KR20240049746A - G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인의 실시간 구조 변화 확인 방법 및 시스템 - Google Patents
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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Abstract
본 발명은 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 변형된(modified) G 단백질 또는 구조 변화 측정 시스템을 이용하는 경우, G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD)의 활성을 실시간으로 측정가능하고, 본 발명의 약물 스크리닝 방법을 이용하는 경우, 기 출시된 약물 중 상당 수를 차지하는 GPCR 활성 조절 관련 약물들에 더해 GPCR 활성 조절에 관여하는 약물 후보 물질을 효과적으로 발굴할 수 있다.
Description
본 발명은 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 방법 및 시스템에 관한 것이다.
G단백질(GTP-binding protein)은 빛, 냄새, 신경전달물질, 호르몬 등의 세포 외부로부터의 신호를 세포 내부로 전달하는 중개자이다. 외부신호자는 세포막을 7번 통과하는 공통된 구조를 지니는 GPCR로 알려진 G단백질 결합수용체 (G-protein coupled receptor)에 결합하는데, 이들 GPCR은 신약개발과정에서 주요 연구대상으로 알려져 있다. G단백질은 α, β, γ의 3개의 소단위체로 구성된 삼합체(heterotrimer) 구조를 가지고 있으며 외부신호자가 GPCR에 결합하면, Gα 소단위체의 GDP가 GTP로 치환되면서 Gβγ로부터 유리되어 활성을 띈다. Heterotrimeric G protein은 GDP가 결합하였을 때 비활성, GTP가 결합하였을 때 활성상태가 된다. 활성화된 Gα 소단위체는 근처에 위치한 효소인 AC(adenylyl cyclase), PDE(phosphodiesterase), PLC(phospholipase C)의 활성을 변화시켜 cAMP, cGMP, Ca2+의 양을 변화시킨다. Gα는 Ras-like domain (RD)와 α-helical domain (AHD)로 구성되어 있고, RD와 AHD 사이에 GDP 혹은 GTP가 결합한다. Heterotrimeric G protein의 상위 신호전달 단백질로서 앞서 언급한 G protein-coupled receptor (GPCR)가 heterotrimeric G protein에 결합하면 구조변화가 일어나 GDP가 떨어져 나오고, GTP가 결합하게 된다. 이러한 구조변화의 대표적인 것이 AHD의 구조 변화이다. 따라서 AHD의 구조 변화를 측정하는 것은 heterotrimeric G protein의 활성 과정의 구조변화를 측정하는 주요 요인이다.
본 발명자들은 G 단백질의 비활성/활성 상태를 실시간으로 관찰하기 위해, G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD)의 구조 변화를 측정할 수 있는 새로운 시스템을 구축하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 G 단백질의 비활성/활성 상태 변화에 따라 G 단백질 알파 서브유닛의 Ras-like 도메인(RD)과 α-helical 도메인(AHD) 사이의 구조 변화가 일어나게 되고, 소정의 위치의 아미노산을 변형시켜 형광(fluorescence) 및 소광(quenching) 원리를 적용함으로써 G 단백질의 비활성/활성 상태 변화를 실시간 측정할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 개질된 특징을 갖는 변형된(modified) G 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GPCR (G protein coupled receptor) 관련 장애 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 특징을 갖는 변형된(modified) G 단백질을 제공한다:
상기 변형된 G 단백질은 Gs 알파 서브 유닛의 303번 위치의 알라닌 및 164번 위치의 글루타메이트 중 선택되는 어느 하나가 시스테인으로 치환되며, 다른 하나는 트립토판으로 치환되고, 상기 치환된 시스테인에 형광표지 물질이 결합되어 있음.
본 발명자들은 G 단백질의 비활성/활성 상태를 실시간으로 관찰하기 위해, G 단백질 알파 서브 유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD)의 구조 변화를 측정할 수 있는 새로운 시스템을 구축하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 G 단백질의 비활성/활성 상태 변화에 따라 G 단백질 알파 서브유닛의 Ras-like 도메인(RD)과 α-helical 도메인(AHD) 사이의 구조 변화가 일어나게 되고, 소정의 위치의 아미노산을 변형시켜 형광(fluorescence) 및 소광(quenching) 원리를 적용함으로써 G 단백질의 비활성/활성 상태 변화를 실시간 측정할 수 있음을 규명하였다.
본 명세서 상의 용어 “G 단백질”은 세포 내 신호전달에 주요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려진 단백질로서, small G protein과 heterotrimeric G protein의 두 단백질 군으로 나누어질 수 있고, Heterotrimeric G protein은 α, β, γ의 세 subunit으로 구성되며, 이 중 α subunit(Gsα)에 GDP 혹은 GTP가 결합하여 heterotrimeric G protein의 비활성/활성이 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 명세서 상에서, 상기 α subunit(Gsα)은 “Gs 알파 서브 유닛”, “Gα”, “Gαs”, “Gsα”, “G 단백질 알파 서브 유닛” 등으로 지칭된다. Heterotrimeric G protein은 GDP가 결합하였을 때 비활성 상태가 되고, GTP가 결합하였을 때 활성상태가 된다. Gα는 Ras-like domain (RD)와 α-helical domain (AHD)으로 구성되어 있고, RD와 AHD 사이에 GDP 혹은 GTP가 결합하게 된다. Heterotrimeric G protein의 상위 신호전달 단백질인 G protein-coupled receptor (GPCR)이 heterotrimeric G protein에 결합하면 구조변화가 일어나 GDP가 떨어져 나오고, GTP가 결합하게 되며, 이러한 구조변화의 대표적인 것이 AHD의 구조 변화이다. 따라서 AHD의 구조 변화를 측정은 heterotrimeric G protein의 활성 과정의 구조변화를 측정하는 주요 수단으로 알려져 있다. 본 발명의 G 단백질의 Gs 알파 서브 유닛은 Uniprot 데이터베이스 상의 식별번호(identifier) P63092에 해당되는 394개의 아미노산(서열번호 1)을 갖는 이형체(isoform) 뿐만 아니라, 알터네이티브 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 생성될 수 있는 것으로 알려진 이형체들을 포함한다. 구체적으로 예를 들면, 상기 P63092를 기준으로 71-72번 위치의 아미노산인 EG가 DS로 치환되고, 73-86번 위치의 아미노산이 결실되어 있는 P63092-2 이형체, 71번 아미노산인 E가 D로 치환되고, 72-86번 아미노산이 결실되어 있는 P63092-3 이형체, 86번 아미노산인 G가 GS로 치환된 P63092-4 이형체 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 변형된 G 단백질의 Gs 알파 서브 유닛의 변형된 아미노산의 위치는 상기 P63092의 394개 아미노산 서열의 서열 위치를 기준으로 설명된 것이다.
본 발명자들은 AHD의 구조 변화를 실시간으로 측정하는데 적합하도록 G 단백질 알파 서브유닛(Gα)을 적절히 개질하였다. 본 발명은 G 단백질의 활성도 변화에 따라, G 단백질의 RD와 AHD 사이의 거리가 변화되는 원리를 이용하는 것이며, Gs AHD의 164번 위치의 글루타메이트와 RD의 303번 위치의 알라닌을 선정하여, 두 아미노산 중 하나의 아미노산을 시스테인으로 치환 후 말단 설프하이드릴기를 이용하여 형광물질과 결합시키고, 나머지 아미노산을 상기 형광물질의 형광을 소광시킬 수 있는 아미노산으로 치환시킴으로써, AHD 구조 변화를 실시간으로 측정할 수 있는 변형된 G 단백질이 얻어질 수 있다. 이와 더불어, 본 발명의 변형된 G 단백질의 Gs 알파 서브 유닛은 G 단백질의 유의한 기능 변화를 초래하지 않는 다양한 추가적인 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 상술한 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 P63092 외에도 P63092-2, P63092-3, P63092-4 등의 이형체를 기반으로 하고, 상술한 바와 같이 개질된 Gs 알파 서브 유닛이 사용될 수 있으며, 상술한 아미노산 변형 외에도, 기능적 필요에 따라, 소정의 길이를 갖는 His tag 또는 소정의 cleavage site와 같이 단백질의 합성, 정제, 분리, 추출 등을 위한 소정의 아미노산 서열 등을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이러한 변형체는 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서 상의 용어, “형광물질”은 빛이나 기타 전자기 복사를 흡수하여 방출할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에서는 특정 소광체에 의해 효과적으로 소광 현상을 일으킬 수 있는 형광물질이 적절히 이용될 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 형광물질이 이용될 수 있다.
본 명세서 상의 용어, “소광”이란, 형광의 퀀칭(quenching)을 의미하는 것으로서, 형광 물질에 특정 소광체가 근접하는 경우, 발광이 감소되고 억제되는 것을 의미한다.
본 발명의 변형된 G 단백질의 형광-소광의 원리는 형광표지물질과 상기 형광표지물질의 형광을 소광시킬 수 있는 소광체의 거리 변화를 이용하는 것으로서, 303번 위치의 알라닌 또는 164번 위치의 글루타메이트 중 어느 일방이 형광물질이 결합된 시스테인 또는 상기 형광물질의 형광을 소광시킬 수 있는 아미노산으로 치환되더라도, 동일 유사한 효능이 발휘됨을 자명하게 예측할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 변형된 G 단백질은 Gs 알파 서브 유닛의 303번 위치의 알라닌이 시스테인으로 치환되며, 164번 위치의 글루타메이트가 트립토판으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 164번 위치의 글루타메이트가 트립토판으로 치환된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 형광 물질로서, 특정 아미노산에 의한 소광 현상이 관찰될 수 있는 형광물질을 적절히 사용할 수 있고, 그 일례로서, Bimane 형광물질을 들 수 있으며, Bimane 형광물질에 대해 트립토판이 가장 바람직한 소광 효과를 발휘할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 변형된 G 단백질은 표면에 노출된 시스테인의 일부 또는 전부가 말단 설프하이드릴기를 포함하지 않는 아미노산으로 추가적으로 치환되어 있는 것이다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 변형된 G 단백질은 표면에 노출된 시스테인의 일부 또는 전부를 말단 설프하이드릴기를 포함하지 않는 아미노산으로 추가적으로 치환하는 것은 164번 또는 303번 위치의 아미노산을 시스테인으로 치환 후, 치환된 시스테인에 형광물질을 결합시키는데 효율을 증진시키기 위함인바, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표면에 노출된 시스테인으로서, 추가적으로 치환되어 있는 아미노산은 Gs 단백질 알파 서브 유닛의 174번, 200번 및 237번 위치의 시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 변형된 G 단백질의 표면에 노출된 시스테인은 각각 독립적으로 세린 및 알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 말단 설프하이드릴기를 포함하지 않는 아미노산으로 치환되어 있는 것이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 형광표지 물질은 Bimane 형광물질 및 BODIPY 형광물질 등 아로마틱 링에 의해 소광이 일어나는 형광물질이 적절히 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 “Bimane 형광물질”은 헤테로고리형 화합물로서, “1H,7H-Pyrazolo[1,2-a]pyrazole-1,7-dione”의 IUPAC 명으로 명명되는 화합물 및 이의 유도체를 의미한다. 보다 구체적으로 본 발명의 실시예에서 사용된 monobromobimane을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 변형된 G 단백질을 포함하는 실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템을 제공한다.
본 발명의 측정 시스템을 이용하면, G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화를 실시간으로 측정할 수 있는 장점이 있다. 헤테로트라이머 G 단백질이 GPCR에 의해 활성화되어, GDP가 나오고 GTP가 들어가는 과정에서 Gα AHD의 구조 변화가 발생되고, 이를 실시간으로 측정함으로써, G 단백질의 활성 연구, GCPR에 작용하는 약물을 스크리닝하는 시스템들으로 응용하여 사용이 가능하다. GPCR에 작용하는 약물을 스크리닝하는 시스템이 종래 일부 공지되어 있지만, 헤테로트라이머 G 단백질 자체의 활성보다는, 헤테로트라이머 G 단백질 활성에 의한 하위 신호전달물질(cAMP, Ca2+)의 농도를 측정하는 간접적 방법에 지나지 않고, 본 발명의 경우, 종래 알려진 방법들에 비해 더욱 우세한 직접적 G 단백질 활성 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 구조 변화 측정은 Bimane 형광 표지 물질의 형광 발광의 세기를 측정함으로써 이루어진다. Bimane 형광의 세기를 실시간으로 측정함으로써, G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화를 직접적으로 관찰하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 양태인 “실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템”은 본 발명의 상술한 다른 일 양태인 “변형된(modified) G 단백질”을 필수 구성으로 포함하는 바, 중복되는 내용을 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해, 중복 기재는 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 GPCR (G protein coupled receptor) 관련 장애 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 상술한 “실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템”에 시료 물질을 처리하는 단계; 및
(b) G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화를 측정하여, 후보 약물을 스크리닝하는 단계.
본 명세서 상의 용어 “GPCR(G protein-coupled receptors)”은 ‘7TM 리셉터(7-(pass)-transmembrane domain receptors)’로도 알려져 있으며, 세포 외부의 분자를 감지하고 세포 반응을 활성화하는 세포 표면 수용체이다. G 단백질과 결합하여 세포막을 7번 통과하는 특징을 갖는다. GPCR은 인체의 대부분의 생리적 활동에 관여하며, 다양한 질병질환과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 심혈관질환, 소화기관질환, 중추신경계질환 등과의 연관성이 알려져 있다. 구체적으로 예를 들어, 위궤양, 고혈압, 알러지, 전립선암, 정신분열증, 간질 등에 관한 GPCR 관련 약물이 시판되고 있으며, 이외에도, GPCR은 인체의 생식 기능, 성장, 물질 대사, 항상성 유지, 식욕, 수면, 심리 등 대부분의 인간 활동을 조절하는 것으로 알려져 있는 바, 다양한 질병의 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는데 본 발명의 약물 스크리닝 방법이 유효하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양태인 “GPCR (G protein coupled receptor) 관련 장애 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법”은 본 발명의 상술한 다른 일 양태인 “실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템”을 이용하는 단계를 필수 구성으로 포함하는 바, 중복되는 내용을 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해, 중복 기재는 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 개질된 특징을 갖는 변형된(modified) G 단백질을 제공한다.
(b) 본 발명은 실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템을 제공한다.
(c) 본 발명은 GPCR (G protein coupled receptor) 관련 장애 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
(d) 본 발명의 변형된(modified) G 단백질 또는 구조 변화 측정 시스템을 이용하는 경우, G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD)의 활성을 실시간으로 측정가능하다.
(e) 본 발명의 약물 스크리닝 방법을 이용하는 경우, 기 출시된 약물 중 상당 수를 차지하는 GPCR 활성 조절 관련 약물들에 더해 GPCR 활성 조절에 관여하는 약물 후보 물질을 효과적으로 발굴할 수 있다.
도 1은 G 단백질에 GDP가 결합되어 있는 경우(왼쪽), receptor에 의해 GDP가 빠져나온 경우(오른쪽)의 모식도를 나타내고, RD(노란색) 대비 AHD(주황색)의 구조가 변화되어 있음을 알 수 있다.
도 2는 Gαs 표면에 노출된 시스테인이 세린으로 치환된 부분은 나타낸다. 치환되지 않은 cysteine은 민트색으로 표시하였고, RD는 노란색, AHD는 주황색으로 표시하였다.
도 3은 Gαs의 RD에 위치한 알리닌 303을 시스테인으로 AHD에 위치한 글루타메이트를 트립토판으로 치환한 모식도를 나타낸다.
도 4는 Cys-less A303C/E164W Gαs 및 이 돌연변이 단백질의 중간체들이 wild type 단백질 대비 GTP 결합이 달라지는지 확인한 결과, wild type 대비 차이가 없음을 나타낸다.
도 5는 GDP/GTPγS 결합 상태의 Gαs 형광도 비교하여 뉴클레오타이드의 차이에 의한 형광도 변화가 일어나는지를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Bimane fluorescence가 GPCR (complex)에 의해 증가하는 것을 실시간 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 Gαs 표면에 노출된 시스테인이 세린으로 치환된 부분은 나타낸다. 치환되지 않은 cysteine은 민트색으로 표시하였고, RD는 노란색, AHD는 주황색으로 표시하였다.
도 3은 Gαs의 RD에 위치한 알리닌 303을 시스테인으로 AHD에 위치한 글루타메이트를 트립토판으로 치환한 모식도를 나타낸다.
도 4는 Cys-less A303C/E164W Gαs 및 이 돌연변이 단백질의 중간체들이 wild type 단백질 대비 GTP 결합이 달라지는지 확인한 결과, wild type 대비 차이가 없음을 나타낸다.
도 5는 GDP/GTPγS 결합 상태의 Gαs 형광도 비교하여 뉴클레오타이드의 차이에 의한 형광도 변화가 일어나는지를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 Bimane fluorescence가 GPCR (complex)에 의해 증가하는 것을 실시간 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: Cys-less A303C/E164W Gαs 제작
N말단에 6×His-tag과 TEV cleavage site를 가지고 Gαs의 cDNA(서열번호 2)가 삽입되어 있는 pET-28a 플라스미드를 사용하였다. C174S (5'-GTACCAGCTGATTGACTCTGCCCAGTACTTCCTGG-3', 5'-CCAGGAAGTACTGGGCAGAGTCAATCAGCTGGTAC-3'), C200S (5'-GATCAGGACCTGCTTCGCTCCCGTGTCCTGACTTCTGG-3', 5'-CCAGAAGTCAGGACACGGGAGCGAAGCAGGTCCTGATC-3'), C237S (5'-CGCAAGTGGATCCAGTCCTTCAACGATGTGACT-3', 5'-AGTCACATCGTTGAAGGACTGGATCCACTTGCG-3'), A303C (5'-GCTCGCTGAGAAAGTCCTTTGTGGGAAATCGAAGATTGAGG-3', 5'-CCTCAATCTTCGATTTCCCACAAAGGACTTTCTCAGCGAGC-3'), E164W (5'-GTGCGTGCCTGCTACTGGCGCTCCAACGAGTAC-3', 5'-GTACTCGTTGGAGCGCCAGTAGCAGGCACGCAC-3') 프라이머를 각각 주문 제작 (Bionics, 서울)하고, Pfu DNA 폴리머라아제(polymerase) (Elpis biotech, 대전)를 사용하여 제조사 메뉴얼을 바탕으로 사이트-지정 돌연변이 유도(Site-directed mutagenesis)를 진행하였다. 완성된 Gαs C174S/C200S/A303C/E164W (BODIPY Assay), Gαs C174S/C200S/C237S/A303C/E164W (Bimane Assay) 플라스미드를 Escherichia coli LOBSTR (Kerafast, EC1001)에 형질 전환을 진행시켰다. 이후 terrific broth에서 600 nm optical density (OD600)가 0.55-0.6 될 때까지 37℃에서 배양시켰다. 이후 0.03 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 넣어 16 ℃에서 24 시간 배양하였다. 이후 세포를 모아 3300×g로 20분간 원심 분리하여 세포 펠릿(pellet)만 모아주었다. 용해 버퍼(Lysis buffer)(20 mM Tris-Hcl pH 7.4, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 μM GDP, 100 μM TCEP, 5 mg/mL lysozyme, 10 μg/mL benzamidine, 2.5 μg/mL leupeptin, protease inhibitor cocktail)를 펠릿(pellet) 부피의 3배 만큼 넣어 30분간 실온에서 반응시켰다. Lysis된 세포에 DNase I을 10 μg/ml 넣어 실온에서 30분간 더 반응 시킨 뒤, 18000×g로 20분간 원심분리를 진행하였다. 상층액만 모아 Ni-IDA resin(Cytiva, Uppsala, Sweden)과 반응시켰다. Wash buffer(20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 μM GDP, 100 μM TCEP, 10 μg/mL benzamidine, 2.5 μg/mL leupeptin, protease inhibitor cocktail, 20 mM imidazole)로 워싱 후 elution buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 μM GDP, 100 μM TCEP, 10 μg/mL benzamidine, 2.5 μg/mL leupeptin, protease inhibitor cocktail, 200 mM imidazole)를 넣어 정제된 단백질을 얻어내었다. Ni-IDA 정제가 된 단백질을 NGC Chromatography system (Bio-rad, Hercules, CA, USA)에 Superdex 200 Increase 10/300 column (Cytiva)을 사용하여 Size-exclusion Chromatography (SEC) buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 μM GDP)로 SEC 진행하여 단백질의 2차 정제까지 진행하였다.
실시예 2: 뉴클레오타이드(nucleotide) 교환 기능 확인을 위한 BODIPY-FL-GTPγS 분석
C237S 변이가 있을 경우 BODIPY-FL-GTPγS와 Gαs의 결합에 의한 형광도 변화가 관찰되지 않아 Gαs C174S/C200S/A303C/E164W 구조를 사용하였다. 2018년 Cell지에 개제된 Disease-Causing Mutations in the G Protein Gas Subvert the Roles of GDP and GTP (Qi Hu, Kevin M. Shokat) 논문에 따르면 C237S 돌연변이는 nucleotide 교환에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이에 따라 C237S는 GTPγS와의 결합이 아닌, BODIPY와의 상호작용에 영향을 미치는 것으로 판단되어 C237S가 제외된 C174S/C200S/A303C/E164W 돌연변이만 유도된 구조를 사용하여 기능 실험을 진행하였다.
Black 96-well microplate에 90 μL의 이미징 버퍼(imaging buffer) (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 100 μM TCEP)를 넣었다. 이미징 버퍼에 250 nM BODIPY-FL-GTPγS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 들어간 것과 아닌 것으로 나누어 실험을 진행하였다. TriStar2 LB 942 Multimode Microplate Reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 excitation wavelength (485 nm, bandwidth 14 nm)와 emission wavelength (530 nm, bandwidth 25 nm)로 측정 값을 지정하였다. BODIPY-FL-GTPγS가 들어간, 또는 들어가지 않은 imaging buffer의 기저 형광 값 측정을 위해 10 초 간격으로 120 초 동안 형광도를 측정하였다. 이후 10 μL의 Gαs buffer (15 μM Gαs C174S/C200S/A303C/E164W; 20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 100 μM TCEP, 10 μM GDP)을 넣고 10 초 간격으로 2,400 초 동안 형광도를 측정하였다.
그 결과 Gαs C174S/C200S/A303C/E164W 구조 및 이 돌연변이의 중간체 구조들이 wild type와 유사한 뉴클레오타이드 교환 속도를 보여주었다. 따라서, 본 발명에서 제작하여 사용된 Gαs C174S/C200S/A303C/E164W 구조가 wild type과 비교하였을 때 뉴클레오타이드 치환 기능에 차이를 가지지 않는 것을 확인하였다.
실시예 3: Bimane 표지된 Gαs를 사용한 AHD의 실시간 구조 변화 관찰
정제된 80 μM의 Gαs C174S/C200S/C237S/A303C/E164W 단백질 사용하였다. 100 mM의 Monobromobimane (mBBr)을 160 μM이 되도록 단백질 용액에 넣어준 뒤, 차광하여 실온에서 1시간 반응시켜 303번 알라닌 자리에 치환된 시스테인에 mBBr 표지하였다. Zeba Desalt Spin Desalting Columns, 7K MWCO (Thermo Fisher Scientific)으로 Buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 μM GDP 또는 GTPγS)를 교환하며 mBBr을 제거하여 반응이 멈추도록 하였다. Vivaspin 500, 10kDa MWCO PES (Cytiva) 사용하여 Gαs의 농도가 200 μM이 되도록 농축시켰다. 농축된 단백질 용액에 1 μM BI-167107 (Custom), 0.1 % n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM; Anatrace, Maumee, OH, USA), 0.01 % cholesteryl hemisuccinate (CHS; Anatrace) 되도록 추가하였다. Gαs와 Gβ1γ2 (Dr. Jun xu 제공, Stanford University School of Medicine)를 각 90 μM이 되도록 하여 black 96-well microplate에 50 μl가 되도록 섞어주었다. Gαs만 있는 well에는 Gβ1γ2 대신 interaction buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 μM BI-167107, 0.1 % DDM, 0.01 % CHS, 10 μM GDP 또는 GTPγS)를 동일 부피 넣어주었다. 90 μM의 Gαs와 Gβ1γ2가 들어있는 microplate를 차광하여 실온에서 30분간 반응시켜 heterotrimer가 형성되도록 하였다. Synergy Neo2 multimode microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)에 microplate를 넣고, excitation wavelength (390 nm, bandwidth 10 nm)와 emission wavelength (485 nm, bandwidth 10 nm)로 10초 간격으로 300 초 동안 형광도를 측정하였다. Heterotrimeric G protein이 들어있는 microplate에 β2-adrenergic receptor (β2AR; Dr. Jun xu 제공)을 넣어 최종 부피 80 μl, β2AR-G protein 복합체 농도 60 μM이 되도록 하였다. β2AR은 실험실에서 가장 많이 사용하는 대표적인 GPCR이다. β2AR이 없는 대조군에는 interaction buffer를 동일 부피만큼 넣어주었다. β2AR이 들어간 직후 10초 간격으로 1,200 초 동안 형광도를 측정하였다.
β2AR의 추가로 인하여 Hetertotrimeric G protein에 β2AR이 결합하면서 GPCR-G protein complex를 형성하며 AHD의 움직임을 유발하게 된다. 그 결과 AHD가 열리면서 303번 잔기의 시스테인에 연결되어 있던 Bimane과 164번 잔기에 치환된 트립토판이 서로 멀어지게 되고, 트립토판에 의해 소광되어있던 Bimane fluorescence가 β2AR에 의해 증가하는 것을 실시간 측정하였다. 이에 반해 AHD 구조 변화가 일어나지 않는 상황(heterotrimer, Gαs alone)에서는 변화가 없음을 확인하였다. 대표적인 GPCR인 β2AR에 의한 실시간 AHD 움직임 관찰 결과는 다른 GPCR로까지 확장할 수 있음을 시사한다.
Claims (11)
- 다음 특징을 갖는 변형된(modified) G 단백질:
상기 변형된 G 단백질은 Gs 알파 서브 유닛의 303번 위치의 알라닌 및 164번 위치의 글루타메이트 중 선택되는 어느 하나가 시스테인으로 치환되며, 다른 하나는 트립토판으로 치환되고, 상기 치환된 시스테인에 형광표지 물질이 결합되어 있음.
- 제1항에 있어서,
상기 변형된 G 단백질은 Gs 알파 서브 유닛의 303번 위치의 알라닌이 시스테인으로 치환되며, 164번 위치의 글루타메이트가 트립토판으로 치환된 것인 것을 특징으로 하는 변형된(modified) G 단백질.
- 제2항에 있어서,
상기 164번 위치의 글루타메이트가 트립토판으로 치환된 것을 특징으로 하는 변형된(modified) G 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 변형된 G 단백질은 표면에 노출된 시스테인의 일부 또는 전부가 말단 설프하이드릴기를 포함하지 않는 아미노산인 알라닌 또는 세린으로 추가적으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 변형된(modified) G 단백질.
- 제4항에 있어서,
상기 표면에 노출된 시스테인으로서, 추가적으로 치환되어 있는 아미노산은 G 단백질 Gs 알파 서브 유닛의 174번, 200번 및 237번 위치의 시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 변형된(modified) G 단백질.
- 제4항에 있어서,
상기 변형된 G 단백질의 표면에 노출된 시스테인은 각각 독립적으로 세린 및 알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 말단 설프하이드릴기를 포함하지 않는 아미노산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 변형된(modified) G 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 형광표지 물질은 아로마틱 링에 의해 소광이 일어나는 형광물질인 것인, 변형된 G 단백질.
- 제7항에 있어서, 상기 형광표지 물질은 Bimane 형광물질 또는 BODIPY 형광물질인 것인, 변형된 G 단백질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 변형된 G 단백질을 포함하는 실시간 G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화 측정 시스템.
- 제9항에 있어서, 상기 구조 변화 측정은 Bimane 형광 표지 물질의 형광 발광의 세기를 측정함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 구조 변화 측정 시스템.
- 다음 단계를 포함하는 GPCR (G protein coupled receptor) 관련 장애 예방 또는 치료용 약물 스크리닝 방법:
(a) 제10항에 따른 측정 시스템에 시료 물질을 처리하는 단계; 및
(b) G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인(AHD) 구조 변화를 측정하여, 후보 약물을 스크리닝하는 단계.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220129136A KR20240049746A (ko) | 2022-10-07 | 2022-10-07 | G 단백질 알파 서브유닛의 알파-헬리컬 도메인의 실시간 구조 변화 확인 방법 및 시스템 |
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| KR20240049746A true KR20240049746A (ko) | 2024-04-17 |
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| KR (1) | KR20240049746A (ko) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2017536104A (ja) | 2014-10-14 | 2017-12-07 | ユニベルシテ ドゥ モントリオール | Ｇタンパク質活性化を監視するためのＧβγ相互作用タンパク質に基づいたバイオセンサー |
-
2022
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