ES2645431T3

ES2645431T3 - Polipéptido de fusión fluorescente, biosensor que comprende dicho polipéptido y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2645431T3
Application number: ES13739169.4T
Authority: ES
Inventors: Danel KORTAZAR ZABALA; Aida Clarisa SALADO POGONZA; Jorge GÁMIZ MATA; Meritxell ROURA FERRER; Rosa MELLA LÓPEZ; Patricia VILLACÉ LOZANO
Original assignee: Innovative Tech In Biological Systems S L; INNOVATIVE TECHNOLOGIES IN BIOLOGICAL SYSTEMS SL
Current assignee: Innovative Tech In Biological Systems S L; INNOVATIVE TECHNOLOGIES IN BIOLOGICAL SYSTEMS SL
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2033-07-08
Also published as: US10877025B2; CA2878126C; IN2014MN02585A; EP2870475B1; US10883981B2; US20180003697A1; EP2870475A1; JP6393260B2; JP2015522582A; US20150185205A1; US20180003698A1; DK2870475T3; CA2878126A1; WO2014006225A1; CN104781667B; CN104781667A; US9784728B2

Abstract

Polipéptido de fusión fluorescente capaz de cambiar su localización dentro de la célula desde la membrana citoplasmática celular hasta las vesículas de retención, tras un aumento en la concentración de segundos mensajeros dentro del citoplasma celular, que comprende un péptido de localización en la membrana, un péptido de unión a proteínas de transducción de segundos mensajeros, una señal de retención en el retículo y un péptido fluorescente en el que: a. el péptido de localización en la membrana está situado en el extremo N-terminal del polipéptido de fusión fluorescente y está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido fluorescente, que a su vez está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, al péptido de unión a proteínas de transducción de segundos mensajeros; y b. el péptido de unión a proteínas de transducción de segundos mensajeros está unido físicamente, opcionalmente a través de un ligador, a la señal de retención en el retículo, que a su vez está situada en el extremo C-terminal del polipéptido de fusión fluorescente; y en el que el término "péptido de localización en la membrana" se pretende que signifique un péptido cuya localización intracelular natural está en la membrana plasmática.

Description

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DESCRIPCION

Polipeptido de fusion fluorescente, biosensor que comprende dicho polipeptido y usos de los mismos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo biotecnologico, particularmente a un polipeptido de fusion fluorescente, a un biosensor que comprende dicho polipeptido y usos de los mismos.

Antecedentes de la invencion

La siguiente discusion de los antecedentes de la invencion se proporciona meramente para ayudar al lector a comprender la invencion, y no se admite que describa o constituya la tecnica anterior de la presente invencion.

El cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados en celulas usa celulas vivas como herramientas en la investigacion biologica para dilucidar el funcionamiento de celulas normales y enfermas. Tambien se usa HCS para descubrir y optimizar nuevos candidatos a farmaco.

El cribado de alto contenido es una combinacion de biologfa celular moderna, con todas sus herramientas moleculares, con microscopfa automatizada de alta resolucion y manipulacion robotica. Las celulas se exponen en primer lugar a reactivos qmmicos o de iARN. Entonces se detectan los cambios en la morfologfa celular usando analisis de imagenes. Los cambios en las cantidades de protemas sintetizadas por celulas se miden usando una variedad de tecnicas tales como las protemas fluorescentes verdes fusionadas a protemas endogenas, o mediante anticuerpos fluorescentes.

A nivel celular, la adquisicion en paralelo de datos sobre diferentes propiedades celulares, por ejemplo la actividad de cascadas de transduccion de senales y la integridad del citoesqueleto es la principal ventaja de este metodo en comparacion con el cribado de alto rendimiento mas rapido pero menos detallado. Aunque HCS es mas lento, la riqueza de los datos adquiridos permite una comprension mas profunda de los efectos de los farmacos. En este sentido, uno de los objetivos de HCS en la adquisicion de datos en relacion con la actividad de cascadas de transduccion de senales es determinar el efecto de diferentes farmacos en los procesos de senalizacion mediante Ja medicion de los niveles intracelulares de segundos mensajeros.

Los segundos mensajeros son moleculas que transmiten senales desde receptores sobre la superficie celular hasta moleculas diana dentro de la celula, en el citoplasma o el nucleo. Transmiten las senales de hormonas como epinefrina (adrenalina), factores de crecimiento, y otros, y provocan algun tipo de cambio en la actividad de la celula. Amplifican en gran medida la fuerza de la senal. Los mensajeros secundarios son un componente de las cascadas de transduccion de senales. Entre estos segundos mensajeros, el AMPc y el calcio proporcionan el paradigma para el concepto del segundo mensajero y se aprecian como moleculas intracelulares ubicuas y cnticas que regulan muchos procesos clave en la celula.

Idealmente, dicha medicion requiere herramientas de localizacion precisa, alto intervalo dinamico y tan poca perturbacion de la fisiologfa celular como sea posible, que a su vez son capaces de monitorizar los niveles de segundos mensajeros in vivo usando un metodo de cribado de alto contenido.

Para esto, se han generado diversos biosensores fluorescentes basados en el cambio dinamico de las propiedades fluorescentes. En este sentido, estos tipos de biosensores se basan a menudo en un cambio en la transferencia de energfa de resonancia fluorescente (FRET). FRET es el proceso por el cual la energfa de un fluoroforo donador excitado se transfiere a un fluoroforo aceptor a traves de acoplamiento dipolo-dipolo sin radiacion. La eficiencia de esta transferencia de energfa depende en gran medida de la distancia entremedias (por ejemplo <10 nm para CFP/YFP) y la orientacion relativa del fluoroforo donador y aceptor. Sin embargo, los biosensores basados en FRET en el contexto de metodos de cribado de alto contenido requieren un equipo de deteccion de al menos cuatro filtros, dos para la excitacion y dos para la emision. Ademas, debido a la baja intensidad de la senal de deteccion, el alcance de la senal de deteccion y la sensibilidad de deteccion son bajos. Por ultimo, el uso de mas de una senal de emision de fluorescencia requiere el uso de mas algoritmos con el fin de analizar correctamente la senal final.

Por tanto, existe todavfa la necesidad de desarrollar metodos o productos mejorados para la medicion en tiempo real de la concentracion segundos mensajeros dentro del entorno dinamico de la celula viva.

Breve descripcion de la invencion

Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un polipeptido de fusion fluorescente capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de segundos mensajeros dentro del citoplasma celular, que comprende un peptido de

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localizacion en la membrana, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros, una senal de retencion en el reffculo y un peptido fluorescente en el que:

a. el peptido de localizacion en la membrana esta situado en el extremo N-terminal del polipeptido de fusion fluorescente y esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido fluorescente, que a su vez esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros; y

b. el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, a la senal de retencion en el reffculo, que a su vez esta situada en el extremo C-terminal del polipeptido de fusion fluorescente;

y en el que el termino “peptido de localizacion en la membrana” se pretende que signifique un peptido cuya localizacion intracelular natural esta en la membrana plasmatica.

En otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion, el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos y la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente dicha senal de retencion en el reffculo es KDEL.

En una realizacion mas preferida del primer aspecto de la invencion, dicho peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros es un peptido de union a protemas de transduccion de AMPc, un peptido de union a protemas de transduccion de calcio, un peptido de union a protemas de transduccion de IP3, un peptido de union a protemas de transduccion de GMPc o un peptido de union a protemas de transduccion de diacilglicerol. Por tanto, en una realizacion preferida adicional de la invencion, el polipeptido de fusion fluorescente del primer aspecto de la invencion es capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de un segundo mensajero seleccionado de la lista que consiste en calcio, AMPc, IP3, GMPc o diacilglicerol.

Un segundo aspecto de la invencion se refiere a un polipeptido de fusion fluorescente capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de calcio intracelular, que comprende un peptido de localizacion en la membrana, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprende una secuencia de union a calmodulina, una senal de retencion en el reffculo y un peptido fluorescente en el que:

a. el peptido de localizacion en la membrana esta situado en el extremo N-terminal del polipeptido de fusion fluorescente y esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido fluorescente, que a su vez esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprende la secuencia de union a calmodulina; y

En una realizacion preferida del segundo aspecto de la invencion, la secuencia de union a calmodulina se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 1 (MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), SEQ ID NO 2

(ASPWKSARLMVHTVATFNSI),: SEQ ID NO 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ), SEQ ID NO 4

(KKTFKEVANAVKISASLMGT),: SEQ ID NO 5 (GAVLKVLTTGLPALISWIKR), SEQ ID NO 6

(RGGFRRIARLVGVLREWAYR),: SEQ ID NO 7 (GGRLALLRARLKELAALEAA) y SEQ ID NO 8

(AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP) o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

En una realizacion preferida adicional del segundo aspecto de la invencion, la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente dicha senal de retencion en el reffculo es KDEL y/o el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

En otra realizacion preferida del segundo aspecto de la invencion el peptido fluorescente se selecciona del grupo que consiste en GFp, YFP, turboGFP, tRFP ytRFP602.

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En todav^a una realizacion preferida adicional del segundo aspecto de la invencion:

a. la secuencia de union a calmodulina se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 1 (MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), SEQ ID NO 2 (ASPWKSARLMVHTVATFNSI), SEQ ID NO 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ), SEQ ID NO 4 (KKTFKEVANAVKISASLMGT), SEQ ID NO 5 (GAVLKVLTTGLPALISWIKR), SEQ ID NO 6 (RGGFRRIARLVGVLREWAYR), SEQ ID NO 7 (GGRLALLRARLKELAALEAA) y SEQ ID NO 8 (AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP) o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

b. el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos; y

c. la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente dicha senal de retencion en el reffculo es KDEL.

En todavfa otra realizacion preferida de la invencion, el polipeptido de fusion fluorescente de calcio comprende o consiste preferiblemente en SEQ ID NO 15.

Un tercer aspecto de la invencion se refiere a un polipeptido de fusion fluorescente capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de AMPc intracelular, que comprende un peptido de localizacion en la membrana, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprende una secuencia de union a los dominios reguladores RI y RII de PKA, una senal de retencion en el reffculo y un peptido fluorescente en el que:

En una realizacion preferida del tercer aspecto de la invencion, la secuencia de union a los dominios reguladores RI y RII de PKA se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY), SEQ ID NO 10 (VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ), SEQ ID NO 11 (VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ), SEQ ID NO 12 (FEELAWKIAKMIWSDVFQQ), SEQ ID NO 13 (QIEYLAKQIVDNAIQQAK) y SEQ ID NO 14 (LEQYANQLADQIIKEATE) o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

En una realizacion preferida adicional del tercer aspecto de la invencion, la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente dicha senal de retencion en el reffculo es KDEL y/o el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

En otra realizacion preferida del tercer aspecto de la invencion, el peptido fluorescente se selecciona del grupo que consiste en GFP, YFP, turboGFP, tRFP y tRFP602.

En todavfa una realizacion preferida adicional del tercer aspecto de la invencion:

a. la secuencia de union a los dominios reguladores RI y RII de PKA se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 9 (DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY), SEQ ID NO 10 (VQGNTDEAQEELAWKIAKMIVSDVMQQ), SEQ ID NO 11 (VQGNTDEAQEELLWKIAKMIVSDVMQQ), SEQ ID NO 12 (FEELAWKIAKMIWSDVFQQ), SEQ ID NO 13 (QIEYLAKQIVDNAIQQAK) y SEQ ID NO 14 (LEQYANQLADQIIKEATE) o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

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c. la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente la senal de retencion en el reffculo es KDEL.

En todavfa otra realizacion preferida del tercer aspecto de la invencion, el polipeptido de fusion fluorescente comprende o consiste preferiblemente en SEQ ID NO 16.

Un cuarto aspecto de la invencion se refiere a un polipeptido de fusion fluorescente capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de diacilglicerol intracelular, que comprende un peptido de localizacion en la membrana, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprende una secuencia de union a PKC8, una senal de retencion en el reffculo y un peptido fluorescente en el que:

En una realizacion preferida del cuarto aspecto de la invencion, la secuencia de union a PKC8 es SEQ ID NO 19 (AARKRKGSFFYGG), o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

En una realizacion preferida adicional del cuarto aspecto de la invencion, la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente dicha senal de retencion en el reffculo es KDEL y/o el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

En otra realizacion preferida del cuarto aspecto de la invencion, el peptido fluorescente se selecciona del grupo que consiste en GFP, YFP, turboGFP, tRFP y tRFP602.

En todavfa una realizacion preferida adicional del cuarto aspecto de la invencion:

a. la secuencia de union a PKC8 es SEQ ID NO 19 (AARKRKGSFFYGG), o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

En todavfa otra realizacion preferida del cuarto aspecto de la invencion, el polipeptido de fusion fluorescente comprende SEQ ID NO 18.

Un quinto aspecto de la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de polinucleotido que codifica para un polipeptido tal como se define en cualquiera de los aspectos previos de la invencion.

Un sexto aspecto de la invencion se refiere a un biosensor que comprende el polipeptido de fusion tal como se define en los aspectos primero, segundo, tercero y cuarto de la invencion.

Un septimo aspecto de la invencion se refiere a una celula que comprende el polipeptido de fusion fluorescente tal

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como se define en cualquiera de los aspectos primero, segundo, tercero o cuarto de la invencion o el biosensor tal como se define en el sexto aspecto de la invencion, en el que preferiblemente dicha celula es la lmea celular U2O2.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a varios usos in vitro del polipeptido de fusion fluorescente tal como se define en cualquiera de los aspectos primero, segundo, tercero o cuarto de la invencion o del biosensor tal como se define en el sexto aspecto de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen parte de esta memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones y junto con la descripcion ilustran las composiciones y los metodos divulgados.

Figura 1. Representacion esquematica del modelo de localizacion celular de biosensor fluorescente. El biosensor fluorescente cambia su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas, tras un aumento en la concentracion de segundos mensajeros dentro del citoplasma celular.

Figura 2. Determinacion de segundos mensajeros usando el biosensor fluorescente. Un aumento en la concentracion de segundos mensajeros promueve una redistribucion del biosensor fluorescente. El cambio en la fluorescencia celular se calculo como un incremento de la granularidad de estas celulas. Se obtuvieron estos mismos resultados con tres clones diferentes de las lmeas celulares anteriores tal como se ilustra en esta figura que proporciona una prueba de la reproducibilidad de estos resultados correspondientes a tres clones que contienen el biosensor de calcio (grafico de la izquierda) o tres clones que contienen el biosensor de AMPc (grafico de la derecha).

Figura 3. Distribucion celular de celulas estimuladas con biosensor de calcio. Se estimularon U2OS, que expresaban de manera estable el receptor de neurocinina humano 1 y biosensor de calcio fluorescente, con 10 pM de agonista de sustancia P durante 6 horas. Tras el tratamiento, el biosensor fluorescente se internalizo en vesmulas en el citosol. Se determino la actividad del receptor de neurocinina humano 1 midiendo la generacion de la vesmula usando algoritmos de analisis de imagenes.

Figura 4. Curva de respuesta a la concentracion para la sustancia P en la lmea celular con receptor de neurocinina 1 - biosensor de calcio. Se trataron las celulas con series de dilucion de 10 log (n=4). La CE50 para la sustancia P fue de ~ 9,5x10"12 M tras un tratamiento de 6 h con agonista. Se fijaron las celulas y se tineron los nucleos con DAPI. Se calculo el % de actividad en relacion al positivo (10 pM). Se valido el ensayo de internalizacion con un promedio de Z'=0,85+/- 0,01 para el cribado de alto contenido.

Figura 5. Distribucion celular de celulas estimuladas con biosensor de AMPc. Se estimularon U2OS que expresaban de manera estable el receptor adrenergico beta 2 humano y biosensor de AMPc fluorescente con 10 pM de agonista de isoproterenol durante 36 horas. Tras el tratamiento, el biosensor fluorescente se internalizo en vesmulas en el citosol. Se determino la actividad de receptor adrenergico beta 2 humano midiendo la generacion de la vesmula usando algoritmos de analisis de imagenes.

Figura 6. Curva de respuesta a la concentracion para isoproterenol en la lmea celular con receptor adrenergico beta 2 - biosensor de AMPc. Se trataron las celulas con series de dilucion de 6 log (n=4). La CE50 para el isoproterenol fue de 2,3x10-7 M tras un tratamiento de 36 h con agonista. Se fijaron las celulas y se tineron los nucleos con DAPI. Se calculo el % de actividad en relacion al positivo (10 pM). Se valido el ensayo de internalizacion con un promedio de Z'=0,7+/- 0,01 para el cribado de alto contenido.

Figura 7. Distribucion celular de celulas estimuladas con biosensor de DAG. Se estimularon U2OS que expresaban de manera estable el biosensor de DAG fluorescente con 25 ng/ml de PMA durante 4 horas. Tras el tratamiento, el biosensor fluorescente se internalizo en vesmulas en el citosol. Se determino la actividad del biosensor de DAG midiendo la generacion de la vesmula usando algoritmos de analisis de imagenes.

Figura 8. Curva de respuesta a la concentracion para la lmea celular con biosensor de DAG. Se trataron las celulas con series de dilucion de 9 log (n=4). La CE50 para el isoproterenol fue de 2,89x10-4 ng/ml tras un tratamiento de 4 h con DAG. Se fijaron las celulas y se tineron los nucleos con DAPI. Se calculo el % de actividad en relacion al positivo (50 ng/ml). Se valido el ensayo de internalizacion con un promedio de Z'=0,76 +/- 0,01 para el cribado de alto contenido.

Descripcion de la invencion

A menos que se especifique expresamente lo contrario, el termino “que comprende” se usa en el contexto del presente documento para indicar que pueden estar presentes opcionalmente elementos adicionales ademas de los elementos de la lista introducidos por “que comprende”. Sin embargo, se contempla como una realizacion espedfica de la presente invencion que el termino “que comprende” abarque la posibilidad de que no esten presentes elementos adicionales, es decir, para el fin de esta realizacion “que comprende” ha de entenderse como que tiene el

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significado de “que consiste en”. Definiciones

En el contexto de la presente invencion, el termino “polipeptido de fusion” se refiere a un polipeptido hforido que comprende una combinacion de al menos cuatro peptidos de diferentes protemas que se combinan en la misma estructura de polipeptido.

En el contexto de la presente invencion, el termino “peptido de localizacion en la membrana” se pretende que signifique un peptido cuya localizacion intracelular natural esta en la membrana plasmatica.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “peptido de union a protemas de transduccion” se pretende que signifique un peptido que es capaz de unirse a una protema de transduccion en una conformacion espedfica. Por tanto, este peptido es capaz de unirse a la protema de transduccion solo cuando esta protema de transduccion esta interactuando con un segundo mensajero (AMPc, Ca2+, IP3, GMPc, diacilglicerol...).

Tal como se usa en el presente documento, el termino “senal de retencion en el rettculo” se pretende que signifique una cadena pepttdica corta que dirige el transporte del polipeptido al rettculo endoplasmatico y a traves de la via secretora que confiere de ese modo una localizacion multivesicular.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “peptido fluorescente” se pretende que signifique un peptido fluorescente que tiene capacidades fluorescentes. Los dominios de peptido fluorescente se caracterizan por tener un espectro de excitacion y espectro de emision espedficos.

En el contexto de la presente invencion, el ligador tiene al menos un residuo de aminoacido, preferiblemente al menos dos residuos de aminoacido consecutivos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “biosensor” se pretende que signifique una herramienta o entidad molecular que es sensible a, y puede responder a, un esttmulo ttsico o qmmico y transmitir informacion sobre el estado celular.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “farmaco” se pretende que signifique una molecula que actua potencialmente como agonista o antagonista o modulador de una via de senalizacion.

Tal como se usa en el presente documento “lmea celular estable” se pretende que signifique una lmea celular que se ha transfectado o infectado con un fragmento exogeno de ADN que se ha incorporado por sf mismo en el genoma de la celula.

Tal como se usa en el presente documento “secuencia de union a calmodulina” se pretende que signifique la secuencia de aminoacidos correspondiente al dominio de union a calmodulina de la cinasa de cadena ligera de miosina del musculo esqueletico. Esta secuencia esta incluida en la subclase 1-8-14 basica del motivo de union a calmodulina 1-14. La secuencia consenso de la 1-8-14 basica es (RK)(RK)(RK)(FILVW) xxxxxx(FAILVW)xxxxx(FILVW). Estos tipos de secuencias pueden encontrarse facilmente en la base de datos de uniones a calmodulina (
http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/home.html).

Tal como se usa en el presente documento “secuencia de union a los dominios reguladores RI y RII de PKA” se pretende que signifique la secuencia de aminoacidos conservada que esta presente en la familia de protemas de anclaje a cinasa A (AKAP) y cuya funcion principal es unirse al dominio regulador (RI o RII) de la protema cinasa A (PKA).

Tal como se usa en el presente documento “HT31” es el peptido derivado de la protema de anclaje a cinasa A de tiroides humana (AKAP) que puede destruir el anclaje de la cinasa A (tras la activacion mediante senal de AMPc) compitiendo con AKAP. HT31 se une a los dos dominios reguladores (RI y RII) de la protema cinasa A, pero su afinidad por estos dominios es: baja para el dominio RI y alta para el dominio RII.

Tal como se usa en el presente documento “secuencia de union a PKCdelta” se pretende que signifique la secuencia de aminoacidos correspondiente a un peptido soluble sintetico que se une espedficamente a PKCdelta y no a otras PKC. Estos tipos de secuencias pueden encontrarse facilmente en la base de datos de PKCLab (
http://www.pkclab.org/PKC/link/sustrate specificity.htm).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion afronta el problema de proporcionar herramientas de localizacion precisa, alto intervalo dinamico y tan poca perturbacion de la fisiologfa celular como sea posible que sean capaces de monitorizar una variacion en los niveles de concentracion intracelular de segundos mensajeros in vivo usando cribado de alto contenido (HCS) en sistemas basados en celulas, en los que estas herramientas no tienen las desventajas de

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biosensores basados en FRET.

Con el fin de solucionar el problema anterior, los autores de la presente invencion disenaron un nuevo polipeptido de fusion fluorescente que comprende un peptido de localizacion en la membrana, un peptido fluorescente, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros y una senal de retencion en el reffculo. Este biosensor esta formado por dos peptidos dirigidos a dos compartimentos celulares diferentes, permitiendo la medicion de la concentracion de segundos mensajeros monitorizando la distribucion del polipeptido fluorescente dentro del citoplasma celular. En este sentido, la translocacion del biosensor dentro de la celula se debe a un cambio en su conformacion tridimensional que oculta o expone las senales de localizacion en ambos extremos del polipeptido desencadenado por la union de la protema de transduccion al peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros. En el estado basal, el biosensor esta situado en uno de los compartimentos; esto significa que el peptido de localizacion dirigido al otro compartimento celular esta oculto por la conformacion tridimensional. Cuando la concentracion del segundo mensajero aumenta debido a una estimulacion celular, estos segundos mensajeros se unen a la protema de transduccion que se vuelve activa. La protema de transduccion activa es capaz de unirse al peptido de union a protemas de transduccion en el biosensor provocando un cambio conformacional. En este momento, se modifica la distribucion espacial de los diferentes elementos estructurales en el biosensor y se expone el peptido de localizacion dirigido al otro compartimento celular por la nueva conformacion tridimensional de modo que todo el biosensor se transporta a su nueva localizacion en el nuevo compartimiento celular. Todo este proceso puede rastrearse en celulas vivas debido a la presencia de la protema fluorescente en el biosensor. Puede visualizarse una vista esquematica del proceso en la representacion esquematica mostrada en la figura 1.

Sin embargo, los autores de la presente invencion se dieron cuenta de que el orden de los peptidos dentro del polipeptido de fusion fluorescente mencionado anteriormente no podffa colocarse arbitrariamente dentro del polipeptido. Este es el caso puesto que despues de numerosos experimentos, los autores concluyeron que solo una combinacion de elementos proporciono el efecto tecnico de transporte del biosensor al otro compartimento celular, tal combinacion fue:

a. el peptido de localizacion en la membrana debe situarse en el extremo N-terminal del polipeptido de fusion fluorescente y debe estar unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido fluorescente, que a su vez debe estar unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros; y

b. el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros debe estar unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, a la senal de retencion en el reffculo, que a su vez debe estar situada en el extremo C-terminal del polipeptido de fusion fluorescente;

Los autores sometieron a prueba si tal biosensor que tiene la estructura anterior podffa emplearse para detectar y cuantificar diferentes tipos de segundos mensajeros. Tal como se ilustra en ejemplos 1-3 divulgados en el presente documento, los autores de la presente invencion construyeron tres polipeptidos de fusion fluorescentes diferentes, comprendiendo todos ellos el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 como peptido de localizacion en la membrana, el peptido KDEL como senal de retencion en el reffculo y turboGFP como peptido fluorescente. Por tanto, la unica diferencia entre estos polipeptidos de fusion fluorescentes se encontraba en el tipo de peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros usado. En este sentido, en el caso del biosensor de calcio del ejemplo 1 los autores usaron un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprendfa un dominio de union a calmodulina, en el caso del biosensor de AMPc del ejemplo 2 los autores usaron un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprendfa un dominio de union a protema cinasa A (PKA) de la protema de anclaje a cinasa A (AKAP) y en el caso del biosensor de diacilglicerol del ejemplo 3 los autores usaron un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros que comprendfa el dominio de union de SEQ ID NO 19.

De manera sorprendente, los resultados mostrados en los ejemplos y dibujos presentados en el presente documento usando los polipeptidos de fusion anteriores de los ejemplos 1-3 indicaron que un aumento en la concentracion del segundo mensajero indujo un cambio conformacional en el biosensor que promovio una redistribucion del biosensor fluorescente. Se calculo la actividad en los tres casos como un incremento de la granularidad de las celulas transfectadas con los biosensores de la invencion. La redistribucion de fluorescencia del biosensor se detecto mediante fluorescencia usando algoritmos de analisis de imagenes. Por consiguiente, las variaciones en las concentraciones de segundos mensajeros pueden monitorizarse a traves de este proceso de “ocultacion y exposicion” de las senales de localizacion y la localizacion final del biosensor.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un polipeptido de fusion fluorescente capaz de cambiar su localizacion dentro la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de segundos mensajeros dentro del citoplasma celular, que comprende un

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peptido de localizacion en la membrana, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros, una senal de retencion en el reffculo y un peptido fluorescente en el que:

En una realizacion mas preferida del primer aspecto de la invencion, dicho peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros es un peptido de union a protemas de transduccion de AMPc, un peptido de union a protemas de transduccion de calcio, un peptido de union a protemas de transduccion de IP3, un peptido de union a protemas de transduccion de GMPc o un peptido de union a protemas de transduccion de diacilglicerol. Por tanto en una realizacion preferida adicional de la invencion, el polipeptido de fusion fluorescente del primer aspecto de la invencion es capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de un segundo mensajero seleccionado de la lista que consiste en calcio, AMPc, IP3, GMPc o diacilglicerol.

(ASPWKSARLMVHTVATFNSI),: SEQ ID NO 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ), SEQ ID NO 4

(KKTFKEVANAVKISASLMGT),: SEQ ID NO 5 (GAVLKVLTTGLPALISWIKR), SEQ ID NO 6

(RGGFRRIARLVGVLREWAYR),: SEQ ID NO 7 (GGRLALLRARLKELAALEAA) y SEQ ID NO 8

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a. la secuencia de union a calmodulina se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 1

(MEKRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), SEQ ID NO 2 (ASPWKSARLMVHTVATFNSI), SEQ ID NO 3 (AIGFKKLAEAVKFSAKLMGQ), SEQ ID NO 4 (KKTFKEVANAVKISASLMGT), SEQ ID NO 5

(GAVLKVLTTGLPALISWIKR), SEQ ID NO 6 (RGGFRRIARLVGVLREWAYR), SEQ ID NO 7

(GGRLALLRARLKELAALEAA) y SEQ ID NO 8 (AEGVRNIKSMWEKGNVFSSP) o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

En todavfa otra realizacion preferida de la invencion, el polipeptido de fusion fluorescente comprende o consiste preferiblemente en SEQ ID NO 15.

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En una realizacion preferida adicional del cuarto aspecto de la invencion, la senal de retencion en el reffculo es un peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido y en el que preferiblemente dicha senal de retencion en el reffculo es KDEL y/o el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos.

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Un septimo aspecto de la invencion se refiere a una celula que comprende el polipeptido de fusion fluorescente tal como se define en cualquiera de los aspectos primero, segundo, tercero o cuarto de la invencion o el biosensor tal como se define en el sexto aspecto de la invencion, en el que preferiblemente dicha celula es la lmea celular U2O2.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a varios usos para el polipeptido de fusion fluorescente tal como se define en cualquiera de los aspectos primero, segundo, tercero o cuarto de la invencion o del biosensor tal como se define en el sexto aspecto de la invencion. Un primer uso del biosensor segun la presente invencion es para detectar y cuantificar segundos mensajeros incluyendo, pero sin limitarse a, AMPc, calcio, diacilglicerol, IP3 y GMPc. Tal como ya se ha mencionado, la union del segundo mensajero al polipeptido de fusion fluorescente de cualquiera de los aspectos de esta invencion da como resultado un cambio sustancial en la conformacion espacial que conduce a un cambio en la localizacion de la fluorescencia intracelular. Esta translocacion de la fluorescencia puede aprovecharse para la cuantificacion de segundos mensajeros mediante microscopfa de fluorescencia. Ademas, todo este proceso puede rastrearse en celulas vivas debido a la presencia de la protema fluorescente en el biosensor.

Ademas, el polipeptido de fusion fluorescente tal como se define en cualquiera de los aspectos primero, segundo, tercero o cuarto de la invencion o el biosensor tal como se define en el sexto aspecto de la invencion es util en la practica de esencialmente cualquier aplicacion para la cual se obtiene la lectura de la transduccion de segundos mensajeros. Tales aplicaciones se conocen bien en la tecnica. Sin embargo, las aplicaciones meramente a modo de ejemplo de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a:

a. identificacion de compuestos de prueba que actuan como agonistas, antagonistas, agonistas inversos o ligandos naturales del receptor de la superficie celular seleccionados de factores de crecimiento, citocinas, receptores acoplados a protemas G, integrinas y canales de ion calcio estudiando el movimiento de segundos mensajeros usando dispositivos de microscopfa de fluorescencia. En una realizacion preferida, dicho receptor de la superficie celular es un receptor acoplado a protema G (GPCR).

b. Clonacion de la expresion del agonista, antagonista y agonista inverso pepffdico de receptores.

c. Clonacion de la expresion de moduladores que cambian la presencia intracelular de segundos mensajeros.

d. Establecimiento de curvas de respuesta a la dosis de moduladores de moleculas de membrana.

e. Determinacion de alteraciones en moleculas de membrana y moduladores implicados en una enfermedad o trastorno cuya cascada de senalizacion depende de estos segundos mensajeros y, de ese modo, puede usarse el biosensor como herramienta de diagnostico.

El polipeptido de fusion fluorescente y el biosensor correspondiente de la presente invencion pueden prepararse mediante tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica pero, a modo de ejemplo, pueden construirse tal como sigue. Las secuencias codificantes correspondientes al peptido de localizacion en la membrana, el peptido fluorescente, el peptido de interaccion con la transduccion de protemas y la senal de localizacion en el reffculo pueden amplificarse facilmente mediante PCR y clonarse en un plasmido lanzadera. Estas secuencias codificantes pueden clonarse entonces facilmente en el plasmido de fusion final en el orden espedfico presentado en el presente documento usando los sitios de enzimas de restriccion que flanqueaban cada secuencia.

Los siguientes ejemplos sirven meramente para ilustrar la presente invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construccion y uso de un biosensor de calcio para la medicion de calcio en celulas vivas dentro de un intervalo dinamico amplio de concentraciones fisiologicas de este segundo mensaiero.

Los autores de la presente invencion construyeron un polipeptido de fusion fluorescente que comprendfa el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ iD NO 17 como peptido de localizacion en la membrana, el dominio de union a calmodulina de la cinasa de cadena ligera de miosina muscular de SEQ ID NO 1 como peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros, el peptido KDEL como senal de retencion en el reffculo y turboGFP como peptido fluorescente en el que:

a. el peptido de localizacion en la membrana se situaba en el extremo N-terminal del polipeptido de fusion fluorescente y estaba unido ffsicamente, a traves de un ligador, al peptido fluorescente, que a su vez estaba unido ffsicamente, a traves de un ligador, al peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros; y

b. el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros estaba unido ffsicamente, a

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traves de un ligador, a la senal de retencion en el reffculo, que a su vez esta situada en el extremo C- terminal del polipeptido de fusion fluorescente.

El polipeptido de fusion fluorescente completo se ilustra en SEQ ID NO 15.

Con el fin de evaluar si este polipeptido induce redistribucion de la fluorescencia intracelular en celulas vivas, se clono el polipeptido de turboGFP como peptido fluorescente y se analizo la localizacion celular del biosensor tras activacion inducida por calcio. En este sentido, se transfectaron de manera estable las lmeas celulares HEK293 y U2O2 con la construccion de plasmido que contiene el ADNc de biosensor mencionado anteriormente (remftase a SEQ ID NO 15). Tras la transfeccion, ambas lmeas celulares presentaron una distribucion en la membrana de la fluorescencia. Sin embargo, se observo una disminucion sustancial en la distribucion en la membrana del biosensor tras aumentar los niveles intracelulares de calcio con 10 ng/ml de PMA y 1 uM de ionomicina. Este resultado indica que un aumento en la concentracion de calcio intracelular induce un cambio conformacional en el biosensor que promueve una redistribucion del biosensor fluorescente. Se calculo la actividad como un incremento de la granularidad de estas celulas. Se obtuvieron estos mismos resultados con tres clones diferentes de las lmeas celulares anteriores tal como se ilustra en la figura 2 (grafico de la izquierda) que proporciona una prueba de la reproducibilidad de estos resultados.

En segundo lugar, con el fin de determinar si el calcio induce un cambio conformacional significativo dentro de un intervalo dinamico fisiologico, se transfecto de manera estable la lmea celular estable de biosensor U2O2 con el receptor de taquicinina 1 humano. El receptor de taquicinina 1 (TACR1) tambien conocido como receptor de neurocinina 1 (NK1R) o receptor de sustancia P (SPR) es un receptor acoplado a protema G que se encuentra en el sistema nervioso central y el sistema nervioso periferico. El ligando endogeno para este receptor es la sustancia P, aunque tiene algo de afinidad por otras taquicininas, la sustancia P se sintetiza por las neuronas y se transporta a las vesmulas sinapticas; se consigue la liberacion de sustancia P a traves de la accion de despolarizacion de mecanismos dependientes de calcio. Cuando se estimulan los receptores de NK1, pueden generar diversos segundos mensajeros, que pueden desencadenar una amplia variedad de mecanismos efectores que regulan la excitabilidad y funcion celular. Uno de estos mecanismos conduce a la movilizacion de calcio de tanto fuentes intra como extracelulares.

Se sembro la lmea celular estable doble a 20.000 celulas por pocillo sobre placas opticas de 96 mm, y se cultivaron en 200 ul de DMEM F12 complementado con suero bovino fetal al 10%. Para la redistribucion del biosensor fluorescente, se estimularon celulas con diferentes concentraciones del agonista sustancia P durante 6 horas. Tras el tratamiento, se tineron los nucleos con DAPI y se detecto la redistribucion de fluorescencia del biosensor mediante fluorescencia usando algoritmos de analisis de imagenes. Cuando se trataron las celulas con el agonista, se internalizo el biosensor de la membrana plasmatica en vesmulas de alta intensidad (figura 3). Se calculo la actividad como un incremento de la granularidad de estas celulas. Se trataron las celulas con series de dilucion de 11 log (n=5). La CE50 para la sustancia P fue de ~ 9,5 x 10"12 M tras un tratamiento de 6 h con agonista. Se valido el ensayo de redistribucion con un promedio de Z'=0,85+/- 0,01 para el cribado de alto contenido (figura 4).

Para comprobar la sensibilidad del biosensor en comparacion con otros metodos, se realizo un ensayo de calcio fluorescente ffpico usando Fura-2/AM ratiometrico. Se midio el aumento de calcio dentro de la celula usando la razon de la fluorescencia de Fura2 unido y no unido al ion. Se incubaron celulas con Fura2-AM y se trataron con concentraciones de sustancia P crecientes. Se trataron celulas con concentraciones de sustancia P que oscilaban entre 0 y 10 pM por cuadruplicado. La CE50 para la sustancia P fue de ~ 1,4x10-8 M. Se valido el ensayo de calcio con una Z'= 0,84 para el cribado de alto contenido.

En ambos metodos de cuantificacion, se realizo la adquisicion de imagenes usando un dispositivo Bioimager de alto contenido “BD Pathway 855” de BD Biosciences.

Ejemplo 2. Construccion y uso de un biosensor de AMPc para la medicion de AMPc en celulas vivas dentro de un intervalo dinamico amplio de concentraciones fisiologicas de este segundo mensajero.

Los autores de la presente invencion construyeron un polipeptido de fusion fluorescente que comprendfa el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ iD NO 17 como peptido de localizacion en la membrana, el dominio de union a protema cinasa A (PKA) de la protema de anclaje a cinasa A (AKAP) de SEQ ID NO 9 como peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros, el peptido KDEL como senal de retencion en el reffculo y turboGFP como peptido fluorescente en el que:

b. el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros estaba unido ffsicamente, a traves de un ligador, a la senal de retencion en el reffculo, que a su vez esta situada en el extremo C-

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REIVINDICACIONES

1. Polipeptido de fusion fluorescente capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de segundos mensajeros dentro del citoplasma celular, que comprende un peptido de localizacion en la membrana, un peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros, una senal de retencion en el reffculo y un peptido fluorescente en el que:

a. el peptido de localizacion en la membrana esta situado en el extremo N-terminal del polipeptido de fusion fluorescente y esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido fluorescente, que a su vez esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, al peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros; y

b. el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros esta unido ffsicamente, opcionalmente a traves de un ligador, a la senal de retencion en el reffculo, que a su vez esta situada en el extremo C-terminal del polipeptido de fusion fluorescente;

y en el que el termino “peptido de localizacion en la membrana” se pretende que signifique un peptido cuya localizacion intracelular natural esta en la membrana plasmatica.
2. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 1, en el que dicho polipeptido es capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de un segundo mensajero seleccionado de la lista que consiste en calcio, AMPc o diacilglicerol.
3. Polipeptido de fusion fluorescente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que:

a. el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17 o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos; y

b. la senal de retencion en el reffculo es el peptido seleccionado de la siguiente lista que consiste en KDEL, HDEL, KKXX, KXKXX y RXR, en los que X es cualquier aminoacido.
4. Polipeptido de fusion fluorescente segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que:

a. el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17; y

b. la senal de retencion en el reffculo es el peptido KDEL.
5. Polipeptido de fusion fluorescente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipeptido es capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de calcio intracelular, y en el que el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros comprende una secuencia de union a calmodulina.
6. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 5, en el que:

a. la secuencia de union a calmodulina se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8 o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

b. el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17; y

c. la senal de retencion en el reffculo es KDEL.
7. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 5, en el que dicho polipeptido comprende SEQ ID NO 15.
8. Polipeptido de fusion fluorescente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipeptido es capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de AMPc intracelular, y en el que el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros comprende una secuencia de union a

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los dominios reguladores RI y RII de PKA.
9. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 8, en el que:

a. la secuencia de union a los dominios reguladores RI y RII de PKA se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14 o una variante que es al menos el 90 % homologa a cualquiera de estas secuencias a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

b. el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17; y

c. la senal de retencion en el retmulo es KDEL.
10. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 8, en el que dicho polipeptido comprende SEQ ID NO 16.
11. Polipeptido de fusion fluorescente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipeptido es capaz de cambiar su localizacion dentro de la celula desde la membrana citoplasmatica celular hasta las vesmulas de retencion, tras un aumento en la concentracion de diacilglicerol intracelular, y en el que el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros comprende una secuencia de union a PKC8.
12. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 11, en el que:

a. el peptido de union a protemas de transduccion de segundos mensajeros comprende una secuencia de union a PKCS seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO 19 o una variante que es al menos el 90 % homologa a esta secuencia a lo largo de toda la region basandose en la identidad de aminoacidos;

b. el peptido de localizacion en la membrana es el dominio extracelular del receptor de interleucina 2 de SEQ ID NO 17;

c. el peptido fluorescente se selecciona del grupo que consiste en GFP, YFP, turboGFP, tRFP y tRFP602; y

d. la senal de retencion en el retmulo es KDEL.
13. Polipeptido de fusion fluorescente segun la reivindicacion 11, en el que dicho polipeptido comprende SEQ ID NO 18.
14. Molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de polinucleotido que codifica para un polipeptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. Biosensor que comprende el polipeptido de fusion tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 113.
16. Celula que comprende el polipeptido fluorescente tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o el biosensor tal como se define en la reivindicacion 15.
17. Uso in vitro del biosensor segun la reivindicacion 15 o el polipeptido fluorescente segun cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para detectar y/o cuantificar segundos mensajeros.