JP2020521118A - 遺伝学的にコードされたカリウムイオン指標 - Google Patents
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Abstract
Description
カリウムイオン(K+)は、あらゆる細胞型にとって、適切に機能するために必要である。細胞膜および細胞小器官の膜を介して電気化学的K+勾配があることにより、K+の流動が促進されて、多様な細胞機能が制御される。細胞外および細胞内のK+濃度の変動によって、筋肉の収縮、神経伝達物質およびホルモンの放出、神経細胞の興奮性、細胞の体積、細胞の増殖、ならびに細胞死が制御されることが知られている。そのため、K+ホメオスタシスの不均衡が細胞レベルおよび生命体レベルのいずれにおいても大きな意味をもち、神経疾患、心血管疾患、腎疾患、免疫疾患、筋肉疾患、および代謝疾患ならびにがんを含む多くの病態に関連しているということは、驚くにはあたらない。生体膜を介するK+の流動および輸送は、非常に多くの選択的K+チャネル、交換体、およびポンプによって行なわれており、これらは、多様な疾患の治療を目的とした治療薬の対象として期待されている。しかしながら、K+動態を高空間分解能および高時間分解能にて研究するために使用できるプローブがないため、細胞外および細胞内のK+の変動についての理解は、現時点では非常に限られている。
さらに、本発明の別の目的は、試料中のK+を検出するための新規方法の提供である。
上述される本発明の目的は、以下のようなポリペプチドによって解決される。このポリペプチドは、
a)第1のシグナル伝達ドメインと、
b)カリウムセンサとを含み、カリウムセンサは、
b1)配列番号1の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第1のドメインと、
b2)配列番号2の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第2のドメインとを含み、
カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、第1のシグナル伝達ドメインは、正電荷を帯びたカリウムイオンがカリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる。
a)本発明に係るポリペプチドを提供する工程、
b)本発明に係るポリペプチドを試料と接触させる工程、
c)第1のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程、ならびに/または
d)第1のシグナル伝達ドメインおよび第2のシグナル伝達ドメインが連携して生成したシグナルを測定する工程を含み、
試料との接触後に生じるシグナル強度の変化により、試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法に関する。
以下において本発明を詳細に記載するに先立ち、本発明が、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されず、これらは多様であるということが理解される。また、本明細書中において用いられる専門用語は、具体的な実施形態について説明する目的でのみ記載されており、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は付属の請求項によってのみ限定される、ということも理解される。特に定義がなければ、本明細書中において用いられるすべての科学技術用語は、当技術分野において通常の知識を有する者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。
a)第1のシグナル伝達ドメインと、
b)カリウムセンサとを含み、カリウムセンサは、
b1)配列番号1の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第1のドメインと、
b2)配列番号2の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第2のドメインとを含み、
カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、第1のシグナル伝達ドメインは、正電荷を帯びたカリウムイオンがカリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる。
i)カリウムセンサの第1のドメインと
ii)第1のシグナル伝達ドメインと、
iii)カリウムセンサの第2のドメインとを含む。
i)カリウムセンサの第2のドメインと、
ii)第1のシグナル伝達ドメインと、
iii)カリウムセンサの第1のドメインとを含む。
a)第1のシグナル伝達ドメインと、
b)カリウムセンサとを含み、カリウムセンサは、
b1)配列番号1の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第1のドメインと、
b2)配列番号2の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第2のドメインとを含み、
さらに、
c)第2のシグナル伝達ドメインとを含み、
カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、第1のシグナル伝達ドメインと第2のシグナル伝達ドメインとは、正電荷を帯びたカリウムイオンがカリウムセンサに結合すると、連携して、検出可能なシグナルを生成できる、ポリペプチドにも関する。好ましくは、検出可能なシグナルは、K+がカリウムセンサに結合すると生成されてよい。K+の結合は、たとえば、カリウムセンサにおける立体構造のシフトを誘導してよく、次いで、第1のシグナル伝達ドメインと第2のシグナル伝達ドメインとを互いに近づけるまたは互いから引き離すことにより、検出可能なシグナルの生成に少なくとも寄与してよい。好ましい一実施形態において、第1のシグナル伝達ドメインと第2のシグナル伝達ドメインとのペアは、FRETのドナーとアクセプターのペア、分割型酵素(split−enzyme)のペア、または分割型蛍光タンパク質(split−fluorescent protein)のペアからなる群より選択され、第1のシグナル伝達ドメインおよび第2のシグナル伝達ドメインは1つのペアの各部分(たとえば、分割型酵素の半分ずつまたは分割型蛍光タンパク質の半分ずつ)である。好ましくは、K+がカリウムセンサに結合することにより、ポリペプチドにおける立体構造のシフトが誘導されてよく、次いで、第1のシグナル伝達ドメインおよび第2のシグナル伝達ドメインが、検出可能なシグナルを生成できてよい。たとえば、FRETのドナーとアクセプターのペアが、検出可能なFRETシグナルを生成してよい、または、分割型酵素の半分ずつが機能可能となり、検出可能なシグナルを生成できる反応を触媒してよい、または、分割型蛍光タンパク質の半分ずつが、適切な範囲の波長を有する光によって励起された場合に、検出可能なシグナルとして、特定波長の光を放射できてよい。
表3:シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
i)第1のシグナル伝達ドメインと、
ii)カリウムセンサであって、好ましくはカリウムセンサの第1のドメインがカリウムセンサの第2のドメインの前に位置する、カリウムセンサと、
iii)第2のシグナル伝達ドメインとを含む。
好ましい一実施形態において、ポリペプチドは、さらに、式(I)のリンカーアミノ酸配列を少なくとも1つ含む。
式中、
xは整数0または1であり、
yは整数1〜6であり、
zは整数0または1である。
好ましい一実施形態において、yは2、3、または5である。
表4:BONドメイン、LysMドメイン、およびKbpをコードするヌクレオチド配列
a)本発明に係るポリペプチドを提供する工程、
b)本発明に係るポリペプチドを接触させる工程、
c)第1のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程を含み、
試料との接触後に生じるシグナル強度の変化によって、試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法に関する。
a)本発明に係るポリペプチドを提供する工程、
b)本発明に係るポリペプチドを接触させる工程、
c)第1のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程、ならびに/または
d)第1のシグナル伝達ドメインおよび第2のシグナル伝達ドメインが連携して生成したシグナルを測定する工程を含み、
試料との接触後に生じるシグナル強度の変化によって、試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法に関する。
上記方法の一実施形態において、試料の非存在下でのポリペプチドのシグナルと比較した、試料との接触後に生じるシグナル強度の変化により、試料中にK+が存在することが示される。
a)本発明に係るポリペプチド、
b)本発明に係るポリヌクレオチドもしくは本発明に係るベクター、および/または
c)本発明に係る細胞のうち少なくとも1つを含む、キットにも関する。
a)試料を希釈するための好適なK+非含有バッファー、
b)ポジティブコントロールとして、K+濃度が既知である少なくとも1種の標準溶液、
c)キットが複数種類の溶液を有する場合には、任意に、K+濃度の異なる標準溶液(これら標準溶液を用いて検量線を得てよい)、または
d)本発明に係るポリペプチドを希釈するための好適なバッファーのうち少なくとも1つを含んでよい。
以下の定義が導入される。本明細書中および意図される請求項中において用いられる単数形「a」および「an」は、特記されない限り、それぞれの複数形をも含む。
(i)塩基性アミノ酸を別の異なる塩基性アミノ酸で置換すること、
(ii)酸性アミノ酸を別の異なる酸性アミノ酸で置換すること、
(iii)芳香族アミノ酸を別の異なる芳香族アミノ酸で置換すること、
(iv)非極性脂肪族アミノ酸を別の異なる非極性脂肪族アミノ酸で置換すること、および
(v)極性非荷電アミノ酸を別の異なる極性非荷電アミノ酸で置換することからなる群より選択される置換である。
10%ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン含有のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Sigma Aldrich)中において、HeLa細胞を増殖させた。60〜80%コンフルエントにおいて、30mmイメージングシャーレ中の細胞を、適切なプラスミドDNA1.5μgおよびTransFastTMトランスフェクション試薬(Promega)3μgと混合した血清非含有抗生物質非含有培地1mlを用いて、トランスフェクションした。加湿インキュベータ(37℃、5%CO2、95%空気)中において細胞を16〜20時間維持した後、各培養基に再度交換した。すべての実験は、トランスフェクションして24時間後に行なった。バリノマイシンは、Sigma Aldrichから購入し、最終濃度7μMにて使用した。使用した実験用バッファーは、8.0または7.6NaCl、1.44Na2HPO4、0.12NaH2PO4から構成され(g/L)、NaOHを使用し、0.4KCl有りまたはKCl無しのいずれかにおいて、pH7.40としたものである。
デジタル広視野蛍光イメージングシステムであるTiLL iMIC(Till Photonics,Graefelfing、ドイツ)を使用して、蛍光イメージングを行なった。レッドシフトしたFRETに基づくR−GEPIIが480nmにおいて励起され、510〜540nm(Clover、すなわちFRETドナー)および560〜610nm(CloverからmRuby2へのFRET)のそれぞれにおける発光を取り込んだ。CFP/YFPに基づくGEPII 1.0が430nmにおいて励起され、480nmおよび535nmのそれぞれにおける発光を記録した。データ収集およびデジタル蛍光顕微鏡の制御を、ライブ収集ソフトウェア バージョン2.0.0.12(Till Photonics)を使用して行なった。
BONドメインおよび全長Kbpのモデルを、オンラインツールPhyre2(タンパク質相同性/類似性認識エンジンV2.0;http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)を使用して予測した。キメラの予測三次元構造のさらなる分析を、ソフトウェアPyMol viewerを使用して行なった。トンネル予測(tunnel prediction)を、オンラインツールPoreWalker 1.0(http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/software/PoreWalker/)を使用して行なった。
GEPII 1.0およびR−GEPII 1.0ポリペプチドをコードするプラスミドDNA(図2aおよび図2b)を、伝統的なクローニング法によって作製した。GEPII 1.0は、最適化されたCFP/YFP(FRETドナーとしてsECFP、およびFRETアクセプターとしてcpV)のFRETペアを含む(図2aの上パネル)。レッドシフトしたR−GEPII 1.0は、CloverおよびmRuby2(図2aの下パネル、および図2b)を含み、これらはそれぞれ、明るい緑色および赤色のFPバリアントである。CloverおよびmRuby2は、動態が改善された深色性FRETプローブを作製するために、最適化されている。これら2つのプローブを、HeLa細胞において試験した。HeLa細胞は、各プラスミドDNAをトランスフェクションした後、CFP/YFPに基づくGEPII 1.0(図2cの左パネル)またはレッドシフトしたR−GEPII 1.0(図2cの右パネル)のいずれかを発現した。サイトゾルK+濃度([K+]cyto)を制御するために、ジギトニンとK+イオノフォアであるバリノマイシンとの混合物(図2d)またはバリノマイシン単独(図2e)を用いて、細胞を透過処理した。実際、GEPIIのFRET比率シグナルは、K+添加に応答して濃度依存的に増加したが(図2d)、K+を除去するとFRET蛍光は速やかに減少した(図2dおよび図2e)。この実験から、FPおよびkbpに基づくキメラのコンストラクトをこのように設計および作製すれば、K+変化をリアルタイムで読み出せる機能性FRETプローブを作製できることが確認された。
GEPIIのK+感受性を操作するために、Phyre−2およびPyMolソフトウェアを用いた配列分析および相同性三次元モデリングに基づいて、野生型kbpの合理的再設計を行なった。我々の予測および事前データが示したところによると、BONおよびLysMドメインにおける荷電極性アミノ酸をコードする突然変異によって、FRETに基づく各GEPIIのK+感受性が有意に減少した。
GEPII 1.0の突然変異体をコードするプラスミドDNAを、部位特異的突然変異誘発によって作製した。ここで、設計された一塩基多型を有するプライマーを用い、ヘラクレス(herculase)IIポリメラーゼ(Agilent Technologies、Santa Clara、米国)を用いて、PCRをそれぞれ行なった。次いで、各PCR産物を、pcDNA3.1(−)哺乳類発現ベクター中に、制限酵素をそれぞれ用いてサブクローニングした。次いで、各プラスミドDNAによりHeLa細胞をトランスフェクションし、上記例4中に説明されるとおりにEC50を求めた。各ポリペプチドバリアントについての結果を表5中にまとめる。
グリシン残基およびセリン残基を含むリンカー配列を含む本発明に係るポリペプチドをコードするプラスミドを、各リンカーを構成するアミノ酸をコードするよう設計したフォワードプライマーとリバースプライマーの対を用いて作製した。フォワードプライマーは、オーバーハング伸長PCRを行なうことによって野生型LysMドメインを5’オーバーハングにより伸長してリンカーを形成するよう設計した。リバースプライマーは、野生型BONドメインを結合して、同じリンカーを3’末端に形成するよう設計した。次いで、さらにPCRを行なうことによってこれら2つのPCR産物を融合し、pcDNA3.1(−)ベクター中の、mseCFPをコードするヌクレオチド配列とcpVをコードするヌクレオチド配列との間にサブクローニングした。最終的に得たコンストラクトは、KbpのBONドメインとLysMドメインとの間にフレキシブルなリンカーを有する、CFP/YFPのFRETに基づく新規のGEPIIバリアントをコードする。
8.BONドメインとLysMドメインとの間にリンカーを含むポリペプチドバリアントのFRET検出
アミノ酸置換およびリンカー配列を含む本発明に係るポリペプチドをコードするプラスミドを、各リンカーを構成するアミノ酸をコードするよう設計したフォワードプライマーとリバースプライマーの対を用いて作製した。フォワードプライマーは、オーバーハング伸長PCRを行なうことによってΔLysMドメイン(ΔLysM GEPII 1.0を参照)を5’オーバーハングにより伸長してリンカーを形成するよう設計した。リバースプライマーは、野生型BONドメインを結合して、同じリンカーを3’末端に形成するよう設計した。次いで、さらにPCRを行なうことによってこれら2つのPCR産物を融合し、pcDNA3.1(−)ベクター中の、mseCFPをコードするヌクレオチド配列とcpVをコードするヌクレオチド配列との間にサブクローニングした。最終的に得たコンストラクトは、BONドメインとΔLysMドメインとの間にフレキシブルなリンカーを有する、CFP/YFPのFRETに基づく新規のGEPIIバリアントをコードする。
遺伝学的にコードされたプローブの大きな利点として、こうしたプローブを細胞の小器官およびサブドメインへ正確に標的指向化できるという点がある。したがって、GEPIIの標的指向化により、K+レベルおよび動態の定量化を、高い空間および時間分解能にて実施可能となる。標的指向化できるK+プローブがないために、細胞内K+流動についての現時点での我々の理解は、具体性を欠いている。
上述される異なるGEPIIバリアントを、petM11細菌発現ベクター中にクローニングした。GEPIIをコードする細菌発現プラスミドをケミカルコンピテントDH5α細菌中に形質転換した後、細胞をLB寒天プレート上で培養して、単一コロニーを得た。単一コロニーを含む前培養を一晩培養し、次いで、37℃の新しいLB培地1L中に接種した。光学濃度0.7が観察されたら、IPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)を添加して最終濃度0.5mMとすることによってタンパク質発現を誘導し、細胞を室温でさらに培養した。次いで、発現したGEPIIを細菌細胞から細胞溶解によって抽出し、アフィニティクロマトグラフィーによってさらに精製した。カラムからの溶出には、イミダゾールを用いた。GEPIIを含有する溶出液を、triton X 100(0.05%)含有のHEPESバッファー溶液で希釈した。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーにより、組換えGEPIIの抽出を確認した。蛍光プレートリーダーを用いたFRET測定によって、組換えポリペプチドのFRET比率シグナルがNa+およびCa2+の影響を受けないことが示された。一方、各イオン3mM添加に応答した精製GEPIIのFRET比率シグナルの増加幅は、K+添加時の方が、Rb+およびCs+添加時よりも大きかった(図5を参照)。
予備実験において、図6A中に記載される実験構成により、上述される精製GEPII 1.0を用いてマウス血清中のK+を求めた。求めた血清K+濃度は6.63±0.34mM(SD、n=5、図6)であったが、この濃度は、発表されているデータとよく合致する。重要なことには、血液採取法(顔面静脈または眼窩)およびマウス血清中におけるGEPIIの安定性とは独立して、再現性および反復性が極めて高く(図6)、このことから、生物学的プローブ中のK+をGEPIIを用いて求める方法は、非常にしっかりとした正確な方法であることが示された。
また、精製GEPII 1.0を用いて、(マルチウェル)細胞培養プレートにおける細胞外K+濃度を動的に記録し、細胞生存力および細胞死の尺度とした。細胞をグルコースまたは2−デオキシグルコース(2−DG)のいずれかを含有する培養基中に維持しながら、細胞外にある組換えGEPII 1.0のFRET比率シグナルを1時間毎に測定した。図7中に示すように、10mMグルコース存在下におけるコントロール細胞の上清中の細胞外K+濃度は、細胞を50μMジギトニンで透過処理するまで、経時的に一定のままであった。一方、精製GEPII 1.0のFRET比率シグナルは、細胞を2−DGで処理した場合に経時的に大きく増加したが、このことから、代謝が危機的状態にあることが示された。代謝が危機的状態になると、細胞内K+の急速な減少につながる。こうした知見から、培養中の細胞によるK+放出の測定が細胞生存力のリアルタイムでの読み出しに相当するということが、さらに強調される。
Claims (25)
- ポリペプチドであって、
a)第1のシグナル伝達ドメインと、
b)カリウムセンサとを含み、前記カリウムセンサは、
b1)配列番号1の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第1のドメインと、
b2)配列番号2の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第2のドメインとを含み、
前記カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、前記第1のシグナル伝達ドメインは、正電荷を帯びたカリウムイオンが前記カリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる、ポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドであって、
a)第1のシグナル伝達ドメインと、
b)カリウムセンサとを含み、前記カリウムセンサは、
b1)配列番号1の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第1のドメインと、
b2)配列番号2の配列との同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第2のドメインとを含み、
さらに、
c)第2のシグナル伝達ドメインとを含み、
前記カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、前記第1のシグナル伝達ドメインと前記第2のシグナル伝達ドメインとは、正電荷を帯びたカリウムイオンが前記カリウムセンサに結合すると、連携して、検出可能なシグナルを生成できる、請求項1に記載のポリペプチド。 - 前記カリウムセンサは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第1のドメインのためのアミノ酸配列として、D41N、D43N、D51N、D59N、E64Q、D83N、D84N、Q26R、N35Q、N75Q、またはG52Dのアミノ酸置換のうち少なくとも1つを有する配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第1のドメインのためのアミノ酸配列として、Q26R、N35Q、N75Q、G52Dの置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第2のドメインのためのアミノ酸配列として、D104N、E125Q、D135N、N116Q、N118Q、N121Q、またはN127Qのアミノ酸置換のうち少なくとも1つを有する配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第2のドメインのアミノ酸配列として、D104N、E125Q、D135Nの置換を有する配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、さらに、リンカーアミノ酸配列−GGGG−を少なくとも1つ、または式(I)のリンカー配列を少なくとも1つ含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド:
−(GGS)x(GGGGS)y(GG)z− (I)
式中、
xは整数0または1であり、
yは整数1〜6であり、
zは整数0または1である。 - yは2、3、または5である、請求項8に記載のポリペプチド。
- 前記リンカーアミノ酸配列は、前記カリウムセンサの第1のドメインのアミノ酸配列の後ろで、かつ、前記カリウムセンサの第2のドメインの前に位置する、請求項8または9に記載のポリペプチド。
- 前記第1のシグナル伝達ドメインと前記第2のシグナル伝達ドメインとのペアは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーとアクセプターのペア、分割型酵素(split−enzyme)のペア、または分割型蛍光タンパク質(split−fluorescent protein)のペアからなる群より選択され、前記第1のシグナル伝達ドメインおよび前記第2のシグナル伝達ドメインは1つのペアの各部分であり、好ましくは、前記第1のシグナル伝達ドメインおよび前記第2のシグナル伝達ドメインはFRETのドナーとアクセプターのペアである、請求項2〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記FRETのドナーとアクセプターのペアは、シアン蛍光タンパク質(CFP)ドメイン、および、循環置換venus(circularly permuted venus)(CPV)などの黄色蛍光タンパク質(YFP)ドメインである、請求項2〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記FRETのドナーとアクセプターのペアは、CloverおよびmRuby2である、請求項2〜11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記第1のシグナル伝達ドメインは、蛍光タンパク質ドメインであり、好ましくはCFPドメインである、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号10、配列番号11、または配列番号12の配列との同一性が少なくとも80%である配列を含む、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードし、真核生物または原核生物の遺伝子発現に好適な、ベクター。
- 請求項15もしくは16に記載のポリヌクレオチド、請求項17に記載のベクター、および/または請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む細胞。
- 試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための方法であって、
a)請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドを提供する工程、
b)請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドを前記試料と接触させる工程、
c)前記第1のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程、ならびに/または
d)前記第1のシグナル伝達ドメインおよび前記第2のシグナル伝達ドメインが連携して生成したシグナルを測定する工程を含み、
前記試料との接触後に生じるシグナル強度の変化により、前記試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法。 - 前記工程c)および/またはd)において測定されるシグナルは、蛍光シグナル、発色シグナル、またはFRETシグナルである、請求項19に記載の方法。
- 測定される前記シグナルはFRETシグナルである、請求項19または20に記載の方法。
- 前記FRETシグナルは、約470nm〜約490nmの範囲の波長を有する光による励起ならびに/または約510nm〜520nmおよび590nm〜約610nmの範囲の光の発光の後に測定される、請求項21に記載の方法。
- 前記工程a)において、前記ポリペプチドの提供は、(i)請求項15もしくは16に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項17に記載のベクターを用いて、少なくとも1つの真核細胞をヒトもしくは動物の生体外でトランスフェクションすることもしくは原核細胞を形質転換すること、または(ii)請求項18に係る細胞を提供することを含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための、請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するためのキットであって、
a)請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチド、
b)請求項15もしくは16に記載のポリヌクレオチドまたは請求項17に記載のベクター、および/または
c)請求項18に記載の細胞のうち少なくとも1つを含む、キット。
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