JPWO2008117792A1 - アデノシン三リン酸測定のための蛍光標識融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、操作が簡便であり、タンパク質濃度に依存することなく感度の高いＡＴＰの測定を可能とする物質を提供することを課題とし、さらには、該物質を用いたＡＴＰの測定方法を提供することを課題とする。かかる課題は、ＡＴＰの結合に応じて構造変化を起こしうるタンパク質、即ちＡＴＰ合成酵素のサブユニットであるεタンパク質に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させてなる蛍光標識融合タンパク質により解決され、さらには、該蛍光標識融合タンパク質を被験物質と接触させた後の蛍光スペクトルを測定することにより解決される。

Description

本発明は、アデノシン三リン酸測定のための蛍光標識融合タンパク質及び該蛍光標識融合タンパク質を蛍光タンパク質プローブとして用いた場合のアデノシン三リン酸の測定方法に関する。
アデノシン三リン酸（以下単に「ＡＴＰ」という。）は、生体内におけるエネルギー通貨である。これまで最も一般的に用いられているＡＴＰの測定方法は、ルシフェリン：ルシフェラーゼ系であり、この系により溶液中の微量のＡＴＰを選択的に測定することができる（非特許文献１〜３）。ルシフェリン：ルシフェラーゼ系によるＡＴＰ測定に関する試薬やキットはすでに市販されており、汎用されている。例えば、LL100-1・ATP発光キット(TOYO INK GROUP)、ATPlite ATP検出システム（パーキンエルマー社）等が挙げられる。しかし、ルシフェラーゼの発光は暗く、また発光量がタンパク質濃度に依存するという欠点があるため、ルシフェラーゼを細胞内に発現させて生体内部のＡＴＰ濃度を測定する場合、定量的な測定は困難であり、高い時間分解能でＡＴＰ濃度の変化を追うことは困難である。
また、ルシフェラーゼはＡＴＰを加水分解する活性があるため、ルシフェラーゼを細胞内に発現させることでＡＴＰ濃度が変化してしまう可能性も考えられる。
別の方法として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により、適当なカラムを用いてＡＴＰを他の物質と分離して検出する方法もある（非特許文献４）。本方法では液体内のＡＴＰは定量的に測定することができるが、操作が煩雑で、生体内、即ち生きた細胞内のＡＴＰを測定することは不可能である。
その他の方法として、３１Ｐ−ＮＭＲ法によりＡＴＰの測定を行うことも報告されている（非特許文献５〜７）。この手法では、ルシフェラーゼなどのタンパク質を強制発現させることなく生体内のＡＴＰ濃度を正確に求めることができる点が長所である。しかしながら、空間分解能や感度が悪いことから組織レベルの測定しかできず、時間分解能が悪いことから測定に時間を要するといった欠点がある。さらに、測定装置が非常に高価であることも大きな欠点である。
現実的には、生体内部のＡＴＰを測定するには、生体を壊して抽出した溶液内のＡＴＰを、ルシフェラーゼ又はＨＰＬＣで測定するケースが圧倒的に多い。しかし、生体を壊してＡＴＰを抽出したものを測定するこのようなケースでは、測定までの間にＡＴＰが加水分解されてしまうという欠点がある。
新たな測定方法として、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰなどのアデノシン核酸に反応しうるタンパク質であるイノシンモノホスフェート脱水素酵素２(inosine monophosphate dehydrogenase 2:IMPDH2)のＣＢＳドメインに、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）及びイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）を結合させた蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer:ＦＲＥＴ）の手法を用いた測定方法が報告されている（非特許文献８）。
Appl Microbiol. 1975; 30, 713-721. J. Am. Soc. Brew. Chem. 1976; 34, 145-150. Plant Cell Physiol. 1979; 20, 145-155. J. Mol. Cell. Cardiol. 1986; 18, 517-527. Nature 1977; 265, 756-758. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1979; 76, 7445-7449. J. Biol. Chem. 1980; 225, 3987-3993 Nat Biotechnol. 2007; 25(2):170-172.
本発明は、操作が簡便であり、タンパク質濃度に依存することなく感度の高いＡＴＰの測定を可能とする物質を提供することを課題とする。さらには、該物質を用いたＡＴＰの測定方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、ＡＴＰの結合に応じて構造変化を起こしうるタンパク質、即ちＡＴＰ合成酵素のサブユニットであるεタンパク質の存在に着目した。該タンパク質の特性を利用して、εタンパク質に、蛍光共鳴エネルギー移動（以下単に「ＦＲＥＴ」という。）におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた新規な蛍光標識融合タンパク質を作製し、本発明を完成した（図１参照）。
本発明は、即ち以下よりなる。
１．ＡＴＰ合成酵素のサブユニットであるεタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質にＦＲＥＴにおけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させてなる蛍光標識融合タンパク質。
２．前記εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分が、少なくともＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部分を含む、前項１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
３．ドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質が、前記εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質の、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインに、それぞれ結合させてなる前項１又は２に記載の蛍光標識融合タンパク質。
４．前記εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質が、野生型εタンパク質を構成するアミノ酸配列に対し、１〜８個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されている前項１〜３のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
５．蛍光標識が、蛍光タンパク質であり、ドナー及びアクセプターの組み合わせが、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）及びイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）及びグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、あるいはグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）及びレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）のいずれかである前項１〜４のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
６．前項１〜５のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
７．前項６に記載のＤＮＡを含み、該ＤＮＡから蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクター。
８．少なくとも以下の工程を含むＡＴＰの測定方法：
１）前項１〜５のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質を、被験物質と接触させて反応させる工程；
２）上記蛍光タンパク質と被験物質を反応させた後に、蛍光標識融合タンパク質と被験物質の混合物から発光した蛍光を測定する工程。
９．被験物質が、ＡＴＰを含む生体であり、該生体内でＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を接触させて反応させる前項８に記載の測定方法。
１０．生体内でＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を接触させて反応させる方法が、生体内に前項６のＤＮＡを導入させて、生体内で蛍光標識融合タンパク質を発現させることによる前項９に記載の測定方法。
１１．前項１〜４のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質、前項６に記載のＤＮＡ又は前項７に記載のプラスミドを含むＡＴＰ測定用試薬。
１２．前項６に記載のＤＮＡ又は前項７に記載のベクターと、蛍光標識融合タンパク質を発現させるために必要な試薬を含むＡＴＰ測定用試薬キット。
ＡＴＰは細胞のエネルギー通貨であり、生きた細胞内部のＡＴＰ量を知ることは、医学的、生物学的に重要である。しかし、これまでは測定のための実用的な手法がなかったため、生きた細胞のＡＴＰ濃度が一定に保たれているのかそれともダイナミックに変動しているのか、また細胞ごとにＡＴＰ濃度が異なるかどうかさえも殆どわかっていなかった。
本発明の蛍光標識融合タンパク質を蛍光タンパク質プローブとして用いると、ＦＲＥＴの手法によりＡＴＰの濃度をドナーとアクセプターの蛍光の比から求めることが可能となる。ルシフェラーゼを用いた場合と異なり、タンパク質の量に定量性が影響されないという大きな利点を有する。本発明の蛍光標識融合タンパク質は、細胞に遺伝子導入するだけで、容易に生きた細胞内部のＡＴＰを測定することが可能である。本発明の蛍光標識融合タンパク質に、適当なオルガネラ移行シグナルをつけるだけで、オルガネラ内部のＡＴＰを測定することも可能である。
本発明の蛍光標識融合タンパク質を用いる本発明のＡＴＰの測定方法は、汎用されている蛍光分光光度計や蛍光顕微鏡を用いて測定することが可能であり、特別な装置を必要としない。また、測定のための空間・時間分解能は従来法と同等又はそれ以上である。
本発明の蛍光標識融合タンパク質を模式的に示した図である。さらに、蛍光標識融合タンパク質のＡＴＰとの反応による構造変化の反応様式を示す図である。 調製した蛍光標識融合タンパク質のＳＤＳ電気泳動による確認結果を示す図である（実施例１）。 蛍光標識プローブＡ（Bacillus sp. PS3由来）を用いて測定したときの結果を示す図である（試験例１）。 蛍光標識プローブＢ（Bacillus subtilis由来）を用いて測定したときの結果を示す図である（試験例２）。 蛍光標識プローブを哺乳類細胞で発現させたときの結果を示す写真である（試験例３）。 蛍光標識プローブを用いた細胞内ＡＴＰ濃度の経時的変化を示す写真である（試験例４）。
符号の説明
ａ ＣＦＰ
ｂ ＹＦＰ
ｃ 436 nm
ｄ 475 nm
ｅ 527 nm
ｆ εタンパク質（ＡＴＰ非結合型）
ｇ εタンパク質（ＡＴＰ結合型）
ｈ Low FRET
ｉ High FRET
Ａ マーカー
Ｂ 全菌体画分
Ｃ 可溶性画分
Ｄ 精製サンプル
ＡＴＰ合成酵素は、Ｆ型及びＶ型に分類され、Ｆ型はさらにＦ１部位とＦ０部位に分類される。Ｆ１部位は、α、β、γ、δ、εなどのサブユニットから構成される。ＡＴＰ合成酵素のサブユニットであるε（以下、単に「εタンパク質」ということとする。）はＡＴＰにアフィニティーが高く、ＡＴＰ以外のヌクレオチド、例えばＡＤＰ、ｄＡＴＰ、ＧＴＰなどへのアフィニティーが非常に小さく、また、ＡＴＰに結合すると構造変化を起すことから、その特質を利用してＡＴＰの測定を行うことを着想した。
本発明において使用されるεタンパク質は、いずれの生物種由来のものであってもよいが、取扱いの簡便さを考えると、微生物由来、例えばBacillus sp. PS3由来(GenBank accession No.AB044942（配列番号１）)やBacillus subtilis由来(GenBank accession No. Z28592（配列番号２）)に示すεタンパク質等を好適に使用することができる。また、これらの菌種以外の菌種から得られたεタンパク質を用いることもできる。由来する生物種が異なれば、ＡＴＰへのアフィニティーが異なる(J. Biological Chemistry 2003; 278, 36013-36016., FEBS Letters 2005; 579, 6875-6878)。そのため、低濃度のＡＴＰに応答するものから、細胞内部のＡＴＰのように高濃度のＡＴＰに応答するものまで、異なるεタンパク質を使い分けることで、様々な濃度領域に感受性を有するＡＴＰ測定用試薬の創出が可能と考えられる。
εタンパク質は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインの２つのドメインを含む。Ｎ末端ドメインは、εタンパク質のＮ末端側から８５番目くらいまでのアミノ酸で構成され、１０本程度のβストランドからなる。Ｃ末端ドメインは、εタンパク質のＣ末端側から４５番目くらいまでのアミノ酸で構成され、２本のαへリックスからなる。Ｃ末端ドメインは、εタンパク質単独の場合は折りたたまれた結晶構造を示し、該εタンパク質がＡＴＰ合成酵素の他のサブユニットであるγタンパク質と複合体を構成する場合は、伸びた構造を示す。また生化学的な実験結果から、γタンパク質等との複合体中では、εタンパク質のＣ末端ドメインはＡＴＰの有無により構造変化を起こし、ＡＴＰがなければ伸びた状態であり、ＡＴＰが存在すると折りたたまれた構造になることが示される。これらにより、εタンパク質はＡＴＰが存在しない場合ではＣ末端ドメインが伸びた、又は動きやすい状態にあり、ＡＴＰが結合すると折りたたまれたコンパクトな状態になるものと考えられる。
本発明において、「εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分」とは、εタンパク質において、少なくともＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部位を構成するアミノ酸配列の部分であればよく、特に限定されない。例えば、上述のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの２つのドメインを含み、それらがＡＴＰの存在により構造変化を生じるうる構成であればよい。「εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質」とは、上記ＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部位を構成するアミノ酸配列を含むのであれば、天然型εタンパク質全体であってもよいし、該天然型εタンパク質に、１〜８個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。例えば、εタンパク質とＡＴＰとの反応によるεタンパク質の構造変化を阻害しうる物質がεタンパク質に結合するのを防ぐために、アミノ酸の配列を一部置換してもよい。具体的には、εタンパク質の部分において、他のサブユニットであるγタンパク質との相互作用に必要な疎水的なアミノ酸残基（Val9/Val42/Phe69/Leu78:配列番号１、Val9/Val42/Phe67/Leu78:配列番号２）の部分を、親水的なアミノ酸残基に置換することができる。
本発明における蛍光標識融合タンパク質は、２種類の蛍光物質とεタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質との融合タンパク質である。
結合される２種類の蛍光物質は、ＦＲＥＴにおけるドナー及びアクセプターとなりうる組み合わせからなる蛍光物質であればよく、特に限定されない。ここにＦＲＥＴとは、ドナーとアクセプターと呼ばれる２種類の蛍光物質が一定の距離以内に近づいた時に、ドナーが吸収した光エネルギーがアクセプターに移動することをいう。ＦＲＥＴの検出は、通常ドナーの励起波長を照射し、ドナー又はアクセプターの蛍光強度を測定することにより行う。ドナーの蛍光強度を測定する場合、２種類の蛍光物質が近い位置にあるとアクセプターに光が吸収されるためにドナーの蛍光強度は低くなり、距離が離れると蛍光強度が高くなる。アクセプターの蛍光強度を測定する場合はその逆で、距離が近いと蛍光強度が強くなり、離れると強度が低くなる。
本発明の蛍光標識融合タンパク質を生体内に取り込むか、又は生体内で発現させて蛍光を測定する場合は、標識となりうる蛍光物質も蛍光タンパク質であることが好適である。蛍光タンパク質は、一般的に使用されているものを用いることができる。具体的には、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質に代表されるグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、ＧＦＰに種々の変異を導入し、蛍光の色を変化させたイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）やシアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）、あるいは珊瑚由来の赤色蛍光タンパク質であるレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）等が挙げられる。蛍光タンパク質がＦＲＥＴの機能を発揮するために、ドナー及びアクセプターの組み合わせとして、例えば、ＣＦＰ及びＹＦＰ、ＢＦＰ及びＧＦＰ、あるいはＧＦＰ及びＲＦＰにより使用することができる。これらの蛍光タンパク質は、市販のものを使用することができる。例えば、ＣＦＰとしてはInvitrogen社のCFPが、ＹＦＰとしてはInvitrogen社のYFPの他にEvrogen社のPhi-Yellowが、ＧＦＰとしてはClontech社のEGFPの他にEvrogen社のTag-GFPが、ＲＦＰとしてはClontech社のDsRed2-monomer、Evrogen社のHcRed-Tandemが使用可能である。
本発明の蛍光標識融合タンパク質を構成する蛍光物質は蛍光標識融合タンパク質を生体内で反応させるのではなければ、低分子の蛍光物質であっても良い。低分子の蛍光物質の組み合わせとして好ましいＦＲＥＴドナー／アクセプターの組み合わせの例は、ピレンマレイミド／フロレセインマレイミド、ＣＰＭ／フルオレセインマレイミド、フルオレセインマレイミド／テキサスレッドマレイミド、アレクサ４８８マレイミド／テキサスレッドマレイミド、テトラメチルローダミンマレイミド／アレクサ６３３マレイミド、Ｃｙ３／Ｃｙ５などが挙げられる。
本発明の蛍光標識融合タンパク質を構成する蛍光物質は、εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質において、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインに結合することができる。さらに詳しくは、蛍光物質が低分子の蛍光物質の場合は、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの適当な部位に結合することができる。蛍光物質が蛍光タンパク質の場合には、Ｃ末端及びＮ末端に結合させることができる他、Ｎ末端側において、配列番号１で示すアミノ酸配列における１９−２１位、３４−４０位、５４−５７位及び７１−７４位で示すいずれかのループ領域に挿入することができる。
本発明の蛍光標識融合タンパク質は、自体公知の方法を用いて作製することができる。例えば、遺伝子工学的手法により作製することができる。低分子の蛍光色素で蛍光標識する方法も、自体公知の方法を用いることができる
本発明において、上記説明した蛍光標識融合タンパク質の他、該蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。ここにおいて、蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡとは、上記説明した蛍光標識融合タンパク質を発現しうる塩基配列からなるＤＮＡをいう。具体的には、例えば配列番号１や配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるεタンパク質を構成するアミノ酸配列そのもの（本明細書では、「天然型εタンパク質」を意味する。）や、前記アミノ酸配列から１〜８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されているものに、各蛍光タンパク質が結合したアミノ酸配列をコードする塩基配列が挙げられる。より具体的には、配列番号１や配列番号２に示される配列からなるεタンパク質を構成するアミノ酸や、それらの配列から上記１〜８個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列に、各蛍光タンパク質を構成するアミノ酸が付加したものからなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどが挙げられる。また、本発明のＤＮＡは、Bacillus sp. PS3由来(GenBank accession No.AB044942)やBacillus subtilis由来(GenBank accession No. Z28592)に示した塩基配列からなるＤＮＡの他、遺伝子コドンと縮重のため、蛍光標識融合タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいずれかのＤＮＡも含み、さらにはそれらの相補鎖も含まれる。
本発明のベクターは、蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクターであり、該ベクターは本発明の蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。具体的には、εタンパク質の全体又は部分をコードするＤＮＡにＦＲＥＴのドナー、アクセプターとなる蛍光タンパク質ＤＮＡを融合しておく。それを例えば、自体公知の発現用ベクターのクローニングサイトに導入して作製することができる。
以下、本発明の蛍光標識融合タンパク質を用いて測定するＡＴＰの測定方法について説明する。ＡＴＰを含む溶液を被験物質とし、上記で作製した蛍光標識融合タンパク質を蛍光タンパク質プローブとして接触させて一定時間反応させることにより測定することができる。ＡＴＰを含む溶液は、例えば細胞抽出物等から得ることができる。
測定条件として、以下が考えられる。
被験物質としては、ＡＴＰを含むものであれば良く、例えばＡＴＰを含む溶液、細胞などの生体試料、生体試料からＡＴＰを抽出したものなどが挙げられる。蛍光タンパク質プローブの濃度は、適宜決定することができ、例えば１０〜１００００ｎＭの範囲から選択することができる。溶解緩衝液としては特に限定されないが、例えば蛍光物質の蛍光を最適な条件で発しうるｐＨのものを選択することができる。具体的には、ＹＦＰを蛍光物質として用いる場合は、ＹＦＰの蛍光は酸性側では減少するため、ｐＨ７以上の緩衝液を用いることが好ましい。反応温度は、蛍光タンパク質プローブが構造変化を起こしうる温度であればよく、例えば３７±１℃や、２５±１℃において測定することができる。反応時間についても適宜決定することができるが、好ましくは１分以上であり、タンパク質が失活しない程度の時間反応させることができる。反応には、適宜添加物を加えることができる。例えば０．０５％の界面活性剤（TritonX100）もしくは１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを安定化の目的で加えることができる。被験試料に混在するマグネシウムの影響を避けるためには、例えばＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのキレート剤を添加してもよい。
反応終了後の被験物質についての蛍光スペクトルは、蛍光光度計を用いて、ドナーの励起光を照射し、それぞれの蛍光物質の蛍光強度が単独でピークとなる波長で蛍光強度をそれぞれ測定して、その比を計算することにより測定することができる。一方濃度既知のＡＴＰ溶液を調製し、同様に蛍光強度の比をとり、検量線を作成しておく。この検量線を用いれば検体のＡＴＰ濃度を求めることができる。
生体内のＡＴＰを測定する場合は、生体内、例えば被験物である細胞に、蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクターをＤＮＡ導入法等の手法により導入し、細胞を一定時間培養し、蛍光標識融合タンパク質を発現させる、又は蛍光標識融合タンパク質そのものをマイクロインジェクションで導入することで、生体内のＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を反応させたものについて、測定することができる。特定のオルガネラ内部のＡＴＰ測定は、蛍光標識融合タンパク質に、自体公知の方法により、当該オルガネラへの移行シグナルをつけることにより可能である。たとえば蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクターに当該シグナルをコードする塩基配列を導入すればよい。測定は、該蛍光標識融合タンパク質が発現した細胞を直接蛍光顕微鏡で観察することにより行うことができる。また、フローサイトメーターにより、ドナーとアクセプターの蛍光量を測定することにより行うことができる。
本発明は、蛍光標識融合タンパク質又は蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクターを含む試薬も範囲に含まれる。さらに、蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクターと該蛍光標識融合タンパク質を発現させるために必要な試薬を含むＡＴＰ測定用試薬キットも範囲に含まれる。
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
（実施例１）蛍光標識融合タンパク質の作製
１）εタンパク質について
ａ．Bacillus sp. PS3由来εタンパク質（配列番号１）
ｂ．Bacillus subtilis由来εタンパク質（配列番号２）
上記各εタンパク質をJ. Biological Chemistry 2003; 278, 36013-36016に記載と同様の方法で取得した。Bacillus subtilis由来の上記配列番号２に示すアミノ酸配列のＣ末端側にアラニン及びアスパラギンを付加した。さらに、Bacillus sp. PS3由来の上記配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質において、他のサブユニットであるγタンパク質との相互作用に必要な疎水的なアミノ酸残基（Val9/Val42/Phe69/Leu78：配列番号１）の部分を、親水的なアミノ酸残基に置換した。上記ａ及びｂから各々得られた改変型タンパク質を、Ａ及びＢとした。
２）蛍光標識融合タンパク質の作製
上記の各改変型タンパク質Ａ又はＢをコードするｃＤＮＡの５’末端に、ＣＦＰをコードするｃＤＮＡを、３’末端側にＹＦＰをコードするｃＤＮＡを付加して融合した。
εタンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し，末端部分を制限酵素ClaI及びEcoRIで切断した。ＣＦＰをコードするＤＮＡも同様にＰＣＲ法によって増幅し、末端部分を制限酵素NdeI, ClaIで切断した。二つの断片をつなげ（ClaI末端同士で結合）、その後pET23aベクターのNdeIサイトとEcoRIサイトの間につなげ、ＣＦＰ-ε融合プラスミドを作製した。続いて、ＹＦＰをコードするＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、末端部分をEcoRIとSalIで切断した。ＰＣＲの際にＹＦＰのＣ末端にヒスチジンタグが融合するようにした。これを、先のＣＦＰ-ε融合プラスミドのEcoRIサイトとSalIサイトの間につなげ、ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合タンパク質の発現プラスミドを作製した。
作製したプラスミドを導入した大腸菌BL21(DE3)株を培養し、ＩＰＴＧを培地中に加える事でタンパク質の発現を誘導した。培養した大腸菌を集菌し、超音波で破砕した後に、遠心分離して上清を得た。これをNi-キレーティングカラムおよび陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製した。
３）調製した蛍光標識融合タンパク質の確認
ＳＤＳ電気泳動によって予想される分子量の位置にバンドがあることで確認した（図２参照）。また、精製融合タンパク質の吸収スペクトルを測定し、ＣＦＰとＹＦＰの両方の吸収がある事を確認した。
上記１）のＡ及びＢの改変型タンパク質に、各蛍光タンパク質を融合した蛍光標識融合タンパク質を、蛍光標識プローブＡ及びＢとした。
（試験例１）蛍光標識プローブＡを用いた測定
１．蛍光標識プローブＡの終濃度が約１００ｎＭとなるように以下の安定化剤を含む緩衝液に希釈し、蛍光プローブ溶液を調製した。緩衝液（50mM MOPS-KOH (pH7.5), 50mM KCl, 2mM MgCl2）に、プローブの安定化の為に0.05% 界面活性剤（TritonX100）もしくは0.1% BSAを添加した。
２．ＡＴＰ濃度を０〜１ｍＭとなるよう蛍光プローブ溶液と混合緩衝液で希釈した。ＡＴＰは精製品を水に溶解させ中和したものを使用した。ＡＴＰ濃度はＡＴＰの２５４ｎｍにおけるモル吸光係数（15.4x103）から算出した。１分間３７℃で反応させた後、分光光度計（日本分光 FP-6500）を用いて、４３５ｎｍで励起し、ＡＴＰと反応させた場合の５２７ｎｍと４７５ｎｍの蛍光強度の比を取り、プロットした。
上記の測定結果を、図３に示した。蛍光スペクトルの顕著な変化が１０μＭ付近で認められた。
（試験例２）蛍光標識プローブＢを用いた測定
蛍光標識プローブＢの濃度を約１００ｎＭとし、ＡＴＰを終濃度が０〜６ｍＭとなるように加えた。試験例１と同手法により測定を行った。
上記測定した結果を、図４に示した。蛍光スペクトルの顕著な変化が１．５ｍＭ付近で認められた。
（実施例２）蛍光標識融合タンパク質の生体内発現用プラスミドの作製
１）εタンパク質について
実施例１に記載のεタンパク質ｂ（Bacillus subtilis由来εタンパク質：配列番号２）のアミノ酸配列のＣ末端側にアラニン及びアスパラギンを付加した。さらに、他のサブユニットであるγタンパク質との相互作用に必要な疎水的なアミノ酸残基の部分を、親水的なアミノ酸残基に置換した（V9T/V42K/F67T/L78N：配列番号２）。このようにして得られた改変型タンパク質を、Ｂ１とした。
２）蛍光標識融合タンパク質の生体内発現用プラスミドの作製
改変型タンパク質Ｂ１をコードするｃＤＮＡの５’末端に、ＣＦＰをコードするｃＤＮＡを、３’末端側にＹＦＰをコードするｃＤＮＡを付加して融合した。
εタンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し，末端部分を制限酵素ClaI及びEcoRIで切断した。ＣＦＰをコードするＤＮＡも同様にＰＣＲ法によって増幅し、末端部分を制限酵素XhoI, ClaIで切断した。二つの断片をつなげ（ClaI末端同士で結合）、その後pcDNA3.1ベクターのXhoIサイトとEcoRIサイトの間につなげ、ＣＦＰ-ε融合プラスミドを作製した。続いて、ＹＦＰをコードするＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、末端部分をEcoRIとHindIIIで切断した。これを、先のＣＦＰ-ε融合プラスミドのEcoRIサイトとHindIIIサイトの間につなげ、ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合タンパク質の発現プラスミド（ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミド）を作製した。
次に、常法を用いて、2xCoxVIIIシグナル（配列番号３：アミノ酸配列）と、3xSV40 Large T antigenシグナル（配列番号４：アミノ酸配列）を、それぞれ、ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミドのＣＦＰの上流につなげ、2xCoxVIIIシグナル-ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミド、3xSV40 Large T antigenシグナル-ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミドを作製した。2xCoxVIIIシグナルはミトコンドリア移行シグナルであり、3xSV40 Large T antigenシグナルは核移行シグナルである。
（試験例３）蛍光標識プローブの哺乳類細胞における発現
実施例２にて作製した３種のプラスミド（2xCoxVIIIシグナル-ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミド、3xSV40 Large T antigenシグナル-ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミド、ＣＦＰ-ε-ＹＦＰ融合プラスミド）を、各々リポフェクション法によってHeLa細胞に導入した。その後、HeLa細胞をガラスボトムディッシュを用いて培地で培養し、プローブを発現させた。
ガラスボトムディッシュを蛍光顕微鏡上にのせ，４２７ｎｍの励起光を照射し、高感度冷却ＣＣＤカメラにより画像を取得した。
結果を図５に示す。左から細胞質、ミトコンドリア、核に蛍光標識プローブを発現させた場合の写真である。本発明の蛍光標識プローブは細胞の任意の場所に発現可能であることがわかった。
（試験例４）単一細胞内でのＡＴＰ濃度変化の追跡
実施例２にて作製したシグナル配列の入っていないプラスミド（ＣＦＰ-ε融合プラスミド-ＹＦＰ）を、リポフェクション法によってHeLa細胞に導入した。その後、HeLa細胞を培地を含むガラスボトムディッシュで培養し、プローブを発現させた。
蛍光画像は、イメージング実験開始後、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６分後の各時間に取得した。各時間に、ガラスボトムディッシュを顕微鏡上にのせ、４２７ｎｍの励起光を照射した。フィルターチェンジャーを用いて４８３ｎｍと５４２ｎｍのバンドパスフィルターを切り替え、ＣＦＰの画像（４８３ｎｍのバンドパスフィルターを透過した像）とＹＦＰの画像（５４２ｎｍのバンドパスフィルターを透過した像）を交互に取得した。画像の取得には高感度冷却ＣＣＤカメラを用いた。なお、イメージンク実験開始１５分後の段階で、ＡＴＰ合成阻害剤であるアジ化ナトリウムと２デオキシグルコースを添加した。
結果を図６に示す。ＹＦＰ画像とＣＦＰ画像の比を擬似カラーで解析した。左上から、イメージング開始から１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６分後の写真を示す。赤がＹＦＰ／ＣＦＰ比が高い（すなわちＡＴＰ濃度の高い）状態を示し（１２，１４分）、青がＹＦＰ／ＣＦＰ比が低い（ＡＴＰ濃度が低い）状態を表す（２２，２４，２６分）。１５分後のＡＴＰ合成阻害剤を加えた直後から、細胞内ＡＴＰ濃度が減少する様子が見られる。
以上詳述したように、本発明の蛍光標識融合タンパク質を用いると、ＡＴＰ濃度が低い場合でも、感度良く測定可能なことが示された。また、Bacillus sp. PS3とBacillus subtilis由来のεタンパク質を用いた場合のＡＴＰに対する感受性が異なることが確認された。この感受性の違いは、各菌種における生育の至適温度が異なるため、同じ温度条件で測定した場合には、各々タンパク質の特異性に違いがあるためと考えられた。
また、該蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡを用いて生体内で発現させることにより、生体内のＡＴＰも感度よく測定することが可能であることが示された。生体内のＡＴＰ濃度の測定は、蛍光標識融合タンパク質を直接細胞内に導入することによっても可能と考えられる。これにより、本発明の蛍光標識融合タンパク質は、生物学研究の現場で簡便にＡＴＰを測定するためのタンパク質試薬、あるいは細胞内のＡＴＰを測定するためのＤＮＡ試薬として提供することができる。
ＡＴＰは神経伝達物質としても働き、最近では細胞内ＡＴＰ濃度の低下がアポトーシスの開始に関与しているとの報告もある。こういった医薬品のターゲットとなるような現象にもＡＴＰが関わっていることから、本発明の蛍光標識融合タンパク質は、基礎研究のみならず医薬品開発においても使用することが期待される。
たとえば、本発明の蛍光標識融合タンパク質は、抗がん剤スクリーニングや、糖尿病診断・薬剤開発などに利用することができると期待される。
抗がん剤はガンの種類や患者によって利き方に大きな差がある。そのため，患者のがん細胞を培養して多くの組み合わせの抗がん剤を作用させた後，ルシフェラーゼを用いて細胞抽出液中のＡＴＰ量を測定する事で最も良い抗がん剤の組み合わせを調べる方法がしばしばとられる（Methods Mol Med 2005 vol.110 p101-120）。本発明の蛍光標識融合タンパク質を利用してがん細胞のＡＴＰ量を測定すれば、より迅速・定量的に抗がん剤の効果を調べる事が可能であると期待される。
糖尿病は膵島にあるインスリン分泌細胞からのインスリン分泌が抑えられることで引き起こされる。血糖値の上昇に伴うインスリン分泌細胞内ＡＴＰ濃度の上昇は，インスリン分泌における重要なステップであると考えられている（Diabetes, 53 Suppl 3, p176-80, 2004）。糖尿病は非常に複雑な発症メカニズムを持っていると考えられ、原因を特定するのは困難である。本発明を利用すれば，膵島細胞におけるＡＴＰ濃度が血糖値に応じてするか調べる事が可能であり、発症の原因を特定する手法となりうる。また、ＡＴＰ濃度を指標とした糖尿病薬の開発にも有用であると考えられる。
【０００３】
εタンパク質の存在に着目した。該タンパク質の特性を利用して、εタンパク質に、蛍光共鳴エネルギー移動（以下単に「ＦＲＥＴ」という。）におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させた新規な蛍光標識融合タンパク質を作製し、本発明を完成した（図１参照）。
［０００９］
本発明は、即ち以下よりなる。
１．アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成酵素のサブユニットであるεタンパク質に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させてなる蛍光標識融合タンパク質。
２．前記εタンパク質が、少なくともＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部分を含む、前項１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
３．ドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質を、前記εタンパク質のＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインに、それぞれ結合させてなる前項１又は２に記載の蛍光標識融合タンパク質。
４．前記εタンパク質が、野生型εタンパク質を構成するアミノ酸配列に対し、１〜８個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されている前項１〜３のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
５．蛍光標識が、蛍光タンパク質であり、ドナー及びアクセプターの組み合わせが、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）及びイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）及びグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、あるいはグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）及びレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）のいずれかである前項１〜４のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
６．前項１〜５のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
７．前項６に記載のＤＮＡを含み、該ＤＮＡから蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクター。
８．少なくとも以下の工程を含むＡＴＰの測定方法：
１）前項１〜５のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質を、被験物質と接触させて反応させる工程；
【０００４】
２）上記蛍光タンパク質と被験物質を反応させた後に、蛍光標識融合タンパク質と被験物質の混合物から発光した蛍光を測定する工程。
９．被験物質が、ＡＴＰを含む生体であり、該生体内でＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を接触させて反応させる前項８に記載の測定方法。
１０．生体内でＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を接触させて反応させる方法が、生体内に前項６のＤＮＡを導入させて、生体内で蛍光標識融合タンパク質を発現させることによる前項９に記載の測定方法。
１１．前項１〜４のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質、前項６に記載のＤＮＡ又は前項７に記載のプラスミドを含むＡＴＰ測定用試薬。
１２．前項６に記載のＤＮＡ又は前項７に記載のベクターと、蛍光標識融合タンパク質を発現させるために必要な試薬を含むＡＴＰ測定用試薬キット。
１３．前記εタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である、前項１〜５のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
１４．前記εタンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である、前項１〜５のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
発明の効果
［００１０］
ＡＴＰは細胞のエネルギー通貨であり、生きた細胞内部のＡＴＰ量を知ることは、医学的、生物学的に重要である。しかし、これまでは測定のための実用的な手法がなかったため、生きた細胞のＡＴＰ濃度が一定に保たれているのかそれともダイナミックに変動しているのか、また細胞ごとにＡＴＰ濃度が異なるかどうかさえも殆どわかっていなかった。
［００１１］
本発明の蛍光標識融合タンパク質を蛍光タンパク質プローブとして用いると、ＦＲＥＴの手法によりＡＴＰの濃度をドナーとアクセプターの蛍光の比から求めることが可能となる。ルシフェラーゼを用いた場合と異なり、タンパク質の量に定量性が影響されないという大きな利点を有する。本発明の蛍光標識融合タンパク質は、細胞に遺伝子導入するだけで、容易に生きた細胞内部のＡＴＰを測定することが可能である。本発明の蛍光標識融合タンパク質に、適当なオルガネラ移行シグナルをつけるだけで、オルガネラ内部のＡＴＰを測定することも可能である。
［００１２］
本発明の蛍光標識融合タンパク質を用いる本発明のＡＴＰの測定方法は、汎用されている蛍光分光光度計や蛍光顕微鏡を用いて測定することが可能であり、特別な装置を必要としない。また、測定のための空間・時間分解能は従来法と同等又はそれ以上である。

Claims (12)

  1. アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成酵素のサブユニットであるεタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質をそれぞれ結合させてなる蛍光標識融合タンパク質。
  2. 前記εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分が、少なくともＡＴＰ特異的に構造変化を生じうる部分を含む、請求の範囲第１項に記載の蛍光標識融合タンパク質。
  3. ドナー及びアクセプターとなりうる２種類の蛍光物質が、前記εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質の、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインに、それぞれ結合させてなる請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛍光標識融合タンパク質。
  4. 前記εタンパク質を構成するアミノ酸配列の部分を含むタンパク質が、野生型εタンパク質を構成するアミノ酸配列に対し、１〜８個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されている請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
  5. 蛍光標識が、蛍光タンパク質であり、ドナー及びアクセプターの組み合わせが、シアンフルオレセントプロテイン（ＣＦＰ）及びイエローフルオレセントプロテイン（ＹＦＰ）、ブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）及びグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、あるいはグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）及びレッドフルオレセントプロテイン（ＲＦＰ）のいずれかである請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質。
  6. 請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
  7. 請求の範囲第６項に記載のＤＮＡを含み、該ＤＮＡから蛍光標識融合タンパク質を発現しうるベクター。
  8. 少なくとも以下の工程を含むＡＴＰの測定方法：
    １）請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質を、被験物質と接触させて反応させる工程；
    ２）上記蛍光タンパク質と被験物質を反応させた後に、蛍光標識融合タンパク質と被験物質の混合物から発光した蛍光を測定する工程。
  9. 被験物質が、ＡＴＰを含む生体であり、該生体内でＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を接触させて反応させる請求の範囲第８項に記載の測定方法。
  10. 生体内でＡＴＰと蛍光標識融合タンパク質を接触させて反応させる方法が、生体内に請求の範囲第６項のＤＮＡを導入させて、生体内で蛍光標識融合タンパク質を発現させることによる請求の範囲第９項に記載の測定方法。
  11. 請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１に記載の蛍光標識融合タンパク質、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ又は請求の範囲第７項に記載のプラスミドを含むＡＴＰ測定用試薬。
  12. 請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ又は請求の範囲第７項に記載のベクターと、蛍光標識融合タンパク質を発現させるために必要な試薬を含むＡＴＰ測定用試薬キット。
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