ES2774416T3

ES2774416T3 - Biosensores para monitorear la localización y el tráfico de biomoléculas en las células

Info

Publication number: ES2774416T3
Application number: ES15841561T
Authority: ES
Inventors: Stéphane Alain Laporte; Yoon Namkung; Michel Bouvier; Gouill Christian Le; Mireille Hogue; Viktoriya Lukasheva; Hiroyuki Kobayashi; Denis Deblois; Etienne Durette
Original assignee: Universite de Montreal; Royal Institution for the Advancement of Learning
Current assignee: Universite de Montreal; Royal Institution for the Advancement of Learning
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2035-09-21
Also published as: CA2960902C; EP3194960B1; DK3194960T3; AU2015318567B2; CN107533049A; US10584159B2; SG11201702133TA; AU2015318567A1; CA2960902A1; EP3194960A1; NZ730131A; EP3194960A4; IL251158A0; WO2016041093A1; PL3194960T3; JP2017534851A; JP6708633B2; US20170313762A1; US20200157184A1; CN107533049B

Abstract

Un biosensor para evaluar el tráfico y/o localización de una proteína de interés que comprende; un primer componente que comprende dicha proteína de interés etiquetada con una proteína verde fluorescente Renilla (Renilla GFP) o una proteína luciferasa Renilla(Renilla Luc); un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento al compartimento celular etiquetado con una Renilla GFP o una Renilla Luc; en el que si dicha primera proteína se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha primera proteína se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla GFP.

Description

DESCRIPCIÓN

Biosensores para monitorear la localización y el tráfico de biomoléculas en las células

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a la evaluación/monitorización de la localización, transporte y tráfico de biomoléculas tales como proteínas, por ejemplo, endocitosis de receptor de superficie celular, reciclaje y tráfico intracelular de receptores y efectores.

Técnica antecedente

El tráfico de proteínas es un proceso activo en el cual las proteínas se reubican desde una región de una célula a otra. Las membranas y sus componentes proteicos se cambian constantemente a través de un mecanismo que tiene múltiples componentes y vías. Uno de los mecanismos de modulación de la actividad de los receptores de la superficie celular, como los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs, por sus siglas en inglés) y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés), es a través de la endocitosis del receptor. Para GPCRs, la endocitosis de receptor inducida por ligando puede conducir a la eliminación de receptores de la PM a través de compartimentos especializados como vesículas recubiertas por clatrina, los cuales implican el reclutamiento del adaptador endocítico p-arrestina a receptores ligados (Claing, Laporte y otros, 2002). Los receptores de internalización pueden dirigirse a vías lisosomales y de reciclaje divergentes, lo que produce efectos esencialmente opuestos sobre la fuerza y la duración de la señalización celular a través de proteínas G heterotriméricas, y también pueden promover distintos eventos de señalización desde las membranas intracelulares a través del andamiaje de señalización de parrestinas (Hanyaloglu y von Zastrow 2008; Posner y Laporte 2010). Se han propuesto ventajas terapéuticas para los fármacos que promueven el direccionamiento intracelular de los complejos GPCR/p-arrestina, mientras que para algunos receptores sus reciclajes a la PM también son esenciales para el mantenimiento adecuado de las respuestas fisiológicas.

Por lo tanto, los sistemas simples y confiables para monitorear el tráfico de receptores son clave para estudiar el mecanismo de la endocitosis del receptor y desarrollar terapias eficientes que actúen sobre los receptores de la superficie celular como los GPCRs. Por ejemplo, el receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R, por sus siglas en inglés) ha atraído una atención significativa para el desarrollo de fármacos, debido a su participación en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, que incluyen hipertensión, hipertrofia, fibrosis y aterosclerosis (Hunyady y Catt 2006), y porque los ligandos, los cuales tienen una función cardioprotectora también puede promover la internalización de receptores y complejos de señalización intracelular de ATlR/p-arrestina. Grandes ventajas, por lo tanto,pueden surgir del desarrollo de ensayos que evalúen eficientemente de manera cuantitativa y de alta eficiencia la inclinación de los fármacos a inducir la internalización de receptores tales como GPCRs.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

Las figuras 1A a 1F muestran la generación del sensor de endocitosis GPCR basado en la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET, por sus siglas en inglés). Figuras 1A a 1C: Tres configuraciones de sensores basados en BRET para evaluar/monitorear la endocitosis de GPCR. Para monitorear las cantidades del receptor (figura 1A) y la p-arrestina (figura 1C) en la membrana plasmática, se ancla el rGFP en la membrana plasmática al marcar una porción de acilación de Lyn-quinasa (MGClKSKGKDS) en el extremo N-terminal del rGFP.

Figuras 1B, 1C: Para examinar la dirección ya sea del receptor (Figura 1B) o la p-arrestina (figura 1C) a los endosomas, el dominio FYVE de endofina (aminoácidos 739 a 806), el cual ancla el sensor en los endosomas, se fusionó al extremo C-terminal del rGFP. Las células HEK293SL que expresan ya sea el Lyn-rGFP (figura 1D) o el rGFP-endofinFYVE (figura 1E) se sometieron a microscopía fluorescente confocal. Las células que expresan rGFP-endofinFYVE se trataron con wortmanina 500 nM durante 40 minutos (figura 1E, panel derecho). Barras de escala, 10 |jm. Figura 1F: Visualización simultánea del receptor, Lyn-rGFP y dominio FYVE tras la endocitosis del receptor. Las células HEK293SL se transfectaron transitoriamente con B2R-CFP, Lyn-rGFP y mCherry-endofinFYVE. El panel superior mostró el estado basal y el panel inferior mostró una endocitosis de B2R inducida por bradicinina. Barras de escala, 10 jm. Figura 1G: Una variante marcada con mCherry del sensor de endofina FYVE también se colocaliza con Rab5, el cual habita EE.

Las figuras 2A a 2F muestran la dosis y la endocitosis de AT1R dependiente del tiempo medida por BRET. Figura 2A: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con Lyn-GFP10 (□) o Lyn-rGFP (■). Las células se incubaron con varias concentraciones de AnglI durante 40 minutos, luego se midió BRET como se describe en "materiales y métodos". Figura 2B: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con GFP10-endofinFYvE o rGFP-endofinFYVE. Figura 2C: Las células HEK293SL se transfectaron con ^aT1R y parr2-Rlucll junto con GFP10-endofinFYVE o rGFP-endofinFYVE. Las células transfectadas con AT1R-Rlucll junto con Lyn-rGFP (figura 2D) o rGFP-endofinFYVE (figura 2E) se incubaron en ausencia o presencia de AnglI 100 nM a 37 °C durante los tiempos indicados, luego se midió BRET. El cambio en la relación BRET se expresa como porcentaje de la relación BRET observada en el grupo control (sin tratamiento con AnglI). Los datos se representan como las medias ± SE a partir de 2-6 experimentos independientes. Figura 2F: Los datos en las figuras 2D y 2E se normalizaron hasta las respuestas máximas, respectivamente, y se trazaron juntas.

Las figuras 3A a 3F muestran el efecto del bloqueo de la endocitosis del receptor y la sobreexpresión de parrestina2 en los cambios de BRET inducidos por AnglI. Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll/Lyn-rGFP (figura 3A), AT1R-Rlucll/rGFP-endofinFYVE (figura 3B), o AT1R/parr2-Rlucll/rGFP-endofinFYVE (figura 3C) junto con pcDNA o dinamina K44A. Las células se incubaron en ausencia (control, ■; DinK44A, O) o en presencia de sacarosa 0,45 M (A ) durante 20 minutos, luego se estimularon con varias concentraciones de AnglI durante 40 minutos antes de la medición de BRET. Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll/LynrGFP (figura 3D) o AT1R-Rlucll/rGFP-endofinFYVE (figura 3E) junto con pcDNA o p-arrestina2. Figura 3f : endocitosis de AT1R en presencia de los inhibidores de la acidificación de vesículas bafilomicina A (Baf) y cloroquina (CQ). Las células se incubaron en varias concentraciones de AnglI durante 40 minutos antes de la medición de BRET. Los valores que se muestran son las medias ± SE desde al menos tres experimentos independientes.

Las figuras 4A a 4E muestran las curvas de dosis-respuesta obtenidas con los biosensores BRET de endocitosis con varios receptores. Figura 4A: Las células HEK293SL se transfectaron con Lyn-rGFP junto con AT1R-Rlucll, B2R-Rlucll, V2R-Rlucll o p ² AR-Rlucll. Figura 4B: Las células HEK293SL se transfectaron con rGFP-endofinFYVE junto con AT1R-Rlucll, B2R-Rlucll, V2R-Rlucll o p ² AR-Rlucll. Las células se incubaron con varias concentraciones del ligando afín respectivo como se describe en la figura durante 30 minutos (figura 4A) o 40 minutos (figura 4B) a 37 °C, luego se midieron BRET. Figura 4C: Las células HEK293SL se transfectaron con parr2-Rlucll y rGFP-endofinFYVE junto con AT1R, B2R, V2R, P ² AR, o construcciones del receptor FP. Las células se incubaron con varias concentraciones del ligando afín respectivo durante 40 minutos antes de la medición de BRET. Los ligandos afines para cada receptor fueron los siguientes: AT1R, AnglI (cuadrados); B2R, bradiquinina (BK, triángulos); V2R, AVP (círculos) u oxitocina (OT, estrellas); P ² AR, isoproterenol (ISO, triángulos invertidos); FP, PGF2a (rombos). Los datos para (a) hasta (c) se expresan como las medias ± SE de 2-3 experimentos independientes. Figura 4D:

Monitorización de la endocitosis de EGFR por BRET entre Rlucll-GRB2 y rGFP-endofinFYVE (GRB2 interactúa con EGFR y participa en la internalización de EGFR). Las células HEK293SL se transfectaron con EGFR junto con Rlucll-GRB2 y rGFP-endofinFYVE. Las células se incubaron con varias concentraciones de EGF durante 30 minutos a 37 °C, luego se midieron BRET. Los resultados para la figura 4D son las medias ± SE de los triplicados en un solo experimento representativo de dos experimentos independientes. Figura 4E: Evaluación de los factores Z como una indicación de la robustez de los ensayos para el cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés). Las HEK293 se cotransfectaron con AT1R-Rlucll/Lyn-rGFP, AT1R-Rlucll/rGFP-endofinFYVE o AT1R/parr2-Rlucll/rGFP-endofinFYVE y se sembraron en una placa de 48 pocillos y se estimularon con AngII 100 nM a 37 °C por 20 minutos para permitir la desaparición del receptor receptor de la membrana plasmática y la acumulación del receptor y parrestina2 en los endosomas. La endocitosis del receptor de superficie celular se evaluó en BRET2. Los valores de BRET se expresan por pocillo en los gráficos presentados y el factor Z evaluado sobre 0,64; 0,73 y 0,79 para el grupo tratado con AngII, respectivamente, el cual indica un ensayo robusto para la internalización del receptor en los endosomas.

Las figuras 5A a 5C muestran la monitorización del reciclaje del receptor después de la eliminación del ligando mediante ensayos BRET de endocitosis. Figura 5A: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con Lyn-rGFP. Las células se incubaron en ausencia (control) o en presencia de AngII 100 nM durante 30 minutos, luego las células se lavaron y se incubaron además en ausencia de AngII durante 45 minutos. El cambio en la relación BRET se expresa como porcentaje de la relación BRET observada en el grupo control (sin tratamiento con AngII). Los datos se representan como las medias ± SE de cuatro experimentos independientes. Figura 5B: Las células HEK293SL que expresan Lyn-rGFP junto con V2R-Rlucll, B2R-Rlucll, ATiR-Rlucll o p ² AR-Rlucll se sometieron al reciclaje del receptor como se describe en la figura 5A con sus ligandos afines, AVP 100 nM para V2R, BK 100 nM para B2R, AngII 100 nM para AT1R e ISO 1 pM para p2AR. El reciclaje del receptor se expresa como un aumento porcentual en la relación BRET 45 minutos después del lavado del ligando. Todos los valores se expresan como las medias ± SE de 3-4 experimentos independientes. Figura 5C: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con rGFP-endofinFYVE. Las células se incubaron en ausencia (control) o en presencia de AngII 100 nM durante 30 minutos, luego las células se lavaron y se incubaron además en ausencia de AngII durante 45 minutos. El cambio en la relación BRET se expresa como porcentaje de la relación BRET observada en el grupo control (sin tratamiento con AngII). Los datos se representan como las medias ± SE de tres experimentos independientes.

Las figuras 6A a 6F muestran los efectos de los análogos de AngII en el tráfico y la clasificación de AT1R. Figura 6A: Las células HEK293SL que expresan AT1R-Rlucll/rGFPendofinFYVE se incubaron ya sea con AngII 100 nM (cuadrados), SI 100 nM (triángulos) o DVG 1 pM (círculos) durante los tiempos indicados, luego se midieron BRET. Las relaciones BRET se normalizaron a la respuesta AngII máxima (60 minutos) como un 100% y la basal (sin ligando) como un 0%. Los datos se expresan como las medias ± SE a partir de al menos tres experimentos independientes. Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll/Lyn-rGFP (figura 6B), AT1R-Rlucll/rGFP-endofinFYVE (figura 6C) o AT1R/parr2-Rlucll/rGFP-endofinFYVE (figura 6D). Las células se incubaron con varias concentraciones de AngII (cuadrados), SI (triángulos) o DVG (círculos) durante 30 minutos (figura 6B) o 40 minutos (figuras 6C, 6D) antes de la medición de BRET. Los datos se representan como las medias ± SE de al menos tres experimentos independientes. Figuras 6E y 6F: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con rGFP-rab4 (figura 6E) o rGFP-rab11 (figura 6F). Las células se incubaron con AngII 100 nM (cuadrados), SI 100 nM (triángulos) o DVG 1 pM (círculos) durante los tiempos indicados y luego se midieron BRET. El cambio en la relación BRET se expresa como porcentaje de la relación BRET observada en el grupo control (sin tratamiento con ligandos). Los datos representan la media ± SE de tres experimentos independientes.

Las figuras 7A y B muestran la intemalización de AT1R accedida por el ensayo de unión a AngII[125I] célula intacta.

Figura 7A: Las células HEK293SL se transfectaron transitoriamente ya sea con AT1R solo (□), AT1R-Rlucll solo (■) o AT1R-Rlucll junto con Lyn-rGFP (■). Las células se incubaron en ausencia o presencia de AngII 100 nM durante 30 minutos a 37 °C, luego se sometieron al ensayo de unión a AngII[125I] célula intacta como se describe en "materiales y métodos". Figura 7B: Las células HEK293SL que expresan AT1R-Rlucll/Lyn-rGFP junto con pcDNA (□), dinamina K44A (■) o p-arrestina2 (■) se incubaron en ausencia o presencia de AngII 100 nM durante 30 minutos a 37 °C, luego se sometieron a un ensayo de unión a AngII[125I] célula intacta como se describe a continuación (ejemplo 1). La endocitosis del receptor se expresó como la pérdida porcentual de los receptores de superficie celular. Los datos se representan como las medias ± SE de tres experimentos diferentes.

La figura 8 muestra la localización endosomal basal alta de V2R. Las células HEK293SL que expresan transitoriamente V2R-YFP junto con mCherry-endofinFYVE, se sometieron a una microscopía confocal. Barra de escala, 10 pm.

La figura 9A muestra la localización vesicular de rGFP-rab4 y rGFP-rab11 con mCherry-FYVE. Las células HEK293SL se transfectaron ya sea con rGFP-rab4 (izquierda) o rGFP-rab11 (derecha), luego se sometieron a una microscopía confocal.

Las figuras 9B a 9D muestran el efecto de la inhibición de Gaq en la internalización de AT1R mediada por AngII.

Figura 9B: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con Lyn-rGFP. Las células se incubaron en ausencia (-Ubo) o en presencia de Ubo 100 nM (+ Ubo) durante 30 minutos, luego se estimularon con varias concentraciones de AngII durante 30 minutos antes de la medición de BRET. Figura 9C: Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con rGFP-FYVE. Las células se incubaron en ausencia (-Ubo) o en presencia de Ubo 100 nM (+ Ubo) durante 30 minutos, luego se estimularon con varias concentraciones ya sea de AngII, SI o DVG durante 40 minutos antes de la medición de BRET. Figura 9D: Las células se transfectaron con AT1R-Rlucll junto con rGFP-rab4 o rGFP-rab11. Las células se incubaron en ausencia (-Ubo) o en presencia de Ubo 100 nM (+ Ubo) durante 30 minutos y luego se estimularon con AngII 100 nM, SI 100 nM o DVG 1 pM durante 10 minutos para el rGFP-rab4 y 30 minutos para el rGFP-rab11, luego se midieron BRET. El cambio en la relación BRET se expresa como porcentaje de la relación BRET observada en el grupo control (sin tratamiento con ligandos). Los datos representan la media ± SE de tres experimentos independientes.

Las figuras 10A y 10B representan el principio de un ensayo de chaperona farmacológica (PC, por sus siglas en inglés) basado en BRET y un ensayo de secuestro para evaluar el rescate funcional. Figura 10A: El ensayo de chaperona farmacológica (PC, por sus siglas en inglés) se basa en la relocalización de una proteína rescatada por chaperona farmacológica que, de lo contrario, sería retenida en un compartimento subcelular diferente. La relocalización detectada y medida al usar BRET, preferentemente con rGFP con una secuencia de direccionamiento a la membrana plasmática (rGFP-CAAX, Lyn-rGFP o rGFP-PB; para una descripción, véase la figura 11D). Los receptores y canales mal plegados, como hERG, se retienen en compartimentos intracelulares y se translocan a la membrana plasmática tras el rescate mediado por chaperona farmacológica. En este ensayo, el receptor se etiqueta preferentemente con Rlucll y la membrana con rGFP; la señal BRET es proporcional a la densidad de la proteína etiquetada con Rlucll en la membrana. La proteína mal plegada podría ser una proteína mutante o silvestre. Para los receptores que se internalizan tras la exposición al agonista, la funcionalidad del receptor rescatado puede evaluarse al usar el ensayo de secuestro inducido por el agonista representado en la figura 10B (el cual corresponde esencialmente al sensor basado en BRET representado en la figura 1A). Figura 10B: principio de un ensayo de secuestro inducido por agonista basado en BRET. Un marcador de membrana plasmática (PM, por sus siglas en inglés) se etiqueta con un aceptor de BRET como GFP (G) y el receptor rescatado por PC de interés (por ejemplo, un GPCR rescatado por PC) se etiqueta con un donador de BRET como RLuc (R). En ausencia de agonista (izquierda), los receptores se retienen en la PM y se colocalizan con el marcador de PM etiquetado con el receptor BRET, por lo tanto resulta en una fuerte señal del aceptor de BRET. Sin embargo, en presencia de un agonista (derecha), los receptores se internalizan, lo que disminuye por lo tanto la densidad del receptor etiquetado con el donador de BRET en la PM, lo cual resulta en una disminución en la señal del aceptor de BRET. Este ensayo puede realizarse después del rescate de receptores de superficie celular mediado por PC, en el mismo pozo, por lo tanto, en un ensayo homogéneo que controla dos aspectos diferentes de la biología del receptor.

Las figuras 11A a D muestran las construcciones usadas para validar y optimizar un sensor para detectar las propiedades de la chaperona farmacológica. Las figuras 11A a C: el ensayo de rescate de chaperona se desarrolló y probó con GPCR humano de tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés) y sustituciones que ocurren naturalmente (receptor de melanocortina 4: hMC4R y receptor de vasopresina 2: hV2R) y un canal de potasio dependiente de voltaje H2 (hERG, por sus siglas en inglés) etiquetado con un donador de BREt . Los receptores se etiquetaron en el extremo C-terminal con Rlucll. El canal hERG se marcó internamente con Rlucll en la posición equivalente del residuo 379 y la secuencia desde los residuos 373-379 se duplicó en cada lado del enlazador 3 y el enlazador 4 (véase figura 11C). Se usaron enlazadores flexibles entre el receptor/canal y la etiqueta Rlucll. La secuencia de los enlazadores se indica en la figura 11A para las construcciones MC4R (enlazador 1), en la figura 11B para las construcciones V2R (enlazador 2) y en la figura 11C para las construcciones hERG (enlazadores 3 y 4). Figura 11D: Se marcó un aceptor de BRET (rGFP) con diferentes secuencias de direccionamiento a la membrana plasmática o al aparato de Golgi: en el extremo N-terminal con la secuencia señal de la palmitoilación y miristoilación a partir de la Lyn quinasa (Lyn-), en el extremo C-terminal con la secuencia polibásica y la secuencia señal de la prenilación a partir de KRAS variante de empalme b (-CAAX), en C-terminal con la secuencia polibásica a partir del GRK5 humano (-PB), en el extremo C-terminal con la secuencia de palmitoilación direccionada a la membrana plasmática y la secuencia señal de prenilación a partir de hRas, en el extremo C-terminal con la secuencia de palmitoilación direccionada a la membrana plasmática a partir de hRas y la secuencia señal de prenilación a partir de Rali, en el extremo C-terminal con Caveolinala humana (un marcador de caveolas); y en el extremo N-terminal con la secuencia de direccionamiento a Golgi (residuos 1-73) a partir de eNOS1 humana. Los enlazadores 5, 6 y 7 se usaron entre rGFP y la secuencia de direccionamiento a la membrana plasmática: Lyn, CAAX y P^b, respectivamente. Se usó el enlazador 8 entre rGFP y la secuencia de palmitoilación/prenilación a partir de hRAS (CAAX) y hRAS/Rall (CAAX = CCIL), y entre rGFP y Caveolinala. Se usó el enlazador 9 entre la secuencia de direccionamiento a Golgi a partir de eNOS (1-73) y rGFP.

Las figuras 12A y B muestran las pruebas de diferentes proporciones (titulación) de dos formas de rGFP direccionadas a la membrana plasmática. Las titulaciones del donador de BRET para aceptor y el ensayo de rescate por PC se realizaron en células transfectadas (cantidad variable de construcción de rGFP 24 ng de construcción del receptor para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos), después de un tratamiento de 16 horas con una chaperona: (DCP^mP (N-((2R)-3(2,4-diclorofenil)-1-(4-(2-((1-metoxipropan-2-ilamino)metil)fenil)piperazin-1-il)-1-oxopropan-2-il)propionamida), 10 jM ) o vehículo (DMSO). Las HEK293 se transfectaron con la construcción hMC4R (R165Q)-Rlucll y diferentes cantidades de la construcción rGFP-CAAX (figura 12A); y rGFP-PB (figura 12B). La relación BRET se informa en función de la expresión de la construcción GFP (evaluada en fluorescencia) sobre la expresión de la construcción Rlucll (evaluada en bioluminiscencia).

Las figuras 13A a C muestran la expresión en la superficie celular y el rescate funcional mediado por PC del wt y el MC4R mutante a diferentes proporciones de receptor y rGFP-CAAX. Las HEK293 se cotransfectaron con una construcción de rGFP-CAAX (72 ng de plásmido para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos) y 3 cantidades diferentes (como se indica en los gráficos: 6, 12 y 24 ng para 10 pocillos) de hMC4R wt-Rlucll (figura 13A); hMC4R (P299H)-Rlucll (figura 13B); y hMC4R (R165Q)-Rlucll (figura l3 c ). El rescate mediado por Pc de la expresión y funcionalidad en la superficie celular (secuestro inducido por agonista) se evaluó en BRET2, en células transfectadas, después de un tratamiento de 16 horas con una chaperona: (DCPMP, 10 jM; barras negras y grises sólidas) o vehículo (DMSO; barras blancas). Las barras grises representan los datos obtenidos a partir de células tratadas con DCPMP, expuestas 1 hora a un agonista (alfa-MSH) para inducir el secuestro del receptor. Como se esperaba, el tratamiento con DCPMP induce un aumento en la expresión en la superficie celular, como lo revela un aumento en la señal BRET, en comparación con las células no tratadas (con barras). El tratamiento con agonistas induce el secuestro como lo revela una disminución en la señal BRET (barras grises) en comparación con las células tratadas con DCPMP pero no expuestas a un agonista (barras negras). Los receptores wt (figura 13A) y mutante R165Q (figura 13C) eran sensibles tanto a DCPMP como a a-MSH (10 jM, 1 hora a 37 °C) mientras que el MC4R mutante P299H no se rescató por PC (figura 13B). La ventana óptima para este ensayo ya se obtiene a 6 ng de donador y, el aumento de la cantidad de construcción de donador transfectado no condujo a un rescate medible de hMC4R (P299H).

La figura 13D muestra construcciones policistrónicas que codifican rGFP-CAAX (Kras) y un hMC4R WT o mutante se expresaron transitoriamente en células Hek293. Esta figura muestra que se pueden obtener resultados similares para el rescate por PC de la expresión en la superficie celular (barras blancas: DMSO frente a barras negras: DCPMP 10 jM ) y el rescate funcional, medido por secuestro inducido por agonista (+ alfa-MSH; barras grises), a partir de construcciones policistrónicas y no policistrónicas (figuras 13A-C). Se presenta el secuestro inducido por el agonista para las células no pretratadas con chaperona (barras hash).

La figura 13E muestra el rescate mediado por PC de mutantes V2R conocidos por retenerse intracelularmente, como lo demuestra el aumento de BRET en la membrana plasmática. El rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular se evaluó en BRET1, en células transfectadas, después de un tratamiento de 16 horas con una chaperona: (SR121463, 10 jM; barras negras sólidas) o vehículo (DMSO; barras blancas).

Las figuras 14A y 14B muestran 2 curvas de dosis-respuesta para el rescate funcional mediado por PC de la expresión en la superficie celular del MC4R WT y mutante (R165Q). Las HEK293 se cotransfectaron con una construcción rGFP-CAAX y las construcciones hMC4R wt-Rlucll o hMC4R (R165Q)-Rlucll (72 ng de construcción rGFP 24 ng de construcción del receptor para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos). Las dosis-respuesta del rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular, después de un tratamiento de 16 horas con concentraciones variables de DCPMP (figura 14A) y con el Compuesto 1 (figura 14B), se evaluaron en BRET2. Los resultados obtenidos con hMC4R wt-Rlucll (curvas superiores) o hMC4R (R165Q)-Rlucll (curvas inferiores) se informan en función de la concentración de chaperona expresada en una escala logarítmica. La CE50 y otros parámetros de curva se indican debajo de cada gráfico.

Las figuras 15A a 15D muestran la evaluación del factor Z como una indicación de la robustez del ensayo. Las HEK293 se cotransfectaron con una construcción rGFP-CAAX y las construcciones hMC4R wt-Rlucll (figuras 15A y 15B) o hMC4R (R165Q)-Rlucll (figuras 15C y 15D) (72 ng de construcción rGFP 24 ng de construcción del receptor para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos). La expresión en la superficie celular se evaluó en BRET2 en las figuras 15A y 15C al usar la coelenterazina 400a, y en BRET1 al usar la coelenterazina H (figuras 15B y 15D) después de un tratamiento de 16 horas con DCPMP 10 jM (48 pocillos) frente al vehículo (DMSO) (48 pocillos). Los valores de BRET se expresan por pocillo en los gráficos presentados y el factor Z se evalua por encima de 0,63 con el receptor hMC4R wt y por encima de 0,82 con el mutante R165Q mutante hMC4R, el cual indica un ensayo robusto con ambos receptores.

Las figuras 16A y 16B muestran la evaluación del impacto de DMSO en el ensayo de expresión en la superficie celular basado en BRET. Las HEK293 se cotransfectaron con una construcción rGFP-CAAX y las construcciones hMC4R wt-Rlucll (figura 16A) o hMC4R (R165Q)-Rlucll (figura 16B) (72 ng de construcción rGFP 24 ng de construcción del receptor para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos). La expresión en la superficie celular se evaluó en BRET2, después de un tratamiento de 16 horas con DCPMP 10 pM (barras derechas) o vehículo (DMSO, barras izquierdas) en presencia de una concentración creciente de DMSO (hasta 3%) durante el tratamiento con PC, en orden de evaluar si el ensayo basado en BRET para la evaluación de la superficie celular es sensible a niveles diferentes de DMSO. Como se presentó, los resultados obtenidos indican que este ensayo es resistente al menos al 3% de DMSO, lo cual es compatible con las aplicaciones HTS y la caracterización de compuestos.

Las figuras 17A y 17B muestran el rescate mediado por PC de la expresión de MC4R y V2R en líneas celulares transfectadas y estables rGFP. Las HEK293 se cotransfectaron con una construcción rGFP-CAAX (72 ng de plásmido para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos) y 3 cantidades diferentes (como se indica en los gráficos: 6, 12 y 24 ng para 10 pocillos) de hMC4R (R165Q)-Rlucll (figura 17A) o en hV2R (Y128S)-Rlucll (figura 17B). Las células HEK293 seleccionadas para expresar de forma estable diferentes niveles de rGFP-CAAX (bajo, medio (Med) y alto (Hi)) se transfectaron con la misma cantidad de construcciones del receptor. El rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular para MC4R se evaluó en BRET2, después de un tratamiento de 16 horas con DCPMP 10 |^j M, y para las células que expresan V2R (Y128S)-Rlucll con la chaperona SR121463 (un antagonista conocido con propiedades de agonista inverso y chaperona farmacológica; Serradeil-Le Gal C., Cardiovasc Drug Rev. 2001, 19 (3): 201-14) a 10 j M o vehículo (Dm So ). Los datos se presentan para las células que expresan MC4R y V2R como un % de la señal BRET observada con células tratadas con vehículo (DMSO). Los datos presentados indican que puede obtenerse una mejor respuesta con líneas celulares estables que expresan niveles más altos de rGFP-CAAX. La línea celular estable que expresa altos niveles de rGFP-CAAX (Estable: Hi) podría usarse para establecer líneas celulares que coexpresan un receptor-Rlucll.

Figuras 18A a 18E: Ensayo de rescate por PC para detectar ligandos del canal hERG (un no GPCR). La expresión en la superficie celular y rescate funcional mediado por PC de hERG wt (figura 18A) y mutante (G601S; figura 18B) a diferentes proporciones de hERG a rGFP-CAAX. Las células HEK293 se cotransfectaron con una construcción rGFP-CAAX (72 ng de plásmido para 10 pocillos de una placa de 96 pocillos) y 3 cantidades diferentes (como se indica en los gráficos: 6, 12 y 24 ng para 10 pocillos) de hERG wt-Rlucll (figura 18A) y hERG (G601S)-Rlucll (figura 18B). El rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular se evaluó en BRET2, después de un tratamiento de 16 horas con una chaperona: (Astemizol, 10 ^jM; barras negras sólidas) o vehículo (DMSO; barras blancas). El tratamiento con Astemizol induce un aumento en la expresión en la superficie celular, como lo revela un aumento en la señal BRET, en comparación con las células tratadas con vehículo. Los hERG wt (figura 18A) y mutante G601S (figura 18B) fueron sensibles al tratamiento con PC y se usaron para caracterizar ligandos que se unen y actúan con diferente eficacia como chaperonas en hERG (figuras 18C y D). En la figura 18E, la robustez del ensayo con la construcción hERG (G601S)-Rlucll se evaluó con un factor Z. La expresión en la superficie celular se evaluó en BRET2, después de un tratamiento de 16 horas con Astemizol 10 ^jM (48 pocillos) frente al vehículo (DMSO) (48 pocillos). Los valores de BRET se expresan por pocillo en los gráficos presentados y el factor Z evaluado en 0,622; lo cual indica un ensayo robusto que sería susceptible de aplicación del cribado de alto rendimiento.

La figura 19A muestra la configuración de un biosensor para monitorear el reclutamiento de p-arrestina a un GPCR en la membrana plasmática. Un aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP, GFP10) se etiqueta con una porción de direccionamiento a PM (anclando así el aceptor de BRET en la PM), y una p-arrestina se etiqueta con un donador de BRET (por ejemplo, Rlucll). En presencia de un agonista de GPCR (representado por A), se recluta p-arr al GPCR, lo que aumenta así la concentración de Rlucll-p-arr en la membrana plasmática, lo que a su vez resulta en un aumento en la transferencia de energía (BRET) entre Rlucll y la GFP etiquetada con PM.

Las figuras 19B y 19C muestran el aumento en la relación BRET para el reclutamiento de p-arrestina y p-arrestina ² , respectivamente, en GPCR p2AR clase A, para diferentes fracciones de direccionamiento a PM (Lyn, CAAX y PB-GRK5) y aceptores BRET (rGFP y GFP10), después de la estimulación con dosis crecientes del agonista isoproterenol (iso). El sensor de translocación p-arrestina-Rlucll con rGFP-CAAX (cuadrados) ofrece la mejor ventana con ambos receptores.

Las figuras 19D y 19E muestran el aumento en la relación BRET para el reclutamiento de p-arrestina ¹ y parrestina ² , respectivamente, en GPCR V ² R clase B, para diferentes fracciones de direccionamiento a PM (Lyn, CAAX y PB-GRK5) y aceptores BRET (rGFP y GFP10), después de la estimulación con dosis crecientes del agonista AVP.

La figura 19F muestra el reclutamiento de p-arrestina ² a p2AR después de la estimulación con dosis crecientes del agonista isoproterenol (iso), tal como se evaluó al usar diferentes fracciones de direccionamiento a PM (CAAX a partir de Kras, CAAX a partir de Hras, la secuencia de palmitoilación direccionada a la membrana plasmática a partir de hRas y la secuencia señal de prenilación a partir de Ral1 (CCIL) y el marcador de las estructuras de caveolas Caveolina1a etiquetada con rGFP. El sensor de translocación p-arrestina-Rlucll con rGFP-CAAX (cuadrados) muestra un aumento de la densidad en la membrana plasmática. En contraste con la respuesta obtenida con los marcadores rGFP-CAAX, una estimulación de p2AR conduce a una disminución en la densidad de p-arrestina ² en las caveolas.

La figura 19G muestra curvas de dosis-respuesta para la translocación de parrestina2 en la membrana plasmática después de la estimulación con AT1R. Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R y parr2-Rlucll junto con Lyn-rGFP, o rGFP-CAAX o GFP10-CAAX. Las células se incubaron con varias concentraciones de AnglI durante 6 minutos a temperatura ambiente antes de las mediciones de BRET. Los datos se expresan como porcentaje basal de BRET. Los datos son las medias ± SE de 3 experimentos diferentes.

Las figuras 19H-19J muestran los factores Z obtenidos para el biosensor parrestina ² -Rlucll/rGFP-CAAX y los receptores de las figuras 19C, 19E y 19G, respectivamente. Este ensayo, para monitorear el reclutamiento de parrestina mediada por receptor, resulta en factores Z de al menos 0,74 (0,74; 0,80 y 0,838), el cual sería susceptible a la detección (incluido el cribado de alto rendimiento) para GPCR de clase A y B.

Las figuras 20A y 20B muestran la disminución dependiente de la dosis de AnglI en la cantidad de PIP2 en plasma detectada por BRET entre Rlucll-PH(PLC61) y rGFP-PH(PLC61) o Lyn-rGFP o rGFP-CAAX. Las células HEK293SL se transfectaron con AT1R y HA-Rlucll-PH(PLC61) junto con rGFP-PH(PLC61), Lyn-rGFP o rGFP-CAAX. Las células se incubaron con varias concentraciones de AnglI durante 1 minuto a temperatura ambiente, luego se midió BRET. Los resultados son medias ± SE de triplicados en un solo experimento representativo.

La figura 21A muestra la configuración de un biosensor unimolecular para monitorear el reclutamiento de parrestina a un GPCR en la membrana plasmática. Un aceptor de BRET ( por ejemplo , rGFP, GFP10) se etiqueta con una porción de direccionamiento a PM (anclando así la construcción en la PM) y se coloca un enlazador flexible entre el aceptor de BRET y un donador de BRET ( por ejemplo , Rlucll), el cual se une a una p-arrestina. En presencia de un agonista de GPCR (representado por A), se recluta p-arr al GPCR, lo que aumenta así la concentración de Rlucll-p-arr en la membrana plasmática, lo que a su vez produce un aumento en la transferencia de energía (BRET) entre Rlucll y la GFP etiquetada con PM.

La figura 21b muestra la relación BRET al usar biosensores unimoleculares con enlazadores flexibles de diferentes longitudes para evaluar el reclutamiento de p-arrestina ² a V ² R después de la estimulación con AVP.

Las figuras 21C a 21E muestran curvas de dosis-respuesta para el reclutamiento de p-arrestina ² a diferentes GPCRs (AT1R, V2R y p2AP) al usar biosensores unimoleculares.

La figura 22A muestra una representación esquemática de un biosensor unimolecular para medir la translocación del dominio de unión a diacilglicerol (DAG-) de PKCdelta (C1b) a la membrana plasmática. El biosensor comprende un dominio/porción de direccionamiento a PM (Mem), un aceptor de BRET ( por ejemplo, GFP10), un enlazador flexible, un donador de BRET ( por ejemplo, RLucll) y el dominio de unión a DAG de PKC6, C1b. Tras la activación de PLC, PIP ² de membrana se hidroliza a IP ³ y DAG. El enriquecimiento de DAG causa que el dominio C1b se una a la membrana, al llevar el aceptor de BRET ( por ejemplo , GFP10) y el donador de BRET ( por ejemplo , Rlucll) más cerca uno del otro, lo que induce una señal BRET más alta.

La figura 22B muestra la cinética de la activación del sensor DAG después de la exposición de AT1R a angiotensina II. Las células HEK293 que expresan AT1R de forma estable se transfectaron con una construcción que codifica el ADN del sensor DAG unimolecular y BRET. El nivel de BRET se monitoreó cada 4 segundos. Se añadió AnglI (concentración final de 100 nM) después de 16 mediciones de BRET (64 segundos). Los datos son la media ± DE de triplicados de un experimento representativo.

Las figuras 22C a 22E muestran las curvas de dosis-respuesta obtenidas con el sensor DAG unimolecular que representa el nivel de DAG producido en la membrana plasmática después de la activación del receptor de angiotensina II (AT1R) con angiotensina II (ANGII) (figura 22c ), receptor de prostaglandina F (FP) con dos ligandos naturales, prostaglandina 2a (PGF2a; diamantes sólidos) y prostaglandina E2 (PGE2; círculos abiertos) (figura 22D), receptor de urotensina II (GPR14) con urotensina II (UTII) (figura 22E). Los valores de CE ⁵⁰ obtenidos para esos ligandos (ANGII=5,3 nM, PGF2a=11 nM, PGE2=90 nM y UTII=1,7 nM) son similares a los datos ya publicados para otro ensayo relacionado (afluencia de calcio) y unión.

La figura 22F muestra que la respuesta BRET medida con el sensor DAG unimolecular refleja la activación de PLC y la producción concomitante de diacilglicerol. Las células HEK293 que expresan transitoriamente el sensor DAG unimolecular se expusieron a 5 pM de m-3m3SFB, un activador directo de PLC (isoformas p2, p3, ^y1, ^y2, 61), durante el tiempo indicado. La activación de PLC condujo a un aumento en BRET, lo que refleja un aumento sostenido del nivel de DAG en la membrana plasmática.

Las figuras 22G y 22H muestran la robustez del biosensor DAG. Se determinó un factor Z para el biosensor DAG al usar HEK293 que expresa transitoriamente la urotensina-II (figura 23G) o el receptor de prostaglandina F (figura 23H) junto con el biosensor DAG. Las células se expusieron a 100 nM del agonista (Uroll en la figura 23G o PGF2a en la figura 23H) durante x minutos antes de las mediciones de BRET.

La figura 23A muestra una representación esquemática de un biosensor para medir la translocación del dominio de unión a diacilglicerol (DAG-) de PKCdelta (C1b) a la membrana plasmática. El biosensor comprende un dominio/porción de direccionamiento a PM unido a un aceptor de BRET ( por ejemplo, rGFP) y un donador de BRET ( por ejemplo, RLucll) enlazado al dominio de unión a DAG de PKC6, C1b. Tras la activación de PLC, PIP ² de membrana se hidroliza a IP ³ y DAG. El enriquecimiento de DAG causa que el dominio C1b se una a la membrana, al llevar el aceptor de BRET ( por ejemplo , rGFP) y el donador de BRET ( por ejemplo , RLucll) más cerca uno del otro, lo que induce una señal BRET más alta.

Las figuras 23B a 23D muestran curvas de dosis-respuesta para el reclutamiento de C1b en la membrana plasmática después de la activación del receptor de histamina H1 (H1R) (figura 23B), receptor de bradiquinina B2 (BKRB2) (figura 23C), receptor de dopamina D2 (D2R) (figura 23D) y p2AR (figura 23E) al usar el biosensor DAG. La activación de los receptores acoplados a Gq (H1R y BKRB2) conduce a una mejor señal que un receptor acoplado a Gi (D2R) o un receptor acoplado a Gs que esencialmente no conduce a una respuesta detectable en ausencia de la coexpresión de G15, una G proteína de la familia Gq.

La figura 24A muestra una representación esquemática de un biosensor para medir la translocación y activación de la proteína G. El biosensor comprende un dominio/porción de direccionamiento a PM ( por ejemplo , dominio CAAX) conectado a un aceptor de BRET ( por ejemplo, rGFP) y un donador de BRET ( por ejemplo, Rlucll) unido a una subunidad de la proteína G, por ejemplo, Gy (sensor basado en el secuestro de GpY) o Ga (sensor basado en el secuestro de Ga). Tras la activación del GPCR por un agonista (A), la subunidad de la proteína G se libera del GPCR, al reducir así la cantidad/densidad de la subunidad de la proteína G en la membrana plasmática, lo que conduce a una señal BRET más baja. Un cambio en BRET también podría reflejar la translocación desde (disminución en BRET) o hacia (un aumento en BRET) un subdominio de la membrana o compartimento subcelular etiquetado con un marcador rGFP.

Las figuras 24B y 24C muestran el secuestro de varias subunidades Gy etiquetadas con RLucll de la membrana plasmática (rGFP-CAAX Kras) en respuesta a la estimulación de p1AP (figura 24B) o p2AR (figura 24C) con isoproterenol. Antes del experimento, las células HEK293 se cotransfectaron con construcciones que codifican un receptor p-adrenérgico, una subunidad Gp1 WT, una subunidad Gy etiquetada con Rlucll (como se indica) y Ga15 WT. La combinación con la subunidad Rlucll-GYl da la mejor ventana para establecer curvas de dosis-respuesta para esos 2 receptores.

La figura 24D muestra una curva de dosis-respuesta para el secuestro de Gy1 etiquetado con RLucll promovido por agonista a partir de rGFP-CAAX (Kras) después de la estimulación plAR (círculos) y p2AR (triángulos) con isoproterenol de células HEK293 transfectadas transitoriamente con construcciones que codifican un receptor padrenérgico, una subunidad Gp1 WT, una subunidad Gy1 etiquetada con Rlucll y Ga15 WT. Las CE ⁵⁰ observadas son similares a los kd reportados de isoproterenol para esos receptores.

La figura 24E muestra curvas de dosis-respuesta para el secuestro de Gs etiquetada con RLucll promovido por agonista a partir de rGFP-CAAX Kras (círculos), rGFP-CAAX Hras (cuadrados) y rGFP-CAAX CCIL (triángulos) después de la estimulación de p1AR con isoproterenol. La potencia observada con los 3 marcadores a PM se extiende desde 4,4 nM (con rGFP-CAAX Kras) hasta 847 nM (con rGFP-CAAX CCIL), lo que indica que la farmacología de diferentes ligandos podría ser distinta en dominios monitoreados con marcadores específicos. La figura 24F muestra la cinética del secuestro de Gs etiquetado con RLucll promovido por agonista a partir de rGFP-CAAX Kras (círculos), rGFP-CAAX Hras (cuadrados) y rGFP-CAAX CCIL (triángulos) después de la estimulación de p1AR con isoproterenol 1 pM durante el tiempo indicado. La respuesta máxima se alcanza principalmente dentro de los 5 minutos de estimulación, medida con los tres marcadores a PM. Las diferencias de la CE ⁵⁰ en la figura 24E, por lo tanto, no son impulsadas por las diferencias en la cinética ya que las curvas de dosisrespuesta se establecieron en la respuesta máxima.

La figura 24G muestra curvas de dosis-respuesta para el secuestro de G12 etiquetado con RLucll promovido por agonista a partir de rGFP-CAAX CCIL (triángulos), rGFP-CAAX Hras (cuadrados) y Golgi-rGFP (dominio de direccionamiento a Golgi de eNOSI; diamantes) después de la estimulación de p1AR con isoproterenol. El BRET basal indica que G12 se colocalizó con el marcador de Golgi. Sin embargo, la mayor parte de la translocación inducida por el agonista de G12 se observa al usar los marcadores a PM y solo mínimamente a partir de Golgi. Estos resultados muestran que tanto Gs como G12 pueden observarse después de la estimulación de un receptor.

La figura 24H muestra curvas de dosis-respuesta para la translocación de Gq etiquetado con RLucll promovido por agonista a rGFP-CAAX Kras (círculos), rGFP-CAAX Hras (cuadrados), rGFP-CAAX CCIL (triángulos) y Golgi-rGFP (dominio de direccionamiento Golgi de eNOSI; diamantes) después de la estimulación de la isoforma a del receptor de tromboxano A2 (TpaR) con un agonista prototípico: U46619. Las curvas de dosis-respuesta se obtuvieron a partir de las células HEK293 transfectadas transitoriamente con construcciones que codifican: TpaR, Gaq pos118Rlucll (Rlucll insertado después del residuo 118 de Gaq), G^y5 WT y Gp1, pretratados o no durante 20 minutos con Ubo-Qic, un inhibidor específico de Gq. El BRET basal indica que Gq está mayormente colocalizado con rGFP-CAAX Kras (círculos sólidos) y el pretratamiento con Ubo-Qic (círculos abiertos) aumenta además la densidad de Gq con este marcador, al atenuar la ventana de respuesta a U46619. Las curvas de dosis-respuesta obtenidas con los otros marcadores muestran un aumento de la densidad de Gq (un aumento en BRET; cuadrados sólidos, triángulos sólidos y diamantes sólidos para rGFP-CAAX Hras, rGFP-CAAX CCIL y Golgi, respectivamente) solo con células no expuestas a un bloqueador Gq. No se observa respuesta con estos marcadores con células pretratadas con el inhibidor de Gq (cuadrados abiertos, triángulos abiertos y diamantes abiertos para rGFP-CAAX Hras, rGFP-CAAX CCIL y Golgi, respectivamente). Estos resultados demostraron que la translocación de la proteína G se enlaza, al menos para Gq, a su activación y que es posible observar tanto el secuestro como el reclutamiento a subdominios, en respuesta a una estimulación agonista.

La figura 25A muestra una representación esquemática de un biosensor para medir la activación de Rho mediante la translocación del dominio de unión a Rho de la proteína quinasa N1 (PKN) a la membrana plasmática. El biosensor comprende un dominio/porción de direccionamiento a PM unido a un aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP) y un donador de BRET (por ejemplo, Rlucll) enlazado al dominio de unión a Rho de PKN. Tras la activación de la proteína G, se recluta un RhoGEF a una subunidad Ga activada, como la familia Gq y G12/13, o al GpY liberado a partir del Ga activado. Este GEF activa una pequeña proteína G de la familia Rho. Una vez activado, Rho recluta efectores específicos con un dominio que interactúa específicamente con un Rho activado; PKN es uno de esos efectores. En base a esta propiedad, se creó un sensor para monitorear la activación de Rho por subclonación del dominio de unión a Rho PKN1 (CRIB) en un vector de expresión que contiene un donador de BRET, Rlucll, y al monitorear su translocación a la membrana plasmática donde se encuentra el Rho activado. La translocación trae el aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP) y el donador de BRET (por ejemplo, RLucll) más cerca uno del otro, lo que induce una señal BRET más alta.

La figura 25B muestra curvas de dosis-respuesta para la translocación de PKN-RRLucll promovida por el agonista a marcadores de la membrana plasmática: rGFP-CAAX Kras (círculos), rGFP-CAAX Hras (triángulos invertidos) y rGFP-CAAX (CCIL; triángulos) después de la estimulación de TpaR con un agonista (U46619). Las curvas de dosisrespuesta se obtuvieron a partir de las células HEK293 transfectadas transitoriamente con construcciones que codifican: TPaR, PKN-RLucll, y un marcador rGFP de membrana plasmática. TPaR es un receptor prototípico acoplado a Gq/12/13 que se sabe que activa RhoA.

La figura 25C muestra la cinética de la activación del sensor Rho después de la exposición de AT1R a angiotensina II. Las células HEK293SL se transfectaron con construcciones que codifican AT1R junto con PKN-crib-Rlucll y rGFP-CAAX. Las células se incubaron primero en ausencia o en presencia de Ubo-Qic 100 nM (un inhibidor específico de Gq también conocido como FR900359) durante 30 minutos antes de las mediciones de BRET cada 2 segundos. Se inyectaron Tyrode (no estimulado) o AnglI (estimulado; concentración final de 100 nM) después de 30 segundos. Los datos son el promedio de lecturas duplicadas en diferentes puntos de tiempo de un experimento representativo. La figura 25D a 25F muestra el impacto de la inhibición de Gq en la activación de Rho por diferentes ligandos de AngII. Las células HEK293SL se transfectaron con construcciones que codifican AT1R junto con PKN-CRIB-Rlucll y rGFP-CAAX. Las células se incubaron en ausencia (línea continua) o presencia (línea punteada) de Ubo-Qic 100 nM (inhibidor de Gq) durante 30 minutos, luego se estimularon con varias concentraciones de AngII o análogos durante 4 minutos antes de las mediciones de BRET. Los datos se normalizaron al Emax de AngII. Los datos representan como las medias ± SE a partir de 3-4 experimentos independientes. Los ligandos activadores de Gq, como AngII, hAngIII, SVdF, SBpa, hSarmesin y SI mostraron una eficacia reducida y una potencia desplazada hacia la derecha en presencia de ubo (figuras 25^d y E). El bloqueo de Gq no afectó la activación de Rho mediada por DVG, Saralasina y TRV ya que estos ligandos no activan Gq. SII mostró solo el CE ⁵⁰ cambiante mediante tratamiento con ubo, lo que sugiere que SII activa débilmente a Gq/11.

La figura 25G muestra el impacto de la inhibición de Gq en la activación de Rho por los receptores AT1R y acetilcolina. Las células HEK293SL se transfectaron con construcciones que codifican AT1R junto con PKN-CRIB-Rlucll y rGFP-CAAX. Las células se incubaron en ausencia (control) o en presencia de Ubo 100 nM antes de estimularse con AngII 100 nM o carbacol 100 pM (CCh) durante 70 segundos antes de las mediciones de BRET. Los resultados muestran que Ubo bloqueó parcialmente el aumento de BRET mediado por AngII y bloqueó completamente las respuestas mediadas por CCh; lo que sugiere que Gq juega un papel en la activación de Rho por AngII y CCh. Los datos son las medias ± D^ede triplicados a partir de un experimento representativo.

La figura 25H muestra los efectos sobre un inhibidor de Rho de la activación del sensor Rho. Las HEK293SL que expresan AT1R, PKN-crib-Rlucll y rGFP-CAAX, se incubaron con 3 pg/ml de toxina C3 (inhibidor de Rho, Cytoskeleton, Inc.) en Tyrode por ~4 horas a 37 °C, luego se estimularon con AngII 100 nM durante 70 segundos a temperatura ambiente. La toxina C3 abolió completamente los aumentos de BRET mediados por agonistas, lo que valida el sensor para monitorear la actividad de Rho.

La figura 25I muestra que la translocación de PKN a la membrana plasmática depende de la activación de Rho. Las células HEK293 que expresan transitoriamente TPaR y el sensor PKN (PKN-Rlucll CAAX-rGFP), se pretrataron o no, durante la noche, con un inhibidor Rho (CT04; Cytoskeleton, Inc) y se expusieron a 100 nM de U46619 (agonista TPaR), 1 pg/ml del activador II de Rho (CN03; Cytoskeleton, Inc) o vehículo. El inhibidor de Rho abolió la respuesta mediada por TPaR mientras que el activador de Rho induce una respuesta, lo que valida este sensor para monitorear la actividad de Rho.

Las figuras 26A y 26B muestran la transferencia BRET obtenida entre Rlucll y diferentes aceptores BRETT para construcciones de fusión unimolecular. La señal BRET obtenida al usar rGFP fue más de 10 veces más alta que la obtenida con los aceptores BRET1 (Venus) y BRET2 (GFP2) típicos. La figura 26A muestra la diferencia de transferencia de energía cuando Rlucll se combina con Venus, GFP2 y rGFP. La figura 26B muestra la relación BRET calculada a partir de construcciones fusionadas de Venus, GFP2 y rGFP.

La figura 26C muestra que la señal BRET mejorada por rGFP puede usarse para monitorear BRET en microscopía, incluso para un ensayo basado en BRET de densidad tal como el reclutamiento de beta-arrestina en la membrana plasmática. El ensayo usado en este experimento es similar al presentado en la figura 19C medido al usar un lector de placa. Las células HEK293 se transfectaron transitoriamente con construcciones que codifican el P ² AR, el parrestina2-Rlucll y el marcador de membrana plasmática: rGFP-CAAX (Kras). La estimulación con isoproterenol indujo el aumento del nivel de la señal BRET solo en la membrana plasmática, lo que indica que un aumento en la señal BRET es un reflejo del reclutamiento de parrestina en la membrana plasmática.

La figura 27A muestra los resultados de una detección de moduladores de la endocitosis AT1R. Después de la transfección transitoria de AT1R-Rlucll y rGFP-FYVE, las células HEK293 se dispensaron en una placa de 384 pocillos (Greiner) tratada con cultivo de tejido blanco y se cultivaron durante 24 horas adicionales. Los compuestos se añaden al usar una herramienta Pin Tool magnética 384 (V&P scientific) a una concentración final de 15 pM o 5 pg/ml en dependencia de la sub-biblioteca de compuestos. Para el modo agonista, los compuestos se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. La fluorescencia de GFP fue roja al al usar un Envision™ (Perkin-Elmer®) y se añadió coelenteracina 400a a una concentración final de 5 pM al usar un multidrop 384 (Thermo-Scientific®). Las células se incubaron a temperatura ambiente antes de leer la señal BRET (RLuc a 480 nm y rGFP a 530 nm). Para el modo antagonista, los compuestos se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Se añadió angiotensina II a 10 nM (CE ⁸⁰ ) y se incubaron durante 30 minutos adicionales a 37 °C. El resto del ensayo se realizó como el modo agonista. Los datos se analizaron al usar ActivityBase (IDBS) y se informaron como % de agonista o % de inhibición basado en la activación de la angiotensina II. Se muestran respectivamente 30 y 42 compuestos que actúan como potenciadores (aumentaron la señal en más del 100%) e inhibidores (bloquearon más del 50% de la señal) para el AT1R dirigido a los endosomas.

La figura 27B muestra los efectos del compuesto #21 en la detección sobre la endocitosis de B2R y parrestina2 a los endosomas, y la figura 27C muestra los efectos de los compuestos #10 y #29 identificados en la detección sobre la endocitosis ^b2^ra los endosomas. Un día antes de la transfección, las células HEK293SL se sembraron en platos con fondo de vidrio de 35 mm a una densidad de 100.000 células/plato. Las células se transfectaron con B2R-YFP mCherry-FYVE (figura 27B izquierda y media y 27C) o B2R parrestina2-YFP (figura 27C). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se privaron de suero durante 30 minutos y se pretrataron ya sea con vehículo (figura 27B izquierda y 27C izquierda), compuesto 21 (figura 27B medio y derecho), compuesto 10 (figura 27C medio) o compuesto 29 (figura 27C derecha) durante 30 minutos a 37 °C. Luego las células se estimularon con o sin (no tratada) bradiquinina (1 pM) durante 15 minutos. Las muestras se analizaron en un microscopio de exploración láser Zeiss™ LSM-510 Meta al usar láser de argón (514 nm) y láser HeNe I (543 nm), y las imágenes (2048x2048 píxeles) se recogieron al usar una lente de inmersión en aceite 63x.

Divulgación de la invención

En los estudios descritos en la presente memoria, se han desarrollado biosensores basados en BRET que permiten evaluar/monitorear la localización y el tráfico intracelular (por ejemplo, internalización del receptor, reciclaje, exocitosis) de proteínas, tales como receptores y otras proteínas. Al usar GPCR y un canal iónico como modelos, se han desarrollado medios sensibles, basados en el BRETde renilla par Rlucll-rGFP, para el monitoreo en tiempo real y el perfil farmacológico de la internalización del receptor y p-arrestina y su tráfico dentro de diferentes compartimentos celulares, así como para la identificación de reguladores de tráfico. Estos sensores se basan en cambios en las concentraciones o densidades del donador en relación con el aceptor en una localización celular dada o en un compartimento celular dado, el cual se promueve por un modulador, independientemente de las interacciones directas proteína-proteína (como suele ser el caso para ensayos BRET convencionales) es más versátil y adaptable a la mayoría del tráfico de proteínas entre diferentes localizaciones/compartimentos celulares. Se encontró que el uso de un par BRET de renilla, como el par BRET representativo Rlucll/rGFP, proporciona un sistema de respuesta muy robusto y reproducible, lo cual aumenta el rango dinámico en ~ 5 a 10 veces en comparación con los pares tradicionales BRET1 (Rluc/Venus) o BRET2 (Rlucll/GFP10). En general, el rango dinámico de la señal es muy estrecho al usar el par Rluc/Venus (relaciones BRET de 0,04-0,08), similar al obtenido con la versión de los biosensores que usan el par Rlucll/GFP10 (véase ejemplos 3 y 12, figuras 2A a 2C y 19A a 19E). Este rango dinámico muy superficial limita en gran medida el análisis de cambios sutiles en el tráfico del receptor y efector y hace que el ensayo sea ineficientemente sensible para el cribado de alto rendimiento (HTS). Los biosensores sensibles descritos en la presente memoria pueden ser útiles para:

• Monitoreo en tiempo real de la internalización y reciclaje del receptor de superficie celular (es decir, receptores que regresan a la membrana plasmática después de la internalización): Ellos permiten examinar la eliminación de diferentes receptores (por ejemplo, GPCR, RTK) a partir de la membrana plasmática y, por el contrario, después de inducir la endocitosis, monitorean el reciclaje de los receptores a través de la recuperación de la señal BREt en la PM después de la eliminación del ligando. También permiten el estudio de la regulación, la farmacología y la especificidad de la vía de endocitosis del tráfico del receptor.

• El monitoreo en tiempo real del tráfico del receptor y fi-arrestina en diferentes compartimentos intracelulares.

Permiten evaluar la internalización de receptores dependiente de clatrina y p-arrestina (por ejemplo, GPCRs) y el tráfico diferencial de complejos receptor/p-arrestina dentro de distintos compartimentos celulares, como los endosomas de reciclaje (ENDs).

• El perfil farmacológico del tráfico del receptor (por ejemplo, GPCR) y de fi-arrestina: Permiten evaluar la propensión de los ligandos a regular el tráfico de complejos receptor/p-arrestina dentro de compartimentos celulares distintos, y monitorear los efectos de los fármacos tanto en la internalización inicial del receptor como en el ciclo de los receptores (por ejemplo, GPCRs) en la PM.

• Identificación de moduladores del tráfico a través del cribado de alto rendimiento (HTS): Debido a que los ensayos son reproducibles y sensibles, permiten el cribado de alto rendimiento para identificar moduladores del receptor (por ejemplo, GPCR) y otro tráfico de proteína. Se proporcionó una prueba de principio con el AT1R, y la identificación de nuevos reguladores de moléculas pequeñas de este tráfico del receptor, y también otros GPCRs como el B2R (ejemplo 17).

• Identificación de agentes (chaperonas) capaces de rescatarla expresión de receptores. El ensayo de chaperona es independiente de la señalización del receptor y es principalmente un ensayo de unión para detectar ligandos que estabilizan o influyen en la conformación de una diana específica (receptor). Por lo tanto, es un ensayo interesante para la detección de ligandos ortostéricos y alostéricos, de manera imparcial de señalización. Este ensayo de unión podría usarse además para identificar un efecto "fuera de la diana" de un agente, es decir, para determinar si un agente identificado contra una diana particular también reacciona de forma cruzada con una o más dianas adicionales (lo cual podría evaluarse al determinar si el agente "rescata" estos una o más dianas adicionales al usar el biosensor descrito en la presente memoria.

• Monitorización/evaluación del reclutamiento de proteínas (por ejemplo, proteínas adaptadoras o de señalización) a los receptores (por ejemplo, reclutamiento de fi-arrestina a GpCRs, secuestro de la subunidad de la proteína G, reclutamiento de Grb2 al receptor de tirosina quinasa (RTK), el cual refleja la activación del receptor.

Debido a que los diferentes marcadores del compartimento celular permanecen en sus compartimentos selectivos (por ejemplo membrana plasmática (PM) o endosomas (ENDs)), y debido a que solo el receptor (u otras proteínas etiquetadas, como p-arrestina, subunidades de la proteína G, efectores, etc.) se mueve de un compartimento a otro tras la modulación por un ligando (por ejemplo, estimulación agonista, inhibición antagonista o chaperonas farmacológicas), permite el rastreo del tráfico de proteínas desde la PM a los ENDs, el cual puede revelarse por una disminución (para el ensayo PM-rGFP/receptor-Rlucll) y/o un aumento (ppara el ensayo END-rGFP/receptor-Rlucll), respectivamente. Además, al usar el sistema PM-rGFP/receptor-Rlucll, el reciclaje del receptor puede monitorearse con la desaparición del ligando después de su endocitosis. Este ensayo no está limitado a evaluar la endocitosis/reciclaje de receptores, sino que también es susceptible a identificar y caracterizar chaperonas farmacológicas (véase ejemplos 7 a 11), y también a evaluar/monitorear los procesos de exocitosis y translocación de proteínas. Por lo tanto, se puede acceder cuantitativamente a cualquier tipo de movimiento de proteínas (tráfico) entre diferentes compartimentos intracelulares con alta sensibilidad al usar los biosensores descritos en la presente memoria.

Estos biosensores también pueden aplicarse no solo al tráfico de proteínas (por ejemplo, receptor, proteínas intracelulares) pero también para monitorear cualquier tipo de concentración local o cambios de densidad de proteínas y otras biomoléculas en las células. Se puede hacer en dos maneras: Primero, si el rGFP o el Rlucll están etiquetados con orgánulos intracelulares específicos o marcadores del compartimento celular, puede ser posible seguir la proteína de interés en diferente localización intracelular tras cualquier condición específica. Segundo, los biosensores de la invención pueden aplicarse para monitorear la concentración o densidad local de proteínas, así como la densidad local de lípidos u otras biomoléculas (por ejemplo, segundos mensajeros). El par Rlucll-rGFP se aplicó para detectar la generación de la membrana PI(4,5)P²al usar el dominio PLC81-PH (ejemplo 13, figuras 20A y B). En el estado basal, PLC81-PH-Rlucll y PLC51-PH-rGFp (o rGFP fusionado a una porción de direccionamiento a PM como Lyn o CAAX) se localizan en la PM donde PI(4,5)P²se localiza, por lo que su concentración local es lo suficientemente alta como para generar un BRET. Cuando se activa la fosfolipasa C (PLC), PI(4,5)P²se hidroliza, y el dominio PLC81-PH etiquetado con Rlucll y rGFP se difunde dentro del citosol lo que reduce la concentración local de rGFP y Rlucll, por lo tanto se reduce la señal BRET. De manera similar, el dominio de unión a DAG de PKCdelta (C1b) puede usarse para medir la hidrolización de PIP ² en IP ³ y DAG (figuras 22A y 23A). El enriquecimiento de DAG hace que el dominio C1b se una a la membrana, al llevar el aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP, enlazado a una porción de direccionamiento a PM) y el donador de BRET (por ejemplo, RLucll, enlazado a C1b) más cerca uno del otro, lo que induce una señal BRET más alta. Con la misma razón, también podría detectarse cualquier tipo de segregación de proteínas. En una realización, el tráfico es la internalización y/o reciclaje del receptor.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un biosensor para evaluar la localización y/o tráfico de una proteína/polipéptido de interés que comprende: un primer componente que comprende la proteína/polipéptido de interés etiquetado con una proteína verde fluorescente Renilla (Renilla GFP) o una proteína luciferasa Renilla (Renilla Luc); un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento al compartimento celular etiquetado con una Renilla ^gF^po una Renilla Luc; en el que si dicha proteína/polipéptido de interés se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha proteína/polipéptido de interés se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla GFP.

El término "proteína/polipéptido de interés" se refiere a cualquier proteína/polipéptido (nativo, mutado, soluble o unido a la membrana) o fragmentos/porciones de los mismos, cuya localización, translocación y/o reclutamiento a uno o más compartimentos celulares debe evaluarse. La proteína de interés puede ser, por ejemplo, un receptor, una proteína reclutada,o secuestrada, de la membrana plasmática tras la estimulación del receptor, una proteína que se transloca al núcleo, etc. En una realización, la proteína de interés es un receptor (es decir, una proteína que se encuentra unida o incrustada dentro de la membrana plasmática). En una realización, el receptor se internaliza tras la unión del ligando (por ejemplo, agonista). En una realización, el receptor es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR). "GPCR" se refiere a moléculas de GPCR nativas de longitud completa, así como a moléculas de GPCR mutantes. Se proporciona una lista de GPCRs en Foord y otros (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288, y una lista actualizada de G^pCR^sestá disponible en la base de datos lUPHAR-DB (Harmar AJ y otros (2009) IUPHAR-DB: the IUPHAR database of G proteincoupled receptors and ion channels. Nucl. Acids Res. 37 (Emisión de la Base de Datos): D680-D685; Sharman JL, y otros, (2013) IUPHAR-DB: updated database content and new features. Nucl. Acids Res. 41 (Emisión de la Base de Datos): D1083-8).

En otra realización, el receptor es un canal iónico, por ejemplo, un canal iónico dependiente de voltaje (por ejemplo, un canal de sodio, calcio, potasio). Una lista de canales iónicos está disponible en la base de datos IUPHAR-DB (véase referencias más arriba).

En otra realización, la proteína/polipéptido de interés es una proteína adaptadora (por ejemplo, una proteína adaptadora de transducción de señal) una variante/fragmento de la misma. Las proteínas adaptadoras son proteínas que son accesorias a las proteínas principales en una vía de transducción de señal y contienen una variedad de módulos de unión a proteínas (por ejemplo, dominios SH2 y/o SH3) que enlazan a los compañeros de unión a proteínas y facilitan la creación de complejos de señalización más grandes. Estas proteínas generalmente carecen de cualquier actividad enzimática intrínseca, pero en cambio median interacciones proteína-proteína específicas que impulsan la formación de complejos proteicos. Los ejemplos de proteínas adaptadoras incluyen MyD88, Grb2 y SHC1.

En otra realización, la proteína de interés es una p-arrestina, una variante de p-arrestina, o una porción/fragmento activo de la misma, por ejemplo p-arrestina-1 (RefSeq: Np_004032.2 para la isoforma 1; NP_064647.1 para la isoforma 2) o parrestina-2 (RefSeq: N^p_004304.1 para la isoforma 1; NP_945355.1 para la isoforma 2; NP_001244257.1 para la isoforma 3; NP_001244258.1 para la isoforma 4; NP_001244259.1 para la isoforma 5; y NP_001244260.1 para la isoforma 6).

En otra realización, la proteína de interés es una subunidad de la proteína G, una variante de subunidad de la proteína G, o una porción/fragmento activo de la misma, por ejemplo, una subunidad Ga, G^yo Gp o un fragmento activo de la misma.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un biosensor para evaluar la activación de la proteína G y/o GPCR, dicho biosensor comprende: un primer componente que comprende una subunidad de la proteína G o un fragmento activo de la misma etiquetado con una proteína verde fluorescente Renilla ( Renilla GFP) o una proteína luciferasa Renilla ( Renilla Luc); un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento a PM etiquetado con una Renilla GFP o una Renilla Luc; en el que si dicha subunidad de la proteína G se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha subunidad de la proteína G se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla GFP.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un biosensor para evaluar si un ligando GPCR modula la actividad de una subunidad de la proteína G, dicho biosensor comprende: un primer componente que comprende una subunidad de la proteína G o un fragmento activo de la misma etiquetado con una proteína verde fluorescente Renilla ( Renilla

GFP) o una proteína luciferasa Renilla ( Renilla Luc); un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento a PM etiquetado con una Renilla GFP o una Renilla Luc; en el que si dicha subunidad de la proteína G

se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha subunidad de la proteína G se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla GFP.

En una realización, dicha subunidad de la proteína G o fragmento activo de la misma se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla GFP. En una realización, la subunidad de la proteína G es una subunidad G^y, por ejemplo, G^y1, G^y2, G^y3, Gy4, Gy5, G^y6, Gy7, G^y8, G^y9, G^y10, G^y11, G^y12 o Gy13. En otra realización, la subunidad de la proteína G es una subunidad Ga, por ejemplo, Gq, Gs, Gil, Gi2, Gi3, Gtcone, Gt-rod, Gt-gus, Gz, GoA, GoB, Golf, G11, G12, G13, G14, o G15/G16. En otra realización, la subunidad de la proteína G es un Gp, por ejemplo, Gp1, Gp2, Gp3, Gp4 o Gp5 (Gp5-S o Gp5-L).

En otra realización, la proteína de interés es una proteína que se une a DAG, o una porción/fragmento activo de la misma, por ejemplo , un dominio de unión a ésteres de forbol/diacilglicerol (dominio de unión a DAG). En una realización, el dominio de unión a DAG es a partir de PKC8 (C1b). Otras proteínas que comprenden un dominio de unión a DAG (comúnmente denominado dominio C1) incluyen, por ejemplo AKAP13; A^rA^f; ARHGAP29; ARHGEF2; BRAF;

CDC42BPA; CDC42BPB; CDC42BPG; CHN1; CHN2; CIT; DGKA; DGKB; DGKD; DGKE; DGKG; DGKH; DGKI; DGKK;

DGKQ; DGKZ; GMIP; HMHA1; KSR1; KSR2; MYO9A; MYO9B; PDZD8; PRKCA; PRKCB1; PRKCD; PRKCE; PRKCG;

PRKCH; PRKCI; PRKCN; PRKCQ; PRKCZ; PRKD1; PRKD2; PRKD3; RACGAP1; RAF1; RASGRP; RASGRP1;

RASGRP2; RASGRP3; RASGRP4; RASSF1; RASSF5; ROCK1; ROCK2; STAC; STAC2; STAC3; TENC1; UNC13A;

UNC13B; UNC13C; VAV1; VAV2 y VAV3.

En otra realización, la proteína de interés es PLC81 o una porción/fragmento activo de la misma capaz de unirse a PI(4,5)², por ejemplo , el dominio con homología a la pleckstrina (PH) de PLC81.

En otra realización, la proteína de interés es una proteína que se une a una pequeña GTPasa (entrada Expasy ENZYME: EC 3.6.5.2). Las GTPasas pequeñas son una familia de aproximadamente 50 enzimas con una masa molecular de 21 kDa relacionadas de forma distante con la subunidad a de las proteínas G, y las cuales participan en la regulación del crecimiento celular (subfamilia Ras), el tráfico de vesículas de membrana y sin recubrimiento (subfamilias

Rab y ARF), importación de proteínas nucleares (subfamilia Ran) y organización del citoesqueleto (subfamilias Rho y

Rac). En una realización, la proteína de interés es una proteína que se une a uno o más miembros de la superfamilia de pequeñas GTPasas Ras, por ejemplo , familias de GTPasas Ras, Rho, Ran, Rab y Arf. La localización/translocación de tales pequeñas GTPasas puede evaluarse al usar un polipéptido que comprende un dominio de unión a Ras (RBD), por ejemplo, el RBD de RAF1 o una variante del mismo que comprende una sustitución de A85K (el cual tiene una mayor afinidad por Ras). Otras proteínas que comprenden un RBD incluyen ARAF, BRAF, RGS12, rGs 14, TIAM1 y PI3K. La proteína de interés puede comprender así la secuencia completa/nativa de una proteína que se une a una pequeña GTPasa, o una variante del fragmento de la misma que mantiene la capacidad de unirse a una pequeña GTPasa.

En una realización adicional, la proteína de interés es una proteína que se une a uno o más miembros de la superfamilia de pequeñas GTPasas Rho, Rho (A, B y C), Rac (racl, 2, 3 o RhoG) o Cdc42 (Cdc42, RhoQ o RhoJ). En otra realización, la proteína de interés es una proteína que se une a una proteína Rho (RhoA, RhoB y/o RhoC, preferiblemente RhoA), o un fragmento activo de la misma, por ejemplo, un dominio Cdc42/Rac interactivo de unión (CRIB). El dominio CRIB (EMBL-EBI/Interpro No. de acceso IPR000095) es una región conservada dentro de la porción

N-terminal del dominio de unión a GTPasa (GBD, también llamado dominio de unión a p21, PBD) que está presente en muchos efectores aguas abajo supuestos de pequeñas GTPasas ( por ejemplo , Cdc42p- y/o pequeñas GTPasas similares a Rho), y comprende aproximadamente 15-16 aminoácidos. Las proteínas que comprenden un dominio CRIB incluyen quinasas asociadas a Cdc42 activadas de mamíferos (ACK), quinasas activadas por p21 de mamíferos (PAK1

a pAK4), Rhotekin (RTKN), proteínas de síndrome de Wiskott-Aldrich de mamífero (WASPs), quinasas de la superfamilia de proteína quinasa C, como la serina/treonina proteína quinasa N (PKN, también conocida como quinasa relacionada con la proteína quinasa C, PRK). En una realización, la proteína de interés comprende el dominio CRIB de

PKN1 humano (referencia Uniprot: Q16512-1) o PKN2 (referencia Uniprot: Q16513), preferiblemente PKN1. El dominio

CRIB de PKN1 humano comprende la secuencia VQSEPRSWSLLEQLG (SEQ ID No: 40), que corresponde a los residuos 6-20 de PKN1 humano nativa (referencia Uniprot: Q16512-1).

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un biosensor para evaluar la activación de una pequeña GTPasa (por ejemplo, Rho), dicho biosensor comprende: un primer componente que comprende un polipéptido que comprende un dominio que se une a dicha pequeña GTPasa (por ejemplo, un dominio CRIB) etiquetado con una proteína verde fluorescente Renilla (Renilla GFP) o una proteína luciferasa Renilla (Renilla Luc); un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento endosomal o a PM etiquetada con una Renilla GFP o una Renilla Luc; en el que si dicho polipéptido comprende un dominio que se une a dicha pequeña GTPasa (por ejemplo, un dominio CRIB) se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento endosomal o a PM etiquetada con dicha Renilla Luc, y si dicho polipéptido que comprende un dominio que se une a dicha pequeña GTPasa (por ejemplo, un dominio CRIB) se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento endosomal o a PM se marca con dicha Renilla GFP. En una realización, la pequeña GTPasa es una proteína Rho (por ejemplo, RhoA). En una realización, el dominio que se une a la pequeña GTPasa es un dominio CRIB, tal como el dominio CRIB de PKN1 humano. En una realización, el segundo componente comprende una porción de direccionamiento a PM.

El termino Renilla luciferasa como se usa en la presente memoria se refiere a una enzima oxidativa usada en bioluminiscencia y que se deriva a partir de un organismo del género Renilla, como Renilla reniformis o Renilla mulleri. Incluye la luciferasa nativa de un organismo Renilla, o variantes de la misma, por ejemplo, la forma nativa (en términos de secuencia de aminoácidos) de Renilla reniformis luciferasa (Rluc) o variantes de la misma como Rlucll o Rluc8. El término "Rlucll" se refiere a una forma mutante de Renilla reniformis luciferasa que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: A55T, C124Ay M185V en relación con una Renilla luciferasa nativa. En una realización, el Rlucll comprende la secuencia representada en el ejemplo 1 (SEQ ID No: 10). El término "Rluc8" se refiere a una forma mutante de Renilla reniformis luciferasa que comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: A55T, C124A, S130A, K136R, A143M, M185V, M253L y S287L en relación con una Renilla luciferasa nativa. La secuencia de aminoácidos de la Renilla mulleri luciferasa nativa se divulga en el número de acceso de GenBank AAG54094.1.

El término "Renilla GFP "se refiere a una proteína verde fluorescente que se deriva a partir de organismos del género Renilla, como Renilla reniformis o Renilla mulleri. Incluye la GFP nativa de un organismo Renilla, o variantes del mismo. En una realización, la Renilla GFP es una Renilla reniformis GFP (denominada en la presente memoria "rGFP"), en una realización adicional, la forma nativa (en términos de secuencia de aminoácidos) de Renilla reniformis GFP. En una realización, la rGFP comprende la secuencia representada en el ejemplo 1 (SEQ ID No: 11). La secuencia de aminoácidos de la Renilla mulleri GFP nativa se divulga en el número de acceso de GenBank AAG54098.1. La secuencia de ácido nucleico de la Renilla luciferasa y/o Renilla GFP puede ser optimizada con codones para la expresión en células humanas (es decir, "humanizada", véase, por ejemplo, WO 2002057451 para una versión humanizada de Renilla mulleri GFP).

La transferencia de energía por resonancia (RET abreviado) es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos cromóforos, que tienen espectros de emisión/absorción superpuestos. Cuando los dos cromóforos (el "donador" y el "aceptor") están a poca distancia (por ejemplo, 10-100 Angstroms) uno del otro y sus dipolos de transición están orientados adecuadamente, el cromóforo donador puede transferir su energía del estado excitado al cromóforo aceptor a través del acoplamiento dipolo-dipolo no radiativo. La transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) se basa en la transferencia no radiativa de energía entre un bioluminóforo donador (enzima bioluminiscente como renilla luciferasa) y un fluoróforo aceptor (por ejemplo, renilla GFP).

La expresión "porción de direccionamiento al compartimento celular" se refiere a una biomolécula, preferiblemente un polipéptido o péptido, el cual, cuando está unido a la Renilla GFP o Renilla Luc (como una proteína de fusión, por ejemplo), los dirige a un compartimento, orgánulo o localización particular dentro de la célula, como por ejemplo la membrana plasmática (o un subdominio particular de la membrana plasmática, como las balsas lipídicas), los endosomas (por ejemplo endosomas tempranos y/o tardíos), los lisosomas, los fagosomas, los ribosomas, la mitocondria, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, el núcleo, etc., lo que aumenta así la concentración efectiva de la Renilla GFP o Renilla Luc. Tales marcadores son típicamente proteínas (o fragmentos adecuados de las mismas) que normalmente se encuentran en niveles altos en el compartimento diana particular. Los péptidos que dirigen proteínas a un compartimento, orgánulo o localización específica dentro de la célula son conocidos en la técnica e incluyen el péptido señal del retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés) o la secuencia de recuperación de ER, el péptido señal de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) y el péptido señal de localización mitocondrial (MLS, por sus siglas en inglés), por ejemplo.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento a la membrana plasmática (PM). Cualquier porción capaz de reclutar la Renilla GFP o Renilla Luc a la PM puede usarse en los biosensores. La Renilla GFP o Renilla Luc puede, por lo tanto, fusionarse con cualquier proteína encontrada en la membrana plasmática (por ejemplo, receptores o cualquier otra proteína encontrada en la PM), o fragmentos de las mismas. Un ejemplo de tales proteínas es Caveolina-1, la cual es el componente principal de las caveolas (un tipo de balsa lipídica que corresponde a pequeñas invaginaciones (50-100 nm) de la membrana plasmática) encontrada en muchos tipos de células. Se han identificado dos isoformas de Caveolina-1, generadas por el empalme alternativo del gen CAV1: Caveolina-1a (que comprende los residuos 2-178) y Caveolina-1p (correspondiente a la secuencia 32-178). Otros ejemplos de tal porción incluyen péptidos/polipéptidos que comprenden una secuencia señal para la lipidación de proteínas/acilación de ácidos grasos, tal como miristoilación, palmitoilación y prenilación, así como dominios polibásicos. Se sabe que varias proteínas son miristoiladas, palmitoiladas y/o preniladas (por ejemplo, proteínas quinasas y fosfatasas como las proteínas Yes, Fyn, Lyn, Lck, Hck, Fgr, Ga, óxido nítrico sintasa, factores de ribosilación de ADP (ARFs), proteínas de unión a calcio y proteínas estructurales asociadas a la membrana o al citoesqueleto, como MARCKS (véase, por ejemplo, Wright y otros, J Chem Biol. Marzo de 2010; 3(1): 19-35; Alcart-Ramos y otros, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, Volumen 1808, Número 12, diciembre de 2011, páginas 2981 2994) y, por lo tanto, las secuencias señal de miristoilación, palmitoilación y prenilación a partir de cualquiera de estas proteínas pueden usarse en el biosensor. En una realización, la secuencia de miristoilación y/o palmitoilación es a partir de la Lyn quinasa.

En una realización, la porción de direccionamiento de membrana a PM comprende un motivo CAAX (C es un residuo de cisteína, AA son dos residuos alifáticos y X representa cualquier aminoácido). Los motivos CAAX se encuentran en las "proteínas CAAX" que se definen como un grupo de proteínas con una secuencia de aminoácidos específica en el C-terminal que dirige su modificación postraduccional. Las proteínas CAAX abarcan una amplia variedad de moléculas que incluyen laminas nucleares (filamentos intermedios) como prelamina A, lamina B1 y lamina B2, Ras y una multitud de proteínas de unión a GTP (proteínas G) como Ras, Rho, Rac y Cdc42, varias proteínas quinasas y fosfatasas, etc. (véase, por ejemplo, Gao y otros, Am J Transl Res. 2009; 1(3): 312-325). Las proteínas que tienen un motivo o caja CAAX al final del término C generalmente necesitan un proceso de prenilación antes de que las proteínas migren a la membrana plasmática o membrana nuclear y ejerzan diferentes funciones. En una realización, la caja CAAX se deriva a partir de una proteína de la familia RAS humana, por ejemplo, HRAS, NRAS, Ral-A, KRAS4A o KRAS4b. Los últimos residuos C-terminal de RAS, NRAS, KRAS4A o KRAS4b (referidos como la región hipervariable o HVR) se muestran a continuación, con la supuesta región mínima de direccionamiento a la membrana plasmática en cursiva y la caja CAAX subrayada (véase, por ejemplo, Ahearn y otros, Nature Reviews Molecular Cell Biology 13: 39-51, enero de 2012): HRAS: KLNPPDESGPGCMSCKCVLS; (SEQ ID No:33); NRAS: KLNSSDDGTQGCMGLPCVVM; (SEQ ID No:34); KRAS4A: KISKEEKTPGCVKIKKCIIM: (SEQ ID No:35); KRAS4b: KMSKDGKKKKKKSKTKCVIM: (SEQ ID No:36); Ral-A/Ral1: KNGKKKRKSLAKRIRERCCIL (SEQ ID No:37).

En una realización, la porción de direccionamiento a PM comprende la secuencia GKKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID No:7) a partir de KRAS4b. En otra realización, la porción de direccionamiento a PM comprende la secuencia de palmitoilación dirigida a la membrana plasmática a partir de hRas y la secuencia señal de prenilación a partir de Ral-A/Ral1 (secuencia: CMSCKCCIL, SEQ ID No:43).

Varias proteínas también contienen un dominio polibásico, no lipídico que se dirige a la MP, como pequeñas GTPasas Ras, PTEN fosfatasa, tirosina quinasa Src no receptora, reguladores de actina WASP y MARCKS, y quinasas receptoras acopladas a proteínas G (GRKs) como GRK5. En una realización, el dominio polibásico es a partir de GRK5 y comprende la secuencia SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS (SEQ ID No:8).

En un aspecto particular, la presente invención proporciona un biosensor que comprende: una preparación celular o de membrana que comprende: (i) un primer componente que comprende una p-arrestina etiquetada con una Renilla GFP o una Renilla Luc; (ii) un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) etiquetada con una Renilla GFP o una Renilla Luc y un GPCR; en el que si dicha p-arrestina se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha p-arrestina se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla GFP. Dicho biosensor puede ser útil para monitorear/medir el reclutamiento de una p-arrestina a un GPCR ubicado en la membrana plasmática.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento endosomal. Se conocen varias fracciones/marcadores de direccionamiento endosomal en la técnica e incluyen la familia de proteínas Rab (RAB4, RAB5, RAB7, RAB9 y RAB11), receptor de 6-fosfato de manosa (M6PR), caveolina-1 y -2, transferrina y su receptor, clatrina, así como proteínas que comprenden un dominio FYVE tal como el autoantígeno endosomal temprano 1 (EEA1), rabenosina-5, el anclaje de las Smad para la activación del receptor (SARA), Vps27p y Endofina. Algunos marcadores son más específicos para los endosomas tempranos (por ejemplo, RAB4, Transferrina y su receptor, y proteínas que comprenden un dominio FYVE), otros son más específicos para los endosomas tardíos (por ejemplo, RAB7, RAB9 y M6PR) y otros son más específicos para los endosomas de reciclaje (por ejemplo, RAB11, RAB4). Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización endosómica.

En una realización, la porción de direccionamiento endosomal comprende un dominio FYVE. El dominio FYVE se define por los tres elementos conservados: los motivos WxxD N-terminal, RR/KHHCR central y RVC C-terminal. En una realización, la porción de direccionamiento endosomal comprende el dominio FYVE de Endofina, por ejemplo, alrededor de los residuos 739 a 806 de Endofina humana.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento lisosomal, como por ejemplo LAMP1 y LAMP2. Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización lisosomal.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento peroxisomal, como por ejemplo PMP70, PXMP2 y Catalasa. Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización peroxisomal. En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento autofagosomal, como por ejemplo las proteínas de la familia ATG (relacionada con autofagia) (ATG4, ATG5, ATG16, ATG12, véase Lamb y otros, Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 759-774 (2013)), LC3a /b y SQSTM1/p62. Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización autofagosomal.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento al ribosoma. Se conocen varias fracciones/marcadores de direccionamiento endosomal en la técnica e incluyen las proteínas ribosomales (L7a, S3 y S6). Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización ribosomal.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento al retículo endoplásmico (ER). Se conocen varias fracciones/marcadores de direccionamiento al ER en la técnica e incluyen ERp72, ERp29, proteína disulfuro isomerasa (PDI), proteínas de la familia HSP70 como GRP78 (HSPA5), GRP94 (HSP90B1) y GRP58 (PDIA3), calnexina y calreticulina. Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización del ER.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento a Golgi. Se conocen varias fracciones/marcadores de direccionamiento a Golgi en la técnica e incluyen eNOS (por ejemplo, la porción N-terminal de la misma, J. Liu y otros, Biochemistry, 35 (1996), pp. 13277-13281), GM130, Golgin-97, la proteína 58K, proteína 2 de membrana de la red Trans-Golgi (TGOLN2), TGN46, TGN38, manosidasa 2, sintaxina 6, GM130 (GOlGa 2), Golgin-160, Membrin (GS27), GS28, proteínas coatómeras, Rbet1 y RCAS1. Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización del aparato de Golgi. En una realización, la porción de direccionamiento a Golgi la porción N-terminal de una proteína eNOS humana, por ejemplo, los residuos 1 a 73 de eNOS1 del humana (SEQ ID No: 42).

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento a la mitocondria. Se conocen varias fracciones/marcadores de direccionamiento a mitocondria en la técnica e incluyen AIF, COX IV, citocromo C, hexoquinasa I, SOD1, SDHA, piruvato deshidrogenasa, VDAC, TOMM22, UCP1, UCP2, UCP3, PHB1 Galpha12 (o la porción N-terminal de la misma; Andreeva y otros, FASEB J. 2008 agosto;22(8):2821-31. Epub 2008 marzo 26), una proteína miembro de la familia Bcl o un fragmento de la misma, por ejemplo, un fragmento de Bcl-XL (RKGQERFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK, SEQ ID No:87, Mossalam y otros, Mol Pharm. 2012 mayo 7; 9(5): 1449-1458). Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse para Renilla Luc o rGFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización mitocondrial. La porción de direccionamiento nuclear también puede comprender una señal de direccionamiento mitocondrial, el cual es un péptido de 10-70 aminoácidos de largo que dirige las proteínas recién sintetizadas a la mitocondria. Se encuentra en el extremo N y consiste en un patrón alterno de aminoácidos hidrófobos y cargados positivamente para formar una hélice anfipática. Las señales de direccionamiento mitocondrial pueden contener señales adicionales que posteriormente dirigen la proteína a diferentes regiones de la mitocondria, como la matriz mitocondrial.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento nuclear. Se conocen varias fracciones/marcadores de direccionamiento nuclear en la técnica e incluyen Lámina A/C, Nucleoporinas (NUP), ASHL2, ESET, Histonas, LSD1, enzimas de reparación de ADN tales como PARP y P84/THOC1. Por lo tanto, estas proteínas o fragmentos adecuados de las mismas pueden fusionarse a Renilla Luc o Renilla GFP para enlazarlos/dirigirlos a una localización nuclear. La porción de direccionamiento nuclear también puede comprender una señal o secuencia de localización nuclear (NLS), la cual es una secuencia de aminoácidos que marca una proteína para importar al núcleo celular mediante el transporte nuclear. Típicamente, esta señal consiste en una o más secuencias cortas de lisinas o argininas cargadas positivamente expuestas en la superficie de la proteína. La señal de transporte mejor caracterizada es la NLS clásica (cNLS) para la importación de proteínas nucleares, la cual consiste en uno (monopartito) o dos (bipartito) tramos de aminoácidos básicos. Las cNLSs monopartitas se ejemplifican por la NLS del antígeno T grande del SV40 (126PKKKRRV132) (SEQ ID No:38) y las cNLSs bipartitas se ejemplifican por la NLS nucleoplasmina (155KRPAATKKAGQAKKKK170) (SEQ ID No:39).

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una secuencia de exportación nuclear (NES). La NES es una secuencia de aminoácidos corta (típicamente 4 residuos hidrófobos) en una proteína que se dirige la exportación del núcleo celular al citoplasma a través del complejo de poros nucleares al usar el transporte nuclear. La secuencia de dicha NES puede ser, por ejemplo, LxxxLxxLxL, donde "L" es un residuo hidrófobo (a menudo leucina) y "x" es cualquier otro aminoácido. En las proteínas que se translocan del citosol al núcleo (como ERK o MDM2), se detecta una disminución en la señal BRET al usar una porción NES.

En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento al citoesqueleto, por ejemplo, actina o un fragmento de la misma, o una proteína que comprende un dominio de unión a actina (ABD), tal como el dominio N-terminal de unión a actina F de Inositol-1,4,5-trifosfato-3-quinasa-A (ITPKA) (Johnson y Schell, Mol. Biol. Cell diciembre 15, 2009 vol. 20 no. 24 5166-5180). En una realización, la porción de direccionamiento al citoesqueleto es un péptido que comprende la secuencia MGVADLIKKFESISKEE (SEQ ID No: 88) ("Lifeact", Riedl y otros, Nat Methods. julio 2008; 5(7): 605)

En otro aspecto, la presente invención proporciona un biosensor para evaluar una modulación (aumento o disminución) en la cantidad de una biomolécula en un compartimento celular entre una primera y una segunda condición, dicho biosensor comprende: un primer componente que comprende una proteína verde fluorescente Renilla (Renilla GFP) etiquetada con un marcador de proteína que se une a dicha biomolécula; y un segundo componente que comprende una proteína luciferasa Renilla (Renilla Luc) etiquetada con dicho marcador de proteína.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un biosensor para evaluar una modulación (aumento o disminución) en la cantidad de una biomolécula en un compartimento celular entre una primera y una segunda condición, dicho biosensor comprende: un primer componente que comprende un marcador de proteína que se une a dicha biomolécula etiquetada con una Renilla GFP o Renilla Luc; y un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento al compartimento celular etiquetada con una Renilla GFP o Renilla Luc; en el que si dicho marcador de proteína se marca con Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con Renilla Luc y viceversa.

Tales biosensores pueden usarse en un procedimiento para evaluar una modulación en la cantidad de una biomolécula en un compartimento celular entre una primera y una segunda condición, por ejemplo, en presencia y ausencia de un agente. Si el agente aumenta la cantidad de biomolécula en el compartimento celular (por ejemplo, ^pM) la señal BRET se incrementará en presencia del agente y viceversa.

El marcador de proteína puede ser cualquier proteína o fragmento de la misma que se una a dicha biomolécula y, por lo tanto, cuya concentración o densidad en dicho compartimento celular depende de la concentración o densidad de dicha biomolécula (por ejemplo, un segundo mensajero, que incluye nucleótidos cíclicos como cAMP y cGMP, IP ³ , DAG, PIP ³ , Ca2⁺iones) en dicho compartimento celular. Por ejemplo, la localización PLC81 en la PM depende de la presencia de PIP ² y/o PIP ³ . Si la concentración de PI(4,5)P²en la PM disminuye (lo cual ocurre cuando se activa la fosfolipasa C (PLC) porque PI(4,5)²se hidroliza), PLC81 se difunde en el citosol lo que reduce su concentración/densidad en la PM. Por lo tanto, la concentración/densidad de PLC81 (o un fragmento del mismo que se une a PIP ² y/o PIP ³ , como su dominio PH) en la PM, la cual puede medirse por BRET al usar PLC81 etiquetada con Renilla Luc y Renilla GFP (o un fragmento del mismo, por ejemplo, SEQ ID No:25), o PLC81 etiquetado con Renilla Luc o etiquetado con Renilla GFP y una porción de direccionamiento a PM etiquetada con Renilla Luc o etiquetada con Renilla GFP, puede usarse como un indicador de la concentración o densidad de la biomolécula en la PM. De manera similar, el dominio de PH y el dominio de homología de Phox (dominio PX) de ciertas proteínas (por ejemplo, akt y PLD1) interactúan con PIP ³ , por lo tanto, un marcador de proteína que comprende un dominio PH o PX selectivo para la unión a PIP ³ , podría usarse como un indicador de la concentración o densidad de PIP ³ en la PM. Otro ejemplo es el dominio C1 (también conocido como dominio de unión a ésteres de forbol/diacilglicerol), el cual se encuentra, por ejemplo, en la porción N-terminal de la proteína quinasa. Además, PLC^yI puede unir a diferentes fosfolípidos, que incluye PIP ³ . El dominio C1 se une al diacilglicerol (DAG) y, por lo tanto, un marcador de proteína que comprende un dominio C1 podría usarse como un indicador de la concentración o densidad de DAG en la PM. Por lo tanto, cualquier proteína o dominio de proteína capaz de unirse a una biomolécula tal como un segundo mensajero y cuya concentración o densidad en dicho compartimento celular depende de la concentración o densidad de dicha biomolécula podría usarse en dicho biosensor.

El término "biomolécula" se refiere a cualquier molécula que puede producirse o estar presente en una célula, por ejemplo, una proteína, un péptido, un aminoácido, un ácido nucleico (ADN o ARN), un lípido o ácido graso, un fosfolípido, un azúcar (polisacárido), o cualquier otro compuesto como ATP, AMP, ADP, histamina, etc. En una realización, la biomolécula es un segundo mensajero (es decir, una molécula que transmite las señales recibidas en los receptores en la superficie celular para dirigir las moléculas en el citosol y/o núcleo), por ejemplo, AMP cíclico, GMP cíclico, trifosfato de inositol (IP ³ ), fosfatidilinositoles (por ejemplo, Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato o PIP ² , Fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato o PIP ³ , Diacilglicerol (DAG), Ca². En una realización, la biomolécula es una molécula hidrófoba (por ejemplo, un fosfolípido) encontrado en la PM, como el diacilglicerol y fosfatidilinositoles.

La variante como se usa en la presente memoria se refiere a una proteína/polipéptido que tiene una identidad o similitud de al menos 60% con una secuencia de referencia (por ejemplo, nativa) y conserva una actividad deseada de la misma, por ejemplo, la capacidad de unirse a una proteína diana y/o translocarse a un compartimento celular. En realizaciones adicionales, la variante tiene una similitud o identidad de al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con una secuencia de referencia (por ejemplo, nativa) y conserva una actividad deseada de la misma. "Similitud" e "identidad" se refiere a la similitud/identidad de secuencia entre dos moléculas de polipéptidos. La similitud o identidad se puede determinar al comparar cada posición en las secuencias alineadas. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos coincidentes o idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias. La alineación óptima de secuencias para comparaciones de similitud o identidad se puede llevar a cabo al usar una variedad de algoritmos, como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2444, y las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (como gAp , BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Genéticos de Wisconsin, Grupo Genético de Computación (GCG), Madison, Wis., E.U.A.). La similitud o identidad de secuencia también puede determinarse al usar el algoritmo BLAST, descrito en Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10 (al usar la configuración predeterminada publicada). El software para realizar el análisis BLAST está disponible a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www. ncbi.nlm. nih.gov/).

La Renilla Luc o Renilla GFP pueden fusionarse en el N-terminal, dentro o C-terminal en relación con la porción de direccionamiento al compartimento celular. En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento a PM, y se fusiona al extremo N-terminal de dicha Renilla Luc o dicha Renilla GFP. En una realización, la porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento endosomal, y se fusiona al extremo C-terminal de dicha Renilla Luc o dicha Renilla GFP.

La Renilla Luc o Renilla GFP pueden fusionarse en el N-terminal, dentro (véase, por ejemplo, subunidad Ga con Rlucll interno descrito en los ejemplos), o C-terminal en relación con la proteína de interés. En una realización, la Renilla Luc o Renilla GFP se fusiona con el extremo N-terminal de la proteína de interés. En otra realización, la Renilla Luc o Renilla GFP se fusiona con el extremo C-terminal de la proteína de interés.

En una realización, la proteína de interés se marca con una Renilla Luc y el marcador del compartimento celular e marca con una Renilla GFP.

Otros dominios o enlazadores pueden presentarse en el N-terminal, C-terminal o dentro de los componentes primero y/o segundo mencionados anteriormente. En realizaciones, la Renilla Luc o Renilla GFP puede unirse covalentemente a la proteína de interés o a la porción de direccionamiento al compartimento celular directamente (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) o "indirectamente" a través de una porción enlazadora adecuada, por ejemplo, un enlazador de uno o más aminoácidos (por ejemplo, un enlazador de poliglicina) u otro tipo de enlazador químico (por ejemplo, un enlazador de carbohidrato, un enlazador de lípido, un enlazador de ácidos grasos, un enlazador de poliéter, PEG, etc). En una realización, pueden insertarse uno o más dominios adicionales antes (N-terminal), entre o después (C-terminal) los componentes definidos anteriormente. En una realización, la Renilla Luc y/o Renilla GFP se unen covalentemente a través de un enlace peptídico a la proteína de interés y/o la porción de direccionamiento al compartimento celular. En una realización, un enlazador peptídico está presente entre la Renilla Luc o Renilla GFP y la proteína de interés o la porción de direccionamiento al compartimento celular. En realizaciones, el enlazador comprende aproximadamente 4 a aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 4 a aproximadamente 40, 30 o 20 aminoácidos, o aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En una realización adicional, el enlazador es uno de los enlazadores descritos en el ejemplo 1 a continuación y/o figuras 11A-11D).

En una realización, los componentes primero y segundo se unen entre sí para proporcionar un biosensor unimolecular. Los componentes primero y segundo se unen covalentemente por un enlazador, preferiblemente un enlazador de polipéptido flexible. En una realización, el enlazador de polipéptido flexible tiene una longitud que corresponde a la longitud de una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 50 a aproximadamente 500-1.000 aminoácidos, por ejemplo, que corresponde a la longitud de una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 100 a aproximadamente 400-500 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 200-400 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 300. En una realización adicional, el enlazador flexible comprende una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 50 a aproximadamente 500-1.000 aminoácidos, por ejemplo una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 100 a aproximadamente 400-500 aminoácidos, preferiblemente una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 200-400 aminoácidos, por ejemplo aproximadamente 300 aminoácidos. Los procedimientos para diseñar enlazadores de aminoácidos flexibles, y más específicamente enlazadores con globularidad mínima y trastorno máximo, son conocidos en la técnica. Esto se puede lograr, por ejemplo, al usar el programa Globplot 2.3. La secuencia puede optimizarse aún más para eliminar puntos de acceso de agregación supuestos, dominios de localización y/o motivos de interacción y fosforilación. Tal biosensor unimolecular permite la evaluación de BRET en células intactas, así como en preparaciones de membrana.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica el primer y/o segundo componente(s) definidos anteriormente. En una realización, el ácido nucleico está presente en un vector/plásmido, en una realización adicional, un vector/plásmido de expresión. Dichos vectores comprenden una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar el primer y/o segundo componente(s) definidos anteriormente enlazados operativamente a una o más secuencias reguladoras transcripcionales, tales como promotores, potenciadores y/u otras secuencias reguladoras. En una realización, el ácido nucleico codifica los componentes primero y segundo (construcción policistrónica).

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, la cual es capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se unen operativamente se refieren en la presente memoria como "vectores de expresión". Un vector de expresión recombinante de la presente invención puede construirse mediante técnicas estándar conocidas por un experto habitual en la técnica y encontradas, por ejemplo, en Sambrook y otros (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Hay una variedad de estrategias están disponibles para ligar fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza de los términos de los fragmentos de ADN y puede determinarse fácilmente por personas expertas en la técnica. Los vectores de la presente invención también pueden contener otros elementos de secuencia para facilitar la propagación y selección del vector en bacterias y células huésped. Además, los vectores de la presente invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos para uno o más sitios de endonucleasa de restricción. Las secuencias de codificación tales como marcadores seleccionables y genes reporteros son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede introducirse en una célula (una célula huésped), la cual puede incluir una célula viva capaz de expresar la región codificante de la proteína a partir del vector de expresión recombinante definido. La célula viva puede incluir tanto una célula cultivada como una célula dentro de un organismo vivo. Por consiguiente, la invención también proporciona células huésped que contienen los vectores de expresión recombinantes de la invención. Los términos "célula", "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en la presente memoria. Dichos términos se refieren no solo a la célula sujeto particular sino a la progenie o la progenie potencial de tal célula. Debido a que determinadas modificaciones pueden producirse en generaciones posteriores ya sea debido a una mutación o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero todavía se incluyen dentro del ámbito del término como se usa en la presente memoria.

El vector de ADN puede introducirse dentro de las células a través de las técnicas de transformación o transfección convencionales. Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a técnicas para introducir ácido nucleico extraño en una célula huésped, incluso coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación, microinyección y transfección mediada por virus. Los procedimientos adecuados para transformar o transfectar células huésped pueden encontrarse en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros manuales de laboratorio. "Secuencia/elemento regulador transcripcional" es un término genérico que se refiere a secuencias de ADN, tales como señales de iniciación y terminación, potenciadores y promotores, señales de empalme, señales de poliadenilación las cuales inducen o controlan la transcripción de secuencias de codificación de proteínas con las que están unidas operativamente. Una primera secuencia de ácido nucleico está "unida operativamente" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a la secuencia codificadora si este afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificadora. Generalmente, las secuencias de ADN enlazadas operativamente son contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, en el marco de lectura. Sin embargo, ya que, por ejemplo, los potenciadores generalmente funcionan cuando se separan de los promotores por varias kilobases y secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar unidos operativamente pero no son contiguos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un estuche que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer componente y un segundo ácido nucleico que codifica el segundo componente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende o expresa el primer y/o segundo componente(s) definidos anteriormente. En una realización, la célula se ha transfectado o transformado con un ácido nucleico que codifica el primer y/o segundo componente(s) definidos anteriormente. La invención proporciona además un sistema de expresión recombinante, vectores y células, tales como los descritos anteriormente, para la expresión del primer y/o segundo componente(s) de la invención, al usar por ejemplo medios de cultivo y reactivos bien conocidos en la técnica. La célula puede ser cualquier célula capaz de expresar el primer y segundo componente(s) definidos anteriormente. Las células huésped y los procedimientos adecuados para la expresión de proteínas son bien conocidos en la técnica. Se puede usar cualquier célula capaz de expresar los componentes definidos anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse células huésped eucariotas tales como células de mamífero (por ejemplo, células de roedores tales como líneas celulares de ratón, rata y hámster, células humanas/líneas celulares). En otra realización, la célula mencionada anteriormente es una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular de riñón embrionario (por ejemplo, células HEK293 o HEK293T).

En una realización, el biosensor mencionado anteriormente comprende una célula que comprende o expresa los componentes primero y segundo. En otra realización, el biosensor mencionado anteriormente comprende una preparación de membrana que comprende los componentes primero y segundo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para comparar el tráfico de una proteína de interés en una célula bajo una primera y una segunda condición, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor definido en la presente memoria bajo dicha primera condición; y medir la señal BRET en el biosensor definido en la presente memoria en dicha segunda condición; en el que una diferencia en dicha señal BRET entre dichas condiciones primera y segunda es indicativa de una diferencia en el tráfico de dicha proteína de interés en dichas condiciones primera y segunda. En una realización, la primera condición es no activación y la segunda condición es activación (por ejemplo, al usar un agonista) o viceversa. En otra realización, la primera condición no es inhibición y la segunda condición es inhibición (por ejemplo, al usar un antagonista) o viceversa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un agente modula (aumenta o disminuye) la densidad o concentración de una proteína de interés en un compartimento celular, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor definido en la presente memoria en presencia y ausencia de dicho agente; en el que una diferencia en dicha señal BRET en presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativa de que dicho agente modula (aumenta o disminuye) la densidad o concentración de dicha proteína de interés en el compartimento celular. Un aumento en la señal BRET indica que el agente aumenta la densidad o concentración de dicha proteína de interés en el compartimento celular, mientras que una disminución en la señal BRET indica que el agente disminuye la densidad o concentración de dicha proteína de interés en el compartimento celular. Los procedimientos y dispositivos para medir la señal BRET son bien conocidos en la técnica. La señal BRET puede medirse, por ejemplo, al determinar la intensidad de la señal de Renilla GFP (intensidad de luz), y/o al calcular la relación de la señal o intensidad de luz emitida por la Renilla GFP sobre la señal o intensidad de luz emitida por la Renilla Luc (relación BRET). La señal BRET puede medirse al usar un lector de microplacas o un microscopio con un conjunto de filtros adecuado para detectar las emisiones de luz de la Renilla luciferasa (donador) y/o rGFP (aceptor). Al elegir una porción de direccionamiento al compartimento celular apropiado, es posible evaluar/monitorear el tráfico de una proteína de interés a cualquier compartimento celular (PM, ER, Golgi, mitocondria, endosomas, etc.). Por ejemplo, para determinar si una condición dada o un agente afecta el tráfico de una proteína de interés a la mitocondria, un biosensor que comprende una porción de direccionamiento mitocondrial etiquetado con Renilla GFP o Renilla Luc se puede usar. Un aumento en la señal BRET en presencia del agente o bajo la condición dada (en relación con la ausencia del agente o en una condición diferente) es indicativo del "reclutamiento" de la proteína de interés a la mitocondria (es decir, un aumento en la concentración/densidad de la proteína de interés en la mitocondria). En contraste, una disminución en la señal BRET en presencia del agente o bajo la condición dada (en relación con la ausencia del agente o en una condición diferente) es indicativa de una disminución en la concentración/densidad de la proteína de interés en la mitocondria. Al usar fracciones de direccionamiento al compartimento celular adecuados, se puede usar un enfoque similar para estudiar el tráfico de proteínas a diferentes compartimentos celulares.

En una realización, el procedimiento comprende determinar si un agente o condición induce (es decir, aumenta) el tráfico de un receptor de superficie celular de interés en un compartimento endosomal (es decir, aumenta la concentración/densidad de la proteína de interés en los endosomas),

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para comparar el tráfico de un receptor de superficie celular de interés en un compartimento endosomal, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor que comprende una porción de direccionamiento endosomal como se define en la presente memoria bajo dicha primera condición; y medir la señal BRET en el biosensor que comprende una porción de direccionamiento endosomal como se define en la presente memoria bajo dicha segunda condición; en el que una diferencia en la señal BRET entre dichas condiciones primera y segunda es indicativa de una diferencia en el tráfico de dicha proteína de interés en dicho compartimento endosomal bajo dichas condiciones primera y segunda.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar un agente que induce (es decir, aumenta) el tráfico de un receptor de superficie celular de interés en una célula en un compartimento endosomal, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor que comprende una porción de direccionamiento endosomal, preferiblemente una porción de direccionamiento endosomal que comprende un dominio FYVE (por ejemplo, el dominio FYVE de Endofina) como se define en la presente memoria en presencia y ausencia de dicho agente; en el que una señal BRET más alta en presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativo de que dicho agente induce (es decir, aumenta) el tráfico de un receptor de superficie celular de interés en una célula en dicho compartimento endosomal (es decir, aumenta la concentración/densidad de la proteína de interés en los endosomas).

Como se muestra en los experimentos descritos en la presente memoria, es posible evaluar/monitorear el tráfico de una proteína a través de la vía endosomal, por ejemplo, mediante el uso de una pluralidad de biosensores, cada uno de los cuales comprende una porción de direccionamiento endosomal diferente (por ejemplo, un primer biosensor que comprende una porción de direccionamiento para los endosomas tempranos y un segundo biosensor que comprende una porción de direccionamiento para los endosomas tardíos).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para comparar la internalización de un receptor de superficie celular de interés en una célula bajo una primera y una segunda condición, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor que comprende una porción de direccionamiento a PM como se define en la presente memoria bajo dicha primera condición; y medir la señal BRET en el biosensor que comprende una porción de direccionamiento a PM como se define en la presente memoria en dicha segunda condición; en el que una diferencia en dicha señal BRET entre dichas condiciones primera y segunda es indicativa de una diferencia en la internalización de dicho receptor de superficie celular de interés bajo dichas condiciones primera y segunda.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar un agente que induce la internalización y/o secuestro de un receptor de superficie celular de interés en una célula, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor que comprende una porción de direccionamiento a PM como se define en la presente memoria en presencia y ausencia de dicho agente; en el que una señal de BRET más baja en presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativo de que dicho agente induce la intemalización y/o secuestro del receptor de superficie celular de interés.

Los biosensores descritos en la presente memoria permiten además determinar si los receptores internalizados se reciclan nuevamente a la superficie celular y, de ser así, evaluar la cinética del reciclaje del receptor.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para monitorear el reciclaje de un receptor internalizado de interés en la superficie celular, dicho procedimiento comprende: (a) poner en contacto el biosensor que comprende una porción de direccionamiento a PM como se define en la presente memoria en presencia de un ligando que induce la internalización de dicho receptor; (b) medir una primera señal BRET en el biosensor; (c) lavar dicho biosensor para eliminar dicho ligando; (d) medir una segunda señal BRET en el biosensor después de dicho lavado; y (e) determinar el reciclaje de un receptor internalizado de interés en la superficie celular mediante la comparación de dichas señales primera y segunda, en el que una segunda señal BRET más alta en relación con dicha primera señal BRET es indicativa de reciclaje del receptor internalizado de interés en la superficie celular.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para monitorear el reciclaje de un receptor internalizado de interés en la superficie celular, dicho procedimiento comprende: (a) poner en contacto un primer y un segundo biosensor que comprende una porción de direccionamiento a PM tal como se define en la presente memoria en presencia de un ligando que induce la internalización de dicho receptor; (b) medir una señal BRET en el primer biosensor después de dicho contacto; (c) lavar dicho segundo biosensor para eliminar dicho ligando; (d) medir una señal BRET en el segundo biosensor después de dicho lavado; y (e) determinar el reciclaje de un receptor internalizado de interés en la superficie celular mediante la comparación de la señal BRET en los biosensores primero y segundo, en el que una señal BRET más alta en dicho segundo biosensor en relación con dicho primer biosensor es indicativo de reciclaje del receptor internalizado de interés en la superficie celular.

En una realización, el procedimiento comprende además repetir las etapas (d) y (e) en diferentes momentos después del lavado para estudiar la cinética de reciclaje del receptor internalizado de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para monitorear una modulación de la actividad de la proteína G y/o GPCR entre una primera condición y una segunda condición, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor para monitorear la modulación de la proteína G y/o GPCR como se define en la presente memoria bajo dicha primera condición; y medir la señal BRET en el biosensor para monitorear la modulación de la proteína G y/o GPCR como se define en la presente memoria en dicha segunda condición; en la que una diferencia en la señal BRET entre dichas condiciones primera y segunda es indicativa de una modulación de la actividad de la proteína G y/o GPCR entre dichas condiciones primera y segunda.

En una realización, la primera condición es la ausencia de un compuesto de prueba (por ejemplo, inhibidor o agonista supuesto) y la segunda condición es la presencia de un compuesto de prueba, o viceversa. Una señal BRET más baja en presencia del compuesto de prueba es indicativa de que el compuesto de prueba es un agonista.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un ligando GPCR modula la actividad de una subunidad de la proteína G de interés, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor para monitorear la modulación de la proteína G y/o GPCR como se define en la presente memoria en presencia o ausencia de dicho ligando GPCR; en el que una diferencia en la señal BRET en presencia frente a ausencia de dicho ligando GPCR es indicativo de que dicho ligando GPCR modula la actividad de la subunidad de la proteína G de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para monitorear una modulación de la actividad de una pequeña GTPasa entre una primera condición y una segunda condición, dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor para evaluar la activación de una pequeña GTPasa como se define en la presente memoria bajo dicha primera condición; y medir la señal BRET en el biosensor para evaluar la activación de una pequeña GTPasa como se define en la presente memoria bajo dicha segunda condición; en la que una diferencia en la señal BRET entre dichas condiciones primera y segunda es indicativa de una modulación de la actividad de una pequeña GTPasa entre dichas condiciones primera y segunda.

En una realización, la primera condición es la ausencia de un compuesto de prueba (por ejemplo, inhibidor o agonista supuesto) y la segunda condición es la presencia de un compuesto de prueba, o viceversa. Una señal BRET más alta en presencia del compuesto de prueba es indicativa de que el compuesto de prueba es un agonista (reclutamiento de la pequeña GTPasa en la PM o en los endosomas).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un agente de prueba modula la actividad de una pequeña GTPasa (por ejemplo, una proteína Rho), dicho procedimiento comprende: medir la señal BRET en el biosensor para evaluar la activación de una pequeña GTPasa como se define en la presente memoria en presencia o ausencia de dicho agente de prueba; en el que una diferencia en la señal BRET en presencia frente a ausencia de dicho agente de prueba es indicativa de que dicho agente de prueba modula la actividad de dicha pequeña GTPasa.

Al usar los biosensores descritos en la presente memoria, también es posible evaluar/monitorear el "rescate" de una proteína de interés (por ejemplo, una proteína defectuosa que no sale correctamente del ER) por una chaperona farmacológica (PC, por sus siglas en inglés). El término "chaperona farmacológica" ("PC") como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que se une a una proteína (por ejemplo, un receptor) y tiene uno o más de los siguientes efectos: (i) potenciar la formación de una conformación molecular estable de la proteína; (ii) mejorar el tráfico apropiado de la proteína desde el ER a otra localización celular, preferiblemente una localización celular nativa, es decir, prevenir la degradación de la proteína asociada al ER; (iii) prevenir la agregación de proteínas conformacionalmente inestables, es decir, mal plegadas; (iv) restaurar o mejorar, al menos parcial, la función, estabilidad y/o actividad de tipo salvaje de la proteína y/o (v) inducir un plegamiento diferente de la proteína. Por lo tanto, una chaperona farmacológica para una proteína es una molécula que se une a la proteína, lo que resulta en un plegamiento, tráfico, no agregación y/o actividad apropiados de la proteína, y/o modula el plegamiento de la proteína (al inducir un plegamiento de la proteína que es diferente al plegamiento en ausencia de la chaperona).

Anteriormente se ha demostrado que los inhibidores de moléculas pequeñas de las enzimas asociadas con los trastornos de almacenamiento lisosomal (LSDs) pueden rescatar tanto el plegamiento como la actividad de la enzima mutante, y mejorar el plegamiento y la actividad de la enzima de tipo salvaje (véase Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.274.597; 6.583.158; 6.589.964; 6.599.919; y 6.916.829). En particular, se descubrió que la administración de derivados de moléculas pequeñas de glucosa y galactosa, los cuales eran inhibidores competitivos específicos de enzimas mutantes asociadas con LSDs, aumentó efectivamente in vitro e in vivo la estabilidad de las enzimas mutantes y mejoró la actividad enzimática mutante. La teoría original detrás de esta estrategia es la siguiente: dado que la proteína enzimática mutante se pliega incorrectamente en el ER (Ishii y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), la proteína enzimática se retrasa en la vía de transporte normal (ER ^ aparato de Golgi ^ endosoma ^ lisosoma) y se degrada rápidamente. Por lo tanto, un compuesto que estabilice el plegamiento correcto de una proteína mutante servirá como una chaperona específica para el sitio activo para la proteína mutante para promover su escape suave del sistema de control de calidad de ER. Los inhibidores de la enzima ocupan el centro catalítico, lo que resulta en la estabilización de la conformación enzimática en las células y en los animales. Estas chaperonas específicas se denominaron "chaperonas específicas para el sitio activo (ASSCs, por sus siglas en inglés)" ya que se unían al sitio activo de la enzima.

Además de rescatar las enzimas mutantes, las ASSCs mejoran la secreción y actividad en el ER de las enzimas recombinantes de tipo salvaje. Un ASSC facilita el plegamiento de la enzima de tipo salvaje sobreexpresada, la cual de otro modo se retrasa en el sistema de control de calidad del ER porque la sobreexpresión y la producción excesiva de la enzima excede la capacidad del ER y conduce a la agregación y degradación de proteínas. Por lo tanto, un compuesto que induce una conformación molecular estable de una enzima durante el plegamiento sirve como una "chaperona" para estabilizar la enzima en una conformación apropiada para salir del ER. Como se señaló anteriormente, para las enzimas, uno de estos compuestos resultó inesperadamente ser un inhibidor competitivo de la enzima.

Además de los LSDs, una gran y diversa cantidad de enfermedades ahora se reconocen como "enfermedades conformacionales" causadas por la adopción de conformaciones de proteínas no nativas, lo cual puede conducir al retraso de la proteína en el ER y a la degradación final de las proteínas. (Kuznetsov y otros, N. Engl. J. Med. 1998; 339:1688-1695; Thomas y otros, Trends Biochem. Set 1995; 20:456-459; Bychkova y otros, FEBS Lett. 1995; 359:6-8; Brooks, FEBS Lett. 1997; 409:115-120). Por ejemplo, se descubrió que pequeños compuestos sintéticos estabilizan el dominio de unión al ADN de las formas mutantes de la proteína supresora de tumores p53, lo que permite a la proteína mantener una conformación activa (Foster y otros, Science 1999; 286:2507-10). Se ha demostrado que la síntesis de receptores es rescatada por antagonistas y ligandos de receptores de moléculas pequeñas (Morello y col, J Clin. Invest.

2000; 105: 887-95; Petaja-Repo y otros, EMBO J. 2002; 21: 1628-37). Incluso se ha demostrado el rescate farmacológico de las proteínas del canal de membrana y otros transportadores de membrana plasmática al usar fármacos o sustratos que bloquean los canales (Rajamani y otros, Circulation 2002; 105:2830-5; Zhou y otros, J Biol. Chem. 1999; 274:31123-26; Loo y otros, J. Biol. Chem. 1997; 272: 709-12; Pedemonte y otros, J. Clin. Invest. 2005; 115: 2564-71). Por lo tanto, los biosensores descritos en la presente memoria pueden ser útiles para identificar chaperonas que rescatan la expresión y/o la maduración apropiada de proteínas, y que a su vez pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con defectos en la expresión y/o maduración adecuada de una o más proteínas, como se describió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un agente actúa como una chaperona farmacológica para un receptor de interés, dicho procedimiento comprende:

proporcionar un biosensor que comprende: una célula que comprende: dicho receptor de interés etiquetado con una Renilla GFP o una Renilla Luc, preferiblemente una Renilla Luc y una porción de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) etiquetada con Renilla GFP o una Renilla Luc, preferiblemente una Renilla GFP; en el que si dicho receptor se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla Luc, y si dicho receptor se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla GFP; y

medir la señal del aceptor de BRET en presencia y ausencia de dicho agente;

en el que un aumento en la señal BRET en presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativo de que dicho agente actúa como una chaperona farmacológica para dicho receptor.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un agente actúa como una chaperona farmacológica para una proteína de interés, dicho procedimiento comprende:

proporcionar un biosensor que comprende: una célula que comprende: dicha proteína de interés etiquetada con una Renilla GFP o una Renilla Luc y una porción de direccionamiento al retículo endoplásmico (ER) etiquetada con una rGFP o una Renilla Luc; en la que si dicha proteína se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento a ER se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha proteína se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento al ER se marca con dicha Renilla GFP; y

medir la señal del aceptor de BRET en presencia y ausencia de dicho agente;

en el que una disminución en la señal BRET en presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativo de que dicho agente actúa como una chaperona farmacológica para dicho receptor.

El procedimiento mencionado anteriormente puede realizarse al usar una proteína/receptor nativo, o un receptor mutado, como se muestra en los experimentos descritos en la presente memoria. Los experimentos descritos en la presente memoria muestran además que los biosensores son adecuados para medir el rescate de un GPCR así como de un receptor no GPCR (un canal de potasio dependiente del voltaje), lo que proporciona evidencia de que pueden usarse para monitorear el rescate de cualquier proteína o receptor. En una realización, la proteína es un GPC^rnativo o un GPCR mutado. En una realización adicional, el GPCR es un receptor de melanocortina-4 (MC4R) nativo o un MC4R mutado. En una realización, el MC4R mutado contiene una o más mutaciones que resultan en un plegamiento intracelular reducido o inapropiado del polipéptido MC4R. Las mutaciones ejemplares son las siguientes: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT al codón 211 e inserción de TGAT en el codón 244. En otra realización, el GPCR es un V2R nativo o un V2R mutado. En una realización adicional, el V2R mutado comprende una sustitución Y128S o W164S. En otra realización, la proteína es un canal iónico, un canal iónico nativo o un canal iónico mutado, en una realización adicional un canal de potasio dependiente de voltaje, tal como hERG.

En una realización, el procedimiento anterior para determinar si un agente actúa como una chaperona farmacológica comprende además determinar si la proteína/receptor rescatado es funcional, por ejemplo, al usar un ligando.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un agente induce el reclutamiento de una p-arrestina en la membrana plasmática (PM), dicho procedimiento comprende:

proporcionar un biosensor que comprende una preparación celular o de membrana que comprende: dicha parrestina etiquetada con una Renilla GFP o una Renilla Luc, preferiblemente una Renilla Luc; una porción de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) etiquetada con una Renilla GFP o una Renilla Luc, preferiblemente una Renilla GFP; y un GPCR; en el que si dicha p-arrestina se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha p-arrestina se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento a PM se marca con dicha Renilla GFP; y

medir la señal del aceptor de BRET en presencia y ausencia de dicho agente;

en el que un aumento en la señal BRE^ten presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativo de que dicho agente induce el reclutamiento de dicha p-arrestina en la PM.

Los procedimientos mencionados anteriormente comprenden poner en contacto el biosensor con un sustrato para una Renilla Luc, como una luciferina, para producir energía (en forma de luz) que será aceptada por (excita) la rGFP. Los ejemplos no limitantes de luciferinas incluyen D-luciferina, compuestos basados en imidazopirazinona como coelenterazina (coelenterazina 400A (DeepBlueC ™), coelenterazina H y análogos de e-Coelenterazina como Prolume Purple™ de Nanolight™), ViviRen™ (de Promega), luciferina Latia ((E)-2-metil-4-(2,6,6-trimetiM-ciclohex-1-il)-1-buten-1 -ol formiato), luciferina bacteriana, luciferina de dinoflagelado, etc. En una realización, el sustrato es coelenterazina 400A, coelenterazina H o Prolume Purple™.

Como se usa en la presente memoria, el término "agente" se usa para referirse a cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido y similares, para analizar la bioactividad. Dichos agentes pueden obtenerse a partir de cualquier cantidad de fuentes, incluidas bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, numerosos medios están disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos aleatorios. Como alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de bacterias, hongos, extractos de plantas y animales están disponibles o se producen con facilidad. Además, las bibliotecas naturales o producidas sintéticamente y los compuestos son fácilmente modificados a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.

Se pueden usar controles positivos y controles negativos en los procedimientos/ensayos. Las muestras de control y prueba pueden realizarse varias veces para obtener resultados estadísticamente significativos.

En una realización, los procedimientos mencionados anteriormente son procedimientos de alto rendimiento (cribado de alto rendimiento, HTS). La expresión "cribado de alto rendimiento" (HTS), como se usa en la presente memoria, se refiere a un procedimiento que permite la detección rápida y en paralelo de grandes cantidades de compuestos (cientos, miles) para la actividad de unión o actividad biológica contra moléculas diana. Tales procedimientos HTS se realizan típicamente en placas de microtitulación que tienen varios pocillos, por ejemplo, 384, 1.536 o 3.456 pocillos. Para HTS, es importante que la señal de lectura se detecte con alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad.

Modos(s) para llevar a cabo la invención

La presente invención se ilustra en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Materiales. Angiotensina II (AngII; [Asp-Arg-Val-Tyr-IIe-His-Pro-Phe], SEQ ID No:), poli-ornitina, poli-D-lisina, isoproterenol, arginina-vasopresina (AVP), bradiquinina, eran de Sigma®. Prostaglandina F2a (PGF2a), Prostaglandina E2 y u46619 eran de Cayman Chemical® (Ann Arbor, MI). [Sar1, Ne8]-AngII (SI) y [Asp1,Val5, Gly8]-AngII (DVG) [Sar1-Val5-D-Phe8]AngII (SVdF) y [Sar1-D-Ala8]AngII (TRVl20027), se sintetizaron en la Universidad de Sherbrooke (Canadá, QC). UBO-QIC se obtuvo del Instituto de Biología Farmacéutica de la Universidad de Bonn (Alemania). El yodo-125 se obtuvo de PerkinElmer®. El medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), suero fetal bovino, OPTI-MEM® y otros reactivos de cultivo celular se compraron de Invitrogen®. Coelenterazina 400a, Coelenterazina H y Prolume Purple™ se compraron de Goldbio®, Biotium o Nanolight® Technology. La polietilenimina (PEI; 25 kDa lineal; se adquirió de Polysciences (Warrington, PA, E.U.A). El ADN de esperma de salmón se adquirió de Lifetechnologies (ThermoFisher). La ADN polimerasa Phusion® era de Thermo Scientific®. Las enzimas de restricción y la ADN ligasa T4 se obtuvieron de NEB®.

Plásmidos y construcciones. Para la construcción de Lyn-GFP10, la secuencia de codificación de los primeros 11 residuos (MGCIKSKGKDS, SEQ ID No: 1) de la Lyn-quinasa humana y la región completa de codificación de GFP10 se sintetizaron en GeneScript® (Piscataway, NJ) y subclonaron en pcDNA 3.1/zeo (-) al usar infusión (Clontech®, CA). El Lyn-rGFP se generó al reemplazar la secuencia de codificación de GFP10 en la construcción Lyn-GFP10 por el rGFP humanizado, el cual se generó por amplificación por PCR. El GFP10 fusionado con StreptagII se sintetizó en GenScript® y se subclonó en pcDNA3.1/zeo (-) (STII-GFP10). El dominio FYVE de la endofina humana (aminoácidos 739-806), se sintetizó en Bio Basic® Inc. (Ontario, Canadá) y se subclonó en el marco de construcción STII-GFP10 (GFP10-endofinFYVE). rGFP-endofinFYVE se generó al insertar el dominio FYVE de GFP10-endofinFYVE en un vector que contiene rGFP humanizado en pcDNA3.1(+) en el marco. rGFP-rab4 y rGFP-rab11 se generaron por reemplazo del dominio FYVE en rGFP-endofinFYVE con secuencias de codificación rab4 y rab11 amplificadas por PCR, respectivamente. Para generar Rlucll fusionado con AT1R, las secuencias codificantes de AT1R humano que contienen un péptido señal y una secuencia de Flag se amplificaron por PCR y se subclonaron en un marco en pcDNA3.1/hygro(+) que también contiene Rlucll a través de sitios Nhel y HindIII. Los plásmidos que codifican parr2-Rlucll humano se describieron previamente (Quoyer, Janz y otros 2013). Los receptores etiquetados con Rlucll se obtuvieron por PCR al usar construcciones publicadas de construcciones MC4R-Venus (P. René y otros J Pharmacol Exp Ther. 2010 Dec;335(3):520-32) y hV2R wt (Morello, JP, y otros, J Clin Invest, 2000. 105(7): p. 887-95). Los receptores etiquetados con Rlucll se obtuvieron por PCR al usar plásmidos que codifican hERG, un generoso regalo de D. Deblois (Universidad de Montreal, Montreal, Canadá). Las construcciones Renilla reniformis GFP (rGFP) se obtuvieron por PCR a partir de la secuencia de codificación sintetizada (de GenScript, EUA). Dominio PH se marcó con Rlucll y rGFP: El dominio PH de PLC81 se amplificó por PCR al usar el clon de imagen ^pL^cS1 (IMAGEN: 5769665) como plantilla. El producto de PCR se usó para reemplazar el dominio endofinFYVE en GFP10-endofinFYVE al subclonar en sitios Xbal e Hindlll. El dominio PH de GFP10-PH(PLC8) se insertó en un vector que contiene rGFP humanizado en pcDNA3.1(+) o en un vector que contiene HA-Rlucll en pcDNA3.1(+) en el marco (rGFP-PH(PLC81) y HA-Rlucll-PH(PLC81), respectivamente). hMC4R-Rlucll: Los plásmidos que codifican la proteína de fusión hMC4Rwt-Rlucll, hMC4R (R165Q)-Rlucll y hMC4R-(P299H)-Rlucll se obtuvieron por amplificación por PCR de MC4R a partir de construcciones MC4R-venus y se subclonaron en marco en el extremo N a la secuencia humanizada Renilla luciferasa II (hRLucll) (una variante de la hRluc informada anteriormente (Leduc, Breton y otros 2009)) en el vector pcDNA3.1 Rlucll (secuencia enlazadora: VGGGGSKLPAT, SEQ ID No:2). hV2R-Rlucll: La sustitución Y128S de V2R se creó al usar la mutagénesis dirigida al sitio con el estuche de mutación Quick Change™ (Agilent Technologies, Santa-Clara, EUA). Los plásmidos que codifican la proteína de fusión hV2R wt-Rlucll y hV2R (Y128S)-Rlucll se obtuvieron por amplificación por PCR de la secuencia de codificación V2R, subclonada en marco en el extremo N a la secuencia hRlucll en el vector pcDNA3.1 Rlucll (secuencia enlazadora: GGSGLKLPAT, SEQ ID No: 3). hERG-Rlucll: Los plásmidos que codifican la proteína de fusión hERG wt-Rlucll y hERG (G601S)-Rlucll se obtuvieron mediante amplificación por PCR de 3 fragmentos que codifican: residuos 1-379 de hERG, 373-1.159 de hERG y Rlucll, y se subclonaron mediante el vector pcDNA3.1 (+) de Ensamblado Gibson (New England Biolabs) (enlazador en el N-terminal de Rlucll: NAAIRSGG, SEC ID No: 4 y en el C-terminal de Rlucll: Gg Na AIRS, SEC ID No: 5). rGFP-CAAX: El plásmido que codifica la proteína de fusión rGFP-CAAX se obtuvo por amplificación por PCR de la secuencia de codificación de rGFP con un cebador inverso que codifica un enlazador (secuencia: GSAGTMASNNTASG, SEQ ID No: 6) y la secuencia polibásica dirigida a la membrana plasmática y la secuencia señal de prenilación a partir de la variante de empalme KRAS b: -GKKKKKKSKTKCVIM (llamado: CAAX, SEQ ID No:7). La secuencia de direccionamiento a la membrana plasmática CAAX está en marco en el extremo C de la secuencia de codificación de rGFP. El fragmento de PCR se subclona en el vector pcDNA3.1 (+). rGFP-PB: Los plásmidos que codifican la proteína de fusión rGFP-PB se obtuvo por reemplazo del motivo CAAX de rGFP-CAAX por el dominio de direccionamiento a la membrana plasmática GRK5 (PB; secuencia: SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS, SEQ ID No: 8) al usar amplificación por PCR y Ensamblado Gibson. El vector completo pCDNA 3.1 (+) rGFP-CAAX se amplifica por PCR al usar oligos que codifican PB. El producto de reacción de PCR se digiere con Dpnl, se purifica y se recirculariza en una reacción de Ensamblado Gibson. Clonación de Rlucll-GRB2: La secuencia de codificación de la variante 1 de GRB2 humana se amplificó por PCR y se subclonó en el extremo C de Rlucll en el vector pCDNA3.1 (+) Rlucll con un pequeño enlazador flexible (secuencia: GsAGT, SEQ ID No: 9) entre GRB2 y Rlucll. Todas los PCR se realizaron al usar la ADN polimerasa Phusion®. Todas las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN antes de su uso.

Cultivo celular y transfección transitoria. Las células humanas de riñón embrionario 293 (HEK293) se mantuvieron en medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina/estreptomicina 100 unidades/ml a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO ² . Las células HEK293SL se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 5% y 20 pg/ml de gentamicina. Las células se cultivaron a 37 °C en 5% de CO ² y 90% de humedad.

Transfecciones usando fosfato de calcio: Las células HEK293SL se transfectaron al usar un procedimiento de fosfato de calcio (Fessart, Simaan y otros 2005). Las células se sembraron a una densidad de ~7,5x10⁵por platos de 100 mm al día antes de la transfección y la transfección se llevó a cabo como se describió anteriormente (Fessart, Simaan y otros 2005). Después de 18 horas de transfección, se reemplazó el medio y las células se dividieron para experimentos posteriores. Todos los ensayos se realizaron 48 horas después de la transfección.

Transfección usando poli(etilenimina) (PEI): Dos días antes de los experimentos, las células HEK293 de una placa de 6 pocillos se lavaron con PBS que no contenía calcio ni magnesio, se separaron y se transfectaron con los plásmidos indicados al usar PEI como agente transfectante (en una proporción de 3 a 1, PEI/ADN) y luego se sembraron directamente en placas de 96 pocillos pretratadas con hidrobromuro de poli-L-ornitina a una densidad de 35.000 células por pocillo.

Líneas celulares estables rGFP-CAAX. Las células HEK293 de una placa de 6 pocillos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y se transfectaron con 1,2 pg de construcción que codifica rGFP-CAAX/pocillo al usar polietilenimina lineal de 25 kDa (PEI) como agente transfectante (en una proporción de 3 a 1, PEI/ADN) (Hamdan, Rochdi y otros 2007). La construcción rGFP-CAAX también codifica para la resistencia a higromicina, y las células transfectadas se sembraron en platos T75 y la selección (higromicina a 100 pg/ml) se mantuvo durante 4 semanas y las células resistentes a higromicina se clasificaron por FACS contra fluorescencia de GFP, en poblaciones que expresan diferentes niveles de rGFP-CAAX.

Las mediciones de BRET para las figuras 1B a 9D, 25D a 25F. Al día siguiente de la transfección, las células se separaron y se volvieron a colocar en una placa blanca de 96 pocillos revestida con poliornitina a una densidad de -25.000 células por pozo. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con tampón Tyrode precalentado (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, CaCl 1 mM ² , NaHCO^a12 mM, D-glucosa 5,6 mM, MgCh 0,5 mM, NaH ² PO ⁴ 0,37 mM, HEPES 25 mM, pH 7,4), y luego se estimularon con varias concentraciones de ligandos en el tampón Tyrode durante el tiempo indicado, o una concentración única de ligandos durante varios tiempos a 37 °C. Para el experimento de reciclaje, después de estimular las células con los ligandos durante 30 minutos a 37 °C, se lavaron tres veces con tampón Tyrode helado o una vez con tampón Tyrode/tres veces con ácido (citrato de sodio 50 mM, pH 4,0)/dos veces con tampón Tyrode. Todos los pasos de lavado se realizaron en hielo. Las células se incubaron además con tampón Tyrode a 37 °C en un baño de agua durante 45 minutos. El sustrato permeable a las células, coelenterazina 400a, se añadió a una concentración final de 5 pM en el tampón Tyrode 3-4 minutos antes de las mediciones de BRET. Las mediciones se realizaron al usar el lector de microplacas Synergy2 (BioTek®) con un conjunto de filtros de 410 ± 80 nm y 515 ± 30 nm para detectar las emisiones de luz Rlucll Renilla luciferasa (donador) y GFP10 o rGFP (aceptor), respectivamente. La señal BRET se determinó al calcular la relación de la intensidad de la luz emitida por GFP10 o rGFP sobre la intensidad de la luz emitida por Rlucll. Todas las mediciones de BRET se realizaron por triplicado a 37 °C.

Ensayo BRET para la evaluación del rescate por PC de la expresión y funcionalidad en la superficie celular (ensayo de secuestro). En las figuras 12A a 18E, las células Hek293 se transfectaron transitoriamente al usar PEI como se describe en esta sección. El ADN transfectado por pocillo de una placa de 96 pocillos es el siguiente: en las figuras 12A y 12B, con 2,4 ng de la construcción que codifica para hMC4R-Rlucll y una cantidad creciente de rGFP-CAAX (Kras) hasta 9,6 ng para la figura 12A y para 12B, rGFP-PB hasta 9,6 ng; en las figuras 13A a 13C con 0,6, 1,2 o 2,4 ng de hMC4R-Rlucll y 4,8 ng de rGFP-CAAX (Kras); en la figura 13D con 2,4 ng de construcción policistrónica rGFP-CAAX(Kras)/MC4R-Rlucll; en la figura 13E con 1,2 ng de hV2R-Rlucll y 4,8 ng de rGFP-CAAX (Kras); en las figuras 14A a 16B con 2,4 ng de hMC4R-Rlucll y 7,2 ng de rGFP-CAAX (Kras); las células Hek293 que expresan de forma estable rGFP-CAAX(Kras) se transfectaron con 0,6; 1,2 o 2,4 ng de hMC4R-Rlucll; en la figura 17A o 0,6, 1,2 o 2,4 ng de hV2R_Y128S-Rlucll; en la figura 17B; en las Figuras 18A y 18B con 0,6; 1,2 o 2,4 ng de hERG-Rlucll y 4,8 ng de rGFP-CAAX (Kras); y en las figuras 18C-18E con 0,6 ng de hERG-Rlucll y 7,2 ng de rGFP-CAAX (Kras). Las células transfectadas sembradas en placas de 96 pocillos se trataron con una chaperona farmacológica (para MC4R: DCPMP(N-((2R)-3(2,4-diclorofenil)-1-(4-(2-((1-metoxipropan- 2-ilamino)metil)fenil)piperazin-1-il)-1-oxopropan-2-il)propionamida) o Compuesto 1; para V2R: SR121463; para hERG: Astemizol, Cisaprida, Quinidina, Ditiazem, Amiodarona y Acetaminofen) o vehículo por 16-18 horas, como se indica en cada figura, antes del ensayo BRET realizado 2 días después de la transfección. Para el ensayo BRET, las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en el tampón Tyrode. Las células luego se trataron opcionalmente para MC4R con 10 pM de a-MSH durante una hora a 37 °C para evaluar el rescate por PC de la funcionalidad como una función del secuestro inducido por el agonista de los receptores que se expresaron en la superficie celular (figura 13). El sustrato Rluc, Coel-400a (para experimentos BRET2) o coelenterazina H (para experimentos BRET1, figura 13E y 15B y 15D), se añadió a una concentración final de 2,5 pM y las células se incubaron además durante 5 minutos adicionales. Los valores de BRET se recopilaron al usar un lector de microplacas multimodo Mithras LB940, equipado con los siguientes filtros para BRET2: 400 nm ± 70 nm (donador de energía) y 515 nm ± 20 nm (aceptor de energía) y para BRET1: 480 nm ± 20 nm (donador de energía) y 530 nm ± 20 nm (aceptor de energía). Los valores de BRET se determinaron al calcular la relación de la luz emitida por el aceptor sobre la luz emitida por el Rlucll.

Reclutamiento de parrestina a la membrana plasmática al usar marcadores rGFP: Para las figuras 19B a 19D, las células HEK293 se transfectaron con PEI, como se describió anteriormente, con 3 ng de parrestina1-Rlucll (figuras 19B y 19D) o parrestina2-Rlucll (figuras 19C y 19E) 4,8 ng del marcador de PM (rGFP-CAAX= triángulos rojos, GFP10-CAAX=círculos, rGFP-PB=triángulos verdes y Lyn-rGFP=cuadrados) 10 ng de V2R (figuras 19D y 19E) o 40 ng de p2AR (figuras 19B y 19C) por pocillo de una placa de 96 pocillos. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y estimularon durante 10 minutos con las dosis indicadas a 37 °C. Luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 5 minutos adicionales. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies). Los datos se normalizaron como una relación de la respuesta máxima obtenida con la construcción GFP10-CAAX (Kras). Para la figura 19F, una mezcla de transfección de 200 ng de P²AR, 20 ng de p-arrestina2-Rlucll, 800 ng de rGFP-CAAX, complementado a 2 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añade a 3 ml de Hek293SL (350.000 células/ml). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl²1 mM a 37 °C durante 60 minutos y luego se trataron con las dosis indicadas de isoproterenol durante 2 minutos a 37 °C. Luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 6 minutos adicionales. BRET se midió a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies). Para las figuras 19C, 19E, 19H y 19I, las células HEK293 se transfectaron con PEI, como se describió previamente con 3 ng de parrestina2-Rlucll (figuras 19C y 19E) 4,8ng de rGFP-CAAX (Kras) 10 ng V2R (figura 19I) o 40 ng de p2AR (figuras 19H) por pocillo de una placa de 96 pocillos. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y la mitad de una placa de 96 pocillos se estimuló durante 10 minutos con AVP 100 nM (para la figura 19H) o con isoproterenol a 1 pM (para la figura 19H) y la otra mitad de la placa con vehículo, a 37 °C. Luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 5 minutos adicionales. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies). Los valores del factor Z se calcularon según lo descrito por Zhang y otros (Zhang, Chung y otros 1999). Para las figuras 19J y 19G, las células Hek293SL se sembraron en un plato de 100 mm y luego al día siguiente las células se transfectaron con 90 ng de parrestina2-Rlucll y 480 de rGFP-CAAX (Kras) junto con 600 ng de AT1R (figura 19J) con un procedimiento de fosfato de calcio, como se describió anteriormente. 24 horas después de la transfección, las células se volvieron a colocar en una placa de 96 pocillos, luego al día siguiente, se lavaron las células y se estimuló la mitad de una placa de 96 pocillos durante 6 minutos con AnglI 100 nM (figura 19J) y la otra mitad de la placa con el vehículo, a temperatura ambiente antes de las mediciones de BRET. (figura 19G) las células HEk293SL se transfectaron con AT1R (600 ng) y parrestina2-Rlucll (90 ng) junto con Lyn-rGFP (480 ng), rGFP-CAAX (480 ng) o GFP10-CAAX (480 ng) en platos de 100 mm. Al día siguiente, las células se volvieron a colocar en placas de 96 pocillos. 48 h después de la transfección, las células se estimularon con varias concentraciones de AnglI durante 6 minutos antes de las mediciones de BRET. Se añadió coelenterazina 400a (concentración final de 5 pM) después de 2 minutos de estimulación con AngII. Se midió BRET a temperatura ambiente, al usar un lector de microplacas Synergy2 (BioTek®). Los valores del factor Z se calcularon según lo descrito por Zhang y otros (Zhang, Chung y otros 1999).

Sensor unimolecular de reclutamiento de parrestina: para la figura 21B, se añadieron 200 ng de V2R-pRK5, 50 ng de sensor unimolecular p2AR con diferentes enlazadores, complementados hasta 1 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1; a 1,2 ml de HEK293SL. Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCh 1 mM a 37 °C durante 60 minutos y luego se trataron con AVP (100 nM) durante 10 minutos a 37 °C. Se añadió coelenterazina 400a (coel-400a) (Biotium) a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 5 minutos adicionales. Las relaciones BRET se midieron a 37 °C, al usar el lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies). Para la figura 21C, 1x transfección: 400 ng de sphAT1R, 200 ng del sensor unimolecular p2AR con un enlazador de 200 residuos de longitud, complementado a 4 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añadieron a 7 ml de HEK293SL. Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl²1 mM a 37 °C durante 60 minutos, luego se trataron con diferentes concentraciones de ligando durante 5 minutos a 37 °C. Se añadió coelenterazina 400a (coel-400a) (Biotium) a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 5 minutos adicionales. Las relaciones BRET se midieron a 37 °C, al usar el lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies).

Sensor DAG unimolecular. Para las figuras 22B y C, las células HEK293SL que expresan establemente hAt1AR (~50 fmol/mg) se cultivaron en DMEM suplementado con SFB al 10% y 20 pg/ml de gentamicina y se sembraron a una densidad de 75.000 células/platos de 100 mm y se transfectaron transitoriamente al día siguiente con 150 ng de construcción que codifica para el sensor DAG unimolecular, al usar el procedimiento de fosfato de calcio como se describió anteriormente. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se añadió Coel-400a a una concentración final de 5 pM y se incubaron 3 minutos. Para la figura 22B se midió BRE^tcada 4 segundos, luego se añadió AnglI a los 64 segundos para una concentración final de 100 nM y se evaluó la cinética de la estimulación promovida por agonista. Los datos son la media ± DE de triplicados de un experimento representativo. Para la figura 22C las células se estimularon con las concentraciones indicadas de AnglI durante 1 minuto antes de las mediciones de BRET. Los datos son la media ± SE de seis experimentos independientes. Para la figura 22D y E, las células Hek293SL se transfectaron con FuGENE HD, de acuerdo con el protocolo de Roche con una proporción de 2:1 fugene:ADN. 10 ng de construcción que codifica el sensor unimolecular y 400 ng para el receptor (figura 22D, FP y en 2E, GPR14) complementado a 1 ug con ADNsc, se transfectaron por pocillo de una placa de 6 pocillos. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron, se incubaron en el tampón Tyrode durante 1 hora. Las células se estimularon con las dosis indicadas con sus respectivos ligandos (en la figura 22d , con PGF2a y PGE2 y en la 22E, con Urotensina II) durante 1 minuto, luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM durante 5 minutos adicionales. Para la figura 22F, las células se transfectaron como en la figura 22D, pero solo con la construcción de codificación del sensor DAG unimolecular. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron, se incubaron en el tampón Tyrode durante 1 hora. Se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM durante 5 minutos adicionales. Luego, las células se estimularon con m-3m3SFB 5 pM o solo vehículo durante el tiempo indicado. Para las figuras 22G y 22H, las células se transfectaron como en las figuras 22E y 22D, respectivamente. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron, se incubaron en el tampón Tyrode durante 1 hora. La mitad de los pocillos de una placa de 96 pocillos se estimularon con 100 nM de ligandos (en la figura 22H, con PGF2a y en la 22G, con Urotensina II) durante 1 minuto y la otra mitad con vehículo. Luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM para una incubación adicional de 5 minutos. Para las figuras 22D a 22H, las relaciones BRET se midieron a 37 °C, al usar el lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies).

Sensor DAG basado en el reclutamiento de C1b para marcadores rGFP. Para las figuras 23B a D, las células HEK293 se transfectaron al usar PEI, como ya se describió, con 100 ng de Rlucll-C1b, 500 ng de rGFP-CAAX (Kras) y 100 ng de histamina humana tipo 1 (H1R, receptor acoplado a Gq, bradiquinina humana tipo 2 (BKRB2, receptor acoplado a Gq), receptores de dopamina humana tipo 2 (D2R, receptor acoplado a Gi usado como control negativo) y complementados a 1 pg con ADNsc. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en el tampón Tyrode. Las células se incubaron 5 minutos con las dosis indicadas de sus respectivos agonistas (histamina para H1R, calidina para BKRB2 y dopamina para D2R). Luego se añadió Prolume Purple™ a 2 pM final durante 5 minutos adicionales. Las mediciones de BRE^tse realizaron al usar un lector de microplacas multimodo Synergy Neo (BioTek Instruments, Inc). Para la figura 23E, 100 ng de p2AR, 20 ng de Rlucll-C1b, 400 ng de rGFP-CAAx (Kras) y 100 ng de Ga15 WT o 100 ng del vector vacío (Mock), complementado a 1 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añadió a 1,2 ml de Hek293SL (350.000 células/ml). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl ² 1 mM a 37 °C durante 60 minutos. Luego se añadió coelenterazina 400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 6 minutos. Las células se trataron con las dosis indicadas de isoproterenol, durante 1 minuto. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies).

Sensor basado en la translocación de proteína G: Para las figuras 24B a D, 100 ng de HA-p1AR o HA-p2AP, 5 ng del Rlucll-Gy indicado, 100 ng de Ga15 w T, 100 ng de Gp1 WT, 200 ng de rGFP-CAAX (Kras), complementado a 1 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añade a 1.2 ml de Hek293SL (350.000 células/ml) (para las figuras 24B y C) o 2x a 3 ml de HEK293SL (350.000 células/ml) (para la figura 24 D). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl ² 1 mM a 37 °C durante 60 minutos. Luego se añadió coelenterazina 400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 6 minutos. Las células se trataron con 1 pM (figuras 24B y C) o las dosis indicadas (figura 24^d ) de isoproterenol, durante 2 minutos. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar® (Berthold Technologies). Para las figuras 24E a G, 100 ng de HA-p1AR, 30 ng de Gas pos67Rlucll o Ga12 pos84Rlucll, 100 ng de Gy5 WT, 100 ng de Gp1 WT, 400 ng de rGFP-CAAX o marcador de Golgi (eNOS(1-73)-rGFP), complementado a 1 g con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añaden 2x a 3 ml de HEK293SL (350.000 células/ml). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl ² 1 mM a 37 °C durante 60 minutos. Luego se añadió Prolume Purple™ a una concentración final de 2 pM y se incubó durante 6 minutos. Las células se trataron o no con 1 pM durante el tiempo indicado (figura 24F) o las dosis indicadas (figuras 24E y G) de isoproterenol, durante 4 minutos. Se midió BRE^ta 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar® (Berthold Technologies). Para la figura 24H 200 ng de TPaR, 30 ng de Gaq pos118Rlucll, 100 ng de G^y5 WT, 100 ng de Gp1 WT, 400 ng de rGFP-CAAX o marcador de Golgi (eNOS (1-73)-rGFP), complementado a 1 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añade a 1.2 ml de HEK293SL (350.000 células/ml). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl ² 1 mM a 37 °C durante 60 minutos. Se incubó o no con 100 nM de Ubo-Qic durante 20 minutos. Luego se trataron las células para las dosis indicadas de U46619, durante 6 minutos. Luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 5 minutos adicionales. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies).

Ensayo de activación de RhoA basado en PKN. Para las figuras 25B-D, las células HEK293SL se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 6% (SFB) y 20 pg/ml de gentamicina, a 37 °C. Las células se sembraron a una densidad de 7,5x10⁵células por platos de 100 mm y se transfectaron transitoriamente al día siguiente con construcciones que codifican AT1R (3 pg) junto con PKN-crib-Rlucll (90 ng) y rGFP-CAAX (480 ng) al usar el procedimiento de fosfato de calcio como se describió anteriormente. Después de 24 horas, las células se separaron y se sembraron en placas blancas de 96 pocillos recubiertas con poliornitina a una densidad de 25.000 células por pocillo en el medio. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con el tampón Tyrode y se dejaron en 80 pl del tampón Tyrode a 37 °C. Cuando se indicó, las células se trataron con Ubo-Qic 100 nM durante 30 minutos o toxina C3 para 3 pg/ml (en la figura 25I), 4 horas a 37 °C. La estimulación celular y las mediciones de BRET se realizaron a temperatura ambiente. Las señales BRET se monitorearon mediante la adición de Coel-400a a una concentración final de 5 pM al usar un lector de microplacas Synergy2 (BioTek®). El conjunto de filtros fue de 410 ± 80 nm y 515 ± 30 nm para detectar la emisión de luz de Rlucll Renilla luciferasa (donador) y rGFP (aceptor). Para la figura 25B una mezcla de transfección de 200 ng de TPaR, 20 ng PKN-Rlucll, 600 ng CAAX-rGFP, complementada a 2 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añade a 3 ml de Hek293SL (350.000 células/ml). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl ² 1 mM a 37 °C durante 30 minutos, luego con Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubaron durante 6 minutos. Las células se estimularon durante 2 minutos con las dosis indicadas de U46619. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies) equipado con un conjunto de filtros BRET400-GFP2/10 (filtros de aceptor, 515 ± 20 nm; y donador, 400 ± 70 nm). Para las figuras 25I y J una mezcla de transfección de 200 ng de TPaR, 20 ng PKN-Rlucll, 600 ng CAAX-rGFP, complementada a 2 pg con ADNsc y PEI en una proporción de PEI:ADN de 3:1, se añade a 3 ml de Hek293SL (350.000 células/ml). Las células se sembraron en placas pretratadas con poli-D-lisina. 24 horas después de la transfección, se añadió cuando se indicó el inhibidor de Rho (CT04; Cytoskeleton, Inc), durante la noche a una concentración final de 2 pg/ml. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron previamente en Tyrode CaCl ² 1 mM a 37 °C durante 60 minutos y luego se trató, como se indicó, con 100 nM de U46619 o 1 pg/ml de activador de Rho II (CN03; Cytoskeleton, Inc) durante 1 minuto a 37 °C. Luego se añadió Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM y se incubó durante 5 minutos adicionales. Se midió BRET a 37 °C, al usar un lector de microplacas Tristar (Berthold Technologies).

Unión de [125I]-AngII a la célula intacta. [¹²⁵I]-AngII se preparó con el procedimiento de yodogen, y su radioactividad específica se determinó a partir de experimentos de autodesplazamiento y saturación como se describió previamente (Zimmerman, Beautrait y otros 2012) La densidad de los receptores en la superficie celular se evaluó con ensayos de unión a 4 °C al usar [¹²⁵I]-AngII como trazador. Las células HEK293SL que expresan AT1R o AT1R-Rlucll se sembraron 1 día después de la transfección a una densidad de -120.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos revestidas con poliornitina. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con DMEM precalentado con HEPES 20 mM (DMEM-H) y luego se incubaron en ausencia o presencia de AngII 100 nM en DMEM-H durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron rápidamente tres veces con ácido helado (citrato de sodio 50 mM, pH 4,0) durante 5 minutos cada una en hielo para detener la estimulación y eliminar tanto el ligando AngII unido o no a la superficie restante. Para eliminar y neutralizar el ácido residual, las células se lavaron además dos veces con tampón Tyrode helado. Las células se incubaron con 0,5 ml de [¹²⁵I]-AngII(-250.000 cpm) en el tampón de unión (BSA al 0,2%, Tris 50 mM, NaCh 100 mM, MgCl ² 5 mM, pH 7,4) a 4 °C durante la noche. La unión no específica se determinó en presencia de AngII 1 pM. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con PBS helado con calcio y magnesio, y se añadieron 0,5 ml de NaOH 0,5 N/SDS al 0,05%. La radiactividad se contó al usar un contador ^yautomático PerkinElmer Wizard® 1470. Las cantidades de proteínas se midieron mediante el estuche Bio-rad® Protein Assay de acuerdo con las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Brevemente, las células se trataron igual que antes, excepto la incubación sin AngII radiomarcado, y luego, después del lavado, se añadieron 2 ml del reactivo de ensayo de proteína diluido en lugar de NaOH/SDS. Después de mezclar por pipeteo, las muestras se transfirieron a cubetas de plástico y se midió la absorbancia a 595 nm.

Microscopía confocal. Un día antes de la transfección, las células HEK293SL se sembraron en platos con fondo de vidrio de 35 mm a una densidad de 100.000 células/plato. Las células se transfectaron con B2R-CFP, LYN-rGFP y mCherry-endofinFYVE. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se privaron de suero durante 30 minutos, se dejaron sin tratar (no tratadas) o se trataron con bradiquinina (1 pM) durante 15 minutos. Las muestras se analizaron se analizaron en un microscopio de exploración láser Zeiss LSM-510 Meta al usar láser de argón (514 nm) y láser HeNe I (543 nm), y las imágenes (2048x2048 píxeles) se recogieron al usar una lente de inmersión en aceite 63x. Para detectar CFP y GFP, se utilizaron láseres UV y argón con filtros de excitación de 405 nm y 514 nm, y filtros de emisión BP 420-480 nm o BP 505-550 nm, respectivamente. Para la detección de mCherry, se usó un láser HeNe I con conjuntos de filtros de excitación de 543 nm y de emisión LP 560 nm.

Microscopía BRET/imagenología. Las células HEK293S se cultivaron en DMEM suplementado con SFB al 10%, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 0,1 mg/ml y se sembraron en placas de cultivo de 35 mm con fondo de vidrio revestido con poli-D-lisina a una densidad de 1-2x10⁵células/plato. Al día siguiente, las células se transfectaron con construcciones fusionadas con Rlucll (donador de BRET) y fusionadas con rGFP (aceptor de BRET) al usar reactivo X-treme GENE HP (Roche) al usar 1 pg de ADN y 3 pl de reactivo por plato según el protocolo del fabricante. Para las figuras 26A y 26B (medición del espectro de luminiscencia), las células se transfectaron con 100 g/plato de Rlucll fusionado N-terminalmente a Venus, GFP2 o rGFP. Las células se separan de la superficie de cultivo mediante la adición de 1 ml de PBS suplementado con EDTA 5 mM y se resuspenden a PBS. Como sustrato de luciferasa, se añadió 1 de Prolume purple (Nanolight Technology) y se obtuvo el espectro de luminiscencia con el lector de placas Synergy Neo (BioTek) 2 minutos después de la adición del sustrato. Para la figura 26C (microscopía de luminiscencia), las células se transfectaron con 100 ng/plato de HA-P2AP, 50 ng/plato de parrestina2-Rlucll y 500 ng/plato de rGFp-CAAX. Las células se lavaron una vez con 1 ml de solución salina balanceada de Hank modificada (NaCl 138 mM, KCl 5,33 mM, KH ² PO ⁴ 0,44 mM, Na ² HPO ⁴ 0,33 mM, NaHCO^s4,16 mM, CaCfe 1,0 mM, MgCfe 1,0 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) y se colocaron en el microscopio. Se añadieron 10 ^M de Prolume Purple (NanoLight Technology) al plato. Las imágenes BRET se obtuvieron al usar el microscopio Nikon® Ti-U equipado con un objetivo 60x (Apochromat TIRF, NA 1.49, Nikon) y una cámara de imágenes (PIXIS1024, Princeton instruments) con cambiador de filtro (Lambda 10-2, Sutter instrument). Inmediatamente después de la adición de coelenterazina, se cerró el obturador de la cámara y se adquirió una imagen en blanco durante 90 segundos. Luego se adquirieron imágenes con los filtros correspondientes a la longitud de onda del donador de BRET (410/80 nm) y del aceptor de BRET (480LP o 510/40 nm) durante 90 segundos cada uno. Las imágenes se capturaron cada 5 minutos, y los valores de la imagen en blanco se restaron de los píxeles correspondientes de las imágenes del donador y del aceptor de BRET para eliminar los recuentos de fotones derivados de la corriente oscura y los ruidos de muestreo de la cámara. Para cada punto de tiempo, se generaron imágenes de relación BRET al usar funciones aritméticas de píxeles del software MetaMorph versión 7.8 (Molecular Devices) de la siguiente manera; tono de píxel: El nivel de b ReT calculado al dividir los recuentos de imágenes del aceptor con imágenes del donador, y se asigna al tono de arcoíris predeterminado (el más bajo (típicamente 0,0) en púrpura y el más alto (típicamente 2,0) en rojo). Brillo de píxeles: el valor de las imágenes del donador con brillo automático.

Determinación de factores Z. Los ensayos BRET1 y BRET2 se realizaron en células cotransfectadas con la construcción rGFP-CAAX y la construcción hMC4R wt-Rlucll o hMC4R (R165Q)-Rlucll (como se indica en las figuras 15A a 15D), con la mitad de la placa de 96 pocillos tratada con la chaperona farmacológica (DCPMP 10 ^M) y la segunda mitad de la placa tratada con el vehículo correspondiente (DMSO). Los valores del factor Z se calcularon según lo descrito por Zhang y otros (Zhang, Chung y otros 1999). Un factor Z superior a 0,4 se considera un ensayo robusto.

Evaluación de la resistencia a DMSO. Los ligandos y las bibliotecas de compuestos a menudo se disuelven en DMSO. Para evaluar si el ensayo basado en BRET para la evaluación de la superficie celulares sensible a las concentraciones de DMSO generalmente alcanzadas con las curvas de dosis-respuesta de los ligandos seleccionados a partir de una biblioteca de compuestos, las células transfectadas se trataron con DCPMP a 10 ^M o con vehículo (DMSO) en un pozo que contiene diferentes concentraciones de DMSO, como se indica en la figura 16. Los valores de BRET se obtuvieron como se describió previamente.

Análisis de datos. La estimación de los valores de t ^1/2 y la CE ⁵⁰ para la endocitosis mediada por ligando se calcularon al usar el programa de ajuste de curvas GraphPad® Prism. Las curvas presentadas a lo largo de este estudio representan los mejores ajustes, y se generaron al usar este programa GraphPad® Prism también.

Secuencias: Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos y construcciones usadas en la presente memoria se representan a continuación.

Rlucll

MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVV

PHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSY

EHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEF

AAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNA

IVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ (SEQ ID NO:10)

rGFP: Proteína verde fluorescente Renilla reniformis

MDLAKLGLKEVMPTKINLEGLVGDHAFSMEGVGEGNILEGTQEVKISVTKGAPLPFAFDIVSVAFSY

GNRAYTGYPEEISDYFLQSFPEGFTYERNIRYQDGGTAIVKSDISLEDGKFIVNVDFKAKDLRRMG

PVMQQDIVGMQPSYESMYTNVTSVIGECIIAFKLQTGKHFTYHMRTVYKSKKPVETMPLYHFIQHR

LVKTNVDTASGYVVQHETAIAAHSTIKKIEGSLP (SEQ ID NO:11)

GFP10

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLS

YGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDF

KEDGNILGHKLEYNYNPHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLP

DNHYLFTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK (SEQ ID NO:12)

hMC4R WT: receptor de melanocortina 4 humana salvaje de tipo salvaje

MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVI

VAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLA

SICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKRVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALM

ASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYC

VCFMSHFNLYLILIMCNSIIDPLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRY (SEQ ID NO:13)

hMC4R (R165Q): mutante R165Q-hMC4R, retenido intracelularmente y rescatable por PC

MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVI

VAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLA

SICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKQVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALM

ASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYC

VCFMSHFNLYLILIMCNSIIDPLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRY (SEQ ID NO:14)

hMC4R (P299H): mutante P299H-hMC4R, retenido intracelularmente y en su mayoría no rescatable por PC

MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVI

VAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLA

SICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKRVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALM

ASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYC

VCFMSHFNLYLILIMCNSIIDHLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRY (SEQ ID NO:15)

hV2R WT: receptor de vasopresina 2 humana de tipo salvaje

MLMASTTSAVPGHPSLPSLPSNSSQERPLDTRDPLLARAELALLSIVFVAVALSNGLVLAALARRG

RRGHWAPIHVFIGHLCLADLAVALFQVLPQLAWKATDRFRGPDALCRAVKYLQMVGMYASSYMIL

AMTLDRHRAICRPMLAYRHGSGAHWNRPVLVAWAFSLLLSLPQLFIFAQRNVEGGSGVTDCWAC

FAEPWGRRTYVTWIALMVFVAPTLGIAACQVLIFREIHASLVPGPSERPGGRRRGRRTGSPGEGA

HVSAAVAKTVRMTLVIVVVYVLCWAPFFLVQLWAAWDPEAPLEGAPFVLLMLLASLNSCTNPWIY

ASFSSSVSSELRSLLCCARGRTPPSLGPQDESCTTASSSLAKDTSS (SEQ ID NO:16)

hV2R (Y128S): mutante Y128S-hV2R, retenido intracelularmente y rescatable por PC

MLMASTTSAVPGHPSLPSLPSNSSQERPLDTRDPLLARAELALLSIVFVAVALSNGLVLAALARRG

RRGHWAPIHVFIGHLCLADLAVALFQVLPQLAWKATDRFRGPDALCRAVKYLQMVGMYASSSMIL

AMTLDRHRAICRPMLAYRHGSGAHWNRPVLVAWAFSLLLSLPQLFIFAQRNVEGGSGVTDCWAC

FAEPWGRRTYVTWIALMVFVAPTLGIAACQVLIFREIHASLVPGPSERPGGRRRGRRTGSPGEGA

HVSAAVAKTVRMTLVIWVYVLCWAPFFLVQLWAAWDPEAPLEGAPFVLLMLLASLNSCTNPWIY

ASFSSSVSSELRSLLCCARGRTPPSLGPQDESCTTASSSLAKDTSS (SEQ ID NO:17)

hERG WT: canal de potasio dependiente de voltaje H2 humano de tipo salvaje

MPVRRGHVAPQNTFLDTIIRKFEGQSRKFIIANARVENCAVIYCNDGFCELCGYSRAEVMQRPCTC

DFLHGPRTQRRAAAQIAQALLGAEERKVEIAFYRKDGSCFLCLVDVVPVKNEDGAVIMFILNFEVV

MEKDMVGSPAHDTNHRGPPTSWLAPGRAKTFRLKLPALLALTARESSVRSGGAGGAGAPGAVV

VDVDLTPAAPSSESLALDEVTAMDNHVAGLGPAEERRALVGPGSPPRSAPGQLPSPRAHSLNPD

ASGSSCSLARTRSRESCASVRRASSADDIEAMRAGVLPPPPRHASTGAMHPLRSGLLNSTSDSD

LVRYRTISKIPQITLNFVDLKGDPFLASPTSDREIIAPKIKERTHNVTEKVTQVLSLGADVLPEYKLQA

PRIHRWTILHYSPFKAVWDWLILLLVIYTAVFTPYSAAFLLKETEEGPPATECGYACQPLAVVDLIVD

IMFIVDILINFRTTYVNANEEVVSHPGRIAVHYFKGWFLIDMVAAIPFDLLIFGSGSEELIGLLKTARLL

RLVRVARKLDRYSEYGAAVLFLLMCTFALIAHWLACIWYAIGNMEQPHMDSRIGWLHNLGDQIGK

PYNSSGLGGPSIKDKYVTALYFTFSSLTSVGFGNVSPNTNSEKIFSICVMLIGSLMYASIFGNVSAII

QRLYSGTARYHTQMLRVREFIRFHQIPNPLRQRLEEYFQHAWSYTNGIDMNAVLKGFPECLQADI

CLHLNRSLLQHCKPFRGATKGCLRALAMKFKTTHAPPGDTLVHAGDLLTALYFISRGSIEILRGDVV

VAILGKNDIFGEPLNLYARPGKSNGDVRALTYCDLHKIHRDDLLEVLDMYPEFSDHFWSSLEITFNL

RDTNMIPGSPGSTELEGGFSRQRKRKLSFRRRTDKDTEQPGEVSALGPGRAGAGPSSRGRPGG

PWGESPSSGPSSPESSEDEGPGRSSSPLRLVPFSSPRPPGEPPGGEPLMEDCEKSSDTCNPLS

GAFSGVSNIFSFWGDSRGRQYQELPRCPAPTPSLLNIPLSSPGRRPRGDVESRLDALQRQLNRLE

TRLSADMATVLQLLQRQMTLVPPAYSAVTTPGPGPTSTSPLLPVSPLPTLTLDSLSQVSQFMACEE

LPPGAPELPQEGPTRRLSLPGQLGALTSQPLHRHGSDPGS (SEQ ID NO:18)

hERG (G601S): mutante G601S-hERG, retenido intracelularmente y rescatable por PC

MPVRRGHVAPQNTFLDTIIRKFEGQSRKFIIANARVENCAVIYCNDGFCELCGYSRAEVMQRPCTC

DFLHGPRTQRRAAAQIAQALLGAEERKVEIAFYRKDGSCFLCLVDVVPVKNEDGAVIMFILNFEVV

MEKDMVGSPAHDTNHRGPPTSWLAPGRAKTFRLKLPALLALTARESSVRSGGAGGAGAPGAVV

VDVDLTPAAPSSESLALDEVTAMDNHVAGLGPAEERRALVGPGSPPRSAPGQLPSPRAHSLNPD

ASGSSCSLARTRSRESCASVRRASSADDIEAMRAGVLPPPPRHASTGAMHPLRSGLLNSTSDSD

LVRYRTISKIPQITLNFVDLKGDPFLASPTSDREIIAPKIKERTHNVTEKVTQVLSLGADVLPEYKLQA

PRIHRWTILHYSPFKAVWDWLILLLVIYTAVFTPYSAAFLLKETEEGPPATECGYACQPLAVVDLIVD

IMFIVDILINFRTTYVNANEEVVSHPGRIAVHYFKGWFLIDMVAAIPFDLLIFGSGSEELIGLLKTARLL

RLVRVARKLDRYSEYGAAVLFLLMCTFALIAHWLACIWYAIGNMEQPHMDSRIGWLHNLGDQIGK

PYNSSSLGGPSIKDKYVTALYFTFSSLTSVGFGNVSPNTNSEKIFSICVMLIGSLMYASIFGNVSAIIQ

RLYSGTARYHTQMLRVREFIRFHQIPNPLRQRLEEYFQHAWSYTNGIDMNAVLKGFPECLQADICL

HLNRSLLQHCKPFRGATKGCLRALAMKFKTTHAPPGDTLVHAGDLLTALYFISRGSIEILRGDVVVA

ILGKNDIFGEPLNLYARPGKSNGDVRALTYCDLHKIHRDDLLEVLDMYPEFSDHFWSSLEITFNLRD

TNMIPGSPGSTELEGGFSRQRKRKLSFRRRTDKDTEQPGEVSALGPGRAGAGPSSRGRPGGPW

GESPSSGPSSPESSEDEGPGRSSSPLRLVPFSSPRPPGEPPGGEPLMEDCEKSSDTCNPLSGAF

SGVSNIFSFWGDSRGRQYQELPRCPAPTPSLLNIPLSSPGRRPRGDVESRLDALQRQLNRLETRL

SADMATVLQLLQRQMTLVPPAYSAVTTPGPGPTSTSPLLPVSPLPTLTLDSLSQVSQFMACEELPP

GAPELPQEGPTRRLSLPGQLGALTSQPLHRHGSDPGS (SEQ ID NO:19)

Lyn: secuencia señal de palmitoilación y miristoilación de la Lyn quinasa

MGCIKSKGKDS (SEQ ID No:1)

CAAX-Kras: secuencia polibásica dirigida a la membrana plasmática y secuencia señal de prenilación a partir de la variante b de empalme kRas

GKKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID No:7)

PB: secuencia polibásica dirigida a la membrana plasmática del GRK5 humano SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS (SEQ ID No:8)

dominio FYVE de endofina

QKQPTWVPDSEAPNCMNCQVKFTFTKRRHHCRACGKVFCGVCCNRKCKLQYLEKEARVCVVCY

ETISK (SEQ ID NO:20)

Rab4

MSETYDFLFKFLVIGNAGTGKSCLLHQFIEKKFKDDSNHTIGVEFGSKIINVGGKYVKLQIWDTAGQ

ERFRSVTRSYYRGAAGALLVYDITSRETYNALTNWLTDARMLASQNIVIILCGNKKDLDADREVTFL

EASRFAQENELMFLETSALTGENVEEAFVQCARKILNKIESGELDPERMGSGIQYGDAALRQLRSP

RRAQAPNAQECGC (SEQ ID NO:21)

Rab11

MGTRDDEYDYLFKVVLIGDSGVGKSNLLSRFTRNEFNLESKSTIGVEFATRSIQVDGKTIKAQIWDT

AGQERYRAITSAYYRGAVGALLVYDIAKHLTYENVERWLKELRDHADSNIVIMLVGNKSDLRHLRA

VPTDEARAFAEKNGLSFIETSALDSTNVEAAFQTILTEIYRIVSQKQMSDRRENDMSPSNNVVPIHV

PPTTENKPKVQCCQNI (SEQ ID NO:22)

péptido señal-Flag-AT1 R humano (spFlag-AT1R)

MKTIIALSYIFCLVFADYKDDDDAMILNSSTEDGIKRIQDDCPKAGRHNYIFVMIPTLYSIIFVVGIFGN

SLVVIVIYFYMKLKTVASVFLLNLALADLCFLLTLPLWAVYTAMEYRWPFGNYLCKIASASVSFNLYA

SVFLLTCLSIDRYLAIVHPMKSRLRRTMLVAKVTCIIIWLLAGLASLPAIIHRNVFFIENTNITVCAFHYE

SQNSTLPIGLGLTKNILGFLFPFLIILTSYTLIWKALKKAYEIQKNKPRNDDIFKIIMAIVLFFFFSWIPHQ

IFTFLDVLIQLGIIRDCRIADIVDTAMPITICIAYFNNCLNPLFYGFLGKKFKRYFLQLLKYIPPKAKSHS

NLSTKMSTLSYRPSDNVSSSTKKPAPCFEVE (SEQ ID NO:23)

hGRB2 v1; variante 1 GRB2 humana

MEAIAKYDFKATADDELSFKRGDILKVLNEECDQNWYKAELNGKDGFIPKNYIEMKPHPFGNDVQ

HFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIEQVPQQPTYVQALFDFDPQE

DGELGFRRGDFIHVMDNSDPNWWKGACHGQTGMFPRNYVTPVNRNV (SEQ ID NO:24)

dominio PH de PLC51

DSGRDFLTLHGLQDDEDLQALLKGSQLLKVKSSSWRRERFYKLQEDCKTIWQESRKVMRTPESQ

LFSIEDIQEVRMGHRTEGLEKFARDVPEDRCFSIVFKDQRNTLDLIAPSPADAQHWVLGLHKIIHHS

GSMDQRQKLQHWIHSCLRKADKNKDNKMSFKELQNFLKELNI (SEQ ID NO:25)

marca HA

MYPYDVPDYA (SEQ ID No:26)

Residuos 1-73 de eNOS1 humana

MGNLKSVAQEPGPPCGLGLGLGLGLCGKQGPATPAPEPSRAPASLLPPAPEHSPPSSPLTQPPE

GPKFPRVKN (SEQ ID NO:42)

Calveolina1a

MSGGKYVDSEGHLYTVPIREQGNIYKPNNKAMADELSEKQVYDAHTKEIDLVNRDPKHLNDDVVK

IDFEDVIAEPEGTHSFDGIWKASFTTFTVTKYWFYRLLSALFGIPMALIWGIYFAILSFLHIWAVVPCI

KSFLIEIQCISRVYSIYVHTVCDPLFEAVGKIFSNVRINLQKEI (SEQ ID NO:44)

Enlazador1: Secuencia enlazadora entre el hMC4R y Rlucll

VGGGGSKLPAT (SEQ ID No:2)

Enlazador2: Secuencia enlazadora entre el hV2R y Rlucll

GGSGLKLPAT (SEQ ID No:3)

Enlazador3: Secuencia enlazadora en el N-terminal de Rlucll, que sigue al residuo 379 de hERG

NAAIRSGG (SEQ ID No:4)

Enlazador4: Secuencia enlazadora en el N-terminal de Rlucll, que precede al residuo 373 de hERG GGNAAIRS (SEQ ID No:5)

Enlazador5: Enlazador entre la secuencia de direccionamiento a la membrana plasmática de Lyn (Lyn) y rGFP LSNAT (SEQ ID No:27)

Enlazador6: Enlazador entre rGFP y secuencia polibásica/prenilación a partir de kRAS (CAAX) GSAGTMASNNTASG (SEQ ID No:28)

Enlazador7: Enlazador entre rGFP y secuencia polibásica a partir de GRK5 (PB):

GGSGLKLPAT (SEQ ID No:3)

Enlazador8: Enlazador entre rGFP y secuencia palmitoilación/prenilación a partir de hRAS (CAAX) y hRAS/Ral1 (CAAX=CCIL), entre rGFP y Caveolinala, y entre Rlucll y GRB2:

GSAGT (SEQ ID No:9)

Enlazador9: Enlazador entre la secuencia de direccionamiento a Golgi eNOS (1-73) y rGFP

GSNAT (SEQ ID No:41)

Enlazador10: entre (i) rGFP y (ii) el dominio FYVE de endofina, Rab4 o Rab11

GSGGSGSGGLE (SEQ ID No:29)

Enlazador11: entre spFlag-AT1R y Rlucll

GGSGGKLPAT (SEQ ID No:30)

Enlazador12: entre Rlucll y el dominio PH de PLC51

GNASGTGSGGSGSGGLEM (SEQ ID No:31)

Enlazador13: entre rGFP y el dominio PH de PLC51

GSGGSGSGGLE (SEQ ID No:29)

Enlazador14: entre la marca HA y Rlucll

SNAKL (SEQ ID No:32)

hV2R (W164S): mutante W164S-hV2R, retenido intracelularmente y rescatable por PC

MLMASTTSAVPGHPSLPSLPSNSSQERPLDTRDPLLARAELALLSIVFVAVALSNGLVLAALARRG

RRGHWAPIHVFIGHLCLADLAVALFQVLPQLAWKATDRFRGPDALCRAVKYLQMVGMYASSYMIL

AMTLDRHRAICRPMLAYRHGSGAHWNRPVLVASAFSLLLSLPQLFIFAQRNVEGGSGVTDCWAC

FAEPWGRRTYVTWIALMVFVAPTLGIAACQVLIFREIHASLVPGPSERPGGRRRGRRTGSPGEGA

HVSAAVAKTVRMTLVIVVVYVLCWAPFFLVQLWAAWDPEAPLEGAPFVLLMLLASLNSCTNPWIY

ASFSSSVSSELRSLLCCARGRTPPSLGPQDESCTTASSSLAKDTSS (SEQ ID NO:46).

CAAX (Hras): secuencia de palmitoilación dirigida a la membrana plasmática y secuencia señal de prenilación a partir de hRas

CMSCKCVLS (SEQ ID No:47)

CAAX (CCIL): secuencia de palmitoilación dirigida a la membrana plasmática a partir de hRas y secuencia señal de prenilación a partir de Ral1

CMSCKCCIL (SEQ ID No: 43)

Receptor de melanocortina 4 mutante hMC4R N62S, retenido intracelularmente y rescatable por PC

MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLESILVI

VAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLA

SICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKRVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALM

ASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYC

VCFMSHFNLYLILIMCNSIIDPLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRY (SEQ ID NO:48)

Receptor de melanocortina 4 mutante hMC4R R165W, retenido intracelularmente y rescatable por PC

MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVI

VAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLA

SICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKWVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLAL

MASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNP

YCVCFMSHFNLYLILIMCNSIIDPLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRY (SEQ ID NO:49) Sensor DAG unimolecular

MGCIKSKGKDSLSNAMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT GKLPVPWPTLVTTLSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKF EGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNPHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADH

YQQNTPIGDGPVLLPDNHYLFTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGTGTAAKE

GEKQKGAMQPSEQQRGKEAQKEKNGKEPNPRPEQPKPAKVEQQEDEPEERPKREPMQLEPAE

SAKQGRNLPQKVEQGEERPQEADMPGQAQSAMRPQLSNSEEGPARGKPAPEEPDEQLGEPEE

AQGEHADEPAPSKPSEKHMVPQMAEPEKGEEAREPQGAEDKPAPVHKPKKEEPQRPNEEKAPK

PKGRHVGRQENDDSAGKPEPGRPDRKGKEKEPEEEPAQGHSLPQEPEPMPRPKPEVRKKPHP

GASPHQVSDVEDAKGPERKVNPMEGEESAKQAQQEGPAENDEAERPERPASGGAREAMTSKV

YDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEP

VARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQD

KIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYL

EPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEG

AKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQGSGSGFNIDMPHRFKVHNYMSP

TFCDHCGSLLWGLVKQGLKCEDCGMNVHHKCREKVANLCG(SEQ ID NO:50)

Sensor Barrestinal unimolecular

MGCIKSKGKDSLSNAMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT

GKLPVPWPTLVTTLSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKF

EGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNPHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADH

YQQNTPIGDGPVLLPDNHYLFTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGTGTAAKE

GEKQKGAMQPSEQQRGKEAQKEKNGKEPNPRPEQPKPAKVEQQEDEPEERPKREPMQLEPAE

SAKQGRNLPQKVEQGEERPQEADMPGQAQSAMRPQLSNSEEGPARGKPAPEEPDEQLGEPEE

AQGEHADEPAPSKPSEKHMVPQMAEPEKGEEAREPQGAEDKPAPVHKPKKEEPQRPNEEKAPK

PKGRHVGRQENDDSAGKPEPGRPDRKGKEKEPEEEPAQGHSLPQEPEPMPRPKPEVRKKPHP

GASPHQVSDVEDAKGPERKVNPMEGEESAKQAQQEGPAENDEAERPERPASGGAREAMTSKV

YDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEP

VARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQD

KIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYL

EPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEG

AKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQGSGSAGTAGDKGTRVFKKASPN

GKLTVYLGKRDFVDHIDLVDPVDGVVLVDPEYLKERRVYVTLTCAFRYGREDLDVLGLTFRKDLFV

ANVQSFPPAPEDKKPLTRLQERLIKKLGEHAYPFTFEIPPNLPCSVTLQPGPEDTGKACGVDYEVK

AFCAENLEEKIHKRNSVRLVIRKVQYAPERPGPQPTAETTRQFLMSDKPLHLEASLDKEIYYHGEPI

SVNVHVTNNTNKTVKKIKISVRQYADICLFNTAQYKCPVAMEEADDTVAPSSTFCKVYTLTPFLANN

REKRGLALDGKLKHEDTNLASSTLLREGANREILGIIVSYKVKVKLVVSRGGLLGDLASSDVAVELP

FTLMHPKPKEEPPHREVPENETPVDTNLIELDTNDDDIVFEDFARQRLKGMKDDKEEEEDGTGSP

QLNNR (SEQ ID NO:51)

Sensor 3arrestina2 unimolecular

MGCIKSKGKDSLSNAMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTT

GKLPVPWPTLVTTLSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKF

EGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNPHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADH

YQQNTPIGDGPVLLPDNHYLFTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGTGTAAKE

GEKQKGAMQPSEQQRGKEAQKEKNGKEPNPRPEQPKPAKVEQQEDEPEERPKREPMQLEPAE

SAKQGRNLPQKVEQGEERPQEADMPGQAQSAMRPQLSNSEEGPARGKPAPEEPDEQLGEPEE

AQGEHADEPAPSKPSEKHMVPQMAEPEKGEEAREPQGAEDKPAPVHKPKKEEPQRPNEEKAPK

PKGRHVGRQENDDSAGKPEPGRPDRKGKEKEPEEEPAQGHSLPQEPEPMPRPKPEVRKKPHP

GASPHQVSDVEDAKGPERKVNPMEGEESAKQAQQEGPAENDEAERPERPASGGAREAMTSKV

YDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEP

VARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQD

KIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYL

EPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEG

AKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQGSGSAGTAGEKPGTRVFKKSSP

NCKLTVYLGKRDFVDHLDKVDPVDGVVLVDPDYLKDRKVFVTLTCAFRYGREDLDVLGLSFRKDL

FIATYQAFPPVPNPPRPPTRLQDRLLRKLGQHAHPFFFTIPQNLPCSVTLQPGPEDTGKACGVDFE

IRAFCAKSLEEKSHKRNSVRLVIRKVQFAPEKPGPQPSAETTRHFLMSDRSLHLEASLDKELYYHG

EPLNVNVHVTNNSTKTVKKIKVSVRQYADICLFSTAQYKCPVAQLEQDDQVSPSSTFCKVYTITPLL

SDNREKRGLALDGKLKHEDTNLASSTIVKEGANKEVLGILVSYRVKVKLVVSRGGDVSVELPFVLM

HPKPHDHIPLPRPQSAAPETDVPVDTNLIEFDTNYATDDDIVFEDFARLRLKGMKDDDYDDQLC(S

EQ ID NO:52)

Subunidad Ga12 humana con un Rlucll insertado en la posición 84:

MSGVVRTLSRCLLPAEAGGARERRAGSGARDAEREARRRSRDIDALLARERRAVRRLVKILLLGA

GESGKSTFLKQMRIIHGREGSGGGGSMTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYY

DSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTA

WFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEG

EKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIV

RNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFV

ERVLKNEQSGGGGSGTFDQKALLEFRDTIFDNILKGSRVLVDARDKLGIPWQYSENEEHGMFLMA

FENKAGLPVEPATFQLYVPALSALWRDSGIREAFSRRSEFQLGESVKYFLDNLDRIGQLEYMPTE

QDILLARKATKGIVEHDFVIKKIPFKMVDVGGQRSQRQKWFQCFDGITSILFMVSSSEYDQVLMED

RRTNRLVESMNIFETIVNNKLFFNVSIILFLNKMDLLVEKVKTVSIKKHFPDFRGDPHRLEDVQRYLV

QCFDRKRRNRSKPLFHHFTTAIDTENVRFVFHAVKDTILQENLKDIMLQ (SEQ ID NO:53)

Subunidad Gag humana con un Rlucll insertado en la posición 118:

MTLESIMACCLSEEAKEARRINDEIERQLRRDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGSGY

SDEDKRGFTKLVYQNIFTAMQAMIRAMDTLKIPYKYEHNKAHAQLVREVDVNAAIRSTRMTSKVYD

PEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVA

RCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQDKIK

AIVHAESWDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPF

KEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDWQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKK

FPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQCTNAAIRSEKVSAFENPYVDAIKSLWN

DPGIQECYDRRREYQLSDSTKYYLNDLDRVADPAYLPTQQDVLRVRVPTTGIIEYPFDLQSVIFRM

VDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIMFLVALSEYDQVLVESDNENRMEESKALFRTIITYPWFQNSS

VILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAQAAREFILKMFVDLNPDSDKIIYSHFTCATDTEN

IRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLV (SEQ ID NO:54)

Subunidad GaS humana con un Rlucll insertado en la posición 67:

MGCLGNSKTEDQRNEEKAQREANKKIEKQLQKDKQVYRATHRLLLLGAGESGKSTIVKQMRILHV

NGSGGGGSMTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAT

SSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWG

AALAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKI

MRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIE

SDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQSGGGGSFNGE

GGEEDPQAARSNSDGEKATKVQDIKNNLKEAIETIVAAMSNLVPPVELANPENQFRVDYILSVMNV

PDFDFPPEFYEHAKALWEDEGVRACYERSNEYQLIDCAQYFLDKIDVIKQADYVPSDQDLLRCRVL

TSGIFETKFQVDKVNFHMFDVGGQRDERRKWIQCFNDVTAIIFVVASSSYNMVIREDNQTNRLQE

ALNLFKSIWNNRWLRTISVILFLNKQDLLAEKVLAGKSKIEDYFPEFARYTTPEDATPEPGEDPRVT

RAKYFIRDEFLRISTASGDGRHYCYPHFTCAVDTENIRRVFNDCRDIIQRMHLRQYELL (SEQ ID

NO:55)

subunidad GB1 humana

MSELDQLRQEAEQLKNQIRDARKACADATLSQITNNIDPVGRIQMRTRRTLRGHLAKIYAMHWGT

DSRLLVSASQDGKLIIWDSYTTNKVHAIPLRSSWVMTCAYAPSGNYVACGGLDNICSIYNLKTREG

NVRVSRELAGHTGYLSCCRFLDDNQIVTSSGDTTCALWDIETGQQTTTFTGHTGDVMSLSLAPDT

RLFVSGACDASAKLWDVREGMCRQTFTGHESDINAICFFPNGNAFATGSDDATCRLFDLRADQEL

MTYSHDNIICGITSVSFSKSGRLLLAGYDDFNCNVWDALKADRAGVLAGHDNRVSCLGVTDDGMA

VATGSWDSFLKIWN (SEQ ID NO:56)

subunidad Gv1 humana

MPVINIEDLTEKDKLKMEVDQLKKEVTLERMLVSKCCEEVRDYVEERSGEDPLVKGIPEDKNPFKE

LKGGCVIS (SEQ ID NO:57)

subunidad Gv2 humana

MASNNTASIAQARKLVEQLKMEANIDRIKVSKAAADLMAYCEAHAKEDPLLTPVPASENPFREKKF

FCAIL (SEQ ID NO:58)

subunidad Gv3 humana

MKGETPVNSTMSIGQARKMVEQLKIEASLCRIKVSKAAADLMTYCDAHACEDPLITPVPTSENPFR

EKKFFCALL (SEQ ID NO:59)

subunidad Gv4 humana

MKEGMSNNSTTSISQARKAVEQLKMEACMDRVKVSQAAADLLAYCEAHVREDPLIIPVPASENPF

REKKFFCTIL (SEQ ID NO:60)

subunidad Gv5 humana

MSGSSSVAAMKKVVQQLRLEAGLNRVKVSQAAADLKQFCLQNAQHDPLLTGVSSSTNPFRPQKV

CSFL (SEQ ID N0:61)

subunidad Gv7 humana

MSATNNIAQARKLVEQLRIEAGIERIKVSKAASDLMSYCEQHARNDPLLVGVPASENPFKDKKPCII

L (SEQ ID NO:62)

subunidad Gv⁸humana

MSNNMAKIAEARKTVEQLKLEVNIDRMKVSQAAAELLAFCETHAKDDPLVTPVPAAENPFRDKRLF

CVLL (SEQ ID NO:63)

subunidad Gv9 humana

MAQDLSEKDLLKMEVEQLKKEVKNTRIPISKAGKEIKEYVEAQAGNDPFLKGIPEDKNPFKEKGGC

LIS (SEQ ID NO:64)

subunidad Gv10 humana

MSSGASASALQRLVEQLKLEAGVERIKVSQAAAELQQYCMQNACKDALLVGVPAGSNPFREPRS

CALL (SEQ ID NO:65)

subunidad Gv11 humana

MPALHIEDLPEKEKLKMEVEQLRKEVKLQRQQVSKCSEEIKNYIEERSGEDPLVKGIPEDKNPFKE

KGSCVIS (SEQ ID NO:66)

subunidad Gv12 humana

MSSKTASTNNIAQARRTVQQLRLEASIERIKVSKASADLMSYCEEHARSDPLLIGIPTSENPFKDKK

TCIIL (SEQ ID NO:67)

subunidad Gv13 humana

MEEWDVPQMKKEVESLKYQLAFQREMASKTIPELLKWIEDGIPKDPFLNPDLMKNNPWVEKGKC

TIL (SEQ ID NO:68)

subunidad Ga15 humana

MARSLTWRCCPWCLTEDEKAAARVDQEINRILLEQKKQDRGELKLLLLGPGESGKSTFIKQMRIIH

GAGYSEEERKGFRPLVYQNIFVSMRAMIEAMERLQIPFSRPESKHHASLVMSQDPYKVTTFEKRY

AAAMQWLWRDAGIRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITEEGYVPTAQDVLRSRMPTTGINEYC

FSVQKTNLRIVDVGGQKSERKKWIHCFENVIALIYLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALFGTILE

LPWFKSTSVILFLNKTDILEEKIPTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGS

KKGARSRRLFSHYTCATDTQNIRKVFKDVRDSVLARYLDEINLL (SEQ ID NO:69)

Dominio de unión a Rho (CRIB) de la proteína quinasa 1 humana (PKN)

VQSEPRSWSLLEQLGLAGADLAAPGVQQQLELERERLRREIRKELKLKEGAENLRRATTDLGRSL GPVELLLRGSSRRLDLLHQQLQE (SEQ ID NQ:70)

Enlazador entre Rlucll y el dominio de unión a Rho de PKN1

GSASAGTATMASDA (SEQ ID No:71)

Dominio de unión a DAG C1b del PK¿5 humana FNIDMPHRFKVHNYMSPTFCDHCGSLLWGLVKQGLKCEDCGMNVHHKCREKVANLCG (SEQ ID No:72) Receptor adrenérgico 31 humano (31AR)

MGAGVLVLGASEPGNLSSAAPLPDGAATAARLLVPASPPASLLPPASESPEPLSQQWTAGMGLL

MALIVLLIVAGNVLVIVAIAKTPRLQTLTNLFIMSLASADLVMGLLVVPFGATIVVWGRWEYGSFFCE

LWTSVDVLCVTASIETLCVIALDRYLAITSPFRYQSLLTRARARGLVCTVWAISALVSFLPILMHWW

RAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRAYAIASSVVSFYVPLCIMAFVYLRVFREAQKQVKKIDSCERRF

LGGPARPPSPSPSPVPAPAPPPGPPRPAAAAATAPLANGRAGKRRPSRLVALREQKALKTLGIIM

GVFTLCWLPFFLANVVKAFHRELVPDRLFVFFNWLGYANSAFNPIIYCRSPDFRKAFQGLLCCARR

AARRRHATHGDRPRASGCLARPGPPPSPGAASDDDDDDVVGATPPARLLEPWAGCNGGAAAD

SDSSLDEPCRPGFASESKV (SEQ ID NO:73)

Receptor adrenérgico 32 humano (32AR)

MGQPGNGSAFLLAPNRSHAPDHDVTQQRDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQT

VTNYFITSLACADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTFGNFWCEFWTSIDVLCVTASIETLCVIAVDRYF

AITSPFKYQSLLTKNKARVIILMVWIVSGLTSFLPIQMHWYRATHQEAINCYANETCCDFFTNQAYAI

ASSIVSFYVPLVIMVFVYSRVFQEAKRQLQKIDKSEGRFHVQNLSQVEQDGRTGHGLRRSSKFCL

KEHKALKTLGIIMGTFTLCWLPFFIVNIVHVIQDNLIRKEVYILLNWIGYVNSGFNPLIYCRSPDFRIAF

QELLCLRRSSLKAYGNGYSSNGNTGEQSGYHVEQEKENKLLCEDLPGTEDFVGHQGTVPSDNID

SQGRNCSTNDSLL (SEQ ID NO:74)

Isoforma a del receptor de prostaglandina 2a humana (FP)

MSMNNSKQLVSPAAALLSNTTCQTENRLSVFFSVIFMTVGILSNSLAIAILMKAYQRFRQKSKASFL

LLASGLVITDFFGHLINGAIAVFVYASDKEWIRFDQSNVLCSIFGICMVFSGLCPLLLGSVMAIERCIG

VTKPIFHSTKITSKHVKMMLSGVCLFAVFIALLPILGHRDYKIQASRTWCFYNTEDIKDWEDRFYLLL

FSFLGLLALGVSLLCNAITGITLLRVKFKSQQHRQGRSHHLEMVIQLLAIMCVSCICWSPFLVTMANI

GINGNHSLETCETTLFALRMATWNQILDPWVYILLRKAVLKNLYKLASQCCGVHVISLHIWELSSIK

NSLKVAAISESPVAEKSAST (SEQ ID NO:75)

Isoforma a del receptor de tromboxano A2 humano (TPaR)

MWPNGSSLGPCFRPTNITLEERRLIASPWFAASFCVVGLASNLLALSVLAGARQGGSHTRSSFLT

FLCGLVLTDFLGLLVTGTIVVSQHAALFEWHAVDPGCRLCRFMGVVMIFFGLSPLLLGAAMASERY

LGITRPFSRPAVASQRRAWATVGLVWAAALALGLLPLLGVGRYTVQYPGSWCFLTLGAESGDVAF

GLLFSMLGGLSVGLSFLLNTVSVATLCHVYHGQEAAQQRPRDSEVEMMAQLLGIMVVASVCWLP

LLVFIAQTVLRNPPAMSPAGQLSRTTEKELLIYLRVATWNQILDPWVYILFRRAVLRRLQPRLSTRP

RSLSLQPQLTQRSGLQ (SEQ ID NO:76)

Receptor de urotensina II humana (GPR14)

MALTPESPSSFPGLAATGSSVPEPPGGPNATLNSSWASPTEPSSLEDLVATGTIGTLLSAMGVVG

VVGNAYTLVVTCRSLRAVASMYVYVVNLALADLLYLLSIPFIVATYVTKEWHFGDVGCRVLFGLDFL

TMHASIFTLTVMSSERYAAVLRPLDTVQRPKGYRKLLALGTWLLALLLTLPVMLAMRLVRRGPKSL

CLPAWGPRAHRAYLTLLFATSIAGPGLLIGLLYARLARAYRRSQRASFKRARRPGARALRLVLGIVL

LFWACFLPFWLWQLLAQYHQAPLAPRTARIVNYLTTCLTYGNSCANPFLYTLLTRNYRDHLRGRV

RGPGSGGGRGPVPSLQPRARFQRCSGRSLSSCSPQPTDSLVLAPAAPARPAPEGPRAPA (SEQ

ID NO:77)

Receptor de histamina tipo 1 humana (H1R)

MSLPNSSCLLEDKMCEGNKTTMASPQLMPLVVVLSTICLVTVGLNLLVLYAVRSERKLHTVGNLYI

VSLSVADLIVGAVVMPMNILYLLMSKWSLGRPLCLFWLSMDYVASTASIFSVFILCIDRYRSVQQPL

RYLKYRTKTRASATILGAWFLSFLWVIPILGWNHFMQQTSVRREDKCETDFYDVTWFKVMTAIINF

YLPTLLMLWFYAKIYKAVRQHCQHRELINRSLPSFSEIKLRPENPKGDAKKPGKESPWEVLKRKPK

DAGGGSVLKSPSQTPKEMKSPVVFSQEDDREVDKLYCFPLDIVHMQAAAEGSSRDYVAVNRSHG

QLKTDEQGLNTHGASEISEDQMLGDSQSFSRTDSDTTTETAPGKGKLRSGSNTGLDYIKFTWKRL

RSHSRQYVSGLHMNRERKAAKQLGFIMAAFILCWIPYFIFFMVIAFCKNCCNEHLHMFTIWLGYINS

TLNPLIYPLCNENFKKTFKRILHIRS (SEQ ID NO:78)

Receptor de bradiquinina tipo 2 humana (BKRB2)

MFSPWKISMFLSVREDSVPTTASFSADMLNVTLQGPTLNGTFAQSKCPQVEWLGWLNTIQPPFL

WVLFVLATLENIFVLSVFCLHKSSCTVAEIYLGNLAAADLILACGLPFWAITISNNFDWLFGETLCRV

VNAIISMNLYSSICFLMLVSIDRYLALVKTMSMGRMRGVRWAKLYSLVIWGCTLLLSSPMLVFRTM

KEYSDEGHNVTACVISYPSLIWEVFTNMLLNVVGFLLPLSVITFCTMQIMQVLRNNEMQKFKEIQTE

RRATVLVLVVLLLFIICWLPFQISTFLDTLHRLGILSSCQDERIIDVITQIASFMAYSNSCLNPLVYVIVG

KRFRKKSWEVYQGVCQKGGCRSEPIQMENSMGTLRTSISVERQIHKLQDWAGSRQ (SEQ ID

NO:79)

Isoforma 1 del receptor de dopamina tipo 2 humana (D2R)

MDPLNLSWYDDDLERQNWSRPFNGSDGKADRPHYNYYATLLTLLIAVIVFGNVLVCMAVSREKAL

QTTTNYLIVSLAVADLLVATLVMPWVVYLEVVGEWKFSRIHCDIFVTLDVMMCTASILNLCAISIDRY

TAVAMPMLYNTRYSSKRRVTVMISIVWVLSFTISCPLLFGLNNADQNECIIANPAFVVYSSIVSFYVP

FIVTLLVYIKIYIVLRRRRKRVNTKRSSRAFRAHLRAPLKGNCTHPEDMKLCTVIMKSNGSFPVNRR

RVEAARRAQELEMEMLSSTSPPERTRYSPIPPSHHQLTLPDPSHHGLHSTPDSPAKPEKNGHAKD

HPKIAKIFEIQTMPNGKTRTSLKTMSRRKLSQQKEKKATQMLAIVLGVFIICWLPFFITHILNIHCDCNI

PPVLYSAFTWLGYVNSAVNPIIYTTFNIEFRKAFLKILHC (SEQ ID NO:80)

Fusión GFP2-Rlucll

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLS

YGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDF

KEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLP

DNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGGGGDIEFLQPGGSGGGGMTS

KVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHI

EPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEH

QDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAA

YLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIV

EGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ (SEQ ID NO:81)

Fusión rGFP-Rlucll

MDLAKLGLKEVMPTKINLEGLVGDHAFSMEGVGEGNILEGTQEVKISVTKGAPLPFAFDIVSVAFSY

GNRAYTGYPEEISDYFLQSFPEGFTYERNIRYQDGGTAIVKSDISLEDGKFIVNVDFKAKDLRRMG

PVMQQDIVGMQPSYESMYTNVTSVIGECIIAFKLQTGKHFTYHMRTVYKSKKPVETMPLYHFIQHR

LVKTNVDTASGYVVQHETAIAAHSTIKKIEGSLPGGGGGDIEFLQPGGSGGGGMTSKVYDPEQRK

RMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDL

IGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQDKIKAIVHAE

SVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGE

VRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTE

FVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ (SEQ ID NO:82)

Fusión Venus-Rlucll

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICTTGKLPVPWPTLVTTLG

YGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDF

KEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLP

DNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGGGGDIEFLQPGGSGGGGMTS

KVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHI

EPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEH

QDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAA

YLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIV

EGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ (SEQ ID NO:83)

Enlazador entre Barrestina (1 y 2) y Rlucll

KLPAT(SEQ ID No:84)

Barrestinal humana

MGDKGTRVFKKASPNGKLTVYLGKRDFVDHIDLVDPVDGVVLVDPEYLKERRVYVTLTCAFRYGR

EDLDVLGLTFRKDLFVANVQSFPPAPEDKKPLTRLQERLIKKLGEHAYPFTFEIPPNLPCSVTLQPG

PEDTGKACGVDYEVKAFCAENLEEKIHKRNSVRLVIRKVQYAPERPGPQPTAETTRQFLMSDKPL

HLEASLDKEIYYHGEPISVNVHVTNNTNKTVKKIKISVRQYADICLFNTAQYKCPVAMEEADDTVAP

SSTFCKVYTLTPFLANNREKRGLALDGKLKHEDTNLASSTLLREGANREILGIIVSYKVKVKLVVSR

GGLLGDLASSDVAVELPFTLMHPKPKEEPPHREVPENETPVDTNLIELDTNDDDIVFEDFARQRLK

GMKDDKEEEEDGTGSPQLNNR (SEQ ID NO:85)

Barrestina²humana

MGEKPGTRVFKKSSPNCKLTVYLGKRDFVDHLDKVDPVDGVVLVDPDYLKDRKVFVTLTCAFRY

GREDLDVLGLSFRKDLFIATYQAFPPVPNPPRPPTRLQDRLLRKLGQHAHPFFFTIPQNLPCSVTL

QPGPEDTGKACGVDFEIRAFCAKSLEEKSHKRNSVRLVIRKVQFAPEKPGPQPSAETTRHFLMSD

RSLHLEASLDKELYYHGEPLNVNVHVTNNSTKTVKKIKVSVRQYADICLFSTAQYKCPVAQLEQDD

QVSPSSTFCKVYTITPLLSDNREKRGLALDGKLKHEDTNLASSTIVKEGANKEVLGILVSYRVKVKL

VVSRGGDVSVELPFVLMHPKPHDHIPLPRPQSAAPETDVPVDTNLIEFDTNYATDDDIVFEDFARL

RLKGMKDDDYDDQLC (SEQ ID NO:^{8 6})

Ejemplo 2: Generación y validación de nuevos sensores BRET para el tráfico de GPCR

Se generaron nuevos aceptadores BRET basados en Renilla reniformis GFP (rGFP) para evaluar la internalización del receptor y su direccionamiento con B-arrestinas a los endosomas. Estos aceptores BRET se diseñaron para su expresión específica en la membrana plasmática o en los endosomas, y para utilizarlos con los donadors RET: GPCRs y B-arrestinas etiquetados con Rlucll (figuras 1A-C). El ensayo BRET divulgado en la presente memoria se basa en cambios en la concentración local del donador en relación con el aceptor en lugar de una interacción proteína-proteína específica; por lo tanto, no se limita al requerimiento para la interacción de proteínas y la avidez del propio complejo. Para su localización en la membrana plasmática, rGFP se marcó primero con un dominio Lyn. Lyn-rGFP se localizó principalmente en la membrana plasmática cuando se expresó en células HEK293 (figura 1D y F). Además, la adición del dominio endofin FYVE a rGFP (rGFP-endofinFYVE) mostró una localización endosomal clara y exclusiva (figura 1E, panel izquierdo). Una variante marcada con mCherry del sensor de endofina FYVE (mCherry-FYVE) también se localizó junto con la pequeña proteína G Rab5, el cual habita EE (figura 1G). En particular, el bloqueo de PI3K al usar wortmanina deslocalizó el rGFP-endofinFYVE en el citosol y en las vesículas endosomales agrandadas (figura 1E, panel derecho), consistente con su anclaje a los endosomas a través de la unión a PI3P. Para visualizar el tráfico de GPCR, se usó el receptor de bradiquinina B2 etiquetado con CFP (B2R-CFP), y se expresaron simultáneamente LynrGFP y mCherry-endofinFYVE (figura 1F). En el estado basal, B2R-CFP se localizó en la membrana plasmática con Lyn-rGFP (panel superior). Tras la estimulación agonista, B2R-CFP se separó de Lyn-rGFP y se trasladó a los endosomas donde se colocalizó con mCherry-endofinFYVE (panel inferior). Solo el receptor redistribuídos de un compartimento celular a otro tras el agonista, como los marcadores de la membrana plasmática y endosomales (es decir Lyn-rGFP y GFP-endofinFYVE, respectivamente) permanecieron en sus respectivos compartimentos, lo que hace este sistema adecuado para rastrear dinámicamente el tráfico de receptores al usar BRET.

Ejemplo 3: Evaluación de la internalización de AT1R y su tráfico a los endosomas con p-arrestina

Se realizaron experimentos BRET para monitorear la endocitosis del receptor. Rlucll se fusionó con el dominio C-terminal del receptor de angiotensina tipo 1 (AT1R-Rlucll), otro GPCR, el cual trafica con p-arrestina a través de la vía de la clatrina y se dirige a los endosomas (Hein, Meinel y otros 1997; Zhang, Barak y otros, 1999; Anborgh, Seachrist y otros, 2000; Oakley, Laporte y otros, 2000; Gaborik, Szaszak y otros, 2001). Al usar la unión de radio-ligando, primero se validó que la AT¹R-Rlucll ingenierizada se internalizó en la misma medida que el receptor sin marcar (figura 7A). La coexpresión de AT1R-Rlucll y Lyn-rGFP no impidió la eliminación eficiente mediada por agonistas de receptores a partir de la membrana plasmática (figura 7A), cuya internalización aumentó además por la expresión de p-arrestina2 o se inhibió con el dominante negativo dinamina K44A (DynK44A; figura 7B). De acuerdo con su colocalización en la membrana plasmática, la expresión de AT1R-Rlucll y Lyn-rGFP reveló una alta relación BRET en el estado basal (figura 2A). La señal disminuyó rápidamente en una manera dependiente de la concentración después de retar las células vivas con AnglI y eliminar el receptor de la membrana plasmática. Expresar Lyn-GFP10, por otro lado, generó cambios tanto en la relación BRET basal como en la inducida por AnglI. Sorprendentemente, expresar AT1R-Rlucll con rGFP-endofinFYVE en lugar de GFP10-endofinFYVE resultó en un aumento de 7,7 veces en los cambios BRET mediados por AnglI (ABRET) (figura 2B). Del mismo modo, expresar AT1R con p-arrestina2-Rlucll y rGFP-endofinFYVE en lugar de GFP10-endofinFYVE resultó en un aumento de 4,5 veces en ABRET (figura 2C). El proceso temporal de la endocitosis del receptor a partir de la membrana plasmática y su direccionamiento a los endosomas se resolvió a continuación al usar AT1R-Rlucll con los sensores aceptores BREt de membrana plasmática o de endosoma (por ejemplo Lyn-rGFP y rGFP-endofinFYVE, respectivamente). La desaparición de AT1R de la membrana plasmática fue más rápida (t-i/^{2 ^ 3}minutos) que su acumulación en los endosomas (t-i/^{2 ^ 9}minutos) (figuras 2D-F).

A continuación se investigó el grado en el cual se podía regular la internalización de AT1R y su direccionamiento a los endosomas con p-arrestina. Dinamina K44A (DynK44A), un dominante negativo de dinamina, el cual es clave para la invaginación de fosas recubiertas de clatrina, y la sacarosa se han usado como bloqueadores de la endocitosis (Zhang, Ferguson y otros 1996). Las respuestas BRET mediadas por AnglI en la membrana plasmática y en los endosomas (AT1R-Rlucll/Lyn-rGFP y AT1R-Rlucll/rGFP-endofinFYVE, respectivamente) se inhibieron eficientemente por la expresión de DynK44A (figuras 3A y B). De acuerdo con la falta de acumulación de complejos AT1R/p-arrestina en los endosomas en presencia de DynK44A, se observaron muy pocos cambios en la relación BRET mediada por AnglI entre p-arrestina2-Rlucll y rGFP-endofinFYVE (figura 3C). De manera similar, la sacarosa bloqueó eficientemente las respuestas BRET inducidas por AngII entre AT1R-Rlucll y Lyn-rGFP en la membrana plasmática y en los endosomas entre AT1R-Rlucll y p-arrestina2-Rlucll o rGFP-endofinFYVE (figuras 3A-C). Sorprendentemente, la sobreexpresión de DynK44A o el tratamiento con sacarosa disminuyeron la relación BRET basal en la membrana plasmática (con LynrGFP) (figura 3A), pero no en el endosoma (con rGFP-endofinFYVE). La expresión de p-arrestina facilita la endocitosis de AT1R (Gaborik, Szaszak y otros 2001). Los inhibidores de la acidificación de las vesículas bafilomicina A (Baf) y cloroquina (CQ), los cuales evitan la degradación del receptor y el reciclaje de AT1R (Heinz y otros, Mol Endocrinol.

1997 Aug;11(9):1266-77), ambos aumentaron la acumulación mediada por agonistas de a T1R en los endosomas (figura 3F). De acuerdo con su importante papel en la endocitosis de GPCRs mediadas por agonistas, la sobreexpresión de parrestin2 potenció ABRET mediada por AngII en más del 50% tanto para la internalización del receptor (AT1R-Rlucll y Lyn-rGFP) como para su direccionamiento a los endosomas (AT1R-Rlucll y rGFP-endofinFYVE) (figuras 3D y E). Los efectos de DynK44A o p-arrestina2 en la endocitosis AT1R mediada por AngII también se validaron mediante experimentos de unión a ligandos, y se encontraron consistentes con lo observado en el ensayo BRET (figura 7B). Juntos, estos resultados resaltan la utilidad de los ensayos basados en BRET para monitorear, de una manera dependiente de la dosis y el tiempo, la endocitosis de AT1R y su tráfico con p-arrestina hacia los endosomas.

Ejemplo 4: Medición de la endocitosis y el tráfico de varios receptores a los endosomas

Se marcaron diferentes GPCRs con Rlucll para examinar su tráfico. Cuando el receptor de vasopresina V2-Rlucll (V2R-Rlucll) se expresó con Lyn-rGFP, la dosis de AVP disminuyó de manera dependiente de la respuesta de la relación BRET. De manera similar al AT1R estimulado por AngII, la AVP promovió la internalización de V2R con una CE⁵⁰en el rango denM(1,1 nM y 7,8 nM, respectivamente) (figura 4A). Por otro lado, la oxitocina, que tiene baja afinidad porV2R (Barberis, Audigier y otros 1992), promovió la internalización del receptor con menor potencia (figura 4A, CE50=^{2 , 2 j}M). El receptor B2R-Rlucll y el receptor p2-adrenérgico (p2AR)-Rlucll también mostraron respectivamente una disminución dependiente de la dosis en la relación BRET por sus ligandos afines, bradiquinina e isoproterenol. Sin embargo, observamos diferencias en la relación BRET basal entre los receptores. Cuando se examinó el tráfico del receptor hacia el endosoma, B2R-Rlucll y p2AR-Rlucll también mostraron diferentes potencias en el aumento mediado por el agonista en la relación BRET (figura 4B). En particular, V2R-Rlucll y rGFPendofinFYVE mostraron una alta relación BRET basal (figura 4B), en comparación con B2R y los otros receptores, aunque aún pudimos detectar un aumento robusto en la relación BRET tras la estimulación con AVP. La señal basal más alta probablemente se causó por la localización endosomal basal alta de V2R como lo sugiere la microscopía (figura 8). De hecho, a diferencia de B2R, la colocalización de V2R con mCherry-endofinFYVE estuvo más presente en ausencia de estímulos agonistas (figuras 1 y 8). A continuación, se examinó el receptor mediado por agonista/p-arrestina dirigidos a los endosomas al usar parr2-Rlucll y rGFPendofinFYVE con diferentes GPCRs. ATiR, V2R y B2R promovieron un aumento de ^{6 - 8}veces sobre el basal en las relaciones BRET tras la estimulación con agonista (figura 4C), lo cual es consistente con el tráfico de GPCR de clase B (Oakley, Laporte y otros 2000), que trafica a los endosomas con p-arrestinas. Sin embargo, la estimulación con isoproterenol de p2AP no pudo generar una señal BRET, consistente con la internalización de un GPCR de clase A en los endosomas sin p-arrestinas (Oakley, Laporte y otros 2000). La oxitocina mostró un tráfico muy marginal del complejo V2R/p-arrestina al endosoma, mientras que para el receptor PGF2a (FP), el cual no se internaliza (Goupil, Wisehart y otros 20l2), no se detectó ningún aumento sobre el basal en la relación BRET tras la estimulación con agonista (figura 4C). Estos resultados respaldan el uso de estos sensores BRET de membrana plasmática y endosoma para estudiar el tráfico mediado por ligando de diferentes clases de GPCRs. La figura 4D muestra que los sensores BRET de membrana plasmática y endosoma también se pueden usar para estudiar la endocitosis y el tráfico de otros tipos de receptores (es decir, no GPCRs), como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (E^gFR), un receptor de tirosina quinasa (RTK). La figura 4E muestra el factor Z de más de 0,73 para los biosensores AT1R-Rlucll/rGFP-endofinFYVE después de la estimulación con AngII, lo que indica un ensayo robusto y compatible con HTS para la internalización del receptor en los endosomas.

Ejemplo 5: Estudio del reciclaje del receptor al usar BRET

Después de la internalización de GPCR, se ha demostrado que muchos receptores se reciclan de regreso a la membrana plasmática o se trafican a otros compartimentos intracelulares (Tsao, Cao y otros 2001). La dinámica del tráfico del receptor después de la eliminación del agonista se evaluó al usar los diferentes pares de sensoresBRET rGFP/Rlucll. Para el reciclaje del receptor a la membrana plasmática, las células que expresan ATIR-Rlucll y Lyn-rGFP que se han retado con AngII durante 30 minutos, se lavaron para eliminar el agonista y se dejaron recuperar durante otros 45 minutos, antes de las mediciones de BRET. Los resultados muestran que en las células pretratadas con AngII, la relación BRET disminuyó alrededor de un 50% en comparación con el control, y la señal se recuperó a aproximadamente ~90% del control después de 45 minutos de eliminación del agonista (es decir ~80% del reciclaje del receptor a la membrana plasmática; figura 5A). Se aplicó el mismo paradigma a los B2R, p2AR y V2R etiquetados con Rlucll. Estos hallazgos revelaron que más del 80% de los B2R y p2AR endocitosados se reciclaron a la superficie celular, mientras que solo aproximadamente el 30% de los V2R endocitosados se reciclaron nuevamente a la membrana plasmática (figura 5B). Estos resultados están en concordancia con estudios previos (Innamorati, Sadeghi y otros 1998; Tsao y von Zastrow 2000; Zimmerman, Simaan y otros 2011). La desaparición del receptor para los endosomas tempranos se monitoreó luego al usar el AT1R-Rlucll y el rGFP-endofinFYVE. El tratamiento con AngII durante 30 minutos aumentó la relación BRET 3 veces en comparación con las células no estimuladas (control, figura 5C). 45 minutos después de la eliminación de AngII, la relación BRET fue 1,5 veces mayor que la basal, lo que implica que el 75% de AT1R desapareció de los endosomas tempranos, ya sea al reciclarse nuevamente a la superficie celular u otra clasificación endocitótica. Estos resultados proporcionan evidencia de que los ensayos BRET de endocitosis se pueden aplicar para monitorear el reciclaje del receptor a la membrana plasmática y la dinámica de la clasificación endosomal.

Las figuras 26A a 26C muestran que los cambios en la señal BRET resultantes a partir de la translocación/reclutamiento de p-arrestina a diferentes compartimentos pueden medirse mediante microscopía BRET, y que el uso de rGFP como el aceptor de BRET resulta en una señal BRET más fuerte en comparación con otros aceptores BRET como Venus y GFP2. Las imágenes de microscopía basadas en BRET abren la posibilidad de multiplexación basada en imágenes para monitorear la translocación de una proteína etiquetada con Rluc a distintos compartimentos subcelulares en respuesta a diversos estímulos.

Ejemplo 6: Clasificación diferencial de AT1 R por análogos de angiotensina

La endocitosis del receptor mediada por ligando se examinó a continuación al usar diferentes ligandos de AT1R: AngII, SI y DVG, los cuales previamente mostraron tener propiedades de señalización sesgadas distintas (Zimmerman, Beautrait y otros 2012). Su capacidad para regular temporalmente el tráfico de AT1R-Rlucll a los endosomas se evaluó primero al usar rGFP-endofinFYVE. Los resultados revelaron que las tasas iniciales de tráfico de AT1R a los endosomas fueron similares tras la incubación del ligando (por ejemplo 0-5 minutos; figura 6A). Sin embargo, AT1R unido a DVG alcanzó la intemalización máxima a los 10 minutos, mientras que SI produjo el efecto máximo solo después de 20 minutos, y ambos ligandos fueron respectivamente 40% y 20% menos eficaces que AngII para promover la concentración de AT1R en los endosomas tempranos. Al tomar como referencia el tiempo de internalización máxima de 40 minutos, se comparó la potencia y la eficacia de los diferentes ligandos de AngII para promover la internalización de AT1R. Como se muestra en la figura 6B, AngII, SI y DVG disminuyeron la relación BRET entre AT1R-Rlucll y Lyn-rGFP en la misma medida a concentraciones máximas de ligando. Mientras que AngII y SI tenían la misma propensión a promover la internalización de AT1R (1,3 nM y 1,5 nM, respectivamente), DVG era menos potente (75 nM). Tanto SI como DVG promovieron una menor acumulación de receptores en los endosomas, en comparación con AngII (figura 6C), aunque su orden relativo de potencia se mantuvo igual que para promover la internalización de AT1R. Curiosamente, SI y DVG promovieron débilmente el tráfico de p-arrestina2 a los endosomas con receptores en comparación con AngII (figura 6D). Juntos, estos hallazgos proporcionan evidencia de que los diferentes ligandos de AngII causan una clasificación distinta del complejo AT1R/p-arrestina2.

Para probar el posible tráfico intracelular diferencial de AT1R, se generaron otros sensores basados en BRET de endosomas al marcar proteínas Rab (Rabs) con rGFP. Las Rabs coordinan el transporte de vesículas entre varios compartimentos intracelulares y se han usado para identificar las vías seguidas por el tráfico de GPCR (Seachrist y Ferguson 2003). Rab5 se encuentra en las vesículas endocitosadas y de reciclaje de ciclo corto, mientras que rab4 está en las vesículas de reciclaje de ciclos cortos y largos, y rab^{1 1}en las vesículas de reciclaje de ciclo largo y las vesículas dirigidas a los lisosomas (Seachrist y Ferguson 2003). Se generaron Rab4 etiquetado con rGFP (rGFP-rab4) y rab11 (rGFP-Rab11), ya que los endosomas marcados con rGFP-endofinFYVE son principalmente positivos para Rab5. Tanto rGFP-rab4 como rGFP-rab11 mostraron buenas localizaciones vesiculares cuando se expresaron en células HEK293 (figura 9A). Cuando las células que expresan AT1R-Rlucll/rGFP-rab4 se incubaron con AngII, SI o DVG, las relaciones BRET aumentaron con el tiempo (figura 6E). Curiosamente, la estimulación de SI y DVG generó una señal BRET significativamente más alta que AngII (5 y 10 minutos, figura 6E). A los 10 minutos, la relación BRET aumentada por SI y DVG fue de más de 2 veces que la de AngII. Las señales se estabilizaron después de 10 minutos con SI y DVG, y a los 30 minutos con AngII. De manera similar a rGFP-rab4, rGFP-rab11 también reveló señales BRET más altas en general con SI y DVG, que con AngII (figura 6F). Las señales de AT1R-Rlucll/rGFP-rab11 aumentaron lentamente con el tiempo en comparación con rGFP-rab4, en concordancia con hallazgos previos relacionados con rab4 y rab11 en el reciclaje rápido y lento, respectivamente (Hunyady, Baukal y otros 2002; Li, Li y otros 2008). En ambos ensayos BRET de rGFP-rab4 y rGFP-rab11, SI y DVG no mostraron diferencias significativas. Estos resultados proporcionan evidencias de que SI y DVG conducen a AT1R dentro de vesículas positivas para rab4 o rab11 y menos dentro de vesículas positivas para rab5, en relación con AngII.

La evidencia reciente sugiere que las proteínas G desempeñan algunas funciones en el tráfico de membranas, pero el papel de Gaq en el tráfico de AT1R está poco estudiado. Los sensores basados en BRET se usaron para evaluar cómo la inhibición de Gaq afectaba la internalización del receptor. El tratamiento de células con Ubo-QIC, un inhibidor que bloquea específicamente Gaq en su estado inactivo, no evitó la internalización de AT1R dependiente de AngII según lo evaluado por el ensayo EsBRET de PM (figura 9B). Curiosamente, sin embargo, la inhibición de Gaq redujo en más del 25% el direccionamiento de AT1R unido a AngII a los endosomas que contienen Rab5 (figura 9C). De acuerdo con la falta de DVG y SI en la activación de Gaq, Ubo-QIC no tuvo efecto sobre la acumulación mediada por ligando de receptores en estos endosomas. La inhibición de Gaq aumentó el AT1R unido a AngII en las vesículas de Rab 4 y Rab11, mientras que tuvo pocos efectos en la clasificación de los receptor a los endosomas promovidos por DVG o SI (figura 9D). Estos hallazgos sugieren que la clasificación de AT1R puede estar sesgada por diferentes ligandos.

Ejemplo 7: Ensayo de chaperona farmacológica (PC) basado en BRET y ensayo de secuestro para evaluar el rescate funcional

Para medir la expresión en la superficie celular, se desarrolló un ensayo basado en la densidad plasmática de una proteína etiquetada con Rlucll (en la figura 10A, un receptor) como se detectó en BRET entre la proteína etiquetada con Rlucll y un aceptor de energía (rGFP) localizado en la membrana plasmática por una marca de localización subcelular. En la figura 10^a, ejemplos de marcas utilizadas para la localización de rGFP: la secuencia polibásica y la secuencia señal de prenilación a partir de la variante de empalme KRAS b (CAAX), la secuencia señal de palmitoilación y miristoilación a partir de la quinasa Lyn (Lyn) y la secuencia polibásica de direccionamiento a la membrana plasmática a partir del GRK5 humano (PB). Una representación esquemática de un ensayo para la evaluación de la expresión en la superficie celular del rescate de las PC de proteínas retenidas en el ER etiquetadas con Rlucll se presenta y describe en la figura 10A. Un ensayo basado en BRET para evaluar la expresión en la superficie celular también puede usarse para evaluar el secuestro inducido por agonista de receptores como se representa y describe en la figura 10B. La mayoría de los GPCRs y otros receptores se internalizan o se secuestran a subdominios de la membrana plasmática tras la estimulación por agonista. Un ensayo de secuestro después del rescate por PC de la expresión en la superficie celular de receptores se puede usar para evaluar la activación del receptor, que refleja la unión del agonista y, por lo tanto, la funcionalidad. Las diferentes construcciones usadas en este estudio se describen en la figura 11; Figura 11A:

Descripción de MC4R-Rlucll; Figura 11B: Descripción de V2R-Rlucll, Figura 11C: Descripción de un canal de potasio dependiente de voltaje (hERG) que se usó como ejemplo de un no GPCR. Se probaron tres construcciones diferentes de rGFP con distintas secuencias de direccionamiento a la membrana plasmática como se describe en la figura 11D.

Para la mayoría de los ensayos presentados, las construcciones rGFP-CAAX y MC4R-Rlucll se usaron para ilustrar la robustez del ensayo, la resistencia al DMSO y el rescate funcional, según se evaluó al usar un agonista de MC4R (a-MSH) para inducir el secuestro promovido por agonista.

Para la optimización del ensayo de expresión en la superficie celular, se probaron dos secuencias de direccionamiento a la membrana plasmática diferentes para rGFP (construcciones y marcas descritas en la figura 11D); la marca del fragmento KRAS está dirigida a la membrana plasmática mediante una combinación de lipidación (rGFP-CAAX; prenilación) y un dominio polibásico y la marca de fragmento GRK5 está dirigida a la membrana plasmática mediante un dominio polibásico (rGFP-PB), no requiere una lipidación de la proteína de fusión rGFP. En la figura 12 titulaciones de las dos construcciones de rGFP (figura 12A = rGFP-CAAX y figura 12B = rGFP-PB) se obtuvieron a partir de células que expresan transitoriamente el mutante hMC4R (R165Q)-Rlucll. Como se muestra en la figura 12A un tratamiento DCPMP conduce a una respuesta BRET saturable para rGFP-CAAX, y esta construcción se seleccionó para los experimentos posteriores.

Para la optimización y validación del rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular y la funcionalidad de MC4R, las células que expresan transitoriamente rGFP-CAAX y 3 formas de hMC4R, el receptor wt (hMC4R wt-Rlucll), un MC4R mutante rescatable por PC (hMC4R-R165Q-rLucll) y un MC4R mutante conocido como resistente al tratamiento con DCPMP (no rescatable por PC), se probaron para la expresión en la superficie celular después del tratamiento con PC y un tratamiento con agonista de 1 hora para inducir el secuestro mediado por agonista. Se probaron tres relaciones diferentes de receptor a rGFP-CAAX. Como se muestra, el tratamiento con DCPMP condujo a un aumento en la señal BRET para el Mc4r WT y R165Q pero no para el MC4R mutante P299H. Tanto el MC4R wt como el mutante R165Q expresados en la superficie celular después del tratamiento con DCPMP mostraron secuestro inducido por agonista como se describe en las figuras 13A a C. La condición equivalente a 24 ng de ADN plasmídico por 10 pocillos de una placa de 96 pocillos se seleccionó para los ensayos posteriores. La figura 13D muestra que los diferentes componentes de los biosensores pueden codificarse y coexpresarse a partir del mismo ARNm (construcción policistrónica). Se usaron construcciones policistrónicas que codifican rGFP-CAAX (Kras) y un hMC4R WT o mutante para mostrar el rescate por PC de la expresión en la superficie celular. Las construcciones policistrónicas ofrecen la ventaja de una relación fija de donador a receptor y la posibilidad de usar solo una construcción para la infección viral o para establecer líneas celulares estables. La figura 13E muestra el rescate mediado por PC de mutantes V2R conocidos porque se retienen intracelularmente por la chaperona SR121463 (Y128S y W164S).

Ejemplo 8: Ensayo de expresión en la superficie celular basado en BRET se puede usar para la evaluación farmacológica de la potencia y eficacia de la chaperona

Para verificar si este ensayo podría usarse para caracterizar fármacos con propiedades de PC, se obtuvieron curvas de dosis-respuesta del tratamiento con 2 PC diferentes (DCPMP y Compuesto 1) de células que coexpresan rGFP-CAAX y la construcción hMC4R wt-Rlucll o la construcción hMC4R (R165Q)-rLucll (figura 14). Las características de las curvas de dosis-respuesta fueron compatibles con los datos obtenidos con un ensayo basado en FACS descrito anteriormente (P. René y otros J Pharmacol Exp Ther. diciembre de 2010; 335(3):520-32), lo que indica que el ensayo basado en BRET puede usarse para caracterizar ligandos.

Los factores Z se determinaron para el rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular de MC4R, para evaluar la robustez del ensayo basado en BRET desarrollado. Se obtuvieron factores Z para ambos hMC4R wt-Rlucll (figuras 15A y 15B) y hMC4R (R165Q)-Rlucll (figuras 15C y 15D). La expresión en la superficie celular se evaluó en BRET2 en las figuras 15A y 15C al usar coelenterazina 400a, y en BRET1 al usar coelenterazina H (figuras 15B y 15D) después de un tratamiento de 16 horas con DCPMP 10 pM frente a vehículo. Los factor Z se evaluó a más de 0,63 con el receptor hMC4R wt y a más de 0,82 con el hMC4R mutante R165Q. Los resultados muestran que la robustez de este ensayo es compatible con los requisitos de las aplicaciones de detección, incluso con el MC4R WT.

Ejemplo 9: Evaluación de la resistencia a DMSO.

Las bibliotecas de ligandos y compuestos a menudo se disuelven en DMSO. Para evaluar si el ensayo basado en BRET para la evaluación de la superficie celular es sensible a las concentraciones de DMSO generalmente alcanzadas con las curvas de dosis-respuesta de los ligandos seleccionados a partir de una biblioteca de compuestos, sas células que expresan hMC4R wt-Rlucll y hMC4R (R165Q)-Rlucll se trataron con DCPMP a 10 uM o con vehículo (DMSO) en un pozo que contiene diferentes concentraciones de DMSO. Como se indica en la figura 16 este ensayo es resistente al menos al 3% de DMSO, lo cual es compatible con aplicaciones del cribado de alto rendimiento (HTS) y la caracterización de compuestos en curvas de dosis-respuesta.

Ejemplo 10: Generación de líneas celulares estables.

Las células que expresan biosensores de manera estable son usualmente preferidas para propósitos de detección. El rescate mediado por PC de la expresión de MC4R y V2R se evaluó en células que expresan transitoriamente rGFP-CAAX y en líneas celulares estables de rGFP-CAAX, para determinar si el nivel de rGFP-CAAX alcanzado en líneas celulares estables es compatible con un ensayo robusto para aplicaciones de detección. Tres cantidades diferentes (como se indica en los gráficos: ⁶, 12 y 24 ng para 10 pocillos) de hMC4R (R165Q)-Rlucll (figura 16A) o en hV2R (Y128S)-Rlucll (figura 16B) se transfectaron en líneas estables que expresan diferentes niveles de rGFP-CAAX (bajo, medio, alto) o se transfectaron conjuntamente en células HEK293 junto con la construcción rGFP-CAAX para probar diferentes relaciones de donador de BRET a receptor. El rescate mediado por PC de la expresión en la superficie celular para MC4R se evaluó en BRET2, como se indica en la figura 17. Los datos presentados indican que se pueden obtener mejores respuestas con líneas celulares estables que expresan niveles más altos de rGFP. Estas líneas celulares estables podrían usarse para establecer líneas celulares que expresen tanto el receptor-Rlucll como el rGFP-CAAX, lo que sería útil para las aplicaciones de detección.

Ejemplo 11: Biosensores para detectar el rescate en la superficie celular mediada por PC de un canal iónico. Para verificar si un ensayo de expresión en la superficie celular mediado por PC basado en BRET podría usarse para identificar y caracterizar fármacos que pueden unir hERG, se crearon construcciones etiquetadas con Rlucll al usar la secuencia WT de hERG y un mutante retenido intracelularmente conocido (G601S) y se probaron para el rescate mediado por astemizol de la expresión en la superficie celular (figuras 18A y B). Las curvas de dosis-respuesta se obtuvieron con las construcciones wt-hERG (figura 18C) y mutante (figura 18D), para fármacos que se conoce que actúan como ligandos y chaperonas farmacológicas en hERG con diferente eficacia y potencia. Las características de las curvas de dosis-respuesta fueron compatibles con los datos obtenidos con un ensayo basado en ELISA (HERG-Lite: Wible BAy otros J Pharmacol Toxicol Methods. 2005, 52(1):136-45). El factor Z obtenido con el hERG-(G601S) (figura 18E) indica que este ensayo basado en BRET es robusto y podría usarse para aplicaciones de alto rendimiento como HTS para identificar chaperonas hERG capaces de rescatar la expresión en la superficie celular de diferentes hERG mutantes que ocurren naturalmente o para identificar medicamentos que podrían tener efectos fuera del objetivo mediados a través de uniones a HERG.

Ejemplo 12: Biosensores para monitorear el reclutamiento de p-arrestina a GPCRs.

Luego se probó si es posible monitorear el reclutamiento de p-arrestina (p-arr) a GPCRs (es decir, a la membrana plasmática donde se localizan los GPCRs) al usar un biosensor BRET que depende de los cambios en la concentración/densidad del donador en relación con el aceptor en la membrana plasmática. Como se muestra en la figura 19A, un aceptor de BRET (por ejemplo, GFP) se etiqueta con una porción de direccionamiento a PM (anclando así el aceptor de BRET en la PM), y una p-arrestina se marca con un donador de BRET (por ejemplo, Rlucll). En presencia de un agonista de GPCR, se recluta p-arr al GPCR, lo que aumenta la concentración de Rlucll-p-arr en la membrana plasmática, lo cual a su vez resulta en un aumento en la transferencia de energía (BRET) entre Rlucll y GFP etiquetado con PM.

Las figuras 19B y 19C muestran el aumento en la relación BRET para p-arrestinai (figuras 19B y 19D) y p-arrestina ² (figuras 19C y 19e ) con dos GPCRs diferentes, un receptor de clase A que tiene menor afinidad por la p-arrestina: P ² AR (figuras 19B y 19C) y un receptor de clase B que tiene mayor afinidad por la p-arrestina: V ² R (figuras 19D y 19E), después de la estimulación con dosis crecientes de isoproterenol (iso) y AVP, respectivamente. Los resultados muestran que se obtiene una señal BRET adecuada al usar diferentes fracciones de direccionamiento a PM (incluido una porción de direccionamiento no basado en lípidos como el dominio polibásico de GRK5) y diferentes aceptores BRET, y la mejor señal se obtiene al usar la porción de direccionamiento a PM CAAX (Kras) y rGFP como el aceptor de BRET (triángulos). La figura 19F muestra que al usar parr-Rlucll con rGFP-CAAX, Lyn o PB, todos generaron mayores respuestas BRET que el par BRET tradicional Rlucll:GFP10 como con GFP10-CAAX. Este ensayo para monitorear el reclutamiento de beta-arrestina ventajosamente no requiere modificación del receptor y también ofrece un ensayo robusto (factor Z de al menos 0,74; figuras 19G y H) susceptibles de aplicaciones de detección (incluido HTS) para receptores de clase A y B. Las figuras 21A a 21E muestran la evaluación de la translocación de p-arrestina al usar un biosensor unimolecular, el cual permite realizar los experimentos en extractos de membrana, por ejemplo. Un enlazador de polipéptido flexible de 300 aminoácidos proporcionó una mejor señal BRET en relación con los enlazadores de polipéptido más cortos (figura 21C).

Ejemplo 13: Biosensores para monitorear la cantidad de PI(4,5)P2 en la membrana plasmática.

El biosensor se aplicó para detectar la generación de PI(4,5) ² de membrana al usar el dominio PLC81-PH. En el estado basal, PLC81-PH-Rlucll y PLC81-PH-rGFP (o Lyn-rGFP o rGFP-CAAX) se localizan en la PM donde PI(4,5) ² se localiza, por lo que su concentración/densidad local es lo suficientemente alta como para generar una señal BRET detectable. Cuando la fosfolipasa C (PLC) se activó mediante la activación de AT1R por su ligando AnglI (por lo tanto indujo la hidrólisis de PI(4,5) ² ), el dominio PLC81-PH etiquetado con Rlucll y rGFP se difundió hacia el citosol, lo que redujo así la concentración local de rGFP y Rlucll y, en consecuencia, la señal BRET en una manera dependiente de la dosis (figuras 20Ay B).

Ejemplo 14: Biosensores para monitorear el diacilglicerol (DAG) en la membrana plasmática

Tras la activación de la PLC, PIP ² de membrana se hidroliza en IP ³ y DAG. Aunque el trifosfato de inositol se difunde hacia el citosol, el DAG permanece dentro de la membrana plasmática, debido a sus propiedades hidrófobas. Las figuras 22A y 23A muestran representaciones esquemáticas de biosensores para medir la translocación del dominio de unión a diacilglicerol (DAG-) de PKCdelta (C1b) a la membrana plasmática. Los biosensores comprenden un dominio/porción de direccionamiento a PM unido a un aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP, GFP10) y un donador de BRET (por ejemplo, Rlucll) enlazado al dominio de unión a DAG de PKC⁸, C1b. El enriquecimiento de DAG en la membrana después de PIP²hace que el dominio C1b se una a la membrana, lo que trae al aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP) y donador de BRET (por ejemplo, RLucll) más cerca uno del otro, e induce una señal BRET más alta. En el biosensor representado en la figura 22A, los componentes del aceptor de BRET y del donador de BRET están enlazados entre sí (biosensor unimolecular), lo cual permite realizar los experimentos en extractos de membrana, por ejemplo, mientras que estos componentes se expresan por separado en el biosensor representado en la figura 23A.

Los resultados representados en las figuras 22B a 22H y las figuras 23B a 23E muestran que la acumulación de DAG en la membrana plasmática puede monitorearse al usar ambos biosensores. La figura 22F muestra que la activación directa de PLC al usar N-(3-trifluorometilfenil)-2,4,6-trimetilbencenosulfonamida (m-3M3SFB), que induce la hidrólisis del PIP²de membrana en IP³y DAG (lo que aumenta la cantidad de DAG en la membrana), condujo a un aumento de la señal BRET detectada al usar el biosensor unimolecular.

Ejemplo 15: Biosensores para monitorear el secuestro de la subunidad de la proteína G

En ausencia de agonista, las subunidades de proteína G se localizan en la membrana plasmática. Tras la activación de GPCR al usar un agonista (A), las subunidades de la proteína G se liberan de la membrana plasmática. Al usar un dominio/porción de direccionamiento a PM unido a un aceptor de BRET (por ejemplo, rGFP, GFP10) y un donador de BRET enlazado a una subunidad de la proteína G, es posible monitorear la activación de GPCR por medición de la disminución en la señal BRET que resulta de la liberación de las subunidades de proteína G de la PM (figura 24A). Las figuras 24B y 24C muestran los cambios en la relación BRET después de la activación de p1AR y p2AR, respectivamente, con isoproterenol al usar diferentes subunidades Gy etiquetadas con Rlucll, lo que proporciona evidencia de que G^y1 y G^y11 se involucran principalmente en la señalización de p1AR, y G^y1 se involucra principalmente en la señalización de p2AR. Las figuras 24D a 24H muestran que el secuestro/translocación de diferentes subunidades de proteína G a diferentes compartimentos celulares después de la estimulación con agonista de GPCRs puede monitorearse al usar los biosensores.

Ejemplo 16: Biosensores para monitorear la activación de RhoA

Se diseñó un biosensor de activación de Rho para monitorear el reclutamiento del dominio CRIB de PKN, el cual une la forma activa de Rho (Rho-GTP) que se localiza en la membrana plasmática, a la membrana plasmática al usar BRET. El par BRET es el dominio CRIB etiquetado con RLucll de PKN como un donador de BRET y la rGFP unida a la membrana plasmática (rGFP-CAAX) como un aceptor (figura 25A). Las figuras 25B a 25G muestran que el dominio CRIB de PKN se transloca a la membrana plasmática tras la estimulación con agonista de GPCR acoplados a Gq/12/13, y que la translocación disminuye en presencia de inhibidores específicos de Gq. Las figuras 25H a 25J muestran el efecto de los moduladores de Rho en la relación BRET medida al usar el biosensor de Rho. La relación BRET aumenta en presencia de activadores de Rho y disminuye en presencia de inhibidores de Rho, lo que confirma la especificidad del ensayo.

Ejemplo 17: Identificación de reguladores de AT1R mediante el cribado de alto rendimiento al usar un biosensor de localización/tráfico

Al usar el AT1R con parr2-Rlucll y rGFP-FYVE, se examinaron 115.000 para identificar mediante un ensayo BRET compuestos que potenciaron o inhibieron la internalización mediada por AnglI de AT1R en endosomas. Se identificaron 30 potenciadores y 42 inhibidores (figura 27A). La figura 27B muestra que el compuesto #21 (Traf 21) identificado en la pantalla bloquea el direccionamiento de B2R-YFP o parr2-YFP a los endosomas, en comparación con las células no tratadas, estimuladas por agonistas. La figura 27C muestra que los compuestos #10 (Traf 10) y #29 (Traf 29) identificados en la pantalla los cuales mejoraron el direccionamiento de B2R-YFP o parr2-YFP a los endosomas, en comparación con las células no tratadas, estimuladas por agonistas. Estos resultados muestran que los biosensores descritos en la presente memoria pueden usarse para identificar reguladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas) de localización/tráfico de proteínas mediante el cribado de alto rendimiento.

Referencias

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Hanyaloglu, A. C. y M. von Zastrow (2008). "Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications." Annu Rev Pharmacol Toxicol 48: 537-568.

Hunyady, L. y K. J. Catt (2006). "Pleiotropic AT1 receptor signaling pathways mediating physiological and pathogenic actions of angiotensin II." Mol Endocrinol 20(5): 953-970.

Molinari, P., I. Casella, y otros (2008). "Functional complementation of high-efficiency resonance energy transfer: a new tool for the study of protein binding interactions in living cells." Biochem J 409(1): 251-261.

Posner, B. I. y S. A. Laporte (2010). "Cellular signalling: Peptide hormones and growth factors." Prog Brain Res 181: 1-16.

Toth, D. J., J. T. Toth, y otros (2012). "Acute depletion of plasma membrane phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate impairs specific steps in endocytosis of the G-protein-coupled receptor." J Cell Sci 125(Pt 9): 2185-2197.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un biosensor para evaluar el tráfico y/o localización de una proteína de interés que comprende;

un primer componente que comprende dicha proteína de interés etiquetada con una proteína verde fluorescente Renilla (Renilla GFP) o una proteína luciferasa Renilla(Renilla Luc);

un segundo componente que comprende una porción de direccionamiento al compartimento celular etiquetado con una Renilla GFP o una Renilla Luc;

en el que si dicha primera proteína se marca con dicha Renilla GFP, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla Luc, y si dicha primera proteína se marca con dicha Renilla Luc, dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla GFP.

2. El biosensor de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de interés se marca con dicha Renilla Luc y dicha porción de direccionamiento al compartimento celular se marca con dicha Renilla GFP.

3. El biosensor de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha proteína de interés es i) una proteína que se une a una pequeña GTPasa, por ejemplo un polipéptido de unión a Rho, ii) un polipéptido de p-arrestina, iii) una proteína receptora de la superficie celular, iv ) un polipéptido de subunidad de la proteína G, v) una proteína de señalización, vi) una proteína adaptadora, vii) una proteína reclutada a la membrana plasmática tras la estimulación de un receptor, viii) una proteína secuestrada de la membrana plasmática tras la estimulación de un receptor, o ix) un fragmento del mismo.

4. El biosensor de la reivindicación 3, en el que dicha proteína de interés es un receptor de superficie celular, por ejemplo un receptor acoplado a proteína G (GPCR) o un receptor tirosina quinasa (RTK).

5. El biosensor de la reivindicación 3, en el que dicha proteína de interés comprende un dominio con homología a la pleckstrina (PH), por ejemplo, el dominio PH de PLC81.

6. El biosensor de la reivindicación 3, en el que dicha proteína de interés comprende un dominio de unión a ésteres de forbol/diacilglicerol, por ejemplo, el dominio de unión a ésteres de forbol/diacilglicerol de PKC (C1b).

7. El biosensor de la reivindicación 3, en el que dicha proteína de interés es una proteína adaptadora o un fragmento de la misma que comprende al menos un dominio SH2 y/o SH3.

8. El biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento a la membrana plasmática (PM), una porción de direccionamiento endosomal, una porción de direccionamiento a Golgi, una porción de direccionamiento lisosomal, una porción de direccionamiento peroxisomal, un porción de direccionamiento autofagosomal, una porción de direccionamiento al ribosoma, una porción de direccionamiento a la mitocondria, una porción de direccionamiento al citoesqueleto o una porción de direccionamiento nuclear.

9. El biosensor de la reivindicación 8, en el que dicha porción de direccionamiento al compartimento celular es una porción de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) o una porción de direccionamiento endosomal.

10. El biosensor de la reivindicación 9, en el que dicha porción de direccionamiento a PM comprende (a) una secuencia señal de palmitoilación, miristoilación y/o prenilación y/o (b) una secuencia polibásica, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos MGCIKSKGKDS (SEQ ID No:1); GKKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID No:7), CMSCKCVLS (SEQ ID No:47), CMSCKCCIL (SEQ ID No:43), or SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS (SEQ ID No:8).

11. El biosensor de la reivindicación 9, en el que dicha porción de direccionamiento endosomal comprende un dominio FYVE, y preferiblemente comprende los residuos 739 a 806 de endofina humana (SEQ ID No: 20).

12. El biosensor de la reivindicación 10 u 11, en el que dicha porción de direccionamiento endosomal se fusiona con el extremo C-terminal de dicha Renilla Luc o dicha Renilla GFP; y/o dicha proteína de interés se fusiona con el extremo N-terminal de dicha Renilla Luc o dicha Renilla GFP.

13. El biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichos componentes primero y segundo se enlazan covalentemente a través de un enlazador flexible, preferiblemente un polipéptido de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 aminoácidos, y más preferiblemente un polipéptido de aproximadamente 300 aminoácidos.

14. Una célula huésped que expresa el biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Un procedimiento para determinar si un agente modula el tráfico de una proteína de interés en una célula, comprendiendo dicho procedimiento:

medir la señal de Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia (BRET) en el biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en presencia y ausencia de dicho agente; en el que una diferencia en dicha señal BRET en presencia de dicho agente en relación con la ausencia del mismo es indicativa de que dicho agente modula el tráfico de dicha proteína de interés en dicha célula.

16. Un procedimiento para evaluar una modulación en la cantidad de una biomolécula en un compartimento celular entre una primera y una segunda condición, comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar un biosensor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 que comprende:

un primer componente que comprende una proteína verde fluorescente Renilla (Renilla GFP) etiquetada con un marcador de proteína que se une a dicha biomolécula; y

un segundo componente que comprende una proteína Renilla luciferasa (Renilla Luc) etiquetada con dicho marcador de proteína;

medir la señal del aceptor de Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia (BRET) en dichas condiciones primera y segunda;

en el que una diferencia en la señal BRET entre dichas condiciones primera y segunda es indicativa de una modulación en la cantidad de dicha biomolécula en dicho compartimento celular entre dichas condiciones primera y segunda.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicha primera condición es la presencia de un agente y dicha segunda condición es la ausencia de dicho agente.

18. El procedimiento de la reivindicación 16 o 17, en el que dicha biomolécula es un fosfolípido, preferiblemente fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP²), o un segundo mensajero, preferiblemente diacilglicerol (DAG).

19. El procedimiento de la reivindicación 16 o 17, en el que si dicha biomolécula es un fosfolípido, dicho marcador de proteína comprende un dominio con homología a la pleckstrina (PH), y si dicha biomolécula es un segundo mensajero, dicho marcador de proteína comprende un dominio de unión a ésteres de forbol/diacilglicerol.