ES2832331T3 - Biosensor basado en proteínas que interactúan con gbetagamma para monitorear la activación de proteínas G - Google Patents

Biosensor basado en proteínas que interactúan con gbetagamma para monitorear la activación de proteínas G Download PDF

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Abstract

Un sistema biosensor para detectar la actividad de proteína G, dicho sistema biosensor comprende los elementos definidos en (A) o (B): (A) (i) una primera célula eucariota que comprende un primer biosensor que comprende: un primer componente que comprende una proteína que interactúa con Gβγ (βγIP) fusionada a (a) un donante de transferencia de energía por resonancia (RET); (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; un segundo componente que comprende una proteína Gβ y una proteína Gγ, en donde dicha proteína Gβ o dicha proteína Gγ se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; y un tercer componente que es un receptor acoplado a proteína G (GPCR); (ii) una segunda célula eucariota que comprende un segundo biosensor que comprende: el primer, el segundo y el tercer componente definidos en (i); y un cuarto componente que comprende una proteína Gα recombinante; en donde (a) si dicha βγIP se fusiona con dicho donante de RET, dicha proteína Gβ o Gγ se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha βγIP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicha proteína Gβ o Gγ se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha βγIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicha proteína Gβ o Gγ se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; o (B) (i) una célula eucariota que expresa una proteína Gβ y una proteína Gγ y que comprende un biosensor que comprende un primer componente que comprende una proteína que interactúa con Gβγ (βγIP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; un segundo componente que comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR) fusionado, en donde dicho GPCR se fusiona en su extremo C terminal a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; un tercer componente que comprende una proteína Gα recombinante; en donde (a) si dicha βγIP se fusiona con dicho donante de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha βγIP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha βγIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho GPCR se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera.

Description

DESCRIPCIÓN
Biosensor basado en proteínas que interactúan con gbetagamma para monitorear la activación de proteínas G
Campo técnico
La presente descripción se refiere a la monitorización de la activación de proteínas G y, más específicamente, a un biosensor de señalización para detectar la activación de proteínas G.
Antecedentes
Las proteínas G heterotriméricas que consisten en tres subunidades a, p y y, transmiten la información proporcionada por los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) a varios efectores intracelulares. En ausencia de estimulación, la subunidad a de la proteína G forma un complejo con una molécula de GDP (difosfato de guanosina). El cambio conformacional que sigue a la activación del receptor por un ligando promueve la fosforilación de la molécula de GDP en un GTP (trifosfato de guanosina). La subunidad Ga unida a GTP se disocia de las subunidades GpY, las cuales quedan disponibles para interactuar con los efectores posteriores y modular su actividad. Por tanto, la activación de la proteína G puede evaluarse mediante el análisis de los efectores posteriores a través de su interacción con GpY, con el uso de proteínas que interactúan con GpY (Py IP). Después de la hidrólisis de GTP a GDP por la subunidad Ga, se restaura la afinidad de Ga por GpY y las tres subunidades se vuelven a asociar para formar una proteína G heterotrimérica inactiva, lo que termina la participación de los efectores y por lo tanto la transducción de señales (Gilman, 1987).
Además de la activación clásica de las proteínas G por los GPCR, otras proteínas también pueden modular la actividad de estas proteínas G heterotriméricas, como los reguladores de la señalización de proteínas G (RGS), los activadores de la señalización de proteínas G (AGS) y proteínas de resistencia a inhibidores de colinesterasa 8 (Ric-8). En algunas de estas vías de señalización no canónicas, la actividad del factor de intercambio de guanina (GEF) ejercida clásicamente por los GPCR se reemplaza por otra proteína como Ric-8, por ejemplo (Boularan y Kehrl, 2014).
Los receptores quinasas acoplados a proteína G (GRK) 2 y 3, que se caracterizaron por primera vez por su papel en la desensibilización de receptores, también son efectores involucrados a través de su interacción con las subunidades GpY. GRK2 y GRK3 contienen un dominio de homología con pleckstrina (PH) que interactúa con las subunidades GpY de las proteínas G, tras su disociación de la subunidad Ga unida a GTP activada (Pitcher, Inglese y otros, 1992) (Touhara, Inglese y otros, 1994)). Como consecuencia, las proteínas que interactúan con GpY (pYlP) como GRK2 y GRK3, pueden usarse para estudiar directamente la activación de proteínas G por los GPCR u otros activadores de proteínas G.
El documento WO 2010/063832 se refiere a métodos para probar la unión de un ligando a un receptor acoplado a proteína G.
El documento WO 2005/121755 se refiere a composiciones y métodos para identificar receptores acoplados a proteína G (GPCR), ligandos de estos y compuestos que modulan la transducción de señales de proteínas G.
Gales y otros (Real-time monitoring of receptor and G-protein interactions in living cells; Nat Methods. Marzo de 2005; 2(3): 177-84. Epub 2005 Feb 17) mencionan que los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan la familia más grande de proteínas involucradas en la transducción de señales. Se presenta un ensayo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) que monitorea directamente en tiempo real las interacciones tempranas entre los GPCR humanos y sus subunidades de proteína G afines en células humanas vivas.
Actualmente se utilizan varios enfoques en la industria del descubrimiento de fármacos para evaluar la activación de los GPCR y, por tanto, la interacción de las proteínas G con los receptores, como el ensayo de movilización de calcio o el ensayo radiactivo basado en la incorporación de GTPyS por las proteínas G. El ensayo de movilización de calcio mide un evento de señalización que ocurre después de la activación de Gq y puede aplicarse a receptores acoplados a Gi o Gs solo cuando se combina con el uso de subunidades Ga modificadas. En el caso del ensayo de incorporación de GTPyS, la activación de las diversas proteínas G heterotriméricas se mide directamente en las membranas celulares mediante el uso de GTPy35S radiactivo, y no se puede realizar en células vivas.
La activación de proteínas G en células vivas, sin modificar el activador de proteínas G o la subunidad Ga, no se ha explorado hasta ahora. Además, los métodos conocidos no son adecuados para estudiar todas las diferentes proteínas G con el uso de las mismas parejas de detección. Dichos ensayos serían particularmente útiles en las diferentes etapas del proceso de descubrimiento de fármacos, al permitir la caracterización del perfil de acoplamiento de proteínas G y facilitar la identificación de nuevos compuestos con propiedades de señalización definidas para su uso en ensayos de detección y estudios de relación estructura-actividad, por ejemplo. Esto es particularmente cierto dada la importancia de los activadores de proteínas G como dianas farmacológicas, donde un 26 % de todos los medicamentos recetados actúan a través de GPCR (Garland, 2013). Aunque se dispone de varios enfoques para apoyar el desarrollo de nuevas moléculas terapéuticamente activas dirigidas a los activadores de proteínas G, el descubrimiento de nuevos fármacos a menudo se ve limitado por la escasez de información disponible sobre el mecanismo de acción preciso de esos compuestos.
Por tanto, existe la necesidad de nuevas herramientas y ensayos para evaluar la activación de proteínas G.
La presente descripción se refiere a varios documentos, cuyo contenido se enumera en la sección de Referencias.
Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones.
Otros objetos, ventajas y características de la presente invención resultarán más evidentes tras la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de modalidades específicas de esta, que se dan a modo de ejemplo únicamente con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos adjuntos:
Las figuras 1A a 1C muestran diagramas esquemáticos que ilustran el principio subyacente al uso del biosensor basado en Py IP para la activación de proteínas G, mediante el uso de un GPCR como ejemplo de activador de proteínas G. El ensayo se basa en la competencia entre la subunidad Ga y la Py IP para la unión al dímero GpY. Mientras está en la forma inactiva, la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica está fuertemente unida al dímero GpY. Tras la unión del ligando al receptor, la subunidad Ga cambia de una forma unida a GDP a una forma unida a GTP, lo que resulta en su disociación de las subunidades GpY, lo que permite que Py IP sea reclutada a las subunidades GpY libres. La interacción entre Py IP y GpY reflejará así la activación de una proteína G específica, tras la estimulación del receptor. Se pueden utilizar diferentes métodos de detección para evaluar esta interacción entre PyIP y GpY, tales como enfoques de transferencia de energía por resonancia (RET) (figura 1A) o ensayos de complementación de proteínas (PC) (figura 1B). En los enfoques de transferencia de energía por resonancia, Py IP y GpY se marcan con un donante y aceptor de energía, y tras la activación de la proteína G, se observa un aumento en la señal de RET. En el caso del ensayo de complementación de proteínas, Py IP y GpY se fusionan con fragmentos de una proteína fluorescente o enzima luminiscente, y después de la activación de la proteína G, la complementación de los dos fragmentos conducirá a un aumento en la señal de fluorescencia o la actividad enzimática. La figura 1C muestra escenarios teóricos y la interpretación correspondiente de los resultados para el biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP. En la figura 1C se representan tres escenarios diferentes con el uso de BRET como ejemplo de método de detección. En el escenario 1 (izquierda) las células se transfectan con todos los componentes del biosensor excepto la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica. La falta de subunidades a hace que el exceso de subunidades GpY interactúe con PyIP en el estado basal. En el escenario 2 (centro), todos los componentes del biosensor se transfectan, pero la subunidad Ga que se sobreexpresa (Gai) no se acopla funcionalmente al receptor de interés. El escenario 3 (derecha) muestra una respuesta típica del biosensor cuando todos sus componentes se expresan junto con la subunidad Ga adecuada (Ga2) para el receptor de interés. En este caso, la activación del receptor conduce a un aumento en la señal de BRET que es causado por el reclutamiento de Py IP marcado con GFP a las subunidades GpY etiquetadas con RLuc acopladas previamente a la subunidad Ga específica.
La figura 2 presenta algunas de las diferentes construcciones analizadas para la optimización del biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP. En la figura 2A, se presenta la estructura de GRK2/3. GRK2/3 incluye diferentes dominios funcionales, un dominio de unión a calmodulina (CAM), un dominio RGS (Regulador de señalización de proteínas G) que puede inactivarse por la sustitución D110A descrita en este documento, un dominio catalítico para su actividad quinasa y que puede inactivarse por la sustitución K220R descrita en el presente documento, y un dominio de homología con pleckstrina (dominio PH) que se une a las subunidades PIP2 y Gp de proteínas G heterotriméricas. Estas interacciones promueven la translocación de GRK a la membrana plasmática y su activación. Se ha informado que la fosforilación de la porción C-terminal de GRK (serina 670 y 685) modula su actividad. Se probaron cuatro construcciones etiquetadas con GFP diferentes para GRK2 y GRK3, dos basadas en la secuencia de codificación completa de GRK y dos en el dominio de PH C-terminal/dominio de unión a Gp, con GFP en la parte N-terminal o C-terminal de GRK. Tanto las subunidades Gp como Gy se analizaron como una fusión con una etiqueta BRET y se pueden usar para monitorear la interacción GRK/GpY.
Las figuras 2B y 2C muestran el análisis de diferentes proporciones (titulación) de las cuatro construcciones de GRK diferentes (figura 2A) y las respuestas obtenidas para la activación de piAR de Gai5 (figura 2B) y para la activación de Gaii mediada por el receptor de tromboxano A2 (TPaR) (figura 2C). Las titulaciones del donante de BRET al aceptor se realizaron en células HEK293 transfectadas con construcciones que codifican un receptor y una Ga (piAR/Gai5 en la figura 2B y TPaR/Gaii en la figura 2C), Gpi, Rlucll-GY5 (0,5 ng por pocillo de una placa de 96 pocillos) y una cantidad variable de construcciones de GRK2 marcadas con GFPiO (hasta 75 ng/pocillo). Las células se trataron con vehículo o agonista (isoproterenol i pM y U-466i9 i00 nM para las células que expresan piAP y TPaR, respectivamente) durante i5 min. Las proporciones de BRET se informaron en función de la expresión de la construcción de GFP (evaluada en fluorescencia) sobre la expresión de la construcción de Rlucll (evaluada en bioluminiscencia). Estos resultados indican que la GRK de longitud completa etiquetada en su Cterminal con el donante de BRET (GFP) proporciona la mejor ventana dinámica en términos de amplitud de la señal de BRET y estabilidad de respuesta en un intervalo más amplio de proporciones de donante a aceptor.
Las figuras 3A a 3C muestran el perfil de activación de proteínas G de TPaR mediante el uso de un biosensor basado en Py IP. Figura 3A: Las células HEK293 que expresan transitoriamente TPaR junto con GRK2-GFP, Rluc-Gy5, Gpi y la Ga indicada, se expusieron a U-466l9 l0o nM o vehículo durante 15 min, antes de las mediciones de BRET. La condición simulada es sin sobreexpresión de subunidades Ga. Figura 3B: valores de BRET obtenidos para las células tratadas con agonista en la figura 3A expresados como porcentaje de los valores de BRET obtenidos con las células correspondientes tratadas con vehículo. La condición simulada se utiliza para determinar el umbral de una respuesta positiva. Figura 3C: Curvas de dosis-respuesta mediante el uso del agonista U-46619 para la activación de Gaq , Ga i 3 , Ga-M, Ga i 5 , GaqG66K y GaqY67C del TPaR mediante el uso del biosensor GRK2-GFP/Rluc-GY5/Gpi.
Las figuras 4A a 4J muestran los perfiles de activación de proteínas G para el receptor de dopamina D2 (D2R), el receptor a iB -adrenérgico (a i s AR) y el receptor a2c-adrenérgico (a2cAR) mediante el uso de un biosensor basado en Py IP. Las células HEK293 que expresan transitoriamente el D2R (figuras 4A y 4B), a iB AR (figuras 4C y 4D) o a2 cAR (figuras 4E y 4F) junto con GRK2-GFP, RIuc-Gy5, Gpi y la Ga indicada, fueron estimulados con los siguientes agonistas, rotigotina (figuras 4A y 4B), fenilepinefrina (figuras 4C, 4D, 4E) o epinefrina (figura 4E) durante i5 minutos antes de las mediciones de BRET. Figuras 4A, 4C y 4E: Los datos se expresan como porcentaje de la señal de BRET obtenida en células tratadas con vehículo. Se utilizó una condición simulada sin sobreexpresión de subunidades Ga para determinar el umbral de una respuesta positiva. Como se presenta en las figuras 4A, 4C y 4E, la proteína G con propiedades de activación promiscuas tales como GaqY67C se podrían utilizar para monitorear la activación del receptor (ver la posición y la secuencia circundante en la figura 14). Estos mutantes promiscuos de Ga podrían usarse como controles positivos para la activación del receptor, lo que podría ser útil para caracterizar antagonistas o cribar agonistas de receptores huérfanos. Figura 4B Curvas de dosisrespuesta para rotigotina, un agonista de D2R, con proteínas Ga seleccionadas (Gai i y cuatro mutantes de Gaq promiscuos: G66K, G66D, Y67C y F75G) mediante el uso del biosensor GRK2-GFP/RIuc-Gy5/Gb í . En la figura 4D, se presentan las curvas de dosis-respuesta para la fenilefrina, un agonista a-adrenérgico, con a i e AR y proteínas Ga seleccionadas (Ga i i y Gaq) mediante el uso del biosensor GRK2-GFP/Rluc-GY5/Gpi. En la figura 4E, se obtuvieron curvas dosis-respuesta de activación de Gaz para diferentes agonistas adrenérgicos: epinefrina, norepinefrina, fenilefrina e isoproterenol, de células HEK293 que expresan a2CAR, Gaz , GRK2-GFP, RIuc-Gy5 y G pi. La figura 4F muestra el perfil de activación de proteínas G para a2CAR mediante el uso de dos agonistas de a2CAR diferentes, epinefrina y fenilefrina. Estos resultados muestran que se puede usar un biosensor basado en PyIP para establecer la activación de proteínas G y los perfiles farmacológicos de diferentes receptores y ligandos. En las figuras 4G a 4J se obtuvieron las curvas de dosis-respuesta para la activación de Gaz promovida por epinefrina/a2CAR con diferentes combinaciones de subunidades G pi. Se transfectaron células HEK293 con construcciones que codifican a2CAR, Gaz , GRK2-GFP, diferentes Gy etiquetadas con Rluc (figuras 4G y 4H) y una Gp (Gpi en la figura 4G y la variante corta de Gp3 (Gp3sh), en la figura 4H). En las figuras 4I y 4J, las células se transfectaron con construcciones que codifican a2CAR, Gaz , GRK2-GFP, Gy etiquetada con Rluc (Gy1 en la figura 4I y Gy5, en la figura 4J) y diferentes Gp. Estos resultados muestran que las combinaciones de las subunidades Gp y Gy pueden conducir a un perfil farmacológico distinto de activación de proteínas G. Estas diferencias podrían estar vinculadas, en parte, a distintos perfiles farmacológicos observados con diferentes células y tejidos que expresan no solo un conjunto específico de subunidades Ga sino también diferentes combinaciones y niveles de subunidades Gp y Gy. Estos resultados muestran que un biosensor basado en Py IP podría ser útil para estudiar y comprender mejor estas diferencias.
Las figuras 5A a 5d muestran que el biosensor basado en Py IP puede usarse para caracterizar y validar la selectividad y el modo de acción de los moduladores de proteínas G. Las figuras 5A y 5B muestran la inhibición selectiva de Ga i i por PTX (un bloqueador de Ga i/Gao), y Gaq por Ubo-Qic (un análogo del inhibidor de Gaq: YM-254890). Las células HEk293 que expresan TPaR y Gaq (figura 5A) o D2R y Ga ii (figura 5B), junto con Gpi, RIuc-Gy5 y GRK2-GFP, se pretrataron con PTX, Ubo-Qic o vehículo (control) y después se expusieron a concentraciones crecientes de U-466i9 (figura 5A) o rotigotina (figura 5B) durante i5 minutos, antes de registrar las señales de BRET. En la figura 5C, la activación de proteínas G mediada por TPaR se utilizó para validar la selectividad del inhibidor Ubo-Qic. Las células que coexpresan TPaR y el biosensor GRK2-GFP/Rluc-GY5/Gpi la subunidad Ga indicada se pretrataron con Ubo-Qic y se expusieron a un vehículo o un agonista: U-466i9 (i00 nM). Estos resultados muestran que, de la familia Gaq (Gaq, Ga i i , Ga i4 y Ga i 5 ), solo Ga i5 es insensible a Ubo-Qic. Las proteínas Ga i2 y Ga i3 también son insensibles a Ubo-Qic. Figura 5D, Se usó el biosensor basado en PyIP para revelar la sensibilidad a Ubo-Qic de la activación de Gaq mutante. Se introdujeron sustituciones de Gaq en la posición 67 (véase la Fig. 14). Solo las sustituciones de este residuo de tirosina que son resistentes a la inhibición de Ubo-Qic (Y67C, Y67G, Y67S e Y67L) también mostraron propiedades promiscuas, lo que indica que este residuo también podría ser importante para controlar la activación de la proteína G. La sustitución del residuo Phe75 por glicina condujo a sólo una inhibición parcial de la activación mediada por Ubo-Qic (figura 5D) y también a un fenotipo promiscuo (ver la figura 4A).
Las figuras 6A y 6B muestran la cinética de las respuestas del biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP tras la activación del receptor. Figura 6A: Las células HEK293 que expresaban transitoriamente D2R junto con Ga i i , G pi, Rluc- Gy5 y GRK2-GFP se expusieron a rotigotina i pM o vehículo a la vez que se realizaban mediciones de BRET a intervalos regulares. La figura 6B: Las células HEK293 que expresaban transitoriamente TPaR junto con Ga i i , Gpi, RIuc-Gy5 y GRK2-GFP se expusieron a U-466i9 i00 nM o vehículo a la vez que se realizaban mediciones de BRET a intervalos regulares. En ambos casos, el agonista y el vehículo se agregaron a las células después de 30 segundos de mediciones.
Las figuras 7A y 7B muestran la evaluación del factor Z' para el biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP. Las células HEK293 que expresaban transitoriamente D2R y Gan (figura 7A) o TPaR y Ga-n (figura 7B), junto con Gp1, RIuc-Gy5 y GRK2-g Fp se expusieron a rotigotina 1 pM (figura 7A), U-46619 100 nM (figura 7B) o vehículo (figuras 7A, 7B) durante 15 min. Las proporciones de BREt se representan para cada pocilio individual de una placa de 96 pocilios. El factor Z', para estos experimentos representativos, se evaluó en 0,79 y 0,89 para D2R (figura 7A) y TPaR (figura 7B), respectivamente.
Las figuras 8A a 8C muestran un perfil de ligando con el biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP.
Figura 8A: Perfil de activación de proteínas G de células HEK293 que expresan transitoriamente el receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) junto con Gp1, RIuc-Gy5, GRK2-GFP y la Ga indicada, estimulados con angiotensina II 1 pM durante 15 min antes de las mediciones de BRET. Figura 8B: Perfiles de activación de la proteína G para una concentración saturada de análogos de angiotensina II (1 pM) para Gaq, Ga-n y Ga12. Los resultados en las figuras 8A y 8B se expresan como un porcentaje de la señal de BRET obtenida en las células tratadas con vehículo, y se utilizó una condición simulada sin sobreexpresión de subunidades Ga para determinar el umbral de una respuesta positiva. Figura 8C: Curvas de dosis-respuesta obtenidas mediante el uso de los ligandos Angll y DVG para la activación de Gaq y Ga12 del AT1R mediante el uso del biosensor GRK2-GFP/Rluc-GY5/Gp1. Los datos se expresan como % de la respuesta de Angll obtenida para cada proteína G.
Las figuras 9A y 9B muestran el uso de un método de detección basado en complementación de proteínas para evaluar la activación de proteínas G con el biosensor basado en Py IP; un ensayo de complementación de proteínas Rluc (Rluc-PCA). Figura 9A: factor Z' obtenido para células HEK293 transfectadas con TPaR, GRk2-RIucF1, RIucF2-Gy5, Gp1 y subunidad Ga-n, estimuladas con U-46619 100 nM o vehículo durante 10 min. Los valores de luminiscencia se representan para cada pocilio individual de una placa de 96 pocilios. El factor Z', para este experimento representativo, se evaluó en 0,53. Figura 9B: Curvas dosis-respuesta mediante el uso del agonista U-46619 para la activación de Ga-n del TPaR mediante el uso del biosensor GRK2-RIucF1/RIucF2-Gy5/G p1. Las figuras 10A a 10C muestran el uso de GRK3 como Py IP para evaluar la activación de la proteína G. Figura 10A: Curvas de dosis-respuesta obtenidas de células HEK293 que expresaban transitoriamente D2R junto con Ga i1, Gp1, RIuc-Gy5 y GRK2-GFP (círculos negros) o GRK3-GFP (triángulos blancos), expuestas a concentraciones crecientes del agonista rotigotina durante 15 minutos antes de las mediciones de BRET. Figura 10B: Cinética de la respuesta del biosensor basado en GRK3 para células HEK293 transfectadas con D2R, Gan, Gp1, RIuc-Gy5 y GRK3-GFP, expuestas a rotigotina 1 pM o vehículo a la vez que se realizaban las mediciones de BRET a intervalos regulares. El agonista y el vehículo se inyectaron en las células después de 30 segundos de mediciones. Figura 10C: Evaluación del factor Z' del biosensor basado en GRK3 para células HEK293 transfectadas con D2R, Gan, Gp1, RIuc-Gy5 y GRK3-GFP, expuestas a rotigotina 1 pM o vehículo durante 15 min. Las proporciones de BRET se representan para cada pocilio individual de una placa de 96 pocilios. El factor Z', para este experimento representativo, se evaluó en 0,71.
Las figuras 11A a 11D muestran los resultados de experimentos realizados con el uso de un vector policistrónico que codifica un biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP. Figura 11A: Diagrama esquemático que ilustra la construcción policistrónica que codifica las siguientes proteínas: GRK2-GFP, RIuc-Gy5 y Gp1. Un perfil de activación de proteína G se presenta en la figura 11B, para células HEK293 cotransfectadas con construcciones que codifican TPaR, una Ga (ya sea Gaq , Ga-n, Ga12, Ga13, Ga-M o Ga15/16; la condición simulada fue sin Ga) y una construcción policistrónica (descrita en la figura 11A) que codifica GRK2 WT marcada con GFP o un mutante de GRK2 con r Gs muerto (D110A). La activación de TPaR por su agonista (100 nM de U46619) condujo a resultados y perfiles similares con ambas construcciones policistrónicas, lo que indica que un dominio RGS funcional no es un requisito previo para el reclutamiento de GRK2. Figura 11C: Curvas de dosis-respuesta con el uso del agonista U-46619 para la activación de Ga-n de TPaR mediante el uso de la construcción policistrónica (con GRK2 WT) descrita en la figura 11A. En la figura 11D, se obtuvo un factor Z' para las células HEK293 transfectadas como en la figura 11C y estimuladas con U-46619 100 nM o vehículo durante 15 min. Las proporciones de BRET se representan para cada pocilio individual de una placa de 96 pocilios. El factor Z', para este experimento representativo, se evaluó en 0,80.
Las figuras 12A y 12B muestran un biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP anclado a la membrana. Figura 12A: diagrama esquemático que ilustra el principio subyacente al uso del biosensor basado en GRK2 anclado a membrana (GRK2-mem) y la construcción de ADN asociada que codifica GRK2-GFP-mem.
Figura 12B: Se obtuvieron preparaciones de membrana a partir de células HEK293 transfectadas con TPaR, Gp1, RIucII-Gy5, GRK2-GFP o GRK2-GFP-mem, en ausencia o presencia de Ga-n, que fueron estimuladas con U-46619 100 nM o vehículo durante 15 min. Después se realizaron experimentos de BRET en esas preparaciones de membrana. Los datos se expresan como porcentaje de la señal de BRET obtenida en células tratadas con vehículo. Las figuras 13A a 13C muestran que las sustituciones que se informan para afectar las funciones de GRK2 (RGS y catalítica) o su regulación por fosforilación, no previenen ni promueven significativamente su reclutamiento a proteínas G activadas. En la figura 13A, las células HEK293 que coexpresaban TPaR, Gaq , Gp1, RIucII-Gy5 y variantes de GRK2-GFP (WT = cuadrado relleno, mutante D110A con RGS muerto = círculo vacío y mutante K220R catalíticamente muerto = triángulo vacío) fueron estimuladas con dosis crecientes de U46619. Como se muestra en la figura 11B y 13A, no se requiere un dominio RGS funcional (ni este promueve) la respuesta de Gaq detectada con el biosensor. También se puede usar un mutante catalíticamente muerto de GRK2 con este biosensor (figuras 13A y 13C) en dos configuraciones: activación de proteína G medida como un aumento en BRET de la interacción GRK2-GFP con Gp1/Rlucll-GY5 libre (figura 13A) y de la interacción Rlucll-GRK2 con GP1/GFP10-Gy5 libre (figura 13C). El uso de estos mutantes minimizaría los efectos secundarios de la sobreexpresión de una quinasa funcional, que se sabe que inhibe la activación de PLC mediada por Gaq a través de su dominio RGS. El uso de tales mutantes podría ser ventajoso para aplicaciones que requieran la monitorización de múltiples vías de señalización a través de la multiplexación de sensores o de diferentes ensayos. En la figura 13B, se transfectaron células HEK293 como en la figura 13A pero con GRK2 WT (cuadrado relleno) o mutantes que evitarían (S670A = triángulos vacíos, S676A = diamantes vacíos y S685A = círculos vacíos) o imitarían (S670D = triángulos rellenos, S676D = diamantes rellenos y S685D = círculos rellenos) la fosforilación de su dominio de unión C-terminal. Se sabe que la fosforilación de GRK2 en estos residuos de serina por ERK, PKA y CDK2-CiclinaA, modula su actividad (Cong y otros, The Journal of Biological Chemistry, 276, 15192-15199; Pitcher y otros, The Journal of Biological Chemistry, 274, 34531-34534; Penela y otros, PNAS, 107(3): 1118-1123; Choudhary y otros, Mol Cell. 2009 36(2): 326-39). Sin embargo, los resultados presentados en la figura 13B proporcionan evidencia de que el reclutamiento de GRK2 a GPy podría ser insensible a la regulación por diferentes eventos de señalización. En la figura 13C, las células HEK293 que coexpresaban TPaR, Gaq, Gp1, GFP-Gy5 y variantes de Rlucll-GRK2 (WT = cuadrados rellenos y mutante K220R catalíticamente muerto = triángulos vacíos) se estimularon con dosis crecientes de U46619. Ambas configuraciones del donante y aceptor de BRET con etiquetas en el extremo N-terminal (figura 13C) o en el extremo C-terminal de GRK2 (figura 13A) condujeron a resultados similares, para proporcionar evidencia de que la configuración del biosensor es flexible.
La figura 14 muestra un alineamiento de secuencias de subunidades a de proteína G humana (SEQ ID NO: 1-17) y sustituciones que conducen a propiedades de acoplamiento promiscuas. Las subunidades Ga humanas de las proteínas G heterotriméricas se alinearon mediante el uso de la herramienta DIALIGN (http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de/dialign/submission.html), formateado con la herramienta Boxshade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) y se presenta una región centrada en el Enlazador1. Los residuos que muestran una alta conservación en todas las subunidades Ga se identifican con un fondo negro y gris. También se identifican el Enlazador1 y las hélices a de la predicción de estructura secundaria.
La figura 15A muestra un diagrama esquemático que ilustra un biosensor que comprende PyIP (GRK) etiquetado con un aceptor de RET (A) y un GPCR etiquetado en su extremo C-terminal con un donante de RET (D). El ensayo también se basa en la competencia entre la subunidad Ga y la Py IP para la unión al dímero GpY, que está unido a la porción C-terminal del GPCR. Mientras está en la forma inactiva, la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica está estrechamente unida al dímero GpY. Tras la unión del ligando al GPCR, la Ga se disocia de las subunidades GpY, lo que permite el reclutamiento de PyIP a las subunidades GpY libres y acerca el aceptor de RET al donante de RET unido al GPCR, para inducir/aumentar así la señal de BRET. Las figuras 15B y 15C muestran curvas de dosis-respuesta para la activación de la proteína G, obtenidas con el biosensor descrito en la figura 15A. Las células HEK293 que coexpresaban TPaR-Rlucll, diferentes Ga (Gaq = cuadrado relleno, Ga-n = triángulo relleno, Ga-M = diamante relleno y Ga12 = círculo vacío), Gp1, Gy5 y, ya sea GRK2 WT-GFP (figura 15B) o el mutante D110A GRK2-GFP (figura 15C), se estimularon con dosis crecientes de U46619. Las curvas de dosisrespuesta muestran perfiles similares en las figuras 15B y 15C que indican, como en las figuras 11B y 13A pero con una configuración de biosensor diferente, que no se requiere un RGS funcional para reclutar una PyIP a una proteína G activada.
La figura 16A muestra un diagrama esquemático que ilustra un biosensor que comprende una PyIP (GRK) etiquetada con el donante de RET (D) y un marcador de la membrana plasmática: un aceptor de RET (A) etiquetado con una secuencia de direccionamiento y anclaje a la membrana plasmática (por ejemplo, un dominio CAAX). El ensayo también se basa en la competencia entre la subunidad Ga y la Py IP para la unión al dímero GpY, en la membrana plasmática. Mientras está en la forma inactiva, la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica está estrechamente unida al dímero GpY. Tras la unión del ligando al GPCR, la Ga se disocia de las subunidades GpY, lo que permite el reclutamiento de Py IP para las subunidades GpY libres, en la membrana plasmática, lo que conduce a un aumento en la densidad del donante (Py IP-D) y el aceptor de RET (marcador de la membrana plasmática, A-CAAX), para inducir/aumentar así la señal de BRET. La figura 16B muestra las curvas de dosisrespuesta para la activación de la proteína G, obtenidas con el biosensor descrito en la figura 16A. Las células HEK293 que coexpresaban TPaR, Ga diferentes (Gaq = cuadrado relleno, Ga-n = triángulo relleno, condición simulada (sin Ga) = círculo vacío), Gp1, Gy5, Rlucll-GRK2 y rGFP-CAAX, se estimularon con dosis crecientes de U46619. Las curvas de dosis-respuesta en la figura 16B son similares a las obtenidas en las figuras 3C, 9B y 11C con diferentes configuraciones de biosensores. En la figura 16C, se obtuvo un factor Z' para las células HEK293 transfectadas como en la figura 16B y estimuladas con U-46619 100 nM o vehículo durante 15 min. Las proporciones de BRET se representan para cada pocillo individual de una placa de 96 pocillos. El factor Z', para este experimento representativo, se evaluó en 0,89.
La figura 17A muestra la secuencia de aminoácidos de GRK2 humana (SEQ ID NO: 18), donde las posiciones D110, K220R, S670, S676 y S685 (mutadas en algunas de las construcciones descritas en este documento) están en negrita, el dominio PH putativo está subrayado y la porción C-terminal de este (Cterm de GRK2, SEQ ID NO: 50) utilizada en algunas de las construcciones descritas en este documento está en cursiva.
La figura 17B muestra la secuencia de aminoácidos de GRK3 humana (SEQ ID NO: 19) donde el dominio PH putativo está subrayado, y la secuencia de aminoácidos de la porción C-terminal de esta (Cterm de GRK3, SEQ ID NO: 51) usada en algunas de las construcciones descritas en la presente está en cursiva.
La figura 17C muestra la secuencia de aminoácidos de PLEKHG2 (SEQ ID NO: 20) con el dominio PH putativo subrayado.
La figura 17D muestra la secuencia de aminoácidos de GFP10 (SEQ ID NO: 38) usada en los experimentos descritos en este documento.
La figura 17E muestra la secuencia de aminoácidos de GFP de Renilla reniformis (rGFP, SEQ ID NO: 46) usada en los experimentos descritos en este documento.
La figura 17F muestra la secuencia de aminoácidos de RLucll (SEQ ID NO: 39) usada en los experimentos descritos en este documento.
Descripción de la invención
Los términos y símbolos de genética, biología molecular, bioquímica y ácidos nucleicos que se usan en este documento siguen los de tratados y textos estándar en el campo, por ejemplo, Kornberg y Baker, DNA Replication, Segunda Edición (W.H. Freeman, Nueva York, 1992); Lehninger, Biochemistry, segunda edición (Worth Publishers, Nueva York, 1975); Strachan y Read, Human Molecular Genetics, segunda edición (Wiley-Liss, Nueva York, 1999); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, Nueva York, 1991); Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (iRl Press, Oxford, 1984); y similares. Todos los términos deben entenderse con sus significados típicos establecidos en la técnica correspondiente.
Los artículos "un" y "una" se utilizan en este documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
En los estudios descritos en el presente documento, los presentes inventores han demostrado que se puede usar un biosensor basado en la competencia con PyIP para monitorear la activación de proteínas G, sin necesidad de modificar el receptor y/o las subunidades Ga. Como se basa en la competencia, se necesita un solo biosensor para estudiar todas las proteínas G diferentes y establecer perfiles de activación/acoplamiento de proteína G sobre la base de la subunidad Ga cotransfectada. Los perfiles de activación de proteínas G no solo son importantes para caracterizar receptores y dianas farmacológicas, sino que también pueden ser útiles en el proceso de descubrimiento de fármacos para identificar, caracterizar y optimizar ligandos de GPCR con propiedades de señalización sesgadas asociadas con la eficacia terapéutica y la reducción de efectos secundarios.
La presente descripción se refiere a un biosensor universal para monitorear la activación de proteínas G, sin tener que modificar las subunidades proteicas Ga o los activadores de las proteínas G (como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), los activadores de la señalización de proteínas G (AGS), los reguladores de la señalización de proteínas G u otras entidades químicas y biológicas). Más específicamente, la descripción se refiere al uso de una proteína que interactúa con GpY (Py IP) para monitorear la activación de las diversas proteínas G heterotriméricas. Ventajosamente, el biosensor de señalización descrito en este documento permite un ensayo sensible y cuantitativo que se puede utilizar en ensayos de cribado a gran escala y estudios de la relación estructura-actividad para la identificación de ligandos (agonistas, antagonistas, agonistas inversos, moduladores alostéricos, etc.) dirigidos a la actividad de la proteína G. Además, el biosensor descrito en este documento representa una herramienta para evaluar los perfiles de activación de proteínas G y permite la elaboración de perfiles de compuestos al abordar qué proteínas G específicas se activan tras la estimulación.
Como se muestra en la figura 1, el sistema de acuerdo con una modalidad de la presente descripción se basa en la competencia entre la subunidad Ga y la PyIP para la unión al dímero GpY. Mientras está en la forma inactiva, la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica está fuertemente unida al dímero GpY. Tras la unión del ligando al receptor, la subunidad Ga cambia de una forma unida a GDP a una forma unida a GTP, lo que da como resultado su disociación de las subunidades GpY, para permitir el reclutamiento de PyIP a las subunidades GpY libres. La interacción entre Py IP y GpY reflejará así la activación de una proteína G específica, tras la estimulación del receptor.
Los presentes inventores también han demostrado que es posible monitorear la activación de proteínas G mediante el uso de un biosensor que mide el reclutamiento/localización de una byIP (por ejemplo, g Rk ), marcada con un donante de BRET (por ejemplo, RLuc), en la membrana plasmática (donde interactúa con el complejo GpY unido al GPCR) mediante el uso de un resto de direccionamiento a la membrana plasmática marcado con un aceptor de BRET complementario (por ejemplo, rGFP). El aumento de la concentración/densidad de Py IP en la membrana plasmática, una medida indirecta del reclutamiento de PyIP al complejo GpY, se detecta por un aumento en la señal de BRET.
Los presentes inventores han demostrado además que es posible monitorear la activación de proteínas G mediante el uso de un biosensor que mide el reclutamiento de una PyIP (por ejemplo, GRK), marcada con un donante de BRET (por ejemplo, RLuc), a un GPCR marcado con un aceptor de BRET complementario (por ejemplo, rGFP) (figura 15).
En este contexto, la presente descripción se refiere a un biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP y a un sistema que usa dicho biosensor para evaluar la activación de proteínas G específicas promovidas por sus activadores. El sistema comprende un activador de proteína G; una proteína Ga; y el biosensor descrito en la presente. La presente descripción se refiere además a un método para detectar la activación de proteínas G mediante el uso del sistema descrito en este documento.
Por tanto, la presente descripción se refiere a un sistema biosensor para detectar la actividad de proteína G, dicho sistema biosensor comprende los elementos definidos en (A) o (B):
(A) (i) un primer biosensor que comprende: un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; y un segundo componente que comprende una proteína Gp fusionada o una proteína Gy fusionada, en donde dicha proteína Gp o dicha proteína Gy se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; (ii) un segundo biosensor que comprende: el primer y segundo componentes definidos en (i); y un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; en donde (a) si dicha PyIP se fusiona con dicho donante de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha Py IP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; o (B) (i) un biosensor que comprende un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; un segundo componente que comprende un receptor acoplado a proteína G fusionado (GPCR), en donde dicho GPCR se fusiona en su extremo C terminal a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; en donde (a) si dicha Py IP se fusiona con dicho donante de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha Py IP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho GPCR se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera.
Por tanto, la presente descripción se refiere a un biosensor que comprende: (1) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionado a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (2) un segundo componente que comprende una proteína Gp fusionada o una proteína Gy fusionada, en donde dicha proteína Gp o dicha proteína Gy se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; (3) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante, en donde dicha proteína Ga recombinante es una proteína Ga promiscua o no selectiva, por ejemplo, una proteína Ga que comprende mutaciones en una posición correspondiente al residuo 66, 67 y/o 75 de Gaq humana, como se describe en el presente documento. En una modalidad, el biosensor comprende además un GPCR (nativo o recombinante), preferentemente un GPCR huérfano.
En una modalidad, el biosensor definido anteriormente comprende además una proteína Gp recombinante y/o una proteína Gy recombinante. En una modalidad adicional, el biosensor definido anteriormente comprende además una proteína Gp recombinante y una proteína Gy recombinante. En una modalidad, el biosensor definido anteriormente comprende además un GPCR, en una modalidad adicional un GPCR recombinante.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere así a un biosensor que comprende (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (PyIP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; y (ii) un segundo componente que comprende un resto fusionado de direccionamiento a la membrana plasmática (PM), en donde dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; en donde (a) si dicha PyIP se fusiona con dicho donante de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha PyIP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha PyIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera.
En una modalidad no limitante, la actividad del biosensor descrito en la presente es detectable sobre la base de una técnica seleccionada entre transferencia de energía por resonancia (ReT) tal como transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET); ensayo de complementación de proteínas o ensayo de complemento de fragmentos de proteínas (PCA) tal como complementación de fragmentos de enzimas (EFC) o complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC); y similares (véase la figura 1). Tales técnicas se conocen en la materia y emplean etiquetas/restos que pueden fusionarse al C-terminal, el N-terminal o dentro de los elementos proteicos del biosensor.
En los enfoques de transferencia de energía por resonancia, la PyIP y GpY se marcan con un donante y aceptor de energía, y tras la activación de la proteína G, se observa un aumento en la señal de RET. En el caso del ensayo de complementación de proteínas, la Py IP y GpY están marcadas con fragmentos de una proteína reportera, como una proteína fluorescente o una enzima luminiscente, y después de la activación de la proteína G, la complementación de los dos fragmentos conducirá a un aumento en la señal de la proteína reportera, por ejemplo, la señal de fluorescencia o la actividad enzimática.
La transferencia de energía por resonancia (abreviado RET) es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos cromóforos, con espectros de emisión/absorción superpuestos. Cuando los dos cromóforos (el "donante" y el "aceptor") están a una distancia corta (por ejemplo, 10-100 Angstroms) entre sí y sus dipolos de transición están orientados apropiadamente, el cromóforo donante es capaz de transferir su energía del estado de excitación al cromóforo aceptor a través de un acoplamiento dipolo-dipolo no radiactivo. Un tipo de RET es la transferencia de energía por resonancia bioluminiscente (BRET) que se basa en la transferencia no radiactiva de energía entre un bioluminóforo donante (enzima bioluminiscente como la luciferasa) y un fluoróforo aceptor (por ejemplo, GFP o YFP). Otro tipo de RET es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FREt ) que implica la transferencia de energía de un fluoróforo donante excitado a un fluoróforo aceptor adyacente. Por ejemplo, CFP e YFP, dos variantes de color de GFP, pueden usarse como donante y aceptor, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, el término "proteína fluorescente" se refiere a cualquier proteína que se vuelve fluorescente tras la excitación a una longitud de onda apropiada. Se ha desarrollado una amplia gama de proteínas fluorescentes que presentan perfiles espectrales de emisión de fluorescencia que abarcan casi todo el espectro de luz visible. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes verdes incluyen EGFP, GFP10, Emerald, Superfolder GFP, Azami Green, mWasabi, TagGFP, TurboGFP, AcGFP, ZsGreen y T-Sapphire. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes azules incluyen EBFP, EBFP2, Azurite y mTag-BFP. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes cian incluyen ECFP, mECFP, Cerulean, mTurquoise, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP, mTFP1 (Teal). Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes amarillas incluyen EYFP, Topaz, Venus, mVenus, mCitrine, mAmetrine, YPet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 y mBanana. Los ejemplos no limitantes de proteínas fluorescentes anaranjadas incluyen Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer y mTangerine. Los ejemplos no limitantes de proteínas rojas fluorescentes incluyen mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, HcRed1, mRasp-berry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum y AQ143.
"Superposición", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a la capacidad de la luz emitida por una proteína fluorescente donante o una enzima luminiscente (por ejemplo, luciferasa) de tener una longitud de onda capaz de excitar un fluoróforo (proteína fluorescente aceptora) que se encuentra muy cerca, generalmente entre aproximadamente 10-100 A (aproximadamente 1-10 nm). En consecuencia, la proteína fluorescente o luminiscente donante y la proteína fluorescente aceptora se seleccionan para permitir la transferencia de energía desde la proteína fluorescente o luminiscente donante, unida a un primer componente del biosensor, a la proteína fluorescente aceptora unida a un segundo componente del biosensor, cuando el primer y segundo componentes están muy próximos (es decir, en forma de un complejo o en el mismo compartimento celular, como la membrana plasmática). Dicha transferencia de energía se conoce comúnmente como "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (o Forster)" o "FRET" (si la proteína donante es una proteína fluorescente), o "transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia" o "BRET" (si la proteína donante es una proteína bioluminiscente). Por tanto, cualquier combinación de proteína fluorescente o luminiscente donante y proteínas fluorescentes aceptoras puede usarse de acuerdo con la presente invención siempre que se cumplan los criterios anteriores. Estas combinaciones suelen denominarse pares FRET o BRET. Un experto en la técnica conocerá la elección de un fluoróforo adecuado para su uso en un ensayo de BRET. En una modalidad, los fluoróforos incluyen proteína fluorescente verde - natural (GFP-wt), proteína fluorescente amarilla (YFP), Venus, Topaz, ZsYellow1, mOrange2, mKeima, proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente cian (CFP), Tsapphire, mAmetrine, proteína fluorescente verde 2 (GFP2), renilla GFP (rGFP) y proteína fluorescente verde 10 (GFP10), o variantes de estas. Las proteínas fluorescentes que tienen un máximo de excitación cercano a 400 nm pueden ser particularmente adecuadas. Los ejemplos más particulares de fluoróforos incluyen mAmetrine, proteína fluorescente cian (CFP) y GFP10. Los ejemplos representativos de pares FRET incluyen BFP/CFP, BFP/GFP, BFP/YFP, BFP/DsRed, CFP/GFP, CFP/YFP, CFP/mVenus, GFP/YFP, GFP2/YFP, GFP/DsRed, TagBFP/TagGFP2, TagGFP2/TagRFP y similares (véase, por ejemplo, Müller y otros, Front. Plant Sci., 4: 413, 2013). Los ejemplos representativos de pares BRET incluyen luciferasa (Luc)/GFP, Luc/Venus, Luc/Topaz, Luc/GFP-10, Luc/GFP-2, Luc/YFP, Luc/rGFP y similares.
Como se usa en este documento, el término "luciferasa" se refiere a la clase de enzimas oxidativas usadas en bioluminiscencia y que son distintas de una fotoproteína. Un ejemplo es la luciferasa de luciérnaga (EC 1.13.12.7) de la luciérnaga Photinus pyralis (luciferasa de P. pyralis). Varias luciferasas recombinantes de varias otras especies, incluida la luciferasa de Renilla reniformis (GENBANK: AAA29804) y variantes de estas (por ejemplo, una variante estable de luciferasa de Renilla, por ejemplo, Rlucll (GENBANK: AAV52877.1), Rluc8 (GENBANK: EF446136.1) Luciferasa de Gaussia (Gluc, GENBANK: AAG54095.1), Luciferasa NanoLuc® (Promega®) también están disponibles comercialmente. Se puede usar cualquier luciferasa de acuerdo con la presente invención siempre que pueda metabolizar un sustrato de luciferasa tal como las luciferinas. Las luciferinas son una clase de compuestos heterocíclicos emisores de luz que se oxidan en presencia de luciferasa para producir oxiluciferina y energía en forma de luz. Los ejemplos no limitantes de luciferinas incluyen D-luciferina, compuestos basados en imidazopirazinona como coelenterazina (coelenterazina 400A (DeepBlueC™), coelenterazina H y derivados de e-coelenterazina como metoxi e-coelenterazina (Prolume® Purple I de NanoLight Technology®), ViviRen™ (de Promega®), luciferina Latia (formiato de (E) -2-metil-4-(2,6,6-trimetil-1 -ciclohex-1-il)-1 -buten-1 -ol), luciferina bacteriana, luciferina de dinoflagelados, etc. Los sustratos de luciferasa pueden tener espectros de emisión ligeramente diferentes y, por tanto, se seleccionarán para favorecer la transferencia de energía óptima al aceptor. En una modalidad, la luciferasa es Luciferasa de Renilla natural (o nativa). En una modalidad, la luciferasa es la variante estable de la luciferasa de Renilla Rluc8. En otra modalidad, la luciferasa es luciferasa de Gaussia (GLuc). En una modalidad específica, la luciferasa es Luciferasa de Renilla II (Rlucll) y la luciferina es coelenterazina 400A.
En una modalidad, se usa una de las siguientes configuraciones de BRET en los biosensores y métodos descritos en la presente: BRET1 que comprende coelenterazina-h (coel-h) y una YFP (YFP) o una GFP de Renilla (rGFP); BRET2 que comprende coelenterazina-400a (coel-400a) y una GFP excitada con UV (uvGFP) o una de Renilla (rGFP); o BRET3 que comprende coel-ho v-coelenterazina (de Nanolight Technology®) y la FP naranja monomérica (mOrange). En una modalidad adicional, se usa RLucll en las configuraciones de BRET mencionadas anteriormente. En otra modalidad, se usa una de las siguientes configuraciones de BRET en los biosensores y métodos descritos en este documento: Rlucll/coel-400a/FP2 azul mejorada (EB), Rlucll/coel-400a/proteína fluorescente supercian (SCFP3A), Rlucll/coel -400a/mAmetrine o Rlucll/coel-400a/GFP10. En una modalidad, el donante de BRET es una luciferasa de Renilla (por ejemplo, RLucll) y el aceptor de BRET es una GFP de Renilla (por ejemplo, GFP de Renilla reniformis).
En PCA, cada una de las proteínas (por ejemplo, PyIP y Gp/GY, o GPCR) se une covalentemente a fragmentos incompletos de una proteína reportera, y la interacción entre PyIP y Gp/GY acerca los fragmentos de la proteína reportera a una proximidad suficiente para permitirles formar una proteína reportera funcional cuya actividad puede medirse. Cualquier proteína que pueda dividirse en dos partes y reconstituirse de forma no covalente puede usarse en el biosensor basado en p Ca . El término "proteína reportera" se refiere a una proteína que puede detectarse (por ejemplo, mediante fluorescencia, espectroscopía, luminometría, etc.) fácilmente y que no está presente normalmente (de forma endógena) en el sistema utilizado. Las proteínas indicadoras típicas utilizadas en PCA incluyen enzimas (cuya actividad se puede medir mediante el uso de un sustrato adecuado) como dihidrofolato reductasa (DHFR), plactamasa, p-galactosidasa o proteínas que dan señales colorimétricas o fluorescentes como una luciferasa (por ejemplo, luciferasa de Renilla), GFP y variantes de estas.
En otra modalidad no limitante, las etiquetas de RET o PCA están ubicadas en: (i) la proteína Py IP y Gp, o (ii) la proteína PyIP y Gy. En una modalidad no limitante adicional, la PyIP y las subunidades Gp o Gy se marcan en su extremo N-terminal, C-terminal o en cualquier región interna dentro de las proteínas. En una modalidad, la Py IP y las subunidades Gp o Gy se marcan en su extremo N-terminal o C-terminal. En una modalidad no limitante, las etiquetas de PCA descritas en el presente documento que se añaden a la PyIP y las subunidades Gp o Gy pueden ser, sin limitarse a, un fluoróforo, una luciferasa o un fragmento de estos que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente.
"GPCR" se refiere a moléculas de GPCR nativas de longitud completa; así como a moléculas de GPCR mutantes/variantes. En Foord y otros (2005) Pharmacol Rev.57, 279-288, que se incorpora en este documento como referencia, se proporciona una lista de GPCR, y en la base de datos IUPHAR-DB está disponible una lista actualizada de GPCR (Harmar AJ, y otros (2009) IUPHAR-DB: the IUPHAR database of G protein-coupled receptors and ion channels. Nucl. Acids Res. 37 (número de la base de datos): D680-D685; Sharman JL, y otros (2013) IUPHAR-DB: updated database content and new features. Nucl. Acids Res. 41 (número de la base de datos): D1083-8; Alexander SPH, Benson HE, Faccenda E, Pawson AJ, Sharman JL, Spedding M, Peters JA y Harmar AJ, CGTP Collaborators. (2013) The Concise Guide to PHARMACOLOGY 2013/14: G Protein-Coupled Receptors. Br J Pharmacol. 170: 1459­ 1581). En una modalidad, el GPCR es un GPCR huérfano. El término "GPCR huérfano", como se usa en el presente documento, se refiere a un receptor aparente que tiene una estructura similar a otros GPCR identificados pero cuyo ligando endógeno aún no se ha identificado. A los receptores GPCR huérfanos a menudo se les da el nombre "GPR" seguido de un número, por ejemplo, GPR1. Una lista actualizada de GPCR huérfanos está disponible en la base de datos IUPHAR-DB descrita anteriormente.
En una modalidad, el GPCR se fusiona en su C-terminal a un donante de RET o aceptor de RET, en una modalidad adicional un donante de RET, tal como una luciferasa (RLuc).
El término "recombinante", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ácido nucleico recombinante, es decir, un ácido nucleico preparado mediante técnicas de biología molecular/ingeniería genética, por ejemplo, una proteína que se expresa después de la transfección/transducción de una célula (o su progenie) con un ácido nucleico (por ejemplo, presente en un vector) que codifica la proteína (a diferencia de una proteína que es expresada naturalmente por una célula).
El término variante (o mutante) como se usa en este documento se refiere a una proteína que es sustancialmente similar en estructura (secuencia de aminoácidos) y actividad biológica a la proteína nativa correspondiente. Incluye fragmentos que comprenden uno o más dominios de una proteína nativa, así como proteínas de fusión que comprenden la proteína nativa o un fragmento de esta. Una variante puede comprender una o más mutaciones (sustituciones, deleciones, inserciones) con respecto a la proteína nativa para generar una proteína que tenga ciertas características deseadas, por ejemplo, ser constitutivamente activa, inactiva, unión alterada a uno o más ligandos, etc. Las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, agregan o eliminan un solo aminoácido o nucleótido o un pequeño porcentaje de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia crean una "variante modificada de manera conservadora", donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservadora son adicionales y no excluyen las variantes polimórficas y los alelos de la invención.
"Homología" o "identidad" y "homólogo" o "idéntico" se refieren a la secuencia y/o similitud estructural entre dos polipéptidos o dos moléculas de ácido nucleico. La homología/identidad se puede determinar comparando cada posición en las secuencias alineadas. Un grado de homología/identidad entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos o aminoácidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias. Como se usa el término en este documento, una secuencia de ácido nucleico es homóloga a otra secuencia si las dos secuencias son sustancialmente idénticas y la actividad funcional de las secuencias se conserva (como se usa en este documento, el término "homólogo" no infiere relación evolutiva). Dos secuencias de ácido nucleico se consideran sustancialmente idénticas si, cuando están alineadas de manera óptima (se permiten espacios), comparten al menos aproximadamente un 50 % de similitud o identidad de secuencia, o si las secuencias comparten motivos funcionales definidos. En modalidades alternativas, la similitud de secuencia en secuencias sustancialmente idénticas alineadas de forma óptima puede ser al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Como se usa en este documento, un porcentaje dado de homología/identidad entre secuencias denota el grado de identidad de secuencia en secuencias alineadas de manera óptima. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 % de identidad, aunque preferentemente menos de aproximadamente el 25 % de identidad, con cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento.
En una modalidad no limitante, el sistema incluye una célula viva, una preparación de membrana o ambas. El sistema definido en este documento es, pero sin limitarse a, una preparación de membrana y dicha PyIP está anclada a la membrana mediante un enlazador de direccionamiento a la membrana, por ejemplo, un enlazador de proteína/péptido que comprende un dominio de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) (por ejemplo, un péptido señal de anclaje a la membrana plasmática). Este dominio de direccionamiento a la membrana plasmática puede ser, sin limitarse a, un grupo lipídico unido covalentemente a la cadena peptídica, como modificaciones de palmitoilación, miristoilación o prenilación (como la señal de anclaje a la membrana de KRAS, por ejemplo (Hancock 2003)), un dominio transmembrana, o una región polibásica (como la presente en GRK5 por ejemplo).
En una modalidad, el resto de direccionamiento a la PM comprende un motivo CAAX (C es un residuo de cisteína, AA son dos residuos alifáticos y X representa cualquier aminoácido. Los motivos CAAX se encuentran en "proteínas CAAX" que se definen como un grupo de proteínas con una secuencia de aminoácidos específica en el extremo C-terminal que dirige su modificación postraduccional. Las proteínas CAAX abarcan una amplia variedad de moléculas que incluyen láminas nucleares (filamentos intermedios) como la prelamina A, lamina B1 y lamina B2, Ras y una multitud de proteínas de unión a GTP (proteínas G) como Ras, Rho, Rac y Cdc42, varias proteínas quinasas y fosfatasas, etc. (véase, por ejemplo, Gao y otros, Am J Transl Res. 2009; 1(3): 312-325). Las proteínas que tienen un motivo o caja CAAX al final del extremo C-terminal típicamente necesitan un proceso de prenilación antes de que las proteínas migren a la membrana plasmática o la membrana nuclear y ejerzan diferentes funciones. En una modalidad, la caja CAAX se deriva de una proteína de la familia RAS humana, por ejemplo, HRAS, NRAS, Ral-A, KRAS4A o KRAS4B. Los últimos residuos C-terminales de RAS, NRAS, KRAS4A o KRAs4b (a los que se hace referencia como región hipervariable o HVR) se muestran a continuación, con la supuesta región mínima de direccionamiento a la membrana plasmática en cursiva y la caja CAAX subrayada (ver, por ejemplo, Ahearn y otros, Nature Reviews Molecular Cell Biology 13: 39-51, enero de 2012): HRAS: KLNPPDESGPGCMSCKCVLS; (SEQ ID NO:40); NRAS: KLNSSDDGTQGCMGLPCVVM; (SEQ ID NO:41); KRAS4A: KISKEEKTPGCVKIKKC//M: (SEQ ID NO:42); KRAS4B: KMSKDGKKKKKKSKTKCVIM: (SEQ ID NO:43); Ral-A/Ral1: KNGKKKRKSLAKRIRERCCIL (SEQ ID NO:54). En una modalidad, el resto de direccionamiento a la membrana comprende los últimos 4 residuos de las secuencias representadas anteriormente. En una modalidad adicional, el resto de direccionamiento a la membrana comprende los últimos 10 residuos de las secuencias representadas anteriormente. En una modalidad, el resto de direccionamiento a la membrana comprende la porción C-terminal (por ejemplo, aproximadamente los últimos 10-30 o 15-25 aminoácidos) de una proteína CAAX, por ejemplo, una proteína de la familia RAS humana, por ejemplo, aproximadamente los últimos 10-30, 15-25 o 20 aminoácidos de una proteína de la familia RAS humana.
En una modalidad, el resto de direccionamiento a la PM comprende la secuencia KKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID NO: 37) de KRAS4B. En otra modalidad, el resto de direccionamiento a la PM comprende la secuencia de palmitoilación de direccionamiento a la membrana plasmática de hRas y la secuencia señal de prenilación de Ral-A/Ral1 (secuencia: CMSCKCCIL, SEQ ID NO: 44).
Varias proteínas también contienen un dominio polibásico no lipídico que se dirige a la PM como las pequeñas GTPasas Ras, la fosfatasa PTEN, la tirosina quinasa no receptora Src, los reguladores de actina WASP y Ma Rc KS, y las quinasas receptoras acopladas a proteína G (GRK) como GRK5. En una modalidad, el dominio polibásico es de GRK5 y comprende la secuencia SPKKGLLQRLFKRq Hq NNSKS (SEQ ID NO: 45). En una modalidad, el resto de direccionamiento a la PM se fusiona en el extremo C-terminal de un donante o aceptor de RET, y en una modalidad adicional un aceptor de RET tal como una GFP (por ejemplo, rGFP). En otra modalidad, el resto de direccionamiento a la PM se fusiona en el extremo C-terminal de un donante o aceptor de RET, y en una modalidad adicional un aceptor de RET como una GFP (por ejemplo, rGFP), y el donante o aceptor de RET se fusiona en su N-terminal a una Py IP, tal como una proteína g Rk o un fragmento/variante de esta que interactúa con GpY.
De acuerdo con la presente descripción, un activador de proteína G incluye, pero no se limita a, la activación clásica de proteínas G por GPCR y otras proteínas que también pueden modular la actividad de estas proteínas G heterotriméricas, tales como reguladores de la señalización de proteínas G (RGS), activadores de la señalización de proteínas G (AGS) y proteínas de resistencia a los inhibidores de colinesterasa 8 (Ric-8). En algunas de estas vías de señalización no canónicas, la actividad del factor de intercambio de guanina (GEF) ejercida clásicamente por los GPCR se reemplaza por otra proteína como Ric-8, por ejemplo (Boularan y Kehrl, 2014).
En una modalidad, el activador de proteína G es un miembro de la familia GPCR.
La subunidad de proteína Ga tal como se define en el presente documento incluye, pero no se limita a, las 17 isoformas conocidas diferentes, sus variantes de corte y empalme y cualquier proteína Ga mutada, por ejemplo, las que conducen a Ga no selectiva/promiscua. En una modalidad no limitante, la proteína Ga descrita en el presente documento se selecciona entre cualquiera de las proteínas Ga naturales de mamíferos, que incluye Gaq, Gas, Ga i i , Ga i2, Ga i3, Gat-cone, Gat-rod, Gat-qust, Gaz , GaoA, GaoB, Ga0lf, Ga i i , Ga i 2 , Ga i3, Ga i 4 yG a i5 / i6 (ahora denominada GNA15), las variantes de corte y empalme de estas isoformas, así como sus variantes funcionales. En una modalidad, la subunidad de la proteína Ga es de la familia G i. En una modalidad, la subunidad de la proteína Ga es de la familia Gs. En una modalidad, la subunidad de la proteína Ga es de la familia Gq. En una modalidad, la subunidad de la proteína Ga es de la familia G i2 / i3. En una modalidad, la proteína Ga es una proteína Ga promiscua o no selectiva. En una modalidad adicional, la proteína Ga es una proteína Ga mutada (por ejemplo, proteínas Gaq) que tiene una sustitución en cualquiera de las siguientes posiciones, G66, Y67, F75 y cualquier combinación de estas, o una sustitución conservada equivalente en otros subtipos de Ga, que produce proteínas Ga no selectivas que son activadas por cualquier GPCR), incluidos los receptores huérfanos (es decir, que pueden interactuar con los GPCR independientemente del acoplamiento natural preferencial de estos receptores a proteínas Ga específicas, también conocidas como proteínas Ga promiscuas), también se incluyen en la presente descripción. En una modalidad, la proteína Ga recombinante utilizada en los biosensores/métodos descritos en este documento es una proteína Ga promiscua, y el GPCR es un GPCR huérfano.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un polipéptido Ga mutado que comprende una mutación en una posición correspondiente al residuo 67 y/o residuo 75 de la proteína Gaq humana. Dicha mutación puede ser una inserción, deleción o sustitución, por ejemplo, una sustitución no conservadora. La figura 14 describe un alineamiento de las secuencias de proteínas hGa representativas que pueden mutar de acuerdo con la presente invención, donde las posiciones 67 y 75 correspondientes de Gaq se indican con flechas. El experto entenderá que según el número de residuos N-terminal de las posiciones correspondientes 67 y 75 de Gaq en una Ga particular, la numeración del residuo varía. Por ejemplo, en hGai4 , el residuo correspondiente a la posición 67 de Gaq es el residuo 63 (Y). Del mismo modo, en hGai2 , el residuo correspondiente a la posición 67 de Gaq es el residuo 85 (F). Por tanto, la presente invención abarca, por ejemplo, un polipéptido Ga i4 mutado que comprende una mutación en la posición 63 (por ejemplo, una sustitución de un residuo no aromático) y un polipéptido Ga i2 mutado que comprende una mutación en la posición 85 (por ejemplo, una sustitución de un residuo no aromático), que corresponden a una mutación en la posición 67 de Gaq. Cualquier polipéptido Ga mutado que comprende una mutación en una o más de las posiciones que corresponden al residuo 67 y/o el residuo 75 de la proteína Gaq humana se incluyen en la presente descripción.
En una modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido Ga mutado que comprende una cualquiera de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: i- i7 , en donde el residuo correspondiente al residuo 67 y/o el residuo 75 de la proteína Gaq humana está mutado. En una modalidad, la mutación está en una posición correspondiente al residuo 67 de la proteína Gaq humana. En una modalidad, la mutación está en una posición correspondiente al residuo 67 y es una sustitución de un residuo no aromático, en una modalidad adicional cisteína. En otra modalidad, la mutación está en una posición correspondiente al residuo 75 de la proteína Gaq humana, y es una sustitución de un residuo no aromático, en una modalidad adicional el residuo no aromático es glicina. Dicho polipéptido Ga mutado se puede usar en cualquiera de los biosensores y/o métodos descritos en el presente documento. En una modalidad no limitante, la proteína Gaq mutada comprende una de las siguientes sustituciones, GaqG66K, GaqY67C y GaqF75G, que dan como resultado proteínas Ga no selectivas.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido Ga mutado definido anteriormente. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un plásmido o vector que comprende el ácido nucleico definido anteriormente. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula (célula huésped) que comprende el ácido nucleico o vector definidos anteriormente. En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido Ga mutado definido en la presente. En una modalidad, la célula se ha transfectado o transformado con un ácido nucleico que codifica el polipéptido Ga mutado definido en la presente. La invención proporciona además un sistema de expresión recombinante, vectores y células, tales como los descritos anteriormente, para la expresión del polipéptido Ga mutado definido en la presente, por ejemplo, mediante el uso de medios de cultivo y reactivos bien conocidos en la técnica. La célula puede ser cualquier célula que pueda expresar el polipéptido Ga mutado definido anteriormente. Las células huésped adecuadas y los métodos para la expresión de proteínas se conocen bien en la técnica. Puede usarse cualquier célula que pueda expresar el polipéptido Ga mutado definido anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse células huésped eucariotas tales como células de mamífero (por ejemplo, células de roedores tales como líneas celulares de ratón, rata y hámster, células/líneas celulares humanas). En otra modalidad, la célula mencionada anteriormente es una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular de riñón embrionario (por ejemplo, células HEK293 o HEK293T).
i2
En modalidades, la proteína Gp descrita en este documento se selecciona entre cualquiera de las proteínas Gp conocidas, que incluye Gp1, Gp2, Gp3 (por ejemplo, una variante corta de Gp3, Gp3sh), Gp4 y Gp5 (Gp5-S o Gp5-L), las variantes de empalme de estas isotermas y sus variantes funcionales. En una modalidad adicional, la proteína Gp es Gp1. En otra modalidad, la proteína Gp es Gp3. En una modalidad adicional, la proteína Gp (por ejemplo, Gp1) está etiquetada en el extremo N con un aceptor de BRET, tal como una GFP.
En modalidades, la proteína Gy descrita en este documento se selecciona entre cualquiera de las proteínas Gy humanas conocidas, que incluyen Gy1, Gy2, Gy3, Gy4, Gy5, Gy7, Gy8, Gy9, Gy10, Gy11, Gy12 y Gy i3, y variantes funcionales de estas. En otra modalidad, la proteína Gy es Gy5. En otra modalidad, la proteínaGY (por ejemplo, Gy5) está marcada en el extremo N con un donante de BRET, como una luciferasa. En otra modalidad, la proteína Gy (por ejemplo, Gy5) está marcada en el extremo N con un aceptor de BRET, como una GFP. En otra modalidad, la proteína Gy (por ejemplo, Gy5) está marcada en el extremo N con un primer dominio de una proteína reportera compatible con p Ca , por ejemplo, una luciferasa (por ejemplo, luciferasa de Renilla).
En una modalidad, la pYlP descrita en este documento es una proteína que interactúa con el dímero GpY tras la disociación del heterotrímero GaPY y que comprende un dominio de homología con pleckstrina (PH), como una proteína quinasa receptora acoplada a proteína G (GRK) (GRK2 o GRK3) o un fragmento funcional de esta que comprende el dominio de homología con pleckstrina (PH) C-terminal de una proteína GRK (es decir, que mantiene la capacidad de interactuar con un dímero GpY), un dominio de homología con pleckstrina que contiene el miembro 2 de la familia G (con dominio RhoGef) (PLe KHg 2). Las secuencias de aminoácidos de GRK2, GRK3 y PLEKHG2 se representan en las figuras 17A-C, con el dominio PH subrayado. En una modalidad no limitante, la proteína GRK descrita en este documento (GRK2 o GRK3) o un fragmento de esta que mantiene la capacidad de interactuar con un dímero GpY (por ejemplo, que comprende el dominio de homología con pleckstrina (PH) C-terminal de GRK, tal como un fragmento C-terminal que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 50 o 51) está marcado en el extremo C-terminal con un aceptor de BRET, tal como un fluoróforo. En una modalidad, la pYlP es GRK2 o GRK3 o una variante/fragmento de estas, y está fusionada en el extremo C con un aceptor de BRET, tal como una GFP. En otra modalidad, la pYlP es una variante de una proteína GRK que comprende una mutación que inactiva su dominio regulador de señalización de proteína G (r Gs ) (variante "RGS-muerto"). En una modalidad adicional, la variante "RGS-muerto" de una proteína GRK comprende una mutación en una posición correspondiente al residuo D110 de GRK2, por ejemplo, una sustitución de D por A. El dominio RGS de GRK2 humana nativa (acceso a UniProtKB P25098) y g RK3 (acceso a UniProtKB P35626) abarca aproximadamente los residuos 54 a 175. En otra modalidad, la pYlP es una variante de una proteína GRK que comprende una mutación que inactiva su dominio quinasa (variante "quinasa muerta"). En una modalidad adicional, la variante "quinasa muerta" de una proteína GRK comprende una mutación (por ejemplo, sustitución no conservadora) en una posición correspondiente al residuo K220 de GRK2, por ejemplo, una sustitución de K por D. El dominio quinasa de GRK2 (acceso a UniProtKB P25098) y GRK3 (acceso a UniProtKB P35626) abarca aproximadamente los residuos 191 a 453. En otra modalidad, la pYlP es una variante de una proteína GRK que comprende una mutación en su dominio C-terminal, por ejemplo, dentro de los últimos 30 residuos C-terminales. En una modalidad adicional, la mutación es un residuo de serina ubicado dentro del dominio C-terminal, y más particularmente una serina que puede fosforilarse en la proteína nativa. En una modalidad adicional, la mutación (por ejemplo, sustitución no conservadora) está en una posición correspondiente al residuo S670, S676 y/o S685 de GRK2, por ejemplo, una sustitución de S por A y/o S por D.
En modalidades, los dominios de las moléculas de fusión descritas en el presente documento pueden unirse covalentemente ya sea directamente (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) o "indirectamente" a través de un resto enlazador adecuado, por ejemplo, un enlazador de uno o más aminoácidos u otro tipo de enlazador químico (por ejemplo, un enlazador de carbohidratos, un enlazador de lípidos, un enlazador de ácidos grasos, un enlazador de poliéter, PEG, etc.) En una modalidad, se pueden insertar uno o más dominios adicionales antes (N-terminal), entre o después (C-terminal) de los dominios definidos anteriormente. En una modalidad, los dominios de las moléculas de fusión se unen covalentemente a través de un enlace peptídico. En otra modalidad, uno o más de los componentes de las moléculas de fusión se unen a través de un enlazador peptídico. Pueden emplearse enlazadores para proporcionar la conformación deseada de los cromóforos marcadores de BRET/FRET dentro del compuesto marcado, por ejemplo, incluida la separación entre cromóforos en un par BRET/FRET. Los enlazadores pueden estar unidos al C terminal, al N terminal o en una posición intermedia. En una modalidad, los enlazadores son enlazadores de péptidos, que típicamente varían de 2 a 30 aminoácidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5 a aproximadamente 20-25 aminoácidos. La composición y la longitud de cada uno de los enlazadores se pueden elegir según las diversas propiedades deseadas, tales como flexibilidad y solubilidad acuosa. Por ejemplo, el enlazador peptídico puede comprender residuos de aminoácidos relativamente pequeños, que incluyen, pero no se limitan a, glicina; pequeños residuos de aminoácidos pueden reducir el volumen estérico y aumentar la flexibilidad del péptido enlazador. El enlazador peptídico también puede comprender aminoácidos polares, que incluyen, pero no se limitan a, serina. Los residuos de aminoácidos polares pueden aumentar la solubilidad acuosa del enlazador peptídico. Además, programas como Globplot 2.3 (Linding y otros, GlobPlot: exploring protein sequences for globularity and disorder, Nucleic Acid Res 2003 -Vol. 31, núm.13, 3701-8), pueden usarse para ayudar a determinar el grado de desorden y globularidad, y por tanto también su grado de flexibilidad. En una modalidad, el enlazador peptídico comprende una o más de las secuencias de aminoácidos descritas en los Ejemplos más adelante.
En una modalidad no limitativa, como se ilustra en la figura 12A, la construcción basada en pYlP recombinante que se describe en este documento comprende una PyIP marcada con un fluoróforo, una luciferasa o un fragmento de estos, que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente, un enlazador, preferentemente un enlazador polipeptídico flexible, y un dominio o señal de anclaje/direccionamiento a la membrana plasmática (PM) para anclar la Py Ip a la membrana. En una modalidad, el enlazador flexible tiene una longitud correspondiente a la longitud de una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 aminoácidos, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 100 a aproximadamente 500, 400 o 300 aminoácidos, preferentemente una longitud de aproximadamente 200 a 400, 200 a 300 o aproximadamente 200 aminoácidos. En una modalidad adicional, el enlazador flexible comprende una secuencia de aminoácidos aleatoria de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 aminoácidos, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 100 a aproximadamente 500, 400 o 300 aminoácidos, preferentemente una longitud de aproximadamente 200 a 400, 200 a 300 o 200 aminoácidos. Se conocen en la técnica métodos para diseñar enlazadores de aminoácidos flexibles, y más específicamente enlazadores con globularidad mínima y desorden máximo. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso del programa Globplot descrito anteriormente. La secuencia puede optimizarse adicionalmente para eliminar supuestos puntos calientes de agregación, dominios de localización y/o motivos de interacción y fosforilación. En una modalidad, el enlazador flexible se ubica entre el donante o aceptor de BRET (por ejemplo, Rluc o GFP) y el dominio de direccionamiento a la membrana plasmática. En una modalidad adicional, la construcción tiene la siguiente configuración: Py IP (por ejemplo, GRK2) - aceptor de BRET (por ejemplo, GFP) - enlazador flexible - dominio de direccionamiento a la PM (por ejemplo, dominio CAAX).
En una modalidad, la presente descripción se refiere a un sistema que comprende: un GPCR; una proteína Ga seleccionada entre las siguientes: Gaq , Gas , Ga i1, Ga i2, Ga i3, Gat-cone, Gat-rod, Gat -qust, Gaz , GaoA, GaoB, Gaolf, Gan, Ga-i2 , Ga-i3 , Ga-M y Ga-i5 /16, y proteínas Ga no selectivas mutadas como se describe en el presente documento; un biosensor de señalización que comprende una proteína GRK (GRK2 o GRK3) o un fragmento de esta que comprende el dominio de homología con pleckstrina (PH) C-terminal de GRK, marcado con un fluoróforo, una luciferasa o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente, una proteína Gp y una proteína Gy, en donde la proteína Gp o la proteína Gy está marcada con un fluoróforo, una luciferasa o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente.
En una modalidad, la presente descripción se refiere a un sistema que comprende: un GPCR; una proteína Ga seleccionada entre las siguientes: Gaq , Gas, Ga i1, Ga i2, Ga1 i3, Gat-cone, Gat-rod, Gat -qust, Gaz , GaoA, GaoB, Gaolf, Gan , Ga12, Ga13, Ga14 y Ga15/16, y una proteína Ga mutada que tiene una sustitución en una posición correspondiente a cualquiera de las posiciones de Gaq: G66, Y67 y/o F75; un biosensor de señalización que comprende una proteína GRK (GRK2 o GRK3) o un fragmento de esta que comprende el dominio de homología con pleckstrina (PH) C-terminal de GRK, marcado con un fluoróforo, una luciferasa o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente, una proteína Gp1 y una proteína Gy5, en donde la proteína Gp o la proteína Gy está marcada con un fluoróforo, una luciferasa o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente.
De acuerdo con otro aspecto amplio no limitante, la presente descripción se refiere a un sistema para caracterizar una firma de señalización de un ligando, donde el sistema comprende: un activador de la actividad de proteína G; una proteína Ga; y un biosensor o sistema como se describe en este documento.
La presente descripción se refiere, además, a un sistema que comprende secuencias de ácido nucleico, que podrían ser, pero no se limitan a, una molécula de ADN, una molécula de ARN, un virus o un plásmido que codifican proteínas como se define en la presente descripción. En una modalidad, la presente descripción se refiere, además, a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica uno o más de los componentes proteicos (por ejemplo, proteínas de fusión) de los biosensores descritos en este documento. En una modalidad, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica (i) una PyIP, (ii) un primer fluoróforo, una proteína bioluminiscente o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o proteína bioluminiscente; (iii) una proteína Gy; (iv) un segundo fluoróforo, una proteína bioluminiscente o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o una proteína bioluminiscente y (v) una proteína Gp. En una modalidad adicional, el ácido nucleico comprende además una o más secuencias que codifican uno o más enlazadores ubicados entre los componentes del biosensor. En una modalidad adicional, el ácido nucleico comprende además una o más secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores, potenciadores y/u otras secuencias reguladoras, y/o una o más secuencias implicadas en la regulación de la traducción, por ejemplo, secuencia(s) de sitio(s) interno(s) de entrada al ribosoma (IRES).
En una modalidad, el ácido nucleico está presente en un vector/plásmido, en una modalidad adicional, un vector de expresión/plásmido. Dichos vectores comprenden una secuencia de ácido nucleico que puede codificar los componentes definidos anteriormente (por ejemplo, proteínas de fusión) del biosensor descrito en el presente documento, unida operativamente a una o más secuencias reguladoras de la transcripción.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión". Un vector de expresión recombinante de la presente invención se puede construir mediante técnicas estándar conocidas por un experto en la materia y que se encuentran, por ejemplo, en Sambrook y otros (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Está disponible una variedad de estrategias para unir fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de ADN, y los expertos en la técnica pueden determinarla fácilmente. Los vectores de la presente invención pueden contener, además, otros elementos de secuencia para facilitar la propagación y selección del vector en bacterias y células huésped. Además, los vectores de la presente invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos para uno o más sitios de endonucleasas de restricción. Los expertos en la técnica conocen bien las secuencias codificantes, tales como para marcadores de selección y genes indicadores.
Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede introducirse en una célula (una célula huésped), que puede incluir una célula viva que puede expresar la región codificante de la proteína del vector de expresión recombinante definido. La célula viva puede incluir tanto una célula cultivada como una célula dentro de un organismo vivo. Por consiguiente, la invención proporciona, además, células huésped que contienen los vectores de expresión recombinantes de la invención. Los términos "célula", "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Dichos términos se refieren no solo a la célula objeto particular sino a la progenie o la posible progenie de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance del término como se usa en este documento.
El ADN del vector se puede introducir en las células mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a técnicas para introducir ácido nucleico extraño en una célula huésped, incluida la coprecipitación de fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación, microinyección y transfección mediada por virus. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) y otros manuales de laboratorio. "Secuencia/elemento regulador transcripcional" es un término genérico que se refiere a secuencias de ADN, tales como señales de iniciación y terminación, potenciadores y promotores, señales de corte y empalme, señales de poliadenilación que inducen o controlan la transcripción de secuencias codificantes de proteínas con las que están unidas operativamente. Una primera secuencia de ácido nucleico está "unida operativamente" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o la expresión de las secuencias codificantes. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura. Sin embargo, dado que, por ejemplo, los potenciadores funcionan generalmente cuando están separados de los promotores por varias kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar unidos operativamente pero no contiguos.
En una modalidad y como se muestra en la figura 11A, el ácido nucleico o vector codifica más de uno de los componentes (proteínas de fusión) de los biosensores descritos en el presente documento (es decir, construcción policistrónica). En una modalidad, la construcción policistrónica (por ejemplo, ADN, vector) comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína PyIP y una Gy, cada una etiquetada con un fluoróforo adecuado, una luciferasa o un fragmento de esta que comprende una porción de una proteína fluorescente o enzima luminiscente, además de una proteína Gp. El sistema de la invención se puede reproducir mediante cotransfección de esta construcción policistrónica con una molécula de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad de proteína Ga y un activador de proteína G de interés.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende los ácidos nucleicos y/o vectores definidos en este documento.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona, además, una célula (por ejemplo, una célula huésped) que comprende o expresa cualquiera de los componentes proteicos (por ejemplo, proteínas de fusión, proteínas recombinantes) de cualquiera de los biosensores descritos en este documento. En una modalidad, la célula se ha transfectado o transformado con un ácido nucleico que codifica el polipéptido Ga mutado definido en la presente. La invención proporciona además un sistema de expresión recombinante, vectores y células, tales como los descritos anteriormente, para la expresión del polipéptido Ga mutado definido en la presente, por ejemplo, mediante el uso de medios de cultivo y reactivos bien conocidos en la técnica. La célula puede ser cualquier célula que pueda expresar el polipéptido Ga mutado definido anteriormente. Las células huésped adecuadas y los métodos para la expresión de proteínas se conocen bien en la técnica. Puede usarse cualquier célula que pueda expresar el polipéptido Ga mutado definido anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse células huésped eucariotas tales como células de mamífero (por ejemplo, células de roedores tales como líneas celulares de ratón, rata y hámster, células/líneas celulares humanas). En otra modalidad, la célula mencionada anteriormente es una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular de riñón embrionario (por ejemplo, células HEK293 o HEK293T). En otro aspecto, la presente descripción proporciona, además, una preparación de membrana que comprende o expresa cualquiera de los componentes proteicos (por ejemplo, proteínas de fusión, proteínas recombinantes) de cualquiera de los biosensores descritos en este documento, en una modalidad adicional una proteína de fusión anclada a la membrana.
La presente descripción se refiere además a un método para evaluar una modulación en el reclutamiento de una proteína que interactúa con GpY (pYlP) a una subunidad GpY entre una primera condición y una segunda condición, dicho método comprende: proporcionar uno de los biosensores definidos en este documento; medir la señal del aceptor de BRET en dichas primera y segunda condiciones; en donde una diferencia en la señal de BRET entre dicha primera y segunda condiciones es indicativa de una modulación en el reclutamiento de una proteína que interactúa con GpY (PyIP) a una subunidad GpY entre la primera condición y la segunda condición. En una modalidad, la primera condición es la presencia de un agente de prueba y la segunda condición es la ausencia de un agente de prueba, en donde una diferencia en la señal de BRET es indicativa de que el agente de prueba modula (aumenta o disminuye) el reclutamiento de la proteína que interactúa con GpY (pYlP) a la subunidad GpY. El reclutamiento de la proteína que interactúa con GpY (pYlP) a la subunidad GpY puede usarse como una lectura para la activación de un GPCR y/o proteína G.
La presente descripción se refiere además a un método para detectar la activación de proteínas G que comprende un sistema descrito en este documento, el método comprende: 1) poner en contacto dicho sistema con un compuesto que activa una proteína G, y 2) detectar la activación de la proteína G midiendo la señal del biosensor. El método puede comprender además las etapas de 3) derivar la información de acoplamiento funcional de la proteína G a partir de la señal del biosensor de señalización, y 4) procesar la información para determinar el perfil de activación de la proteína G del activador de la proteína G y la firma de señalización del compuesto. Con el uso de un sistema biosensor que comprende una pluralidad de biosensores, en donde cada uno de los biosensores comprende una proteína Ga recombinante diferente, es posible determinar el perfil de acoplamiento de proteína G de cualquier GPCR y/o ligando de GPCR, como se ejemplifica en la figura 3A y 3B.
Los términos "compuesto", "agente", "compuesto de prueba" o "agente de prueba" se refieren a cualquier molécula (por ejemplo, candidatos a fármacos) que se puede cribar mediante el método/biosensor de la invención y que se puede obtener de cualquier fuente, incluidas las bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluida la expresión de oligonucleótidos aleatorios. Alternativamente, están disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, las bibliotecas y compuestos producidos de forma natural o sintética se modifican fácilmente por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.
La presente descripción se refiere además a un método para determinar si un agente de prueba modula la actividad de un GPCR, dicho método comprende medir la señal emitida por un aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agente de prueba en uno de los biosensores descritos en este documento; en donde una señal más alta medida en presencia del agente es indicativa de que dicho agente de prueba aumenta la actividad de dicho GPCR, y una señal más baja medida en presencia del agente es indicativa de que dicho agente inhibe la actividad de dicho GPCR. En una modalidad, el método comprende:
(1) proporcionar un biosensor que comprende los elementos definidos en (A), (B) o (C):
(A) (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (pYlP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (ii) un segundo componente que comprende una proteína Gp fusionada o una proteína Gy fusionada, en donde dicha proteína Gp o dicha proteína Gy se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera, en donde (a) si dicha pYlP se fusiona con dicho donante de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha pYlP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha pYlP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; (iii) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; y (iv) un cuarto componente que comprende dicho GPCR;
(B) (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (pYlP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (ii) un segundo componente que comprende dicho GPCR fusionado en su C-terminal a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; (iii) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; en donde (a) si dicha pYlP se fusiona con dicho donante de r Et , dicho GPCR se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha pyIp se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha pYlP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho GPCR se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; o
(C)
(i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (pYlP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera;
(ii) un segundo componente que comprende un resto de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) fusionado, en donde dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; en donde (a) si dicha Py IP se fusiona con dicho donante de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha PyIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera;
(iii) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; y
(iv ) un cuarto componente que comprende dicho GPCR; y
(2) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agente de prueba; en donde una señal más alta medida en presencia del agente es indicativa de que dicho agente de prueba aumenta la actividad de dicho GPCR, y una señal más baja medida en presencia del agente es indicativa de que dicho agente inhibe la actividad de dicho GPCR.
En una modalidad, el método mencionado anteriormente comprende, además:
(3) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en el (los) biosensor(es) definido(s) en este documento en presencia y ausencia de un agente de prueba y en presencia de un agonista de GPCR, en donde la proteína Ga recombinante se acopla al GPCR (es decir, se conoce que se acopla o se activa por el GPCR); y
(4) determinar si dicho agente de prueba es un inhibidor de dicha proteína Ga; en donde una señal más baja medida en presencia del agente de prueba indica que el agente de prueba es un inhibidor de la proteína Ga, y una señal similar o más alta medida en presencia del agente de prueba indica que el agente de prueba no es un inhibidor de la proteína Ga.
En una modalidad, el término "señal más alta" o "señal más baja" como se usa en este documento se refiere a una señal que es al menos 10, 20, 30, 40, 45 o 50 % más alta (o más baja) con respecto a la señal de referencia medida en ausencia del agente de prueba. En otra modalidad, la "señal más alta" o la "señal más baja" se determina cuando muestra una diferencia estadísticamente significativa (determinada con un análisis estadístico adecuado) en la señal medida en la presencia en relación con la ausencia del agente de prueba, por ejemplo, al combinar los resultados obtenidos en una pluralidad de muestras. En la técnica se conocen los análisis estadísticos (ANOVA, prueba t de Student, Chi cuadrado, etc.) para determinar diferencias significativas entre diferentes conjuntos de datos, y tal análisis puede realizarse mediante el uso de programas informáticos adecuados.
La presente descripción se refiere además a un método para identificar la(s) proteína(s) Ga activada(s) por un agonista de GPCR (perfil de proteína G/firma del agonista), dicho método comprende (i) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agonista de GPCR en una pluralidad de biosensores como se define en este documento, en donde cada uno de los biosensores comprende una proteína Ga recombinante diferente; (ii) identificar la(s) proteína(s) Ga activada(s) por dicho agonista de GPCR; en donde un mayor aumento de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en un biosensor que comprende una proteína Ga recombinante en relación con un biosensor correspondiente que no expresa la proteína Ga recombinante es indicativo de que la proteína Ga es activada por dicho agonista de GPCR, y en donde un aumento o una disminución similar o menor de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en un biosensor que comprende una proteína Ga recombinante en relación con un biosensor correspondiente que no expresa la proteína Ga recombinante es indicativo de que dicho agonista de GPCR no activa la proteína Ga. En una modalidad, el método comprende: (a) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agonista de GPCR en el primero y en la pluralidad de segundos biosensores del sistema biosensor definido en la presente, y (b) identificar la(s) proteína(s) Ga activada(s) por dicho agonista de GPCR; en donde un mayor aumento de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en dicho segundo biosensor en relación con dicho primer biosensor es indicativo de que dicho agonista de GPCR activa la proteína Ga, y en donde un aumento o una disminución similar o menor de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en dicho segundo biosensor con respecto a dicho primer biosensor es indicativo de que dicho agonista de GPCR no activa la proteína Ga.
Pueden usarse controles positivos y controles negativos en los métodos/ensayos descritos en este documento. Las muestras de control y prueba se pueden realizar varias veces para obtener resultados estadísticamente significativos.
En una modalidad, los métodos mencionados anteriormente son métodos de alto rendimiento (cribado de alto rendimiento, HTS). El término "cribado de alto rendimiento" (HTS), como se usa en este documento, se refiere a un método que permite cribar rápidamente y en paralelo un gran número de compuestos (cientos, miles) para determinar una actividad de unión o actividad biológica contra moléculas diana. Dichos métodos de HTS se realizan típicamente en placas de microtitulación que tienen varios pocillos, por ejemplo 384, 1536 o 3456 pocillos. Para HTS, es importante que la señal de lectura se detecte con alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad.
Los métodos y dispositivos para medir la señal de BRET se conocen bien en la técnica. La señal de BRET puede medirse, por ejemplo, determinando la intensidad de la señal del aceptor de BRET (intensidad de la luz) y/o calculando la relación entre la señal o la intensidad luminosa emitida por el aceptor de BRET y la señal o la intensidad luminosa emitida por el donante de BRET (proporción BRET). La señal de BRET puede medirse mediante el uso de un lector de microplacas o un microscopio con un juego de filtros adecuado para detectar las emisiones de luz del donante de BRET y/o aceptor de BRET.
Debe entenderse que cualquier combinación/subcombinación de las características o modalidades descritas en el presente documento puede estar presente o usarse en los biosensores, sistemas y/o métodos descritos en este documento.
En una modalidad, los biosensores, sistemas y/o métodos descritos en este documento comprenden una o más de las construcciones/proteínas de fusión y/o proteínas recombinantes descritas en los Ejemplos a continuación y las figuras adjuntas, por ejemplo, RIuc-Gy1 a Gy13, GRK-GFP, GRK-RlucF1, RIucF2-Gy5, GRK2-GFP-mem, Rluc-GRK2, GFP-Gy5, GFP-CAAX o GPCR-Rluc.
Modo(s) para llevar a cabo la invención
La presente invención se ilustra en más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Reactivos. La angiotensina II (Angll; [Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe], SEQ ID NO: 49), poli-ornitina, poli-D-lisina, isoproterenol, rotigotina, epinefrina, norepinefrina, fenilefrina y la toxina pertussis eran de Sigma®. u46619 era de Cayman Chemical® (Ann Arbor, MI). [Sar1, IleB]-AngN (SI) and [Asp1, Val5, Gly8]-AngII (DVG) [Sar1-Val5-D-Phe8] Angll (sVdF) y [Sar1-D-Ala8] Angll fueron sintetizados en la Université de Sherbrooke (Canadá, QC). UBO-Qic (L-treonina, (3R)-N-acetil-3-hidroxi-L-leucil-(aR)-a-hidroxibencenopropanoil-2,3-idehidro-N-metilalanil-L-alanil-N-metil-L-alanil-(3R)-3-[[(2S,3R)-3-hidroxi-4-metiM-oxo-2-[(1-oxopropil)amino]pentil]oxi]-L-leucil-N,O-dimetil-,(7^1)-lactona (9CI)) se obtuvo del Instituto de Biología Farmacéutica de la Universidad de Bonn (Alemania). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero fetal bovino, OPTI-MEM® y otros reactivos de cultivo celular se adquirieron de Invitrogen®. Coelenterazina 400a, Coelenterazina H y Prolume® Purple I se adquirieron de Goldbio®, Biotium® o Nanolight® Technology. La polietilenimina (PEI; 25 kDa lineal; se adquirió de Polysciences® (Warrington, PA, Estados Unidos). El ADN de esperma de salmón se adquirió de Lifetechnologies (ThermoFisher). La ADN polimerasa Phusion era de Thermo Scientific®. Las enzimas de restricción y la T4 ADN ligasa se obtuvieron de NEB®. Los oligonucleótidos para mutagénesis y aplicaciones de PCR se sintetizaron en BioCorp DNA®.
Vectores de expresión: receptores y proteínas G. El plásmido que codifica AT1R fue un generoso regalo de Stéphane Laporte (Universidad McGill, Montreal, Canadá). Gaq , Ga i i , Ga i 2 , Ga¡3, Ga i 4 , Ga i5 / i6 , GaoA, GaoB, Gaz , Gas , Ga¡ i , Ga¡2, Ga¡3, Gp1, TPaR, D2R y a^AR se obtuvieron del cDNA Resource Center (cDNA.org). Los plásmidos que codifican proteínas Ga mutantes, incluidas GaqG66K, GaqY67C y GaqF75G, se obtuvieron mediante mutagénesis dirigida al sitio (superposición de PCR) de la secuencia codificante de la proteína natural Gaq con el uso de los cebadores representados en la Tabla I. Los fragmentos de PCR fueron digeridos con enzimas de restricción Acc65I + XhoI y se clonaron en pCDNA3.1 Zeo(+) (de Invitrogen®, Carlsbad, California) digerido con Acc65I + XhoI. Se utilizó la secuenciación de ADN para la validación de las diferentes construcciones y para identificar las sustituciones específicas creadas a partir de cebadores degenerados.
Tabla I: Secuencias de cebadores usados en los experimentos descritos en este documento
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Continuación
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Vectores de expresión: construcciones de biosensores. RIuc-Gy5 y GFP-Gy: El plásmido que codifica las proteínas de fusión RIuc-Gy1 a Gy13 y GFP10-Gy5 se obtuvo mediante amplificación por PCR de las secuencias codificantes de Gy que después se fusionaron en marco en su extremo N-terminal a la secuencia humanizada de luciferasa II de Renilla (hRlucll) (una variante de la hRluc descrita anteriormente (Leduc, Breton y otros, 2009), SEQ ID NO:39) en el vector pcDNA3.1 (secuencia enlazadora: GSAGT, SEQ ID NO: 33), o a la GFP10 (una forma variante de la proteína fluorescente verde (GFP) descrita anteriormente (Mercier, Salahpour y otros, 2002, SEQ ID NO: 38). GRK2-GFP y GRK3-GFP: GRK2-GFP, GRK3-GFP, GRK2 Cterm (SEQ ID NO: 50)-GFP, GRK3 Cterm (SEQ ID NO: 51)-GFP se generaron mediante amplificación por PCR de GRK2 y GRK3, que después se fusionaron en su extremo C-terminal con la GFP10 en el vector pcDNA3.1 Zeo(+), para generar un enlazador de 11 residuos de aminoácidos entre la proteína GRK y la GFP10 (secuencia enlazadora: GSAGTGKLPAT, SEQ ID NO: 34). GFP-GRK2 y GFP-GRK3:
GRK2-GFP, GFP-GRK2 Cterm (SEQ ID NO: 50), GFP-GRK3 Cterm (SEQ ID NO: 51) se generaron mediante amplificación por PCR de GRK2 y GRK3, que después se fusionaron en su N-terminal a la GFP10 (SEQ ID NO: 38) en el vector pcDNA3.1 Zeo(+), para generar un enlazador de 7 residuos de aminoácidos entre la proteína GRK y la GFP10 (secuencia enlazadora: GSAGTGG, SEQ ID NO: 52). Se generaron mutantes de GRK2 etiquetados con GFP y Rlucll mediante mutagénesis dirigida por PCR con el uso de un procedimiento similar. GRK2-Rluc F1 y Rluc F2-Gy5: GRK2-Rluc F1 se obtuvo mediante amplificación por PCR de la secuencia codificante de los residuos 1 a 110 de la secuencia humanizada de luciferasa II de Renilla expuesta en la SEQ ID NO: 39 (Rluc F1), que posteriormente se fusionó con el C-terminal de la proteína GRK2 en el vector pcDNA3.1 Zeo (+), para generar un enlazador de 18 aminoácidos entre el fragmento de Rluc y la GRK2 (secuencia enlazadora: GSAGWGKLGSAGSG-SAGS, SEQ ID NO: 35). Rluc F2- Gy5 se obtuvo mediante amplificación por PCR de la secuencia codificante de los residuos 111 a 311 de la secuencia humanizada de luciferasa de Renilla expuesta en la SEQ ID NO: 39 (Rluc F2), que posteriormente se fusionó en marco del N-terminal de la proteína Gy5 en el vector pcDNA3.1 Zeo(+), para generar un enlazador de 11 residuos de aminoácidos entre el fragmento de Rluc y Gy5 (secuencia enlazadora: GSAGTGSAGTT, SEQ ID NO: 36).
GRK2-GFP-mem: la construcción GRK2-GFP-mem que codifica una proteína de fusión entre GRK2-GFP y un enlazador flexible de 200 residuos de aminoácidos seguida de la señal de anclaje a la membrana de la proteína KRAS humana (motivo de prenilación: CAAX) (Hancock 2003) se generó de la siguiente manera. En primer lugar, se creó un enlazador con una estructura desordenada predicha a partir de una secuencia aleatoria de 2000 residuos. A partir de esta secuencia, se seleccionó un segmento de 200 residuos con mínima globularidad y máximo índice de desorden, después de la eliminación de puntos calientes de agregación, localización putativa, motivos de interacción y fosforilación. Este enlazador flexible de 200 aminoácidos (SEQ ID NO: 53) se sintetizó directamente y después se fusionó en marco en el N-terminal de la señal de anclaje a la membrana de la variante b de empalme de la proteína KRAS humana (secuencia de aminoácidos: KKKKKKSKTKCVIM, SEQ ID NO: 37) mediante el uso de amplificación por PCR. El enlazador flexible seguido de la señal de prenilación de KRAS se subclonó después en el vector GRK2-GFP pcDNA3.1 Zeo(+), en el extremo C-terminal de la proteína GRK2-GFP. Vector biosensor policistrónico: El vector policistrónico que codifica GRK2-GFP, RIuc-Gy5 y Gp1 se desarrolló al subclonar primero las proteínas de fusión GRK2-GFP10 WT y mutante D110A en el vector pLVX. A continuación, se realizó subclonación de IRES-Gp1 en pcDNA3.1 RIuc-Gy5 para obtener pcDNA3.1 RIuc-Gy5-IRES-GP1. Finalmente, las dos construcciones se ensamblaron para generar un vector pLVX que contenía GRK2-Gf P-IRES-RIuc-Gy5-IRES-GP1. rGFP-CAAX: El plásmido que codifica la proteína de fusión rGFP-CAAX se obtuvo mediante amplificación por PCR de la secuencia codificante de rGFP (SEQ ID NO: 46) con un cebador inverso que codifica un enlazador (secuencia: GSAGTMASNNTASG, SEQ ID NO: 47) y la secuencia polibásica de direccionamiento a la membrana plasmática y la secuencia señal de prenilación de la variante b de corte y empalme de KRAS: -GKKKKKKSKTKCVIM (denominada: CAAX, SEQ ID NO: 37). La secuencia de direccionamiento a la membrana plasmática CAAX está en marco en el extremo C-terminal de la secuencia codificante de rGFP. El fragmento de PCR se subclona en el vector pcDNA3.1 (+).
Rlucll-GRK2: El ADNc de GRK2 se amplificó por PCR y se subclonó con Rlucll en su extremo N-terminal en el vector de expresión pIREShyg3 (de Clonetech®) con el enlazador: GGSGSGSGS (SEQ ID NO: 48).
Cultivo celular y transfecciones. Las células 293 de riñón embrionario humano (HEK293) se mantuvieron en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10 %, penicilina/estreptomicina 100 unidades/ml a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Dos días antes de los experimentos, las células HEK293 se transfectaron con los plásmidos indicados mediante el uso de polietilenimina lineal de 25 kDa (PEI) como agente de transfección (en una proporción de 3 a 1, PEI/ADN) (Hamdan, Rochdi y otros, 2007), y después se sembraron directamente en placas de 96 pocilios pretratadas con bromhidrato de poli-L-ornitina o poli-D-lisina, a una densidad de 35000 células por pocilio (para los ensayos de BRET y PCA en células vivas), o placas de 6 pocilios a una densidad de 1000000 células por pocillo (para los ensayos de BRET en preparaciones de membrana).
Ensayos de BRET en células vivas. Las células sembradas en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de la adición de tampón Tyrode (composición: NaCi 137 mM, KCl 0,9 mM, MgCl21 mM, NaHCOa 11,9 mM, NaH2PO43,6 mM, HEPES 25 mM, glucosa 5,5 mM y CaCÍ21 mM, pH 7,4). A continuación, las células se trataron con los diferentes ligandos o vehículo durante los tiempos indicados. Se añadió el sustrato de Rluc, coelenterazina 400a, a una concentración final de 2,5 pM y las células se incubaron adicionalmente durante 5 minutos más. A continuación, se registraron los valores de BRET mediante el uso de un lector de microplacas multimodo Mithras™ LB940 o un lector de microplacas multimodo TRISTAR® LB942, equipados con los siguientes filtros: 400 nm ± 70 nm (donante de energía) y 515 nm ± 20 nm (aceptor de energía). Los valores de BRET se determinaron calculando la relación de la luz emitida por GFP (515 nm) sobre la luz emitida por Rluc (400 nm). Para determinar el % de activación (Estim como % del basal), los valores de BRET obtenidos para las células tratadas con agonista se expresaron como un porcentaje de los valores de BRET obtenidos con las células correspondientes tratadas con vehículo.
Ensayos de BRET para la translocación de GRK2-GFP al receptor marcado con Rlucll (figuras 15B y 15C): 100 ng de HA-TPaR-Rlucll, 750 ng de GRK2-GFP10 (WT en la figura 15B o mutante D110A en la figura 15C), 100 ng de la Ga indicada, 100 ng de Gp1 WT y 100 ng de Gy5 WT y PEI en una proporción de PEI: ADN de 3:1, se añaden a una suspensión de HEK293SL (350,000 células/ml). Las células se sembraron (100 pl de la suspensión de células/PEI/ADN por pocillo de una placa de 96 pocillos) en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se preincubaron en Tyrode CaCh 1 mM a 37 °C durante 60 min. Las células se expusieron durante un total de 15 min a diferentes dosis de U-46619 en la figura 15B y 15C, a 37 °C. A continuación, se añadió coelenterazina 400a a una concentración final de 2,5 pM en los últimos 5 minutos de estimulación. El valor de BRET se midió a 37 °C, mediante el uso de un lector de microplacas Tristar® (Berthold Technologies®).
Ensayos de BRET para la translocación de Rlucll-GRK2 a la membrana plasmática marcada con rGFP-CAAX (Kras) (figuras 16B y 16C): 100 ng de HA-TPaR, 20 ng de Rlucll-GRK2, 100 ng de la Ga indicada, 100 ng de Gp1 WT, 100 ng de Gy5 WT, 400 ng de rGFP-CAAX (Kras), 180 ng de ADNss y PEI a una proporción de PEI:ADN de 3:1 se añaden a una suspensión de HEK293SL (350,000 células/ml). Las células se sembraron (100 pl de la suspensión de células/PEI/ADN por pocillo de una placa de 96 pocillos) en placas pretratadas con poli-D-lisina. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron y se preincubaron en Tyrode CaCh 1 mM a 37 °C durante 60 min. Las células se expusieron durante un total de 15 min a diferentes dosis de U-46619 en la figura 16B o para la determinación del factor Z' (figura 16C) se añadió vehículo o U46619 100 nM a los pocillos de la mitad de una placa de 96 pocillos, a 37 °C. A continuación, se añadió coelenterazina 400a a una concentración final de 2,5 pM en los últimos 5 minutos de estimulación. El valor de BRET se midió a 37 °C, mediante el uso de un lector de microplacas Tristar® (Berthold Technologies). La determinación del factor Z' se obtuvo como se describió anteriormente.
Inhibidores de proteína G. Los ensayos de BRET se realizaron como se describió anteriormente, excepto que las células se pretrataron durante la noche a 37 °C con toxina pertussis a 100 ng/ml o, durante 20 minutos a 37 °C con Ubo-Qic 100 nM.
Experimentos cinéticos. Los ensayos de BRET se realizaron como se describió anteriormente, excepto que las lecturas de BRET se recogieron a intervalos regulares, 5 minutos después de la adición de coelenterazina, mientras que los ligandos y el vehículo se inyectaron a las células después de 30 segundos de mediciones de BRET.
Determinación del factor Z ’. Las células HEK293 se transfectaron como se describe con las construcciones indicadas (ver descripción de las figuras 7A, 7B, 9A, 10C, 11D y 16C). Los ensayos de BRET se realizaron como se describió anteriormente, con la mitad de la placa de 96 pocillos tratada con los agonistas indicados y la segunda mitad de la placa tratada con el vehículo correspondiente. El factor Z' se calculó según lo descrito por Zhang y otros (Zhang, Chung y otros 1999). Un factor Z' entre 0,4 y 1 se considera un ensayo consistente.
Ensayos de complementación de proteínas mediante el uso de fragmentos de Rlucll. Las células se lavaron dos veces con PBS, seguido de la adición de tampón Tyrode. A continuación, las células se pretrataron con el sustrato de Rluc, coelenterazina 400a, a una concentración final de 2,5 pM durante 30 min a 37 °C. Los diferentes ligandos o vehículo se agregaron durante 10 min más. A continuación, se registraron los valores de luminiscencia mediante el uso de un lector de microplacas multimodo Mithras™ LB940, sin ningún filtro.
Ensayos de BRET en preparaciones de membranas. Las células sembradas en placas de 6 pocillos se recogieron, se resuspendieron en tampón de lisis (composición: Tris-HCl 25 mM pH 7,4, EDTA 2 mM, MgCh 5 mM, sacarosa al 27 %, GDP 15 pM, GTP 2 pM, benzamidina a 10 pg/ml, inhibidor de tripsina de soja a 5 pg/ml y leupeptina a 5 pg/ml) y se sometieron a homogeneización con polytron. Después de las etapas de centrifugación, los sedimentos de membrana se resuspendieron en tampón de Tyrode suplementado con MgCh 5 mM, GDP 15 pM y GTP 15 pM. A continuación, se realizaron los experimentos de BRET como se describió anteriormente, con el uso de 400 pg de membrana por pocillo.
Titulaciones de BRET (en las figuras 2B y 2C): las células HEK293 se transfectaron transitoriamente mediante el uso de PEI en una proporción de pg de ADN a pl de PEI 1 mg/ml igual a 1 pg:3 pl. El ADN transfectado por pocillo de una placa de 96 pocillos es el siguiente: En las figuras 2A y 2B: 40 ng de HA-TPaR o HA-p1AR, 0,5 ng de RlucII-Gy5, 10 ng de Ga-n o Ga-i5, 10 ng de construcciones que codifican Gp1 y una cantidad creciente de construcciones de GRK2 etiquetadas con GFP10, hasta 75 ng. El ensayo de BRET se realizó 2 días después de la transfección; las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en tampón de Tyrode. Las células se trataron con vehículo o fármaco agonista, U-46619 100 nM (figura 2B) o isoproterenol 1 pM (figura 2A) durante un total de 15 min a RT. A continuación, se añadió el sustrato de Rluc Coel-400a a una concentración final de 2,5 pM en los últimos 5 minutos de estimulación. A continuación, se registraron los valores de BRET con el uso de un lector de microplacas multimodo Mithras® LB940 y se determinaron al calcular la relación entre la luz emitida por el aceptor y la luz emitida por Rlucll. Las curvas de titulación (figuras 2B y 2C) representan las proporciones de BRET obtenidas en función de la expresión de la construcción de GFP (evaluada en fluorescencia) sobre la expresión de la construcción de Rlucll (evaluada en bioluminiscencia).
Ejemplo 2: Resultados
Para estudiar la activación de proteínas G específicas por los GPCR, se desarrolló un ensayo basado en la competencia entre las subunidades Ga y Py IP por su unión a las subunidades GpY. Como se muestra en las figuras 1A y 1B, en ausencia de la activación del receptor, la subunidad Ga se une estrechamente al dímero GpY, lo que impide su asociación con Py IP. Después de la estimulación del receptor, la Ga unida a GTP se disocia del complejo GpY, que después queda libre para interactuar con la Py IP. Por lo tanto, la interacción entre PyIP y GpY refleja la activación de la proteína G. Con la coexpresión de PyIP y GpY, cada uno etiquetado con uno de los dos componentes del sistema de detección, con diferentes subtipos de Ga sin etiquetar, ha sido posible determinar el perfil de acoplamiento de un receptor dado después de su activación. Como se muestra a continuación, se pueden usar diferentes métodos de detección para evaluar la interacción entre Py IP y GpY, tales como enfoques de transferencia de energía por resonancia (RET) (figura 1A: transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) o de fluorescencia (FRET)); o figura 1B: ensayos de complementación de proteínas (PC).
Si tomamos a RET como un ejemplo de método de detección, los posibles escenarios y la interpretación de los resultados correspondientes para los biosensores, basados en Py IP, de la activación de proteínas G se muestran en la figura 1C. En ausencia de cualquier subunidad Ga cotransfectada con las dos parejas de RET Py IP-A y GpY-D, la señal de RET basal es relativamente alta debido a la interacción constitutiva entre Py IP y el dímero GpY. En ese caso, una modulación de la señal de RET medida después de la estimulación del receptor reflejaría la activación de las subunidades Ga endógenas (condición simulada o -Ga). La coexpresión de una subunidad Ga previene la interacción basal entre PyIP-A yGpY-D, que conduce a una disminución en la respuesta de RET basal registrada (barras blancas en condiciones Ga i y Ga2). Tras la estimulación del receptor (con un ligando de GPCR adecuado, por ejemplo), se observa un aumento significativo en la modulación de la señal de RET en comparación con la condición simulada solo si el receptor interactúa con (es decir, se acopla a) la subunidad Ga específica coexpresada con los otros componentes del biosensor (barra negra, condiciones Ga2). Sin embargo, si la subunidad Ga sobreexpresada no se acopla funcionalmente al receptor, no se detecta ningún cambio significativo en la señal de BRET tras la estimulación del receptor (barra negra, condiciones Ga i ).
Las figuras 2A a 2C presentan algunas de las diferentes construcciones analizadas para la optimización del biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP. Se probaron cuatro construcciones etiquetadas con GFP diferentes para GRK2 y 3, dos basadas en la secuencia de codificación de GRK completa y dos en el dominio de PH C-terminal/dominio de unión a Gp, con GFP en la porción N-terminal o C-terminal de GRK (figura 2A). Los resultados presentados en las figuras 2B y 2C indican que todas las configuraciones/construcciones de GRK2 dieron una respuesta BRET detectable (y por lo tanto pueden usarse en el biosensor), y que la GRK2 de longitud completa etiquetada en su extremo C terminal con un aceptor de BRET (por ejemplo, GFP) produce la mejor ventana dinámica en términos de amplitud de la señal de BRET y estabilidad de respuesta en un intervalo más amplio de relaciones de donante a aceptor. Se obtuvieron resultados similares con el uso de construcciones de GRK3 etiquetadas con GFP.
Para evaluar la viabilidad de utilizar una Py IP para monitorear la activación de la proteína G, la proteína GRK2, que interactúa específicamente con dímeros GpY libres, se seleccionó como una PyIP representativa, y se etiquetó en su extremo C terminal con el aceptor de energía GFP10 (GFP), lo que permite el uso de BRET como una lectura de su interacción con GpY. La proteína de fusión GRK2-GFP se coexpresó con una subunidad Gy5 etiquetada en el extremo N terminal con la luciferasa de Renilla (Rluc) donante de energía, así como con las subunidades Gp1 y Ga sin etiquetar. Además de los componentes del biosensor (GRK2-GFP y Rluc-Gy5), Gp1 y varias Ga, las células se cotransfectaron con el receptor de tromboxano A2 (TPaR), que se eligió como ejemplo de un GPCR prototípico. En el experimento representado en la figura 3A, el perfil de acoplamiento de la proteína G del TPaR se determinó mediante la estimulación de las células que coexpresan las diferentes proteínas Ga, Gaq, Ga i i , Ga i 2 , Ga i 3 , Ga i 4 , Ga i 5 , GaoA, GaoB, Gaz , Gas, Ga i i , Ga i2 y Ga i3, con el agonista de TPaR U-466i9 (un análogo sintético estable del endoperóxido prostaglandina PGH2), y se comparó con los resultados obtenidos en ausencia de sobreexpresión de Ga (condición simulada, barras de la izquierda). En ausencia de cotransfección con Ga, la señal de BRET registrada fue relativamente alta y solo se moduló ligeramente tras la estimulación con U-466i9, lo que refleja la activación de las proteínas Ga endógenas. Tras la coexpresión de proteínas Ga específicas, una modulación de la señal de BRET inducida por agonistas fue significativamente mayor en las células que sobreexpresan Gaq , Ga i i , Ga i 2 , Ga i3, Ga i4 y Ga i5 / i6 , en relación con la condición simulada o con las células que sobreexpresan subunidades Ga de la familia Ga i, lo que indica que TPaR se acopla a la activación de proteínas G de Gaq y familias, pero no de las de la familia Ga i (figura 3B).
Además de las proteínas Ga naturales (nativas), también se usaron tres mutantes Gaq (GaqG66K, GaqY67C y
2 i
GaqF75G, en el panel de proteínas G analizadas con el TPaR). La sustitución del residuo de glicina en la posición 66 de la proteína Gaq por un residuo cargado (GqG66K por ejemplo), se había descrito previamente como resultado de mutantes de la proteína Gaq con propiedades de acoplamiento promiscuas, ya que también pueden ser activadas por receptores no acoplados a Gaq (Heydorn, Ward y otros, 2004). Como puede observarse en las figuras 3A y 3B, el mutante GaqG66K previamente descrito, así como los novedosos GaqY67C y GaqF75G descritos en el presente documento, fueron activados por el TPaR. Estas proteínas Ga promiscuas (o cualquier proteína Ga que tenga mutaciones equivalentes en estas posiciones, ver la figura 14) pueden usarse como controles positivos para la activación de GPCR en ensayos de biosensores basados en Py y ser particularmente útiles con receptores para los que solo se dispone de información limitada en sus preferencias de acoplamiento, como los receptores huérfanos. A continuación, se seleccionaron Gaq, Ga i 3 , Ga-M, Ga i5 / i6 , GaqG66K y GaqY67C para las curvas de dosis-respuesta de U-46619 (figura 3C). Curiosamente, se midieron potencias que iban desde 0,5 nM para G13 a 6,6 nM para Ga i5 / i6 , lo que valida que los ensayos de biosensores basados en Py IP pueden detectar la potencia de activación específica ligada a cada proteína G acoplada por un par dado de receptor-ligando.
Para ilustrar adicionalmente que un biosensor de activación de proteína G basado en PyIP se puede utilizar para revelar la especificidad de la activación de la proteína G para diferentes GPCR, cada uno del receptor de dopamina D2 (D2R) y el receptor aiB -adrenérgico (a^AR) se coexpresó con GRK2-GFP, Rluc- Gy5, Gpi y varias Ga, y se estimularon con sus agonistas prototípicos; rotigotina para D2R y fenilepinefrina para a iB AR. Como se muestra en las figuras 4A y 4C, cada receptor muestra un perfil de activación de proteína G específico, distinto del observado con TPaR (figuras 3A y 3B); D2R se acopla únicamente a miembros de la familia Ga i (GaoA, GaoB, Gaz , Gai i , Gai2 y Ga i3), mientras que aiB AR se acopla exclusivamente a miembros de la familia Gaq (Gaq, Ga i i y Ga i5 / i6 ). El mutante Gaq promiscuo GaqY67C fue activado por los dos receptores (figuras 4A y 4C). Se obtuvieron curvas de dosis-respuesta con algunas de las proteínas G activadas por D2R (Ga i i y GaqY67C) y aiB AR (Gaq y Ga i i (figuras 4B y 4D). En la figura 4E, se obtuvieron curvas de dosis-respuesta de activación de Gaz para diferentes agonistas adrenérgicos: epinefrina, norepinefrina, fenilefrina e isoproterenol, de células HEK293 que expresan a2oAR, Gaz , GRK2-GFP, RIuc-Gy5 y Gpi. Estos resultados demuestran que un biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP puede usarse para establecer preferencias de proteínas G y perfiles de activación/farmacológicos de GPCR, así como una herramienta farmacológica para abordar las potencias y eficacias de ligandos dados para activar varias proteínas G a través de sus receptores afines. Como se muestra en las figuras 4F a 4J, se obtuvieron distintos perfiles de activación de proteína G con diferentes combinaciones de subunidades Gp y Gy. Los resultados muestran que las combinaciones de las subunidades Gp y Gy pueden conducir a distintos perfiles farmacológicos de activación de proteína G. Estas diferencias podrían estar relacionadas, al menos en parte, con distintos perfiles farmacológicos observados con diferentes células y tejidos que expresan no solo un conjunto específico de subunidades Ga sino también diferentes combinaciones y niveles de subunidades Gp y Gy.
Los inhibidores de la actividad de proteínas G, como la toxina pertussis (PTX) y Ubo-Qic (estructuralmente relacionado con el depsipéptido cíclico YM-254890) que bloquea selectivamente la activación de Ga i y Gaq , respectivamente, se han utilizado ampliamente en el campo de los GPCR para caracterizar las propiedades de acoplamiento de los receptores (Takasaki, Saito y otros, 2004). Con el uso del biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP, se realizaron experimentos con esos inhibidores de proteína G selectivos para demostrar la especificidad de las señales de BRET obtenidas. Para el TPaR, que está acoplado a la activación de Gaq, la respuesta BRET medida con el biosensor basado en Py IP tras la estimulación con el agonista, fue completamente abolida tras un pretratamiento con Ubo-Qic, mientras que un pretratamiento con PTX no tuvo efecto sobre esta respuesta (Figura 5A). En contraste, para el receptor acoplado a Gai D2R, un pretratamiento con PTX redujo significativamente la respuesta BRET del biosensor que se detecta después de la incubación con el agonista, mientras que el pretratamiento con el inhibidor de Gq Ubo-Qic no tuvo efecto detectable en la señal de BRET registrada (figura 5B). La activación de proteína G mediada por TPaR también se usó para validar la selectividad del inhibidor Ubo-Qic. Los resultados presentados en la figura 5C muestran que, de la familia Gaq (Gaq, Ga i i , Ga i4 y Ga i5 / i6 ), solo Ga i5 / i6 es insensible a Ubo-Qic. Las proteínas Ga i2 y Ga i3 también son insensibles a Ubo-Qic. Finalmente, el biosensor basado en Py IP se usó para revelar la sensibilidad a Ubo-Qic de la activación de Gaq mutante (en la posición 67 o 75; véase la figura 14). Las sustituciones del residuo de tirosina en la posición 67 (Y67C, Y67G, Y67S e Y67L) produjeron resistencia a Ubo-Qic y propiedades promiscuas, lo que indica que este residuo puede ser importante para controlar la activación de la proteína G y que la sustitución del residuo Phe75 por glicina (que se asocia con un fenotipo promiscuo; ver la figura 4A) condujo a una inhibición parcial de la activación mediada por Ubo-Qic (figura 5D) Por lo tanto, además de validar la especificidad de las señales de BRET registradas para las diversas proteínas G, estos resultados apoyan el uso de los biosensores de activación de proteína G basados en PyIP descritos en este documento como herramientas para identificar/desarrollar nuevos inhibidores selectivos de proteínas G.
Para caracterizar adicionalmente el biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP, se determinó la cinética de activación de Ga i i (figura 6A) y Ga i i (figura 6B) después del tratamiento con un agonista de D2R y TPaR, respectivamente. Como se muestra en las figuras 6A y 6B, se obtuvieron cinéticas de activación similares para los dos receptores y proteínas G diferentes, con una respuesta máxima alcanzada aproximadamente 30 segundos después de la adición del ligando y una meseta que duró al menos 30 minutos después de la estimulación inicial. Esta respuesta sostenida es particularmente adecuada para la adaptación del ensayo al cribado de alto rendimiento (HTS).
Para evaluar la robustez del ensayo, se determinaron los factores Z' para la activación de proteína G a través de receptores típicos acoplados a Ga i (D2R, figura 7A) y Gaq-(TPaR, figura 7B). El ensayo es particularmente robusto con factores Z' de 0,79 y 0,89 para D2R/Gan (figura 7A) y TPaR/Gan (figura 7B), respectivamente. La solidez de este ensayo es compatible con los requisitos de las aplicaciones de cribado, especialmente las aplicaciones de HTS.
Además de las posibles aplicaciones del biosensor basado en pY en el perfil de proteínas G de receptores y HTS descritas anteriormente, la caracterización del ligando representa otra aplicación de este biosensor de activación de proteínas G. Los GPCR pueden interactuar preferentemente con diferentes proteínas G y vías de señalización tras la activación con diferentes ligandos, este fenómeno se conoce como señalización de los GPCR sesgada por el ligando (Galandrin, Oligny-Longpre y otros, 2007) (Kenakin y Christopoulos, 2013). Los biosensores descritos en el presente documento son particularmente adecuados para realizar experimentos de perfiles de ligandos, ya que es posible evaluar la actividad de todos los subtipos de proteínas G mediante el uso de las mismas parejas de RET. Como ejemplo representativo, se perfilaron varios ligandos del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) mediante el uso del biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP (figuras 8A a 8C). Se realizó un primer conjunto de experimentos para determinar las propiedades de acoplamiento del receptor mediante el uso de su ligando natural, angiotensina II. Como se muestra en la figura 8A, el AT1R se acopla a varios miembros de la familia de proteínas Gaq, Ga i 2 y Ga i. Por tanto, Gaq, Ga-n y Ga- ^ se seleccionaron para la caracterización adicional después de la activación de AT1R con diferentes análogos de angiotensina II. Como se muestra en las figuras 8B y 8C, esos péptidos derivados de la angiotensina II estimularon las diferentes proteínas G en diversos grados, lo que reveló un posible sesgo de algunos ligandos hacia proteínas G específicas. Por ejemplo, el péptido DVG mostró una mejor eficacia para la activación de Ga i2 que de Gaq, con relación a la respuesta de la angiotensina II (figura 8C).
A continuación, se evaluó si se puede usar el ensayo de complementación de proteínas (PCA), en lugar de los ensayos basados en RET, para evaluar la interacción entre PyIP y las subunidades GpY (figura 1B). El PCA, como la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) o la complementación de fragmentos enzimáticos (EFC), permite la detección de la interacción entre dos parejas de proteínas, lo que lo hace compatible con el biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP. Para determinar si es posible utilizar un ensayo basado en EFC, y más particularmente un ensayo EFC basado en Rluc (Stefan, Aquin y otros, 2007), en el biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP, se generaron dos proteínas de fusión: GRK2 etiquetada con una porción N-terminal de Rluc en C-terminal (GRK2-Rluc F1), y la porción complementaria C-terminal de Rluc en el N-terminal de Gy5 (Rluc F2-Gy5). Si se produce una interacción entre GRK2 y las subunidades GpY libres (después de la activación de la proteína G), los dos fragmentos complementarios de Rluc se volverían a asociar y la luminiscencia se puede medir en presencia del sustrato de RLuc coelenterazina. Se realizó una prueba de concepto mediante el uso de células que coexpresan TPaR con GRK2-Rluc F1, Rluc F2-Gy5, Gp1 y Gan. Una señal luminiscente robusta se midió después de la estimulación con U-46619, que revela la activación de la proteína G11, con un factor Z' de 0,53 (figura 9A) y una EC50 de 8,4 nM (figura 9B), lo que valida que se puede usar el PCA en el biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP descrito en el presente documento.
A continuación, se evaluó si las Py IP distintas de GRK2 (como GRK3) podrían usarse para monitorear la activación de proteínas G en el biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP. Se generó una proteína de fusión entre GRK3 y el aceptor de energía GFP, y la GRK3-GFP resultante se coexpresó con RIuc-Gy5, Gp1, Gan y D2R, para obtener las curvas de dosis-respuesta de dopamina. Como se ve en la figura 10A, se observaron potencias similares con el uso de biosensores basados en GRK2 o GRK3 (96 pM para GRK2 y 56 pM para GRK3). La cinética de activación del biosensor basado en GRK3 también fue similar a la obtenida con el biosensor basado en GRK2 (figuras 6A y 6B), con una respuesta máxima alcanzada aproximadamente a los 30 segundos, y una meseta de al menos varios minutos (figura 10B). Finalmente, el factor Z' también se generó con el biosensor basado en GRK3. Con el uso de D2R y Gan , se obtuvo un factor Z' de 0,71 con el biosensor GRK3, lo que confirma la solidez del ensayo (figura 10C). En conjunto, estos datos demuestran que se pueden usar diferentes Py IP en el biosensor de activación de proteínas G basado en pYIP para evaluar la activación de proteínas G.
Para simplificar el uso del biosensor de activación de proteínas G basado en Py IP, se desarrolló un vector policistrónico que codifica GRK2-GFP, RIuc-Gy5 y Gp1 (figura 11A). Esto asegura que los componentes del biosensor se expresen a partir de una única construcción y en una proporción fija, lo que podría minimizar la variabilidad entre experimentos. Como se muestra en la figura 11D, se obtuvo un factor Z' de 0,8 con el uso de la construcción policistrónica, cotransfectada con plásmidos que codifican TPaR y Gan. Este resultado es comparable al factor Z' obtenido con células transfectadas con plásmidos que codifican componentes individuales del biosensor (figura 7B: Z' = 0,89). También se realizaron experimentos de curvas de dosis-respuesta con el uso de este vector policistrónico y se obtuvo un valor de EC50 de 4,3 nM para el TPaR estimulado con U-46619 (figura 11C), similar a la EC50 de 8,4 nM medida para el mismo par de receptor/ligando utilizado con el biosensor GRK2 basado en Rluc-PCA (figura 9B). Estos resultados confirman la validez de expresar los diferentes componentes del biosensor en un vector policistrónico, que podría usarse ventajosamente para establecer líneas celulares estables con un solo marcador de selección, para simplificar así los procedimientos experimentales y potencialmente mejorar la reproducibilidad (por ejemplo, minimizar la variabilidad entre experimentos).
Se desarrolló otra variante del biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP, en la que la proteína GRK2 está anclada a la membrana plasmática (PM) (figura 12A). Esta construcción puede ser útil para algunas aplicaciones específicas en las que se preferirían los experimentos in vitro con preparaciones de membranas a los experimentos de células completas, como para aplicaciones de cribado. Para validar este enfoque, se realizaron experimentos de BRET en preparaciones de membranas que expresan TPaR, Ga-n, Gp1, RIuc-Gy5, y la forma citoplasmática de GRK2-GFP usada previamente (GRK2 wt en la figura 12B) o la GRK2-GFP anclada a la membrana plasmática (GRK2-mem). Se observó una modulación superior de la señal de BRET con la GRK2 unida a la membrana, en relación con la GRK2 wt (figura 12B), para la cual sólo se detectó un aumento marginal de BRET tras la estimulación con el ligando. Estos resultados validan el uso de una Py IP anclada a PM para medir la activación de proteínas G en preparaciones de membrana.
Los resultados representados en las figuras 13A a 13C muestran que las mutaciones que se han informado que afectan las funciones de GRK2, como la sustitución D110A en el dominio RGS (mutante RGS-muerto) y la sustitución K220R en el dominio catalítico (mutante catalítico-muerto), o su regulación por fosforilación (como las sustituciones S670A, S676A y S685A, o las sustituciones S670D, S676D y S685D, que previenen e imitan respectivamente la fosforilación del dominio de unión C-terminal de GRK2 por ERK, PKA y CDK2-CiclinaA, no previenen ni promueven significativamente su reclutamiento a proteínas G activadas, como se evalúa con el uso de un biosensor de activación de proteínas G basado en PyIP. Las variantes de GRK2 que comprenden las mutaciones indicadas anteriormente se reclutan en un grado similar al de GRK2 nativa (figuras 13A a 13C), lo que proporciona evidencia de que el reclutamiento de GRK2 a GpY podría ser insensible a la regulación por diferentes eventos de señalización. Se obtuvieron resultados similares con el mutante de GRK2 D110A después de la activación de AT1R con angiotensina II.
Se desarrolló otro biosensor para medir la competencia entre las subunidades Ga y PyIP por su unión a las subunidades GpY; la figura 15A muestra la configuración y el principio de dicho biosensor. El biosensor comprende una PyIP (GRK) etiquetada con un donante o aceptor de RET (se ilustra un aceptor de RET (A)) y un GPCR etiquetado en su extremo C terminal con un donante o aceptor de RET (se ilustra un donante de RET (D)). Mientras está en la forma inactiva, la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica está estrechamente unida al dímero GpY. Tras la unión del ligando (L) al GPCR, la Ga se disocia de las subunidades GpY, lo que permite que Py IP sea reclutada por las subunidades GpY libres y acerque el aceptor de BRET al donante de BRET RLuc unido al GPCR, lo que induce/aumenta la señal de BRET. Las figuras 15B y 15C muestran curvas de dosis-respuesta para la activación de proteína G, obtenidas con un biosensor de acuerdo con la figura 15A, que comprende una g RK2 natural (figuras 15A) o el mutante GRK2 RGS muerto (D110A) (figura 15B). Las curvas de dosis-respuesta mostraron perfiles similares en las figuras 15B y 15C, lo que indica que no se requiere un RGS funcional para reclutar una Py IP a una proteína G activada, lo que confirma los resultados presentados en las figuras 1lB y 13A con el uso de una configuración de biosensor diferente.
Se desarrolló otro biosensor para medir la competencia entre las subunidades Ga y PyIP por su unión a las subunidades GpY; La figura 16A muestra la configuración y el principio de dicho biosensor. El biosensor comprende una Py IP (por ejemplo, GRK) etiquetada con un donante o aceptor de RET (se ilustra un donante de RET (D)) y un dominio de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) etiquetado con un donante o aceptor de RET (se ilustra un aceptor de RET (A)). Mientras está en la forma inactiva, la subunidad Ga de la proteína G heterotrimérica está estrechamente unida al dímero GpY. Una vez que el ligando (L) se une al GPCR, la Ga se disocia de las subunidades GpY, lo que permite que Py IP sea reclutada a las subunidades de GpY libres que se encuentran en la PM, y que el donante de RET D esté muy cerca del aceptor de RET A anclado a la PM, lo que induce/aumenta así la señal de BRET. La figura 16B muestra las curvas de dosis-respuesta para la activación de proteína G, obtenidas con un biosensor de acuerdo con la figura 16A, con el uso de células HEK293 que coexpresan TPaR, diferentes Ga (Gaq = cuadrado relleno, Ga-n = triángulo relleno, condición simulada (sin Ga) = círculo vacío), Gp1, Gy5, RlucII-GRK2 y rGFP-CAAX, estimuladas con dosis crecientes de U46619. Las curvas de dosis-respuesta de la figura 16B son similares a las obtenidas con biosensores que tienen una configuración diferente (figuras 3C, 9B y 11C), lo que proporciona evidencia de que un biosensor que mide el reclutamiento de PyIP en la PM es adecuado para evaluar "indirectamente" el reclutamiento de Py IP en las subunidades de GpY libres que están ancladas a la PM.
Aunque la presente invención se ha descrito anteriormente mediante modalidades específicas, esta puede modificarse sin apartarse del espíritu y la naturaleza de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En las reivindicaciones, la palabra "que comprende" se usa como un término abierto, sustancialmente equivalente a la frase "que incluye, pero no se limita a". Las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las correspondientes referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Referencias
1. Boularan, C. y J. H. Kehrl (2014). "Implications of non-canonical G-protein signaling for the immune system." Cell Signal 26(6): 1269-1282.
2. Galandrin, S., G. Oligny-Longpre y M. Bouvier (2007). "The evasive nature of drug efficacy: implications for drug discovery." Trends in Pharmacological Sciences 28(8): 423-430.
3. Garland, S. L. (2013). "Are GPCRs still a source of new targets?" J Biomol Screen 18(9): 947-966.
4. Gilman, A. G. (1987). "G-proteins: Transducers of receptor-generated signals." Annu Rev Biochem 56: 615­ 649.
5. Hamdan, F. F., M. D. Rochdi, B. Breton, D. Fessart, D. E. Michaud, P. G. Charest, S. A. Laporte y M. Bouvier

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un sistema biosensor para detectar la actividad de proteína G, dicho sistema biosensor comprende los elementos definidos en (A) o (B):
    (A)
    (i) una primera célula eucariota que comprende un primer biosensor que comprende:
    un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionada a (a) un donante de transferencia de energía por resonancia (RET); (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera;
    un segundo componente que comprende una proteína Gp y una proteína Gy, en donde dicha proteína Gp o dicha proteína Gy se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; y
    un tercer componente que es un receptor acoplado a proteína G (GPCR);
    (ii) una segunda célula eucariota que comprende un segundo biosensor que comprende:
    el primer, el segundo y el tercer componente definidos en (i); y
    un cuarto componente que comprende una proteína Ga recombinante;
    en donde (a) si dicha Py IP se fusiona con dicho donante de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha PyIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; o
    (B)
    (i) una célula eucariota que expresa una proteína Gp y una proteína Gy y que comprende un biosensor que comprende
    un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionada a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; un segundo componente que comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR) fusionado, en donde dicho GPCR se fusiona en su extremo C terminal a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera;
    un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante;
    en donde (a) si dicha Py IP se fusiona con dicho donante de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha Py IP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho GPCR se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera.
  2. 2. El sistema biosensor de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha proteína Gy se fusiona con dicho donante de RET, aceptor de RET o segundo fragmento.
  3. 3. El sistema biosensor de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho donante de RET, aceptor de RET o segundo fragmento se fusiona en el extremo N-terminal de dicha proteína Gp o Gy.
  4. 4. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho donante de RET, aceptor de RET o primer fragmento se fusiona en el extremo C-terminal de dicha Py IP.
  5. 5. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET y dicha proteína Gp, proteína Gy o GPCR se fusiona con dicho donante de RET.
  6. 6. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho donante de RET es una proteína bioluminiscente, por ejemplo, una luciferasa, preferentemente una luciferasa de Renilla; y dicho aceptor de RET es una proteína fluorescente, por ejemplo, una proteína fluorescente verde (GFP).
  7. 7. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el primer componente comprende además un resto de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) fusionado, preferentemente en el extremo C-terminal, a dicha Py IP o dicho donante de RET, aceptor de RET o primer fragmento, en donde dicho resto de direccionamiento a la PM comprende preferentemente un motivo de prenilación, preferentemente el motivo de prenilación de la variante b de corte y empalme de KRAS humana, por ejemplo la secuencia de aminoácidos KKKKKKSKTKCVIM (SEQ ID NO: 37).
  8. 8. El sistema biosensor de conformidad con la reivindicación 7, que comprende además un enlazador flexible entre (i) dicho donante de RET, aceptor de RET o primer fragmento y (ii) dicho resto de direccionamiento a la PM, en donde dicho enlazador flexible tiene una longitud que corresponde de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 aminoácidos, preferentemente una longitud que corresponde a aproximadamente 200 aminoácidos.
  9. 9. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha proteína Ga recombinante es una proteína humana Gaq, Gas, Gaii, Gai2, Gai3, Gat-cone, Gat-rod, Gat-gust, Gaz, GaoA, GaoB, Gaolf, Gaii, Gai2, Gai3, Gai4 y Gai5/Gai6, o su variante de Ga promiscua o no selectiva.
  10. 10. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones i a 9, en donde dicha Py IP es GRK2 o GRK3.
  11. 11. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones i a i0 , en donde (i) si dicho segundo componente comprende una proteína Gp fusionada, dicho primer y segundo biosensores comprenden, además, una proteína Gy recombinante, o (ii) si dicho segundo componente comprende una proteína Gy fusionada, dicho primer y segundo biosensores comprenden además una proteína Gp recombinante.
  12. 12. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones i a i i , en donde (i) si dicho segundo componente comprende una proteína Gp fusionada, dicho primer y segundo biosensores comprenden una proteína Gy recombinante, o (ii) si dicho segundo componente comprende una proteína Gy fusionada, dicho primer y segundo biosensores comprenden una proteína Gp recombinante.
  13. 13. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones i a i2 , en donde el sistema biosensor definido en (A) comprende una pluralidad de segundos biosensores, en donde cada uno de dichos segundos biosensores comprende una proteína Ga recombinante diferente, y en donde dichas proteínas Ga recombinantes diferentes son al menos dos de las siguientes proteínas Ga: Gaq, Gas, Gaii, Gai2, Gai3, Gat-cone, Gat-rod, Gat-gust, Gaz, GaoA, GaoB, Gaolf, Gaii, Gai2, Gai3, Gai4y Gai5/Gai6.
  14. 14. Una célula huésped eucariota que comprende el primer o segundo biosensor definido en cualquiera de las reivindicaciones i a i3.
  15. 15. Un biosensor para detectar la actividad de una proteína G que comprende:
    una célula eucariota que expresa una proteína Gp y una proteína Gy y que comprende
    (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (pYlP) fusionado a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera;
    (ii) un segundo componente que comprende un resto de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) fusionado, en donde dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera;
    (iii) un tercer componente que es una proteína Ga recombinante;
    (iv) un cuarto componente que es un GPCR;
    en donde (a) si dicha pYlP se fusiona con dicho donante de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha pYlP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha pYlP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera.
  16. 16. Un método para determinar si un agente de prueba modula la actividad de un GPCR, dicho método comprende:
    ( i) proporcionar un biosensor que comprende los elementos definidos en (A), (B) o (C):
    (A) una célula eucariota que comprende:
    (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (pYlP) fusionado a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (ii) un segundo componente que comprende una proteína Gp y una proteína Gy, en donde dicha proteína Gp o dicha proteína Gy se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera, en donde (a) si dicha pYlP se fusiona con dicho donante de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha pYlP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha pYlP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicha proteína Gp o Gy se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera;
    (iii) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; y
    (iv) un cuarto componente que comprende dicho GPCR;
    (B) una célula eucariota que expresa una proteína Gp y una proteína Gy y que comprende
    (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionado a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (ii) un segundo componente que comprende dicho GPCR fusionado en su extremo C-terminal a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; (iii) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante;
    en donde (a) si dicha Py IP se fusiona con dicho donante de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha PyIP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha PyIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho GPCR se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; o (C) una célula eucariota que expresa una proteína Gp y una proteína Gy y que comprende
    (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con GpY (Py IP) fusionado a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (ii) un segundo componente que comprende un resto de direccionamiento a la membrana plasmática (PM) fusionado, en donde dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera; en donde (a) si dicha Py IP se fusiona con dicho donante de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho aceptor de RET; (b) si dicha Py IP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho donante de RET; y (c) si dicha PyIP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho resto de direccionamiento a la PM se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera;
    (iii) un tercer componente que comprende una proteína Ga recombinante; y
    (iv) un cuarto componente que comprende dicho GPCR; y
    (2) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agente de prueba;
    en donde una señal más alta medida en presencia del agente es indicativa de que dicho agente de prueba aumenta la actividad de dicho GPCR, y una señal más baja medida en presencia del agente es indicativa de que dicho agente inhibe la actividad de dicho GPCR.
  17. 17. Un método para determinar si una proteína Ga es activada por un agonista de GPCR, dicho método comprende:
    (a) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agonista de GPCR en el primer y segundo biosensores del sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, e
    (b) identificar si la proteína Ga es activada por dicho agonista de GPCR sobre la base de la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera;
    en donde un mayor aumento de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en dicho segundo biosensor en relación con dicho primer biosensor es indicativo de que la proteína Ga es activada por dicho agonista de GPCR, y en donde un aumento, o una disminución, similar o menor de la señal medida en presencia del agonista de GPCr en dicho segundo biosensor con respecto a dicho primer biosensor es indicativa de que dicha proteína Ga no es activada por dicho agonista de GPCR; o
    (a1) medir la señal emitida por un aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agonista de GPCR en un primer biosensor que comprende:
    (i) un primer componente que comprende una proteína que interactúa con G3y (Py IP) fusionado a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un primer fragmento de una proteína reportera; (ii) un segundo componente que comprende un receptor acoplado a proteína G fusionado (GPCR), en donde dicho GPCR se fusiona en su extremo C terminal a (a) un donante de RET; (b) un aceptor de RET o (c) un segundo fragmento de dicha proteína reportera;
    (b1) medir la señal emitida por un aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agonista de GPCR en un segundo biosensor que comprende:
    (i) el primer y segundo componentes definidos en (a1); y
    (ii) un tercer componente que comprende una forma recombinante de dicha proteína Ga;
    en donde (A) si dicha PyIP se fusiona con dicho donante de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho aceptor de RET; (B) si dicha pYlP se fusiona con dicho aceptor de RET, dicho GPCR se fusiona con dicho donante de RET; y (C) si dicha Py IP se fusiona con dicho primer fragmento de dicha proteína reportera, dicho GPCR se fusiona con dicho segundo fragmento de dicha proteína reportera; en donde un mayor aumento de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en dicho segundo biosensor en relación con dicho primer biosensor es indicativo de que la proteína Ga es activada por dicho agonista de GPCR, y en donde un aumento, o una disminución, similar o menor de la señal medida en presencia del agonista de GPCR en dicho segundo biosensor con respecto a dicho primer biosensor es indicativo de que dicha proteína Ga no es activada por dicho agonista de GPCR.
  18. 18. Un método para determinar si un agente de prueba es un inhibidor o activador de una proteína Ga de interés, dicho método comprende:
    (1) poner en contacto
    (a) el(los) segundo(s) biosensor(es) definido(s) en el elemento (A) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o
    (b) el biosensor definido en el elemento (B) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;
    con un agonista o antagonista de GPCR, en donde dicha proteína Ga recombinante corresponde a dicha proteína Ga de interés;
    (2) medir la señal emitida por dicho aceptor de RET o proteína reportera en presencia y ausencia de dicho agente de prueba; y
    (c) determinar si dicho agente de prueba es un inhibidor o un activador de dicha proteína Ga,
    en donde (i) una señal más baja medida en presencia del agente de prueba después del contacto con dicho agonista de GPCR es indicativa de que dicho agente de prueba es un inhibidor de dicha proteína Ga de interés, y una señal similar o más alta medida en presencia del agente de prueba después del contacto con dicho agonista de GPCR es indicativa de que dicho agente de prueba no es un inhibidor de dicha proteína Ga de interés; o (ii) una señal más alta medida en presencia del agente de prueba después del contacto con dicho antagonista de GPCR es indicativa de que dicho agente de prueba es un activador de dicha proteína Ga de interés, y una señal similar o más baja medida en presencia del agente de prueba después del contacto con dicho antagonista de GPCR es indicativa de que dicho agente de prueba no es un activador de dicha proteína Ga de interés.
  19. 19. El sistema biosensor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, la célula huésped eucariota de conformidad con la reivindicación 14, el biosensor de conformidad con la reivindicación 15 o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde la célula eucariota es una célula de mamífero.
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