyl-6-(4-hydroxyphenyl)-2-(naphthalen-1-ylmethyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2cccc3ccccc23)nc2c(Cc3ccccc3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 ONVKEAHBFKWZHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000006722 Calanus jashnovi Species 0.000 description 1
- 241001048431 Candacia bipinnata Species 0.000 description 1
- 241000375310 Candacia columbiae Species 0.000 description 1
- 241001226886 Candacia longimana Species 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102100038385 Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Human genes 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000132302 Euchaeta marina Species 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033417 Glucocorticoid receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000375307 Heterorhabdus tanneri Species 0.000 description 1
- 241000331041 Heterostylites major Species 0.000 description 1
- 101000743767 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein R3HCC1L Proteins 0.000 description 1
- 101000979249 Homo sapiens Neuromodulin Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000895759 Lucicutia ovaliformis Species 0.000 description 1
- 241000186140 Metridia longa Species 0.000 description 1
- 241000375308 Metridia okhotensis Species 0.000 description 1
- 241000535810 Metridinidae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000252572 Neocalanus cristatus Species 0.000 description 1
- 241000252571 Neocalanus flemingeri Species 0.000 description 1
- 241000252579 Neocalanus plumchrus Species 0.000 description 1
- 102100023206 Neuromodulin Human genes 0.000 description 1
- 241001443980 Oplophoridae Species 0.000 description 1
- 241001443978 Oplophorus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001343647 Pleuromamma Species 0.000 description 1
- 241000331020 Pleuromamma abdominalis Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- KAEGGIFPLJZUOZ-UHFFFAOYSA-N Renilla luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C(N1)=CN2C(=O)C(CC=3C=CC=CC=3)=NC2=C1CC1=CC=CC=C1 KAEGGIFPLJZUOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000036231 Scaphocalanus magnus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241001155467 Spinocalanus Species 0.000 description 1
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000375321 Undeuchaeta Species 0.000 description 1
- 241001644849 Undeuchaeta major Species 0.000 description 1
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 231100000507 endocrine disrupting Toxicity 0.000 description 1
- 231100000049 endocrine disruptor Toxicity 0.000 description 1
- 239000000598 endocrine disruptor Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008622 extracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000001748 luminescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003158 yeast two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
(i)配列番号38に示されたアミノ酸配列、又は、
(ii)配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
(i)配列番号37に示されたアミノ酸配列、又は、
(ii)配列番号37に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
(iii)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列、
(iv)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
(v)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
(vi)配列番号22に示されたアミノ酸配列、又は、
(vii)配列番号22に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
N末端側及びC末端側に2分割された前記〔10〕に記載のレポーター蛋白質と共に、リガンド結合性の標的蛋白質及び標的蛋白質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するポリペプチドを含む融合蛋白質からなる生物発光プローブ。
(1−1)カイアシ類ルシフェラーゼについて:
発光性の海洋動物としては、Metridia okhotensis、Pleuromamma abdominalis、Lucicutia ovaliformis、Heterorhabdus tanneri、Heterostylites major、Gaussia princeps、Renilla reniformis(ウミシイタケ)、Metridia pacifica、Lucicutia grandis、Lucicutia bicormuta、Pleuromamma xiphias、Pleuromamma scutullata、Haloptilus pseudooxycephalus、Candacia longimana、Candacia columbiae、Candacia bipinnata、Calanus jashnovi、Neocalanus cristatus、Neocalanus flemingeri、Neocalanus plumchrus、Scaphocalanus magnus、Spinocalanus spinipes、Euchaeta marina、Undeuchaeta plumose、Undeuchaeta major、Xanthocalanus kurilensis、Scaphocalanus magnus Gaidius variabilis、Euchirella amoena、Cypridina (ウミホタル;CLuc)、オベリン(Obelin)、アクアリン(aqualine)、Oplophorus由来の海洋生物が生物発光酵素(ルシフェラーゼ)を産生していることが知られている。
本発明の新規な人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、これらの「カイアシ類ルシフェラーゼ」群のアミノ酸配列をもとに創製されているので、前記基質特異性や至適pHなど「カイアシ類ルシフェラーゼ」の基本的な酵素としての特性は保持しており、さらに発光強度、長波長の発光、発光の安定性などの発光特性において、顕著に優れた特性を獲得した画期的な人工ルシフェラーゼである。
(i)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列、
(ii)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
(iii)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、例えば、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上の同一性を有するアミノ酸配列であればさらに好ましい。
(iv)配列番号37に示されたアミノ酸配列、又は、
(v)配列番号37に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は214-218位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
(iv)配列番号38に示されたアミノ酸配列、又は、
(v)配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
(vi)配列番号22に示されたアミノ酸配列、又は、
(vii)配列番号22に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
(2−1)本発明の新規ルシフェラーゼ(ALuc)に求められる発光特性について
カイアシ類ルシフェラーゼに求められる発光特性としては、具体的には高輝度発光強度と共に長波長側にシフトした発光スペクトル、高い発光安定性、耐熱性や耐塩性が取り上げられる。発光のスペクトルが長波長側にシフトすることによって、皮膚組織や臓器などにおける発光の組織透過性が増すため、長波長発光スペクトルも、バイオアッセイや診断プローブ用発光酵素として用いるレポーター蛋白質として重要な発光特性である。また、発光強度が強ければ、様々なバイオアッセイにおいて少数の発光分子でも検出できる効果が期待できる。また経時的な発光安定性が保たれていれば、発光信号の信頼性が高くなり、分子イメージングの際、退色性の緩和が見込まれる。また耐熱性や耐塩性があることによって様々なバイオアッセイ環境下でも確実に発光信号を見込まれる利点がある。本発明においても人工ルシフェラーゼ(ALuc)を見比べるときに、このような性質の有無を中心に比較をしてよりよい人工ルシフェラーゼ(ALuc)の樹立を目指した。
従来の新規ルシフェラーゼを樹立するための方法は、1つは、種々のカイアシ類の体液から直接mRNAを抽出し、逆転写酵素を用いてDNA化して発現ベクター(例、pcDNA3.1(+))に挿入し、発現させて評価することで新規ルシフェラーゼを発見する方法である。もう一つの方法は、既に樹立されたルシフェラーゼに変異を導入することによって新たな性質を生み出し強化する方法であり、新たな変異体の樹立方法として一般的に用いられてきた。この際、塩基の変異方法は部位突然変異法(クイックチェンジ法ともいう)など周知の方法を適宜用いることができる(非特許文献18)。
着目点1:まず、従来の蛋白質配列の理解法の一つとして、“consensus sequence-driven mutagenesis strategy”という方法が提案されている(非特許文献13)。この方法は、既存のデータベース上にある類似したアミノ酸配列を整列して、配列間で頻度の高いアミノ酸が熱力学的にも最も安定化効果の高いアミノ酸であるだろうという前提で配列を解析する方法である。ただし、このアミノ酸類似性に基づいた整列方法は、人間の偏見やデータベース内の類似配列の数によって結果が大きく左右される短所がある。本研究者はこの点に留意しながら実施例1−1に示すアミノ酸配列の類似性整列を行った。
0%:extracellular
22.2%:cytosol
33.3%:ER
67%:extracellular
11.1%:cyto
11.1%:ER
44.4%:endoplasmic reticulum
33.3%:mitochondrial
11.1%:Golgi
11.1%:nuclear
33.3%:extracellular,including cell wall
22.2%:vacuolar
22.2%:cytoplasmic
22.2%:endoplasmic reticulum
55.6%:extracellular,including cell wall
22.2%:endoplasmic reticulum
11.1%:cytoplasmic
11.1%:vacuolar
前述した着目点1〜4のストラテジーに従ったアミノ酸配列決定作業を行い、多数の新たな候補配列を作り上げることができた。当該アミノ酸配列群を実際の発現に移すために、遺伝子コドン(codon)表に基づいて各アミノ酸に対応する遺伝子コドンを当てはめた。この際に哺乳類動物細胞に有利に発現できるように、マウス細胞で最適に発現できるように一連のコドンを決定した。その1例についての塩基配列を、配列番号23として示す。
(3−1)酵素活性の確認方法
ALucの酵素活性は、例えば、以下の方法で検証することができる。
本発明における典型的な人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、ALuc10(配列番号11),ALuc15(配列番号12),ALuc16(配列番号13),ALuc17(配列番号24),ALuc18(配列番号14),ALuc19(配列番号25),ALuc21(配列番号26),ALuc22(配列番号15),ALuc23(配列番号16),Luc24(配列番号27),ALuc25(配列番号17),ALuc26(配列番号28),ALuc27(配列番号29,ALuc28(配列番号30),ALuc29(配列番号31),ALuc30(配列番号32),ALuc31(配列番号33),ALuc32(配列番号34),ALuc33(配列番号35)及びALuc34(配列番号36)である。
(1)一過性の強い光を示す特徴があり発光安定性が乏しい点、
(2)N末端に分泌シグナルを有する点、
(3)発光酵素の大きさが他の発光酵素より小さい点、
(4)共通して青色(480 nm)を出す点があった。
本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の用途については、典型的には、従来の生物発光プローブにおける発光酵素の要素として用いることの他に、きわめて高輝度な安定的な発光シグナルを発するため生体内の各種の蛍光イメージング用レポーター遺伝子の代替として用いることなどが挙げられる。いずれにしても、主要な用途は、ヒトをはじめ哺乳動物の生体内で、又は試験管内の哺乳動物細胞で用いる場合である。
(5−1)本発明の「レポーター分析法」について
本発明のALuc及びその遺伝子は、各種「レポーター分析法」における「レポーター蛋白質」又は「レポーター遺伝子」として好適に用いることができる。
(i)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列、
(ii)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
(iii)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(iv)配列番号37に示されたアミノ酸配列、
(v)配列番号37に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は214-218位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列、
(vi)配列番号38に示されたアミノ酸配列、
(vii)配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列、
(viii)配列番号22に示されたアミノ酸配列、又は、
(ix)配列番号22に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
本発明のALucをレポーター蛋白質として「basic法」に適用する場合、ALucを単純に標的蛋白質に繋げた融合蛋白質を作ればよい。この際に非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。
生物発光酵素をレポーター蛋白質として「inducible法」に適用することは、組換えDNA技術によって組換え蛋白質が作製される際の遺伝子発現の時期及び発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期及び発現量変化を示す指標として広く用いられている。「inducible法」に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ(reporter gene assay)、Yeast Two-hybrid assay、Mammalian Two-hybrid assay、protein splicing assay(PSA)、protein complementation assay(PCA)、circular permutation assay、bioluminescence resonance energy transfer assay(BRET)等があるが、これらの分析システムに必須のレポーター遺伝子として本発明のALucを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できる。この形態のレポーター分析法は、本明細書の実施例1−9に示す。
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化及び遺伝子の発現調節の解析手段として繁用されているが、典型的には核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質(環境ホルモン)の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子(例えば、ホルモン応答性遺伝子)の発現は、リガンドと受容体の複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域(ホルモン応答配列;hormone response element)に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子又は内分泌攪乱物質量を生物発光量などで検出するアッセイ法である。
ツー・ハイブリッド法(Two-hybrid法)は蛋白質間の相互作用を調べる手法の1つであり、1989年に酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いたyeast two-hybrid(Y2H)システムがまず構築された。転写活性化因子であるGAL4蛋白質のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、GAL4 DBDと任意の蛋白質A(bait)を融合蛋白質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン(TA)と融合蛋白質とした蛋白質B(prey)と相互作用をするかどうかを判定できる。前記蛋白質AとBが結合する場合にはDBDとTAが近接してDNA結合ドメイン(DBD)が、「UASG」塩基配列に結合するのでその下流に連結したレポーター遺伝子発現を促すことになる。レポーター遺伝子がルシフェラーゼであれば、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、A,B両蛋白質の親和性が測定でき、蛋白質A(bait)と相互作用をする蛋白質、ペプチドのスクリーニングができる。その際の蛋白質B(prey)は発現ライブラリーによって提供させることもできる。
生物発光酵素を“activatable”法のレポーター蛋白質として搭載する分析システムも、従来から本発明者らが「生物酵素発光プローブ」技術として研究開発し、発展させてきた。以下、典型的な“activatable”法の例として、本発明のALucの「生物酵素発光プローブ」への適用例、及びそれを用いた「細胞内イメージング法」について述べるが、それに先立ち、まず、本発明ではじめて開発した「発光性融合蛋白質(発光カプセル)」について述べる。その他、本発明のALucは、“activatable”法に含まれるprotein complentation assay(PCA),protein splicing assay (PSA)におけるレポーター蛋白質として好適に適用できる。
本発明のALucのC末端側に膜局在シグナル(MLS)を結合することで、ALuc本体を細胞膜に局在させることができるが、このように細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、ALuc本体とシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドや蛋白質の遺伝子をカーゴ(貨物という)として挿入することが可能である。こうすることによってカーゴとなる蛋白質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るように仕掛けたことになる。典型的な例としては、各蛋白質の繋ぎ目に、細胞死に応答するDEVD配列やIETD配列を入れ込んだ場合では、細胞死の際caspase-3やcaspase-8の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。本発明者はこの構造の発光性融合蛋白質を「発光カプセル」と名付けた。
(a)本発明のALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、蛍光蛋白質又はルシフェラーゼが挿入された発光性融合蛋白質、(なお、ルシフェラーゼとしては本発明の他のALucであってもよい。
(b)本発明のALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチド又は当該ポリペプチドが認識する20アミノ酸以下の、好ましくは10アミノ酸以下のポリペプチドが挿入された発光性融合蛋白質。ここで、特に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、Caspase及びその認識配列である「DEVD」又は「IETD」を含む20アミノ酸以下のポリペプチドが特に好ましい。
また、本発明のALucを、本発明者らが既に特許出願している発明に係る一分子型発光プローブ(非特許文献4,6,9,10、特許文献1−4)、又は二分子型発光プローブ(非特許文献5,8)に組み込むことによって、リガンドの有無、リガンドの活性強度を高輝度で観測できる。当該プローブの構成要素として、[1]2つに分割された当該発光酵素(NとC末側断片)の近傍に、[2]標的リガンドに応答するリガンド結合蛋白質と、[3]リガンド結合蛋白質にリガンドが結合したことを認識する認識蛋白質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成できる。この発光プローブ中、前記リガンド結合蛋白質にリガンドが結合したことを前記認識蛋白質が認識した場合に、2つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。
また、当該ALucをコードする遺伝子を用いることで、様々な細胞株に安定的に導入できる。一例として、胚内未分化細胞、ES細胞や新型万能細胞(iPS)に当該ALucを安定的に導入できる。前記細胞そのものは、光らないため内部で起こる分子現象、組織特異性を探索するのは大変困難であった。この困難を克服するために、まず、体細胞に当該ALucを含む分子プローブを導入してから胚を作成し、様々な臓器組織に分化させる。すると、各臓器ごとに起こる特異的な分子現象を高感度に計測できる。
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)",Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);D.M.Glover et al.ed.,"DNA Cloning",2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y,1995;日本生化学会編、「続生化学実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座2、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992);R.Wu ed.,"Methods in Enzymology",Vol.68(Recombinant DNA),Academic Press,New York(1980);R.Wu et al.ed.,"Methods in Enzymology",Vol.100(Recombinant DNA,Part B) & 101(Recombinant DNA,Part C),Academic Press,New York(1983);R.Wu et al.ed.,"Methods in Enzymology",Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E) & 155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)から入手することができる。
公開の生物情報データベース(NCBI)等からカイアシ類ルシフェラーゼ配列を、アミノ酸類似性に基づいて整列することによって頻度の高いアミノ酸を中心に新規人工ルシフェラーゼ(ALuc)の原型を作りあげた(図1A)。更に前記データベース上のルシフェラーゼ配列を前頭部、前半部、後半部に分けて前頭部の配列の類似性整列からは頻度の高いアミノ酸配列を抽出した(図1B)。また前半部と後半部を重ねることによって頻度の高いアミノ酸のみならず、配列の前半と後半間の相同性の高いアミノ酸配列を抽出し、約23個の人工的なルシフェラーゼ配列を作り出す作業を行った。
前記過程を通じて合成された人工ルシフェラーゼ(ALuc)遺伝子群を哺乳細胞発現ベクター(pcDNA3.1(+))にsubcloneした。この個々の発現ベクターをアフリカミドリサル腎臓由来のCOS-7細胞にトランスフェクションして、各人工ルシフェラーゼ(ALuc)の輝度、発光安定性、長波長側シフト度を比較した(図2〜図5)。
本発明の人工ルシフェラーゼALuc)の発光安定性を様々な側面で検証した(図3)。それぞれのルシフェラーゼの遺伝子を導入したCOS-7細胞を9時間培養し、Promega製の細胞溶解溶液で20分処理し、更にPromega製の基質入りの反応溶液を添加してからのそれぞれの発光酵素の輝度の経時変化を5分刻みで観察した(図3A)。その結果、従来のGLucやALuc2の場合、基質導入後、急激な発光減光現象が見えたが、ALuc15とALuc16は25分が経過しても最初より6割の発光輝度が維持できた。
本発明の人工生物発光酵素の耐熱性、細胞外分泌度をそれぞれ測定した(図4)。まず、耐熱性を測定するために、それぞれの生物発光酵素を導入したCOS-7細胞をPromega製の細胞溶解溶液でLysateを作った後、同一サンプルに対して、そのまま室温放置した場合と80℃で10分間加熱した場合において発光強度の変化をPromega製の反応溶液(基質入り)をもって比較した(図4A)。
本人工ルシフェラーゼ(ALuc)の発光スペクトルを指標に生物発光の長波長側シフト度を測定した(図5)。まず、COS-7細胞にそれぞれの人工ルシフェラーゼ(ALuc)を導入しovernight培養した。その後、Promega製の細胞溶解液で20分間処理し、5μL(図5A)や2μL(図5B)のLysateにPromega製の基質入りの反応溶液を添加して直ちにspectrophotometer (AB-1850,ATTO)でスペクトルを測定した。その結果、本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)類の多くは長波長側シフトした発光スペクトルを示しており、その程度は従来のカイアシ類ルシフェラーゼの一般的なスペクトル頂点(470-480nm)と比べて50-80 nmも長波長側シフトしたスペクトルを示した(例、ALuc15,ALuc16,ALuc23など)。
前記実施例1−1〜1−5に示す新規合成の人工ルシフェラーゼ(ALuc)類のアミノ酸配列を基に、既存の発光生物由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列との相関性、類似性を比較した(図6)。
本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)を骨格とした“発光カプセル”プローブを開発した(図7)。本発光カプセルの基本的な分子構造は、細胞外分泌シグナル(SP)、ALuc本体、適当な貨物蛋白質(ペプチド)、膜局在化シグナルで構成されている。このプローブはSPのため最初に小胞体に移行され小胞体から細胞膜にまで移送される。このプローブはMLSの働きによって細胞膜に最終的に局在するように設計されている(図7AB)。
前記実施例1−7に示した発光カプセルの作用を蛍光顕微鏡(Leica)で測定した(図8)。まず、従来の蛍光蛋白質であるmPlumを挿入した発光カプセル(配列番号20)をCOS-7細胞に導入しovernight培養した。STS刺激を行った場合と対象群としてSTS刺激を行っていない場合における細胞映像を比較した(図8C)。その結果、発光カプセルがSTS刺激以前は細胞膜に、STS刺激後は細胞質に主に局在していることが確認できた。この結果は、当該発光カプセルが細胞死のような細胞内信号伝達過程を高感度で計測できることを意味する。
本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の発光レポーターとしての利点を示すために、従来の哺乳動物ツーハイブリットアッセイシステムのレポーターとしてALucを使用してみた。まず、既知の遺伝子工学技術を用いて、市販のレポーター発現ベクター(pG5)にMpLuc4やALuc16をコードする遺伝子を挿入した新規レポーター発現ベクターを構築した。更に本研究者の以前の研究結果物であるpG5-GLucもともに準備した(図9A)。
ALucの利点を示すために、ALucを骨格にする、一連の一分子型生物発光プローブを開発した(図10)。図10Aは、その遺伝子骨格を示す。まず、ALucを2分割して前後して配置させる。更にその外側にストレスホルモン受容体(glucocorticoid receptor ligand binding domain;GR HLBD)とその結合ペプチド(LXXLLモチーフ)をそれぞれつなげた。このプローブの作動原理は、図10Aの下段に示すように、リガンド有りの条件で分子が折畳まれ、発光輝度が回復するものである。
細胞毒性検出実験を行うために新たな生物発光測定デバイスを開発した(図11D)。その構造は以下に説明する。
まず、市販の細胞培養や顕微鏡観察用のマイクロスライド(6チャンネル、ibidi社製)がフィットするようにマイクロスライドホルダーを、アルミで加工した。このマイクロスライドホルダーがはめられるように例えばプラスチック材でプラットフォームを製作した。このマイクロスライドホルダーが一定間隔毎にプラットフォームを滑り止るようにスライドホルダーの横または下に一定間隔で溝を作り、この溝に係合するようにプラットフォームに係合部材(例えばスプリングボール等)をとりつけた。
本発明の発光測定デバイスを用いて、細胞死誘発化学物質(STS)の毒性を発光スペクトルの変化を基に測定した(図12参照)。まず市販の細胞培養用のマイクロスライド(ibidi社製)にサル腎臓由来のCOS-7細胞を植え、マイクロスライド面積の9割が細胞に埋まるまで細胞を培養した。その細胞に生物発光プローブをコードするプラスミドを遺伝子導入し、更に24時間培養した。前記マイクロスライドに培養した細胞にSTS(最終濃度:1μM)有り無しの条件で10分間刺激を行った。
ALuc16を骨格に作った生物発光カプセル(配列番号19)を用いて化学物質の細胞毒性を測定した(図13)。まずCOS-7細胞を6-チャンネルマイクロスライドに培養し、前記「配列番号19」をコードする遺伝子を細胞に導入し、更に16時間培養を続けた。その後、細胞毒性物質(STS)有り無しの条件で細胞を2分刺激し、基質入りの溶液下で生物発光輝度の違いを示す発光イメージをLAS-4000(FujiFilm)で測定した。
本発明の発光測定デバイスを用いて、ストレスホルモンを測定した(図14参照)。まずアフリカ緑サル腎臓由来のCOS-7細胞を6-チャンネルのマイクロスライド(2.5×7.5cm,μ-Slide VI0.4;ibidi社製)に蒔き90%の底体積を被るまで培養した。このスライド上の細胞に図14Aに示すような一分子型生物発光プローブ(cSimgr13等)を、遺伝子導入用脂質試薬(TransIT-LT1)を用いて導入し16時間培養した。このマイクロスライドに左3チャンネルにはそれぞれコントロール溶液入りの培地で刺激した。一方、右の3チャンネルにはストレスホルモンの標準溶液(10-5M)を投与し20分間インキュベートした。その後、マイクロスライド内の溶液を全部除去しHBSSバッファーで一回洗浄した。その後、Promega社が提供するライシス溶液を用いて細胞溶解液を作成し、同じPromega社が提供するnCTZ入りのアッセイ溶液を添加した。このスライドを本発明の発光測定デバイスに搭載し、この発光測定デバイスは更にルミノメーター(GloMax 20/20n,Promega社製)に乗せてミラーキャップの有り無しの条件で発光値を測定した。
本発明の人工生物発光酵素(ALuc)の発光色素としての利点を示すために、GSTタグ抗体の可変領域フラグメントにALucを繋げた新規一本鎖抗体(single chain variable fragment;scFv)を試作した(図15)。
scFv-ALuc16と従来のHRPの発光スペクトルを比較するために以下のスペクトル測定を行った(図16)。まず実施例1−15に示した手法と同様に0.1μg/mLのscFv-ALuc16とHRP付の抗マウス抗体を調製した。この溶液25μLを96穴マイクロプレートの各ウェルに入れた。更に実施例1−15に示したのと同様に調製したそれぞれの基質溶液75μLを、8チャンネルマイクロピペットを用いて同時に前記各ウェルにInjectし、発光スペクトルを発光専用の高感度分光機(AB-1850,ATTO)で測定した。
実施例10に示したALucを骨格とする一分子型生物発光プローブであるcSimgr13を発現する新たなES細胞を樹立し、ストレスホルモン感受性を可視化した(図17)。まず、フィーダーフリーの胚性幹細胞(ES)であるEB3細胞を10センチディッシュに培養した後、cSimgr13をコードするpcDNA3.1(+)ベクターをEB3細胞に導入し、G418存在下で、cSimgr13を安定的に発現する形質変換細胞を樹立した。
前記研究開発結果を踏まえ、更なる機能性人工生物発光酵素の開発を行った。ALuc25を基に、より親水性アミノ酸の割合が多い配列と少ない配列を作り、ALuc26, ALuc27, ALuc28, ALuc29と名付けた。また、配列の中で抗原認識部位(epitope, 例:Hisタグ、Mycタグ等)を有する一連の人工生物発光酵素を開発し、それぞれALuc30 (配列中にHisタグ含有), ALuc31 (配列中にHisタグ含有), ALuc32 (配列中にMycタグ含有)と名付けた(図18)。
本発明で開発した人工生物発光酵素(ALuc)活性の長時間安定性を調べた。まずCOS-7細胞にそれぞれの人工生物発光酵素(ALuc16, ALuc22, ALuc23, ALuc24, ALuc25, ALuc30)(図中、それぞれをA16, A22, A23, A24, A25, A30と表す。)を発現するプラスミドを導入した後、24時間さらに培養を続けた。この培養により人工生物発光酵素が培地に分泌される。この培地中に分泌された人工生物発光酵素を取り、それぞれ同一条件での酵素活性の相違を以下の要領で測定した。初日(0 day)に5μLの培地に50μLのアッセイ溶液(ネイティブセレンテラジン入りのプロメガ製)を添加して、発光値(酵素活性)をLAS-4000 (FujiFilm)で測定した。同じ要領で8日目、16日目、25日目の発光値をそれぞれ測定に初日の数値と見比べた(図19(A))。その結果、ALuc16とALuc22の場合、著しい酵素活性の低下がみられたが、ALuc24, ALuc25, ALuc30などは安定的な酵素活性を25日まで維持できた。特にALuc30の場合、初日の6割程度の酵素活性を長く維持できることが分かった。
本発明で樹立された人工生物発光酵素の生細胞イメージング能を検討するために以下の実験を行った(図20)。
人工生物発光酵素(ALuc)に機能性(抗原認識能、アフィニティカラム精製能)を付与することは、発光酵素の汎用性に欠かせない要素である。この目的を達成するために、本発明で樹立された人工生物発光酵素の配列の一部に、従来の所謂「タグ」を含有した一連の人工生物発光酵素を樹立した。この発光酵素類の特徴は、その配列の中のある最適位置に抗原認識部位(アフィニティカラム精製用にも使える)を有する点である。
前記実施例(1−21)で樹立した新規機能性人工生物発光酵素(抗体認識部位(epitope配列)などを有する)の発光特性を調べた。
Claims (24)
- 下記の(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド;
(i)配列番号38に示されたアミノ酸配列、又は、
(ii)配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。 - 下記の(iii)〜(v)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド;
(iii)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列、
(iv)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
(v)配列番号11〜17または24〜36のいずれかに示されたアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列。 - 下記の(vi)又は(vii)に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド;
(vi)配列番号22に示されたアミノ酸配列、又は、
(vii)配列番号22に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、1個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。 - 配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち1-71位の領域が、配列番号39に示すアミノ酸配列である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち1-157位の領域が、配列番号40に示すアミノ酸配列である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号38に示されたアミノ酸配列のうち20-31位の領域が抗体認識部位である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項7に記載の核酸が発現可能に挿入された発現ベクター。
- 請求項7に記載の核酸が発現可能に導入された形質転換細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドからなることを特徴とするレポーター蛋白質であって、レポーター分析法に用いるためのレポーター蛋白質。
- 請求項10に記載のレポーター蛋白質と共に、標的蛋白質又は標的蛋白質を認識するペプチドを含む融合蛋白質を含む発光性融合蛋白質。
- レポーター蛋白質のC末端側には膜局在シグナル(MLS)が結合されており、標的ポリペプチドが両者の間に貨物として挿入されていることを特徴とする、請求項11に記載の発光性融合蛋白質。
- 前記挿入された標的ポリペプチドが、蛍光蛋白質又はルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項12に記載の発光性融合蛋白質。
- 前記挿入された標的ポリペプチドが、細胞膜の形態を変化させるポリペプチド又は当該ポリペプチドが認識するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項12に記載の発光性融合蛋白質。
- 請求項11〜14のいずれか1項に記載の発光性融合蛋白質をコードするレポーター遺伝子を含む発現ベクター。
- 請求項15記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
- 請求項16に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、外部刺激に応じた細胞内での標的遺伝子の発現の位置、発現時期又は発現量を解析するためのレポーター分析法。
- 前記分析法が、レポータージーンアッセイ法又はツーハイブリットアッセイ法である、請求項17に記載の分析法。
- リガンド結合性の蛋白質のリガンド活性を測定するための生物発光プローブであって、N末端側及びC末端側に2分割された請求項10に記載のレポーター蛋白質と共に、リガンド結合性の標的蛋白質及び標的蛋白質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するポリペプチドを含む融合蛋白質からなる生物発光プローブ。
- リガンド結合性の蛋白質のリガンド活性を測定するための発現ベクターであって、請求項19に記載の生物発光プローブをコードする核酸が、当該核酸を細胞内で発現可能とする制御配列の制御下にあることを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項20に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
- 前記形質転換細胞が、幹細胞である請求項16に記載の形質転換細胞。
- 請求項20に記載の発現ベクターを用いることを特徴とする、被検細胞内におけるリガンド結合性の蛋白質のリガンド活性の検出方法。
- 請求項20に記載の発現ベクターを用いて被検細胞内におけるリガンド結合性の蛋白質のリガンド活性を観察することを特徴とする、生物発光イメージング法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013193508A JP6132350B2 (ja) | 2012-10-26 | 2013-09-18 | 人工生物発光酵素 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012237043 | 2012-10-26 | ||
JP2012237043 | 2012-10-26 | ||
JP2013193508A JP6132350B2 (ja) | 2012-10-26 | 2013-09-18 | 人工生物発光酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014100137A JP2014100137A (ja) | 2014-06-05 |
JP6132350B2 true JP6132350B2 (ja) | 2017-05-24 |
Family
ID=51023289
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013193508A Active JP6132350B2 (ja) | 2012-10-26 | 2013-09-18 | 人工生物発光酵素 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6132350B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6785008B2 (ja) | 2015-09-30 | 2020-11-18 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 新規人工生物発光酵素群 |
US11827908B2 (en) | 2021-02-12 | 2023-11-28 | Shimadzu Corporation | Polypeptide having luciferase activity |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10058091A1 (de) * | 2000-11-23 | 2002-06-06 | Bayer Ag | Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung |
US7871803B2 (en) * | 2004-12-09 | 2011-01-18 | Nec Soft, Ltd. | Gene encoding novel luciferase |
JP5110573B2 (ja) * | 2007-08-02 | 2012-12-26 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 多色生物発光可視化プローブセット、又は一分子型多色生物発光可視化プローブ |
EP2420573A1 (en) * | 2009-04-17 | 2012-02-22 | National Institute of Advanced Industrial Science And Technology | Stable artificial bioluminescent enzyme having super-high brightness |
WO2011005978A2 (en) * | 2009-07-08 | 2011-01-13 | Duke University | Methods of manipulating cell signaling |
WO2011102178A1 (ja) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 改良されたレポーター遺伝子を用いる分析システム |
JP6147669B2 (ja) * | 2010-12-03 | 2017-06-14 | ジーン・ストリーム・ピーティワイ・リミテッド | 改良光放射分子 |
-
2013
- 2013-09-18 JP JP2013193508A patent/JP6132350B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014100137A (ja) | 2014-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2014065047A1 (ja) | 人工生物発光酵素 | |
Ozawa et al. | Advances in fluorescence and bioluminescence imaging | |
Chudakov et al. | Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging | |
Andresen et al. | Short tetracysteine tags to β-tubulin demonstrate the significance of small labels for live cell imaging | |
Wehr et al. | Split protein biosensor assays in molecular pharmacological studies | |
WO2010119721A1 (ja) | 超高輝度で安定な人工生物発光酵素 | |
Sun et al. | In vivo analysis of protein–protein interactions with bioluminescence resonance energy transfer (BRET): progress and prospects | |
US20030203404A1 (en) | Bioluminescence resonance energy transfer( bret) system with broad spectral resolution between donor and acceptor emission wavelengths and its use | |
WO2001046694A2 (en) | A bioluminescence resonance energy transfer (bret) fusion molecule and method of use | |
EP1088233A2 (en) | A bioluminescence resonance energy transfer (bret) system and its use | |
US20130344591A1 (en) | Modified Fluorescent Proteins and Methods for Using Same | |
EP1571448A1 (en) | Fluorescent indicator using fret | |
EP1565559B1 (en) | Fluorescent proteins and chromoproteins from non-aequorea hydrozoa species and methods for using same | |
JP6132350B2 (ja) | 人工生物発光酵素 | |
JP5110573B2 (ja) | 多色生物発光可視化プローブセット、又は一分子型多色生物発光可視化プローブ | |
Awais et al. | Illuminating intracellular signaling and molecules for single cell analysis | |
JP6153140B2 (ja) | 人工生物発光酵素に用いるための発光基質 | |
WO2011102178A1 (ja) | 改良されたレポーター遺伝子を用いる分析システム | |
Kumar et al. | Green fluorescent protein and their applications in advance research | |
EP2685260A1 (en) | Direct and quantitative detection of targets in living cells | |
De et al. | Engineering aspects of bioluminescence resonance energy transfer systems | |
KR20200005645A (ko) | 유전자 코딩 칼륨 이온 표지자 | |
JP6785008B2 (ja) | 新規人工生物発光酵素群 | |
WO2013163681A1 (en) | Fluorescent proteins and uses thereof | |
WO2013087921A1 (en) | Engineered fluorescent proteins for enhanced fret and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170124 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170404 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170413 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6132350 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |