KR20200005645A - 유전자 코딩 칼륨 이온 표지자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 신호전달 도메인, 및 K⁺에 결합할 수 있는 칼륨 센서를 포함하며, 칼륨 센서에의 K⁺의 결합시 제1 신호전달 도메인이 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 다양한 K⁺ 검출 적용분야에서의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

유전자 코딩 칼륨 이온 표지자

칼륨 이온 (K⁺)은 모든 세포 유형의 적정한 기능에 필수적이다. 원형질 막 및 세포 소기관 막을 가로지르는 전기화학적 K⁺ 구배는 K⁺ 유동을 추진하여 다양한 세포 기능들을 조절한다. 세포외 및 세포내 K⁺ 농도의 변동이 근육 수축, 신경전달물질 및 호르몬 방출, 뉴런 흥분성, 세포 부피, 세포 증식 및 세포 사멸을 조절한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, K⁺ 항상성의 불균형이 세포 및 생물체 수준 모두에서 깊은 영향을 주며 신경학적-, 심-혈관-, 신장-, 면역학적-, 근육- 및 대사 장애는 물론 암을 포함한 병리학적 이상을 가지는 숙주와 연관된다는 것은 놀랍지 않다. 생체막을 가로지르는 K⁺ 유동 및 수송은 다양한 질환의 치료를 위한 수많은 선택적 K⁺-채널, 교환체 및 펌프에 의해 달성되는데, 이들은 유망한 치료용 약물 표적으로 부상해 있다. 그러나, 세포외 및 세포내 K⁺ 변동에 대한 현재의 이해는 고도의 공간적 및 시간적 해상도로 K⁺ 동역학을 조사하는 데에 적용가능한 프로브의 부족으로 인하여 매우 제한되어 있다.

놀랍게도, 세포 내에서의 K⁺ 농도가 막 전위에 대한 그의 영향과 관계없이 핵심적인 신호전달 기작들도 조절한다는 떠오르는 증거가 존재한다.

최근의 연구에서, 증가된 세포내 K⁺ 농도는 T-세포에서 포스파타제의 PP2A의 활성을 증대시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Eil et al., Nature 537, 539-543 (22 September 2016)]). 그 결과, Akt-mTOR 복합체가 과소-인산화되며, T-세포 이펙터 기능이 억제된다. 이와 같은 연구는 얼마나 긴밀하게 기본적인 세포 기능이 막 전위에 대한 그의 기여에 관계없이 K⁺ 이온에 의해 조절되는지는 밝히지 않고 있다. 또한, 세포 소기관들 사이에서의 K⁺의 분포, 및 특정 생리학적 및 병리학적 상태하에서 내부 소기관 K⁺ 농도가 얼마나 역동적이고 강하게 영향을 받을 수 있는지는 아직까지 포괄적으로 조사되어 있지 않다. 주로 실-시간으로 개별 세포 및 세포 소기관 수준에서 K⁺ 유동을 정량하는 것을 가능케 하는 적합한 방법 및 도구의 부족으로 인하여, 이와 관련한 현재의 지식은 매우 저조하다. 현재, K⁺ 감지 전극이 종종 세포외 K⁺ 변동을 측정하는 데에 사용되고 있는데, 통상적으로 적어도 1 ml인 상대적으로 큰 샘플 부피를 필요로 한다. 이러한 전극은 K⁺에 대하여 고도로 선택적이지만, K⁺ 변동 및 세포내 K⁺ 신호의 시공간적 동역학을 검출하는 데에는 그것이 거의 사용될 수 없다. 세포외 K⁺ 변동 또는 세포 내에서의 K⁺의 변화 중 어느 하나를 영상화할 것을 목표로 하여 몇 가지 소형 화학 형광 K⁺ 센서들이 개발되어 있다. 그러나, 이러한 형광 이온 표지자들은 많은 한계를 가지고 있는데, 그들이 종종 K⁺에 대하여 덜 특이적이며, 낮은 동역학적 범위를 나타내고, 비-생리 범위에서 K⁺ 감지성이며, 세포 및 세포 소기관에 적재하기가 어렵고, 일부 경우에는 입수하기가 어렵기 때문이다.

형광 K⁺ 프로브의 이러한 많은 심각한 한계들로 인하여, 형광 현미경법 및/또는 형광측정기를 사용한 의미있는 정량적 K⁺ 영상화는 사실상 불가능하다.

아쉬라프(Ashraf) 등은 칼륨 결합 단백질 (Kbp)이 생체 내에서 높은 K⁺ 농도에서의 이. 콜리(E. coli)의 정상적인 성장에 필요한 세포질 칼륨 센서로 작용할 수 있다고 개시하고 있다 (문헌 [Structure 2016, May 3; 24(5) 741-9]).

WO 01/04623 A1호는 형광-표지된 고리형의 펩톨리드(peptolide) (뎁시펩티드(depsipeptide)), 및 샘플 중 칼륨 이온의 농도를 광학적으로 측정하기 위한 그의 용도에 대해 개시하고 있다.

US 2013/244891 A1호는 링커에 의해 피분석물과 상호작용하는 환경-감지 공여자에 연결된 활성화가능한 수용자 형광원을 포함하는 바이오센서에 대해 개시하고 있다.

WO 2012/112440 A2호는 칼륨 이온 센서로 기능할 수 있는 형광성 공-중합체에 대해 개시하고 있다.

US 2003/119195 A1호는 칼륨 센서로서의 형광성 안트라젠-기재 형광이온운반체(fluoroionophore)에 대해 개시하고 있다.

이와 같은 선행 기술로 볼 때, 추가적인 K⁺ 센서를 제공할 필요성이 여전히 존재한다. 그와 같은 센서의 개발은 간단하지가 않은데, 예를 들면 근접-기반 프로브(proximity-based probe)의 구성이 간단하지 않기 때문이다. 현재까지, 리간드 결합으로 인한 유전자 코딩 센서에서의 입체적인 효과가 예를 들면 형광 켄칭(quenching) 또는 포스터 에너지 공명 전달(Forster Energy Resonance Transfer) (FRET)에 의해 검출가능할 수 있는 입체형태 변화를 유도할 수 있는지 여부는 신뢰성 있게 예측할 수 없다. 이에 따라, 유전자 코딩 센서의 적합성은 개별 결합 도메인, 리간드 결합시의 그의 입체형태 변화의 정도 및 안정성, 및 결합 모듈과 검출 도메인 사이의 임의적인 링커 서열에 따라 사례별 기준으로 달라진다.

따라서, K⁺의 검출에 적합한 신규 작용제를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

또한, 샘플에서 K⁺를 검출하기 위한 신규한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.

본 발명의 상기 목적들은

a) 제1 신호전달 도메인, 및

b) b1) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제1 도메인; 및 b2) 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제2 도메인을 포함하는 칼륨 센서

를 포함하며, 여기서 상기 칼륨 센서는 양으로 하전된 칼륨 이온에 결합할 수 있고, 상기 제1 신호전달 도메인은 칼륨 센서에의 양으로 하전된 칼륨 이온의 결합시 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 것인 폴리펩티드에 의해 해결된다.

한 측면에서, 본 발명은 K⁺의 검출에 적합한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 진핵 또는 원핵 유전자 발현에 적합한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은

a) 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 단계;

b) 본 발명의 상기 폴리펩티드를 샘플과 접촉시키는 단계;

c) 제1 신호전달 도메인에 의해 생성되는 신호를 측정하는 단계; 및/또는

d) 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인에 의해 함께 생성되는 신호를 측정하는 단계

를 포함하며, 여기서 샘플과의 접촉 후의 신호 강도의 변화는 샘플 중 칼륨 이온의 존재를 나타내는 것인, 샘플 중 양으로 하전된 칼륨 이온의 검출 방법에 관한 것이다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드의, 샘플 중 양으로 하전된 칼륨 이온을 검출하기 위한 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 양으로 하전된 칼륨 이온을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.

도 1은 검출가능한 FRET 신호를 증가시키는 BON 도메인에의 K⁺ 결합시의 폴리펩티드 입체형태 변화의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 FRET-기반 폴리펩티드를 나타내는 것으로써, 특히 (a) GEPII 1.0 및 R-GEPII 1.0으로 지칭되는 2종 폴리펩티드의 개략도, (b) R-GEPII 1.0의 예측 3-D 구조, (c) GEPII 1.0 (좌측 2개 패널) 또는 R-GEPII 1.0 (우측 2개 패널) 중 어느 하나를 발현하는 HeLa 세포를 나타낸다. 척도 막대는 10 ㎛를 나타낸다. (d) 서로 다른 K⁺ 농도의 첨가 및 제거시의 시간 경과에 따른 GEPII 1.0의 ECFP, FRET 신호 (좌측 패널) 및 FRET 비 신호 (중앙 패널). 우측 패널은 투과화된 (3 μM 디지토닌 + 2 μM 발리노마이신) HeLa 세포에서의 GEPII 1.0의 농도 반응 곡선을 나타낸다; EC50=2.04 (1.716 내지 2.413) mM; N=10. (e) 발리노마이신 (10 μM) 처리된 HeLa 세포에서의 시간 경과에 따른 R-GEPII 1.0의 대표적인 FRET 비- (좌측 패널), 클로버- (중앙 패널) 및 FRET 신호 (우측 패널).
도 3은 K⁺-결합 BON 도메인의 예측 3-D 구조 (a, b)를 도시하는 것으로써, 산성 아미노산들이 강조되어 있다. (c)에서, 도 3은 2개의 가장 가까운 산성 아미노산들 사이의 거리를 보여준다. (d)에서, 도 3은 K⁺ 이온을 포함하는 예측 세공 직경을 보여주며, 이어서 (e) 수화가 있고 없는 K⁺ 이온 반경을 보여준다.
도 4는 서로 다른 표적화 서열들이 없고 있는 HeLa 세포에서 발현되는 GEPII 1.0 변이들의 공초점 영상을 나타내는 바, 패널 a의 축적 막대는 10 ㎛를 나타내고: (a)는 어떠한 표적화 서열도 없는 GEPII 1.0을 나타내며, (b) 핵 외수송 서열 NES가 있는 GEPII 1.0, (c) 핵 안내 서열 NLS가 있는 GEPII 1.0, (d) 미토콘드리아 표적화 서열 (COX8의 일렬 이량체 반복)이 있는 GEPII 1.0, (e) ER 표적화 서열 (N-말단상 칼레티큘린(calreticulin)부터) 더하기 C-말단상의 KDEL 체류 서열이 있는 GEPII, (f) GPI-고정된 GEPII 1.0, (g) 에메린의 C-말단에 그것을 융합시키는 것에 의해 핵주변 표적화된 GEPII 1.0, 및 (h) 형질막하 영역의 K⁺를 모니터링하기 위한 CAAX-GEPII 1.0이다. 영상은 폴리펩티드가 세포의 표적화된 소기관 또는 하위-도메인에 위치한다는 것을 보여준다.
도 5는 각각 3 mM K⁺, Na⁺, Ca^{2 +}, Rb⁺ 또는 Cs⁺에 반응하는 정제된 GEPII 1.0의 최대 델타 FRET-비 신호를 나타낸다. K⁺에 대하여 최고 비를 수득하였다. Na⁺ 및 Ca^{2 +}는 최저 비를 나타내었다. 실험은 클라리오스타(CLARIOstar) 형광 마이크로 플레이트 판독기 (BMG 랩테크(Labtech) 사, 독일 소재)를 사용하여 수행하였다. 0.05 % 트리톤(triton) X 100을 함유하는 HEPES 완충 용액 (pH: 7.3) 중 정제된 GEPII 200 nM을 3 mM KCl, NaCl, CaCl₂, RbCl 또는 CsCl 중 어느 하나의 부재 또는 존재하에서 분석하였다. 80 μl의 GEPII 함유 용액을 다중-웰 플레이트 (형광 분석용 96 웰, 그레이너 바이오-원(Greiner Bio-One) 사, 오스트리아 크렘스뮌스터 소재)로 전달하고, 430 nm ± 10 nm에서 조명하였다. 각각 475 nm ± 10 nm 및 525 nm ± 10 nm에서 방출을 수집하였다. FRET 비 값 (F₅₂₅/F₄₇₅)을 계산하고, 일가 및 이가 이온 부재하에서의 GEPII의 각 FRET 비 값과 상관시켰다.
도 6은 본 발명 폴리펩티드의 가능한 적용을 도시한다. 소형 생물학적 샘플 (예를 들면 인간 또는 마우스 샘플) 중 칼륨 농도는 무-K⁺ 완충제와 희석된 다음, 본 발명의 폴리펩티드가 첨가되고, 예를 들면 다중-웰 플레이트에서 FRET에 의해 칼륨 이온의 농도가 검출될 수 있다 (a). 정제된 GEPII를 사용하여, 동물을 희생시키지 않으면서 실험실 마우스의 안면 정맥(vena facealis) 또는 안와(orbita) 중 어느 하나로부터 채취된 (b) 소형 혈액 샘플 (~30 μl) 중 K⁺ 혈청 농도를 측정하였다. K⁺ 혈청 농도는 패널 (c)에 나타낸 선형 보정 피팅을 사용하여 각 GEPII FRET 비 값으로부터 측정하였다. 도시되어 있는 바와 같이, HEPES 완충 용액 중 6개의 정해진 K⁺ 농도를 사용하여 보정 곡선을 수득하였다. 마우스 혈청을 HEPES 완충제와 1:12.5로 희석하고, 96 웰에서 GEPII 용액과 혼합함으로써, 1:25의 최종 희석물을 산출하였다. 클라리오스타 형광 마이크로 플레이트 판독기 (BMG 랩테크 사, 독일 소재)를 사용하여 이러한 샘플의 FRET 비 신호를 측정하였다. (d) 그의 안면 정맥 (적색 원) 또는 안와 (청색 정사각형) 중 어느 하나로부터 혈액이 수집된 4 마리 서로 다른 마우스의 정제된 GEPII 1.0을 사용하여 측정된 mM로 나타낸 K⁺ 혈청 값. 혈액 수집 양식이 K⁺ 값에 영향을 주지는 않았다. (e) 패널 D에 나타낸 결과는 혈액 수집 양식에 따라 플로팅된다. (f) 혈액 수집 직후 (0시간), 2- 및 4시간 후의 5 마리의 서로 다른 마우스 혈청에서의 정제된 GEPII 1.0을 사용하여 측정된 K⁺ 값. 이와 같은 데이터는 GEPII 1.0이 마우스 혈청에서 수시간 동안 기능성으로 유지된다는 것을 보여준다. (g) 패널 F에 나타낸 결과는 혈액 수집 후 FRET 측정의 시간에 따라 플로팅된다.
도 7 패널 (a)는 세포 생존율의 효과적인 척도로서 (다중-웰) 세포 배양 플레이트에서 시간 경과에 따른 세포외 K⁺ 농도를 동역학적으로 기록하는 데에 있어서의 정제된 GEPII의 사용을 개략적으로 도시한다. 글루코스와 같은 기질과 함께 공급된 세포는 세포외 ~5 mM K⁺ 및 세포내 ~130 mM K⁺의 생리학적 K⁺ 구배에서 생존 및 유지된다. 이러한 조건하에서는, 매우 적은 세포만이 사멸되어 K⁺를 방출한다. 반면, 2-데옥시글루코스 (2-DG)와 같은 독성 항대사물질로 처리된 세포는 사멸되어 K⁺를 방출하는데, 그것은 결과적으로 상청액 중에서 증가한다. (b) 정제된 GEPII 1.0 (c = 500 nM)을 사용하여 96 웰에서 측정된 세포외 배지의 시간 경과에 따른 K⁺ 농도. 클론성 췌장 베타 세포 (INS-1)를 10 mM 글루코스 (청색 곡선, 대조) 또는 10 mM 2-DG (적색 곡선)의 존재하에서 유지하였다. 표시되어 있는 바와 같이, 대조 세포는 14시간 시점에 50 μM의 디지토닌을 사용하여 처리하였는데, 세포 K⁺를 최대로 방출하였다. GEPII FRET 비 신호는 상기한 바와 같이 클라리오스타 형광 마이크로 플레이트 판독기 (BMG 랩테크 사, 독일 소재)를 사용하여 측정하였다.

하기에서 본 발명을 상세하게 기술하기 전에, 본 발명이 본원에서 기술되는 구체적인 방법론, 프로토콜 및 반응물들로 제한되지는 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 이들이 가변적일 수 있기 때문이다. 본원에서 사용되는 용어들은 구체적인 실시양태를 기술할 목적만을 위한 것으로써 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되게 되는 본 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니라는 것 역시 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서의 본문 전체에 걸쳐 몇 가지 문헌들이 인용되지만, 그들은 그 전체가 참조로써 개재되는 것으로써, 그 중 어느 것도 본 발명이 선행 발명으로 인하여 해당 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것에 대한 승인으로 해석되어서는 아니 된다.

YgaU로도 알려져 있는 K⁺ 결합 단백질 (Kbp)은 에셰리키아 콜리(Escherichia coli) 유래의 가용성인 16-kDa 세포질 단백질이다. 그것은 고도로 특이적인 K⁺ 결합 단백질로서, 높은 외부 K⁺ 농도의 존재하에서의 정상적인 성장에 필요하다. 칼륨 이온은 전적으로 BON 도메인 (서열식별번호: 1)에 결합하며, 결합시 그것은 입체형태 변화를 겪는다. Kbp는 추가로 BON 도메인과 상호작용할 수 있는 LysM 도메인 (서열식별번호: 2)을 포함한다.

BON 도메인, LysM 도메인은 물론 전체 길이 Kbp의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

a) 제1 신호전달 도메인, 및

b) b1) 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제1 도메인; 및 b2) 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제2 도메인을 포함하는 칼륨 센서

를 포함하며, 여기서 상기 칼륨 센서는 양으로 하전된 칼륨 이온에 결합할 수 있고, 상기 제1 신호전달 도메인은 칼륨 센서에의 양으로 하전된 칼륨 이온의 결합시 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 융합 단백질에 의해 K⁺가 검출될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

칼륨 센서에의 K⁺의 결합은 상기 칼륨 센서에서 입체형태 변화를 촉발할 수 있으며, 그것은 이후 신호전달 도메인을 통하여 검출될 수 있다. 이와 같은 원리는 도 1에 본 발명의 폴리펩티드 중 하나에 대하여 도시되어 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본원에서 유전자 코딩 칼륨 이온 표지자 (GEPII)로도 지칭된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 제1 신호전달 도메인은 형광 단백질 도메인이다. 제1 신호전달 도메인은 시안 형광 단백질, 바람직하게는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 6에 따른 서열과 적어도 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 100 %의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 시안 형광 단백질인 것이 더욱 더 바람직하다.

바람직한 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인은 형광 단백질 도메인이다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 제1 신호전달에 의해 생성되는 검출가능한 신호는 형광 단백질 도메인의 형광 신호 켄칭일 수도 있다. 바람직한 한 실시양태에서, 본 발명 폴리펩티드의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: i) 칼륨 센서의 제1 도메인; ii) 제1 신호전달 도메인; 및 iii) 칼륨 센서의 제2 도메인. 상기 제1 신호전달 도메인은 임의적으로 링커 서열에 선행하고/거나 후속할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명 폴리펩티드의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다: i) 칼륨 센서의 제1 도메인; i) 칼륨 센서의 제2 도메인; ii) 제1 신호전달 도메인; 및 iii) 칼륨 센서의 제1 도메인. 상기 제1 신호전달 도메인은 임의적으로 링커 서열에 선행하고/거나 후속할 수 있다.

칼륨 센서의 제1 도메인은 Kbp의 BON 도메인을 기재로 한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 75 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 90 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 95 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 100 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제1 도메인은 적어도 하나의 아미노산 치환이 있는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열은 약 1 내지 약 11개의 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 D41N, D43N, D51N, D59N, E64Q, D83N, D84N, Q26R, N35Q, N75Q 또는 G52D로 이루어진 군에서 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 하기의 치환들을 가지는 서열식별번호: 01의 칼륨 센서 제1 도메인에 대한 아미노산 서열을 포함한다: Q26R, N35Q, N75Q, G52D (서열식별번호: 5).

칼륨 센서의 제2 도메인은 Kbp의 LysM 도메인을 기재로 한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 75 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 90 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 95 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 100 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 적어도 하나의 아미노산 치환이 있는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서의 제2 도메인은 약 1 내지 약 11개의 치환을 포함하는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 D104N, E125Q, D135N, N116Q, N118Q, N121Q 및 N127Q로 이루어진 군에서 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 하기의 치환들을 가지는 서열식별번호: 2의 칼륨 센서 제2 도메인 아미노산 서열을 포함한다: D104N, E125Q, D135N (서열식별번호: 4). 서열 중 아미노산의 번호지정은 Kbp의 야생형 서열 (서열식별번호: 3)을 기준으로 한다.

표 2에 Kbp, 및 BON 및 Lys 도메인 변이들의 각 아미노산 서열을 요약하였다.

본 발명은 또한 a) 제1 신호전달 도메인, 및 b) b1) 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제1 도메인; 및 b2) 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제2 도메인을 포함하는 칼륨 센서; 및 c) 제2 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 상기 칼륨 센서는 양으로 하전된 칼륨 이온에 결합할 수 있고, 상기 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인은 칼륨 센서에의 양으로 하전된 칼륨 이온의 결합시 함께 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 검출가능한 신호는 칼륨 센서에의 K⁺의 결합시 생성될 수 있다. K⁺의 상기 결합은 예를 들면 칼륨 센서의 입체형태 전환을 유도하고, 이어서 제1 신호전달 도메인과 제2 신호전달 도메인을 서로 더 근접하거나 더 멀어지도록 함으로써 적어도 검출가능한 신호를 생성시키는 데에 기여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인은 FRET-공여자-수용자 쌍, 분할(split)-효소 쌍 또는 분할-형광 단백질 쌍으로 이루어진 군에서 함께 선택되며, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인이 쌍의 각 부분 (예를 들면 분할-효소의 2개 절반부 또는 분할-형광 단백질의 2개 절반부)이 된다. 바람직하게는, 칼륨 센서에의 K⁺의 결합은 폴리펩티드의 입체형태 전환을 유도할 수 있으며, 이어서 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인이 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는데, 예를 들면 FRET-공여자-수용자 쌍이 검출가능한 FRET 신호를 생성시킬 수 있거나, 분할-효소의 2개 절반부가 기능성이어서 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 반응을 촉매촉진할 수 있거나, 또는 분할-형광 단백질의 2개 절반부가 적절한 범위 이내의 파장을 가지는 광에 의해 여기될 경우 검출가능한 신호로서 특정 파장을 가지는 광을 방출할 수 있게 된다.

바람직한 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인은 FRET-공여자-수용자 쌍이다. 바람직하게는, 상기 공여자는 시안 형광 단백질 (CFP) 도메인일 수 있으며, 상기 수용자는 황색 형광 단백질 (YFP) 도메인일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 신호전달 도메인은 공여자일 수 있으며, 제2 신호전달 도메인은 수용자일 수 있다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인은 공여자 CFP 도메인이며, 제2 신호전달 도메인은 수용자 YFP 도메인이다. CFP 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 6에 따른 서열과 적어도 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 100 %의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기 파장 및 형광 방출 파장이 서열식별번호: 6에 따른 CFP 도메인에서와 동일하거나 실질적으로 동일한 것, 즉 약 436 nm 파장에서의 여기 피크 및 약 477 nm 파장에서의 방출 피크를 가지는 것 역시 바람직하다. 바람직하게는, YFP 도메인은 더욱 더 바람직하게는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 7에 따른 서열과 적어도 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 100 %의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기 파장 및 형광 방출 파장이 서열식별번호: 7에 따른 YFP 도메인에서와 동일하거나 실질적으로 동일한, 즉 약 514 nm 파장에서의 여기 피크 및 약 527 nm에서의 방출 피크인 원형 순열화 비너스(circularly permuted venus) (CPV) 단백질일 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 공여자는 클로버(Clover) 도메인일 수 있으며, 수용자는 mRuby2 도메인일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 신호전달 도메인은 공여자일 수 있으며, 제2 신호전달 도메인은 수용자일 수 있다. 클로버 도메인이 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 8에 따른 서열과 적어도 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 100 %의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기 파장 및 형광 방출 파장이 서열식별번호: 8에 따른 클로버 도메인에서와 동일하거나 실질적으로 동일한 것, 즉 약 505 nm 파장에서의 여기 피크 및 약 515 nm 파장에서의 방출 피크를 가지는 것 역시 바람직하다. 바람직하게는, mRuby2 도메인은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 9에 따른 서열과 적어도 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 100 %의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기 파장 및 형광 방출 파장이 서열식별번호: 9에 따른 mRuby2 도메인에서와 동일하거나 실질적으로 동일한 바, 즉 약 559 nm 파장에서의 여기 피크 및 약 600 nm에서의 방출 피크이다.

표 3은 서열식별번호: 6 내지 9의 아미노산 서열을 나타낸다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 GEPII 1.0 (서열식별번호: 13) 또는 R-GEPII 1.0 (서열식별번호: 21)의 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인은 번역후 변형, 예컨대 접합된 플루오레세인(fluorescein) 분자 또는 기타 소형 분자 형광단 또는 검출가능 잔기를 포함하는데, 이들은 칼륨 센서에의 K⁺의 결합시 제2 신호전달과 함께 제1 신호전달 도메인의 검출가능한 신호를 생성시키는 데에 기여할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 Kbp의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 75 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 90 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 95 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 칼륨 센서는 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 100 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명 폴리펩티드의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 하기를 포함한다:

i) 제1 신호전달 도메인;

ii) 바람직하게는 칼륨 센서의 제1 도메인에 이어 칼륨 센서의 제2 도메인이 후속하는 칼륨 센서; 및

iii) 제2 신호전달 도메인.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 추가로 적어도 하나의 링커 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 유연성인, 즉 경질이 아닌 구조를 가지는 상기 링커는 검출가능한 신호의 민감도를 변형시킬 수 있다. 링커 아미노산 서열은 제1 신호전달 기, 칼륨 센서의 제1 도메인, 칼륨 센서의 제2 도메인 및 제2 신호전달 도메인 중 임의의 2개 사이의 폴리펩티드 아미노산 서열에 위치할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 링커 아미노산 서열에는 칼륨 센서 제1 도메인의 아미노산 서열이 선행하며, 칼륨 센서 제2 도메인이 후속한다. 그러나 물론, 칼륨 센서와 제1 신호전달 도메인의 사이, 또는 칼륨 센서와 제2 신호전달 도메인의 사이에 링커 도메인이 위치하는 것 역시 당연히 가능하다.

한 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 -GGGG-를 함유한다.

바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 추가로 적어도 하나의 하기 화학식 (I)의 링커 아미노산 서열을 포함한다:

(식 중

x는 정수 0 또는 1이며,

y는 정수 1 내지 6이고,

z는 정수 0 또는 1임).

바람직한 실시양태에서, y는 4가 아니다.

바람직한 한 실시양태에서, y는 2, 3 또는 5이다.

바람직한 한 실시양태에서, x는 0이며, y는 1이고, z는 1이다. 이와 같은 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, x는 0이며, y는 2 또는 3이고, z는 0이다. 이와 같은 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, x는 0이며, y는 4이고, z는 1이다. 이와 같은 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, x는 1이며, y는 5이고, z는 0이다. 이와 같은 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

생물학적 시스템에서의 세포외 K⁺ 농도는 통상적으로 약 1 mM 내지 약 10 mM의 범위인 것으로 알려져 있다. 반면, 세포내 세포액 및 소기관 K⁺ 농도는 통상적으로 약 100 mM 내지 300 mM의 범위이다. 실시예에서 드러나게 될 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드들은 서로 다른 K⁺에 대한 민감도를 제공할 수 있는 바, 이는 상기한 바와 같은 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2 중 링커 서열 또는 아미노산 치환의 존재에 따라 달라질 수 있다. 통상의 기술자라면 이에 따라 각 적용분야에 적합한 민감도를 가지는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 사용하게 된다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 통상의 기술자라면, 세포외 K⁺ 농도를 측정하는 데에는 상대적으로 낮은, 즉 20 mM 이하, 바람직하게는 10 mM 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 mM인 EC₅₀ 값을 가지는 폴리펩티드를, 그리고 세포내 K⁺ 농도를 측정하는 데에는 더 높은, 즉 약 10 내지 약 300 mM, 바람직하게는 약 50 내지 약 150 mM인 EC₅₀ 값을 가지는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 여기에서 언급되는 EC₅₀ 값은 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 방법에 의해 수득되는 EC₅₀ 값이다.

이에 따라, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 약 10 내지 약 300 mM의 EC₅₀ 값을 제공한다. 이와 같은 폴리펩티드는 세포내 K⁺의 검출에 특히 적합할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 세포외 K⁺를 측정하는 데에 있어서 약 20 mM 이하, 바람직하게는 약 5 mM의 EC₅₀ 값을 제공한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 추가로 표적화 서열을 포함한다. 표적화 서열은 표적으로 하는 세포의 소기관 또는 하위-도메인 또는 세포외 분비물로 폴리펩티드를 안내하는 아미노산 서열이다. 표적으로 하는 상기 소기관 및 하위-도메인에는 예를 들면 핵, 미토콘드리아, 내형질 세망 (ER), 세포 표면, 핵막 및 형질막하 영역이 포함될 수 있다. 표적화 서열은 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 폴리펩티드 C-말단에의 핵 외수송 서열, 예를 들면 아미노산 서열 LPPLERLTL의 첨가는 세포액에서의 폴리펩티드의 위치지정만을 초래할 수 있다. C-말단 핵 인도 서열 (KRSWSMAFC)의 첨가는 핵의 표적화를 초래할 수 있다. 미토콘드리아는 COX8의 일렬 이량체 반복과 같은 미토콘드리아 표적화 서열에 의해 표적화될 수 있다. ER 표적화 서열의 예에는 N-말단상 칼레티큘린의 ER 표적화 서열 더하기 본 발명 폴리펩티드 C-말단상의 KDEL 체류 서열이 포함된다. GPI-앵커 서열은 예를 들면 폴리펩티드를 세포 표면으로 안내할 수 있다. 핵주위 표적 서열의 예에는 에메린(emerin)이 포함되는데, 본 발명 폴리펩티드의 서열이 에메린의 C-말단에 융합된다. 형질막하 영역 표적화 서열의 예는 예를 들면 본 발명에 따른 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는 서열 MSKDVKKKKKKSKTKCVIM을 가지는 GTPase Kras 동형 b의 CAAX 도메인이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

관련 기술분야 통상의 기술자라면, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 주어지는 본 발명에 따른 폴리펩티드가 여러 뉴클레오티드 서열로 코딩될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 9000 뉴클레오티드 미만, 8000 뉴클레오티드 미만, 7000 뉴클레오티드 미만, 6000 뉴클레오티드 미만, 5000 뉴클레오티드 미만, 4000 뉴클레오티드 미만, 3000 뉴클레오티드 미만, 2000 뉴클레오티드 미만, 1000 뉴클레오티드 미만 또는 500 뉴클레오티드 미만의 길이를 가진다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 24 내지 9000 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 24 내지 8000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 24 내지 7000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 24 내지 6000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 24 내지 5000 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 24 내지 4000 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 적어도 60 내지 9000 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 60 내지 8000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 60 내지 7000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 60 내지 6000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 60 내지 5000 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60 내지 4000 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 적어도 90 내지 9000 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 90 내지 8000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 90 내지 7000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 90 내지 6000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 90 내지 5000 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90 내지 4000 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 적어도 120 내지 9000 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 120 내지 8000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 120 내지 7000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 120 내지 6000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 120 내지 5000 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 120 내지 4000 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 300 내지 9000 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300 내지 8000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 300 내지 7000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 300 내지 6000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 300 내지 5000 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 300 내지 4000 뉴클레오티드의 길이를 가진다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 적어도 300 뉴클레오티드, 적어도 400 뉴클레오티드, 적어도 1000 뉴클레오티드, 적어도 2000 뉴클레오티드 또는 적어도 2500 뉴클레오티드의 길이를 가진다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 10에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 10에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 더욱 바람직하게는 적어도 91 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 92 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 93 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 94 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 96 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98 % 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 10에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 더욱 바람직하게는 적어도 95 % 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 98 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 더욱 바람직하게는 적어도 91 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 92 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 93 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 94 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 96 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98 % 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 더욱 바람직하게는 적어도 95 % 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 98 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 12에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 12에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 더욱 바람직하게는 적어도 91 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 92 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 93 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 94 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 96 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98 % 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 12에 따른 서열에 대하여 적어도 85 %, 바람직하게는 적어도 90 %, 더욱 바람직하게는 적어도 95 % 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 98 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.

서열식별번호: 10 내지 12의 서열들을 하기 표 4에 나타내었다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 단일 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA 분자일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터와 같은 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 예를 들면 단리된 플라스미드, 미니염색체, 코스미드, 세균 파지, 레트로바이러스 벡터, 또는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 임의의 다른 벡터와 같은 원핵 또는 진핵 발현 벡터일 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 구체적인 필요성에 따라 적절한 벡터를 선택하는 방법과 친숙할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 단리된 플라스미드이다.

이에 따라, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및/또는 플라스미드를 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 인간 배아 줄기 세포는 아니다. 세포의 예에는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포, 인간 세포 또는 식물 세포, 또는 그 각각이 임의적으로 해당 세포의 형질감염 또는 형질전환과 같이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 보편적으로 알려져 있는 방법에 의해 유전적으로 변형되어 있을 수 있는 원핵 세포의 시험관내 세포 배양 세포 또는 세포 용해물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 측면에서, 본 발명은

a) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공하는 단계;

b) 본 발명에 따른 상기 폴리펩티드를 접촉시키는 단계;

c) 제1 신호전달 도메인에 의해 생성되는 신호를 측정하는 단계

를 포함하며, 여기서 샘플과의 접촉 후의 신호 강도의 변화는 샘플 중 칼륨 이온의 존재를 나타내는 것인, 샘플 중 양으로 하전된 칼륨 이온의 검출 방법에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은

a) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공하는 단계;

b) 본 발명에 따른 상기 폴리펩티드를 접촉시키는 단계;

c) 제1 신호전달 도메인에 의해 생성되는 신호를 측정하는 단계; 및/또는

d) 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인에 의해 함께 생성되는 신호를 측정하는 단계

를 포함하며, 여기서 샘플과의 접촉 후의 신호 강도의 변화는 샘플 중 칼륨 이온의 존재를 나타내는 것인, 샘플 중 양으로 하전된 칼륨 이온의 검출 방법에 관한 것이다.

폴리펩티드를 제공하는 상기 단계 a)는 인간 신체의 외부에서 이루어진다.

상기 방법의 한 실시양태에서, 샘플 부재하에서의 폴리펩티드의 신호와 비교한 샘플과 접촉 후의 신호 강도의 변화는 샘플 중 K⁺의 존재를 나타낸다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 (정량적인) 생체내 영상화 방법이다.

바람직한 실시양태에서, 측정되는 신호는 형광 신호, 비색 신호 또는 FRET 신호이다. 바람직하게는, 상기 신호는 본 발명에 따른 폴리펩티드 칼륨 센서에의 K⁺의 결합시 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 신호는 FRET-공여자-수용자 쌍, 분할-효소 쌍 또는 분할-형광 단백질 쌍에 의해 생성될 수 있다. 검출은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 보편적으로 알려져 있는 방법에 의해 이루어질 수 있다.

한 실시양태에서, 측정되는 신호는 형광 신호이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 형광 신호는 칼륨 센서 도메인에의 K⁺의 결합에 의해 켄칭된다.

더욱 바람직한 실시양태에서, 측정되는 검출가능한 신호는 FRET 신호이다. 바람직하게는, 상기 FRET 신호는 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인에 의해 생성된다. 더욱 바람직하게는, FRET 신호는 FRET-공여자-수용자 쌍, 바람직하게는 YFP 예컨대 CPV, 및 CFP에 의해 생성된다. FRET 신호를 측정하는 방법에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있다. 바람직하게는, YFP와 CFP 사이의 FRET은 약 420 nm 내지 약 450 nm 범위 파장에서의 광을 사용한 여기 후에 측정된다. 더욱 바람직하게는, 상기 측정은 약 440 nm에서의 광을 사용한 여기 후에 수행된다. 약 525 nm 내지 약 545 nm 범위, 더욱 바람직하게는 약 535 nm 파장에서 광의 방출이 측정되는 것 역시 바람직하다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, FRET 쌍은 YFP와 CFP 대신 클로버와 mRuby2이다. 이와 같은 경우, FRET 신호는 470 nm 내지 약 490 nm를 사용한 여기 및/또는 약 510 nm 내지 520 nm (방출 1) 및 590 nm 내지 약 610 nm (방출 2) 범위에서의 광 방출 후에 측정된다.

바람직한 실시양태에서, K⁺ 검출 방법의 단계 a), 즉 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공하는 것은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및/또는 발현 벡터를 사용하여, 인간 또는 동물 신체 외부에서 적어도 하나의 세포를 형질감염시키는 것 또는 원핵 세포를 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다. 이후, 해당 세포의 단백질 합성에 의해 본 발명에 따른 폴리펩티드가 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 이후 세포로부터 단리되거나, 세포에 의해 분비되거나, 또는 세포 내부에 잔류하는 것 중 어느 하나일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명에 따른 세포를 제공하는 것에 의해 본 발명에 따른 방법의 단계 a)에서 제공될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 어떠한 종류의 샘플에서도 칼륨 이온의 존재를 검출할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 샘플은 생물학적 샘플 또는 액체 샘플 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 샘플은 세포 배양물, 세포 펠렛, 세포 용해물, 인간 또는 동물로부터 조직 샘플, 혈액, 또는 K⁺를 함유하는 액체이다. 한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 세포의 단층 배양물 또는 3-차원 세포 배양물을 포함한 세포 배양물, 세포 현탁액, 세포 펠렛, 세포 용해물, 인간 또는 동물로부터의 조직 샘플, 및 K⁺를 함유하는 액체 샘플을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 이후 K⁺의 존재 및/또는 분포를 검출하는 것에 의해, 그리고 임의적으로 세포 세포자멸사, 세포 신호전달, 세포 유전자 발현 등과 같은 생물학적 샘플의 다른 관련 파라미터들을 측정하는 것과의 조합으로써, 생물학적 샘플에 대한 K⁺의 영향을 특성화하는 데에 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 이에 따라 상기한 바와 같이 샘플 중 K⁺를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도는 본 발명에 따른 폴리펩티드의, (정량적인) 생체내 영상화에서의 용도를 포함한다. "생체내 영상화"라는 용어는 인간 신체 외부에서의 살아있는 세포에서의 영상화, 예컨대 시험관 내에서 배양된 단리된 살아있는 세포의 현미경법을 지칭한다. 세포 내의 본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들면 정해진 자극 또는 스트레스에 반응하는 예컨대 세포액, 형질막하 영역, 핵, 내형질 세망, 핵막 및 미토콘드리아에서의 K⁺ 농도의 변화를 나타낼 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 적합한 용기, 예를 들면 다중-웰 플레이트에서 생물학적 샘플과 접촉될 수 있으며, 예를 들면 플레이트 형광 판독기를 사용하여 바로 칼륨 농도가 측정될 수 있다. 그와 같은 검정이 K⁺ 전극을 적정하게 배싱(bath)하는 데에 통상적으로 대략 100 내지 1000 μl 또는 심지어는 더 많은 부피를 필요로 하던 전극을 사용한 칼륨 농도의 측정에 필요한 생물학적 샘플의 양에 비해 더 적은 양의 샘플 (겨우 약 5-10 μl)을 필요로 하게 된다는 것이 본 발명에 따른 폴리펩티드 사용의 한 가지 장점이다. 이에 따라, 1.5 - 2.5 ml (체중의 6-8 %)의 총 혈액 부피를 가지는 마우스와 같은 소형 실험실 동물의 그와 같은 K⁺ 전극을 사용한 혈청 K⁺ 농도의 측정은 보통 최대 혈액 농도를 위한 동물의 희생을 필요로 하였었다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 시험관내 세포 사멸 검정에 사용될 수 있다. 사실상 모든 세포 유형, 특히 여기가능 세포에서는, Na⁺/K⁺-ATPase를 통하여 원형질 막을 가로지르는 Na⁺ 및 K⁺ 구배를 유지하는 데에 막대한 에너지를 필요로 한다. 스트레스 상태하에서는, 충분한 에너지가 세포에 가용하지 않게 되며, 그에 따라 그것이 감소된 생존율을 가지게 되고, 결국 세포 사멸을 겪게 된다. 본 발명의 이와 같은 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리펩티드는 배양된 세포의 배양 배지에 첨가되어, 시간 경과에 따라 배양 배지 중 K⁺ 농도를 모니터링하는 데에 사용될 수 있다. 세포의 생존율이 감소하거나 세포 사멸의 발생이 증가하는 경우, 배지 중 K⁺ 농도는 증가하게 된다. 이는 이후 적절하게 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 검출될 수 있다. 이와 같은 검정에서의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사용은 그것이 다른 현행 기술 세포 사멸/생존율 검정들 (예를 들면 MTT 검정 또는 레사주린-기반 검정 예컨대 셀타이터-블루(CellTiter-Blue)® 세포 생존율 검정)과 달리 세포에 추가적인 손상/영향을 주지 않는 실-시간 측정을 가능케 한다는 장점을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 세포 성장 검정에 사용된다. 세포가 성장할 때 K⁺의 농도는 감소하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 단리된 폴리펩티드가 배양되는 세포의 배양 배지에 첨가되는 경우, 역시 세포 성장 정도를 모니터링하는 것이 가능하다. 이와 같은 검정은 예를 들면 성장하는 세균 세포 배양물과 주로 성장 및 복제하지 않는 사멸 세포를 함유하는 세균 세포 배양물을 구별하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면 세균 세포 배양물의 광학 밀도 (OD600)를 측정하는 것에 의해 세균 성장을 모니터링하는 현재의 표준 방법에 의해서는 이것이 측정될 수 없다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 실시간으로의 예를 들면 뇌 또는 근육의 생체내 현미경법을 사용한 살아있는 동물에서의 세포외 K⁺ 변동의 가시화를 위한 센서로 사용될 수 있다. 이와 같은 적용시, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들면 국소적으로 동물에게 적용될 수 있다. 이와 같은 맥락에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들면 동물 모델의 연구를 위한 암 또는 신경학적 장애 예컨대 간질, 편두통 또는 두개뇌 외상의 조사에 연구 도구로 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 또한 하기 중 적어도 1종을 포함하는, 샘플 중 K⁺를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다:

a) 본 발명에 따른 폴리펩티드;

b) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 벡터; 및/또는

c) 본 발명에 따른 세포.

이와 같은 키트의 예에는 상기한 바와 같이 세포 사멸 또는 세포 생존율을 측정하기 위한 키트가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 이외에, 상기 키트는 예를 들면 하기 항목들 중 적어도 1종을 포함할 수 있다:

a) 샘플을 희석하기 위한 적합한 무-K⁺ 완충제;

b) 양성 대조로서의 알려져 있는 K⁺ 농도를 가지는 적어도 1종의 표준 용액;

c) 키트가 1종을 초과하는 용액을 함유하는 경우, 표준 용액들은 해당 표준 용액들을 사용하여 보정 곡선을 수득하기 위하여 서로 다른 농도의 K⁺를 함유할 수 있음; 또는

d) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 희석하기 위한 적합한 완충제.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 키트는 추가로 대조 샘플을 생성시키기 위하여 오로지 하나 또는 둘 다의 신호전달 도메인, 또는 칼륨 센서만을 코딩하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 키트는 추가로 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 희석하기 위한 적합한 완충제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 세포를 포함하는 키트는 추가로 세포를 위한 적합한 배양 배지 및/또는 냉동보존 매체를 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 휴대용 K⁺ 즉석 시험 키트에 사용될 수도 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 그와 같은 시험에서 용액, 바람직하게는 무칼륨 용액 중에 존재할 수 있거나, 또는 고체 상 또는 비드상에 그것이 고정될 수 있다.

[정의]

하기의 정의가 도입된다. 본 명세서 및 예정 청구범위에서 사용될 때, 단수 형태는 문맥상 분명하게 달리 지정되지 않는 한 각 복수도 포함한다.

"포함하다(comprise)"라는 용어, 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"과 같은 변이들은 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 목적상, "~로 이루어지는"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다.

이하에서 하나의 군이 적어도 소정 수의 실시양태를 포함하도록 정의되는 경우, 이는 바람직하게 해당 실시양태들만으로 이루어진 군도 포괄하는 것을 의미한다.

본 발명의 맥락에서, "약" 및 "대략" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 용어는 관련 기술분야 통상의 기술자라면 해당 특징의 기술적 효과를 계속 확보하는 것으로 이해하게 될 정밀도 간격을 나타낸다. 상기 용어는 통상적으로 표시되어 있는 숫자 값으로부터 ±10 %, 바람직하게는 ±5 %의 편차를 포괄한다.

본원에서 사용될 때, "도메인"이라는 용어는 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 빌딩 블록을 지칭한다. 도메인이라는 용어는 예컨대 폴리펩티드 사슬 또는 구조의 나머지와 관계없이 접히거나, 기능하거나, 및/또는 존재할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 포함한다. 예를 들어, 시안 형광 단백질은 그것이 융합 단백질의 일부인 경우 도메인으로 간주된다. 또한, 본원에서 사용될 때, 도메인이라는 용어는 분할-효소 또는 분할 형광 단백질의 각 부분도 포함하는데, 여기서 각 부분은 분할-효소 또는 분할 형광 단백질의 2개 도메인이 함께만 접혀 기능할 수 있다 할지라도 도메인으로 간주된다.

본원에서 사용될 때, "폴리펩티드" 및 "단백질"라는 용어는 일부 또는 전체-길이 단백질 중 어느 하나를 포함할 수 있는 단백질 분자를 기술하는 데에 본원에서 호환가능하게 사용된다. 상기 용어는 2종 이상 단백질로부터 유래하는 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 "융합 단백질"을 포함한다. 융합 단백질은 개별 단백질로부터 유래하는 아미노산 부분들 사이에 아미노산의 연결 영역도 포함할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "검출가능한 신호"라는 용어는 생화학, 화학, 의학 또는 진단 기술의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 신호의 증가 또는 감소를 지칭한다. 검출가능한 신호의 예에는 전기적 (예를 들면 커패시턴스), 기계적, 광학적, 음향적 또는 열적 신호가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 광학적 신호는 형광 신호, FRET 신호, 비색 신호 또는 전기화학발광 신호일 수 있다. 적절한 기술 장비를 사용하여 신호가 검출가능할 수 있는 것, 즉 신호 및 신호의 각 변화가 모니터링될 수 있는 것 역시 바람직하다. 바람직하게는, 검출가능한 신호는 예를 들면 폴리펩티드의 입체형태 변화에 의해 유도되는 근접-의존성 방식으로 생성되거나 변경되는 신호일 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "FRET"이라는 용어는 분자들 사이 또는 분자 내에서의 형광 공명 에너지 전달을 지칭한다. FRET 방법에서는, 하나의 형광단이 에너지 공여자로 작용할 수 있으며, 다른 하나는 에너지 수용자이다. 이들은 때로는 각각 리포터(reporter) 및 켄처로 알려져 있다. 공여자는 그것이 보통 그에 대하여 형광 방출 파장을 나타내게 되는 특정 파장의 광에 의해 여기될 수 있다. 수용자 역시 다양한 거리-의존성 에너지 전달 메커니즘에 의해 그것이 공여자 분자의 방출 에너지를 수용할 수 있도록 하는 파장에서 여기될 수 있다. 일반적으로, 수용자는 그것이 근접하여 있는 경우에 공여자의 방출 에너지를 수용한다. 공여자와 수용자는 서로 다른 분자일 수 있거나, 또는 폴리펩티드의 2개의 서로 다른 도메인과 같이 동일한 분자의 개별 부분일 수 있다. FRET 측정 기술에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다.

본원에서 사용될 때, "FRET-공여자-수용자 쌍"이라는 용어는 상기한 바와 같은 FRET을 할 수 있는 에너지 공여자 및 에너지 수용자에 상당하는 형광단을 지칭한다. 이와 같은 문맥에서, "형광단"이라는 용어는 분자가 형광성이 되도록 하는 분자의 구성요소를 지칭한다. 그것은 특정 파장의 광을 흡수하고 다른 (그러나 동일하게 특이적인) 파장에서 광을 재-방출하게 되는 분자 중의 관능기이다. 방출되는 광의 양 및 파장은 형광단 및 형광단의 화학적 환경 둘 다에 따라 달라진다. 형광단에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 플루오레세인의 반응성 유도체, 로다민 (TRITC), 쿠마린, 시아닌 염료 (Cy) 예를 들면 시아닌 3, 시아닌 5 또는 시아닌 7, 형광 단백질 예컨대 아에쿠오레아 빅토리아( Aequorea Victoria) 또는 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis ) 유래의 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 그의 단백질 변이 예컨대 시트린, 비너스 및 Ypet을 포함한 황색 형광 단백질 (YFP); 청색 형광 단백질 (BFP) 예컨대 EBFP, EBFP2, 아주라이트, mKalama1; 시안 형광 단백질 (CFP) 예컨대 ECFP, 세룰레안, CyPet; 및 기타 형광 단백질 예컨대 UnaG, dsRed, mRuby2, 클로버, eqFP611, 드론파, TagRFPs, KFP, EosFP, 덴드라, IrisFP, 클로버, mRubby, mKOk 및 mKO2가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 소형 분자 형광단 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 플루오레세인의 반응성 유도체, 로다민 (TRITC), 쿠마린, 시아닌 (Cy)은 단백질에 접합되어 형광단으로 작용할 수 있다. FRET-공여자-수용자 쌍으로 사용될 수 있는 형광단의 예에는 공여자로서의 CFP와 수용자로서의 YFP, 공여자로서의 EGFP와 수용자로서의 Cy3, 또는 공여자로서의 EGFP와 수용자로서의 YFP, 또는 공여자로서의 클로버와 수용자로서의 mRuby2, 또는 공여자로서의 cpEGFP와 수용자로서의 mKO2가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "분할 효소"라는 용어는 생물학적 활성이 적어도 감소되거나 없는 적어도 2개의 부분으로 분할되는 생물학적으로 활성인 효소를 지칭한다. 이와 같은 문맥에서, "분할 효소 쌍"이라는 용어는 적어도 2개의 적어도 부분적으로는 불활성인 효소 부분들을 지칭한다. 근접시, 상기 효소 부분들은 상호작용하여 생물학적으로 활성인 효소를 형성하며, 그것은 통상적인 효소 검출 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 분할 효소 기술에 대해서는 WO 2005/094441 A2호에도 추가로 기술되어 있다. 분할 효소의 예에는 생체발광을 통하여 재구성 및 모니터링될 수 있는 레닐라 루시퍼라제; 비색, 화학발광 또는 형광 검출을 통하여 활성이 모니터링될 수 있는 상보성 분할 β-갈락토시다제; 가수분해시 니트로세핀의 색상 변화에 의해, 또는 CCF-2/AM을 통한 형광에 의해 상보성이 검정될 수 있는 분할 β-락타마제; GTPase (전하의 변화), 퍼옥시다제 (비색), 뉴클레아제 (엔도 및 엑소 절단), 제한 엔도뉴클레아제 (서열 특이적 엔도 절단), 프로테아제 (단백질 절단), 리가제 (핵산 올리고(oligo)를 결찰시킴) 및 티올-디술피드 옥시도리덕타제 (디술피드 결합을 통한 입체형태 변화)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "분할 형광 단백질 (SFP) 쌍"이라는 용어는 형광 단백질의 적어도 2개의 부분들을 지칭한다. SFP는 개별적으로는 형광성이 아니나 상호보완될 경우 기능성인 형광 분자를 형성하는 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편들로 구성된다. 예를 들면, 분할-녹색 형광 단백질 (분할-GFP)이 SFP이다. 일부 조작된 분할-GFP 분자는 자가-조립성이다 (예를 들면 U.S. 특허 출원 공개 제2005/0221343호 및 PCT 공개 제WO/2005/074436호; 문헌 [Cabantous et al., Nat. Biotechnol., 23:102-107, 2005]; [Cabantous and Waldo, Nat. Methods, 3:845-854, 2006.] 참조). US2012282643호 역시 분할-황색 형광 단백질 변이 및 분할-시안 형광 단백질 변이들에 대해 기술하고 있다.

본원에서 사용될 때의 2개 서열 사이의 "% 동일성"의 측정은 바람직하게는 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877]의 수학 알고리즘을 사용하여 달성된다. 그와 같은 알고리즘은 예를 들면 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)에서 입수가능한 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램에 통합되어 있다.

% 동일성의 측정은 바람직하게는 상기 BLASTn 및 BLASTp 프로그램의 표준 파라미터들을 사용하여 수행된다.

BLAST 폴리뉴클레오티드 서치는 바람직하게는 BLASTn 프로그램을 사용하여 수행된다.

일반 파라미터의 경우, "최대 표적 서열" 박스가 100으로 설정될 수 있으며, "짧은 질문" 박스가 조회될(ticked) 수 있고, "예상 임계치" 박스는 10으로 설정될 수 있으며, "단어 크기" 박스는 28로 설정될 수 있다. 점수화 파라미터의 경우, "일치/불일치 점수"가 1-2로 설정될 수 있으며, "갭 비용(Gap Cost)" 박스는 선형으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터의 경우, "낮은 복잡도 영역" 박스는 조회되지 않을 수 있으며, "종-특이적 반복체" 박스는 조회되지 않을 수 있고, "검색 표 마스킹 전용" 박스는 조회될 수 있으며, "더 낮은 경우 문자의 마스킹" 박스는 조회되지 않을 수 있다.

BLAST 단백질 서치는 바람직하게는 BLASTp 프로그램을 사용하여 수행된다.

일반 파라미터의 경우, "최대 표적 서열" 박스가 100으로 설정될 수 있으며, "짧은 질문" 박스가 조회될 수 있고, "예상 임계치" 박스는 10으로 설정될 수 있으며, "단어 크기" 박스는 "3"으로 설정될 수 있다. 점수화 파라미터의 경우, "매트릭스" 박스가 "BLOSUM62"로 설정될 수 있으며, "갭 비용" 박스는 "현재: 11 확장: 1"로 설정될 수 있고, "조성 조정" 박스는 "조건부 조성 점수 매트릭스 조정"으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터의 경우, "낮은 복잡도 영역" 박스는 조회되지 않을 수 있으며, "검색 표 마스킹 전용" 박스는 조회되지 않을 수 있고, "더 낮은 경우 문자의 마스킹" 박스는 조회되지 않을 수 있다.

% 동일성은 각 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐, 즉 각 문맥에서 인용되는 서열식별번호 또는 서열식별번호들에 따른 서열의 전체 길이에 걸쳐 측정된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타낸다. 또 다른 예에서, 서열식별번호: 3에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 서열은 서열식별번호: 3의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 3에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타낸다.

본 발명의 맥락에서 "단리된"이라는 용어는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 그의 자연 환경으로부터 분리되어 있고/거나 자연에서는 그것이 발견되지 않는 형태로 존재한다는 것을 나타낸다. "단리된" 폴리펩티드 또는 "단리된" 폴리뉴클레오티드는 시험관 내에서 생성된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다.

본원에서 사용될 때, "아미노산 치환"이라는 용어는 보존성 또는 비-보존성 치환, 바람직하게는 보존성 치환에 따른 아미노산 서열의 치환을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치환에는 비-자연 아미노산을 사용한 자연 발생 아미노산의 교체도 포함된다. 보존성 치환은 치환되는 아미노산과 유사한 화학적 특성을 가지는 또 다른 아미노산을 사용한 아미노산의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 보존성 치환은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 치환이다:

(i) 또 다른 상이한 염기성 아미노산을 사용한 염기성 아미노산의 치환;

(ii) 또 다른 상이한 산성 아미노산을 사용한 산성 아미노산의 치환;

(iii) 또 다른 상이한 방향족 아미노산을 사용한 방향족 아미노산의 치환;

(iv) 또 다른 상이한 비-극성 지방족 아미노산을 사용한 비-극성 지방족 아미노산의 치환; 및

(v) 또 다른 상이한 극성 비하전 아미노산을 사용한 극성 비하전 아미노산의 치환.

염기성 아미노산은 바람직하게는 아르기닌, 히스티딘 및 리신으로 이루어진 군에서 선택된다. 산성 아미노산은 바람직하게는 아스파르테이트 또는 글루타메이트이다.

방향족 아미노산은 바람직하게는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된다. 비-극성 지방족 아미노산은 바람직하게는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 메티오닌 및 이소류신으로 이루어진 군에서 선택된다. 극성 비하전 아미노산은 바람직하게는 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어진 군에서 선택된다. 보존성 아미노산 치환과 달리, 비-보존성 아미노산 치환은 상기에서 개괄된 보존성 치환 (i) 내지 (v)에 속하지 않는 임의의 아미노산을 사용한 아미노산의 교체이다.

본원에서 사용될 때, "생물학적 샘플"이라는 용어는 인간 또는 동물 신체 외부의 조직 (예를 들면 조직 생검물), 기관, 세포, 세포 용해물 또는 체액 (혈액, 소변, 타액, 담즙, 혈청, 뇌척수액 등)의 샘플을 지칭한다. 또한, "생물학적 샘플"이라는 용어에는 포유동물 세포, 인간 세포 또는 식물 세포와 같은 진핵 세포, 또는 임의적으로 형질감염 및 형질전환 방법을 포함한 관련 기술분야 통상의 기술자에게 보편적으로 알려져 있는 방법에 의해 유전적으로 변형되었을 수 있는 원핵 세포의 시험관내 세포 배양 세포 또는 세포 용해물도 포함된다.

본원에서 사용될 때, "결합"이라는 용어는 분자들이 서로 근접하여 존재하는 안정한 연합을 초래하는 2개 분자들 사이의 견인성 상호작용을 지칭한다. 결합의 결과는 때로는 구성요소들을 함께 유지하는 견인력이 대체로 비-공유성이며 그에 따라 보통 공유 결합에 비해 에너지상 더 약한 분자 복합체의 형성이다.

[ 실시예 ]

1. 세포 배양, 세포 형질감염, 화학물질 및 완충제

10 % 소 태아 혈청, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbeccos's Modified Eagle Medium) (DMEM, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 사)에서 HeLa 세포를 성장시켰다. 60-80 % 합류시, 1.5 ㎍의 적절한 플라스미드 DNA 및 3 ㎍의 트랜스패스트(TransFast)TM 형질감염 반응물 (프로메가(Promega) 사)와 혼합되어 있는 무-혈청 및 무-항생제 배지 1 ml를 사용하여 30-mm 영상화 디쉬 중 세포를 형질감염시켰다. 세포를 가습 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO2, 95 % 공기)에서 16-20시간 동안 유지한 후, 각 배양 배지로 다시 교체하였다. 모든 실험은 형질감염 24시간 후에 수행하였다. 발리노마이신은 시그마 알드리치 사로부터 구매하여, 7 μM의 최종 농도로 사용하였다. 사용된 실험 완충제는 하기로 구성되었다 (g/L로 나타냄): 8.0 또는 7.6 NaCl, 1.44 Na₂HPO₄, 0.12 NaH₂PO₄, 0.4 KCl이 있거나 KCl이 없는 NaOH 중 어느 하나를 사용하여 pH는 7.40.

2. 살아있는-세포 영상화

디지털 광각(wide field) 형광 영상화 시스템인 TiLL iMIC (틸 포토닉스(Till Photonics) 사, 독일 그라에펠핑 소재)을 사용하여 형광 영상화를 수행하였다. 적색 이동 FRET-기반 R-GEPII를 480 nm에서 여기시키고, 각각 510-540 nm (클로버 즉 FRET 공여자) 및 560-610 nm (클로버에서 mRuby2로의 FRET)에서 방출을 포착하였다. CFP/YFP-기반 GEPII 1.0을 430 nm에서 여기시키고, 각각 480 nm 및 535 nm에서 방출을 기록하였다. 데이터 획득 및 디지털 형광 현미경의 제어는 라이브 포착 소프트웨어 버전 2.0.0.12 (틸 포토닉스 사)를 사용하여 수행하였다.

3. 인실리코 (In silico ) 모델링

온라인 툴인 파이어(Phyre)2 (단백질 상동성/유사성 인식 엔진 V 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)를 사용하여 BON 도메인 및 전체 길이 Kbp의 모델을 예측하였다. 소프트웨어 파이몰(PyMol) 뷰어를 사용하여 예측된 키메라 3차원 구조의 추가적인 분석을 수행하였다. 온라인 툴인 포어 워커(PoreWalker) 1.0 (http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/software/PoreWalker/)을 사용하여 터널 예측(Tunnel prediction)을 수행하였다.

4. FRET에 의한 K ⁺ 의 검출

전통적인 클로닝 전략을 사용하여 GEPII 1.0 및 R-GEPII 1.0 폴리펩티드 (도 2a 및 b)를 코딩하는 플라스미드 DNA를 생성시켰다. GEPII 1.0은 최적화된 CFP/YFP (FRET 공여자로서의 sECFP 및 FRET 수용자로서의 cpV) FRET 쌍 (도 2a, 상부 패널)을 포함한다. 적색-이동 R-GEPII 1.0은 향상된 동역학을 가지는 심색성(bathochromic) FRET-기반 프로브의 생성에 최적화된, 각각 밝은 녹색 및 적색 FP 변이인 클로버 및 mRuby2 (도 2a, 저부 패널 및 b)를 함유한다. 각 플라스미드 DNA의 형질감염 후 CFP/YFP-기반 GEPII 1.0 (도 2c, 좌측 패널) 또는 적색-이동 R-GEPII 1.0 (도 2c, 우측 패널) 중 어느 하나를 발현하는 HeLa 세포에서 두 프로브를 시험하였다. 세포액 K⁺ 농도 ([K⁺]_cyto)를 조절하기 위하여, 디지토닌과 K⁺ 이온운반체 발리노마이신의 혼합물 (도 2d) 또는 발리노마이신 단독 (도 2e)을 사용하여 세포를 투과화하였다. 실제로, GEPII의 FRET 비 신호는 K⁺ 첨가에 반응하여 농도 의존성 방식으로 증가한 반면 (도 2d), FRET 형광은 K⁺ 제거시 즉시 감소하였다 (도 2d 및 e). 이러한 실험은 FP 및 Kbp-기반 키메라 구축물의 설계 및 생성이 K⁺ 변화의 실-시간 판독을 제공하는 기능성인 FRET-기반 프로브를 산출한다는 것을 확인해 주었다.

제자리에서(in situ), CFP/YFP 기반 GEPII 1.0 및 각 R-GEPII 1.0의 최대 절반 유효 농도 (EC₅₀)는 각각 2.04 (1.72-2.41) mM (도 2d, 우측 패널) 및 4.11 (3.25-5.19) mM인 것으로 밝혀졌다 (n=8). 제자리에서 (배양된 단일 HeLa 세포) EC₅₀ 값을 측정하기 위하여, GEPII를 발현하는 세포들을 무 K⁺ 용액 중에서 5 μM 디지토닌을 사용하여 10분 동안 투과화하였다. 디지토닌은 반-자동 관류 시스템을 사용하여 현미경상 세포에 적용하였다. 시간 경과에 따른 연속 FRET 비 영상화를 사용하여 프로브의 K⁺ 민감도를 조사하였다. FRET 비 신호가 증가한 후 안정하게 유지될 때까지, 관류 시스템을 통하여 0.01 mM 내지 100 mM 범위의 상이한 K⁺ 농도들을 첨가하였다. 최대 델타 FRET 비 값을 각 대수 K⁺ 농도에 대하여 플로팅하고, S자형 농도 반응 방정식을 사용하여 피팅하였다. 데이터 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

5. 합리적인 폴리펩티드 변이의 설계

GEPII의 K⁺ 민감도를 조작하기 위하여, 서열 분석, 및 파이어-2 및 파이몰 소프트웨어를 사용한 상동성 3D-모델링을 기반으로 야생형 Kbp를 합리적으로 재설계하였다. 본 발명자들의 추정은 물론 예비 데이터도 BON 및 LysM 도메인에 하전 및 극성 아미노산을 코딩하는 돌연변이가 각 FRET-기반 GEPII의 K⁺ 민감도를 상당히 감소시킨다는 것을 나타내었다.

Kbp의 야생형 K⁺-결합 BON 도메인에서는, 하기 8개 위치의 산성 아미노산이 확인될 수 있다: D41, D43, D51, D59, E64, E67, D83 및 D84 (도 3a 및 b, 적색 영역). 흥미롭게도, 파이어2 및 파이몰을 사용한 BON 도메인의 3-D 모델링은 세공 또는 터널-유사 구조를 예측하였다 (도 3a). 이와 같은 세공 내에서의 2개 산성 아미노산의 최소 거리는 680 내지 800 pm 가량이다 (도 3c). 660 pm 가량인 최소 세공 직경을 고려해보면 (도 3d), 세공에 가깝거나 그 안에 있는 산성 아미노산은 수화된 K⁺ 이온에 충분히 간섭하고 결합할 수 있다 (도 3e).

또한, BON 도메인의 3-D 모델링과 조합된 서열 분석 (도 3)은 모든 산성 아미노산 이외에, 27의 Q (글루타민), 35의 N (아스파라긴), 75의 N (아스파라긴) 및 53의 G (글리신)도 K⁺ 감지에 중요한 것으로 여겨진다는 것을 예측하였다.

K⁺ 결합 BON 도메인과 상호작용하는 것으로 여겨지는 LysM 도메인 내 위치 105 (D), 126 (E) 및 408 (D)의 3개의 음으로 하전된 아미노산들 역시 K⁺ 결합시 단백질의 입체형태 변화에 중요한 것으로 보인다.

6. 폴리펩티드 변이를 사용한 FRET-검출

부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 GEPII 1.0의 돌연변이를 코딩하는 플라스미드 DNA를 생성시켰다. 여기에서, 헤르큘라제 II 폴리머라제 (아길렌트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 사, 미국 산타 클라라 소재)를 사용한 각 PCR에는 설계된 단일 뉴클레오티드 다형체들을 함유하는 프라이머를 사용하였다. 다음에, 각 제한 효소를 사용하여 각 PCR 생성물을 pcDNA3.1(-) 포유동물 발현 벡터에 서브-클로닝하였다. 다음에, 각 플라스미드 DNA를 사용하여 HeLa 세포를 형질감염시키고, 실시예 4에서 상기한 바와 같이 EC₅₀을 측정하였다. 각 폴리펩티드 변이에 대한 결과를 표 5에 요약하였다.

7. 칼륨 센서 제1 도메인과 칼륨 센서 제2 도메인 사이에 상이한 링커 분자를 사용하는 폴리펩티드 변이들의 FRET 검출

각 링커를 형성하는 아미노산들을 코딩하는 설계된 순방향 및 역방향 프라이머 쌍들을 사용하여, 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 링커 서열을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드를 생성시켰다. 순방향 프라이머는 오버행 연장 PCR에 의해 링커를 형성하는 5' 오버행으로 야생형 LysM 도메인을 연장하도록 설계하였다. 역방향 프라이머는 야생형 BON 도메인에 결합하여 3' 말단에 동일한 링커를 형성하도록 설계하였다. 다음에, 추가적인 PCR에 의해 이러한 두 가지 PCR 생성물을 융합하고, 각각 mseCFP 및 cpV를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 측접하도록 pcDNA3.1(-) 벡터에 서브-클로닝하였다. 최종 구축물은 Kbp의 BON 및 LysM 도메인 사이에 유연성 링커를 가지는 신규한 CFP/YFP FRET-기반 GEPII 변이를 코딩한다.

다음에, 플라스미드 DNA를 사용하여 세포를 형질감염시키고, 실시예 4에서 상기한 바와 같이 EC₅₀을 측정하였다. 각 폴리펩티드 변이에 대한 결과를 표 6에 요약하였다.

링커 분자를 포함하는 폴리펩티드들은 GEPII 1.0에 비해 증가된 EC₅₀을 나타내었다.

8. BON과 LysM 도메인 사이에 링커를 포함하는 폴리펩티드 변이들의 FRET 검출

각 링커를 형성하는 아미노산들을 코딩하는 설계된 순방향 및 역방향 프라이머 쌍들을 사용하여, 아미노산 치환 및 링커 서열을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드를 생성시켰다. 순방향 프라이머는 오버행 연장 PCR에 의해 링커를 형성하는 5' 오버행으로 ΔLysM 도메인 (ΔLysM GEPII 1.0 참조)을 연장하도록 설계하였다. 역방향 프라이머는 야생형 BON 도메인에 결합하여 3' 말단에 동일한 링커를 형성하도록 설계하였다. 다음에, 추가적인 PCR에 의해 이러한 두 가지 PCR 생성물을 융합하고, 각각 mseCFP 및 cpV를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 측접하도록 pcDNA3.1(-) 벡터에 서브클로닝하였다. 최종 구축물은 BON 및 ΔLysM 도메인 사이에 유연성 링커를 가지는 신규한 CFP/YFP FRET-기반 GEPII 변이를 코딩한다.

다음에, 플라스미드 DNA를 사용하여 HeLa 세포를 형질감염시키고, 실시예 4에서 상기한 바와 같이 EC₅₀을 측정하였다. 각 폴리펩티드 변이에 대한 결과를 표 7에 요약하였다.

9. 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포의 소기관 및 하위-도메인 표적화

유전자 코딩 프로브의 커다란 장점은 그것이 세포의 소기관 및 하위-도메인에 대하여 정밀하게 표적화될 수 있다는 것이다. 이에 따라, GEPII의 표적화는 고도의 공간적 및 시간적 해상도로의 K⁺ 농도 및 동역학의 정량을 가능케 하게 된다. 표적화가능한 K⁺ 프로브의 부족으로 인하여, 세포이하 K⁺ 유동에 대한 우리의 현재의 개념은 매우 막연하다.

통상의 기술자에게 알려져 있는 일반적인 분자 생물학 방법들을 사용하여 N-말단 또는 C-말단 표적 서열 중 어느 하나를 가지는 GEPII 1.0을 코딩하는 각 DNA 플라스미드를 클로닝하였다. 형광 현미경법에 의해 핵 (도 4c), 미토콘드리아 (도 4d), 내형질 세망 (ER, 도 4e), 세포 표면 (도 4f), 핵막 (도 4g) 및 형질막하 영역 (도 4h)에 대하여 GEPII 1.0 폴리펩티드 (도 2 참조)를 표적화하는 실험을 분석하고, 결과는 도 4에 나타내었다. 어떠한 표적화 서열도 없는 GEPII 1.0은 세포액 및 핵 내에 국소화된다 (도 4a). GEPII 1.0 C-말단에의 핵 외수송 서열 (NES; LPPLERLTL)의 첨가는 세포액 내에서만의 K⁺ 프로브의 국소화로 이어졌다 (도 4b). 표적화된 프로브는 세포이하 K⁺ 유동의 시간 주기 형광 영상화를 가능케 하게 된다.

10. 단리된 폴리펩티드의 특성화

서로 다른 GEPII 변이들을 petM11 세균 발현 벡터에 클로닝하였다. 화학적으로 적격인 DH5α 세균에의 GEPII를 코딩하는 세균 발현 플라스미드의 형질전환 후, LB 아가 플레이트상에서 세포를 배양하여 단일 콜로니들을 수득하였다. 단일 콜로니를 함유하는 예비-배양물을 밤새 배양한 다음, 37 ℃에서 1 L의 새로운 LB 배지에 접종하였다. 0.7의 광학 밀도가 관찰되었을 때, 0.5 mM의 최종 농도로 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하고, 실온에서 세포를 추가로 배양하였다. 다음에, 세포 용해에 의해 세균 세포로부터 발현된 GEPII를 추출하고, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다. 이미다졸을 사용하여 컬럼으로부터 용리액을 수득하였다. GEPII 함유 용출액을 트리톤 X 100 (0.05 %)을 함유하는 HEPES 완충 용액에 희석하였다. 추가로 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 재조합 GEPII 추출을 확인하였다. 형광 플레이트 판독기상에서의 FRET 측정의 사용은 재조합 폴리펩티드의 FRET 비 신호가 Na⁺ 및 Ca^{2 +}에 의해 영향을 받지 않았음을 나타내었다. 반면, Rb⁺ 및 Cs⁺에 대비한 K⁺는 각 이온 3 mM의 첨가에 반응하여 정제된 GEPII의 FRET 비 신호를 증가시켰다 (도 5 참조).

11. 생물학적 샘플에서의 K ⁺ 농도의 측정

일련의 예비 실험에서, 상기한 바와 같이 정제된 GEPII 1.0을 사용하여 도 6a에 기술되어 있는 바와 같은 실험 설정으로 마우스 혈청 중 K⁺를 측정하였다. 6.63 ± 0.34 mM (SD; n=5; 도 6)의 혈청 K⁺ 농도를 측정하였는데, 이는 공표되어 있는 데이터와 충분히 일치하는 것이다. 중요한 것은 혈액 수집 양식 (안면 정맥 또는 안와)은 물론 마우스 혈청 내에서의 GEPII의 안정성과 무관한 재현성 및 반복성이 극히 높아서 (도 6), 생물학적 프로브에서의 K⁺의 GEPII-기반 측정이 강력하고 정밀한 방법에 해당한다는 것을 나타내고 있다는 것이다.

12. 생존율/세포 사멸 검정

또한, 정제된 GEPII 1.0을 사용하여, 세포 생존율 및 세포 사멸의 척도로서 (다중-웰) 세포 배양 플레이트에서 세포외 K⁺ 농도를 동역학적으로 기록하였다. 글루코스 또는 2-데옥시글루코스 (2-DG) 중 어느 하나-함유 배양 배지에서 세포를 유지하면서, 매시간 세포외에 위치된 재조합 GEPII 1.0의 FRET 비 신호를 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 10 mM 글루코스 존재하에서의 대조 세포 상청액 중 세포외 K⁺ 농도는 50 μM의 디지토닌을 사용하여 세포가 투과화될 때까지 시간 경과에 따라 일정하게 유지되었다. 반면, 정제된 GEPII 1.0의 FRET 비 신호는 2-DG를 사용하여 세포를 처리할 경우 시간 경과에 따라 강하게 증가함으로써, 빠르게 세포내 K⁺의 손실로 이어지는 대사 붕괴를 나타내었다. 이러한 발견은 추가로 배양물에서 세포의 K⁺ 방출을 측정하는 것이 세포 생존율의 실-시간 판독을 나타낸다는 것을 역설하고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Medical University Graz <120> Genetically Encoded Potassium Ion Indicators <130> M11159 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 63 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr 50 55 60 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys 1 5 10 15 Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn 20 25 30 Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu 35 40 45 Arg Ile 50 <210> 3 <211> 149 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Gly Leu Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala Gly Glu Lys Leu Trp Asp 1 5 10 15 Ala Val Thr Gly Gln His Asp Lys Asp Asp Gln Ala Lys Lys Val Gln 20 25 30 Glu His Leu 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Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser 225 230 235 240 Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys 245 250 <210> 9 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mRuby2 <400> 9 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Arg Met Lys 1 5 10 15 Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe Lys Cys Thr Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys 35 40 45 Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr 50 55 60 Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr Pro Lys Gly Ile 65 70 75 80 Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg 85 90 95 Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Met Gln Asp Thr 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Val Tyr His Val Gln Val Arg Gly Val 115 120 125 Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp 130 135 140 Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly 145 150 155 160 Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly His Leu Ser Cys 165 170 175 Ser Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val Gly Asn Ile Lys 180 185 190 Met Pro Gly Ile His Ala Val Asp His Arg Leu Glu Arg Leu Glu Glu 195 200 205 Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln Arg Glu His Ala Val Ala Lys 210 215 220 Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 10 <211> 189 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 caggcgaaga aggtgcagga gcatctgaac aaaaccggta taccggatgc cgataaagtg 60 aatattcaaa ttgccgacgg caaagcgacg gtcactggtg acggcctgag tcaggaggcg 120 aaggagaaaa tccttgttgc ggtggggaat atttccggta ttgccagtgt cgatgatcag 180 gtgaaaacg 189 <210> 11 <211> 150 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 cagttttata ccgttaagtc tggcgacact ctgagtgcca tttccaaaca ggtctacggt 60 aacgctaatc tgtacaataa aatcttcgaa gcgaataaac cgatgctaaa aagcccggat 120 aaaatttatc cggggcaagt gttgcgtatt 150 <210> 12 <211> 447 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 atgggtctgt tcaattttgt gaaagatgcc ggagaaaaac tctgggacgc ggttacaggt 60 cagcacgata aagacgatca ggcgaagaag gtgcaggagc atctgaacaa aaccggtata 120 ccggatgccg ataaagtgaa tattcaaatt gccgacggca aagcgacggt cactggtgac 180 ggcctgagtc aggaggcgaa ggagaaaatc cttgttgcgg tggggaatat ttccggtatt 240 gccagtgtcg atgatcaggt gaaaacggcg acaccagcca ctgccagcca gttttatacc 300 gttaagtctg gcgacactct gagtgccatt tccaaacagg tctacggtaa cgctaatctg 360 tacaataaaa tcttcgaagc gaataaaccg atgctaaaaa gcccggataa aatttatccg 420 gggcaagtgt tgcgtattcc ggaagag 447 <210> 13 <211> 626 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEP II 1.0 <400> 13 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Ile Asp Met Gly Leu Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala 225 230 235 240 Gly Glu Lys Leu Trp Asp Ala Val Thr Gly Gln His Asp Lys Asp Asp 245 250 255 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 260 265 270 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 275 280 285 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 290 295 300 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 305 310 315 320 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr 325 330 335 Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn 340 345 350 Lys Ile Phe Glu Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile 355 360 365 Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile Pro Glu Glu Glu Phe Met Asp Gly 370 375 380 Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp 385 390 395 400 Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys 405 410 415 Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu 420 425 430 Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 450 455 460 Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 465 470 475 480 Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 485 490 495 Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro 500 505 510 Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr 515 520 525 Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu 530 535 540 Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr 545 550 555 560 Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg 565 570 575 Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly 580 585 590 His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala 595 600 605 Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn 610 615 620 Ile Glu 625 <210> 14 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEPII 2.7 <400> 14 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr 85 90 95 Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met 100 105 110 Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile 115 120 125 <210> 15 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEPII 2.10 <400> 15 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys 85 90 95 Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn 100 105 110 Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu 115 120 125 Arg Ile 130 <210> 16 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEPII 2.15 <400> 16 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu 85 90 95 Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys 100 105 110 Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr 115 120 125 Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile 130 135 <210> 17 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEPII 2.22 <400> 17 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr Thr 85 90 95 Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly 100 105 110 Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu 115 120 125 Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile 130 135 140 <210> 18 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEP II 2.28 <400> 18 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile 100 105 110 Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln 130 135 140 Val Leu Arg Ile 145 <210> 19 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEPII 2.4 <400> 19 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gln Phe Tyr Thr Val Lys 65 70 75 80 Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala 85 90 95 Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser 100 105 110 Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile 115 120 <210> 20 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GEPII 2.7 <400> 20 Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr 20 25 30 Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr 85 90 95 Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met 100 105 110 Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile 115 120 125 <210> 21 <211> 641 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R-GEPII 1.0 <400> 21 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser 225 230 235 240 Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys Ile Asp Met Gly Leu 245 250 255 Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala Gly Glu Lys Leu Trp Asp Ala Val Thr 260 265 270 Gly Gln His Asp Lys Asp Asp Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu 275 280 285 Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala 290 295 300 Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys 305 310 315 320 Glu Lys Ile Leu Val Ala Val Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val 325 330 335 Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gln Phe Tyr 340 345 350 Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr 355 360 365 Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn Lys Pro Met 370 375 380 Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile Pro 385 390 395 400 Glu Glu Glu Phe Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn 405 410 415 Met Arg Met Lys Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe 420 425 430 Lys Cys Thr Gly Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly Thr Gln Thr 435 440 445 Met Arg Ile Lys Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp 450 455 460 Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr 465 470 475 480 Pro Lys Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe 485 490 495 Thr Trp Glu Arg Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 500 505 510 Met Gln Asp Thr Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Val Tyr His Val Gln 515 520 525 Val Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 530 535 540 Thr Lys Gly Trp Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly 545 550 555 560 Gly Leu Arg Gly Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly 565 570 575 His Leu Ser Cys Ser Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val 580 585 590 Gly Asn Ile Lys Met Pro Gly Ile His Ala Val Asp His Arg Leu Glu 595 600 605 Arg Leu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln Arg Glu His 610 615 620 Ala Val Ala Lys Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr 625 630 635 640 Lys

Claims (25)

1. a) 제1 신호전달 도메인, 및
   b) b1) 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제1 도메인; 및 b2) 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제2 도메인을 포함하는 칼륨 센서
   를 포함하며, 여기서 칼륨 센서는 양으로 하전된 칼륨 이온에 결합할 수 있고, 제1 신호전달 도메인은 칼륨 센서에의 양으로 하전된 칼륨 이온의 결합시 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 것인 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   a) 제1 신호전달 도메인, 및
   b) b1) 서열식별번호: 1에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제1 도메인; 및 b2) 서열식별번호: 2에 따른 서열에 대하여 적어도 70 %의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 칼륨 센서의 제2 도메인을 포함하는 칼륨 센서; 및
   c) 제2 신호전달 도메인
   을 포함하며, 여기서 칼륨 센서는 양으로 하전된 칼륨 이온에 결합할 수 있고, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인은 칼륨 센서에의 양으로 하전된 칼륨 이온의 결합시 함께 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 것인 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 칼륨 센서가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 센서가 하기 아미노산 치환들: D41N, D43N, D51N, D59N, E64Q, D83N, D84N, Q26R, N35Q, N75Q 또는 G52D 중 적어도 하나를 가지는 서열식별번호: 1의 칼륨 센서 제1 도메인에 대한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
5. 제4항에 있어서, 칼륨 센서가 하기 치환들: Q26R, N35Q, N75Q, G52D를 가지는 서열식별번호: 1의 칼륨 센서 제1 도메인에 대한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 센서가 하기 아미노산 치환들: D104N, E125Q, D135N, N116Q, N118Q, N121Q 또는 N127Q 중 적어도 하나를 가지는 서열식별번호: 2의 칼륨 센서 제2 도메인에 대한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
7. 제6항에 있어서, 칼륨 센서가 하기 치환들: D104N, E125Q, D135N을 가지는 서열식별번호: 2의 칼륨 센서 제2 도메인 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 링커 아미노산 서열 -GGGG-, 또는 적어도 하나의 하기 화학식 (I) 링커 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
   

   

   
   식 중
   x는 정수 0 또는 1이고,
   y는 정수 1 내지 6이고,
   z는 정수 0 또는 1이다.
9. 제8항에 있어서, y가 2, 3 또는 5인 폴리펩티드.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 링커 아미노산 서열에, 칼륨 센서 제1 도메인의 아미노산 서열이 선행하며, 칼륨 센서 제2 도메인이 후속하는 것인 폴리펩티드.
11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인이 형광 공명 에너지 전달 (FRET)-공여자-수용자 쌍, 분할-효소 쌍 또는 분할-형광 단백질 쌍으로 이루어진 군에서 함께 선택되며, 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인이 쌍의 각 부분이 되고, 바람직하게는 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인이 FRET-공여자-수용자 쌍인 폴리펩티드.
12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, FRET-공여자-수용자 쌍이 시안 형광 단백질 (CFP) 도메인 및 황색 형광 단백질 (YFP) 도메인 예컨대 원형 순열화 비너스 (CPV)인 폴리펩티드.
13. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, FRET-공여자-수용자 쌍이 클로버 및 mRuby2인 폴리펩티드.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 신호전달 도메인이 형광 단백질 도메인, 바람직하게는 CFP 도메인인 폴리펩티드.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
16. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 따른 서열에 대하여 적어도 80 %의 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
17. 진핵 또는 원핵 유전자 발현에 적합한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 벡터.
18. 제15항 또는 제16항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제17항에 따른 벡터 및/또는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 세포.
19. a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    b) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 샘플과 접촉시키는 단계;
    c) 제1 신호전달 도메인에 의해 생성되는 신호를 측정하는 단계; 및/또는
    d) 제1 신호전달 도메인 및 제2 신호전달 도메인에 의해 함께 생성되는 신호를 측정하는 단계
    를 포함하며, 여기서 샘플과의 접촉 후의 신호 강도의 변화는 샘플 중 칼륨 이온의 존재를 나타내는 것인, 샘플 중 양으로 하전된 칼륨 이온의 검출 방법.
20. 제19항에 있어서, 단계 c) 및/또는 d)에서 측정되는 신호가 형광 신호, 비색 신호 또는 FRET 신호인 방법.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 측정되는 신호가 FRET 신호인 방법.
22. 제21항에 있어서, FRET 신호가 약 470 nm 내지 약 490 nm 범위 파장에서의 광을 사용한 여기, 및/또는 약 510 nm 내지 520 nm 및 590 nm 내지 약 610 nm 범위에서의 광 방출 후에 측정되는 것인 방법.
23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서, 폴리펩티드를 제공하는 것이 (i) 제15항 또는 제16항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제17항에 따른 벡터를 사용하여, 인간 또는 동물 신체 외부에서 적어도 하나의 진핵 세포를 형질감염시키는 것 또는 원핵 세포를 형질전환시키는 것, 또는 (ii) 제18항에 따른 세포를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
24. 샘플 중 양으로 하전된 칼륨 이온을 검출하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
25. a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드;
    b) 제15항 또는 제16항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제17항에 따른 벡터; 및/또는
    c) 제18항에 따른 세포
    중 적어도 1종을 포함하는, 양으로 하전된 칼륨 이온을 검출하기 위한 키트.

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