CN1894582A

CN1894582A - 金属离子介导的荧光超猝灭分析、试剂盒以及试剂

Info

Publication number: CN1894582A
Application number: CN 200480037075
Authority: CN
Inventors: 夏文胜; 弗劳克·里尼斯兰德; 西瑞兰姆·库马尔阿斯万; 斯图尔特·库顺; 卢良德
Original assignee: QTL Biosystems LLC
Current assignee: QTL Biosystems LLC
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2004-12-13
Publication date: 2007-01-10

Abstract

描述了用于激酶、磷酸酯酶和蛋白酶酶活性的试剂和分析，该试剂和分析使用金属离子－磷酸盐配体的特异性结合和荧光聚合物的超猝灭。该分析应用肽和蛋白底物，为激酶、磷酸酯酶和蛋白酶酶活性测定提供了普遍性平台。也描述了基于DNA杂交的试剂和分析以及应用适体、抗体和其它配体的用于蛋白的试剂和分析。

Description

金属离子介导的荧光超猝灭分析、试剂盒以及试剂

背景

本申请要求2003年12月12日提交的序列号为60/528,792的美国临时专利申请；2004年3月8日提交的序列号为60/550,733的美国临时专利申请；和2004年8月27日提交的序列号为60/604,813的美国临时专利申请的优先权。上述申请中每一申请均在此全文引入作为参考。

技术领域

本申请通常涉及用于检测生物分子的试剂、试剂盒和分析方法，特别涉及将金属离子结合与荧光聚合物超猝灭组合的用于检测生物分子的试剂、试剂盒和分析方法。

技术背景

酶联免疫吸附分析(即ELISA)是最广泛应用且公认的，用于对广泛的蛋白质、抗体、细胞、病毒等等的存在和生物活性进行鉴别的技术。ELISA是一个多步骤的“三明治分析”，其中分析物生物分子首先与附着在表面上的抗体结合。然后第二抗体结合该生物分子。在一些情况下，第二抗体附着在催化酶上，该催化酶随后“发展”放大反应。在其它情况下，第二抗体被生物素化以结合第三蛋白(例如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素)。此蛋白质或者附着在引起化学级联反应而放大比色变化的酶上，或者附着在用于荧光标记的荧光团上。

尽管其被广泛应用，但ELISA仍存在许多缺点。例如，由于该多步法要求精确的控制试剂和发展时间，因此其费时且具有“假阳性”倾向。另外，必须要求仔细的清洗以除去非特异性的吸附试剂。

荧光共振能量转移(即FRET)技术用于基于聚合酶链式反应(PCR)的基因序列分析和免疫分析。FRET应用分析物生物分子的同种(homogeneous)结合以活化染料的荧光，该荧光在基态(off-state)时猝灭。在FRET技术的常规例子中，荧光染料连接到抗体上(F-Ab)，此二联体(diad)结合到与猝灭剂偶联的抗原(Ag-Q)。该结合复合物(F-Ab:Ag-Q)通过能量转移来猝灭(即非荧光性)。在同样的未束缚至Q的分析物抗原(Ag)存在的情况下，该Ag-Q二联体被定量置换，该置换通过由相对浓度[Ag-Q]/[Ag]确定的平衡结合可能性来测定。这限制了FRET应用于抗原已被充分表征(well-characterized)的定量分析，而且对每一种新情况，必须解决将抗原连接至Q的化学方法。

其它FRET底物及分析在美国专利第6,291,201号，以及下列文章中公开：Anne等人“用于测定肉毒杆菌B型神经毒素蛋白酶活性的高通量荧光分析”(High Throughput Fluorogenic Assay for Determination ofBotulinum Type B Neurotoxin Protease Activity)，Analytical Biochemistry(分析生物化学)，291，253-261(2001)；Cummings等人“用于炭疽杆菌致死因子蛋白酶的基于肽的荧光共振能量转移分析”(A Peptide BasedFluorescence Resonance Energy Transfer Assay for Bacillus Anthracis LethalFactor Protease)，Proc.Natl.Acad.Scie.99，6603-6606；Mock等人“炭疽杆菌致死活性因子的快速筛选进展”(Progress in Rapid Screening of BacillusAnthracis Lethal Activity Factor)，Proc.Natl.Acad.Sci.，99，6527-6529(2002)；Sportsman等人Assay Drug Dev.Technol.，2004，2，205；和Rodems等人Assay Drug Dev.Technol.，2002，9。

其它应用分子内猝灭的荧光底物的分析方法在以下文章中公开：Zhong等人“用于大肠杆菌前导肽酶的内部猝灭的荧光底物的发展”(Development of an Internally Quenched Fluorescent Substrate forEscherichia Coli Leader Peptidase)。Analytical Biochemistry 255，66-73(1998)；Rosse等人“应用组合多肽库的新蛋白酶底物的快速鉴别”(RapidIdentification of Substrates for Novel Proteases Using a CombinatorialPeptide Library)，Comb.Chem.，2，461-466(2000)以及Thompson等人“用于测定钙蛋白酶及其它蛋白酶活性的BODIPY荧光微板分析”(ABODIPY Fluorescent Microplate Assay for Measuring Activity of Calpainsand Other Proteases)，Analytical Biochemistry，279，(2000)。

分析方法也得到了发展，其中荧光偏振已被测量并用于定量分析分析物的量。参见，例如Levine等人“应用荧光偏振测定特异性蛋白酶活性”(Measurement of Specific Protease Activity Utilizing FluorescencePolarization)，Analytical Biochemistry 247，83-88。也见Schade等人“BODIPY-a-酪蛋白，用于使用荧光偏振的蛋白酶分析的不依赖于pH的蛋白底物”(BODIPY-a-Casein，a pH-Independent Protein Substrate forProtease Assays Using Fluorescence Polarization)，Analytical Biochemistry243，1-7(1996)。

然而，仍然需要以高灵敏度、快速并准确地检测和定量诸如酶和核酸的生物学相关分子。

发明概述

根据第一实施方案，提供了复合物，其包含：

生物素化的多肽，其中该多肽包含一个或多个磷酸基；及

与该多肽的磷酸基结合的金属阳离子。

根据第二实施方案，提供了检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或数量的方法。此实施方案的方法包括：

a)将样品与生物素化的多肽孵育，其中，对于激酶分析物，所述多肽包含一个和多个可被该分析物磷酸化的基团，或者，对于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一个或多个可被该分析物脱磷酸化的基团；

b)向所述样品加入金属阳离子，其中或者该金属阳离子是猝灭剂，或者该方法还包括向该样品加入可与该金属阳离子结合的猝灭剂；

c)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭(superquenching)，其中该荧光剂结合到生物素结合蛋白；以及

d)检测荧光，

其中所检测的荧光表示该样品中分析物的存在和/或数量。

根据第三实施方案，提供了筛选作为激酶或磷酸酯酶活性抑制剂的化合物的方法。此实施方案的所述方法包括：

a)在所述化合物的存在下，在样品中将生物素化的多肽与激酶或磷酸酯酶孵育，其中，对于激酶分析，该多肽包含一个或多个可被所述分析物磷酸化的基团，且对于磷酸酯酶分析，该多肽包含一个或多个可被所述分析物脱磷酸化的基团；

b)向所述样品加入金属阳离子，其中或者该金属阳离子是猝灭剂，或者所述方法还包括向所述样品加入可与该金属阳离子结合的猝灭剂；

c)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中所述荧光剂结合到生物素结合蛋白；以及

d)在所述化合物的存在下，检测来自所述样品的荧光；

其中在该化合物的存在下，所检测的荧光量表示该化合物对激酶和磷酸酯酶活性的抑制作用。

根据第四实施方案，提供了生物轭合物，其包含：

含有一个或多个可磷酸化或可脱磷酸化基团的多肽；及

与该多肽轭合的猝灭部分。该猝灭部分可以是若丹明(rhodamine)或其它具有相似光谱特性的染料。

根据第五实施方案，上述的生物轭合物还可包含一个或多个磷酸基和剪切位点，其中所述猝灭部分和所述磷酸基位于所述剪切位点的相反侧。优选地，在该剪切位点的与该猝灭部分轭合的一侧不存在磷酸基。

根据第六实施方案，提供了检测样品中蛋白酶存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与上述包含剪切位点和一个或多个磷酸基的生物轭合物孵育，其中所述蛋白酶在该剪切位点剪切该多肽；

b)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭部分与该荧光剂结合时，该猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基结合；以及

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光表示该样品中蛋白酶的存在和/或数量。

根据第七实施方案，提供了用于检测样品中激酶或蛋白酶分析物的存在和/或数量的试剂盒，该试剂盒包括：

包含上述生物轭合物的第一组分；和

包含荧光剂的第二组分，该荧光剂包含多种彼此结合的荧光物质，使得当所述生物轭合物的猝灭部分与该荧光剂结合时，该猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基相结合。

根据第八实施方案，提供了检测样品中酶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与上述生物轭合物孵育，其中该生物轭合物的多肽包含可被所述酶分析物磷酸化或脱磷酸化的基团；

b)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭部分与该荧光剂结合时，该猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基相结合；以及

c)检测来自该样品的荧光；

其中所检测的荧光表示该样品中分析物的存在和/或数量。

根据第九实施方案，提供了用于检测样品中分析物存在的试剂盒，该试剂盒包括：

包含猝灭剂的第一组分，和

包含生物素化的多肽的第二组分，其中该多肽可被所述分析物修饰，且由该分析物修饰的多肽与该猝灭剂结合。

根据第十实施方案，提供了检测样品中磷酸二酯酶的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与包含与环AMP(磷腺苷)或环GMP(磷鸟苷)轭合的猝灭剂的生物轭合物孵育；

b)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基相结合；以及

c)检测来自该样品的荧光；

其中所检测的荧光表示该样品中磷酸二酯酶的存在和/或数量。

根据第十一实施方案，提供了检测多肽底物的激酶活性的方法，该方法包括：

a)将所述多肽底物和猝灭剂标记的包含一个或多个磷酸基的多肽与包含激酶的样品孵育；

c)检测来自该样品的荧光；

其中该多肽底物的磷酸化导致荧光的增加；以及

其中所检测的荧光量表示该多肽底物的激酶活性的存在和/或数量。

根据第十二实施方案，提供了检测样品中核酸分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与包含猝灭剂的多核苷酸(polynucleotide)孵育，该猝灭剂与该多核苷酸第一末端区的多肽及该多核苷酸第二末端区的磷酸基轭合，其中至少部分该多核苷酸的第一末端区和第二末端区可杂交在一起形成发夹结构，且位于所述末端区之间的该多核苷酸的中央区包含核酸序列，该核酸序列可杂交至该核酸分析物，从而破坏该发夹结构并导致所述猝灭剂与该多核苷酸的磷酸基分离；

c)检测来自该样品的荧光；

其中所检测的荧光表示该样品中核酸分析物的存在和/或数量。

根据第十三实施方案，提供了检测样品中核酸分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)用猝灭剂标记样品中的核酸；

b)将该样品与多核苷酸孵育，该多核苷酸第一末端区包含磷酸基，其中该多核苷酸包含可杂交至该核酸分析物的核酸序列；

c)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基相结合；以及

d)检测来自该样品的荧光；

其中该核酸分析物与该多核苷酸的杂交导致荧光的减少；且

其中减少的荧光表示该样品中核酸分析物的存在和/或数量。

根据第十四实施方案，提供了检测样品中核酸分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与在末端区包含磷酸基的第一多核苷酸和包含轭合在其末端区的猝灭剂的第二多核苷酸孵育，其中该第二多核苷酸和所述核酸分析物可杂交该第一多核苷酸；

b)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，该猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基结合；以及

c)检测来自该样品的荧光；

其中该核酸分析物与所述第一多核苷酸的杂交导致荧光的增加；且

其中检测的荧光量表示该样品中核酸分析物的存在和/或数量。

根据第十五实施方案，提供了检测样品中多肽分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与在末端区包含磷酸基的核酸适体和包含猝灭剂的多核苷酸孵育，其中该核酸适体可结合到所述多肽分析物；且该多核苷酸可杂交至该核酸适体；

c)检测来自该样品的荧光；

其中该多肽分析物与该核酸适体的结合导致荧光的增加；且

其中检测的荧光量表示该样品中多肽分析物的存在和/或数量。

根据第十六实施方案，提供了复合物，该复合物包括：

包含生物素部分的多肽，其中该多肽的一个或多个氨基酸残基可磷酸化或脱磷酸化；及

轭合到猝灭部分的生物素结合蛋白；

其中该多肽的生物素部分通过蛋白-蛋白相互作用与该生物素结合蛋白结合；且

其中当与荧光剂结合时，该猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭。

根据第十七方案，提供了检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与上述复合物孵育，其中对于激酶分析物，所述多肽包含一个或多个可被该分析物磷酸化的基团，且对于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一个或多个可被该分析物脱磷酸化的基团；

c)检测来自该样品的荧光；

其中检测的荧光量表示该样品中分析物的存在和/或数量。

根据第十八实施方案，提供了检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或数量的方法，该方法包括：

a)将所述样品与生物素化的多肽孵育，对于激酶分析物分析，该多肽包含一个或多个可被该分析物磷酸化的基团，或者对于磷酸酯酶分析物分析，该多肽包含一个或多个可被该分析物脱磷酸化的基团；

b)向所孵育的样品加入与猝灭部分轭合的生物素结合蛋白；

c)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭部分与该荧光剂结合时，该猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基相结合；以及

d)检测来自该样品的荧光；

其中所检测的荧光表示该样品中分析物的存在和/或数量。

附图的简要说明

图1A和1B表示可用于金属离子介导的荧光超猝灭分析的聚合物的化学结构。

图2是基于金属离子介导的荧光超猝灭的，酶介导的磷酸化或脱磷酸化活性分析的示意图。

图3是若丹明标记的磷酸化肽猝灭镓传感器的Stern-Volmer图。

图4A和4B是显示蛋白激酶A(PKA)分析终点和动力学分析的曲线图。

图5是显示在抑制剂的存在下，蛋白激酶A(PKA)分析反应的曲线图。

图6是表示蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTB-1B)磷酸酯酶分析的EC₅₀值和检测限的曲线图。

图7是显示蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTB-1B)活性抑制的曲线图。

图8是基于金属离子介导的荧光超猝灭的蛋白酶分析的示意图。

图9是基于金属离子介导的超猝灭的，应用蛋白和多肽底物阻断激酶分析的示意图。

图10是显示作为例子的使用PKCα的荧光开启(fluorescence turn-on)阻断激酶分析的曲线图。

图11是应用金属离子介导的超猝灭的磷酸二酯酶分析的示意图。

图12是显示以实时或动力学分析模式监测胰蛋白酶活性的结果的曲线图。

图13表示一个实施方案的磷酸化多肽的检测。

图14是显示根据一实施方案，在使用生物素化肽底物(BT)的分析中，作为蛋白激酶A(PKA)浓度的函数的相对荧光(relative fluorescence)的图。

图15是显示对磷酸化和非磷酸化组蛋白的相对荧光反应的图表。

图16是显示根据另一实施方案，在应用生物素化的肽底物(BT)的分析中，作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)浓度的函数的相对荧光的图。

图17表示的分析中，猝灭剂-连接轭合物(QT)与金属离子和荧光聚合物的整体结合，导致放大的荧光聚合物的超猝灭。

图18是显示用于金属离子介导的超猝灭分析的磷酸肽校准曲线图。

图19显示得自金属离子介导的超猝灭分析的蛋白激酶A浓度曲线。

图20是基于金属离子介导的荧光超猝灭的激酶活性传感器的示意图，该超猝灭通过在第二步骤中加入的链霉抗生物素猝灭剂分子与激酶反应的结合来实现。

图21A和21B是比较采用两步法的、使用生物素化的底物和猝灭剂(即，若丹明)标记的底物的PKA终点分析的图，其中图21A显示作为PKA浓度的函数的RFU，及图21B显示作为PKA浓度的函数的磷酸化％。

图22显示用7种不同的生物素化肽底物进行筛选的结果的棒状图，该生物素化肽底物每个均与3种不同的酶反应(即，PTP-1B、PKCα和PKA)。

详细说明

生物传感的猝灭剂-连接-配体(quencher-tether-ligand)(QTL)途径通过电子和能量传递猝灭剂来利用荧光聚合电解质的超猝灭。所述QTL分析平台利用共轭聚合物的集光能力及其高度离域的激发态，以提供响应极少量电子和能量传递物质存在的放大的荧光信号调节。该新技术通过将该信号调节现象与抗原受体、底物-酶和寡核苷酸-寡核苷酸结合相互作用相联系，应用于蛋白、小分子、肽、蛋白酶和寡核苷酸的高灵敏度检测[1-9]。

在一种方法中，所述荧光聚合物，P，与生物素结合蛋白协同定位于溶液中或固体载体上，并通过生物素-生物素结合蛋白相互作用与猝灭剂-连接-生物素(QTB)生物轭合物形成关联复合物。该QTB生物络合物包括通过反应性链(reactive tether)与生物素偶联的猝灭剂Q，该猝灭剂强烈地结合与所述聚合物P协同定位的生物素结合蛋白。该QTB生物轭合物与靶分析物的反应以易检测的方式修饰该聚合物的荧光。

如本发明所述，开发了将所述QTL生物轭合物与荧光聚合物结合的可选择方式，该方式利用作为溶液中的个体分子或载体上的组件的荧光聚合电解质的自我组织能力来与金属离子络合。因此所络合的金属离子可选择性地与结合在所述QTL生物轭合物内的配位基团(例如，磷酸基)结合，因而提供了选择性检测，例如，蛋白、小分子、肽、蛋白酶、激酶、磷酸酯酶和寡核苷酸的基础[10-11]。

受体分子(即，猝灭剂)可猝灭供体分子效力的有效性依赖于两个实体分开的距离。在构建分析(constructing assay)中，分子链接(tethering)(将受体和供体结合)可通过诸如共价键的常规策略和生物素-亲和素的相互作用来完成。因为共价键直接将所述猝灭剂置于所述受体上使其形成一个分子，所以是用于共振能量转移的良好途径。因此两者之间的距离可小至单键的长度。另一方面，因为几乎任何的分子均可共价连接到生物素，所以生物素和诸如抗生物素蛋白的生物素结合蛋白(BBP)的相互作用提供广泛的多样性。但是，生物素结合蛋白通常大于60千道尔顿，因此当所述受体和供体通过生物素-BBP相互作用结合时，该受体和供体间的距离是明显的。

作为生物素-BBP相互作用的常规置换，我们提出了用于在超猝灭分析中将受体和供体协同定位的金属离子磷酸盐相互作用。因为许多分子可被磷酸化，因而作为生物素-BBP相互作用的置换，该策略通常是可应用的。另外，因为所述链的端点到端点的距离(即，金属离子与磷酸盐间的配对距离(coordination distance))明显较短，所以该策略改进了生物素-抗生物素蛋白相互作用。金属离子对诸如磷酸基的配体的亲合性显著低于生物素-BBP相互作用(Ka＝10^5-7对10^13-15)。

根据第一实施方案，提供了包含与金属离子络合的荧光聚合电解质的新传感器，该荧光聚合电解质或者作为溶液中的个体分子或者作为载体上的组件。该传感器的金属离子还可选择性地与结合在QTL生物轭合物内的配体(例如，磷酸基)结合，并为上述同类分子(例如，蛋白、小分子、肽、蛋白酶、激酶、磷酸酯酶和寡核苷酸)的选择性检测提供了基础，该选择性检测包括但不限于终点和动力学方式。如下文所述，对于一些分析，所述配位基-金属离子结合提供了生物素-生物素结合蛋白结合的替代方法。在其它实施例中，该配位基附着在QTL的猝灭部分上或被从其中除去，从而提供传感器荧光的猝灭或恢复(或两者)。

本发明所述的各种实施方案应用荧光聚合物-QTL超猝灭和金属离子-磷酸配体特异性结合来提供改进的激酶、磷酸酯酶和蛋白酶活性分析。金属离子介导的荧光聚合物超猝灭提供了应用肽和蛋白底物来测定激酶、磷酸酯酶和蛋白酶活性的通用平台，及用于实施基于DNA杂交的分析和应用适体、抗体和其它配体的蛋白分析的更通用的途径。

聚(苯撑亚乙炔)(poly(phenylene-ethynylene))(PPE)家族的共轭的聚合物可制备成在芳环上附加有各种官能团。合成的具有侧链(pendant)阴离子基的聚合物如图1A和1B中所示。图1A显示了磺基(sulfo)聚对苯撑乙炔(PPE-Di-COOH)共轭聚合物的分子结构。图1B显示了磺基聚对苯撑乙炔(PPE)共轭聚合物的分子结构。在水中，这些聚合物均可与阳离子微球结合形成稳定的聚合物包衣。该聚合物包被的微球显示强烈的荧光。该聚合物包被的微球上的全部电荷可通过聚合物装载程度的变化及聚合物结构的改变来调节。

已发现，荧光聚合物包被的微球可与金属阳离子结合，以及金属离子的负载可能依赖于该微球上所述聚合物的负载水平。某些诸如Fe³⁺和Cu²⁺的金属离子可猝灭该聚合物的荧光，而其它诸如Ga³⁺的金属离子不猝灭。在一些实施方案中，在不含该金属离子则极少或无猝灭发生的条件下，Ga³⁺用于介导微球结合的聚合物荧光的超猝灭。

例如，包含染料的磷酸化肽：

若丹明-LRRA(pS)LG SEQ ID NO：1

其中pS指磷酸化的丝氨酸，该磷酸化肽应为所述聚合物的良好的能量转移猝灭剂，但发现其极少或不猝灭聚合物包被的微球的荧光。在该聚合物包被的微球通过Ga³⁺的添加被“装载(charged)”后，但是，向该悬浮液加入相同的肽导致该聚合物荧光的显著猝灭。相反，只包含磷酸化残基或所述猝灭剂染料的肽，例如如下所示的肽：

若丹明-LRRASLG SEQ ID NO：2

在相同的条件下，对该聚合物荧光产生很小的作用。磷酸化生物分子与所述金属离子荷电的聚合物间的特异结合是下述多种分析的基础。

图2示意性地显示了基于金属离子介导的超猝灭的传感器，该传感器可用于激酶或磷酸酯酶活性分析。图2显示了如何通过加入所述QTL传感器来检测靶酶(target enzymes)对若丹明肽底物的磷酸化或脱磷酸化。用若丹明猝灭剂来标记所述肽产物，并利用结合到Ga³⁺金属离子的特异性磷酸盐将其带至所述聚合物表面。所发生的聚合物荧光猝灭伴随着该多肽底物的磷酸化或脱磷酸化。这类分析可用于缓和生物底物的磷酸化或脱磷酸化的酶，该生物底物包括，但不限于肽、蛋白、类脂、碳水化合物和核苷或小分子。

激酶/磷酸酯酶分析

蛋白的磷酸化和脱磷酸化介导了细胞代谢、生长、分化和细胞增殖的调节。酶功能的畸变可导致诸如癌症和炎症的疾病。超过500个激酶和磷酸酯酶被认为参与了细胞活动的调节，许多激酶和磷酸酯酶是用于药物治疗的靶标。

蛋白激酶A(PKA)是cAMP依赖的蛋白激酶，且作为诸如激素和神经递质的众多cAMP-升高(elevating)第一信使的效应器发挥功能。PKA的普遍分布及其灵活的底物识别特性使PKA在活细胞的许多过程中成为重要因素，例如淋巴细胞增殖和免疫应答的抑制、在海马和感觉神经传递中长期抑制的介导。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)最近发现为胰岛素信号途径的负调节物，这表明PTP-1B的抑制剂可有益于2型糖尿病的治疗。

在激酶中，存在着90％磷酸化丝氨酸残基、10％磷酸化苏氨酸残基和0.1％磷酸化酪氨酸残基。虽然可能开发出抗磷酸酪氨酸的抗体、但是抗磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基的抗体具有低亲合性，且通常仅对一种激酶有特异性。目前，基于非抗体的高通量筛选(HTS)分析基于诸如时间分辨荧光(time-resolved fluorescence)(TRF)、荧光偏振分析(FP)，或荧光共振能量转移(FRET)的方法。这些分析需要专门的设备和/或需要忍受作为酶活性函数的低荧光强度变化。

我们寻求通过应用上述超猝灭来放大荧光信号以增强酶活性测量法的灵敏度。所述传感器平台可包含诸如图1A所示聚(苯撑乙炔)(PPE)衍生物的改良的阴离子聚电解质荧光剂。该PPE荧光剂可通过吸附在荷正电的微球上来固定。该聚合物显示具有高量子效率的光致发光，并用于蛋白酶活性的检测[9]。在该平台中，使用反应性肽序列，该肽序列与N-末端猝灭剂及C-末端生物素侧接(flank)。该肽结合与生物素结合蛋白协同定位的PPE包被的微球，导致近全部的PPE荧光的猝灭。酶介导的所述肽的剪切导致与酶活性成线性关系的荧光猝灭的逆转。已证实单一的能量受体染料可大约猝灭49重复单位/猝灭剂的光致发光[9]。

如图2所示，荧光聚合物超猝灭可适用于激酶/磷酸酯酶活性的生物检测。如图2所示，多价金属离子可强烈地与溶液中的阴离子轭合聚合物结合，导致聚合物荧光的改变和/或猝灭。因为聚合物-微球整体(ensemble)上的总电荷可被调谐，因而这些整体可提供平台，由此金属离子与该聚合物结合，而未强烈地猝灭所述该聚合物荧光，同时保留与特异性配体络合的能力。该途径类似于在固定化金属离子亲和色谱法(IMAC)中应用的途径，因此在低pH值下，金属离子可通过与磷酸盐中的氧配位来特异地捕获磷酸化的化合物。参见，例如，Morgan等人，AssayDrug Dev.Technol.，2004，2，171。

如本发明所述，镓可与荧光剂(包括，但不限于，诸如图1A和1B所示的那些阴离子轭合聚合物和其它包含多种荧光物质的荧光剂)相结合，而不猝灭所述聚合物发光。该镓可以单体Ga³⁺或诸如聚氧类(polyoxospecies)的多聚整体形式存在。荧光剂结合的镓也可与磷酸化的肽结合，从而当所述肽包含诸如若丹明的染料时，发生金属离子介导的聚合物超猝灭。该荧光剂可与诸如微球的固体载体的表面结合。如图2所示，该途径为灵敏和选择性的激酶/磷酸酯酶分析提供了基础。

对于荧光猝灭(关闭)激酶分析，聚合物荧光的猝灭与酶活性成线性关系。如以下实施例所述，该分析可在近生理pH值下完成，并具有构建实时分析或终点分析的灵活性。该分析是瞬时的，“混合并读数”且无需洗涤步骤或制备复杂样品。

以下实施例1显示了蛋白激酶A(PKA)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTB-1B)酶活性的粗略分析。在底物转化10-20％时，该分析常规地输送大于0.9的Z′值。在如下所示的实施例中，该激酶分析提供作为酶活性函数的荧光信号衰减，而该磷酸酯酶分析提供随酶活性增加而增强的信号。因为，对于诸如SEQ ID NO：1的肽，作为聚合物荧光猝灭的结果，所述猝灭剂可显示敏化荧光，所以该分析可显示相同样品中的信号增强或减少，这依赖于检测的波长度。因此，可产生比率(ratiometric)测量方法。此外，检测可通过监测所述肽的猝灭剂中的荧光偏振来完成。对于基于金属离子介导的超猝灭的蛋白激酶、磷酸酯酶和蛋白酶分析，可完成终点分析和动力学分析。

实施例1蛋白激酶A(PKA)和酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)的活性分析

以下肽用作酶底物及用作磷酸肽的校准物。

对PKA活性检测：

若丹明-LRRASLG SEQ ID NO：2

和校准物肽：

若丹明-LRRA(pS)LG SEQ ID NO：1

均由Anaspec合成。

对磷酸酯酶活性检测：

若丹明-KVEKIGEGT(pY)GVVYK SEQ ID NO：3

和校准物肽：

若丹明-KVEKIGEGTYGVVYK SEQ ID NO：4均由美国肽公司合成的。

重组PKA购自Promega。酶PTP-1B和抑制剂PK682购自Biomol。PKA的十字孢碱抑制剂购自Sigma。聚苯乙烯胺功能化的小珠(bead)得自界面动力学公司(Interfacial Dynamics)。

传感器珠的性能通过将15μl位于分析缓冲液中的1μM肽溶液(若丹明-磷酸肽或者若丹明-非磷酸化肽)加入到15μl位于检测缓冲液中的传感器中来确定。该混合物的荧光应用SpectraMax Gemini XS平板读数器(分子仪器有限公司(Molecular Devices，Inc.))，借助450nm激发、475nm截止滤光片和490nm发射以孔扫描模式来测定。

基于在溶液中，二价或三价金属离子可强烈地与诸如图1A和1B所示的阴离子聚合物结合这一发现，选择结构如图1A所示的聚合物作为用于激酶/磷酸酯酶分析的传感器。当GaCl₃以340μM浓度加入到包含PPE-Di-COOH包被的微球的溶液中时，未观察到发射的猝灭。在更高的GaCl₃浓度观察到荧光发射的猝灭。但是，当使用最佳浓度的Ga³⁺时，发现若丹明标记的磷酸肽提供强烈的聚合物荧光猝灭，而当使用未磷酸化若丹明标记的肽时，观察到很少的荧光调节。

图3显示得自若丹明标记的PTP-1B磷酸肽底物的Stern Volmer图。该Stern Volmer常数(K_sv)提供了猝灭的定量测定，其中F_o是无猝灭剂时的荧光强度，以及F是猝灭剂存在时的荧光强度。

本发明所测定的K_sv相对较大(即，2×10⁷M^-1)。50％猝灭剂提供(PRU/Q)50＝50，这证明超猝灭的发生。

如上所示，通过应用猝灭剂标记的底物开发了分析方法。所述底物磷酸化时，所述肽通过磷酸基与所述传感器结合并猝灭荧光。因为所述金属离子配位基特异性地结合磷酸盐、所以可检测磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸残基。

下文描述了基于荧光超猝灭的，用于丝氨酸和酪氨酸酶，即蛋白激酶A(PKA)和蛋白酪氨酸磷酸酶1-B(PTP-1B)的分析方法。

图4A显示PKA酶活性的终点测定，在该终点测定中聚合物猝灭的增加与酶浓度相关。不同于需要非常低pH值的Fe³⁺配位分析，该平台在近生理学pH值时具有功能，因此允许研究者灵活地选择进行实时分析或终点分析。与图4B所示的终点分析相比，包括作为酶反应混合物一部分的检测器混合物的实时分析对50％底物磷酸化需要高近10倍的酶浓度。

所述分析的灵敏度通过使用公知的PKA活性抑制剂，十字孢碱来测定。图5显示了所得结果。如图5所示，在与6.5μM ATP和200mU PKA的反应中，应用1μM底物获得的IC₅₀为59mU，并与公开的值(18.4mU)相符。

与用于PKA的模式相比，对用于检测蛋白酪氨酸磷脂酶1B(PTP-1B)对不同长度和序列组成的肽底物的活性的模式进行了测试。图6显示了作为终点分析测定的或对125nM底物使用PTP-1B而实时测定的EC₅₀和酶浓度曲线的优势对数(LOD)的结果。应用公知的抑制剂RK-682的抑制剂曲线产生了26.4nM的良好IC₅₀值。

可用此分析传递(delivered)的统计学参数通过在8次重复中评估公知量的磷酸肽校准肽来确定(图6)。所述数据是良好的，且显示该分析适用于测定少至5-10％的底物转化，Z′因子分别为0.8和0.9。

该PKA分析的性能与商业可用的FRET分析、ATP消耗分析和基于IMAC的分析进行比较。实施所有的分析以产生酶浓度曲线中的最佳性能，并且如果可能，在所有分析中使用相同的肽。该基于IMAC的分析传递了酶浓度曲线中最低的灵敏度(1ng比20pg)。相对于当前模式中的1∶50，在原理上最接近于所述QTL光速^TM(QTL Lightspeed^TM)分析的本发明所述分析中，传感器对检测器的比为1∶1。这些结果清楚证明用超猝灭可获得增加的灵敏度。

开发了应用对Akt-1和PKCα的底物的其它分析。当使用这些不同的底物时，未观察到明显的荧光猝灭对底物长度或肽序列含量的依赖性。在这点上，所述金属离子介导的超猝灭分析可视为具有普遍性，并对FRET肽具有主要优势，在FPET肽中，猝灭高度地依赖于所述供体和受体间的距离。

蛋白酶分析

蛋白酶剪切其底物上的酰胺键。肽或蛋白底物及金属离子-荧光聚合物整体的应用使得开发了检测蛋白酶活性的高灵敏度的分析方法，该肽或蛋白底物包含在剪切位点任一侧的猝灭剂和磷酸基。

蛋白酶分析的一个实施方案显示于图8中。如图8所示，当完整的底物结合所述传感器时，该传感器的荧光被猝灭剂染料的promixity猝灭。所述酶将该底物剪切成片段，将该猝灭剂与该磷酸基分离，导致该猝灭剂和聚合物的分离。在酶活性的存在下，该分离减少了聚合物荧光的猝灭(即，增强了来自该传感器的信号)。

蛋白酶活性可以同种(homogeneous)或异种(hegerogeneous)的方式来进行实时监测或在终点监测。在同种的实时分析中，所述底物可位于所述聚合物-微球整体的表面。在同种的终点分析中，所述底物和所述酶可在溶液中反应，并在特定孵育期的末尾，可将所述传感器加入该样品中以停止该反应。当荧光染料用作所述猝灭剂时，可比率(ratiometrically)地监测蛋白酶活性。在异种的终点方式中，可使用生物素化的底物，其在剪切位点同一侧包含磷酸基和猝灭剂。剪切后，所述肽物质通过与生物素类的结合来分离，而猝灭剂标记的部分被转移，因而可猝灭该荧光剂。

实施例2基于金属离子介导的荧光超猝灭的蛋白酶分析

在此分析中，胰岛素的肽底物为：

若丹明-LRRApSLG(SEQ ID NO：1)。

胰岛素在两个精氨酸处剪切该肽。本实施例中实施的分析使用以下参数：

微球-荧光剂-镓整体(QTL传感器)；

3μM最终的Rh-LRRApSLG(SEQ ID NO：1)；

1U/μL胰岛素；

40×10⁶微球(MS)/15μL；

λ_ex430；

λ_m490；和

λ_co475nm。

该分析在约22℃下，在384孔的白色平板中进行1小时。分析结果如以下表1所示。

表1 基于金属离子介导的荧光超猝灭的蛋白酶分析结果

单独的QTL传感器不含酶的对照样品	88842777142138
单独的QTL传感器不含酶的对照样品	88842777142138	信号上升背景信号Z′噪音信号	343675.420.689.69

图12的曲线图显示了以“实时”(即，动力学)分析方式对胰岛素活性进行监测的结果。如图12所示，胰岛素活性存在时间依赖的上升。因此，随时间推移发生荧光信号的增强。

应用未标记的肽和蛋白的阻断分析

用于图2所示的上述分析的基础可适用于阻断分析，在该阻断分析中，在不含另外的磷酸化底物时，“一般的”磷酸化染料标记的肽，或者其它包含染料和结合磷酸盐的金属离子(例如，镓)的底物猝灭包含荧光聚合物和金属离子的聚合物珠，但是当肽或蛋白底物被磷酸化时，其被“阻断”。

所述分析的原理如图9所示，图9示意性地阐明基于金属离子介导的超猝灭的阻断激酶分析(blocking kinase assay)。该分析可方便地通过将所述传感器加入孵育后的酶和分析物的混合物中发生反应来进行。如图9所证实，任何磷酸化的分析物与该传感器相结合，而不猝灭所述聚合物荧光。加入所述“一般的”磷酸化染料标记的肽可导致该聚合物荧光的猝灭，其受到所述“阻断”的微球上的“游离”磷酸盐结合位点的范围的限制。该分析用作荧光“开启”分析，并具有其它优点：在开发该分析中，无需先进行所述底物的衍生化。图10显示了利用髓磷脂碱性蛋白(MBP)对PKCα进行阻断分析(“荧光开启”)的实验数据。

与使用如下所述的肽底物相比，激酶对天然蛋白底物的活性检测具有数个优点。

·在518个公知的人类激酶(或2500个亚型)中，仅对约50个激酶建立了肽底物，但是所述靶蛋白在多数情况下均可被识别。一些酶可能需要靶的不连续氨基酸来进行有效的底物识别，结合和磷酸化，在此情况中，人工肽序列难以被构建，即使相关的氨基酸已鉴定。

·认为天然靶蛋白的磷酸化比肽底物的磷酸化更有效。这不仅对(肽底物的)成本很重要，而且使HTS中抑制剂的鉴别更准确。

·天然靶蛋白的磷酸化比人工底物的磷酸化更具有特异性。将来对剖析细胞中的激酶活性的尝试会被肽底物的交叉识别所阻碍，但是对蛋白底物起作用。

·目前用于检测蛋白磷酸化的非放射性和不基于抗体的分析是基于第二酶荧光素酶对ATP的消耗。由于对该第二酶(荧光素酶)的抑制作用，所以在抑制剂筛选中这类分析易于形成假阴性结果。FP分析需要大的分子运动变化以获得信号，因此仅可以检测到小分子量的蛋白。

实施例3

激酶PKCα对髓磷脂碱性蛋白(MBP)的磷酸化可在标准反应中进行，并加入以上实施例2中所述的QTL传感器。凭借特异性磷酸盐结合金属配位离子，磷酸化的MBP结合该QTL传感器，且以浓度依赖性方式抑制染料标记的磷酸肽(示踪器)的结合。所产生的荧光与mbp磷酸化的程度相关。

该原理在以下实施例中所证实。在室温下，在白色384孔的透明平板中，用系列稀释的激酶PKCα酶对1μg浓度的mbp进行磷酸化1小时。孵育后，在约22℃时，加入50×10⁶QTL传感器珠10分钟，随后加入1μM染料标记的肽示踪器。在约22℃时，将平板孵育30分钟，并在双子星XS平板阅读器上(Gemini XS Plate reader，Molecular Devices，Inc.)应用450nm激发，490nm发射和475nm截止滤光片来监测荧光信号。所述荧光“开启”示意性地显示在图9中。

通过金属离子介导的荧光超猝灭监测的磷酸酯酶活性

3’，5’-环核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)包括金属磷酸水解酶家族，该金属磷酸水解酶特异性地裂解环磷酰苷(cAMP)和/或环磷鸟苷(cGMP)的3’键以产生相应的5’-核苷。在哺乳动物组织中已鉴定了对cAMP和cGMP具有不同选择性的11个PDEs家族。

PDEs是细胞cAMP和/或cGMP水平的基本调节剂。环磷酰苷或环磷鸟苷是细胞内第二信使，其在参与重要的细胞过程的细胞内信号转导中起关键作用。PDEs是治疗各种疾病的药物开发的靶点。例如，西地那非(Sidenafil)，PDE5的选择性抑制剂，已商品化为药物(即，伟哥，辉瑞公司注册的商标)。数个PDE4抑制剂作为治疗诸如哮喘疾病的抗炎药物进入临床试验。

如上所述，QTL传感器对磷酸基显示出高亲合力，这在所述激酶和磷酸酯酶分析中证实。所述PDE分析使用染料标记的cAMP或cGMP为底物以分析磷酸二酯酶的活性。染料包括但不限于若丹明、偶氮或荧光素，该荧光素可偶联cAMP或cGMP而不抑制对PDEs的反应性。由于cAMP或cGMP以磷酸二酯形式存在，其并不强烈地结合在镓聚合物的表面上，所以很少有聚合物荧光的初始猝灭。在由PDE催化的水解中，在这些底物上的磷酸二酯被转化为磷酸基。所述染料因而通过镓-磷酸盐的特异性相互作用被带至微球表面附近，导致该聚合物荧光的猝灭。图11描述了磷酸二酯酶分析。

核酸分析

金属磷酸盐介导的结合可用于产生用于DNA和RNA检测的超猝灭分析。可使用众多不同的基于核酸类与靶核酸类的杂交的方法，该靶核酸类可以在溶液中或固定在固体载体上。第一种途径使用在其一个末端处被磷酸化的寡核苷酸。所述磷酸盐允许金属磷酸盐介导的、DNA链(strand)与轭合的荧光聚合物的协同定位。如果磷酸基附着在该寡核苷酸的5’-端，在3’-端上互补的含猝灭剂的靶可杂交该磷酸化的链。该末端也可被逆转而保留功能性系统。在该杂交构象中，所述猝灭剂可被定向于该轭合的聚合物以促进超猝灭。因此，在所述猝灭剂标记的靶存在下，该聚合物的荧光被猝灭。通过允许未标记的和标记的DNA竞争性结合其磷酸化的互补链，这类系统很容易联想到作为对未标记的DNA的分析。

第二种方法的策略类似于分子指示标使用的途径。可设计一端为磷酸盐另一端为猝灭剂的发夹结构的寡核苷酸，使得该寡核苷酸的末端区互补，并形成杂交茎(hybridized stem)，而该寡核苷酸的中央区与靶寡核苷酸互补，而当不存在靶时，形成单链环。这样的寡核苷酸形成“发夹”结构，该发夹结构利用茎杂交，将所述磷酸盐和猝灭剂带至邻近处。当通过磷酸盐与金属的相互作用将所磷酸化的发夹结构的寡核苷酸与所述金属-聚合物复合物结合时，因为所述猝灭剂定向为朝向该聚合物，所以诱导猝灭。如果该磷酸盐/猝灭剂功能化的寡核苷酸与结合该发夹结构环区的靶杂交，则该环区变成可破坏该茎区二级结构的刚性棒。这使所述受体和供体对被迫分开，从而减少所述聚合物的猝灭。

对蛋白和其它靶的直接分析也可通过众多应用DAN适体结合特性的途径来进行。磷酸化的DNA适体可结合至金属包被的轭合的聚合物表面。在所述靶分子的存在下(小尺寸的分子，最多为蛋白大小)，所述寡核苷酸的适体构象应被稳定化(较低的ΔG)。在其选择的靶不存在的情况下，该适体链可具有差的自我结构(self-structure)。如果该适体的自我结构可由猝灭剂标记的互补寡核苷酸穿透，则可产生分析。在这样的分析中，当所述适体的靶不存在时，该互补的寡核苷酸-猝灭剂可杂交该适体。此杂化物可具有上文所列的形式(即，5’-端为磷酸盐，和3’-端为猝灭剂，或反之亦然)，因此该猝灭剂被定向以猝灭所述轭合的聚合物。在所述适体的靶存在的情况下，该适体的自我结构被稳定化，且该寡核苷酸猝灭剂不能够杂交该适体。因此，在所述适体的靶存在的情况下，所述聚合物发荧光，而该适体的靶不存在时，该荧光猝灭。

常规的磷酸盐修饰或消耗

在任何的包含通过任一方法与猝灭剂链接的磷酸盐的系统中，通过化学方法对该磷酸盐进行的修饰可将该磷酸盐转变为另一功能性，因此阻止了磷酸盐-金属介导的对金属-聚合物复合物的结合。同样，该磷酸盐与其它元素的结合可阻止该磷酸盐与金属聚合物的结合。在这些情况中，所述猝灭剂不与所述轭合的聚合物协同定位，并存在荧光。作为一般例子，复合物A，其包含通过任一方法与猝灭剂链接的磷酸盐，可猝灭所述金属聚合物复合物。如果与分子B共同存在时，则复合物A不能够结合并猝灭所述金属聚合物复合物，其中该分子B对复合物A具有亲和性，且包含或者化学修饰或者结合复合物A中所包含的磷酸盐的元素。

应用生物素-链(BT)轭合物的分析、试剂和试剂盒

根据实施方案，提供了用于对靶分析物进行分析的试剂盒。该试剂盒包含两个分离的组分：猝灭剂(Q)和生物素-链轭合物(BT)。该BT轭合物的链(T)可包括，例如，蛋白或多肽底物。根据此实施方案，该链通过与所述靶分析物相互作用并被其修饰获得了与该猝灭剂结合的能力，以形成修饰的链(T’)。在该链的修饰后，由于该BT轭合物与该靶分析物相互作用，接着所修饰的BT轭合物(BT’)与该猝灭剂(Q)结合，所以形成QT’B生物轭合物。所述试剂盒也可包含荧光剂组分(P)。该荧光剂组分包含多个结合的荧光物质，该结合方式使得当猝灭剂与荧光剂结合时，该猝灭剂能够扩大该荧光剂的超猝灭。该荧光剂可与诸如微球、珠或纳米颗粒的固体载体结合。该固体载体也可包含生物素结合蛋白，使得该QT’B复合物上的生物素部分与该固体载体上的生物素结合蛋白相互作用，导致荧光的超猝灭。

如上所述，所述BT轭合物的链可通过与所述靶分析物的结合或反应被识别和修饰，而形成所述BT’轭合物。该链的修饰使所修饰的BT轭合物(BT’)能够结合所述猝灭剂(Q)以形成QT’B复合物。这一事件序列之后可进行所述聚合物荧光的调节。特别地，荧光变化可用于指示样品中靶分析物的存在和/或数量。此外，在所述BT轭合物与酶或其它靶分析物的特异性结合或反应不存在的情况下，P的荧光不受与该BT轭合物结合的影响。因此，也提供了应用上述猝灭剂(Q)和生物素-链轭合物(BT)来测定样品中靶分析物的存在和/或数量的方法。

根据实施方案，所述BT轭合物的链(T)与靶分析物的相互作用可导致该链上猝灭剂-结合组分的除去。在此实施方案中，由于与该分析物的相互作用，该BT轭合物结合该猝灭剂(Q)的能力被消除以形成修饰的轭合物(BT’)。此外，该事件序列之后可进行定量的聚合物荧光的调节。在某些实施方案中，BT与所述靶分析物的反应可被催化，导致放大的聚合物荧光调节。

根据另一实施方案，聚合物超猝灭可通过金属离子来介导。根据此实施方案，QT轭合物(其中Q为电子或能量转移猝灭剂及T是反应性链)可与靶分析物反应以引入、修饰或除去该链上的功能基。该功能基可以是能够与金属离子结合的功能基，该金属离子与荧光聚合物结合或协同定位(例如，在固体载体的表面)。因此所修饰的QT轭合物(QT’)能够与包含该荧光聚合物和该金属离子的整体相结合。因此，该链的修饰导致聚合物荧光的变化。该方法可用于以激酶、磷酸酯酶和其它酶为靶分析物的高灵敏度分析中。

用于翻译后修饰事件的生物检测的基于可修饰链的QTB途径

该途径应用合成的生物素化的肽底物或链(下文称为“BT轭合物”)该链与靶分析物相互作用后被修饰以形成BT’轭合物。在一实施方案中，所述BT轭合物不能够与非荧光的猝灭剂(Q)络合，而修饰的轭合物(BT’)易结合该猝灭剂。这类的相互作用产生荧光“关闭”分析，在该分析中，所述聚合物荧光随底物转化的增加而减少。

在另一实施方案中，所述BT轭合物可易与所述暗猝灭剂(dstkquencher)结合。但是，在与所述靶分析物相互作用以形成所述修饰的轭合物(BT’)后，该BT轭合物失去结合的能力。这类相互作用导致荧光“开启”分析。

在另一实施方案中，上述实施方案中的猝灭剂也可以是荧光部分。将荧光部分用作猝灭剂可提供荧光的敏化发射。在所有这些实施方案中，所述QTB生物轭合物可与聚合物-受体整体形成复合物，以通过所述超猝灭过程有效地调节所述聚合物荧光。

在用于翻译后修饰相互作用的分析中使用的猝灭剂部分包含与所述功能基结合的特性，当非常靠近时，该功能基在所述底物上被修饰并放大所述轭合聚合物的荧光超猝灭。在一实施方案中，所述猝灭剂可以是过渡金属或诸如铁(III)亚氨二醋酸(IDA)型螯合物的有机金属类，其中该三价铁不仅可强烈地与磷酸肽结合而且通过电子转移超猝灭所述荧光聚合物。在另一实施方案中，所述猝灭剂可由两个截然不同的部分组成，一个促进该猝灭剂与所修饰的功能基的结合，另一个通过能量转移引起聚合物猝灭。

所述传感器可包含与固体载体上或溶液中的生物素结合蛋白协同定位的轭合的荧光聚合物。该聚合物可以是带电荷的聚合物、中性聚合物或“虚拟”聚合物，该“虚拟”聚合物包含装配在非轭合骨架上或诸如珠或纳米颗粒的固体载体的带相反电荷的表面上的荧光染料。

用于激酶和磷酸酯酶的生物检测和生物分析的基于可修饰链(QT’B)的途径

所述QT’B模式可用于检测和定量样品中的激酶或磷酸酯酶活性。例如，该分析可用于监测诸如PKA的激酶和诸如PTP-1B的磷酸酯酶分别对生物素化的肽底物的磷酸化和脱磷酸化。QTB模式在激酶或磷酸酯酶活性筛选中的应用如图13所示。

所述QTL传感器可包含与生物素结合蛋白协同定位的、高度荧光的轭合聚合电解质，该聚合电解质或者包被在如图13所示的固体载体(例如，微球)表面，或者作为复合物存在于溶液中。生物素化的肽或公知的由靶激酶(例如，PKA)特异性磷酸化或由靶磷酸酯酶(例如，PTP-1B)特异性脱磷酸化的蛋白底物可用适当的酶孵育特定的时间。

如图13所示，可将未磷酸化的BT轭合物加入样品中，并与样品孵育以监测激酶活性。该轭合物与该样品孵育后，向该样品中加入所述聚合物传感器和猝灭剂，导致聚合物荧光的猝灭。荧光的减少是酶活性的线性函数。

图14是应用QT’B分析的蛋白激酶A(PKA)活性测量图。在图14中，荧光(RFU)作为PKA浓度(mU/孔)函数来绘图。如图14所见，PKA浓度的增加导致荧光的减少。

图15是应用全蛋白底物，组蛋白1的蛋白激酶C活性检测图。如图15所见，与磷酸化的组蛋白底物(1)相比，对于未磷酸化的组蛋白底物(2)观察到较低水平的聚合物荧光。

如图13所示，样品中磷酸酯酶的活性可通过将该样品与磷酸化的BT轭合物孵育来监测。向所孵育的样品中加入所述聚合物传感器和猝灭剂可导致作为PTP-1B活性函数的聚合物荧光的增加。

图16是应用QT’B分析的蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)活性检测图。在图16中，荧光(RFU)作为PTP-1B浓度(mU/孔)的函数来绘图。如图16所见，PTP-1B浓度的增加导致荧光的减少。

对于PKA激酶活性检测，可使用肯普肽肽底物。该底物包含位于N-末端的生物素和可被PKA磷酸化的丝氨酸。

对于PTP-1B磷酸酯酶活性的检测，可使用N-末端有生物素的磷酸化底物。该底物通过与PTP-1B相互作用发生脱磷酸化。

不同于FRET(荧光共振能量转移)分析，在该分析中所述猝灭剂是供体和受体间的等摩尔物。上述QTL激酶和磷酸酯酶分析应用出众的功能性平台，该平台将已确立的磷酸盐-金属络合相互作用与电子和能量转移猝灭剂对轭合聚合物的超猝灭现象组合，导致该荧光信号的放大，并增强了酶活性测定的灵敏度。

基于金属离子介导的聚合物超猝灭的生物分析

先前已显示阴离子轭合的聚合物强烈地与金属阳离子和有机阳离子结合，有时会同时发生所述聚合物荧光的猝灭[1，4]。该结合为库仑与疏水性相互作用的结果。早期的研究表明聚合物和抗衡离子间的结合可通过该聚合物与诸如聚苯乙烯微球、硅石和粘土的荷电载体或与其它荷电聚合物的前结合来调控或调谐[4-6]。

阴离子聚合物，其例子如图1A所示，可在引起所述聚合物荧光少量改变的方法中，与金属离子结合。作为该途径的例子，具有图1A所示结构的聚合物首先包被在阳离子聚苯乙烯微球上，随后用Ga³⁺处理。该过程如图17所示。如图17所见，Ga³⁺与该聚合物结合但不猝灭其荧光。由所述固体载体(例如，珠)、所述聚合物和金属离子(例如Ga³⁺)组成的整体提供新的传感器平台，该平台利用先前证实的金属离子结合有机磷酸盐的能力。

金属离子亲和色谱法(IMAC)是磷酸化物质纯化中的常规技术。金属离子，例如Fe(III)、Ga(III)、Al(III)、Zr(IV)、Sc(III)和Lu(III)(硬路易斯酸)，通过与共价连接的亚氨二醋酸(IDA)或次氨基三乙酸(NTA)或其它配体相结合，可固定在诸如琼脂糖、琼脂糖凝胶等等的树脂珠表面。结合的金属离子可随后结合到诸如蛋白或肽的磷酸化物质。除IMAC在蛋白分离中的应用之外，通过磷酸化后形成所述磷酸盐金属复合物来监测荧光标记底物的荧光偏振变化，可将IMAC相关技术用作蛋白激酶的传感模式。

如图17所示，所述固体载体结合Ga³⁺保留了与激酶产生的磷酸化底物(或者由磷酸酯酶脱磷酸化)络合的能力。因此该固体载体结合的Ga³⁺可用于提供QTL分析的基础。在所示的实施例中，所述底物已用猝灭剂来功能化，当该猝灭剂通过与所述金属离子的结合(例如，Ga³⁺)被带至所述聚合物邻近时，其可通过能量或电子转移猝灭来减少所述荧光聚合物的荧光。

示例性传感模式应用具有图1A所示结构的阴离子聚合电解质(下文称为“PPE”)、0.55μm阳离子聚苯乙烯微球、氯化镓和若丹明标记的磷酸肽。图17中示意性地描述了该传感模式。

首先通过水中的沉积作用，将所述阴离子PPE聚合物固定在所述固体载体上(即，0.55μm阳离子聚苯乙烯微球)。然后在pH为5.5的水溶液中，用氯化镓处理该聚合物包被的微球。随后洗去过量的Ga³⁺。

从酶磷酸化反应(例如，激酶)、蛋白酶剪切反应、或单一的DNA/RAN序列中产生的、或通过竞争性反应产生的染料标记的磷酸化底物可与所述镓聚合物传感器结合并调节来自该聚合物的荧光。

图18显示了作为肽底物的磷酸化程度函数的镓聚合物传感器的荧光。在图18中，相对荧光作为磷酸化程度(磷酸肽％)的函数来绘图。

图19显示了样品中蛋白激酶A酶水平的实际动力学分析，在该样品中，在所述镓聚合物传感器的存在下，发生该酶介导的所述底物磷酸化。图19中，相对荧光作为蛋白激酶A(PKA)浓度(mU/Rx)的函数来绘图。

所述荧光变化可以各种方式来监测。如动力学分析和终点分析，常规的分析可用于监测酶介导的对各种底物的反应。

QT’B传感途径在用于药物开发的抑制剂筛选中的应用

在激酶和磷酸酯酶活性分析中，在电子或能量转移猝灭剂存在下，显示超猝灭的轭合聚合物的应用可适用于筛选大化合物库，寻找可缓解药理学相关的酶和其它生物分子的作用的药物。添加公知的酶活性抑制剂将干扰酶与底物的反应，因而调节在不存在该抑制剂的情况下所见的信号反应。在给定浓度的抑制剂的条件下观察到的信号调节的范围，是对抑制剂的强度的衡量。

该给予QT’B的分析可再各种孔密度的微滴定板上进行以加速药物的开发进程。在一实施方案中，可分别在激酶或磷酸酯酶分析中，对化合物库进行筛选，以寻找磷酸化反应或脱磷酸化反应的抑制。

应用生物素化的连接物(BT)和猝灭剂与生物素结合蛋白的轭合物的分析、试剂和试剂盒

如上所述，已开发了与荧光聚合物结合的QTL生物轭合物，该QTL生物轭合物利用了荧光聚合电解质的自我组织能力来与金属离子络合，其中该荧光聚合电解质为溶液中的个体分子或载体上的组件。因此所络合的金属离子可选择性地与在包含猝灭剂(Q)的生物轭合物上的配位基(例如，磷酸基)结合，因而为蛋白、小分子、肽、蛋白酶和寡核苷酸的选择性检测提供了基础[10-11]。

上述途径应用猝灭剂标记的生物轭合物。但是，该生物轭合物，也可以两步法来组装，其中在第一步骤中使生物素化的底物发生酶学反应，并在第二步骤中，加入包含与猝灭剂连接的生物素结合蛋白分子(例如，链霉抗生物素蛋白)的检测分子。加入传感器时，发生磷酸盐与金属离子的结合，且生物素结合蛋白/猝灭剂轭合物的结合介导猝灭的发生。

该“插入式(snap-on)”途径也可通过将所述生物素化的底物与链霉抗生物素蛋白猝灭剂预结合，并使用所装配的生物轭合物直接与所述酶反应来用于一步分析。但是，该一步插入式分析途径的用途可折衷分析速度和/和灵敏度。

金属离子介导的超猝灭

聚(苯撑乙炔)(PPE)家族中的轭合聚合物可用附加在芳环上的各种功能基来制备。在所用的侧链阴离子基中，那些阴离子基示意性地显示于图1A中，图1A显示了磺酸基聚对-苯撑乙炔(PPE-Di-COOH)轭合聚合物的分子结构。该聚合物可与水中的阳离子微球结合形成稳定的聚合物包衣。所包被的微粒显示强烈的荧光。在聚合物包被的微球上的总电荷可通过聚合物的装填程度和通过变化该聚合物的结构来调谐。

已发现所述聚合物包被的微球可与金属阳离子结合，以及金属阳离子的装填可依赖于该聚合物在该微球上的装填水平。某些诸如Fe³⁺和Cu²⁺的金属离子可猝灭该聚合物荧光，而其它⁺诸如Ga³的金属离子不猝灭荧光。在很少的或无猝灭发生的情况下，或金属离子不存在，非猝灭金属离子介导微球结合的聚合物荧光的超猝灭。在所述聚合物包被的微球通过Ga³⁺的添加而荷电后，向该悬浊液中加入所述磷酸化的肽，导致该聚合物荧光的显著猝灭。显而易见的是所述肽上的磷酸盐与Ga³⁺的结合将所述猝灭剂带至非常接近所述聚合物处，并介导荧光猝灭。

如下所述，利用所述金属离子荷电的聚合物对磷酸化生物分子进行聚合物猝灭可在两步法中完成。图20示意性地显示金属离子介导的超猝灭，以及用于激酶分析的例子，该超猝灭通过将猝灭剂加入酶反应的生物素化底物中来完成。图20示意性地表明，可通过加入QTL传感器、随后加入链霉抗生物素蛋白-猝灭剂，来检测靶酶对生物素肽底物的磷酸化或脱磷酸化。所述肽产物可通过磷酸盐与Ga³⁺金属离子的特异性结合被带至所述聚合物的表面。所产生的聚合物荧光的猝灭伴随着磷酸化或脱磷酸化。

基于金属离子介导的超猝灭的生物分析-激酶磷酸酯酶分析

蛋白质的磷酸化和脱磷酸化介导细胞代谢、生长、分化及细胞增殖的调节。酶功能的失常可导致诸如癌症和炎症的疾病，。超过500种激酶和磷酸酯酶被认为参与调节细胞活性，并成为可能的药物治疗靶点。

已公开了通过使用超猝灭放大荧光信号从而在酶活性的测定中显示出增强的灵敏度的分析方法[10-11]。在这些分析中使用的传感器平台包含修饰的阴离子聚合电解质衍生物，其通过吸附在正电荷微球上来固定。示例性的修饰的阴离子聚合电解质是如图1A所示的聚(苯撑乙炔)(PPE)的衍生物。如图示20所示，荧光聚合物超猝灭已适用于激酶/磷酸酯酶活性的检测。在溶液中二价或三价金属离子可强烈地与阴离子共轭聚合物结合，导致聚合物荧光的改变和/或猝灭。由于聚合物-微球整体的总电荷可被调谐，构建整体以提供平台，籍此金属离子可与所述聚合物结合，而不强烈地猝灭该聚合物荧光，同时保留与特异性配体络合的能力。例如，发现PPE-结合的Ga³⁺也可与磷酸化的肽结合，因此当所述肽包含诸如若丹明的染料时，发生金属离子介导的聚合物超猝灭。在此我们描述了用于检测生物素化的肽底物的平台的应用。

在使用例如闪烁迫近分析(scintillation proximity)(SPA)或链霉抗生物素膜载体(SAMs)的应用中，需要洗涤步骤来分离来自所述反应混合物的未结合的放射性ATP或未结合的抗磷抗体。为了保留转化的底物，使用生物素化的肽，并通过链霉抗生物素或其它生物素-结合蛋白来将其固定在各种基质上。如下所述，金属离子介导的超猝灭可用于筛选激酶对个体底物或生物素-肽库的活性。此途径使研究者能够：

1)测试酶突变体的底物特异性；

2)通过比较磷酸化模式，评价专有酶的酶纯度；

3)监测提供用于激酶的荧光开启(turn-on)分析的增强的发射；以及

4)因此用适当的染料猝灭剂，使用增强的发射使检测红移以改进库中可见自发荧光化合物的筛选。

例如，可将链霉抗生物素偶联的荧光素猝灭剂加入酶反应的生物素化的肽底物中。该途径为如图20所示的灵敏的且选择性的激酶/磷酸酯酶分析提供了基础。检测是瞬间的“混合并读取”分析，其不需要洗涤步骤或复杂样品的制备。

在将生物素化的肽底物与样品中的酶孵育后，加入猝灭剂和生物素结合蛋白(例如链霉抗生物素)的轭合物，使得其与所孵育的样品结合(例如在室温下15分钟)。

以下实施例4表明蛋白激酶A(PKA)的粗略分析方法，以及一步法和两步法步骤的性能比较。在实施例4中，激酶分析作为荧光关闭(turn off)分析。由于作为聚合物荧光猝灭的结果，猝灭剂可能显示出敏化荧光，该分析可作用开启(turn on)或关闭(turn off)分析，这依赖于所监测的波长。此外，同时监测所述聚合物和猝灭剂的荧光以提供灵敏的比率分析。

实施例4-蛋白激酶A(PKA)活性分析

以下描述了用作酶底物及磷酸肽校准物的肽。对于一步模式的PKA活性检测：

若丹明-LRRASLG SEQ ID NO：2

及校准肽：

若丹明-LRRA(pS)LG SEQ ID NO：1是由Anaspec合成的。

对于两步模式的PKA活性检测，

生物素-LRRASLG SEQ ID NO：5

以及

生物素-LRRA(pS)LG SEQ ID NO：6

购自Anaspec。重组PKA购自Promega。链霉抗生物素-偶合的荧光素得自分子探针(Molecular Probes)。聚苯乙烯功能化的珠得自InterfacialDynarmics。

与两步法相比，一步法的性能是通过位于分析缓冲液中的1μM肽(若丹明-肽或生物素-肽)在CRT中反应60分钟来确定的。对于两步法，则是在CRT中加入5μL链霉抗生物素-荧光素并孵育15分钟。最后，加入位于检测缓冲液中的15μL传感器。混合物的荧光使用SpectraMax GeminiXS平板阅读器(Molecular Devices，Inc.)在450nm激发、475nm截止滤光片和490nm发射以孔扫描模式来测定。

如图示21A及21B所示，分析是通过使用合成的带有N端猝灭剂的合成底物，或者使用加入链霉抗生物素-荧光素轭合物的生物素化底物来实施的。所述所述底物磷酸化时，肽通过磷酸基与传感器结合并猝灭荧光。

图21A和21B是在两步法中，使用若丹明标记的底物或生物素化底物的PKA的酶浓度曲线图。所述分析中产生的RFU如图21A所示，随后从标准曲线中计算得出的磷酸化％如图21B所示。在图21A及21B中，在室温下，在白色384孔透明平板中，1μM浓度的底物用连续稀释的激酶PKA酶磷酸化1小时。孵育后，加入5pmol链霉抗生物素-若丹明轭合物并在大约22℃时孵育15分钟，随后加入约100×10⁶ QTL传感器珠，并在22℃时孵育10分钟。在22℃时将所述平板孵育30分钟，并使用Gemini XS平板阅读器(Molecular Devices，Inc.)在450nm激发、490nm发射和475nm截止滤光片来监测荧光信号。

实施例5-用于筛选PKA，PKCα或PTB-IB底物的分析

对于底物筛选，22℃时将1μM生物素-肽在分析缓冲液中反应60分钟。对照反应不含酶。随后，加入5μL链霉抗生物素-荧光素共轭物，并在约22℃孵育15分钟。最后，加入15μL位于检测缓冲液中的传感器。所述混合物的荧光使用SpectraMax Gemini XS平板阅读器(MolecularDevices，Inc.)以孔扫描模式在450nm激发、475nm截止滤光片和490nm发射来测定。

图22是表示使用酶PTP-1B、PKCcα和PKA对用于激酶或者磷酸酯酶的7种不同的生物素化底物进行筛选的柱状图。反应在存在或不存在酶的情况下进行，计算RFU的差别并绘图。如图22所示，磷酸化依赖的荧光猝灭只有在包含适当底物的反应中被检测到，在含有非特异性底物的反应中未检测出。

根据实施方案，用Stern-Volmer猝灭常数测定的放大超猝灭的猝灭灵敏度至少为500。根据另一实施方案，用Stern-Volmer猝灭常数测定的放大超猝灭的猝灭敏感性至少为1000、2000、5000、10,000、100,000或1×10⁶。

示例性荧光剂包括荧光聚合物。示例性荧光聚合物包括发冷光的轭合材料，例如，诸如聚(对苯撑乙烯)(PPV)的聚(苯撑乙烯)、聚噻吩、聚苯撑、聚丁二炔(polydiacetylene)(PDA)、聚乙炔(polyacetylene)、聚(对萘乙烯)、聚(2，5-吡啶乙烯)以及其衍生物，诸如聚(2，5-甲氧基丙基磺酸酯苯乙烯)(MPS-PPV)，聚(2，5-甲氧基丁基磺酸酯苯乙烯)(MBS-PPV)等等。至于水溶性，衍生物可包括一个或多个诸如磺酸(酯)盐以及甲铵的侧离子基。示例性侧基包括：

-O-(CH₂)_n-OSO₃ ^-(M⁺)，

其中n是整数(例如，n＝3或4)及M⁺是阳离子(例如，Na⁺或Li⁺)；

-(CH₂)_n-OSO₃-(M⁺)，

-O-(CH₂)_n-N⁺(CH₃)₃(X^-)，

其中n是整数(例如，n＝3或4)及X^-是阴离子(例如，Cl^-)；以及

-(CH₂)_n-N⁺(CH₃)₃(X^-)

其中n是整数(例如，n＝3或4)及X^-是阴离子(例如，Cl^-)。

上述说明书利用为说明目的提供的实施例，描述了本申请的原理，本领域内技术人员通过阅读本公开，应理解在不偏离本公开的实际范围的情况下，可作出各种形式和细节上的改变。

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Claims

1.复合物包含：

生物素化的多肽，其中所述多肽包含一个或多个磷酸基；以及

与所述多肽的磷酸基结合的金属阳离子。

2.如权利要求1所述的复合物，其中所述金属阳离子是Ga³⁺。

3.如权利要求1所述的复合物，其还包含荧光剂；

其中所述荧光剂包含一个或多个阴离子基和多种彼此结合的荧光物质，使得当猝灭剂与所述荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大所述荧光剂的超猝灭，其中所述荧光剂与生物素结合蛋白结合；以及

其中所述荧光剂的阴离子基与所述金属阳离子结合。

4.如权利要求3所述的复合物，其中所述荧光剂为荧光聚合物。

5.如权利要求3所述的复合物，其中所述荧光剂为聚(对-苯撑乙炔)聚合物。

6.如权利要求3所述的复合物，其中所述荧光剂与固体载体的表面相结合。

7.如权利要求6所述的复合物，其中所述固体载体为微球。

8.如权利要求6所述的复合物，其中所述固体载体包含带正电荷的表面，且其中所述荧光剂的阴离子基与所述带正电荷的表面结合。

9.权利要求3所述的复合物，其还包含猝灭剂，其中当所述猝灭剂与所述荧光剂结合时能够放大所述荧光剂的超猝灭，且其中所述猝灭剂与所述多肽的磷酸基结合。

10.如权利要求9所述的复合物，其中所述猝灭剂为有机金属化合物。

11.如权利要求10所述的复合物，其中所述猝灭剂为铁(III)亚氨二醋酸螯合物。

12.如权利要求3所述的复合物，其中所述荧光剂和所述生物素结合蛋白与所述固体载体的表面结合。

13.检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与生物素化的多肽孵育，其中，对于激酶分析物，所述多肽包含一个和多个被所述分析物磷酸化的基团，或者，对于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一个或多个被所述分析物脱磷酸化的基团；

b)向所述样品中加入金属阳离子，其中或者所述金属阳离子是猝灭剂，或者所述方法还包括向所述样品中加入能与所述金属阳离子结合的猝灭剂；

c)向所述样品中加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂与生物素结合蛋白结合；

d)检测荧光，

其中所检测的荧光表示该样品中分析物的存在和/或数量。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述猝灭剂与所述磷酸化的多肽结合。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物磷酸化的基团；且

其中所述可磷酸化的基团的磷酸化导致了荧光的减少。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物脱磷酸化的基团；且

其中所述基团的脱磷酸化导致荧光的增加。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述金属阳离子是Ga³⁺。

18.如权利要求13所述的方法，其中所述荧光剂为荧光聚合物。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述荧光剂为聚(对-苯撑乙炔)聚合物。

20.如权利要求13所述的方法，其中所述荧光剂与固体载体的表面结合。

21.如权利要求13所述的方法，其中所述荧光剂和所述生物素结合蛋白与所述固体载体的表面结合。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述固体载体为微球。

23.如权利要求20所述的方法，其中所述固体载体包含带正电荷的表面；

其中所述荧光剂包含一个或多个阴离子基团；且

其中所述荧光剂的阴离子基团与所述带正电荷的表面结合。

24.如权利要求13所述的方法，其中所述猝灭剂为有机金属化合物。

25.如权利要求14所述的方法，其中所述猝灭剂为铁(III)亚氨二醋酸螯合物。

26.如权利要求13所述的方法，其中在孵育后及检测荧光前，将所述荧光剂、所述猝灭剂和所述金属阳离子加入所述样品中。

27.如权利要求13所述的方法，其中在孵育前或孵育过程中，将所述荧光剂、所述猝灭剂和所述金属阳离子加入所述样品中，且其中检测荧光包括在孵育过程中检测荧光。

28.筛选作为激酶或磷酸酯酶酶活性抑制剂的化合物的方法，所述方法包括：

a)在所述化合物存在下，在样品中将生物素化的多肽与激酶或磷酸酯酶孵育，其中，对于激酶分析，所述多肽包含一个或多个可被所述分析物磷酸化的基团，以及对于磷酸酯酶分析，所述多肽包含一个或多个可被所述分析物脱磷酸化的基团；

b)向所述样品中加入金属阳离子，其中或者该金属阳离子是猝灭剂，或者所述方法还包括向所述样品中加入能与该金属阳离子结合的猝灭剂；

c)向所述样品中加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中所述荧光剂与生物素结合蛋白结合；以及

d)在所述化合物的存在下，检测来自所述样品的荧光；

其中在所述化合物的存在下检测的荧光量指示了该化合物对激酶或磷酸酯酶酶活性的抑制作用。

29.如权利要求28所述的方法，还包括：

a)在第二化合物存在下，在第二样品中将所述生物素化的多肽与所述激酶或磷酸酯酶孵育；

b)向所述第二样品中加入所述荧光剂、所述猝灭剂和所述金属阳离子；

c)在所述第二化合物存在下，检测来自所述第二样品的荧光；

其中从所述第二样品检测的荧光量指示所述第二化合物对激酶或磷酸酯酶酶活性的抑制作用。

30.权利要求28所述的方法，还包括：

a)在第二样品中将所述生物素化的多肽与所述激酶或磷酸酯酶孵育，其中所述第二样品不含所述化合物；

b)向所述第二样品中加入所述荧光剂、所述猝灭剂和所述金属阳离子；以及

c)在所述化合物不存在的情况下，检测来自所述第二样品的荧光；

其中在所述化合物不存在的情况下，所检测的来自所述第二样品的荧光量为基线荧光。

31.如权利要求30所述的方法，还包括：

将所述化合物存在时所检测的荧光与所述化合物不存在时所检测的基线荧光进行比较；

其中所述化合物存在时所检测的荧光与所述基线荧光的差别指示所述化合物对激酶或磷酸酯酶酶活性的抑制作用。

32.生物轭合物，其包含：

包含一个或多个可磷酸化或可脱磷酸化的基团的多肽；以及

与所述多肽轭合的猝灭部分，其中当所述猝灭部分与荧光聚合物结合时，所述猝灭部分能够放大所述荧光聚合物的超猝灭。

33.如权利要求32所述的生物轭合物，其中所述猝灭部分为若丹明。

34.如权利要求32所述的生物轭合物，其中所述多肽包含一个或多个磷酸基团。

35.如权利要求34所述的生物轭合物，其中所述多肽还包含剪切位点，且其中所述猝灭部分和所述磷酸基位于所述剪切位点的相对侧，且其中在所述剪切位点的与所述猝灭部分轭合的那一侧不存在磷酸基。

36.如权利要求34所述的生物轭合物，其中所述多肽还包含剪切位点，且其中所述猝灭部分和所述磷酸基位于所述剪切位点的同侧，且其中在所述剪切位点的与所述猝灭部分轭合一侧的相对侧不存在磷酸基。

37.检测样品中蛋白酶存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与权利要求35所述的生物轭合物孵育，其中所述蛋白酶在所述剪切位点剪切所述多肽；

b)向所述样品中加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭部分与该荧光剂结合时，所述猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且其中至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基结合；以及

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光指示所述样品中蛋白酶的存在和/或数量。

38.检测样品中激酶或蛋白酶分析物的存在和/或数量的试剂盒，该试剂盒包括：

包含权利要求32所述的生物轭合物的第一组分；和

包含荧光剂的第二组分，该荧光剂包含多种彼此结合的荧光物质，使得当所述猝灭部分与该荧光剂结合时，所述生物轭合物的猝灭部分能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且其中至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基结合。

39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述荧光剂为荧光聚合物。

40.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述荧光剂为聚(对-苯撑乙炔)聚合物。

41.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述荧光剂与固体载体的表面相结合。

42.如权利要求41所述的试剂盒，其中所述固体载体为微球。

43.如权利要求41所述的试剂盒，其中所述固体载体包含带正电荷的表面，且其中所述荧光剂的一个或多个阴离子基与所述带正电荷的表面结合。

44.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述猝灭部分为若丹明。

45.检测样品中酶分析物存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与权利要求32所述的生物轭合物孵育，其中所述生物轭合物的多肽包含可被所述酶分析物磷酸化或脱磷酸化的基团；

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光指示所述样品中分析物的存在和/或数量。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物磷酸化的基团，且其中所述多肽的可磷酸化基团的磷酸化导致荧光的减少。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述多肽包含可被所述分析物脱磷酸化的基团，且其中所述多肽的可脱磷酸化基团的脱磷酸化导致荧光的增加。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述金属阳离子是Ga³⁺。

49.如权利要求45所述的方法，其中所述荧光剂为荧光聚合物。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述荧光剂为包含阴离子基的聚(对-苯撑乙炔)聚合物。

51.如权利要求45所述的方法，其中所述荧光剂与固体载体的表面结合。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述固体载体为微球。

53.如权利要求51所述的方法，其中所述固体载体包含带正电荷的表面，且其中所述荧光聚合物的阴离子基与所述带正电荷的表面结合。

54.如权利要求45所述的方法，其中在孵育后及检测荧光前将所述荧光剂加入所述样品中。

55.如权利要求45所述的方法，其中在孵育前或孵育过程中将所述荧光剂加入所述样品中，且其中检测荧光包括在孵育过程中检测荧光。

56.检测样品中分析物存在的试剂盒，其包括：

包含猝灭剂的第一组分，和

包含生物素化的多肽的第二组分，其中该多肽可被所述分析物修饰，且其中被所述分析物修饰的多肽与所述猝灭剂结合。

57.如权利要求56所述的试剂盒，其还包含荧光剂，所述荧光剂包含多种彼此结合的荧光物质，使得当所述猝灭剂与所述荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大所述荧光剂的超猝灭。

58.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述荧光剂为荧光聚合物。

59.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述荧光聚合物为聚(对-苯撑乙炔)聚合物。

60.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述荧光剂与固体载体的表面结合。

61.如权利要求60所述的试剂盒，其中所述固体载体为微球。

62.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述分析物为酶。

63.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述酶为激酶或磷酸酯酶。

64.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述酶能磷酸化所述多肽底物，且其中所磷酸化的肽底物与所述猝灭剂结合。

65.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述猝灭剂为有机金属化合物。

66.如权利要求56所述的试剂盒，其中所述猝灭剂为铁(III)亚氨基二醋酸螯合物。

67.检测样品中磷酸酯酶存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与生物轭合物孵育，该生物轭合物包含与环磷腺苷或环磷鸟苷轭合的猝灭剂；

b)向所述样品中加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且其中至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基结合；以及

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光指示所述样品中磷酸酯酶的存在和/或数量。

68.如权利要求67所述的方法，其中在孵育后及检测荧光前将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中。

69.如权利要求67所述的方法，其中在孵育前或孵育过程中将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中，且其中检测荧光包括在孵育过程中检测荧光。

70.检测多肽底物的激酶酶活性的方法，所述方法包括：

a)将所述多肽底物和猝灭剂标记的包含一个或多个可磷酸化基团的多肽与包含激酶的样品孵育；

c)检测来自该样品的荧光；

其中该多肽底物的磷酸化导致荧光的增加；以及

其中所检测的荧光量指示该多肽底物的激酶活性的存在和/或数量。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述多肽底物为天然蛋白。

72.如权利要求70所述的方法，其中在孵育后及检测荧光前将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中。

73.如权利要求70所述的方法，其中在孵育前或孵育过程中将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中，且其中检测荧光包括在孵育过程中检测荧光。

74.检测样品中核酸分析物存在和/或数量的方法，所述分析包括：

a)将所述样品与多核苷酸孵育，该多核苷酸包括与位于其第一末端区的多肽及位于其第二末端区的磷酸基轭合的猝灭剂，其中至少部分所述多核苷酸的第一末端区和第二末端区杂交在一起形成发夹结构，以及其中位于所述末端区之间的该多核苷酸的中央区包含核酸序列，该核酸序列可杂交所述核酸分析物，从而破坏所述发夹结构，并导致所述猝灭剂与所述多核苷酸的磷酸基的分离；

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光指示所述样品中核酸分析物的存在和/或数量。

75.检测样品中核酸分析物的存在和/或数量的方法，所述分析包括：

a)用猝灭剂标记所述样品中的核酸；

b)将所述样品与多核苷酸孵育，该多核苷酸第一末端区包含磷酸基，其中该多核苷酸包含可杂交所述核酸分析物的核酸序列；

c)向所述样品中加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，所述猝灭剂能够扩大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且其中至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基结合；以及

d)检测来自所述样品的荧光；

其中所述核酸分析物与所述多核苷酸的杂交导致荧光的减少；且

其中所减少的荧光指示所述样品中核酸分析物的存在和/或数量。

76.检测样品中核酸分析物的存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与末端区包含磷酸基的第一多核苷酸和第二多核苷酸孵育，该第二多核苷酸包含与其末端区轭合的猝灭剂，其中该第二多核苷酸与所述核酸分析物能杂交所述第一多核苷酸；

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所述核酸分析物与所述第一多核苷酸的杂交导致荧光的增加；且

其中所检测的荧光量指示所述样品中核酸分析物的存在和/或数量。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述磷酸基位于所述第一多核苷酸的3’-末端区，且所述猝灭剂位于所述第二多核苷酸的5’-末端区，或者所述磷酸基位于所述第一多核苷酸的5’-末端区，且所述猝灭剂位于所述第二多核苷酸的3’-末端区。

78.检测样品中多肽分析物的存在和/或数量的方法，所述分析包括：

a)将所述样品与末端区包含磷酸基的核酸适体和包含猝灭剂的多核苷酸孵育，其中该核酸适体可结合所述多肽分析物；且其中所述多核苷酸可杂交至所述核酸适体；

b)向所述样品加入包含多种彼此结合的荧光物质的荧光剂，使得当所述猝灭剂与该荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大该荧光剂的超猝灭，其中该荧光剂还包含一个或多个阴离子基，且其中至少一个金属阳离子与该荧光剂的阴离子基相结合；以及

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所述多肽分析物与所述核酸适体的结合导致荧光的增加；且

其中所检测的荧光量指示所述样品中多肽分析物的存在和/或数量。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述磷酸基位于所述核酸适体的3’-末端区，且所述猝灭剂位于所述多核苷酸的5’-末端区，或者所述磷酸基位于所述核酸适体的5’-末端区，且所述猝灭剂位于所述多核苷酸的3’-末端区。

80.如权利要求78所述的方法，其中所述多肽分析物为天然蛋白。

81.复合物，所述复合物包括：

包含生物素部分的多肽，其中该多肽的一个或多个氨基酸残基是可磷酸化或脱磷酸化的；以及

与猝灭部分轭合的生物素结合蛋白；

其中所述多肽的生物素部分通过蛋白-蛋白相互作用与所述生物素结合蛋白结合；且

其中当所述猝灭部分与荧光剂结合时，所述猝灭部分能够放大所述荧光剂的超猝灭。

82.如权利要求81所述的复合物，其中所述多肽包含一个或多个磷酸基团。

83.权利要求82所述的复合物，其还包含与所述多肽的磷酸基结合的金属阳离子。

84.如权利要求83所述的复合物，其中所述金属阳离子为Ga³⁺。

85.权利要求83所述的复合物，其还包含荧光剂；

其中所述荧光剂包含一个或多个阴离子基和多种彼此结合的荧光物质，使得当所述猝灭剂与所述荧光剂结合时，所述猝灭剂能够放大所述荧光剂的超猝灭；且

其中所述荧光剂的阴离子基与所述金属阳离子结合。

86.如权利要求85所述的复合物，其中所述荧光剂为荧光聚合物。

87.如权利要求85所述的复合物，其中所述荧光剂为聚(对-苯撑乙炔)聚合物。

88.如权利要求85所述的复合物，其中所述荧光剂与固体载体的表面结合。

89.如权利要求88所述的复合物，其中所述固体载体为微球。

90.如权利要求88所述的复合物，其中所述固体载体包含带正电荷的表面，且其中所述荧光剂的阴离子基与所述带正电荷的表面结合。

91.如权利要求81所述的复合物，其中所述生物素结合蛋白为链霉抗生物素蛋白。

92.如权利要求81所述的复合物，其中所述猝灭部分为荧光素。

93.检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物的存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与权利要求81所述的复合物孵育，其中对于激酶分析物，所述多肽包含一个和多个可被所述分析物磷酸化的基团，以及，对于磷酸酯酶分析物，所述多肽包含一个或多个可被所述分析物脱磷酸化的基团；

c)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光量指示所述样品中分析物的存在和/或数量。

94.如权利要求93所述的方法，其中在孵育后及检测荧光前将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中。

95.如权利要求93所述的方法，其中在孵育前或孵育过程中将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中，且其中检测荧光包括在孵育过程中检测荧光。

96.检测样品中激酶或磷酸酯酶分析物存在和/或数量的方法，所述方法包括：

a)将所述样品与生物素化的多肽孵育，该多肽包含一个或多个可被用于激酶分析物分析的分析物磷酸化的基团，或者包含一个或多个可被用于磷酸酯酶分析物分析的分析物脱磷酸化的基团；

b)向所孵育的样品中加入与猝灭部分轭合的生物素结合蛋白；

d)检测来自所述样品的荧光；

其中所检测的荧光指示所述样品中分析物的存在和/或数量。

97.如权利要求96所述的方法，其中在孵育后及检测荧光前将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中。

98.如权利要求96所述的方法，其中在孵育前或孵育过程中将所述荧光剂和所述金属阳离子加入所述样品中，且其中检测荧光包括在孵育过程中检测荧光。