CN115785287A - 一种识别鹿茸多肽的生物探针及其重组质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种识别鹿茸多肽的生物探针及其重组质粒，是基于环化重排荧光蛋白cpFP技术和生物亚克隆技术设计制备的生物探针。该探针包括环化重排Mcherry荧光蛋白和分别连接在其两端的识别鹿茸多肽的互作蛋白TβRI‑R和TβRI‑F，与表达载体质粒构成重组质粒。将探针转染到活细胞后，能够在活细胞内自行表达，当细胞内表达的探针与鹿茸多肽相互作用时，探针显示出红色荧光，即可通过动态实时检测荧光信号有无来反应鹿茸多肽是否进入细胞，实现可视化检测鹿茸多肽；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度检测鹿茸多肽，实现液体中的鹿茸多肽的检测。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种识别鹿茸多肽的生物探针及其重组质粒，具体涉及一种基于环化重排荧光蛋白(circularly permutedfluorescent proteins,cpFP)技术的检测鹿茸多肽的生物探针及其重组质粒。
背景技术
鹿茸是一种传统的名贵中药，而鹿茸多肽为通过凝胶过滤、离子交换层析等生化技术提取出的分子量为3.2k的天然多肽，是鹿茸的主要活性成分之一，具有抗炎、抗细胞凋亡促进软骨细胞增殖等作用，此前的工作证明鹿茸多肽能够抑制骨肉瘤细胞的迁移，参与其过程的信号通路有TGF-beta。通过蛋白质相互作用分析预测其靶点为tβRI，因此，需要一种可以检测鹿茸多肽的生物探针。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于cpFP技术的检测鹿茸多肽的生物探针及其重组质粒，其基于环化重排荧光蛋白(circularly permuted fluorescent proteins,cpFP)技术和常规生物亚克隆技术设计制备探针工具。该生物探针蛋白可在活细胞内自行表达，基于蛋白间的特异性相互作用关系，通过荧光信号的有无及强度定量地反映鹿茸多肽的与受体蛋白的相互作用情况。也可通过原核细胞表达探针蛋白，进而通过扫描荧光发射波长强度实现鹿茸多肽检测，应用于液体中的鹿茸多肽检测。它具有时间分辨率高、成本低、精准实现单细胞水平的无伤检测等优点。
本发明通过构建生物探针，基于蛋白质间的特异性相互作用，实现鹿茸多肽作用机制的可视化。鹿茸多肽作用机制可视化cpFP探针工具包含环化重排荧光蛋白以及连接在其两端的识别目的蛋白鹿茸多肽的互作蛋白TβRI-R和TβRI-F三个部分，运用亚克隆技术，即聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)、核酸特异性酶切和连接实验技术，对这两个部分的DNA序列进行剪切和连接重构，并与pcDNA3.1(+)或pRSET-B载体形成重组质粒。其中探针设计截取的TβRI-R和TβRI-F序列仅为其与鹿茸多肽结合的必需部分，其可以特异性与鹿茸多肽结合，既可以排除TβRI蛋白功能变化对探针工作的干扰，又可以降低外源TβRI蛋白水平升高对细胞的影响。检测原理为，当检测结构域特异性与鹿茸多肽结合后，荧光蛋白形成闭合环状结构后发出荧光，从而实现检测鹿茸多肽的目的。
本发明的技术方案为：
一种识别鹿茸多肽的生物探针，包括环化重排荧光蛋白cpFP以及连接在其两端的识别目的蛋白鹿茸多肽的互作蛋白TβRI-R和TβRI-F。其中，环化重排荧光蛋白cpFP是利用一段接头(Linker)将荧光蛋白本体原有的N和C端连接，并在其发色团附近重新打开一个N和C端所形成的。
其中，TβRI-R结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ IDNO.4所示。
TβRI-F结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示。
接头(Linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示。
TβRI-R的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
EIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTT
对应的DNA序列(SEQ ID NO.4)：
GAAATTGACTTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGTGCACCCTCTTCA
AAAACTGGGTCTGTGACTACAACA
TβRI-F氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
FTCVTDGLCFVSVTETTDKVIH
对应的DNA序列(SEQ ID NO.6)：
TTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACA
GACAAAGTTATACAC
Linker氨基酸序列为(SEQ ID NO.7)：
GGTGGS
对应的DNA序列为(SEQ ID NO.8)：
GGCGGCACCGGCGGCAGC
所述的环化重排荧光蛋白cpFP的选自环化蓝色荧光蛋白(circularly permutedblue fluorescent protein,cpBFP)、环化绿色荧光蛋白(circularly permutedgreenfluorescent protein,cpGFP)、环化红色荧光蛋白(circularly permutedredfluorescent protein,cpRFP)、环化青色荧光蛋白(circularly permutedcyanfluorescent protein,cpCFP)、环化黄色荧光蛋白(circularly permutedyellowfluorescent protein,cpYFP)。
在一个优选的实施方案中，所述的环化重排荧光蛋白选取红色的mCherry环化荧光蛋白。
在一个优选的实施方案中，识别鹿茸多肽的生物探针的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
识别鹿茸多肽的生物探针的完整氨基酸序列为(SEQ ID NO.1)：MEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTGYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGLMCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNGFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIH
识别鹿茸多肽的生物探针的完整核苷酸序列为(SEQ ID NO.2)：AAGCTTATGGAAATTGACTTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGTGCACCCTCTTCAAAAACTGGGTCTGTGACTACAACATTGGCGCGCCAAATCGATGGCTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAGAAAAACGGCATTAAAGTGAACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCTATCAGAGCGCGCTGAGCAAAGATCCGAACGAAAAACGCGATCATATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGCATTACCCATGGCATGGATGAACTGTATAAAGGCGGCAGCGGCGGCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGCGAAGGCGATGCGACCTATGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCTTTACCTATGGCCTGATGTGCTTTGCGCGCTATCCGGATCATATGAAACGCCATGATTTTTTTAAAAGCGCGATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGCACCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTGAACCGCATTGAACTGAAAGGCATTGATTTTAAAGAAGATGGCAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACGGCATCGATTTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACAGACAAAGTTATACACTAGGAATTC
另一方面，本发明提供了一种重组质粒，其包含上述的识别鹿茸多肽的生物探针完整核苷酸序列。
所述的重组质粒的载体为真核表达载体或者原核表达载体。其中，真核表达载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNATM3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体、CMV4载体；原核表达载体选自pET-32a(+)载体、pET-30a载体、pRSET-B载体、PGEX载体。
在一个优选的实施方案中，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体或者pRSET-B载体。
本发明的有益效果：
本发明提供一种基于cpFP技术的鹿茸多肽可视化检测的生物探针，该探针将鹿茸多肽变化通过荧光信号有无和强度反映出来，从而实现鹿茸多肽的可视化检测。将构建的探针工具转染入活细胞，自行表达出荧光蛋白重构融合探针结构，使用荧光显微镜或荧光分光光度仪动态检测分析荧光信号的变化，从而检测鹿茸多肽作用机制。同时可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，并通过扫描荧光发射波长强度实现检测鹿茸多肽，可应用于液体中的鹿茸多肽检测。该探针实现了在活体细胞内及细胞外动态检测鹿茸多肽，具有操作简便、成本低、对细胞无损伤、核查结果简单等特点，为研究检测鹿茸多肽提供了一种可视化监测工具。
附图说明
图1(a)是基于cpFP技术的检测鹿茸多肽生物探针结构图。
图1(b)是基于cpFP技术的检测鹿茸多肽生物探针的工作原理图。
图2(a)至图2(c)是基于cpFP技术的检测鹿茸多肽生物探针转入不同细胞的荧光图像。
图3(a)是基于cpFP技术的检测鹿茸多肽生物探针在不同蛋白下荧光光谱扫描结果。
图3(b)是基于cpFP技术的检测鹿茸多肽生物探针在不同pH值下荧光光谱扫描结果。
图3(c)是基于cpFP技术的检测鹿茸多肽生物探针在不同温度下荧光光谱扫描结果。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
一种识别鹿茸多肽的生物探针，如图1(a)所示，其包括环化重排荧光蛋白cpFP以及连接在其两端的识别鹿茸多肽的互作蛋白TβRI-R和TβRI-F。其中，环化重排荧光蛋白cpFP是利用一段接头(Linker)将荧光蛋白本体原有的N和C端连接，并在其发色团附近重新打开一个N和C端所形成的。其工作原理如图1(b)所示。
实施例
本发明主要通过在某公司合成探针DNA序列获得质粒，然后将重组质粒转化入DH5α进行筛选和扩增等实验获取目的探针。
测试例1：
使用脂质体转染法将本实施例中制备的探针转染到活细胞体内后，细胞能够表达出重构的融合荧光蛋白。本探针具有稳定性特征，可以在多种活细胞体内工作，在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人骨肉瘤细胞U2OS、Hela细胞内都能正常表达并产生荧光，如图2(a)至图2(c)所示。
测试例2：
将探针利用原核表达系，即利用BL21感受态将探针融合蛋白进行表达后，提纯获得探针融合蛋白，在体外利用不同蛋白来检测探针的特异性实验中，结果表明探针可特异性检测鹿茸多肽如图3(a)所示；在检测探针在不同温度和pH值下检测鹿茸多肽稳定性实验中，也发现探针具有良好稳定性如图3(b)和图3(c)所示。
综上，本探针转染细胞后可以在活细胞内稳定表达探针蛋白，对转染后的细胞给予580nm波长的激发光，利用荧光显微镜同时采集610nm波长的发射荧光图像，通过发射荧光信号的有无来检测鹿茸多肽，当出现红色荧光增强则表明鹿茸多肽进入细胞，否则，则表明鹿茸多肽不进入细胞；同时当将本探针利用原核表达系统表达提纯后，利用荧光分光度仪，扫描不同激发波长下的荧光蛋白发射波长的荧光强度值即可检测液体中是否含有鹿茸多肽。
Claims (8)
1.一种识别鹿茸多肽的生物探针，其特征在于，所述的识别鹿茸多肽的生物探针，包括环化重排荧光蛋白cpFP以及分别连接在其两端的识别目的蛋白鹿茸多肽的互作蛋白序列TβRI-R和TβRI-F；其中，环化重排荧光蛋白cpFP是利用一段接头Linker将荧光蛋白本体原有的N和C端连接，并在其发色团附近重新打开一个N和C端所形成的；其中，
TβRI-R结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
TβRI-F结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的识别鹿茸多肽的生物探针，其特征在于，所述的环化重排荧光蛋白选自环化绿色荧光蛋白、环化红色荧光蛋白、环化青色荧光蛋白、环化蓝色荧光蛋白或环化黄色荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的识别鹿茸多肽的生物探针，其特征在于，所述的环化重排荧光蛋白为发射红色荧光的mCherry环化荧光蛋白。
4.根据权利要求1或2或3所述的识别鹿茸多肽的生物探针，其特征在于，所述的接头的氨基酸序列SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求1或2或3所述的识别鹿茸多肽的生物探针，其特征在于，所述的识别鹿茸多肽的生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述的识别鹿茸多肽的生物探针，其特征在于，所述的识别鹿茸多肽的生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒包含如权利要求1至6中任一项所述的识别鹿茸多肽的生物探针的核苷酸序列，所述的重组质粒的载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNATM3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体、CMV4表达载体、pET-32a(+)载体、pET-30a载体、pRSET-B载体或PGEX载体。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体和pRSET-B载体。
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| US20020127673A1 (en) * | 2000-10-30 | 2002-09-12 | Gabriel Nunez | Nod2 nucleic acids and proteins |
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| CN113372431A (zh) * | 2021-06-16 | 2021-09-10 | 山东省第二人民医院(山东省耳鼻喉医院、山东省耳鼻喉研究所) | 一种与耳听力相关的基因及其应用 |
-
2022
- 2022-12-21 CN CN202211651438.7A patent/CN115785287A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020127673A1 (en) * | 2000-10-30 | 2002-09-12 | Gabriel Nunez | Nod2 nucleic acids and proteins |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王艳玲;黄晓巍;李哲;何璐;徐岩;曲晓波;: "鹿茸多肽诱导心肌干细胞向心肌细胞分化的机制研究", 中国药房, no. 34, 10 December 2016 (2016-12-10), pages 43 - 47 * |
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