CN113292660B

CN113292660B - 一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针

Info

Publication number: CN113292660B
Application number: CN202110568427.1A
Authority: CN
Inventors: 刘波; 姜清云; 李娜; 张郑瑶; 张航与
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113292660A

Abstract

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其是基于环化重排荧光蛋白技术和亚克隆技术设计制备的生物探针。该探针包括可检测CD166的检测单元CY166，和CD34的检测单元YE34，再将两个检测单元依次与载体质粒连接构成重组质粒，转染到活的MSCs后能够自行表达，实现动态检测荧光信号的颜色不同和有无来定性反应细胞表面标志蛋白的变化，进而确定MSCs的分化状态，且对细胞无损害；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度检测CD166和CD34，进而实现检测液体中的CD166和CD34。

Description

一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针

技术领域

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，具体地，涉及一种基于环化重排荧光蛋白(circularly permutedfluorescent proteins,cpFP)技术的检测细胞膜蛋白CD166和CD34的生物探针。

背景技术

修复受损的血管内皮细胞或构建可替代的人工血管对心脑血管疾病的治疗具有重要意义。干细胞移植和以干细胞为基础的细胞组织工程是目前解决以上问题的首选。干细胞扩增和定向诱导间充质干细胞(MSCs)分化为内皮细胞是核心环节，但目前对MSCs分化状态的鉴定手段多为传统免疫鉴定方法，存在检测精确度低、不能动态检测、检测后细胞废弃等问题，成为制约此技术发展的关键。因此，本发明提出一种基于活细胞荧光技术的生物探针，用于检测MSCs特异性标志蛋白和分化为内皮细胞的标志性蛋白，从而明确细胞的分化状态。它具有时间分辨率高、成本低、精准实现单细胞水平的无伤检测等优点，从而为MSCs扩增和定向分化为内皮细胞提供动态检测工具。

发明内容

本发明提供一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其为基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针，其可检测活的MSCs表面标志性蛋白CD166，同时还可以检测内皮细胞标志物CD34。其基于环化重排荧光蛋白(circularly permutedfluorescent proteins,cpFP)技术和生物工程亚克隆技术设计制备探针工具。该生物探针蛋白在活细胞内可自行表达，基于蛋白构象与互作特异蛋白的关系，通过荧光信号的有无及强度定量地反映活细胞膜蛋白CD166和CD34的表达水平，应用于活细胞内检测细胞膜蛋白CD166和CD34；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度实现检测膜蛋白CD166和CD34，应用于液体中的膜蛋白CD166和CD34检测。

本发明通过构建生物探针，基于特异性互作蛋白特异性，实现细胞膜蛋白CD166和CD34的可视化。其中检测探针包括检测CD166的检测单元CY166，以及检测CD34的检测单元YE34，其中每个检测单元由不同颜色的cpFP荧光蛋白序列和膜蛋白互作蛋白序列两个部分，运用亚克隆技术，即聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)、核酸特异性酶切和连接实验技术，对这两个部分的DNA序列进行剪切和拼接重构，并与pcDNA3.1(+)或pRSET-B载体形成重组质粒也可直接通过基因合成构成重组质粒。其中探针设计截取的检测膜蛋白CD166的互作蛋白C6的必需部分，要求可特异性与细胞膜蛋白CD166结合，减少使用CD6序列全长而导致的多实验难点以及其他结构域有可能其他蛋白结合的干扰；同理截取特异性检测CD34的互作蛋白CrkL的必要区域。检测单元CY166检测原理为，当检测结构域CD6-R和CD6-F特异性与CD166结合后，荧光蛋白形成闭合环状结构后发出荧光，从而实现检测CD166的目的；检测单元YE34同理。

本发明的技术方案为：

一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其为基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针，如图1所示，其包括检测单元CY166和检测单元YE34，每个检测单元包括环化重排荧光蛋白cpFP和识别膜蛋白的互作蛋白，其中，环化重排荧光蛋白cpFP是利用一段接头(Linker)将荧光蛋白本体FP原有的N和C端连接，并在其发色团附近重新打开一个N和C端，从而形成环化重排荧光蛋白cpFP。

其中，检测单元CY166的识别膜蛋白的互作蛋白包括：

CD6-R蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ ID NO.4所示。

CD6-F蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示。

检测单元YE34的识别膜蛋白的互作蛋白包括：

CrkL-R蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示。

CrkL-F蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸如SEQ IDNO.10所示。

接头(Linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸如SEQ ID NO.12所示。

CD6-R氨基酸序列SEQ ID NO.3：

PGRGPIHRDQVNCSGAEAYLWDCPGLPGQHYCGHKEDAGVVCSEHQSWRLTGGADRCEGQVEVHFRGVWNTVCDSEWYPSEAKVLCQSLGCGTAVERPKGLPHSLSGRMYYSCNGEELTLSNCSWRFNNSNLCSQSLAARVLCSASRGH

其DNA序列SEQ ID NO.4：

CCCGGCAGGGGCCCCATCCACAGGGACCAGGTGAACTGCAGCGGCGCCGAGGCCTACCTGTGGGACTGCCCCGGCCTGCCCGGCCAGCACTACTGCGGCCACAAGGAGGACGCCGGCGTGGTGTGCAGCGAGCACCAGAGCTGGAGGCTGACCGGCGGCGCCGACAGGTGCGAGGGCCAGGTGGAGGTGCACTTCAGGGGCGTGTGGAACACCGTGTGCGACAGCGAGTGGTACCCCAGCGAGGCCAAGGTGCTGTGCCAGAGCCTGGGCTGCGGCACCGCCGTGGAGAGGCCCAAGGGCCTGCCCCACAGCCTGAGCGGCAGGATGTACTACAGCTGCAACGGCGAGGAGCTGACCCTGAGCAACTGCAGCTGGAGGTTCAACAACAGCAACCTGTGCAGCCAGAGCCTGGCCGCCAGGGTGCTGTGCAGCGCCAGCAGGGGCCAC

CD6-F氨基酸序列SEQ ID NO.5所示：

LPVRLTNGSSSCSGTVEVRLEASWEPACGALWDSRAAEAVCRALGCGGAEAASQLAPPTPELPPPPAAGNTSVAANATLAGAPALLCSGAEWRLCEVVEHACRSDGRRARVTCAENRALRLVDGGGACAGRVEMLEHGEWGSVCDDTWDLEDAHVVCRQLGCGWAVQALPGLHFT

其DNA序列SEQ ID NO.6：

CTGCCCGTGAGGCTGACCAACGGCAGCAGCAGCTGCAGCGGCACCGTGGAGGTGAGGCTGGAGGCCAGCTGGGAGCCCGCCTGCGGCGCCCTGTGGGACAGCAGGGCCGCCGAGGCCGTGTGCAGGGCCCTGGGCTGCGGCGGCGCCGAGGCCGCCAGCCAGCTGGCCCCCCCCACCCCCGAGCTGCCCCCCCCCCCCGCCGCCGGCAACACCAGCGTGGCCGCCAACGCCACCCTGGCCGGCGCCCCCGCCCTGCTGTGCAGCGGCGCCGAGTGGAGGCTGTGCGAGGTGGTGGAGCACGCCTGCAGGAGCGACGGCAGGAGGGCCAGGGTGACCTGCGCCGAGAACAGGGCCCTGAGGCTGGTGGACGGCGGCGGCGCCTGCGCCGGCAGGGTGGAGATGCTGGAGCACGGCGAGTGGGGCAGCGTGTGCGACGACACCTGGGACCTGGAGGACGCCCACGTGGTGTGCAGGCAGCTGGGCTGCGGCTGGGCCGTGCAGGCCCTGCCCGGCCTGCACTTCACC

CrkL-R氨基酸序列如SEQ ID NO.7：

TRMNINGQWEGEVNGRKGLFPFTHVKIFDPQNPDENE

其DNA序列SEQ ID NO.8：

ACCAGGATGAACATCAACGGCCAGTGGGAGGGCGAGGTGAACGGCAGGAAGGGCCTGTTCCCCTTCACCCACGTGAAGATCTTCGACCCCCAGAACCCCGACGAGAACGAG

CrkL-F氨基酸序列SEQ ID NO.9：

PVFAKAIQKRVPCAYDKTALALEVGDIVKV

其DNA序列SEQ ID NO.10：

CCCGTGTTCGCCAAGGCCATCCAGAAGAGGGTGCCCTGCGCCTACGACAAGACCGCCCTGGCCCTGGAGGTGGGCGACATCGTGAAGGTG

Linker氨基酸序列为(SEQ ID NO.11)：

GGSGG

对应的DNA序列为(SEQ ID NO.12)：

GGCGGCAGCGGCGGC

进一步地，所述的环化重排荧光蛋白cpFP的荧光蛋白本体选自蓝色荧光蛋白(bluefluorescent protein,BFP)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)及其变体(EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus)、红色荧光蛋白(red fluorescentprotein,RFP)及其变体(mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby)、青色荧光蛋白(cyanfluorescent protein,CFP)及其变体(mTurquoise2,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和ECFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)及其变体(EYFP,Venus,Citrine,sEYFP和YPet)；以上荧光蛋白作为本体，进行环化重排而形成新的不同颜色的cpFP，作为检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针中检测单元CY166和检测单元YE34的环化重排荧光蛋白cpFP部分。

进一步地，检测单元CY166和检测单元YE34的环化重排荧光蛋白发射荧光颜色不同。

在一个优选的实施方案中，所述的检测单元CY166和检测单元YE34的环化重排荧光蛋白cpFP的荧光蛋白本体分别选取的发射青色荧光的荧光蛋白ECFP和发射黄色荧光的荧光蛋白Citrine。

在一个优选的实施方案中，检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，即基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针完整氨基酸序列为(SEQ IDNO.1)：

PGRGPIHRDQVNCSGAEAYLWDCPGLPGQHYCGHKEDAGVVCSEHQSWRLTGGADRCEGQVEVHFRGVWNTVCDSEWYPSEAKVLCQSLGCGTAVERPKGLPHSLSGRMYYSCNGEELTLSNCSWRFNNSNLCSQSLAARVLCSASRGHLARQGAISDNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNGIDLPVRLTNGSSSCSGTVEVRLEASWEPACGALWDSRAAEAVCRALGCGGAEAASQLAPPTPELPPPPAAGNTSVAANATLAGAPALLCSGAEWRLCEVVEHACRSDGRRARVTCAENRALRLVDGGGACAGRVEMLEHGEWGSVCDDTWDLEDAHVVCRQLGCGWAVQALPGLHFTTRMNINGQWEGEVNGRKGLFPFTHVKIFDPQNPDENELARQGYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGLMCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNGIDPVFAKAIQKRVPCAYDKTALALEVGDIVKV

基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针完整核苷酸序列为(SEQ IDNO.2)：

CCCGGCAGGGGCCCCATCCACAGGGACCAGGTGAACTGCAGCGGCGCCGAGGCCTACCTGTGGGACTGCCCCGGCCTGCCCGGCCAGCACTACTGCGGCCACAAGGAGGACGCCGGCGTGGTGTGCAGCGAGCACCAGAGCTGGAGGCTGACCGGCGGCGCCGACAGGTGCGAGGGCCAGGTGGAGGTGCACTTCAGGGGCGTGTGGAACACCGTGTGCGACAGCGAGTGGTACCCCAGCGAGGCCAAGGTGCTGTGCCAGAGCCTGGGCTGCGGCACCGCCGTGGAGAGGCCCAAGGGCCTGCCCCACAGCCTGAGCGGCAGGATGTACTACAGCTGCAACGGCGAGGAGCTGACCCTGAGCAACTGCAGCTGGAGGTTCAACAACAGCAACCTGTGCAGCCAGAGCCTGGCCGCCAGGGTGCTGTGCAGCGCCAGCAGGGGCCACTTGGCGCGCCAAGGCGCCATCAGCGACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCAGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGAGCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGAGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGCATCACCCTGGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGCGGCAGCGGCGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCGCCAGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGAGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCAGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACGGCATCGATCTGCCCGTGAGGCTGACCAACGGCAGCAGCAGCTGCAGCGGCACCGTGGAGGTGAGGCTGGAGGCCAGCTGGGAGCCCGCCTGCGGCGCCCTGTGGGACAGCAGGGCCGCCGAGGCCGTGTGCAGGGCCCTGGGCTGCGGCGGCGCCGAGGCCGCCAGCCAGCTGGCCCCCCCCACCCCCGAGCTGCCCCCCCCCCCCGCCGCCGGCAACACCAGCGTGGCCGCCAACGCCACCCTGGCCGGCGCCCCCGCCCTGCTGTGCAGCGGCGCCGAGTGGAGGCTGTGCGAGGTGGTGGAGCACGCCTGCAGGAGCGACGGCAGGAGGGCCAGGGTGACCTGCGCCGAGAACAGGGCCCTGAGGCTGGTGGACGGCGGCGGCGCCTGCGCCGGCAGGGTGGAGATGCTGGAGCACGGCGAGTGGGGCAGCGTGTGCGACGACACCTGGGACCTGGAGGACGCCCACGTGGTGTGCAGGCAGCTGGGCTGCGGCTGGGCCGTGCAGGCCCTGCCCGGCCTGCACTTCACCTAGACCAGGATGAACATCAACGGCCAGTGGGAGGGCGAGGTGAACGGCAGGAAGGGCCTGTTCCCCTTCACCCACGTGAAGATCTTCGACCCCCAGAACCCCGACGAGAACGAGTTGGCGCGCCAAGGCTACAACAGCCACAACGTGTACATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCAGGCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGAGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGCATCACCCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGCGGCAGCGGCGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCTTCACCTACGGCCTGATGTGCTTCGCCAGGTACCCCGACCACATGAAGAGGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGAGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCAGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACGGCATCGATCCCGTGTTCGCCAAGGCCATCCAGAAGAGGGTGCCCTGCGCCTACGACAAGACCGCCCTGGCCCTGGAGGTGGGCGACATCGTGAAGGTGTAG

另一方面，本发明提供了一种重组质粒，其包含编码上述的检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针的核苷酸序列。

进一步地，编码上述的检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的重组质粒的载体为真核表达载体或者原核表达载体。其中，真核表达载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNATM3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4载体；原核表达载体选自pET-32a(+)载体、pET-30a载体、pRSET-B载体和PGEX载体。

在一个优选的实施方案中，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体或者pRSET-B载体。

本发明的有益效果：

本发明提供基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针，该探针将CD166和CD34蛋白是否表达及表达量变化通过荧光信号有无和颜色反映出来，从而实现膜蛋白CD166和CD34的可视化检测。将构建的探针工具转染入活细胞，自行表达出荧光蛋白重构融合探针结构，使用荧光显微镜或荧光分光光度仪动态检测分析荧光信号的变化，从而检测细胞膜蛋白CD166和CD34表达变化。该探针实现了在活体细胞内及细胞外动态检测膜蛋白CD166和CD34表达水平，具有操作简便、成本低、对细胞无损伤、核查结果简单等特点，为研究检测MSCs分化提供了一种可视化监测工具。

附图说明

图1是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针结构图。

图2(a)是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针的检测单元CY166的工作原理图。

图2(b)是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针的检测单元YE34的工作原理图。

图3(a)和图3(b)是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针转入不同细胞的荧光图像。

图4(a)是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针在不同蛋白下荧光光谱扫描结果。

图4(b)是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针在不同pH值下荧光光谱扫描结果。

图4(c)是基于cpFP技术的检测MSCs分化状态及种类的生物探针在不同温度下荧光光谱扫描结果。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

本发明主要通过在武汉金开瑞公司合成探针DNA序列获得重组质粒，然后将重组质粒转化入DH5α进行筛选和扩增等实验获取目的探针。

测试例

通过实施例中武汉金开瑞公司合成序列构成重组质粒，基于蛋白构象与互作特异蛋白的关系和cpFP原理检测细胞膜蛋白CD166和CD34。将构建的探针转染入活细胞，细胞自行翻译表达出重构融合探针蛋白结构，使用荧光显微镜动态检测荧光信号变化，通过荧光信号有无及颜色来检测细胞膜有无CD166和CD34表达和表达水平的变化；同时可将探针转入原核表达感受态BL21中表达和纯化探针融合蛋白后，利用荧光光度仪检测荧光蛋白发射波长强度即可检测液体中细胞膜蛋白CD166和CD34。

测试例1：

使用脂质体转染法将本实施例中制备的探针转染到活细胞体内后，细胞能够表达出重构的融合荧光蛋白。本探针具有稳定性特征，可以在多种活细胞体内工作，在人内皮细胞ECs和间充质干细胞MSCs后，ECs中可检测到CD34而显示黄色荧光，而MSCs可检测到CD166而显示青色荧光，如图3(a)和图3(b)所示。

测试例2：

将探针利用原核表达系，即利用BL21感受态将探针融合蛋白进行表达后，提纯获得探针融合蛋白，在体外利用不同细胞膜蛋白来检测探针的特异性实验中，结果表明探针可特异性检测CD166和CD34如图4(a)所示；在检测探针在不同温度和pH值下检测CD166和CD34稳定性实验中，也发现探针具有良好稳定性如图4(b)和图4(c)所示。

综上，本探针转染细胞后可以在活细胞内稳定表达探针蛋白，对转染后的细胞分别给予405nm和514nm波长的激发光，利用荧光显微镜同时分别采集485nm和527nm波长的发射荧光图像，通过发射荧光信号的有无来检测细胞膜蛋白CD166和CD34，当只出现青色荧光则表明细胞有CD166表达，即MSCs未发生分化，而当只出现黄色荧光则表明细胞有CD34表达，即此时MSCs已分化为内皮细胞；同时当将本探针利用原核表达系统表达提纯后，利用荧光分光度仪，扫描不同激发波长下的荧光蛋白发射波长的荧光强度值即可检测液体中是否含有CD166和CD34。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针

<130> 2021

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 895

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生物探针氨基酸序列

<400> 1

Pro Gly Arg Gly Pro Ile His Arg Asp Gln Val Asn Cys Ser Gly Ala

1 5 10 15

Glu Ala Tyr Leu Trp Asp Cys Pro Gly Leu Pro Gly Gln His Tyr Cys

20 25 30

Gly His Lys Glu Asp Ala Gly Val Val Cys Ser Glu His Gln Ser Trp

35 40 45

Arg Leu Thr Gly Gly Ala Asp Arg Cys Glu Gly Gln Val Glu Val His

50 55 60

Phe Arg Gly Val Trp Asn Thr Val Cys Asp Ser Glu Trp Tyr Pro Ser

65 70 75 80

Glu Ala Lys Val Leu Cys Gln Ser Leu Gly Cys Gly Thr Ala Val Glu

85 90 95

Arg Pro Lys Gly Leu Pro His Ser Leu Ser Gly Arg Met Tyr Tyr Ser

100 105 110

Cys Asn Gly Glu Glu Leu Thr Leu Ser Asn Cys Ser Trp Arg Phe Asn

115 120 125

Asn Ser Asn Leu Cys Ser Gln Ser Leu Ala Ala Arg Val Leu Cys Ser

130 135 140

Ala Ser Arg Gly His Leu Ala Arg Gln Gly Ala Ile Ser Asp Asn Val

145 150 155 160

Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys

165 170 175

Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr

180 185 190

Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

195 200 205

His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

210 215 220

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr

225 230 235 240

Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser

245 250 255

Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu

260 265 270

Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu

275 280 285

Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr

290 295 300

Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Trp

305 310 315 320

Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp

325 330 335

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile

340 345 350

Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

355 360 365

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

370 375 380

Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Ile

385 390 395 400

Asp Leu Pro Val Arg Leu Thr Asn Gly Ser Ser Ser Cys Ser Gly Thr

405 410 415

Val Glu Val Arg Leu Glu Ala Ser Trp Glu Pro Ala Cys Gly Ala Leu

420 425 430

Trp Asp Ser Arg Ala Ala Glu Ala Val Cys Arg Ala Leu Gly Cys Gly

435 440 445

Gly Ala Glu Ala Ala Ser Gln Leu Ala Pro Pro Thr Pro Glu Leu Pro

450 455 460

Pro Pro Pro Ala Ala Gly Asn Thr Ser Val Ala Ala Asn Ala Thr Leu

465 470 475 480

Ala Gly Ala Pro Ala Leu Leu Cys Ser Gly Ala Glu Trp Arg Leu Cys

485 490 495

Glu Val Val Glu His Ala Cys Arg Ser Asp Gly Arg Arg Ala Arg Val

500 505 510

Thr Cys Ala Glu Asn Arg Ala Leu Arg Leu Val Asp Gly Gly Gly Ala

515 520 525

Cys Ala Gly Arg Val Glu Met Leu Glu His Gly Glu Trp Gly Ser Val

530 535 540

Cys Asp Asp Thr Trp Asp Leu Glu Asp Ala His Val Val Cys Arg Gln

545 550 555 560

Leu Gly Cys Gly Trp Ala Val Gln Ala Leu Pro Gly Leu His Phe Thr

565 570 575

Thr Arg Met Asn Ile Asn Gly Gln Trp Glu Gly Glu Val Asn Gly Arg

580 585 590

Lys Gly Leu Phe Pro Phe Thr His Val Lys Ile Phe Asp Pro Gln Asn

595 600 605

Pro Asp Glu Asn Glu Leu Ala Arg Gln Gly Tyr Asn Ser His Asn Val

610 615 620

Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys

625 630 635 640

Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr

645 650 655

Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

660 665 670

His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

675 680 685

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr

690 695 700

His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser

705 710 715 720

Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu

725 730 735

Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu

740 745 750

Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr

755 760 765

Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Thr Tyr

770 775 780

Gly Leu Met Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp

785 790 795 800

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile

805 810 815

Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

820 825 830

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

835 840 845

Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Ile

850 855 860

Asp Pro Val Phe Ala Lys Ala Ile Gln Lys Arg Val Pro Cys Ala Tyr

865 870 875 880

Asp Lys Thr Ala Leu Ala Leu Glu Val Gly Asp Ile Val Lys Val

885 890 895

<210> 2

<211> 2691

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 生物探针核苷酸序列

<400> 2

cccggcaggg gccccatcca cagggaccag gtgaactgca gcggcgccga ggcctacctg 60

tgggactgcc ccggcctgcc cggccagcac tactgcggcc acaaggagga cgccggcgtg 120

gtgtgcagcg agcaccagag ctggaggctg accggcggcg ccgacaggtg cgagggccag 180

gtggaggtgc acttcagggg cgtgtggaac accgtgtgcg acagcgagtg gtaccccagc 240

gaggccaagg tgctgtgcca gagcctgggc tgcggcaccg ccgtggagag gcccaagggc 300

ctgccccaca gcctgagcgg caggatgtac tacagctgca acggcgagga gctgaccctg 360

agcaactgca gctggaggtt caacaacagc aacctgtgca gccagagcct ggccgccagg 420

gtgctgtgca gcgccagcag gggccacttg gcgcgccaag gcgccatcag cgacaacgtg 480

tacatcaccg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggcca acttcaagat caggcacaac 540

atcgaggacg gcggcgtgca gctggccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 600

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agagcgccct gagcaaggac 660

cccaacgaga agagggacca catggtgctg ctggagttcg tgaccgccgc cggcatcacc 720

ctgggcatgg acgagctgta caagggcggc agcggcggca tggtgagcaa gggcgaggag 780

ctgttcaccg gcgtggtgcc catcctggtg gagctggacg gcgacgtgaa cggccacaag 840

ttcagcgtga gcggcgaggg cgagggcgac gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 900

atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tggtgaccac cctgacctgg 960

ggcgtgcagt gcttcgccag gtaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagagc 1020

gccatgcccg agggctacgt gcaggagagg accatcttct tcaaggacga cggcaactac 1080

aagaccaggg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaacaggat cgagctgaag 1140

ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctgggccaca agctggagta caacggcatc 1200

gatctgcccg tgaggctgac caacggcagc agcagctgca gcggcaccgt ggaggtgagg 1260

ctggaggcca gctgggagcc cgcctgcggc gccctgtggg acagcagggc cgccgaggcc 1320

gtgtgcaggg ccctgggctg cggcggcgcc gaggccgcca gccagctggc cccccccacc 1380

cccgagctgc cccccccccc cgccgccggc aacaccagcg tggccgccaa cgccaccctg 1440

gccggcgccc ccgccctgct gtgcagcggc gccgagtgga ggctgtgcga ggtggtggag 1500

cacgcctgca ggagcgacgg caggagggcc agggtgacct gcgccgagaa cagggccctg 1560

aggctggtgg acggcggcgg cgcctgcgcc ggcagggtgg agatgctgga gcacggcgag 1620

tggggcagcg tgtgcgacga cacctgggac ctggaggacg cccacgtggt gtgcaggcag 1680

ctgggctgcg gctgggccgt gcaggccctg cccggcctgc acttcaccta gaccaggatg 1740

aacatcaacg gccagtggga gggcgaggtg aacggcagga agggcctgtt ccccttcacc 1800

cacgtgaaga tcttcgaccc ccagaacccc gacgagaacg agttggcgcg ccaaggctac 1860

aacagccaca acgtgtacat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 1920

aagatcaggc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctgg ccgaccacta ccagcagaac 1980

acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag ctaccagagc 2040

gccctgagca aggaccccaa cgagaagagg gaccacatgg tgctgctgga gttcgtgacc 2100

gccgccggca tcacccacgg catggacgag ctgtacaagg gcggcagcgg cggcatggtg 2160

agcaagggcg aggagctgtt caccggcgtg gtgcccatcc tggtggagct ggacggcgac 2220

gtgaacggcc acaagttcag cgtgagcggc gagggcgagg gcgacgccac ctacggcaag 2280

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctggtg 2340

accaccttca cctacggcct gatgtgcttc gccaggtacc ccgaccacat gaagaggcac 2400

gacttcttca agagcgccat gcccgagggc tacgtgcagg agaggaccat cttcttcaag 2460

gacgacggca actacaagac cagggccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 2520

aggatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg ccacaagctg 2580

gagtacaacg gcatcgatcc cgtgttcgcc aaggccatcc agaagagggt gccctgcgcc 2640

tacgacaaga ccgccctggc cctggaggtg ggcgacatcg tgaaggtgta g 2691

<210> 3

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD6-R氨基酸序列

<400> 3

Pro Gly Arg Gly Pro Ile His Arg Asp Gln Val Asn Cys Ser Gly Ala

1 5 10 15

Glu Ala Tyr Leu Trp Asp Cys Pro Gly Leu Pro Gly Gln His Tyr Cys

20 25 30

Gly His Lys Glu Asp Ala Gly Val Val Cys Ser Glu His Gln Ser Trp

35 40 45

Arg Leu Thr Gly Gly Ala Asp Arg Cys Glu Gly Gln Val Glu Val His

50 55 60

Phe Arg Gly Val Trp Asn Thr Val Cys Asp Ser Glu Trp Tyr Pro Ser

65 70 75 80

Glu Ala Lys Val Leu Cys Gln Ser Leu Gly Cys Gly Thr Ala Val Glu

85 90 95

Arg Pro Lys Gly Leu Pro His Ser Leu Ser Gly Arg Met Tyr Tyr Ser

100 105 110

Cys Asn Gly Glu Glu Leu Thr Leu Ser Asn Cys Ser Trp Arg Phe Asn

115 120 125

Asn Ser Asn Leu Cys Ser Gln Ser Leu Ala Ala Arg Val Leu Cys Ser

130 135 140

Ala Ser Arg Gly His

145

<210> 4

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD6-R核苷酸序列

<400> 4

cccggcaggg gccccatcca cagggaccag gtgaactgca gcggcgccga ggcctacctg 60

tgggactgcc ccggcctgcc cggccagcac tactgcggcc acaaggagga cgccggcgtg 120

gtgtgcagcg agcaccagag ctggaggctg accggcggcg ccgacaggtg cgagggccag 180

gtggaggtgc acttcagggg cgtgtggaac accgtgtgcg acagcgagtg gtaccccagc 240

gaggccaagg tgctgtgcca gagcctgggc tgcggcaccg ccgtggagag gcccaagggc 300

ctgccccaca gcctgagcgg caggatgtac tacagctgca acggcgagga gctgaccctg 360

agcaactgca gctggaggtt caacaacagc aacctgtgca gccagagcct ggccgccagg 420

gtgctgtgca gcgccagcag gggccac 447

<210> 5

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD6-F氨基酸序列

<400> 5

Leu Pro Val Arg Leu Thr Asn Gly Ser Ser Ser Cys Ser Gly Thr Val

1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Glu Ala Ser Trp Glu Pro Ala Cys Gly Ala Leu Trp

20 25 30

Asp Ser Arg Ala Ala Glu Ala Val Cys Arg Ala Leu Gly Cys Gly Gly

35 40 45

Ala Glu Ala Ala Ser Gln Leu Ala Pro Pro Thr Pro Glu Leu Pro Pro

50 55 60

Pro Pro Ala Ala Gly Asn Thr Ser Val Ala Ala Asn Ala Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gly Ala Pro Ala Leu Leu Cys Ser Gly Ala Glu Trp Arg Leu Cys Glu

85 90 95

Val Val Glu His Ala Cys Arg Ser Asp Gly Arg Arg Ala Arg Val Thr

100 105 110

Cys Ala Glu Asn Arg Ala Leu Arg Leu Val Asp Gly Gly Gly Ala Cys

115 120 125

Ala Gly Arg Val Glu Met Leu Glu His Gly Glu Trp Gly Ser Val Cys

130 135 140

Asp Asp Thr Trp Asp Leu Glu Asp Ala His Val Val Cys Arg Gln Leu

145 150 155 160

Gly Cys Gly Trp Ala Val Gln Ala Leu Pro Gly Leu His Phe Thr

165 170 175

<210> 6

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD6-F核苷酸序列

<400> 6

ctgcccgtga ggctgaccaa cggcagcagc agctgcagcg gcaccgtgga ggtgaggctg 60

gaggccagct gggagcccgc ctgcggcgcc ctgtgggaca gcagggccgc cgaggccgtg 120

tgcagggccc tgggctgcgg cggcgccgag gccgccagcc agctggcccc ccccaccccc 180

gagctgcccc ccccccccgc cgccggcaac accagcgtgg ccgccaacgc caccctggcc 240

ggcgcccccg ccctgctgtg cagcggcgcc gagtggaggc tgtgcgaggt ggtggagcac 300

gcctgcagga gcgacggcag gagggccagg gtgacctgcg ccgagaacag ggccctgagg 360

ctggtggacg gcggcggcgc ctgcgccggc agggtggaga tgctggagca cggcgagtgg 420

ggcagcgtgt gcgacgacac ctgggacctg gaggacgccc acgtggtgtg caggcagctg 480

ggctgcggct gggccgtgca ggccctgccc ggcctgcact tcacc 525

<210> 7

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CrkL-R氨基酸序列

<400> 7

Thr Arg Met Asn Ile Asn Gly Gln Trp Glu Gly Glu Val Asn Gly Arg

1 5 10 15

Lys Gly Leu Phe Pro Phe Thr His Val Lys Ile Phe Asp Pro Gln Asn

20 25 30

Pro Asp Glu Asn Glu

35

<210> 8

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CrkL-R核苷酸序列

<400> 8

accaggatga acatcaacgg ccagtgggag ggcgaggtga acggcaggaa gggcctgttc 60

cccttcaccc acgtgaagat cttcgacccc cagaaccccg acgagaacga g 111

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CrkL-F氨基酸序列

<400> 9

Pro Val Phe Ala Lys Ala Ile Gln Lys Arg Val Pro Cys Ala Tyr Asp

1 5 10 15

Lys Thr Ala Leu Ala Leu Glu Val Gly Asp Ile Val Lys Val

20 25 30

<210> 10

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CrkL-F核苷酸序列

<400> 10

cccgtgttcg ccaaggccat ccagaagagg gtgccctgcg cctacgacaa gaccgccctg 60

gccctggagg tgggcgacat cgtgaaggtg 90

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头氨基酸序列

<400> 11

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头核苷酸序列

<400> 12

ggcggcagcg gcggc 15

Claims

1.一种检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针，其特征在于，所述的检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针包括检测单元CY166和检测单元YE34，检测单元CY166和检测单元YE34均包括环化重排荧光蛋白和识别膜蛋白的互作蛋白；其中，

检测单元CY166的识别膜蛋白的互作蛋白包括：

CD6-R蛋白功能结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；

CD6-F蛋白功能结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示；

检测单元YE34的识别膜蛋白的互作蛋白包括：

CrkL-R蛋白功能结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示；

CrkL-F蛋白功能结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；

所述的检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种重组质粒，其包含编码如权利要求1所述的检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针的核酸。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，编码检测间充质干细胞定向分化状态的生物探针的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.根据权利要求2或3所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的载体为真核表达载体或者原核表达载体；其中，

真核表达载体选自pcDNA3.1（+）载体、pcDNA™ 3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4载体；

原核表达载体选自pET-32a(+)载体、pET-30a载体、pRSET-B载体和PGEX载体。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1（+）载体或者pRSET-B载体。