ES2874138T3

ES2874138T3 - Indicadores de iones potasio genéticamente codificados

Info

Publication number: ES2874138T3
Application number: ES18725444T
Authority: ES
Inventors: Emrah Eroglu; Helmut Bischof; Wolfgang Graier; Roland Malli; Markus Waldeck-Weiermair
Original assignee: Univ Graz Medizinische; Medizinische Universitaet Graz
Current assignee: Univ Graz Medizinische; Medizinische Universitaet Graz
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2021-11-04
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: US10429374B2; CO2019012859A2; EP3622292B1; EP3622292A1; KR20200005645A; CA3062431A1; AU2018265070A1; JP2020521118A; AU2018265070B2; WO2018206625A1; CN110892264A; BR112019023530A2; RU2727685C1; US20180328908A1

Abstract

Polipéptido que comprende a) un primer dominio de señalización, y b) un sensor de potasio, que comprende b1) un primer dominio del sensor de potasio que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 70% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1; y b2) un segundo dominio del sensor de potasio que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 70% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2; en el que el sensor de potasio puede unirse a un ion potasio cargado positivamente y el primer dominio de señalización puede generar una señal detectable tras la unión de un ion potasio cargado positivamente al sensor de potasio.

Description

DESCRIPCIÓN

Indicadores de iones potasio genéticamente codificados

Antecedentes de la invención

Los iones potasio (K+) son necesarios para el correcto funcionamiento de todos los tipos de células. Los gradientes electroquímicos de K+ a través de la membrana plasmática y las membranas de orgánulos celulares impulsan los flujos de K+ para controlar una variedad de funciones celulares. Se sabe bien que las fluctuaciones de la concentración de K+ extracelular e intracelular controlan la contracción muscular, la liberación de neurotransmisores y hormonas, la excitabilidad neuronal, el volumen celular, la proliferación celular y la muerte celular. De este modo, no es sorprendente que un desequilibrio de la homeostasis de K+ tenga profundas implicaciones tanto a nivel celular como a nivel de organismo y esté asociada con una multitud de estados patológicos, incluyendo trastornos neurológicos, cardiovasculares, renales, inmunitarios, musculares y metabólicos, así como cáncer. Los flujos y el transporte de K+ a través de membranas biológicas se logran mediante numerosos canales, intercambiadores y bombas de K+ selectivos, que surgieron como dianas farmacológicas terapéuticas prometedoras para el tratamiento de diversas enfermedades. Sin embargo, el conocimiento actual de las fluctuaciones de K+ extracelular e intracelular es muy limitado debido a la falta de sondas aplicables para investigar la dinámica del K+ con alta resolución espacial y temporal.

Sorprendentemente, existen nuevas evidencias de que la concentración de K+ dentro de las células controla los eventos clave de la señalización, también independientemente de su impacto sobre el potencial de membrana. En un estudio reciente, se demostró que los niveles aumentados de K+ intracelular aumentan la actividad de la fosfatasa PP2A en células T (Eil et al., Nature 537, 539-543 (22 de septiembre de 2016). Como consecuencia, el complejo Akt-mTOR está hipofosforilado y se suprime la función efectora de las células T. Este estudio revela cómo se controlan las funciones celulares más fundamentales por los iones K+ independientemente de su contribución al potencial de membrana. Además, la distribución de K+ entre los orgánulos celulares y cómo pueden verse afectadas las concentraciones de K+ en orgánulos internos dinámicos y fuertes en determinadas condiciones fisiológicas y patológicas no se ha investigado hasta ahora de manera exhaustiva. El conocimiento en cuando a esto es muy escaso, principalmente debido a una falta de métodos y herramientas adecuados que permitan cuantificar los flujos de K+ a nivel de células y orgánulos celulares individuales en tiempo real. Actualmente, a menudo se usan electrodos sensibles a K+ para medir las fluctuaciones de K+ extracelular y, normalmente, requieren volúmenes de muestra relativamente grandes de al menos 1 ml. Estos electrodos son altamente selectivos para K+, pero apenas pueden usarse para detectar la dinámica espaciotemporal de las fluctuaciones de K+ y las señales de K+ intracelular. Se han desarrollado varios sensores de K+ fluorescentes químicos pequeños con el objetivo de obtener imágenes de las fluctuaciones de K+ extracelular o cambios de K+ dentro de las células. Sin embargo, estos indicadores iónicos fluorescentes tienen muchas limitaciones, ya que suelen ser menos específicos para K+, muestran un intervalo dinámico bajo, son sensibles a K+ en un intervalo no fisiológico, son difíciles de cargar en las células y los orgánulos celulares y, en algunos casos, son difíciles de obtener.

Debido a estas numerosas limitaciones graves de las sondas de K+ fluorescentes, obtener imágenes de K+ cuantitativas significativas usando microscopía de fluorescencia y/o fluorímetros es prácticamente imposible. Ruckh et al., ACS NANO, vol. 10, n.° 4, 18 de abril 2016, páginas 4020-4030 dan a conocer un constructo de FRET de puntos cuánticos sensibles a potasio conmutable por iones (abs). Ashraf et al. dan a conocer que una proteína de unión a potasio (Kbp) puede actuar in vivo como sensor de potasio citoplásmico, que es necesario para el crecimiento normal de E. coli a altas concentraciones de K+. (Structure, 3 de mayo de 2016; 24(5) 741-9). El documento WO 01/04623 A1 da a conocer peptólidos cíclicos marcados con fluorescencia (depsipéptidos) y su uso para la determinación óptica de la concentración de iones potasio en una muestra.

El documento US 2013/244891 A1 da a conocer un biosensor que comprende un fluorógeno aceptor activable unido mediante un ligador a un donante sensible al entorno que interacciona con un analito.

El documento WO 2012/112440 A2 da a conocer un copolímero fluorescente que pueden funcionar como sensor de iones potasio.

El documento US 2003/119195 A1 da a conocer fluoroionóforos a base de antraceno fluorescentes como sensores de potasio.

A la luz de esta técnica anterior, sigue existiendo la necesidad de proporcionar sensores de K+ adicionales. El desarrollo de tales sensores constituye un reto, puesto que, por ejemplo, la construcción de sondas basadas en proximidad constituye un reto. Hasta ahora, no puede predecirse de manera fiable si los efectos estéricos en un sensor genéticamente codificado debido a la unión del ligando puede inducir un cambio conformacional que pueda detectarse, por ejemplo, mediante extinción de fluorescencia o transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET). Por tanto, la idoneidad de un sensor genéticamente codificado depende, según el caso, del dominio de unión individual, el grado y la estabilidad de su cambio conformacional tras la unión del ligando y la secuencia de ligador opcional entre el módulo de unión y los dominios de detección.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar agentes novedosos adecuados para la detección de K+.

Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos novedosos para detectar K+ en una muestra.

Sumario

Los objetos de la presente invención se resuelven mediante un polipéptido que comprende:

a) un primer dominio de señalización, y

b) un sensor de potasio, que comprende

b1) un primer dominio del sensor de potasio que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 70% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1; y

b2) un segundo dominio del sensor de potasio que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 70% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2;

en el que el sensor de potasio puede unirse a un ion potasio cargado positivamente y el primer dominio de señalización puede generar una señal detectable tras la unión de iones potasio cargados positivamente al sensor de potasio.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica para un polipéptido adecuado para la detección de K+.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un vector que codifica para el polipéptido de la invención adecuado para la expresión génica en eucariotas o procariotas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido, el vector o el polipéptido de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para detectar iones potasio cargados positivamente en una muestra, que comprende las etapas de

a) proporcionar el polipéptido de la invención;

b) poner en contacto el polipéptido de la presente invención con la muestra;

c) medir la señal generada por el primer dominio de señalización; y/o

d) medir la señal generada conjuntamente por el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización;

en el que un cambio en la intensidad de señal después del contacto con la muestra indica la presencia de los iones potasio en la muestra.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un polipéptido según la presente invención para detectar un ion potasio cargado positivamente en una muestra.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para detectar iones potasio cargados positivamente.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una visión general esquemática del cambio conformacional en el polipéptido tras la unión de K+ al dominio BON, que aumenta la señal de FRET detectable.

La figura 2 muestra polipéptidos basados en FRET según la presente invención, en particular (a) una visión general esquemática de dos polipéptidos denominados GEPII 1.0 y R-GEPII 1.0, (b) la estructura tridimensional predicha de R-GEPII 1.0, (c) células HeLa que expresan o bien GEPII 1.0 (los dos paneles de la izquierda) o bien R-GEPII 1.0 (los dos paneles de la derecha). La barra de escala representa 10 pm, (d) señales de ECFP y de FRET (panel izquierdo) y señales de la razón de FRET (panel central) de GEPII 1.0 con el tiempo tras la adición y retirada de diferentes concentraciones de K+. El panel derecho muestra la curva de respuesta a la concentración de GEPII 1.0 en células HeLa permeabilizadas (digitonina 3 pM valinomicina 2 pM); CE50=2,04 (de 1,716 a 2,413) mM; N=10. (e) Señales representativas de la razón de FRET (panel izquierdo), de Clover (panel central) y de FRET (panel derecho) de R-GEPII 1.0 con el tiempo en células HeLa tratadas con valinomicina (10 pM).

La figura 3 ilustra la estructura tridimensional predicha del dominio BON de unión a K+ (a, b), en la que se destacan los aminoácidos ácidos. En (c), la figura 3 muestra la distancia entre los dos aminoácidos ácidos más cercanos. En (d), la figura 3 muestra el diámetro de poro predicho con el ion K+, seguida por (e) radio del ion K+ con y sin hidratación.

La figura 4 muestra imágenes confocales de variantes de GEPII 1.0 expresados en células HeLa sin y con diferentes secuencias de direccionamiento, la barra de escala en el panel a representa 10 pm: (a) muestra GEPII 1.0 sin ninguna secuencia de direccionamiento, (b) GEPII 1.0 con una secuencia de exportación nuclear, NES, (c) GEPII 1.0 con secuencia de localización nuclear, NLS, (d) GEPII 1.0 con secuencia de direccionamiento mitocondrial (repetición dimérica en tándem de COX8), (e) GEPII con secuencia de direccionamiento en el RE (de calreticulina en el extremo N terminal) más la secuencia de retención KDEL en el extremo C-terminal, (f) GEPII 1.0 anclado a GPI, (g) GEPII 1.0 perinuclear seleccionado como diana fusionándolo al extremo C-terminal de emerina y (h) CAAX-GEPII 1.0 para monitorizar K+ en el área por debajo del plasmalema. Las imágenes muestran que el polipéptido está ubicado en el orgánulo o subdominio seleccionado como diana de la célula.

La figura 5 muestra la variación máxima de señales de la razón de FRET de GEPII 1.0 purificado en respuesta a K+, Na+, Ca2+, Rb+ o Cs+ 3 mM, respectivamente. La razón más alta se obtuvo para K+. Na+ y Ca2+ mostraron las razones más bajas. Los experimentos se realizaron usando el lector de microplacas de fluorescencia CLARIOstar (BMG Labtech, Alemania). Se analizó GEPII 200 nM purificado en disolución tamponada con HEPES (pH: 7,3) que contenía Triton X-100 al 0,05% en ausencia o presencia de KCl, NaCl, CaCl², RbCl o CsCl 3 mM. Se transfirieron 80 pl de las disoluciones que contenían GEPII a una placa con múltiples pocillos (96 pocillos para el análisis por fluorescencia, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria) y se iluminó a 430 nm ± 10 nm. Se recogieron las emisiones a 475 nm ± 10 nm y 525 nm ± 10 nm, respectivamente. Se calcularon los valores de la razón de FRET (F⁵²⁵/F⁴⁷⁵) y se correlacionaron con valores respectivos de la razón de FRET de GEPII en ausencia de iones monovalentes y divalentes.

La figura 6 ilustra posibles aplicaciones para el polipéptido de la presente invención. La concentración de potasio en una pequeña muestra biológica (por ejemplo, muestra humana o de ratón) puede diluirse con un tampón libre de K+ y, a continuación, se añade el polipéptido de la presente invención y la concentración de iones potasio se detecta mediante FRET, por ejemplo, en una placa de múltiples pocillos (A) Se usó GEPII purificado para determinar la concentración de K+ en suero en pequeñas muestras de sangre (~30 pl) extraídas de la vena facial u orbitaria (B) de ratones de experimentación sin escarificar a los animales. Se determinaron los niveles de K+ en suero a partir de los valores respectivos de la razón de FRET de GEPII usando el ajuste de calibración lineal mostrado en el panel C. Tal como se representa, la curva de calibración se obtuvo usando 6 concentraciones de K+ definidas en disolución tamponada con HEPES. Se diluyeron los sueros de los ratones 1:12,5 con tampón HEPES y se mezclaron con disolución de GEPII en una placa de 96 pocillos produciendo una dilución final de 1:25. Se midieron las señales de la razón de FRET de estas muestras usando el lector de microplacas de fluorescencia CLARIOstar (BMG Labtech, Alemania). (D) Valores de K+ en suero, en mM, determinados usando GEPII 1.0 purificado de 4 ratones diferentes, a partir de los cuales se extrajo sangre de la vena facial (círculos rojos) u orbitaria (cuadrados azules). El modo de extracción de sangre no afectó a los valores de K+. (E) Los resultados mostrados en el panel D están representados gráficamente dependiendo del modo de extracción de sangre. (F) Valores de K+ determinados con GEPII 1.0 purificado en sueros de 5 ratones diferentes brevemente después de la extracción de sangre (0 horas), 2 y 4 horas después de eso. Estos datos muestra que GEPII 1.0 sigue siendo funcional en los sueros de ratones durante horas. (G) Los resultados mostrados en el panel F están representados gráficamente dependiendo del tiempo de medición de FRET después de la extracción de sangre.

Figura 7. El panel A ilustra esquemáticamente el uso de GEPII purificado para registrar dinámicamente la concentración de K+ extracelular con el tiempo en una placa de cultivo celular (de múltiples pocillos) como medición energética de la viabilidad celular. Las células suministradas con sustrato, tal como glucosa, sobreviven y mantienen un gradiente de K+ fisiológico, con K+ extracelular ~5 mM y K+ intracelular —130 mM. En estas condiciones, sólo mueren unas pocas células y liberan K+. Por el contrario, las células tratadas con antimetabolitos tóxicos, tales como 2-desoxiglucosa (2-DG), mueren y liberan K+ que, en consecuencia, aumenta en el sobrenadante. (B) Concentración de K+ con el tiempo del medio extracelular medido en una placa de 96 pocillos usando GEPII 1.0 purificado (c = 500 nM). Se mantuvieron células beta pancreáticas clonales (INS-1) en presencia de glucosa 10 mM (curva azul, control) o 2-DG 10 mM (curva roja). Tal como se indica, las células de control se trataron con digitonina 50 pM en el punto de tiempo de 14 horas, que liberaron al máximo K+ celular. Se determinaron las señales de la razón de FRET de GEPII usando el lector de microplacas de fluorescencia CLARIOstar (BMG Labtech, Alemania), tal como se describió anteriormente.

Descripción detallada

A continuación, antes de describir con detalle la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, a los protocolos ni a los reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el único propósito de describir realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que únicamente estará limitado por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica.

Aunque se citan varios documentos a lo largo del texto de esta memoria descriptiva, que se incorporan como referencia en su totalidad, nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser anterior a tal divulgación en virtud de la invención anterior.

La proteína de unión a K+ (Kbp), también conocida como YgaU, es una proteína citoplásmica soluble de 16 kDa de Escherichia coli. Es una proteína de unión a K+ altamente específica y es necesario para el crecimiento normal en presencia de altos niveles de K+ externo. El ion potasio se une exclusivamente al dominio BON (SEQ ID NO: 1) que, tras la unión, experimenta un cambio conformacional. La Kbp comprende además el dominio LysM (SEQ ID NO: 2), que puede interaccionar con el dominio BON.

Las secuencias de aminoácidos del dominio BON, el dominio LysM, así como la Kbp de longitud completa se muestran a continuación en la tabla 1.

Tabla 1. Secuencias del dominio BON y el dominio LysM de Kbp

Sorprendentemente, se ha descubierto que puede detectarse K+ mediante una proteína de fusión que comprende

a) un primer dominio de señalización, y

b) un sensor de potasio, que comprende

en la que el sensor de potasio puede unirse a un ion potasio cargado positivamente y el primer dominio de señalización puede generar una señal detectable tras la unión de un ion potasio cargado positivamente al sensor de potasio.

La unión de K+ al sensor de potasio puede desencadenar un cambio conformacional en dicho sensor de potasio que, a continuación, puede detectarse a través del dominio de señalización. Este principio se ilustra en la figura 1 para un polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos según la invención también se denominan en el presente documento indicador de iones potasio genéticamente codificado (GEPII).

En una realización preferida, el primer dominio de señalización es un dominio de proteína fluorescente. Es incluso más preferido que el primer dominio de señalización sea una proteína cian fluorescente, preferiblemente una proteína cian fluorescente que puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 6.

En una realización preferida, el primer dominio de señalización es un dominio de proteína fluorescente. Sin estar vinculado a ninguna teoría, la señal detectable generada por la primera señalización puede ser una extinción de la señal de fluorescencia del dominio de proteína fluorescente. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención comprende, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal:

i) el primer dominio del sensor de potasio;

ii) el primer dominio de señalización; y

iii) el segundo dominio del sensor de potasio.

Opcionalmente, el primer dominio de señalización puede estar precedido y/o seguido por una secuencia de ligador.

En aún otra realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención comprende, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: i) el primer dominio del sensor de potasio;

i) el segundo dominio del sensor de potasio;

ii) el primer dominio de señalización; y

iii) el primer dominio del sensor de potasio.

El primer dominio del sensor de potasio se basa en el dominio BON de Kbp.

En una realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 75% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 85% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 90% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 95% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 1.

En otra realización preferida, el primer dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácido. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 comprende desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 11 sustituciones. En una realización preferida, la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D41N, D43N, D51N, D59N, E64Q, D83N, D84N, Q26R, N35Q, N75Q o G52D. En una realización particularmente preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos para el primer dominio del sensor de potasio de SEQ ID NO: 1 que tiene las siguientes sustituciones: Q26R, N35Q, N75Q, G52D (SEQ ID NO: 5). El segundo dominio del sensor de potasio se basa en el dominio LysM de Kbp. En una realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 75% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 85% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 90% de identidad con la secuencia según s Eq ID NO: 2. En una realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 95% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2.

En otra realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 con al menos una sustitución de aminoácido. En una realización preferida, el segundo dominio del sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 11 sustituciones. En una realización preferida, la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en D104N, E125Q, D135N, N116Q, N118Q, N121Q y N127Q. En una realización particularmente preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos del segundo dominio del sensor de potasio de SEQ ID NO: 2 que tiene las siguientes sustituciones: D104N, E125Q, D135N (SEQ ID NO: 4). La numeración de los aminoácidos en la secuencia se basa en la secuencia de tipo natural de Kbp (SEQ ID NO: 3).

La tabla 2 resume las secuencias de aminoácidos respectivas de Kbp y variantes de los dominios BON y Lys.

Tabla 2: Kbp y variantes de los dominios BON y Lys

La presente invención también se refiere a un polipéptido que comprende

a) un primer dominio de señalización, y

b) un sensor de potasio, que comprende

b2) un segundo dominio del sensor de potasio que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 70% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 2; y

c) un segundo dominio de señalización;

en el que el sensor de potasio puede unirse a un ion potasio cargado positivamente y el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización, juntos, pueden generar una señal detectable tras la unión de un ion potasio cargado positivamente al sensor de potasio. Preferiblemente, la señal detectable puede generarse tras la unión de K+ al sensor de potasio. La unión de K+ puede inducir, por ejemplo, un cambio conformacional en el sensor de potasio y, a continuación, poner el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización en proximidad más cercana o más lejos entre sí, al menos contribuyendo de ese modo a generar la señal detectable. En una realización preferida, el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización se seleccionan conjuntamente del grupo que consiste en pares donante-aceptor de FRET, pares de enzimas de división o pares de proteínas fluorescentes de división, en el que el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización son las partes respectivas de un par (por ejemplo, dos mitades de una enzima de división o dos mitades de una proteína fluorescente de división). Preferiblemente, la unión de K+ al sensor de potasio puede inducir un cambio conformacional en el polipéptido y, a continuación, el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización pueden generar la señal detectable, por ejemplo, el par donante-aceptor de FRET puede generar una señal de FRET detectable, las dos mitades de una enzima de división pueden ser funcionales y catalizar una reacción que puede generar una señal detectable o las dos mitades de una proteína fluorescente de división podrán emitir luz con una longitud de onda especificada como señal detectable si se excita con luz con una longitud de onda dentro del intervalo apropiado.

En una realización preferida, el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización son un par donante-aceptor de FRET. Preferiblemente, el donante puede ser un dominio de proteína cian fluorescente (CFP) y el aceptor puede ser un dominio de proteína amarilla fluorescente (YFP). Más preferiblemente, el primer dominio de señalización puede ser el donante y el segundo dominio de señalización puede ser el aceptor. En una realización incluso más preferida, el primer dominio de señalización es el dominio de CFP donante y el segundo dominio de señalización es el dominio de YFP aceptor. También se prefiere que el dominio de CFP pueda comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 6, en el que la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión de fluorescencia son las mismas o sustancialmente las mismas que para el dominio de CFP según SEQ ID NO: 6, concretamente con un máximo de excitación a una longitud de onda de aproximadamente 436 nm y un máximo de emisión a una longitud de onda de aproximadamente 477 nm. Preferiblemente, el dominio de YFP puede ser la proteína venus circularmente permutada (CPV), que comprende, incluso más preferiblemente, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 7, en el que la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión de fluorescencia son las mismas o sustancialmente las mismas que para el dominio de YFP según SEQ ID NO: 7, concretamente un máximo de excitación a una longitud de onda de aproximadamente 514 nm y un máximo de emisión a aproximadamente 527 nm.

En otra realización preferida, el donante puede ser un dominio de Clover y el aceptor puede ser un dominio mRuby2. Más preferiblemente, el primer dominio de señalización puede ser el donante y el segundo dominio de señalización puede ser el aceptor. También se prefiere que el dominio de Clover pueda comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 8, en el que la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión de fluorescencia son las mismas o sustancialmente las mismas que para el dominio de Clover según SEQ ID NO: 8, concretamente con un máximo de excitación a una longitud de onda de aproximadamente 505 nm y un máximo de emisión a una longitud de onda de aproximadamente 515 nm. Preferiblemente, el dominio de mRuby2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos de al menos el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 9, en el que la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión de fluorescencia son las mismas o sustancialmente las mismas que para el dominio de mRuby2 según SEQ ID NO: 9, concretamente un máximo de excitación a una longitud de onda de aproximadamente 559 nm y un máximo de emisión a aproximadamente 600 nm.

La tabla 3 muestra las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 a 9.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de los dominios de señalización

En otra realización preferida, el polipéptido según la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos de GEPII 1.0 (SEQ ID NO: 13) o R-GEPII 1.0 (SEQ ID NO: 21).

En otra realización preferida, el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización comprenden modificaciones postraduccionales, tales como una molécula de fluoresceína conjugada u otros restos detectables o fluoróforos de molécula pequeña, que pueden contribuir a generar la señal detectable del primer dominio de señalización junto con la segunda señalización tras la unión de K+ al sensor de potasio.

En otra realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos de Kbp. En una realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 75% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 85% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 90% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 95% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 100% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3.

En otra realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención comprende, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal:

i) el primer dominio de señalización;

ii) el sensor de potasio, en el que preferiblemente el primer dominio del sensor de potasio está seguido por el segundo dominio del sensor de potasio; y

iii) el segundo dominio de señalización.

En otra realización preferida, el polipéptido según la presente invención puede comprender además al menos una secuencia de ligador . El ligador, que preferiblemente tiene una estructura flexible, es decir, que no es rígida, puede modificar la sensibilidad de la señal detectable. La secuencia de aminoácidos de ligador puede estar ubicada en la secuencia de aminoácidos del polipéptido entre dos cualesquiera del primer dominio de señalización, el primer dominio del sensor de potasio, el segundo dominio del sensor de potasio y el segundo dominio de señalización. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de ligador está precedida por la secuencia de aminoácidos del primer dominio del sensor de potasio y seguida por el segundo dominio del sensor de potasio. Sin embargo, por supuesto, también es posible que el dominio de ligador esté ubicado entre el sensor de potasio y el primer dominio de señalización, o entre el sensor de potasio y el segundo dominio de señalización.

En una realización, el ligador contiene la secuencia de aminoácidos -GGGG-.

En una realización preferida, el polipéptido comprende además al menos una secuencia de aminoácidos de ligador de fórmula (I):

-(GGS)x(GGGGS)y(GG)z- (I)

en la que

x es el número entero 0 ó 1,

y es un número entero desde 1 hasta 6,

z es el número entero 0 ó 1.

En una realización preferida, y no es 4.

En una realización preferida, y es 2, 3 ó 5.

En una realización preferida, x es 0, y es 1 y z es 1. Además, en esta realización, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En otra realización preferida, x es 0, y es 2 ó 3 y z es 0. Además, en esta realización, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.

En aún otra realización preferida, x es 0, y es 4 y z es 1. Además, en esta realización, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

En otra realización preferida, x es 1, y es 5 y z es 0. Además, en esta realización, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.

Se sabe que los niveles de K+ extracelular en sistemas biológicos oscilan normalmente entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM. En cambio, las concentraciones de K+ intracelular en el citosol y los orgánulos oscilan normalmente entre aproximadamente 100 mM y 300 mM. Tal como resultará evidente a partir de los ejemplos, los polipéptidos de la presente invención pueden proporcionar sensibilidades diferentes para K+, y esto puede depender de la presencia de una secuencia de ligador o sustituciones de aminoácido en SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, tal como se describió anteriormente. Por tanto, es necesario entender que el experto usaría un polipéptido según la presente invención con una sensibilidad adecuada para la aplicación respectiva. Por ejemplo, un experto podría usar un polipéptido con un valor de CE⁵⁰relativamente bajo, es decir, de hasta 20 mM, preferiblemente de hasta 10 mM y más preferiblemente de aproximadamente 5 mM, para medir los niveles de K+ extracelular, y los polipéptidos según presente invención que tienen un valor de CE50 más alto, es decir, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 mM, preferiblemente desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 mM, para medir las concentraciones de K+ intracelular. En el presente documento, los valores de CE50 se refieren a los valores de CE50 obtenidos mediante el método tal como se describe en ejemplo 4.

Por tanto, en una realización preferida, el polipéptido de la presente invención proporciona un valor de CE50 de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 mM. Este polipéptido puede ser particularmente adecuado para la detección de K+ intracelular.

En otra realización preferida, el polipéptido de la presente invención proporciona un valor de CE50 de aproximadamente hasta 20 mM y preferiblemente de aproximadamente 5 mM para medir el K+ extracelular. En otra realización preferida, el polipéptido comprende además una secuencia de direccionamiento. La secuencia de direccionamiento es una secuencia de aminoácidos que dirige el polipéptido a un orgánulo o subdominio seleccionado como diana de una célula o secreción extracelular. Los orgánulos y subdominios seleccionados como diana pueden incluir, por ejemplo, el núcleo, la mitocondria, el retículo endoplásmico (RE), la superficie celular, la membrana nuclear y el área por debajo del plasmalema. La secuencia de direccionamiento puede estar ubicada en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del polipéptido. La adición de una secuencia de exportación nuclear, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos LPPLERLTL, al extremo C-terminal del polipéptido, puede dar como resultado la localización del polipéptido únicamente en el citosol. La adición de una secuencia de localización nuclear al extremo C-terminal (KRSWSMAFC) puede dar como resultado la selección del núcleo como diana. La mitocondria puede seleccionarse como diana por una secuencia de direccionamiento mitocondrial, tal como una repetición dimérica en tándem de COX8. Los ejemplos de una secuencia de direccionamiento en el RE incluyen la secuencia de direccionamiento en el RE de calreticulina en el extremo N-terminal más la secuencia de retención KDEL en el extremo C-terminal del polipéptido de la invención. Por ejemplo, una secuencia de anclaje a GPI puede dirigir al polipéptido a la superficie celular. Los ejemplos de una secuencia diana perinuclear incluyen emerina, en la que la secuencia del polipéptido de la presente invención se fusiona con el extremo C-terminal de la emerina. Un ejemplo de una secuencia de direccionamiento del área por debajo del plasmalema es el dominio CAAX de la isoforma b de GTPasa Kras, por ejemplo, que tiene una secuencia MSKDVKKKKKKSKTKCVIM fusionada con el extremo C-terminal del polipéptido según la presente invención.

En una realización preferida, el polipéptido de la presente invención es un polipéptido aislado.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica para el polipéptido según la presente invención.

Resultará evidente para el experto en la técnica que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado según la invención puede estar codificado por diferentes secuencias de nucleótidos.

En una realización preferida, el polinucleótido según la invención tiene una longitud de menos de 9000 nucleótidos, menos de 8000 nucleótidos, menos de 7000 nucleótidos, menos de 6000 nucleótidos, menos de 5000 nucleótidos, menos de 4000 nucleótidos, menos de 3000 nucleótidos, menos de 2000 nucleótidos, menos de 1000 nucleótidos o menos de 500 nucleótidos.

En una realización preferida adicional, el polinucleótido aislado según la invención tiene una longitud de entre al menos 24 y 9000 nucleótidos, preferiblemente entre al menos 24 y 8000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 24 y 7000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 24 y 6000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 24 y 5000 nucleótidos e incluso más preferiblemente entre al menos 24 y 4000 nucleótidos. En otra realización preferida, el polinucleótido según la invención tiene una longitud de entre al menos 60 y 9000 nucleótidos, preferiblemente entre al menos 60 y 8000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 60 y 7000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 60 y 6000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 60 y 5000 nucleótidos e incluso más preferiblemente entre al menos 60 y 4000 nucleótidos. En una realización preferida adicional, el polinucleótido según la invención tiene una longitud de entre al menos 90 y 9000 nucleótidos, preferiblemente entre al menos 90 y 8000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 90 y 7000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 90 y 6000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 90 y 5000 nucleótidos e incluso más preferiblemente entre al menos 90 y 4000 nucleótidos. En aún otra realización preferida, el polinucleótido según la invención tiene una longitud de entre al menos 120 y 9000 nucleótidos, preferiblemente al menos el entre 120 y 8000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 120 y 7000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 120 y 6000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 120 y 5000 nucleótidos e incluso más preferiblemente entre al menos 120 y 4000 nucleótidos. En aún otra realización preferida, el polinucleótido aislado según la invención tiene una longitud de entre al menos 300 y 9000 nucleótidos, preferiblemente entre al menos 300 y 8000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 300 y 7000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 300 y 6000 nucleótidos, más preferiblemente entre al menos 300 y 5000 nucleótidos e incluso más preferiblemente entre al menos 300 y 4000 nucleótidos.

En otra realización preferida, un polinucleótido según la invención tiene una longitud de al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 1000 nucleótidos, al menos 2000 nucleótidos o al menos 2500 nucleótidos.

En una realización preferida, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 10. En una realización preferida adicional, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 91%, incluso más preferiblemente al menos el 92%, incluso más preferiblemente al menos el 93%, incluso más preferiblemente al menos el 94%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 96%, incluso más preferiblemente al menos el 97%, incluso más preferiblemente al menos el 98% o incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 10. En una realización particularmente preferida, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% o incluso más preferiblemente al menos el 98% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 10.

En una realización preferida, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 11. En una realización preferida adicional, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 91%, incluso más preferiblemente al menos el 92%, incluso más preferiblemente al menos el 93%, incluso más preferiblemente al menos el 94%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 96%, incluso más preferiblemente al menos el 97%, incluso más preferiblemente al menos el 98% o incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 11. En una realización particularmente preferida, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% o incluso más preferiblemente al menos el 98% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 11.

En una realización preferida, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 12. En una realización preferida adicional, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 91%, incluso más preferiblemente al menos el 92%, incluso más preferiblemente al menos el 93%, incluso más preferiblemente al menos el 94%, incluso más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 96%, incluso más preferiblemente al menos el 97%, incluso más preferiblemente al menos el 98% o incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 12. En una realización particularmente preferida, el polinucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia que muestra al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% o incluso más preferiblemente al menos el 98% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 12.

Las secuencias de SEQ ID NO: 10 a 12 se muestran a continuación en la tabla 4.

,

Un polinucleótido según la invención puede ser una molécula de ARN o ADN monocatenario o bicatenario. En algunas realizaciones, el polinucleótido aislado según la invención puede insertarse en un vector, tal como un vector de expresión. El vector de expresión puede ser, por ejemplo, un vector de expresión procariota o eucariota, tal como, por ejemplo, un plásmido aislado, un minicromosoma, un cósmido, un fago bacteriano, un vector retroviral o cualquier otro vector conocido por el experto en la técnica. Al experto en la técnica le resultará familiar cómo seleccionar un vector apropiado según la necesidad específica. En una realización preferida, el vector de expresión es un plásmido aislado.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un polinucleótido según la invención.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el polipéptido, el polinucleótido, el vector de expresión y/o el plásmido que codifica para el polipéptido de la presente invención. Dicha célula no es una célula madre embrionaria humana. Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, células de cultivos celulares in vitro o lisados celulares de células eucariotas, tales como células de mamífero, células humanas o células vegetales, o células procariotas, cada una de las cuales, opcionalmente, puede haberse modificado genéticamente mediante métodos habitualmente conocidos por el experto en la técnica, tales como transfección o transformación de dichas células.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar iones potasio cargados positivamente en una muestra, que comprende las etapas de

a) proporcionar un polipéptido según la presente invención;

b) poner en contacto el polipéptido según la presente invención;

c) medir la señal generada por el primer dominio de señalización;

a) proporcionar un polipéptido según la presente invención;

b) poner en contacto el polipéptido según la presente invención;

c) medir la señal generada por el primer dominio de señalización; y/o

La etapa a) de proporcionar el polipéptido se produce fuera del cuerpo humano.

En una realización de dicho método, el cambio en la intensidad de señal después del contacto con la muestra en comparación con la señal del polipéptido en ausencia de la muestra indica la presencia de K+ en la muestra. En otra realización preferida, el método según la presente invención es un método de obtención de imágenes (cuantitativa) in vivo.

En una realización preferida, la señal medida es una señal de fluorescencia, una señal colorimétrica o una señal de FRET. Preferiblemente, la señal puede generarse tras la unión de K+ al sensor de potasio del polipéptido según la presente invención. En una realización preferida, la señal puede generarse por un par donante-aceptor de FRET, par de enzimas de división o par de proteínas fluorescentes de división. La detección puede producirse mediante métodos habitualmente conocidos por el experto en la técnica.

En una realización, la señal medida es una señal de fluorescencia. En una realización preferida, la señal de fluorescencia se extingue mediante la unión de K+ al dominio del sensor de potasio.

En una realización más preferida, la señal detectable medida es una señal de FRET. Preferiblemente, la señal de FRET se genera por el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización. Más preferiblemente, la señal de FRET se genera por un par donante-aceptor de FRET, preferiblemente YFP, tal como CPV, y CFP. El experto en la técnica sabe cómo medir señales de FRET. Preferiblemente, la FRET entre YFP y CFP se mide después de la excitación con luz a una longitud de onda en el intervalo de desde aproximadamente 420 nm hasta aproximadamente 450 nm. Más preferiblemente, la medición se realiza después de la excitación con luz a aproximadamente 440 nm. También se prefiere que la emisión de luz se mida a una longitud de onda en el intervalo de desde aproximadamente 525 nm hasta aproximadamente 545 nm y más preferiblemente a aproximadamente 535 nm.

En otra realización preferida, el par de FRET es Clover y mRuby2 en lugar de YFP y CFP. En este caso, la señal de FRET se mide después de la excitación a de 470 nm a aproximadamente 490 nm y/o una emisión de luz en el intervalo de desde aproximadamente 510 nm hasta 520 nm (emisión 1) y desde 590 nm hasta aproximadamente 610 nm (emisión 2).

En una realización preferida, la etapa a) del método para detectar K+, es decir, proporcionar un polipéptido según la invención, puede comprender transfectar al menos una célula fuera del cuerpo humano o animal o transformar una célula procariota con un polinucleótido, un plásmido y/o un vector de expresión que codifica para el polipéptido según la presente invención. A continuación, el polipéptido según la invención puede proporcionarse mediante síntesis de proteínas de dicha célula. A continuación, el polipéptido según la presente invención puede aislarse a partir de la célula, secretarse por la célula o permanecer dentro de la célula. En otra realización preferida, el polipéptido según la presente invención puede proporcionarse en la etapa a) del método según la presente invención al proporcionar una célula según la presente invención.

En una realización preferida, el método según la presente invención puede detectar la presencia de iones potasio en cualquier tipo de muestra. Más preferiblemente, la muestra se selecciona del grupo que consiste en muestras biológicas o muestras líquidas, o una combinación de las mismas. Incluso más preferiblemente, la muestra es un cultivo celular, un sedimento celular, un lisado celular, una muestra de tejido de un ser humano o animal, sangre o un líquido que contiene K+. En una realización, la muestra también puede comprender una muestra biológica, tal como un cultivo celular, incluyendo un cultivo celular monocapa o un cultivo celular tridimensional, una suspensión celular, un sedimento celular, un lisado celular, una muestra de tejido de un ser humano o animal y una muestra líquida que contiene K+. A continuación, preferiblemente, el método según la presente invención puede usarse para caracterizar la influencia de K+ sobre la muestra biológica detectando la presencia y/o distribución de K+ y, opcionalmente, en combinación con la determinación de otros parámetros relevantes de la muestra biológica, tales como la apoptosis celular, la señalización celular, la expresión génica celular o similares. Por tanto, en un aspecto, el polipéptido de la presente invención puede usarse para detectar K+ en una muestra, tal como se describió anteriormente. En una realización preferida, el uso según la presente invención comprende el uso del polipéptido según la presente invención en la obtención de imágenes (cuantitativa) in vivo. El término “obtención de imágenes in vivo" se refiere a la obtención de imágenes en células vivas fuera del cuerpo humano, tal como microscopía de células vivas aisladas que se cultivaron in vitro. El polipéptido intracelular según la presente invención puede indicar, por ejemplo, cambios en los niveles de K+ en el citosol, el área por debajo del plasmalema, el núcleo, el retículo endoplásmico, la membrana nuclear y la mitocondria, por ejemplo, en respuesta a estrés o estímulos definidos.

En otra realización preferida, el polipéptido aislado de la invención puede ponerse en contacto, en un recipiente adecuado, por ejemplo, una placa de múltiples pocillos, con una muestra biológica y puede medirse directamente la concentración de potasio, por ejemplo, usando un lector de placas de fluorescencia. Una ventaja del uso del polipéptido según la presente invención es que un ensayo de este tipo requeriría una baja cantidad de muestra (sólo aproximadamente 5-10 pl) en comparación con la cantidad de muestra biológica necesaria para medir la concentración de potasio usando electrodos, que normalmente requiere de aproximadamente 100 a 1000 pl o incluso más volumen para bañar de manera adecuada el electrodo de K+. Por tanto, la determinación de la concentración de K+ en suero, usando un electrodo de K+ de este tipo, de pequeños animales de experimentación, tales como ratones, que tienen un volumen total de sangre de 1,5-2,5 ml (6-8% del peso corporal), requiere habitualmente el sacrificio del animal para obtener una concentración máxima en sangre. En otra realización preferida, el polipéptido según la presente invención puede usarse en un ensayo de muerte celular in vitro. Prácticamente en todos los tipos de células, particularmente en células excitables, se requiere una gran cantidad de energía para mantener un gradiente de Na+ y K+ a través de la membrana plasmática mediante la ATPasa de Na+/K+. En condiciones de estrés, las células no disponen de suficiente energía y, por consiguiente, tendrán una viabilidad reducida y, finalmente, experimentarán la muerte celular. En esta realización de la presente invención, el polipéptido aislado según la presente invención se añade al medio de cultivo de células cultivadas y puede usarse para monitorizar la concentración de K+ en el medio de cultivo con el tiempo. Cuando disminuye la viabilidad de las células o aumenta la aparición de muerte celular, aumentará la concentración de K+ en el medio. A continuación, esta puede detectarse usando el polipéptido de la presente invención, por consiguiente. El uso del polipéptido según la presente invención en este ensayo proporciona la ventaja de que permite mediciones en tiempo real que no dañan/influyen adicionalmente a las células a diferencia de otros ensayos de muerte/viabilidad celular del estado de la técnica (por ejemplo, ensayo MTT o ensayos basados en resazurina, tales como el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue®).

En otra realización, el polipéptido según la presente invención se usa en un ensayo de crecimiento celular. Se sabe que la concentración de K+ disminuye a medida que crecen las células. Cuando el polipéptido aislado según la presente invención se añade al medio de cultivo de células cultivadas, es posible monitorizar de nuevo el grado de crecimiento celular. Por ejemplo, este ensayo puede usarse para diferenciar entre un cultivo de células bacterianas en crecimiento y un cultivo de células bacterianas que contiene células muertas en su mayoría que no crecen ni se replican. Esto no puede determinarse mediante los métodos convencionales actuales para monitorizar el crecimiento bacteriano, por ejemplo midiendo la densidad óptica (DO600) del cultivo de células bacterianas.

En aún otra realización, el polipéptido según la presente invención puede usarse como sensor para la visualización de fluctuaciones de K+ extracelular en animales vivos usando microscopía intravital, por ejemplo, del cerebro o del músculo, en tiempo real. Por ejemplo, en esta aplicación, el polipéptido según la presente invención puede aplicarse por vía tópica a los animales. Por ejemplo, en este contexto, el polipéptido según la presente invención puede usarse como herramienta de investigación para la investigación del cáncer o trastornos neurológicos, tales como epilepsia, migrañas o traumatismo craneoencefálico, para el estudio de modelos animales.

En un aspecto, la presente invención también se refiere a un kit para detectar K+ en una muestra, que comprende al menos uno de:

a) un polipéptido según la invención;

b) un polinucleótido según la invención o el vector según la invención; y/o

c) una célula según la invención.

Los ejemplos de tales kits incluyen kits para determinar la muerte celular o la viabilidad celular, tal como se describió anteriormente. Además del polipéptido de la presente invención, un kit de este tipo puede incluir, por ejemplo, al menos uno de los siguientes elementos:

a) un tampón libre de K+ adecuado para diluir la muestra;

b) al menos una disolución patrón con una concentración conocida de K+ como control positivo;

c) si el kit contiene más de una disolución, las disoluciones patrón pueden contener diferentes concentraciones de K+ para obtener una curva de calibración usando dichas disoluciones patrón; o d) un tampón adecuado para diluir el polipéptido según la presente invención.

Un kit que comprende el polinucleótido o el vector según la presente invención puede comprender además plásmidos que codifican para sólo uno o ambos de los dominios de señalización o sólo para el sensor de potasio para generar muestras de control. El kit puede comprender además un tampón adecuado para diluir el polinucleótido o el vector.

Un kit que comprende la célula según la presente invención puede comprender además un medio de cultivo y/o un medio de crioconservación adecuado para la célula.

En aún otra realización, el polipéptido según la presente invención también puede usarse en un kit portátil de prueba rápida para determinar K+. El polipéptido según la presente invención puede estar presente, en una prueba de este tipo, en una disolución, preferiblemente una disolución libre de potasio, o puede inmovilizarse sobre una fase sólida o sobre perlas.

Definiciones

Se introducen las siguientes definiciones. Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular de “un” y “uno/a” también incluyen los plurales respectivos, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Debe entenderse que el término “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, no es limitativo. Para el propósito de la presente invención, el término “que consiste en” se considera como una realización preferida del término “que comprende”.

A continuación en el presente documento, si se define un grupo como que comprende al menos un determinado número de realizaciones, esto quiere decir que también abarca un grupo que consiste preferiblemente en estas realizaciones únicamente.

Los términos “aproximadamente” y “de manera aproximada” o “sustancialmente igual” en el contexto de la presente invención indican un intervalo de precisión que un experto en la técnica entenderá para garantizar aun así el efecto técnico de la característica en cuestión. El término abarca normalmente una desviación del valor numérico indicado de ±10% y preferiblemente de ±5%.

Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio” se refiere a elementos estructurales de polipéptidos o proteínas de fusión. Por tanto, el término dominio comprende partes de un polipéptido que pueden plegarse, funcionar y/o existir independientemente de la parte restante de la estructura o cadena del polipéptido. Por ejemplo, la proteína cian fluorescente se considera como un dominio cuando forma parte de una proteína de fusión. Además, el término dominio, tal como se usa en el presente documento, también comprende cada parte de una enzima de división o proteína fluorescente de división, en el que cada parte se considera como un dominio aunque los dos dominios de una enzima de división o proteína fluorescente de división puedan plegarse únicamente y funcionar juntos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para describir moléculas de proteína que pueden comprender proteínas de longitud parcial o completa. El término incluye “proteínas de fusión”, que comprenden proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos derivada de dos o más proteínas. La proteína de fusión también puede incluir regiones de unión de aminoácidos entre porciones de aminoácidos derivadas de proteínas independientes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “señal detectable” se refiere a un aumento o a una disminución de las señales usadas habitualmente en los campos técnicos de la bioquímica, la química, la tecnología médica o de diagnóstico. Los ejemplos de la señal detectable incluyen, pero no se limitan a, una señal eléctrica (por ejemplo, capacitancia), mecánica, óptica, acústica o térmica. Preferiblemente, la señal óptica puede ser una señal de fluorescencia, una señal de FRET, una señal colorimétrica o una señal de electroquimioluminiscencia. También se prefiere que la señal pueda ser detectable, es decir, la señal y un cambio respectivo de la señal pueden monitorizarse usando los equipos tecnológicos apropiados. Preferiblemente, la señal detectable puede ser una señal generada o alterada de manera dependiente de la proximidad, por ejemplo, inducida por un cambio conformacional de un polipéptido.

El término “FRET”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre o dentro de moléculas. En los métodos de FRET, un fluoróforo puede actuar como donante de energía y otro es un aceptor de energía. Algunas veces, estos se conocen como indicador y extintor, respectivamente. El donante puede excitarse a una longitud de onda específica de luz para la que normalmente mostrará una longitud de onda de emisión de fluorescencia. El aceptor también puede excitarse a una longitud de onda de tal manera que pueda aceptar la energía de emisión de la molécula donante mediante una variedad de mecanismos de transferencia de energía dependiente de la distancia. Generalmente, el aceptor acepta la energía de emisión del donante cuando están en proximidad cercana. El donante y el aceptor pueden ser moléculas diferentes o pueden ser partes independientes de la misma molécula, tales como dos dominios diferentes de un polipéptido. Las técnicas de medición de FRET se conocen bien en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “par donante-aceptor de FRET” se refiere a fluoróforos que representan el donante de energía y el aceptor de energía que pueden experimentar FRET, tal como se describió anteriormente. En este contexto, el término “fluoróforo” se refiere a un componente de una molécula que hace que la molécula sea fluorescente. Es un grupo funcional en una molécula que absorberá luz de una longitud de onda específica y emitirá de nuevo luz a una longitud de onda diferente (pero igualmente específica). La cantidad y la longitud de onda de la luz emitida dependen del fluoróforo y del entorno químico del fluoróforo. Los fluoróforos incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína (FITC), un derivado reactivo de la fluoresceína, rodamina (TRITC), cumarina, colorantes de cianina (Cy), por ejemplo, cianina 3, cianina 5 o cianina 7, proteínas fluorescentes, tales como la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea Victoria o Renilla reniformis, o variantes de proteínas de la misma, tales como proteína amarilla fluorescente (YFP), incluyendo Citrine, Venus e Ypet; proteína azul fluorescente (BFP), tal como EBFP, EBFP2, azurita, mKalamal; proteína cian fluorescente (CFP), tal como ECFP, Cerulean, CyPet; y otras proteínas fluorescentes, tales como UnaG, dsRed, mRuby2, Clover, eqFP611, Dronpa, TagRFP, KFP, EosFP, Dendra, IrisFP, Clover, mRubby, mKOk y mKO2. Los fluoróforos de molécula pequeña, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), un derivado reactivo de la fluoresceína, rodamina (TRITC), cumarina, cianina (Cy), pueden conjugarse con proteínas y actuar como fluoróforo. Los ejemplos de fluoróforos que pueden usarse como par donante-aceptor de FRET incluyen, pero no se limitan a, CFP como donante e YFP como aceptor, EGFP como donante y Cy3 como aceptor, o EGFP como donante e YFP como aceptor, o Clover como donante y mRuby2 como aceptor, o cpEGFP como donante y mKO2 como aceptor.

Tal como se usa en el presente documento, el término “enzima de división” se refiere a una enzima biológicamente activa que se divide en al menos dos porciones que tienen actividad biológica al menos reducida o nula. En este contexto, el término “par de enzimas de división” se refiere a las al menos dos porciones de enzimas al menos parcialmente inactivas. Al estar en proximidad cercana, las porciones de enzimas interaccionan para formar la enzima biológicamente activa, que puede detectarse usando técnicas de detección de enzimas convencionales. La tecnología de enzimas de división también se describe adicionalmente en el documento WO 2005/094441 A2. Los ejemplos de enzimas de división incluyen, pero no se limitan a, luciferasa de Renilla que puede reconstituirse y monitorizarse por bioluminiscencia; complementación con p-galactosidasa de división en la que la actividad puede monitorizarse mediante detección colorimétrica, por quimioluminiscencia o fluorescencia; p-lactamasa de división cuya complementación puede someterse a ensayo por el cambio de color de la nitrocefina tras la hidrólisis o por fluorescencia mediante CCF-2/AM; GTPasas (cambio de carga), peroxidasas (colorimétrica), nucleasas (escisión en el interior y en el exterior), endonucleasas de restricción (escisión en el interior específica de secuencia), proteasas (escisión de proteínas), ligasas (ligación de oligos de ácidos nucleicos) y tiol-disulfuro oxidorreductasas (cambio conformacional a través de los enlaces disulfuro). Tal como se usa en el presente documento, el término “pares de proteína fluorescente de división (SFP)” se refiere a al menos dos porciones de una proteína fluorescente. Las SFP se componen de múltiples péptidos o fragmentos de polipéptido que, individualmente, no son fluorescentes, pero que, cuando se complementan, forman una molécula fluorescente funcional. Por ejemplo, la proteína verde fluorescente de división (Split-GFP) es una SFP. Algunas moléculas de Split-GFP modificadas por ingeniería pueden autoensamblarse. (véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0221343 y la publicación PCT n.° WO/2005/074436; Cabantous et al., Nat. Biotechnol., 23:102-107, 2005; Cabantous y Waldo, Nat. Methods, 3:845-854, 2006). El documento US2012282643 también describe variantes de proteína amarilla fluorescente de división y variantes de proteína cian fluorescente de división.

La determinación del “porcentaje de identidad” entre dos secuencias, tal como se usa en el presente documento, se logra preferiblemente usando el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Un algoritmo de este tipo se incorpora, por ejemplo, en los programas BLASTn y BLASTp de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 disponibles en N^cBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). La determinación del porcentaje de identidad se realiza preferiblemente con los parámetros convencionales de los programas BLASTn y BLASTp.

Las búsquedas de polinucleótidos con BLAST se realizan preferiblemente con el programa BLASTn.

Para los parámetros generales, la casilla “secuencias diana máximas” puede establecerse en 100, la casilla “consultas breves” puede marcarse, la casilla “umbral esperado” puede establecerse en 10 y la casilla “tamaño de palabra” puede establecerse en 28. Para los parámetros de puntuación, las “puntuaciones de coincidencia/no coincidencia” pueden establecerse en 1,-2 y la casilla “costes por hueco” puede establecerse en lineal. Para los parámetros filtros y enmascaramiento, la casilla “regiones de baja complejidad” puede no marcarse, la casilla “repeticiones específicas de especie” puede no marcarse, la casilla “máscara sólo para búsqueda de tabla” puede marcarse, la casilla “máscara para letras en minúscula” puede no marcarse.

Las búsquedas de proteínas con BLAST se realizan preferiblemente con el programa BLASTp.

Para los parámetros generales, la casilla “secuencias diana máximas” puede establecerse en 100, la casilla “consultas breves” puede marcarse, la casilla “umbral esperado” puede establecerse en 10 y la casilla “tamaño de palabra” puede establecerse en “3”. Para los parámetros de puntuación la casilla “matriz” puede establecerse en “BLOSUM62”, la casilla “costes por hueco” puede establecerse en “existencia: 11, extensión: 1”, la casilla “ajustes composicionales” puede establecerse en “ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional”. Para los parámetros filtros y enmascaramiento, la casilla “regiones de baja complejidad” puede no marcarse, la casilla “máscara sólo para búsqueda de tabla” puede no marcarse y la casilla “máscara para letras en minúscula” puede no marcarse.

El porcentaje de identidad se determina en toda la longitud de la secuencia de referencia respectiva, es decir, en toda la longitud de la secuencia según la SEQ ID NO o las SEQ ID NO enumeradas en el contexto respectivo. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID No : 1 muestra al menos 80% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 en toda la longitud de SEQ ID NO: 1. En otro ejemplo, una secuencia que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según SEQ ID NO: 3 muestra al menos el 80% de identidad con respecto a SEQ ID NO: 3 en toda la longitud de SEQ ID NO: 3.

El término “aislado” en el contexto de la presente invención indica que un polipéptido o polinucleótido se ha retirado de su entorno natural y/o se presenta en una forma en la que no se encuentra en la naturaleza. Un polipéptido “aislado” o un polinucleótido “aislado” también puede ser un polipéptido o polinucleótido que se ha generado in vitro.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sustitución de aminoácido” se refiere a una sustitución en una secuencia de aminoácidos según una sustitución conservadora o no conservadora, preferiblemente una sustitución conservadora. En algunas realizaciones, una sustitución también incluye el intercambio de un aminoácido que se produce de manera natural por un aminoácido no natural. Una sustitución conservadora comprende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una propiedad química similar al aminoácido que se sustituye. Preferiblemente, la sustitución conservadora es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una sustitución de un aminoácido básico por otro aminoácido básico diferente;

(ii) una sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido diferente;

(iii) una sustitución de un aminoácido aromático por otro aminoácido aromático diferente;

(iv) una sustitución de un aminoácido alifático apolar por otro aminoácido alifático apolar diferente; y (v) una sustitución de un aminoácido sin carga polar por otro aminoácido sin carga polar diferente.

Un aminoácido básico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en arginina, histidina y lisina. Un aminoácido ácido es preferiblemente aspartato o glutamato.

Un aminoácido aromático se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano. Un aminoácido alifático apolar se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, metionina e isoleucina. Un aminoácido sin carga polar se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en serina, treonina, cisteína, prolina, asparagina y glutamina. A diferencia de una sustitución de aminoácido conservadora, una sustitución de aminoácido no conservadora es el intercambio de un aminoácido por cualquier aminoácido que no se encuentre dentro de las sustituciones conservadoras (i) a (v) mencionadas anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra biológica” se refiere a una muestra de tejido (por ejemplo, biopsia de tejido), órgano, célula, lisado celular o líquido corporal (sangre, orina, saliva, bilis, suero, líquido cefalorraquídeo y similares) fuera del cuerpo de un ser humano o animal. Además, el término “muestra biológica” también incluye células de cultivos celulares in vitro o lisados celulares de células eucariotas, tales como células de mamífero, células humanas o células vegetales, o células procariotas que, opcionalmente, pueden haberse modificado genéticamente mediante métodos habitualmente conocidos por el experto en la técnica, incluyendo los métodos de transfección y transformación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “unión” se refiere a una interacción atractiva entre dos moléculas que da como resultado una asociación estable en la que las moléculas están en proximidad cercana entre sí. El resultado de la unión suele ser la formación de un complejo molecular en el que las fuerzas atractivas que mantienen juntos a los componentes son generalmente no covalentes y, por tanto, normalmente son energéticamente más débiles que los enlaces covalentes.

Ejemplos

1. Cultivo celular, transfección celular, productos químicos y tampones

Se hicieron crecer células HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma Aldrich) que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml. Al 60-80% de confluencia, se transfectaron las células en placas de obtención de imágenes de 30 mm con 1 ml de medio libre de suero y antibióticos que se había mezclado con 1,5 pg del ADN plasmídico apropiado y 3 pg de reactivo de transfección TransFast™ (Promega). Se mantuvieron las células en una incubadora humidificada (37°C, el 5% de CO², el 95% de aire) durante 16-20 horas antes de cambiar de nuevo al medio de cultivo respectivo. Todos los experimentos se realizaron 24 horas después de la transfección. La valinomicina se adquirió de Sigma Aldrich y se usó en una concentración final de 7 pM. El tampón experimental usado se componía de (en g/l): 8,0 o 7,6 de NaCl, 1,44 de Na2HPO4, 0,12 de NaH2PO4, pH 7,40 usando NaOH con 0,4 de KCl o sin KCl.

2. Obtención de imágenes de células en vivo

La obtención de imágenes de fluorescencia se realizó usando el dispositivo TiLL iMIC (Till Photonics, Graefelfing, Alemania), un sistema obtención de imágenes de fluorescencia digital de campo amplio. El R-GEPII basado en FRET desplazado al rojo se excitó a 480 nm y las emisiones se capturaron a 510-540 nm (Clover, es decir, donante de FRET) y 560-610 nm (FRET de Clover para mRuby2), respectivamente. El GEPII 1.0 basado en CFP/YFP se excitó a 430 nm y las emisiones se registraron a 480 nm y 535 nm, respectivamente. La adquisición de datos y el control del microscopio de fluorescencia digital se realizaron usando el software de adquisición en vivo, versión 2.0.0.12 (Till Photonics).

3. Modelado in silico

Se predijeron modelos del dominio BON y de la Kbp de longitud completa usando la herramienta en línea Phyre2 (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index). Se realizaron análisis adicionales de las estructuras tridimensionales predichas de la quimera usando el software PyMol viewer. La predicción de túnel se realizó usando la herramienta en línea PoreWalquer 1.0 (http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/software/PoreWalquer/). 4. Detección de K+ mediante FRET

Se generó ADN plasmídico que codifica para los polipéptidos GEPII 1.0 y R-GEPII 1.0 (figura 2a y b) usando estrategias de clonación clásicas. GEPII 1.0 comprende un par de FRET de CFP/YFP optimizado (sECFP como donante de FRET y cpV como aceptor de FRET) (figura 2a, panel superior). El R-GEPII 1.0 desplazado al rojo contiene Clover y mRuby2 (figura 2a, panel inferior y b), que son variantes de FP roja y verde brillante, respectivamente, optimizadas para la generación de sondas basadas en FRET batocrómicas con dinámica mejorada. Ambas sondas se sometieron a prueba en células HeLa que expresaban GEPII 1.0 basado en CFP/YFP (figura 2c, paneles de la izquierda) o R-GEPII 1.0 desplazado al rojo (figura 2c, paneles de la derecha) después de la transfección del ADN plasmídico respectivo. Con el fin de controlar la concentración de K+ citosólico ([K+]cito), se permeabilizaron las células con una mezcla de digitonina y el ionóforo de K+ valinomicina (figura 2d) o con valinomicina sola (figura 2e). De hecho, la señales de la razón de FRET de los GEPII aumentó en respuesta a la adición de K+ de manera dependiente de la concentración (figura 2d), mientras que la fluorescencia de FRET disminuyó inmediatamente tras la retirada de K+ (figura 2d y e). Estos experimentos confirmaron que el diseño y la generación de FP y constructos quiméricos basados en Kbp produjeron sondas basadas en FRET funcionales que proporcionan una lectura en tiempo real de los cambios de K+.

In situ, se encontró que la concentración efectiva semimáxima (CE⁵⁰) del GEPII 1.0 basado en CFP/YFP y el R-GEPII 1.0 respectivo era de 2,04 (1,72-2,41) mM (figura 2d, panel derecho) y de 4,11 (3,25-5,19) mM (n=8), respectivamente. Con el fin de determinar los valores de CE50 in situ (células HeLa individuales cultivadas), se permeabilizaron las células que expresaban los GEPII con digitonina 5 pM durante 10 minutos en una disolución libre de K+. La digitonina se aplicó a las células sobre el microscopio usando un sistema de perfusión semiautomático. La obtención continua de imágenes de la razón de FRET con el tiempo se usó para investigar la sensibilidad a K+ de las sondas. Se añadieron diferentes concentraciones de K+ que oscilaban entre 0,01 mM y 100 mM mediante el sistema de perfusión hasta que la señal de la razón de FRET aumentó y permaneció estable. Los valores de la variación máxima de la razón de FRET se representaron gráficamente frente al logaritmo de las concentraciones de K+ respectivas y se ajustaron usando una ecuación sigmoidea de respuesta a la concentración. El análisis de datos se realizó usando el software GraphPad Prism 5.

5. Diseño racional de variantes polipeptídicas

Con el fin de manipular la sensibilidad a K+ de los GEPII, se rediseñó de manera racional la Kbp de tipo natural basándose en el análisis de la secuencia y el modelado tridimensional de la homología usando el software Phyre-2 y PyMol. Las predicciones, así como los datos preliminares, indicaron que las mutaciones que codifican para aminoácidos cargados y polares en el dominio BON y LysM reducen significativamente la sensibilidad a K+ de los GEPII basados en FRET respectivos.

En el dominio BON de unión a K+ de tipo natural de Kbp, pueden identificarse 8 posiciones de aminoácidos ácidos: D41, D43, D51, D59, E64, E67, D83 y D84 (figura 3a y b, áreas rojas). Curiosamente, el modelado tridimensional del dominio BON usando Phyre2 y PyMol predijo una estructura de poro o similar a un túnel (figura 3a). La distancia mínima de dos aminoácidos ácidos dentro de este poro es de alrededor de 680 a 800 pm (figura 3c), considerando un diámetro de poro mínimo de alrededor de 660 pm (figura 3d). Los aminoácidos ácidos cercanos al poro y dentro del mismo pueden interferir y unirse bien al ion K+ hidratado (figura 3e).

Además, los análisis de secuencias combinados con el modelado tridimensional del dominio BON (figura 3) predijeron que, además de todos los aminoácidos ácidos, Q (glutamina) en 27, N (asparagina) en 35, N (asparagina) en 75 y G (glicina) en 53 se consideran importantes para la detección de K+.

Tres aminoácidos cargados negativamente en las posiciones 105 (D), 126 (E) y 408 (D) dentro del dominio LysM, que se supone que interacciona con el dominio BON de unión a K+, también parecen ser significativos para el cambio conformacional de la proteína tras la unión a K+.

6. Detección de FRET usando las variantes polipeptídicas

Se generó ADN plasmídico que codifica para mutantes de GEPII 1.0 usando mutagénesis dirigida al sitio. En este caso, se usaron cebadores que contenían polimorfismos de nucleótidos únicos diseñados para la PCR respectiva usando la polimerasa herculasa II (Agilent Technologies, Santa Clara, EE.UU.). A continuación, se subclonaron los productos de PCR respectivos en un vector de expresión de mamífero pcDNA3.1(-) usando las enzimas de restricción respectivas. A continuación, se transfectaron células Hela con el ADN plasmídico respectivo y se determinó la CE⁵⁰tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Los resultados para las variantes polipeptídicas respectivas se resumen en la tabla 5.

Tabla 5: Sensibilidad de variantes de GEPII 1.0 con sustituciones de aminoácido

7. Detección de FRET de las variantes polipeptídicas usando diferente moléculas de ligador entre el primer dominio del sensor de potasio y el segundo dominio del sensor de potasio

Se generaron plásmidos que codifican para los polipéptidos según la presente invención que comprenden una secuencia de ligador que comprende residuos de glicina y serina usando pares de cebadores directos e inversos diseñados que codifican para los aminoácidos que forman los ligadores respectivos. El cebador directo se diseñó para alargar el dominio LysM de tipo natural con una proyección en 5' que forma el ligador mediante una PCR de extensión por proyección. El cebador inverso se diseñó para unir el dominio BON de tipo natural y formar el mismo ligador en el extremo 3'. A continuación, se fusionaron estos dos productos de pCr mediante una PCR adicional y se subclonaron en un vector pcDNA3.1(-) flanqueado por secuencias de nucleótidos que codifican para mseCFP y cpV, respectivamente. Los constructos finales codifican para las novedosas variantes de GEPII basado en FREt de CFP/YFP con ligadores flexible entre los dominios bOn y LysM de Kbp.

A continuación, se transfectaron las células con el ADN plasmídico y se determinó la CE⁵⁰tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Los resultados para las variantes polipeptídicas respectivas se resumen en la tabla 6.

Los polipéptidos que comprenden una molécula de ligador mostraron una CE⁵⁰aumentada en comparación con GEPII 1.0.

8. Detección de FRET de las variantes polipeptídicas que comprenden un ligador entre los dominios BON y LysM Se generaron plásmidos que codifican para los polipéptidos según la presente invención que comprenden sustituciones de aminoácido y una secuencia de ligador usando pares de cebadores directos e inversos diseñados que codifican para los aminoácidos que forman los ligadores respectivos. El cebador directo se diseñó para alargar el dominio ALysM (véase ALysM GEPII 1.0) con una proyección en 5’ que forma el ligador mediante una PCR de extensión por proyección. El cebador inverso se diseñó para unir el dominio BON de tipo natural y formar el mismo ligador en el extremo 3’. A continuación, se fusionaron estos dos productos de PCR mediante una PCR adicional y se subclonaron en un vector pcDNA3.1(-) flanqueado por secuencias de nucleótidos que codifican para mseCFP y cpV, respectivamente. Los constructos finales codifican para las novedosas variantes de GEPII basadas en FRET de CFP/YFP con ligadores flexibles entre los dominios BON y ALysM..

A continuación, se transfectaron células HeLa con el ADN plasmídico y se determinó la CE⁵⁰tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Los resultados para las variantes polipeptídicas respectivas se resumen en la tabla 7:

Tabla 7: Sensibilidades de las variantes de GEPII 1.0 que comprenden sustituciones de aminoácido y secuencias de ligadores

9. Selección como diana de orgánulos y subdominios de células que expresan el polipéptido de la presente invención

Una gran ventaja de las sondas genéticamente codificadas es que pueden dirigirse con precisión a orgánulos y subdominios de una célula. Por consiguiente, la selección de los GEPII como diana permitirá la cuantificación de la dinámica y los niveles de K+ con una alta resolución espacial y temporal. Debido a la falta de sondas de K+ que puedan seleccionarse como diana, la actual idea de flujos de K+ subcelular es muy difusa.

Se clonaron plásmidos de ADN respectivos que codifican para GEPII1.0 con secuencias diana N-terminales o C-terminales usando métodos habituales de biología molecular conocidos por el experto en la técnica. Los experimentos que dirigen el polipéptido GEPII 1.0 (véase la figura 2) al núcleo (figura 4c), la mitocondria (figura 4d), el retículo endoplásmico (RE, figura 4e), la superficie celular (figura 4f), la membrana nuclear (figura 4g) y el área por debajo del plasmalema (figura 4h) se analizaron mediante microscopía de fluorescencia y los resultados se muestran en la figura 4. GEPII 1.0 sin ninguna secuencia de direccionamiento se ubica dentro del citosol y el núcleo (figura 4a). La adición de una secuencia de exportación nuclear (NES; LPPLERLTL) al extremo C-terminal de GEPII 1.0 dio como resultado la localización de la sonda de K+ dentro del citosol únicamente (figura 4b). Las sondas dirigidas permitirán la obtención de imágenes de fluorescencia con lapsos de tiempo de los flujos de K+ subcelular.

10. Caracterización de polipéptidos aislados

Se clonaron las diferentes variantes de GEPII en un vector de expresión bacteriano petM11. Después de la transformación de los plásmidos de expresión bacterianos que codifican para los GEPII en bacterias DH5a químicamente competentes, se cultivaron las células en placas de agar LB para recibir colonias individuales. Los cultivos previos que contenían las colonias individuales se cultivaron durante la noche y, a continuación, se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que comprende

a) un primer dominio de señalización, y

b) un sensor de potasio, que comprende

en el que el sensor de potasio puede unirse a un ion potasio cargado positivamente y el primer dominio de señalización puede generar una señal detectable tras la unión de un ion potasio cargado positivamente al sensor de potasio.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende

a) un primer dominio de señalización, y

b) un sensor de potasio, que comprende

c) un segundo dominio de señalización,

en el que el sensor de potasio puede unirse a un ion potasio cargado positivamente y el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización, juntos, pueden generar una señal detectable tras la unión de un ion potasio cargado positivamente al sensor de potasio.

3. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

4. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos para el primer dominio del sensor de potasio de SEQ ID NO: 1 que tiene al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácido: D41N, D43N, D51N, D59N, E64Q, D83N, D84N, Q26R, N35Q, N75Q o G52D, preferiblemente en el que el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos para el primer dominio del sensor de potasio de SEQ ID NO: 1 que tiene las siguientes sustituciones: Q26R, N35Q, N75Q, G52D.

5. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos para el segundo dominio del sensor de potasio de SEQ ID NO: 2 que tiene al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácido: D104N, E125Q, D135N, N116Q, N118Q, N121Q o N127Q, preferiblemente en el que el sensor de potasio comprende una secuencia de aminoácidos del segundo dominio del sensor de potasio de SEQ ID NO: 2 que tiene las siguientes sustituciones: D104N, E125Q, D135N.

6. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido comprende además al menos una secuencia de aminoácidos de ligador -GGGG- o al menos una secuencia de ligador de fórmula (I):

-(GGS)x(GGGGS)y(GG)z- (I)

en la que

x es el número entero 0 ó 1,

y es un número entero desde 1 hasta 6,

z es el número entero 0 ó 1, preferiblemente en la que y es 2, 3 ó 5 y/o en la que la secuencia de aminoácidos de ligador está precedida por la secuencia de aminoácidos del primer dominio del sensor de potasio y seguida por el segundo dominio del sensor de potasio.

7. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización se seleccionan conjuntamente del grupo que consiste en un par donanteaceptor de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), un par de enzimas de división o par de proteínas fluorescentes de división, en el que el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización son las partes respectivas de un par y preferiblemente en el que el primer dominio de señalización y el segundo dominio de señalización son un par donante-aceptor de FRET.

8. Polinucleótido que codifica para el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, preferiblemente en el que dicho polinucleótido comprende una secuencia que muestra al menos el 80% de identidad con la secuencia según S^eQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

9. Vector que codifica para el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, adecuado para la expresión génica en eucariotas o procariotas.

10. Célula que comprende el polinucleótido según la reivindicación 8, el vector según la reivindicación 9 y/o el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Método para detectar iones potasio cargados positivamente en una muestra, que comprende las etapas de a) proporcionar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

b) poner en contacto el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con la muestra; c) medir la señal generada por el primer dominio de señalización; y/o

12. Método según la reivindicación 11, en el que la señal medida en la etapa c) y/o d) es una señal de fluorescencia, una señal colorimétrica o una señal de FRET, preferiblemente una señal de FRET.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que, en la etapa a) de proporcionar el polipéptido, comprende (i) transfectar al menos una célula eucariota fuera del cuerpo humano o animal o transformar una célula procariota con un polinucleótido según la reivindicación 8 o con un vector según la reivindicación 9, o (ii) proporcionar una célula según la reivindicación 10.

14. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para detectar un ion potasio cargado positivamente en una muestra.

15. Kit para detectar iones potasio cargados positivamente, que comprende al menos uno de:

a) un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

b) un polinucleótido según la reivindicación 8 o el vector según la reivindicación 9; y/o

c) una célula según la reivindicación 10.