CN102050813A - 荧光猝灭剂分子及其方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种荧光猝灭剂分子及其方法和用途。本发明涉及新的吡啶基-异喹啉-二酮衍生物、制备这些衍生物的方法、包含新的吡啶基-异喹啉二酮衍生物和(i)固相支持体或(ii)生物分子的缀合物、制备这些缀合物的方法以及这些缀合物在荧光共振能量转移(FRET)中作为猝灭剂的用途。
Description
技术领域
本发明涉及新的吡啶基-异喹啉-二酮衍生物、制备这些衍生物的方法、包含新的吡啶基-异喹啉二酮衍生物和(i)固相支持体或(ii)生物分子的缀合物、制备这些缀合物的方法以及这些缀合物在荧光共振能量转移(FRET)中作为猝灭剂的用途。
背景技术
荧光共振能量转移(缩写为FRET),亦称共振能量转移(以其发现者Theodor 命名),是描述激发能从一个分子转移到另一个分子而无需荧光和重新吸收的机制。按照理论,通过供体荧光偶极子与受体吸收偶极子的偶极子-偶极子耦合进行能量转移。因此,FRET现象总是非辐射能量转移。在吸收某一波长的光后开始处于电子激发态的供体发色团(chromophor)可将能量非辐射地转移至受体,而促使受体处于其电子激发态。随后,受体的电子激发态衰减以致进而放出能量。FRET的效率取决于多个可如下归类的参数:供体与受体之间的距离;供体发射光谱与受体吸收光谱的光谱重叠;以及供体发射偶极矩和受体吸收偶极矩的相对取向。
在常规FRET技术中,供体和受体均为荧光团。因此,由供体荧光团所吸收的某一波长(吸收波长)的光的能量被转移至受体。由于吸收了转移的能量,促使受体成为电子激发态,电子激发态随后衰减,然后被转移至受体的能量发射出某一特定波长(发射波长)的光。与吸收波长相比,发射波长向更长的波长转移。当供体和受体由于发色团的相互作用而紧密靠近时(例如1-10nm),由于自供体到受体的FRET,因此主要观察到受体发射。因此,可通过供体荧光的减弱或受体荧光的增强来检测FRET现象。
在FRET的一种具体形式中,使用所谓的猝灭剂代替荧光受体(J.R.Lakowicz,Principles of Fluorescence,第二版,Kluwer AcademicPlenum Publishers,New York,1999)。猝灭剂是这样一种分子:它吸收自供体(亦称报道分子(reporter))转移的能量而不再发光,故可猝灭荧光。因此,在报道分子-猝灭剂系统中,供体向猝灭剂转移能量。因此,供体返回基态,并产生猝灭剂的激发态。随后,猝灭剂的激发态非辐射性衰减((黑)暗猝灭剂)。在非辐射或暗衰减中,通过分子振动(热)释放出能量。因为探头中猝灭剂的浓度通常处于μM以下的范围,所以非辐射衰减的热量太小,以致不能影响溶液的温度。根据方程式,这类荧光猝灭还取决于供体与受体间的距离。与上述FRET技术不同,不测量受体的发射,只测量供体的发射:发色团彼此分得越开,得到的能量转移越弱,致使供体的荧光相应地增强。
直到最近几年,猝灭剂一般都是荧光染料,例如作为报道分子的荧光素和作为猝灭剂的罗丹明(FAM/TAMRA探头)。最著名的猝灭剂之一为用来降低报道分子染料(reporter dye)发射的TAMRA(四甲基-罗丹明)。由其性质所致,TAMRA适于作为FAM(羧基荧光素)、HEX(六氯荧光素)、TET(四氯-荧光素)、JOE(5′-二氯-二甲氧基-荧光素)和Cy3-染料(花青)的猝灭剂。
然而,TAMRA的实用性有限,因为其宽大的发射光谱降低了其在多路复用(multiplexing)(当同时使用两个或更多个报道分子-猝灭剂探头时)中的能力。它固有的荧光产生背景信号,导致信号动力学减弱,因此,可能降低基于TAMRA的测定法的灵敏度。
暗猝灭剂为这个问题提供了解决办法,因为它们不占据发射带宽。而且,暗猝灭剂能够多路复用。一种典型的暗猝灭剂是DABCYL(4-[[4-(二甲基氨基)-苯基]-偶氮基]-苯甲酸),它常常与分子信标联用。DABCYL在380~530nm的范围内猝灭染料。因此,即使具有较长波长发射的荧光团(例如Cy3-染料)也可被DABCYL更好地猝灭。然而,DABCYL具有不适当的吸收谱带,与在480nm以上发射的荧光团的重叠非常差。又一种非荧光染料为猝灭剂(4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺,Epoch Biosciences,Inc.的商标,Corporation Delaware21720,23rd Drive NE,Suite 150,Bothell Washington 98021,USA),它在530nm处吸收最大,并且有效猝灭从520nm到670nm的光谱。
对上述暗猝灭剂的一种改进为Black Hole猝灭剂,例如BHQ-1([(4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮基)-基-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)-偶氮基)]-苯胺)和BHQ-2([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮基)-基-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮基)]-苯胺)(均可获自Biosearch Technologies,Inc.),它们能够猝灭整个可见光谱。这些非荧光受体常用作荧光受体的替代物,目的是为了降低背景荧光并以此提高灵敏度。
然而,已知的非荧光猝灭剂的缺点是其猝灭功效不足,这导致了高背景信号,进而又导致了信号动力学特征受到限制。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供新的猝灭剂,优选具有低背景信号和/或高猝灭功效。此外,在一个优选的实施方案中,它们可与生物分子或FRET的固相支持体偶联。
令人惊讶的是,发现吡啶基-异喹啉-二酮衍生物以低背景信号和/或高猝灭功效为特征。迄今为止,几乎没有文献披露过这类物质,而且其只是用于药物应用(J.Med.Chem.1991,34,1871-1879)。此外,这类物质的二苯基氨基衍生物和具有用于与生物分子或固相支持体偶联的官能团的衍生物也不为本领域所知。
因此,本发明涉及下式I的化合物:
其中
R1和R2中的一个为氢、C1-C6烷基或卤素,而另一个为-Q-Y,其中Q表示包含1-10个线性共价连接原子的连接基团,Y为官能团,尤其为其中Q为直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的C1-C10烃链,Y选自羟基、羧基和氨基;和
R3和R4彼此独立地表示-NR5R6,其中R5和R6彼此独立地为氢或者取代或未取代的芳基。
术语“烷基”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指仅由碳和氢原子组成的一价残基。烷基形成具有通式CnH2n+1的同类系列。烷基可为直链或支链烷基,例如烷基可为仲烷基或叔烷基,仲烷基为支链,具有与两个碳残基连接的中心碳原子;叔烷基为支链,具有与3个碳残基连接的中心碳原子。式(I)的C1-C6烷基可为例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、3-甲基丁-2-基、2-甲基丁-2-基、2,2-二甲基-丙基、正己基、2-甲基-戊基、3-甲基-戊基、2-二甲基-丁基、3-二甲基-丁基、4-二甲基-丁基、2,3-二甲基丁基、2,4-二甲基丁基或3,4-二甲基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、2-甲基-戊基、或3-甲基-戊基,优选甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基,更优选甲基、乙基或异丙基,最优选甲基。
术语“卤素”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指残基氟、氯、溴、碘和砹,优选氯和溴。
基团-Q-Y中的字母Q表示“连接基团”,包含1-10个线性的共价连接的原子。术语“连接基团”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指某一部分用于合成以连接较大的部分。因此,在第一方面,二价基团-Q-是指使官能团Y与吡啶基-异喹啉-二酮部分连接的连接基团。在进一步和更重要的方面,连接基团Q是指在本发明的缀合物中的后一连接基团,其中本发明的化合物与固相支持体或生物分子偶联,其中所述化合物通过连接基团Q与支持体或生物分子偶联(详见下文)。
因此,在本文中的术语“连接基团”还包括如本领域普通技术人员已知的术语“接头”的含义。例如,连接基团可完全由氢和碳原子组成,使得1-10个碳原子为线性共价连接,例如为取代或未取代、支链或直链、饱和或不饱和的烃链的形式。
在一个实施方案中,连接基团Q的1-10个原子链可完全由氢和碳原子组成,其为取代或未取代、支链或直链、饱和或不饱和的烃链的形式。
有关连接基的术语“烃链”在本文中以熟练技术人员已知的含义使用,是指全部由碳和氢组成的有机化合物。因此,在连接基团为烃链的情况下,连接基团可为二价亚烷基,可用式-(CH2)n-表示,其中n为1-10的整数,即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;二价亚烯基,具有一个或多个碳-碳双键和例如1-10个碳原子,即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子;或二价亚炔基,具有一个或多个碳-碳三键和例如1-10个碳原子,即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。因此,例如Q可为具有1-10个碳原子,即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的二价亚烷基,例如正亚癸基、正亚壬基、正亚辛基、正亚庚基、正亚己基、正亚戊基、正亚丁基、正亚丙基、正亚乙基和亚甲基。
烃链还可以是具有一个或多个烷基的支链,其中烷基可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
又或者,烃链还可包括环组分,例如亚环烷基或亚苯基,其中术语亚苯基按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指衍生自苯的二价芳基-C6H4-。术语亚环烷基在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指二价环烃残基,其中亚环烷基可以为亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基或亚环己基,优选亚环己基。
这类烃链还可被例如卤素原子或羟基取代。因此,从相应烃链中的1个氢原子到全部氢原子都可被例如卤素原子或羟基取代。
有关术语连接基的定义的术语“取代(的)”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指烃链的氢原子被以下的一价残基取代:例如卤素、羟基、巯基、氨基、甲基或乙基,其中术语卤素如上定义。
而且,术语“取代(的)”还指在形成羰基的情况下通过一个碳原子上两个氢原子的取代,或者通过两个相邻碳原子上两个氢原子的取代形成环氧基而引起的两个氢原子被氧原子的取代。
最后,术语“取代(的)”还可指烃链的一个或多个(例如1、2、3或最多4个)亚甲基单元(-CH2-)被相应数目的二价原子或原子基团取代,例如含硫、氧或氮的基团,例如-NH-或-NR-,其中R为例如甲基或乙基。
示例性的连接基团可含有至少一个由亚甲基单元被氧取代而形成的醚键。因此,连接基团可含有例如至少一个-(O-CH2-CH2)n-类型的乙二醇单元,其中n为1-3的整数,因此,对于n=3,连接基团可视为短的聚乙二醇链。再举例来讲,连接基团还可含有一个或两个酯或酰胺键。为了得到更刚性的连接基团,建议掺入至少一个酯基和/或至少一个酰胺基。
有关术语连接基的定义的术语“未取代(的)”按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指完全由碳和氢组成的烃链。
有关术语连接基的定义的术语“线性(的)”按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指这样的连接基团,其中至少为二价并且具有至少两个相邻原子的连接基团的成员排列成直线。因此,术语“线性的”和“直链的”在本发明的情况下等同地使用。
有关术语连接基的定义的术语“线性共价连接的原子”按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指这样的连接基团,其中连接基团的成员通过共价键连接并且其中这些共价连接的成员排列成直线。共价键可为碳-碳单键、碳-碳双键或碳-碳三键。再举例来讲,碳原子和杂原子,例如氧、硫或含氮基团(例如-NH-或-NR-,其中R为例如甲基或乙基),是以线性方式共价连接的。有关术语连接基的定义的术语“线性共价连接的原子”优选为含有1-20个原子的链。
有关术语连接基的定义的术语“支链(的)”在本文按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指在分子或部分的主链上存在侧链。因此,支链连接基团可为具有一个或多个烷基作为侧链的如上定义的烃链,其中烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基,优选甲基或乙基。在一个到全部碳原子用Q所表示的支链烃链中可具有如上定义的一个或多个烷基。
有关术语连接基的定义的术语“饱和(的)”按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指连接基团中所有的基团成员都通过单键与相应的邻接原子连接。因此,饱和烃链用式-(CH2)n-表示,其中n为1-10的整数。同样,-(O-CH2-CH2)n-类型的短聚乙二醇链或-(S-CH2-CH2)n-类型的短聚乙二硫醇(polyethylene sulphide)链(其中n为1-3的整数)是饱和的。又或者,-(NH-CH2-CH2)n-类型的短聚亚乙基亚胺链(其中n为1-3的整数)也是示例性的饱和连接基团。
有关术语连接基的定义的术语“不饱和(的)”在本文按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指连接基团中不是全部碳原子都完全被氢或其它原子所饱和,例如烃链。
例如,烃链可具有一个或多个双键或三键,其中术语“双键”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指两个原子通过两个电子对形成的键。同样,术语“三键”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指两个原子通过三个电子对形成的键。连接基团可具有至少一个双键,因此,连接基团Q可以是具有1个、2个或更多个碳-碳双键的烃链。例如,连接基团Q可以是完全由-CH=CH-CH=CH-类型的交替的碳-碳双键组成的烃链。或者,连接基团可完全由累接的碳-碳双键组成,因此,连接基团可用-(CH=CH)n-表示,其中n为1-5的整数,即1、2、3、4或5。在不饱和烃链的另一实例中,碳-碳双键的一个或两个碳原子可具有烷基,其中术语烷基如上文中定义,优选为甲基。在又一个实例中,仅每两个碳-碳双键可具有一个烷基,优选为甲基,相当于类胡罗卜素的烃链。
此外,碳-碳双键可彼此独立地为顺式或反式,分别为Z或E。有关碳-碳双键的术语顺式和Z按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指其中两个取代基或两个氢原子分别位于双键的同侧的异构体。有关碳-碳双键的术语反式和E按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指异构体中两个取代基或两个氢原子各位于双键的不同侧,相当于类胡罗卜素的烃链。
在又一个实例中,烃链可具有一个或多个三键。因此,烃链可具有1-12个碳-碳三键。连接基团可完全由交替或累接的碳-碳三键组成。同样,烃链同时可具有碳-碳双键和碳-碳三键。最好在连接基团中掺入至少一个碳-碳双键和/或至少一个碳-碳三键,由于碳-碳重键缺乏自由旋转,因此增加连接基团的刚性。
术语“官能团”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指原子的多种组合的任意一种,它构成化学分子的组成部分,自身进行特征性反应,并且在多种情况下影响分子其余部分的反应性。典型的官能团为羟基、羧基、醛、羰基、氨基、叠氮化物、炔基、巯基和腈。还可以按照本领域普通技术人员已知的方法使这些基团衍生化。因此,官能团还可以是已经衍化的羟基,例如其被甲苯磺酰氯衍生化成为在亲核反应中是良好离去基团的甲苯磺酰基,或者官能团还可为例如羧基卤,或N-羟基琥珀酰亚胺酯或亚磷酸酰胺(phosphoramidite)。亚磷酸酰胺可通过与羟基反应直接形成或者使用三官能接头(Gen Probe EP 313219)形成。本发明的化合物可通过官能团与生物分子或与固相支持体偶联。
因此,根据本发明的化合物将与之偶联的固相支持体或生物分子的性质来选择官能团。一般而言,官能团应以这类方式选择,使得固相支持体或生物分子的相应官能团的反应性与将与之反应而形成化学键的本发明化合物的官能团相称。例如,如果本发明化合物的官能团是亲核基团,例如氨基或羟基,则固相支持体或生物分子的相应基团基本上是亲电基团,例如羰基、醛、卤素原子、羧基卤或羧基。在又一个实例中,作为代表性亲核基团的羟基可通过与甲苯磺酰氯或三氟乙酸酐反应而衍生化为甲苯磺酸基或三氟甲磺酸基,这在亲核取代反应中是两种极佳的离去基团。
术语“衍(生)化”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指化合物的衍生物,其中通常从所述化合物开始只在一次反应中就形成衍生物。因此,衍生物与起始化合物保持紧密的化学关系。同样,碳酸NHS酯是用N-羟基琥珀酰亚胺和DCC(二环己基碳二亚胺)处理羧酸所得到的衍生化形式羧酸。腈基可用碳载钯作为氢化催化剂或者氢或任何提供氢的氢源通过氢化还原成为氨基。为了避免任何副反应,在本发明的化合物与固相支持体或生物分子偶联前应进行相应的衍生化反应。
R3和R4彼此独立地表示-NR5R6,其中R5和R6彼此独立地为氢或者取代或未取代的芳基。术语“-NR5R6”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指伯氨基、仲氨基或叔氨基,这取决于其取代基R5和R6。如果取代基R5和R6两者均为氢原子,则相应的-NR5R6基团为伯氨基;如果R5和R6中的一个为氢,另一个为取代或未取代的芳基,则-NR5R6为仲氨基;如果R5和R6两者均为取代或未取代的芳基,则-NR5R6为叔氨基。R3和R4彼此独立地由-NR5R6表示。因此,R3和R4各自可具有由R5和R6表示的不同的取代基。例如,R3可具有其中R5和R6两者均为氢的-NR5R6,R4可具有其中R5为氢且R6为未取代芳基的-NR5R6。在又一个实例中,R3可具有其中R5和R6两者均为未取代芳基的-NR5R6,而R4可具有其中R5和R6两者均为取代芳基的-NR5R6。
术语“芳基”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指只由氢和碳原子组成的芳族残基,例如苯基(C6H5-)、萘基(C10H7-)或蒽基(C14H9-)残基。芳基可被例如以下基团取代或者可以是未取代的:例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基;或卤素原子,例如溴、氯或氟。
正如上文中更详尽说明一样,基团-Q-Y中的Y表示官能团。在本发明的情况下,优选的官能团为羟基、羧基和氨基。因此,在本发明的一个优选实施方案中,式I化合物的基团Y选自羟基、羧基、氨基、叠氮化物、炔基、亚磷酸酰胺和NHS酯。
在本发明的一个甚至更优选的实施方案中,式I化合物的基团Q为直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的C1-C10烃链,优选C2-C8烃链,更优选C2-C5烃链,还更优选C3、C4或C5烃链,最优选C4烃链;和/或式I化合物的基团Y为羟基或羧基。
术语“烃”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指全部由氢和碳原子组成的有机残基。除术语“烃”以外,术语“链”在本文中以其一般含义使用,并且有关术语“烃”是指非环状烃残基。在式I化合物的情况下,由Q表示的烃链以其一端与吡啶基-异喹啉-二酮衍生物连接,在其另一端则被官能团Y封端。烃链可以是直链或支链。
有关烃链的术语“饱和(的)”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指全部由具有单键(被氢键饱和)的碳主链组成的饱和烃链。有关烃链的术语“不饱和(的)”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指碳原子之间具有一个或多个双键或三键的不饱和链。有关“烃链”的术语“取代(的)”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指其中一个或多个氢原子被例如一个或多个卤素原子、或者一个和多个羟基或者一个或多个线性或支链C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)置换的烃链。
在本发明的另一个优选的实施方案中,本发明式I的R3和/或R4为-NR5H,优选其中R5为取代或未取代的苯基残基。因此,在一种情况下,R3和R4两者均为-NR5H,在另一种情况下,R3或R4为-NR5H。而且,R5优选为苯基。术语“苯基”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指从苯残基衍生的残基,因此是指化学基团C6H5。
在本发明的一个优选的实施方案中,式I化合物的R3和R4中的每一个均为-NR5R6,优选-NR5H。因此,式I化合物的R3和R4优选都为-NR5H。
在本发明的一个更优选的实施方案中,式I化合物的R3和R4中的每一个均为-NR5R6,优选-NR5H,其中R5为未取代或取代的芳基,优选被C1-C4烷基取代,更优选被甲基取代。因此,R3和R4优选都为-NR5H,其中R5为未取代芳基或甲基取代的芳基。
在本发明的一个还更优选的实施方案中,式I化合物中的R3和/或R4为-NR5H,其中R5是未取代或取代的苯基或甲苯基(toluyl)残基。苯基残基可被烷基取代,例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。因此,取代的苯基可以是甲苯基。
在本发明的另一个优选的实施方案中,芳基为芳族的C6H5、C10H7或C14H9烃基残基,例如苯基、萘基或蒽基,优选芳族的C6H5或C10H7烃基残基,更优选芳族的C6H5烃基残基。因此,苯基、萘基或蒽基残基可以是未取代的或者被卤素原子或被烷基取代,卤素原子例如溴、氯或氟,优选溴或氯,烷基例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。还更优选的为烷基取代的苯基,例如甲苯基。
在本发明的再一个优选的实施方案中,R1和R2中的一个为1-羟基-4-乙基-丁基残基或正戊酸残基,而另一个为氢;且R5为4-甲苯基或苯基残基。还更优选的是这样的化合物,其中R1和R2中的一个为1-羟基-4-乙基-丁基残基,而另一个为氢,且R5为4-甲苯基残基;或者R1和R2中的一个为1-羟基-4-乙基-丁基残基,而另一个为氢,且R5为苯基;或者R1和R2中的一个为正戊酸残基,而另一个为氢,且R5为4-甲苯基残基;如实例中的定义。
术语“1-羟基-4-乙基-丁基残基”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指在其4位与式I化合物的喹啉-二酮部分连接的HO-(CH2)3CH(C2H5)-类型的烃链。
术语“4-甲苯基(4-toluyl)残基”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指由甲苯衍生的基团-C6H4(CH3),在本发明的情况下其在1位与R3和R4的-NR5R6基团的氮原子连接。
术语“正戊酸残基”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指由正戊酸(又称为缬草酸)衍生的-(CH2)4-COOH型的直链残基。
为了观察FRET现象,必须使供体和受体、各自的猝灭剂紧密靠近。因此,可将非荧光猝灭剂通过接头臂与生物分子或固相支持体连接,接头臂例如如上所述的连接基团Q部分。每个接头臂的长度可能十分重要,因为接头臂将影响供体与受体部分之间的距离。对于本发明目的的接头臂的长度是由猝灭剂到生物分子或固相支持体的距离,单位为埃。接头臂可以是WO 84/03285中所披露的种类。同样在WO84/03285和EP 313219中公开的是用于使接头臂与特定核苷酸碱基连接以及用于使荧光部分与接头臂连接的方法。
因此,在本发明的一个优选实施方案中,Y能够与(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘(disc);或(ii)生物分子,优选核酸或蛋白质结合。
术语“固体支持体”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指任何不溶性的惰性无机或有机材料,优选具有大的表面面积的无机材料,表面有机分子可以通过电子间相互作用或静电相互作用形成化学键或吸附从而与之连接,例如通过如上所述的官能团Y形成化学键。在本发明的情况下,“固体支持体”的代表性实例为硅酸盐,例如SiO2树脂,例如离子交换树脂、玻璃、葡聚糖(dextrane)、纤维素或者亲水聚合物或疏水聚合物。
术语“载体”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,常常是指可用作本发明化合物的固相支持体的无活性物质。
术语“微珠”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指任何由无机或有机材料制成的基本上为球形的小物体,它可以是带电的和/或磁化的,优选具有大的表面面积,表面有机分子可通过电子间相互作用或静电相互作用形成化学键或吸附从而与之连接。在本发明的情况下,“微珠”的代表性实例可由硅酸盐(例如SiO2树脂)制成,例如离子交换树脂、玻璃、葡聚糖、纤维素或者疏水聚合物或亲水聚合物。术语“盘”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指任何薄的平板或表面扁平并近似圆形的物体,优选具有大的表面面积,表面有机分子可通过电子间相互作用或静电相互作用形成化学键或吸附从而与之连接。在本发明的情况下,“盘”的代表性实例可由硅酸盐(例如SiO2树脂)制成,例如离子交换树脂、玻璃、葡聚糖、纤维素或者疏水聚合物或亲水聚合物。
术语“载体”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,常常是指用作活性物质载体的无活性物质。
术语“生物分子”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指由活的有机体产生的任何有机分子,或者是指这类化合物的任何人工产生的衍生物,包括大的聚合物分子例如蛋白质、多糖、碳水化合物、脂质、核酸和寡核苷酸以及小分子,例如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。
术语“核酸”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指由单体核苷酸链构成的大分子,其中每个核苷酸由3个组分构成:含氮杂环碱基,其为嘌呤或嘧啶;戊糖;以及磷酸基团。术语“蛋白质”在本文中按本领域普通技术人员已知的含义使用,是指由氨基酸组成的有机化合物,其中氨基酸排成直链,并且在相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间通过肽键连接在一起。肽也包括在内。
而且,本发明涉及制备下式II化合物的方法:
所述方法包括以下步骤:
a)使式R5-N=C(OH)-C(OH)=N-R5’的二取代草酰胺与五氯化磷反应,得到式R5-N=CCl-ClC=N-R5’的草酸的双偕亚氨酰氯(bis-imidoylchloride of oxalic acid);
b)使在步骤a)中得到的草酸的双偕亚氨酰氯与2-氨基甲基吡啶反应,得到下式III的二取代吡啶并[1,2-a]吡嗪:
和
c)使步骤b)中得到的二取代吡啶并[1,2-a]吡嗪与下式IV的一取代醌反应:
得到式II化合物,
其中R1、R2、R5如本发明化合物的上述详细定义,只要适用即可,且
其中R5’如本发明化合物的上述详细定义的R5的定义,只要适用即可。
在上文详述的式II化合物的制备方法的步骤a)中,通常将1当量式R5-N=C(OH)-C(OH)=N-R5’的二取代草酰胺(其中R5’如本发明化合物中的上述详细定义的R5的定义,只要适用即可)悬浮于约2当量的五氯化磷的无水甲苯溶液中,回流悬浮液直到得到清澈的暗黄色溶液并且完成气体释放为止。在气体释放完成后,真空蒸发溶剂,残余物用例如正庚烷重结晶,得到式R5-N=CCl-ClC=N-R5’的草酸的双偕亚氨酰氯。
在步骤b)中,将1当量2-氨基甲基吡啶与约2当量三乙胺一起溶于THF,使所得溶液例如逐滴与步骤a)中得到的约1当量相应的草酸的双偕亚氨酰氯溶液混合。然后,回流所得溶液达例如约4小时,在溶液冷却后,真空蒸发溶剂。残余物用例如少量甲醇洗涤,然后残余物用乙腈或THF重结晶,得到式III的二取代吡啶并[1,2-a]吡嗪。
在步骤c)中,将在步骤b)中得到的1当量式IV的一取代醌和约1当量式III的吡啶并[1,2-a]吡嗪溶于例如无水二氯甲烷中。例如通常可回流所得溶液5-12小时,或者通常可将溶液在室温下搅拌2-3天。例如采用薄层色谱法可以监测反应进程。反应完成后,将反应混合物蒸发至干,例如用硅胶柱色谱法纯化(用例如甲苯/乙酸酯或氯仿/甲醇洗脱),得到式II化合物。观察到形成两种区域异构体(regioisomer),残基R1和R2重排列。或者,反应还可以在甲苯中进行。在这种溶剂中反应进行得更快,然而,同时观察到副产物的量增加。
在实施例中还例举了优选的实施例。
具有上述猝灭剂的生物分子在FRET测定法中作为最新工具是特别有价值的。在这种情况下,术语生物分子在本文按上文说明使用。在代表性FRET测定法中,可以分析两种分子或聚合物(例如酶和底物)的结合。在这类方法中,荧光团和猝灭剂与聚合物的两种分子的特定部分连接。在因涉及FRET机制的猝灭而不存在荧光团的发射光谱时,可以检测相应络合物的形成。同样,使用FRET猝灭剂,还可以研究生物分子的特殊作用。以所谓的蛋白伴侣的关闭为基础进一步说明该实例,蛋白伴侣是桶状的“反应容器(reaction vessel)”,其中特定蛋白质是折叠的(参见H.S.Rye,Methods 24(2001),278)。“容器”(GroEL)具有一个“帽(cap)”(GroES),在ATP依赖性过程中该帽是盖在容器上的。GroEL提供荧光团,GroES提供猝灭剂。在ATP存在时,含有蛋白伴侣的样品的荧光光谱因涉及FRET的猝灭而显著改变。在ATP不存在时,测到荧光团的发射光谱,而在ATP存在下,这时“容器”被“帽”关闭,因此,荧光团和猝灭剂彼此紧密靠近,荧光团的荧光至少部分猝灭,理想的是完全猝灭。
FRET技术还可用于设计用作(杂交)探针的寡核苷酸。设计用作(杂交)探针的寡核苷酸可以类似于引物设计的方式进行,但是探针对成员优选退火至在同一链上的彼此几个(例如不超过5个)核苷酸的扩增产物上,使得可发生荧光共振能量转移(FRET)(例如彼此的核苷酸不超过1、2、3或4个)。这种最低程度的分隔通常使相应的荧光部分充分接近致使发生FRET。另外,可将探针设计成与含有突变或多态性的靶标杂交,因此基于例如要区别的各具体核酸类型相应的不同探针对的完全杂交,或者例如探针对的成员和由例如特定核酸产生的各扩增产物的差别解链温度,来差别性地检测例如特定的核酸。
本文所使用的“扩增”是指合成与模板核酸的一条或两条链互补的核酸的过程。扩增核酸通常包括使模板核酸变性,在低于引物解链温度的温度下使引物退火至核酸上,通过酶的作用使引物延伸以产生扩增产物。变性、退火和延伸步骤各自可以进行一次。然而一般而言,变性、退火和延伸步骤进行多次,致使扩增产物的量常以指数倍数增加。扩增通常需要脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如TaqPolymerase)和合适的缓冲液和/或适于聚合酶最佳活性的辅因子(例如MgCl2和/或KCl)的存在。
核酸型FRET技术的一种常用方式利用两个杂交探针,其中一个探针用荧光团标记,另一个探针用猝灭剂标记,且其中所述探针一般被设计成在靶DNA分子(例如扩增产物)上彼此紧密靠近杂交。然而,一种替代性FRET方式利用水解探针以检测扩增产物是否存在。该技术利用用一个荧光部分和一个猝灭部分标记的单链杂交探针。当荧光部分被适当波长光激发时,吸收的能量根据FRET原理被转移至猝灭剂,然后荧光被猝灭。在PCR(聚合酶链式反应)的退火步骤中,标记的杂交探针与靶DNA(即扩增产物)结合,并在随后的延伸期被TaqPolymerase的5’-3’外切核酸酶活性降解。因此,激发的荧光部分和猝灭部分在空间上彼此分隔开来。结果,当荧光团激发时如果无猝灭剂紧密接近,则可以检出荧光发射。举例来说,PRISM7700序列检测系统(Applied Biotechnology Institute,Inc.的商标,Corporation Iowa,Building 36,Cal Poly State University San Luis Obispo,California 93407,USA)采用水解探针技术。有关使用PRISM 7700系统进行PCR扩增和检测的信息可参见http://www.appliedbiosystems.com/products。
同样涉及荧光共振能量转移的又一种方式是所谓的(Roche Diagnostics GmbH的两个商标,Sandhofer Straβe 116,68305Mannheim(DE))。在该技术中,两个序列特异性寡核苷酸探针用不同的染料标记(供体和受体)后,与PCR引物一起加入反应混合物中。在退火阶段,HybProbe探针在扩增的DNA片段上以头尾排列方式与靶序列杂交,因此将使两种染料彼此靠近。供体染料(荧光素)被变蓝的LED激发。只要这两种染料彼此接近(15个核苷酸),由供体染料发出的能量便会激发第二HybProbe上的受体染料,接着便发出不同波长的荧光。这种荧光与PCR期间产生的靶DNA的量成正比。在延伸和变性步骤中HybProbe探针被置换。
因此,作为供体的荧光素或JA270和作为受体的本发明的荧光猝灭剂分子可用于涉及FRET的技术,例如上述技术。
采用实时PCR方法,可使用与FRET结合的分子信标来检测扩增产物的存在。分子信标技术利用用荧光团和猝灭剂标记的杂交探针,其中标记通常位于探针各端。分子信标技术利用具有允许二级结构形成(例如发夹结构)的序列的探针寡核苷酸。因此,当探针在溶液中时,在探针、荧光团和猝灭剂内形成的二级结构在空间上接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交后,探针的二级结构被破坏,荧光团和猝灭剂变得彼此隔开,因此,在用适当波长的光激发后,可检测到荧光团的发射。
最后,因为FRET的功效十分依赖于荧光团和猝灭剂之间的距离,所以它可适用于测定某一特定分子中两个特定区域之间的距离,其中一个区域用荧光团标记,而另一个区域用猝灭剂标记。
由于已知猝灭剂缀合物的缺点,因此存在对包含适用于FRET测定法的猝灭剂和生物分子的缀合物的需求。
此外,为了有利于将猝灭剂由溶液(例如探针溶液)中分离,还存在对包含适用于FRET测定法的猝灭剂和固相支持体的缀合物的需求。在这种情况下,就分离方法而论,包含本发明的化合物和固相支持体的缀合物是有益的,例如过滤或者涉及在电场中移动的分离或涉及带电粒子在磁场中的分离。
因此,本发明的化合物还可以是包含本发明的化合物和固相支持体的缀合物的组成部分。如上详述的本发明的化合物含有基团-Q-Y,其中Q为连接基团,Y为官能团。同样,如上详述的与连接基团Q连接的官能团Y可与固相支持体或生物分子的匹配官能团反应形成新的化学键。通过这个新形成的化学键,连接基团将本发明的化合物与固相支持体或与生物分子连接起来。
因此,本发明还涉及包含本发明的化合物和(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘;或(ii)生物分子,优选核酸或蛋白质的缀合物,其中所述化合物通过连接基团Q与支持体或生物分子偶联。
有关本发明缀合物的术语“固体支持体”、“载体”、“微珠”、“盘”、“生物分子”和“官能团Y”可以是如上所述的本发明化合物的优选实施方案的所述定义。
此外,为了得到包含本发明的化合物和(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘;或(ii)生物分子(优选核酸或蛋白质)的本发明缀合物,存在对制备本发明的缀合物的需求。
因此,本发明还涉及制备本发明的缀合物的方法,所述方法包括使本发明的化合物与(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘;或(ii)生物分子,优选核酸或蛋白质结合。
在制备本发明缀合物的本发明的方法方面的术语“固体支持体”、“载体”、“微珠”、“盘”、“生物分子”、“核酸”和“蛋白质”如上所述。
由于缀合物包含可用作猝灭剂的本发明的化合物,因此该缀合物本身也可用作猝灭剂。因此,包含本发明的化合物和(i)生物分子,优选核酸或蛋白质;或(ii)固相支持体,优选载体、微珠或盘的缀合物可用作荧光供体的猝灭剂。
因此,本发明还涉及本发明的化合物或者包含本发明的化合物和(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘;或(ii)有机分子,优选核酸或蛋白质的缀合物的用途,其中所述化合物通过连接基团Q与支持体或有机分子偶联而用作荧光供体的猝灭剂。
由于包含本发明的化合物和(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘;或(ii)生物分子(优选核酸或蛋白质)的本发明缀合物可用作荧光供体的猝灭剂,因此该缀合物也可在荧光共振能量转移(FRET)中用作猝灭剂。
因此,本发明还涉及包含本发明的化合物和(i)固相支持体,优选载体、微珠或盘;或(ii)生物分子,优选核酸或蛋白质的缀合物的用途,其中所述化合物通过连接基团Q与支持体或有机分子偶联,其中所述缀合物在例如如上详述的荧光共振能量转移(FRET)中用作猝灭剂。
实施例
实施例1:示例性猝灭剂化合物的制备
下列反应流程说明了制备式I化合物的通用反应途径。
化合物 | R1 | R2 | R5=R5’ |
4a(TWDQ9A) | (CH 2)4COOH | H | 4-甲苯基 |
4b(TWDQ9B) | H | (CH2)4COOH | 4-甲苯基 |
4c(TWDQ11A) | (CH2)4COOH | H | 苯基 |
4d(TWDQ11B) | H | (CH2)4COOH | 苯基 |
4e(TWDQ8A) | CH(CH2CH3)(CH2)3COOH | H | 4-甲苯基 |
4f(TWDQ8B) | H | CH(CH2CH3)(CH2)3COOH | 4-甲苯基 |
4g(TWDQ10A) | CH(CH2CH3)(CH2)3COOH | H | 苯基 |
4h(TWDQ10B) | H | CH(CH2CH3)(CH2)3COOH | 苯基 |
草酸的双偕亚氨酰氯(1)的制备:
将草酰胺(20mmol)悬浮于五氯化磷(40mmol)的无水甲苯(200)溶液中,回流直到得到透明的暗黄色溶液并且完成气体释放为止。反应完成后,减压除去溶剂,残余物用正庚烷重结晶。
吡啶并[1,2-a]吡嗪(2):
将2-氨基甲基吡啶(10mmol)与三乙胺(20mmol)一起溶于THF(50ml),滴加相应双偕亚氨酰氯(10mmol)的溶液。然后,使溶液回流约4小时,冷却后减压除去溶剂。残余物用少许冷甲醇洗涤,随后,残余物用乙腈或THF重结晶。
使喹啉成分与吡啶并[1,2-a]吡嗪(4a/b)反应:
将醌(1当量)和吡啶并[1,2-a]吡嗪(1当量)溶于无水二氯甲烷(无惰性气氛)(约30ml溶剂/1mmol醌),回流数小时(通常3-12小时)或者在室温下搅拌(通常2-3天)。反应过程采用薄层色谱法监测。反应完成后,使反应混合物浓缩至干,并用柱色谱法纯化(SiO2/甲苯:乙酸乙酯或氯仿/甲醇)。形成两个区域异构体,例如TWDQ 9A和B。
或者,在甲苯中进行该反应,其中反应进行得较快,然而观察到较大量的副产物。
2-(ω-羧基-丁基)-1,4-苯醌:TWDQ 9的前体
在60-65℃温度下,在45分钟内,将过硫酸铵(27mmol)的25ml水溶液在剧烈搅拌下滴加到1,4-苯醌(20mmol)、己二酸(40mmol)和硝酸银(6mmol)的40ml水溶液中。搅拌持续10分钟,然后使溶液冷却至0℃,过滤,将残余物在索格利特抽取器(Soxhlet apparatus)中用苯萃取。
收率:约35-40%,文献:42%
熔点:108-109℃
2-(1-乙基-4-羟基丁基)-1,4-苯醌:TWDQ10和TWDQ 8的前体
在60℃搅拌的同时,将过硫酸钠(0.01mol)的水(10ml)溶液加入硝酸银(0.2g)的水(40ml)溶液及1,4-苯醌(0.01mol)和1-己醇(0.04mol)的己烷(5ml)溶液的非均匀混合物中。用乙醚萃取,接着真空蒸发,得到残余物,残余物用硅胶柱色谱法纯化(用己烷/乙醚洗脱)。
异喹啉-醌:
TWDQ 8B(由于未进行X射线晶体结构分析,因此区域异构体的排布不详)
收率:两种异构体均约65%
1H-NMR(250MHz,CDCl3):0.85(t,3H);1.25(t,2H);1.53-1.63(m,4H);2.25(s,3H);2.34(s,3H);2.36(s,1H);2.95(m,1H);3.60(t,2H);6.59(s,1H);6.90-7.26(m,9H);7.35(t,1H);7.60(d,1H);7.86(t,1H);8.63(d,1H);10.47(s,1H)
UV/Vis(CHCl3):λmax(lgε)=586nm(3.9)
MS(DEI)=546(M+)
TWDQ 10A和B(由于未进行X射线晶体结构分析,因此区域异构体的排布不详)
TWDQ 10A
收率:约25%
1H-NMR(250MHz,CDCl3):0.70(t,3H);0.83(d,2H);1.51-1.61(m,4H);2.36(s,1H);2.88(m,1H);3.51(t,2H);6.64(s,1H);3.90-7.30(m,12H);7.67(d,1H);7.88(t,1H);8.56(d,1H);70.27(s,1H)
UV/Vis(CHCl3):λmax(lgε)=550nm(3.9)
MS(DEI)=518(M+)
TWDQ 10B
收率:约40%
1H-NMR(CDCl3):0.84(t,3H);0.90(d,2H);1.51-1.61(m,4H);2.37(s,1H);2.88(m,1H);3.51(t,2H);6.61(s,1H);7.00-7.39(m,12H);7.63(d,1H);7.86(t,1H);8.63(d 1H);10.35(s,1H)
UV/Vis(CHCl3):λmax(lgε)=555nm(3.9)
MS(DEI)=518(M+)
TWDQ 9A和B(由于未进行X射线晶体结构分析,所以区域异构体的排布不详)
TWDQ 9A
收率:约20%
1H-NMR(250MHz,CDCl3):1.27(m,2H);1.64(m,2H);2.26(s,3H);2.30(s,3H);2.34(m,2H);2.47(m,2H);6.65(s,1H);6.90-7.30(m,9H);7.42(t,1H);7.72(d,1H);7.95(t,1H);8.76(d,1H);10.45(s,1H)
UV/Vis(CHCl3):λmax(lgε)=558nm(3.9)
MS(DEI)=546(M+)
TWDQ 9B
收率:约35%
1H-NMR(250MHz,CDCl3):1.26(m,2H);1.60(m,2H);2.24(s,3H);2.28(s,3H);2.31(m,2H);2.45(m,2H);6.60(s,1H);6.90-7.25(m,9H);7.35(t,3H);7.60(d,1H);7.85(t,1H);8.64(d,1H);10.41(s,1H)
UV/Vis(CHCl3):λmax(lgε)=568nm(3.9)
MS(DEI)=546(M+)
TWDQ 9-NHS酯
将离析物溶于DMF(25mg/3ml)和6mg N-羟基琥珀酰亚胺中,加入15mg HBTU和11μl吗啉代-乙基-胩。搅拌溶液3小时。蒸发后,将粗制的混合物用制备型HPLC纯化。收率:81%
实施例2:示例性猝灭剂化合物在FRET测定法中的应用
应用水解探针检测技术,以λDNA实时PCR测定法对TWDQ9的猝灭功效进行了评价。
1.λDNA引物的合成
采用标准亚磷酸酰胺化学法(所有试剂可获自例如Sigma-Aldrich或Glen Research),在394DNA合成仪(Applied BiotechnologyInstitute,Inc.的商标,Corporation Iowa,Building 36,Cal Poly StateUniversity San Luis Obispo,California 93407,USA)中以1μmol的量合成了引物。引物用氢氧化铵在55℃下脱保护8小时。将氨性溶液蒸发,粗制寡核苷酸使用强阴离子交换HPLC柱纯化(氯化钠线性梯度,在高pH下)。合并含有产物寡核苷酸的流分,脱盐后,在10mM Tris(pH 8.0)中制备。测定了纯度和光密度。
λ正向引物 | AACAAAAACGGGGTTTACCTTA SEQ ID No.1 |
λ反向引物 | GTCGCTTTTTGCTGTCCCACAGTA SEQ ID No.2 |
2.λDNA BHQ2猝灭水解探针(参比)的合成
采用标准亚磷酸酰胺化学法,在394DNA合成仪(AppliedBiotechnology Institute,Inc.的商标,Corporation Iowa,Building 36,CalPoly State University San Luis Obispo,California 93407,USA)中以1μmole的量合成了水解探针。除标准dT亚磷酸酰胺tac-dA外,还使用了tac-dC和tac-dG保护的脱氧核苷酸亚磷酸酰胺(Sigma-Aldrich,目录号T111031、A112031、C112031、G112031)。另外,使用亚磷酸酰胺试剂,掺入JA270亚磷酸酰胺(Roche Applied Science,材料编号4906802)标记和Black Hole Quencher(BHQ-2)猝灭剂(BiosearchTechnologies Inc.,目录号BNS-5052)。通过3′-延伸阻断剂CPG(Clontech Inc.,目录号PT3357-2)引入3′-磷酸。寡核苷酸用氢氧化铵在室温下脱保护过夜。使氨性溶液蒸发后,粗制寡核苷酸用反相HPLC纯化(0.1M乙酸三乙铵(pH 7)缓冲液中乙腈增量的梯度)。合并含有产物寡核苷酸的流分,脱盐后在10mM Tris(pH 8.0)中制备。测定了纯度和光密度。
3.λDNA TWDQ9猝灭水解探针的合成
采用标准亚磷酸酰胺化学法,在394DNA合成仪(AppliedBiotechnology Institute,Inc.的商标,Corporation Iowa,Building 36,CalPoly State University San Luis Obispo,California 93407,USA)中以1μmole的量合成了水解探针。除标准dT亚磷酸酰胺tac-dA外,还使用了tac-dC和tac-dG保护的脱氧核苷酸亚磷酸酰胺(Sigma-Aldrich,目录号T111031、A112031、C112031、G112031)、TFA保护的3’-氨基调节剂亚磷酸酰胺(按照US 6,031,091制备基于3-氨基-1,2-丙二醇的氨基-调节剂亚磷酸酰胺)。另外,在5’端掺入FAM(5’-荧光素亚磷酸酰胺,Glen Research,目录号10-5901)或JA270亚磷酸酰胺(EP 0962497)标记。通过3′-延伸阻断剂CPG支持体(Clontech Inc.,目录号PT3357-2)引入3’-磷酸。寡核苷酸用氢氧化铵在室温下脱保护过夜。将氨性溶液蒸发后,粗制寡核苷酸使用反相HPLC纯化(0.1M乙酸三乙铵(pH 7)缓冲液中乙腈增量的梯度)。收集含有主峰的流分,脱盐后蒸发。将氨基修饰的寡核苷酸溶于0.1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5),加入2×2mg溶于DMF的TWDQ9-NHS酯(5小时后第二份)。在室温下反应过夜后(18小时),溶液经透析脱盐,随后使用反相HPLC再次纯化,其中使用0.1M乙酸三乙铵(pH 7)缓冲液的乙腈增量梯度。合并含有产物寡核苷酸的流分,脱盐后在10mM Tris(pH 8.0)中制备。测定了纯度和光密度。
λ探针2 | 5`-JA270TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC TWDQ9PO4-3` |
λ探针3 | 5`-FAM TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC TWDQ9PO4-3` |
4.实时PCR测定法
材料与方法:
·LC480仪器(96 block)(Roche Applied Science,目录号04640268001)
·LC TaqMaster Roche(Roche Applied Science,目录号04535286001)
·DNA lambda Roche(Roche Applied Science,目录号10745782001,[c=6.25ng/ml])
·λ反向引物:
5’-GTC GCT TTT TGC CCC ACA GTA-3’SEQ ID No.3
得自实施例1的BMO 07.442983lot ah_PP_48_A12-H12[c=10μM]
·λ正向引物:SEQ ID No.1
5’-AAC AAA AAC GGG GTT TAC CTT A-3’
得自实施例1的BMO 07.442982lot ah_PP_A11-H11[c=10μM]
·具有不同的报道分子/猝灭剂组合的3λ探针[c=5μM](得自实施例2和3):
5`-R TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC Q PO4-3`
寡核苷酸名称 | 寡核苷酸编号 | 5’修饰的R | 3’修饰的Q |
λ探针1 | GO2986 | JA270 | BHQ2 |
λ探针2 | GO3014 | JA270 | TWDQ9 |
λ探针3 | HO 1214 | FAM | TWDQ9 |
根据LC TaqMaster应用手册进行PCR设置。
各个探针用两个阴性样品和两个阳性样品进行了评价。
PCR程序:
在实施例A和实施例B中,使用下列探针进行实时PCR实验:
实施例A
λ水解探针1(GO 2986):
5’-X TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC Y PO4-3’
X=JA270 Y=BHQ2
λ水解探针2(GO 3014):
5’-X TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC Y PO4-3’
X=JA270 Y=TWDQ9
实施例B
λ水解探针1(GO 2986):
5’-X TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC Y PO4-3’
X=JA270 Y=BHQ2
λ水解探针2(GO 3014):
5’-X TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC Y PO4-3’
X=JA270 Y=TWDQ9
为了得到用罗丹明报道分子染料JA270标记的被BHQ2(探针1)或TWDQ9(探针2)猝灭的水解探针的比较结果,进行了实时PCR实验。尽管两种探针的信号背景值非常类似,但是对于TWDQ9猝灭探针,生长曲线的斜率和高度较好。TWDQ9猝灭探针2的cp值好于BHQ2猝灭探针1的cp值(cp=21.8与cp=22.0相比)。下表表示所得到的精确cp值:
# | 样品 | 探针 | cp |
1 | λDNA阴性 | λDNA探针1(GO 2986)JA270/BHQ2 | - |
2 | λDNA阴性 | λDNA探针1(GO 2986)JA270/BHQ2 | - |
3 | λDNA阳性 | λDNA探针1(GO 2986)JA270/BHQ2 | 22.06 |
4 | λDNA阳性 | λDNA探针1(GO 2986)JA270/BHQ2 | 22.03 |
5 | λDNA阴性 | λDNA探针2(GO 3014)JA270/TWDQ9 | - |
6 | λDNA阴性 | λDNA探针2(GO 3014)JA270/TWDQ9 | - |
7 | λDNA阳性 | λDNA探针2(GO 3014)JA270/TWDQ9 | 21.80 |
8 | λDNA阳性 | λDNA探针2(GO 3014)JA270/TWDQ9 | 21.82 |
实施例C
对用荧光素报道分子染料标记的被具有下列序列的TWDQ9猝灭的水解探针进行了实时PCR实验:
λ水解探针3(HO 1214):
5’-X TCG GTA CGG ATA CCG CGA AAG AGC Y PO4-3’
X=FAM Y=TWDQ9
可获得良好的生长曲线。所得到的cp值与JA270/TWDQ9标记的水解探针2的cp值相当。下表表示所得到的精确的cp值:
# | 样品 | 探针 | cp |
1 | λDNA阴性 | λDNA探针3(HO1214)FAM/TWDQ9 | - |
2 | λDNA阴性 | λDNA探针3(HO1214)FAM/TWDQ9 | - |
3 | λDNA阳性 | λDNA探针3(HO1214)FAM/TWDQ9 | 21.83 |
4 | λDNA阳性 | λDNA探针3(HO1214)FAM/TWDQ9 | 21.81 |
结果表明,猝灭剂还可与不同的报道分子染料组合。
Claims (15)
2.权利要求1的化合物,其中Q为直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的C2-C8烃链。
3.权利要求1或2的化合物,其中Y为羟基或羧基。
4.权利要求1-3中任一项的化合物,其中R3和/或R4为-NR5H。
5.权利要求1-4中任一项的化合物,其中R3和R4均为-NR5R6。
6.权利要求5的化合物,其中R5为取代或未取代的芳基。
7.权利要求5或6的化合物,其中取代或未取代的芳基为苯基或甲苯基。
8.权利要求1-7中任一项的化合物,其中芳基为芳族的C6H5、C10H7或C14H9烃基残基。
9.权利要求1-8中任一项的化合物,其中R1和R2中的一个为1-羟基-4-乙基-丁基残基或正戊酸残基,而另一个为氢;且R5为4-甲苯基或苯基残基。
10.权利要求1-9中任一项的化合物,其中Y能够与(i)固相支持体;或(ii)生物分子结合。
12.一种缀合物,所述缀合物包含权利要求1-10中任一项的化合物和(i)固相支持体或(ii)生物分子,其中所述化合物通过连接基团Q与支持体或生物分子偶联。
13.一种制备权利要求12的缀合物的方法,所述方法包括使权利要求1-10中任一项的化合物与(i)固相支持体或(ii)生物分子结合。
14.权利要求1-10中任一项的化合物或权利要求12的缀合物作为荧光供体猝灭剂的用途。
15.权利要求14的用途,其中所述缀合物在荧光共振能量转移(FRET)中用作猝灭剂。
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